JPH02257883A - シグナルペプチド、dna配列、ベクター、細菌、およびポリペプチド周辺質生産法 - Google Patents
シグナルペプチド、dna配列、ベクター、細菌、およびポリペプチド周辺質生産法Info
- Publication number
- JPH02257883A JPH02257883A JP1220106A JP22010689A JPH02257883A JP H02257883 A JPH02257883 A JP H02257883A JP 1220106 A JP1220106 A JP 1220106A JP 22010689 A JP22010689 A JP 22010689A JP H02257883 A JPH02257883 A JP H02257883A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- signal peptide
- sequence
- polypeptide
- plasmid
- bacterium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 40
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 title claims abstract description 38
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 32
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 30
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 28
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 title claims abstract description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 20
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims abstract description 15
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims abstract description 15
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 15
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 7
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims abstract description 5
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims abstract description 4
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims abstract description 4
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims abstract description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims abstract description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims abstract description 4
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims abstract description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims abstract description 4
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims abstract description 4
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims abstract description 4
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 claims abstract description 4
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims abstract description 3
- 102000007625 Hirudins Human genes 0.000 claims description 25
- 108010007267 Hirudins Proteins 0.000 claims description 25
- 229940006607 hirudin Drugs 0.000 claims description 25
- WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N hirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(OS(O)(=O)=O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2)=O)CSSC1)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)CSSC1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N 0.000 claims description 25
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 19
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 13
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 12
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 claims description 11
- 230000035939 shock Effects 0.000 claims description 9
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 7
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 5
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 claims description 4
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 claims description 4
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 claims description 4
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 2
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 claims 1
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 claims 1
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 63
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 55
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 11
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 5
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000004019 antithrombin Substances 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000702374 Enterobacteria phage fd Species 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- QEWYKACRFQMRMB-UHFFFAOYSA-N fluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)CF QEWYKACRFQMRMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 2
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 2
- 210000003127 knee Anatomy 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- LWGJTAZLEJHCPA-UHFFFAOYSA-N n-(2-chloroethyl)-n-nitrosomorpholine-4-carboxamide Chemical compound ClCCN(N=O)C(=O)N1CCOCC1 LWGJTAZLEJHCPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 102100040004 Gamma-glutamylcyclotransferase Human genes 0.000 description 1
- BUAKRRKDHSSIKK-IHRRRGAJSA-N Glu-Glu-Tyr Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 BUAKRRKDHSSIKK-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerol Natural products OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003794 Gram staining Methods 0.000 description 1
- 101000886680 Homo sapiens Gamma-glutamylcyclotransferase Proteins 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- JYOAXOMPIXKMKK-YUMQZZPRSA-N Leu-Gln Chemical compound CC(C)C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C([O-])=O)CCC(N)=O JYOAXOMPIXKMKK-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241001400590 Richia Species 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000010310 bacterial transformation Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- CGZZMOTZOONQIA-UHFFFAOYSA-N cycloheptanone Chemical compound O=C1CCCCCC1 CGZZMOTZOONQIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002635 electroconvulsive therapy Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-YPZZEJLDSA-N iodine-125 Chemical compound [125I] ZCYVEMRRCGMTRW-YPZZEJLDSA-N 0.000 description 1
- 229940044173 iodine-125 Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
- C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/034—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a motif for targeting to the periplasmic space of Gram negative bacteria as a soluble protein, i.e. signal sequence should be cleaved
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
め要約のデータは記録されません。
Description
これらの配列を有する発現ベクター、これらのベクター
を導入されたグラム陰性細菌およびポリペプチドの周辺
質生産に関する。
リペプチドを産生じ、細胞質膜と細菌壁の間の空間−周
辺質(ペリプラスム)−に放出、そこで成熟ポリペプチ
ド、すなわち、特異的生化学的作用を保証し得るポリペ
プチドとして蓄積されることが知られている。これらの
ポリペプチドは特にアルカリホスファターゼのような酵
素を含む。
を産生じ得ることが知られている。この周辺質生産は、
細胞質中の蓄積を伴う生産の場合に要求されるように、
細胞質中の他の成分からポリペプチドを分離するよりも
、周辺質の他の構成成分から上記ポリペプチドを分離す
る方がより容易であるため、この種の周辺質生産は非常
に有利である。ポリペプチドは、いずれ除去されなけれ
ばならないN−末端メチオニンの付加なしに、および好
ましくない第2次構造を採ることなく、成熟体で構築さ
れることも有利である。
アミノ酸からなるシグナルペプチドと呼ばれるペプチド
によりN−末端が延長される成熟ポリペプチドに対応す
る前駆物質の形で、ポリペプチド合成されなければなら
ないことが知られている。このシグナルペプチドは蛋白
の分泌において決定的な役目を果たし、その過程中に開
裂し、その際周辺質中に成熟ポリペプチドを放出する。
ドの生産における細菌の採用に関する最初の研究は、上
記ポリペプチドの天然の前駆体を暗号化するDNA配列
を有する発現ベクターによって細菌を形質転換すること
であった。この方法は量に関して産業的生産には適して
いないことが繰り返し証明された。
合成した細菌性ポリペプチドのシグナルペプチドに置換
する試みは満足すべき解決法を与える。ヨーロッパ特許
公開第0177343号はこのようなシグナルペプチド
を用いる方法を開示している。
ポリペプチド(特に真核由来の)前駆体による不適当な
第2次構造形成を、上記前駆体が細菌中で合成される際
に決定し得るとの知見に基づいて、生化学的に活性な異
種ポリペプチドの好収率な周辺質生産を与える新規なシ
グナルペプチドをデザインした。
、 A=アラニン M=メチオニンC=システィ
ン N=アスパラギンF=フェニルアラニン
P=プロリンG=グリシン S;セリン に=リジン T=スレオニンL=ロイシン
W2トリプトファンおよびXはMとKとの
間の直接結合、遺伝子コードの20個のアミノ酸を含む
群から選ばれるアミノ酸、または各々他から独立して、
遺伝子コードの20個のアミノ酸を含む群から選ばれる
2、3または4個のアミノ酸を含むペプチドを表す。
直接結合を表すか、配列がAPSGのペプチドの全部ま
たは部分を表す場合である。
化したDNA配列に関する。遺伝子コードの変質によっ
て許容されるどんな配列も使用することができる。つぎ
のような2個の配列が特に有利である。
A−TCe−ACG− CTG−CTT−CTC−TTへ− TTT−CTG−CTC−CTG− TGC−CTG−CCC−TCT− TGG−AAC−GCC−GGC− OCT−3゜ これは、式(1)、 MAPSGKSTLLLLFLLLCLPSWNAGA
のシグナルペプチドを暗号化したものである:および 5°−ATG−AAA−TCC−ACG−CTG−CT
T−CTC−TTA− TTT−CTG−CTC−CTG− TGC−CTG−CCC−TCT− TGG−AAC−GCC−GGC− GCT−3′ これは式(2)、 MKSTLLLLFLLLCLPSWNAGAのシグナ
ルペプチドを暗号化したものである。
DNA配列を有する発現ベクターに関し、シグナルペプ
チドを暗号化したこの配列のその部分は本発明の配列で
ある。
列およびこれらの配列を有する発現ベクターはこれらの
ベクターを形質転換されたグラム染色試験に陰性反応す
る細菌(いわゆるグラム陰性細菌)によるポリペプチド
の周辺質生産に適用することができる。
って形質転換されたグラム陰性に関する。
richia coli)が有効である。後者は1個ま
たはそれ以上の変異(もしできるなら安定である)、例
えば、cya遺伝子および/またはarp遺伝子に影響
を及ぼす欠失による変異を伴っているのが好ましい。
する。上記で定義したグラム陰性細菌の細胞を培養し、
浸透圧ショックを与え、浸透圧ショックの上清から組換
えボリベチドを分離するものである。
現が誘導プロモーターの制御のもとに行なわれる誘導モ
ード(inducible ll1ode)による生産
に適合しており、また形質転換された菌の培養が始まる
やいなやボリペチドの生産が連続的に行なわれる構成モ
ードによる生産に適合している。
あるあらゆる種類のボリペチドの生産に適している。す
なわち、真核起源のボリペチドの生産に適している。こ
れらは、厳密な意味でひと成長ホルモン(haH)、ま
たは特にヒルジンの天然体または変異体、例えば、変形
(Lys′7)HV 2のような小型のペプチドの生産
にしている。
よってさらに詳細に説明する。
示する: 4二二 =複製開始点の位置(0,R1)−−一−1−
−−−−0.−−−=プラスミドpI3R322から誘
導されたDNAセグメント =hmHの天然前駆体を暗号化 した配列を含むDNAセグメ ント =転写終了暗号を含むファージ fdのDNAセグメント 2刀万 =UV5)リプトファンーラクトースハイブリ
ッドプロモー ター作動因子を含むDNA セグメント ■■■■I■I =β−ラクタマーゼを暗号化したDN
Aセグメント (ApR:アンピシリン耐性) 第2図は、プラスミドp160.1の制限地図であり、
そのPvul −Xhol −BamHIおよびPvu
I −ORI −BamHI (2)フラグメントは各
プラスミドp163、lおよびpBR327に由来し、
その小さいBa5HI (2,)−Baa+HI (1
)フラグメントは下記の実施例1に記載のフラグメント
3である。
に共通の制限地図である。種々の制限セグメントを任意
につぎの記号表によって表示する:=IuaHの天然前
駆体を暗号化し た配列を含むDNAセグメント のP at I −H1ndIII 第4図は、プラスミドp400.+8の制限地図である
。種々の制限セグメントを任意にっぎの記号表によって
表示する: 列 一−−−−−−−−−−=プラスミドp163.1から
誘導したPvul−Xhol配列 W=ニブラスミドル16.1から誘 導したXhol −Hlncll 斡番+瞳−―県−― =−一一一二シー− XXXXXXXXXX =下記の実施例1中に記載のフラ グメント3 =転写終了暗号を含むファージfd のDNAセグメント −4−4−4−4−4−”プラスミドpBR327から
誘導したPvul −Ba+sHI(2)=プラスミド
ル163.1から誘 導したPvul−Xhol配列 :イ、エユユ、=プラスミドp163.1から誘導した
X ho [−H1ncll配列n万力刀テバ =下記
の実施例1中に記載のフラグメント3 左;:五工=転写終了暗号を含むファージfdのDNA
セグメント 雪特にヒルジンの前駆体のブロモ ーターを含むDNAセグメント (フラグメント4のHinall−N ニ[Iコ[ de1部分) を暗号化した配列を含み、記 号中黒色で示されている(フラ グメント5と7の組み合わせ)。
の制限セグメントを任意にっぎの記号表によって表示す
る: 導したPvul −BamHI (2)m + + +
+ + + + + ++ =プラスミドル163
.lから誘導したPvul−Xhol配列 ユココエσm=プラスミドp163.1から誘導したX
ho I −H1nall配列1、□1x代 ”下記
の実施例1中に記載のフラグメント3 萱、ア□ブ =転写終了暗号を含むファージfd伽着
・e――t+ のDNAセグメント 一ターを含むDNAセグメント (フラグメント4のHincll−N de1部分) を暗号化した配列を含み、記 号中黒色で示されている。
(1)のシグナルペプチドを有するひと成長ホルモンの
周辺質生産 使用する菌種はヨーロッパ特許出願公開第024513
8号に記載の菌種と直接関連する菌エシェリキア・コリ
(Escherichia colt)であり、198
6年2月17日にコレクシオン・ナシオナル・ド・キュ
ルチュル・ド・ミクロオルガニスムス(CNCM パ
リ、フランス)に寄託番号1−529で寄託されている
。この菌は欠失によるcya変異および欠失によるcr
p変異を伴っている〇シグナルペプチドが本発明の式(
1)−MAPSGKSTLLLLFLLLCLPSWN
AGAである、hmHの前駆体を暗号化したDNA配列
を有するプラスミドを製造した。このプラスミドはp3
98という。
得たフラグメントおよび現在周知の技術による合成によ
り製造したフラグメントを用いた。
・エフ・フリッチュおよびジェイ・サムプルツク、モル
キュラー・クローニング、ア・ラボラトリ−・マニュア
ル(Molcular cloning、 a 1ab
oratory manual)、(コールド・スプリ
ング・ハーバ−・ラボラトリ−11984年)に記載の
ものである。オリゴヌクレオチドはバイオサーチ460
0DNAシンセサイザーを使用して合成した。
出願公開第0245138号に記載されており(上記出
願公開の第2図に示されており、ここに添付の第1図に
示されているBamHI(1)部位をマーク指定してい
ない)、1986年2月17日に1−530の寄託番号
でCNCMに寄託された菌の中に存在し、酵素PvuI
およびBamHIで切断された。このプラスミドはhm
Hの遺伝子コードを含んでいる。Pvul −BamH
I (1)フラグメント−以下、フラグメント1という
−は、第1図に示すように、制限酵素X ho Iの作
用部位を含んでおり、これを精製した。
知であり(ソベロン・エクス、ら、ジェネ(Gene)
第9巻第287−305頁(1980年)参照)、酵素
、Pvulおよび−BamHIによって切断された。P
vul−BamHI(2)フラグメント−以下、フラグ
メント2という−は、複製開始点を含んでおり、これを
精製した。
遺伝子およびそのプロモーターを含−む合成りa5HI
(1)およびBamHI(2)フラグメントであり、っ
ぎのようなりNA配列を含み、その上に、鎖の二つの端
を第2および3図に記載のプラスミド中のフラグメント
の方向性を特定するために1および2の数字によって識
別する。
び3を結合し、プラスミドpBR327を得る。このプ
ラスミドは制限酵素HincllおよびPstlで部分
的に切断処理した。この大きいHinall−Pstl
フラグメントは複製開始点を含んでおり、ついで、第2
図に示すように、下記に示すフラグメント4に結合した
。これは、hmHの天然前駆体の最初の44個のアミノ
酸およびこの配列の上流に調節シグナルを暗号化した配
列を有する合成りNAフラグメントである。
号による文字で示す。
N=アスパラギンD=アスパラギン酸 P=
プロリン E=グルタミン酸 Q=グルタミンF=フェニルア
ラニン R=アルギニンG=グリシン S=セ
リン H=ヒスチジン T:スレオニン1=イソロイシ
ン V=バリン に=リジン W=ニトリブトファン=ロイシ
ン Y=チロシン プロモーターの配列の配列−35(TTGCTT)およ
び−10(TATAAT)、および当業者に周知のシャ
インーダルガルノ(Shine−Dargarno)配
列は、このフラグメント中でその順番に下線で示す。
素C1alおよびNdelで切断し、上記のフラグメン
ト4の小さいC1al−NdeIフラグメントを除去し
、これを下記のC1al−NdeIフラグメントで置換
した: 1a1 5° CGATAGCGTATAATGTGIGGAA
TTGTGAGCGGATAACAT^TCGCAT人
TTACACACCTT人ACACTCGCCTATT
GTム 得られたプラスミドはプラスミドp373.2である(
第3図)。
およびXbaIで切断し、上記のフラグメント4のNd
eI−Xbalフラグメントを除去し、これを下記に示
す合成Ndel−Xbalフラグメントで置換した。
AAA、TCCACG CTGACCGA GGT
AGA CCG TTT AGG TGC
GACCTT CTCTTA TTT CTG CTC
CTG TGCCTGGAA GAG AAT AAA
GACGAG GACACG GACCCCTCT
TG’G AACGCCGGCccitryc CCA
GGG AGA ACCTTG CGG CC
G CGA AAG GG丁bal ACCA丁T CCCT丁AT TGG TAA GGG AAT AGATC5’この
ようにして得られたプラスミドp398は、式(1)の
シグナルペプチドを暗号化した特に有利なりNA配列を
含む。この配列は上記の二つの矢印で画する。
2.3.5.6.7および8)で行なわれ、結果をプラ
スミド9373.2に対して評価した。
化したDNA配列を含む。実験は前もって製造した当該
宿主ベクターを、十分なバイオマス(2,2参照)で得
、導入処理した細胞がhmHを産生(2,4参照)する
ような条件で培養し、浸透圧ショック(2,4参照)で
周辺質空間に含まれる蛋白質を集め、細菌を全融解処理
し、2.4で集めた周辺質hnHを測定し、2.4およ
び2.5で得られた上清をウェスタン・プロット・テク
ニク(2,7参照)によって分析することにより行った
。
造した。これは具体的に、つぎのような文献に記載され
ている。
cl。
bolatory Manual)−テ(−マニアティ
ス、イー・エフ・フリッチュおよびジェイ・サムプルツ
ク−コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリー−
1982年 一イクスペリメンツ・イン・モルキュラー・ジエネテイ
ックス(Experiments in Mo1ecu
lar GenetiaS)−ジェイ・エイチ・ミラー
−コールドデスプリング・ハーバ−・ラボラトリー−1
972年2.2 培養 a)接種 固体培地(LB培地+寒天)で得られた分離コロニーを
培地(LB培地)5ffi1中に懸濁さけた。
菌前に導入された成分は、 バクトドリプトン 10g酵母抽出液
5g塩化ナトリウム
5g蒸留水 全量 11
2高圧滅菌前に、phiを7.2に調整する。
添加する。
ージロンし、安定生長期に達するまで培養した。得られ
た濃厚懸濁液をLB培地で希釈し、光学密度を600n
sにて一600nmにおける0D−0,03に近付け、
ついで、この細菌懸濁液を37℃にて撹拌しつつ、60
0nmにおけるODを0.3のオーダーになるまでイン
キニベートした。
−チオガラクトース(またはIPTG)を最終濃度が1
bMに等しくなるような量で添加する。IPTGはここ
で通常ラクトース・オペレーターに結合するリプレッサ
ーの作用を中和することによってhmHの前駆体の合成
を始動および維持するために使用した。
間30分撹拌した。
ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
(The Journal Biological C
hemistry)第241巻第3055−3063頁
(1966年)に記載のプロトコルを明細書の記載とし
て挿入する。
000gで5分間遠心分離した。
ーダーになるような容量のpH7の緩衝液に添加した(
A液)(上記参照)。使用した緩衝液は蒸留水につぎの
ちのを添加して製造した。
ように添加した。
濃度が1mMになるように添加する。
遠心分離した。残渣を注意深く等量の、A液に対してス
クロースを100m1当たり15g添加し、用時調製の
B液中に加えた。
0gにて5分間遠心分離した。遠心分離管を氷水中に入
れた。
水(同量で)で置換した。
がlOを有する)を0℃にて5分間放置した。
遠心分離した。
た。
ペンドルフ管中6000gにて5分間遠心分離した。
となるような量の緩衝液に懸濁した。
した緩衝液から調製した。
ドデシル硫酸ナトリウム(4%(W/V));−グリセ
リン(20%(W/V)); −β−メルカプトエタノール(10%(W/V))−ブ
ロモフェノール・ブルー(0,02%(V/V))。
を6000gにて5分間遠心分離し、上清を集めた。
sの検知器を備えた装置を高圧液体クロマトグラフィー
にかけた。
CB−300オングストローム逆相カラム(ジンクロム
、製品番号C3−Rl03−10)、・20分間にSt
液70容とS2液30容からSi液40容とS2液60
容に直線こう配で通過する移動相。
精製水、 ・52=0.8%CV/V)のトリフルオロ酢酸を含む
HPLCのためのアセトニトリル 流速は1分当たり1mlである。
ml当たり、マイクログラムであられし、先に確定した
検量曲線と比較して測定する。
れた各上清に含まれる種々の蛋白質の分離(レミリ、ニ
ー、ケー1、ネイチュア(Nature)第227巻第
680−685頁(1970年)記載のプロトコルによ
る);使用したゲルは0.5%のドデシル硫酸ナトリウ
ムを含むポリアクリルアミドゲル(15%1/V)であ
る; 一ゲル中に含まれる上部蛋白質のニトロセルロース膜の
透過(エイチ、タウビンら、プロシーディング・オブ・
ナショナルアカデミ−・オブ・サイエンス(Proc、
Natl、 Acad、 Sci、 USA)第7
6巻第4350−4354頁(1979年);−バーネ
ットの操作による免疫検出(ダブリュ。
トリー(Anal、 Bioahem、 )第112巻
第195−203頁(1981年)):これは次の連続
操作を含むニ ー緩衝液A(TriII−HCI 10+MSNaC
1170aM、に夏 ]膿M)でニトロセルロース・フ
ィルターを10分間洗浄する。; 一緩衝液B(ウシ血清アルブミンを100s当たり39
の割合で添加した緩衝液A)をニトロセルロース・フィ
ルターに接触させるニ ー20℃にて18時間、ニトロセルローズ・フィルター
を免疫血清(成熟hG)(およびその前駆体を検出する
ポリクa−ナル抗体)に接触させる;−緩衝液Bでニト
ロセルローズ・フィルターを洗浄; 一1xQ当たり0.1マイクロキユリーの割合のヨード
125でラベルした蛋白質A液とニトロセルローズ・フ
ィルターと20℃にて6時間接触させる; 一フィルターを緩衝液Aで洗浄; =2枚の吸収シート間でフィルターを乾燥ニーフィルタ
ーをX線フィルムと接触させるニーフィルムを現像。
に比べておよそ2倍の周辺質産生を行うことが明らかで
ある。
p398で形質転換した細菌の全顯解後得られた抽出物
中に検出されないが、クローンp373.2で形質転換
した細菌の全融解後得られた抽出物中には検出されるこ
とを示している。これは本発明のシグナルペプチドが、
前駆体を高い効率で細胞質膜を通過させ、同時成熟を可
能にすることを示している。
ひと成長ホルモンなどの蛋白の周辺質生産に用いる大き
な利点を強調している。
する。ヨーロッパ特許出願公開第0273800号に記
載の変異体(Lys”)HV2を暗号化したDNA配列
を用いた。この式を次に示す:Glu Glu Tyr
Leu Gln上記DNA配列が、式(りの本発明の
シグナルペプチドを暗号化した配列に続いている。
た配列を含む合成AccI −Hlndll[フラグメ
ント(フラグメント5)を調製した。下記に示すが、最
後のアミノ酸に対応するコドンは矢印で示しである: フラグメント5 八cc1 5’ AT ACA GACTGCACA GA
A TCG GGT。
CAA ATT TTG TGCCTCTGCGA
G GGA AGCAA丁G丁T TTA A
ACACG GAG ACG CTc CCT
TCG TTAGTT TGCGGT AAA G
GCAAT AAG TGCATA TTGCM A
CG CCA TTT CCG TTA T
TCACG 丁Aτ MCGGT TCT AAAG
GA AAG GGCAACCAATGT GTCCC
A AGA TTA CCT TTCCCG
TTG GTT ACA CAGACT GGC
GM GGT ACA CCG AAA CCT GA
A AGCtcA CCG CTT CCA TG
T GGC7丁丁 GGA CTT rcrsC
AT AAT MCGGCGAT TTCGM GM
ATT CCAGTA TTA TTG CCG
CTA MG CTT CIT T/A GG
丁GAA GM TAT TTA CM’TGAMA
ATGMA GAAATA GTT AGT ATCT
CT TAA AACTAA ACCCTTTTCGA
A AAG TTCGCT GGT ACT
AAG GCT TTGAAG CIT TTC
AAG CGA CCA TGA TTCCGA AC
A TTA GACGAA GTT GTCMG A
GCTCT CCT GCTAAT CTG CTT
CAA CAG TTCTCG AGA CGA C
GAGGT MCACCGTCATCATT GCTG
GT GGT GACCC^ 7TG TGG C
AG TAG 丁AA CCA CCA C
CA C丁GACτGCCACT GICGCT A
AG AAG TACGGT GτCTGA CGG
TGA CAG CGA TTCTic ATG CC
A CAGl((ndl■■ ACT GACAAG ATCCCA TGA CTG TTCTAG GGT TCG A
−5’プラスミドp373.2を制限酵素Ndelおよ
びHindll+で切断し、第3図に示すように複製開
始点を含むNdeO−Hindll+7ラグメント(フ
ラグメント6)を精製した。
ント7)を調製する;そのフラグメントを次に示す:フ
ラグメント7 de1 5°岳GGCTCCATCTGGCAAATCCACG
CTGCTTCTCTTATTTCTGCTCCTGT
GCCTGCCCTCT −ACCG AG(iTAG
ACCGTTTAGGTGCGACG^^GAGAA
TAAAGAC(liAGGAcAcGGAcGGGA
G^−ccl TGGAACGCCGGCG己TTACGTACCTT
GCGGCCGCGATAATGCAT^5゜このフラ
グメントは、式(1)のシグナルペプチドを暗号化した
特に有利なりNA配列を含んでおり、この配列は2つの
矢印で画しており、ヒルジン変異体(Lys”)HV2
の最初の3個のコドンに対応するヌクレオチド5.6お
よび7を結合する;得られたプラスミドがプラスミドp
400でありこれを第4図に示す。
により導入した。
により2種の異なるクローン(クローンp400.18
およびp400.24)に平行して行った。培養は実施
例1の2.3項に示した方法により誘導し、2種類の修
正を行った:誘導は、培養物が600nmにてODがお
よそ0.5に達したときIPTGを添加して始め、第■
の実験では3時間30分間維持し、第2の実験では17
時間維持した。
4参照)、集められた上清中のヒルジンの抗トロンビン
活性を測定した。
ス・アンド・ヘモスタシス(Thromb、 I−Ia
emostas)第52巻(19)第160−163頁
)記載およびハーベイ、アール・ピーら、(プロシーデ
ィング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエ
ンス(Proc、 Natl、 Ac1d、 Sci、
USA)第83巻第1084−1088頁(1986
年)において研究されている技術により測定した。
クロマログラフイーにより精製し、そのNH!〜末端配
列を決定した。
清を、濁度を600nsにおける0D=10にもってい
き、n+1当たりの抗トロンビンで表現した。
ン1+g当たりi aoooと177000抗トロンビ
ン単位の間にあるから(ロイソン、ジーら、バイオテク
ノロジー(Bio/Technology)第6巻第7
2−77頁(1988年))、誘導17時間後、600
nm当たりの0D=1の上清lリットル当たり、ヒルジ
ンが5−10mg抽出されることが判明した。
(FEBS)第202巻第373−377頁記載の量よ
りも非常に多い。これは、ヒルジンのハイブリッド前駆
体を暗号化した配列を有するプラスミドで形質転換した
エシェリキア・コリ(E、 coli)菌中の周辺質中
に産生ずるヒルジンHVI変異体を伴っており、このシ
グナルペプチドはアルカリホスファターゼのものである
。
ンは変異体(Lys”)HV2(7)NH,−末端特徴
を有している。
がヒルジン変異体(Lys”)HV2のようなペプチド
の効果的な周辺室生産に適していることを示している。
ルペプチドを有するヒルジン 変異体の周辺質生産 1、菌種およびプラスミド 実施例1に記載の菌を使用した。
ーロッパ特許出願公開第0273800号に記載のヒル
ジン(Lys”)HV2を暗号化した配列を含んでおり
、この配列は本発明の式(2)=MKSTLLLLFL
LLCLPSWNAGAによるシグナルペプチドを暗号
化した配列に続くものであるが、実施例2に記載したプ
ラスミドp400.1Bおよびアメルシャム(Amer
shas)でマークしたファージ゛M13splQ中に
変異誘発して得られたフラグメントを使用した。
グメント α)プラスミド9400.18を酵素PstおよびEc
oRIで切断した。複製の開始点を含む386gbpの
Pst−EcoRIフラグメント、以下、フラグメント
8という(第5図中F8として表す)を精製した。
stIで切断した。プロモーターを含む1062bpの
小さいNrul−Pstlフラグメントは、以下、フラ
グメント9という(第5図中、F9として示す)を精製
した。
フラグメント α)酵素XholおよびEcoRIで切断および精製に
よりプラスミドp400.18から誘導された650b
pのXhol−EcoRIフラグメントは、式(1)の
シグナルペプチドを暗号化した配列を含み、これを制限
部位、5all/EcoR1にあるファージM l 3
mp 19 (Amershas)のポリリンカー(
クローニング・ポリサイド)中に導入した。Xholお
よびSci1部位の連結はこれら二つの部位を消滅させ
た。
レオチド 5° −ATG−AAA−TCC−ACG−CTGCT
T−CTC−TTA−TTT−CTG−CTC−CTG
−TGC−CTG−CCC−TCT−TGG−AAC−
GCC−GGC−GCT −3’ を合成した。この配列は式(2)のシグナルペプチドを
暗号化したものである。
ム1523キットを用いて、α)にて得られたフラグメ
ントに関連し、シグナルペプチドを暗号化した配列に関
して、変異を有するフラグメントを構築した。
に記載されており、ファージM13の二重鎖に650
bp(上記α)の項参照)のXhol −EcoRIの
導入、この組換えファージの一重鎖の精製、63ヌクレ
オチドの上述のオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成
、DNAポリメラーゼのフレナラフラグメント、および
組換えファージの二重鎖円形を形成するためのT4リガ
ーゼの作用からなる。
ulおよびEcoRIで切断した。式(2)のシグナル
ペプチドを暗号化した配列およびヒルジン変異体(Ly
s”)HV2を暗号化した配列を含むNrll −Bc
oRIフラグメント、以下、フラグメント10という(
第5図にFIOとして示す)を精製した。
ラスミドはプラスミドp460であり、これを第5図に
示す。
した。実験は平行して2種類のクローン(クローンp4
60.2およびp460.4)で行い、これらには、6
3ヌクレオチドの上述の配列の存在が認められている。
び2.2の項に記載の方法のとおりに行った。培養は実
施例1の2゜3の項に示された方法で2つの修正をして
誘導した:培養物が600ra+JこてODがおよそ0
.5に達したとき、IPTGを添加して誘導を行い、2
時間維持した。
.4の項)、上清中に遊離したヒルジン変異体(Lys
”)HV2をHPLCにて測定した。
ク後、得られた上清を、検量注入器および220nra
の検知器を備えた装置を高圧液体クロマトグラフィーH
PLC,にかげた。
製のCB−300人逆相カラム(ジンクロム、製品番号
CB−R103−10)、 ・10分間にSt液85容とS2液15容からSl液5
0容とS2液50容に直線こう配で通過する移動相。
精製水、 一52=0.8%(V/V)のトリ3ルオロ酢酸を含む
HPLCのためのアセトニトリル 流速は1分当たり2mlである。
)HV2の量を上清1ml当たり、ミリグラムで表し、
変異体(Lys”)HV2の標準溶液と比較して測定し
た。
を1とし、集めた上滑のmg/Iで示す。
60.2および460.4により産生じたヒルジン変異
体(L ys”)HV 2の周辺質生産はかなりプラス
ミド400.18により産生じたものより多いことが上
記の表から明らかである。
、1 プチドがヒルジン変異体(Lys”)HV2のようなヘ
プチドの効果的な周辺質生産にかなり適していることを
示している。
限地図である。 第4図は、プラスミドp400.18の制限地図である
。 第5図は、プラスミドp460の制限地図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、一般式、 【遺伝子配列があります】 [式中、 A=アラニンM=メチオニン C=システインN=アスパラギン F=フェニルアラニンP=プロリン G=グリシンS=セリン K=リジンT=スレオニン L=ロイシンW=トリプトファン およびXは、MとK間の直接結合、遺伝子コードの20
個のアミノ酸を含む群から選ばれるアミノ酸、または各
々他から独立して、遺伝子コードの20個のアミノ酸を
含む群から選ばれる2、3または4個のアミノ酸を含む
ペプチドを表す]。 2、Xが、MとK間の直接結合を表すか、 またはAPSGの配列のペプチドのすべて、または部分
を表す、請求項1記載のシグナルペプチド。 3、Xが、直接結合を表す、請求項2記載 のシグナルペプチド。 4、Xが、APSGの配列のペプチドを表 す、請求項2記載のシグナルペプチド。 5、請求項1−4のいずれか1項記載のシ グナルペプチドを暗号化したDNA配列。 6、式、 【遺伝子配列があります】 を有する請求項5記載の配列。 7、式、 【遺伝子配列があります】 を有する請求項5記載の配列。 8、ポリペプチドの前駆体を暗号化したD NA配列を有する発現ベクターにおいて、シグナルペプ
チドを暗号化した配列の部分が請求項5−7のいずれか
1項の配列である、発現ベクター。 9、請求項8によるベクターによって形質 転換されたグラム陰性細菌。 10、エシェリキア・コリ(Escherchiaco
li)菌種に属する、請求項9記載の細菌。 11、欠失によるcya変異および欠失によるcrp変
異を有する、請求項10記載の細菌。 12、ポリペプチドがヒルジンの天然体ま たは変異体である、請求項9または10記載の細菌。 13、ヒルジン変異体が(Lys^4^7)HV2であ
る、請求項12記載の細菌。 14、ポリペプチドがひと生長ホルモンで ある、請求項9または10記載の細菌。 15、ポリペプチドの前駆体の発現ベクタ ーにより形質転換してグラム陰性細菌細胞を培養し、細
胞を浸透圧ショック処理し、浸透圧ショック上清から組
換えポリペプチドを分離する、ポリペプチドの周辺質生
産の方法において、グラム陰性細菌が請求項9−14の
いずれか1項記載の細菌であることを特徴とする方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR8811188 | 1988-08-24 | ||
FR8811188A FR2636643B1 (fr) | 1988-08-24 | 1988-08-24 | Peptide-signal, sequences d'adn codant pour celui-ci, vecteurs d'expression portant l'une de ces sequences et procede de production periplasmique d'un polypeptide |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH02257883A true JPH02257883A (ja) | 1990-10-18 |
JP2535076B2 JP2535076B2 (ja) | 1996-09-18 |
Family
ID=9369498
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP1220106A Expired - Lifetime JP2535076B2 (ja) | 1988-08-24 | 1989-08-24 | シグナルペプチド、dna配列、ベクタ―、細菌、およびポリペプチド周辺質生産法 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0356335B1 (ja) |
JP (1) | JP2535076B2 (ja) |
AT (1) | ATE122398T1 (ja) |
CA (1) | CA1334944C (ja) |
DE (1) | DE68922549T2 (ja) |
ES (1) | ES2074087T3 (ja) |
FR (1) | FR2636643B1 (ja) |
GR (1) | GR3016981T3 (ja) |
PT (1) | PT91511B (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2004510410A (ja) * | 2000-06-05 | 2004-04-08 | コリクサ コーポレイション | 宿主細胞由来組換えタンパク質の分泌を促進するリーダーペプチド |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE4009268A1 (de) * | 1990-03-22 | 1991-09-26 | Consortium Elektrochem Ind | Sekretion von hirudinderivaten |
US6514730B1 (en) | 1991-03-21 | 2003-02-04 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Secretion of hirudin derivatives |
FR2957598B1 (fr) | 2010-03-17 | 2015-12-04 | Lfb Biotechnologies | Nouveau peptide signal, et son utilisation pour la production de proteines recombinantes |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0170266B1 (en) * | 1984-07-30 | 1993-03-24 | Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha | Process for producing protein, and vector, recombinant dna and transformant used therefor |
ATE78515T1 (de) * | 1984-10-05 | 1992-08-15 | Genentech Inc | Dna, zellkulturen und verfahren zur sekretion von heterologen proteinen und periplasmische proteinrueckgewinnung. |
-
1988
- 1988-08-24 FR FR8811188A patent/FR2636643B1/fr not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-08-22 PT PT91511A patent/PT91511B/pt not_active IP Right Cessation
- 1989-08-23 AT AT89402328T patent/ATE122398T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-08-23 CA CA000609139A patent/CA1334944C/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-08-23 ES ES89402328T patent/ES2074087T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-08-23 DE DE68922549T patent/DE68922549T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-08-23 EP EP89402328A patent/EP0356335B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1989-08-24 JP JP1220106A patent/JP2535076B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-08-02 GR GR950402097T patent/GR3016981T3/el unknown
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2004510410A (ja) * | 2000-06-05 | 2004-04-08 | コリクサ コーポレイション | 宿主細胞由来組換えタンパク質の分泌を促進するリーダーペプチド |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0356335B1 (fr) | 1995-05-10 |
FR2636643B1 (fr) | 1990-12-28 |
DE68922549D1 (de) | 1995-06-14 |
PT91511A (pt) | 1990-03-08 |
JP2535076B2 (ja) | 1996-09-18 |
ATE122398T1 (de) | 1995-05-15 |
EP0356335A1 (fr) | 1990-02-28 |
PT91511B (pt) | 1995-07-18 |
GR3016981T3 (en) | 1995-11-30 |
DE68922549T2 (de) | 1996-01-18 |
CA1334944C (en) | 1995-03-28 |
FR2636643A1 (fr) | 1990-03-23 |
ES2074087T3 (es) | 1995-09-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Bedouelle et al. | Mutations which alter the function of the signal sequence of the maltose binding protein of Escherichia coli | |
CA2145388C (en) | Method of controlling polypeptide production in bacteria | |
US5608036A (en) | Enhanced secretion of polypeptides | |
JPS62501608A (ja) | 生物学的に活性なヒト腫瘍壊死因子蛋白質のシステイン除去ミュ−テイン | |
IE881597L (en) | Expression of Human Proapolipoprotein A-I | |
US4886748A (en) | DNA encoding flagellin and vector having the same | |
KR20000019788A (ko) | 대장균 엔테로톡신ⅱ 신호펩티드의 변형체와 인체성장호르몬의융합단백질을 발현하는 재조합 미생물 및 그를 이용한 인체성장호르몬의 제조방법 | |
Ishino et al. | Nucleotide sequence of the lig gene and primary structure of DNA ligase of Escherichia coli | |
US5210028A (en) | Process for the production of unfused igf-ii protein in e. coli | |
JPH03503596A (ja) | 蛋白質若しくはポリペプチドの調製方法、該ポリペプチドをコードするdna配列、該dna配列およびポリペプチドを有する微生物および該ポリペプチドの薬学的製剤としての利用 | |
Emerick et al. | Expression of a β-lactamase preproinsulin fusion protein in Escherichia coli | |
Trojanowska et al. | The bacteriophage T4 regA gene: primary sequence of a translational repressor | |
KR900004428B1 (ko) | 용성 성숙 hIL-β 및 변경된 생물학적 활성을 갖는 유도체를 이.콜라이에서 고도로 발현시키는 플라즈미드 및 그 방법 | |
DK175020B1 (da) | Fremgangsåde til udtrykkelse og ekstracellulær udskillelse af proteiner i G(-)bakterie, rekombinant DNA-konstruktion og plasmidvektor kodende herfor, samt G(-)bakterie indeholdende disse | |
JPH02257883A (ja) | シグナルペプチド、dna配列、ベクター、細菌、およびポリペプチド周辺質生産法 | |
US6342374B1 (en) | Human collagenase inhibitor, recombinant vector system for using same and recombinant-DNA method for the manufacture of same | |
JPH0779701B2 (ja) | 成長ホルモン放出因子を含むハイブリドポリペプチドをコ−ドする遺伝子 | |
EP0300459A2 (en) | Human pancreatic secretory trypsin inhibitor | |
US5212083A (en) | Sequence for stabilizing proteins in bacteria | |
AU603145B2 (en) | Aminoglycoside phosphotransferase-proteinfusions | |
JPS61149089A (ja) | Dna塩基配列、ポリペプチド分泌発現ベクター及び形質転換微生物 | |
US5284768A (en) | Signal peptide, DNA sequences coding for the latter, expression vectors carrying one of these sequences, gram-negative bacteria transformed by these vectors, and process for the periplasmic production of a polypeptide | |
JP2662044B2 (ja) | Dna配列、発現ベクターおよびポリペプチドの周辺質生産方法 | |
US5279947A (en) | DNA sequence participating in the regulation of the expression of a DNA sequence coding for a precursor of a polypeptide, expression vectors and process for the periplasmic production of the polypeptide | |
NO851308L (no) | Genetisk ekspresjon av somatostatin som hybridpolypeptid |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111 |
|
R370 | Written measure of declining of transfer procedure |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R370 |
|
S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080627 Year of fee payment: 12 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090627 Year of fee payment: 13 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100627 Year of fee payment: 14 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term | ||
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100627 Year of fee payment: 14 |