KR900004428B1 - 용성 성숙 hIL-β 및 변경된 생물학적 활성을 갖는 유도체를 이.콜라이에서 고도로 발현시키는 플라즈미드 및 그 방법 - Google Patents

용성 성숙 hIL-β 및 변경된 생물학적 활성을 갖는 유도체를 이.콜라이에서 고도로 발현시키는 플라즈미드 및 그 방법 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

용성 성숙 hIL-β 및 변경된·생물학적 활성을 갖는 유도체를 이.콜라이에서 고도로 발현시키는 플라즈미드 및 그 방법
제 1 도는 플라즈미드 pDP 506의 제조공정도이고,
제 2 도는 pro hIL-1β를 암호화하는 DNA를 함유하는 1.6kb 절편을 나타내며,
제 3 도는 pro hIL-1β의 아미노산 위치 112 내지 269를 암호화하는 뉴클리오타이드 서열이고,
제 4 도는 pst I부위 및 이 부위로부터 11개의 아미노산 코돈에 의해 분리되는 상부 ATG/Met/출발 코돈을 함유하는 pUC 8의 부분을 나타내며,
제 5 도는 pDP 506중 pUC 8의 13개 코돈이 선행하는 pro hIL-1β의 아미노산 위치 115 내지 269의 암호화 서열이고,
제 6도 내지 제 10 도 각각 플물라즈이드 pDP 516, 'pDP 516-22A, pDP 5l6-18, pDP 516-23 및 pDP516-16에서 pro hIL-lβ를 암호화하는 서열의 선도부분을 나타내고 있다.
본 발명은 성숙(mature)사람 인터루킨 1β(hIL-1β) 및 N-말단에 아이노산 치환체 및 삽입물을 갖고동시에 생물학적 활성이 변경된 성숙 hIL-1β(뮤테인 : muteins)의 유도체에 상응하는 용성 재조합 단백질의 발현에 관한 것이다. 더욱 특히 본 발명은 1ac 프로모터를 함유하는 플라즈미드를 활용하여 그런 단백질을 이콜라이(E.coli)에서 고도로 발현시키는 것에 관한 것이다.
사람 인터루킨-1β(hIL-1β)는 30,747의 Mr을 갖는 269 아이노산 단백질로서 초기에 자극된 단핵세포에의해 생성된다. 이는 위치 117에서 위치 269까지의 153개 아미노산으로 이루어진 17,377의 Mr을 갖는 생물학적으로 활성인 형태로 단백분해적으로 전환된다.269개 아미노산 단백질은 pro hIL-1β에 해당하며;153개 아미노산 단백질은 성숙 hIL-1β에 해당한다.
1985년 3월 임무넥스 코포레이션(Immunex Corporation)에 의해·출물원된 유럽 록허된 공고번호 제0165654호는 메타이오닌 잔기 선행 위치 1을 갖는 재조합 성숙 hIL-1β(met hIL-1β)의 발현을 기술하고있다. 비록 hIL-lβ를 암호화하는 유전자는 이콜라이에서 증폭되었으나 효모에서 발현시켰다.1985년 임무넥스의 연구원들은 λ페이지(phage) PL 프로모터를 함유하는 벡터를 사용하여 재조합 성숙 met hIL-1β를 이.콜라이에서 발현시켰음을 기술하는 문헌을 발포하였다[March et al., Nature 315 : 641-647,20 June1985]. 이 문헌은 644-5면에서 세포가 IL-1 활성을 고도로 생성시켰다고 기술하고 있다. 단백질의 정제에 대한 내용은 없다. 1986년 임무넥스의 연구원들은 마치 등(March et al.)의 문헌에 기술된 "1차 구조"가 고도의 재조합 hIL-1β를 생성치 않았고, 정제된 hIL-1β가 단지 사람의 단핵세포로부터 이미 수득되었음을 l080면에 시사하는 또다른 문헌을 발표하였다[Kronheim et al., Biotechnology 4 : 1078-1082]. 크로ㅈ하임 등 (Kronheim et al.)의 문헌은 발현 시스템l pLNIL 1β를 사용하고 또한 λ페이지 Pl 프로모터를함유하는 이.콜라이에서 hIL-1β를 고도로 발현시키고 이 단백질을 정제하있음을 기술하고 있다.
유럽 특허원된 공고번호 제0161901호 및 문헌[Auron et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 : 7907-7911(1984)]은 pro hIL-1β의 뉴클리오타이드 암호화 서열을 함유하는 클로닝 비이클(pcD 415 및 pcD1218) 및 그의 여러가지 단편을 기술하고 있다. 유럽 특허원 공고번호 제016190l호는. 상기 서열을 발현벡터에 융합시켜 진핵 또는 원핵세포에서 발현시킬 수 있다고 기술하고 있으나 특별한 발현시스템에 관해서는언급하고 있지 않다. 문헌[Dinarello et al.,J. Clin.Invest 77 : 1734-1739(June 1986)]은 24개의 아미노산이 선행하는 pro hIL-1β의 아미노산 71-269로 이루어진 단백질을 발현시스템에 의해 이.콜라이에서 발현시켰음과, 이어서 효소적 분해로 pro hIL-1β의 아미노산 112-269로 이루어진 단백질을 생산하였음을기술하고 있다. 이 문헌에는 pcD 1218의 단편을 확인되지 않은 이콜라이 발현 플라즈미드에 삽입하여 발현벡터를 구성하였다고 기술되어 있다. 문헌[Rossenwasser et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,83 : 5243-5246(July 1987)]에는 플라즈미드 pcD 415 및 l218을 사용하여 pro hIL-1β, 및 성숙 hIL-1β의카복시 말단 약 138개 아미노산으로 아루어진 것을 위시하여 여러가지 결실된 형태를 COS 몽키(monkey)세포에서 발현시켰다고 기술되어 있다.
프로 사람 인터루킨 1α(pro hIL-1α)는 pro hIL-1β와 약 27% 상동적인 271개의 아미노산 단백질이다. 이것은 단백분해적 과정을 거쳐 pro hIL-1α의 카복시-말단 159개 아미노산으로 이루어진 생물학적으로 활성인 약 17kD의 단백질로 된다. 문헌[Gubler et al.,J.Immunology 136 : 2492-24971986)]에는 λ페이지 PL 프로모터를 함유하는 플라즈미드를 사용하여 prO hIL-1α의 카복시-말만 154개 아미논산이 이콜라이에서 발현됨이 기술되어 있다.
pUC 8과 같이 1ac 프로모터를 함유하는 플라즈미드 벡터가 기술된 바 있으며[Vieira and Messing etal.,Gene 19 : 259-268(1982)]·파마시아(Pharmacia, Piscataway, NJ) 및 베데스다 리서취 래보러포리(Bethesda Research Laboratory,Bethesda,MD)로부터 상업적으로.시판되고 있다. 유럽 특허원 공보 제0161901호 및 상술한 로젠바세르 등(Rossenwasser et al.)의 문헌은 클로닝 및 발현 벡터의 구성과 관련해서, 그러나 단지 플라즈미드 pcD 1218의 구성시 사용된 폴리링커 단편의 공급원으로서 pUC 8을 언급하고있다.
본 발명자들은 성숙 hIL-1β, 또는 위치 1 내지 4의 한군데 이상에서 아미노산이 치환 또는 삽입된 성숙hIL-1β의 유도체를 암호화하는 DNA를, pUC 8의 lac 프로모터의 하부에 있는 ATG/Met/출발 코돈이 4내지 18개 코돈에 의해 성숙 hIL-1β의 위치 5에 대한 TCA/Ser 코돈으로부터 분리되는 방식으로 플라즈미드 pUC 8에 삽입하면 성숙 hIL-1β의 아미노산 서열 또는 hIL-1β의 유도체를 함유하는 용성 단백질을이, 콜라이에서 고도로 발현시킬 수 있는 플라즈미드가 제공됨을 발견하였다.
본 발명자를은 성숙 hIL-1β의 N-말단 서열에서 아미노산이 번경된 hIL-1β의 유도체가 다양한 정도의 생물학적 활성을 나타냄을 발견하였다. 구성된 hIL-1β의 변경된 형태의 특별한 생물학적 활성은 성숙
hIL-1β에 비해 약 7배 증가에서 약 700배 감소까지의 범위이다. 이 결과는 성숙 hIL-1β의 N-말단 서열 구조가 본 분자의 생물학적 기능에 중요함을 보여준다. 본 결과는 성숙 hIL-lβ의 N-말단 서열, 특히N-말단 4개 아미노산 잔기가 이 분자의 생물학적 활성에 증가 또는 감소를 초래할 수 있는 구조적 변화의 표적임을 입증한다. 따라서 성숙 hIL-1β의 N-말단 서열에서의 변화가 hIL-1β의 생물학적 활성을 촉진하는데 사용될 수 있는 것으로 설명된다.
천연 hIL-1β보다 약 10%정도 활성이 더 큰 이 발명의 IL-1β 유도체는 천연 및 재조합 hIL-1β를 사용하는 방식과 같게, 예를들면 혈액 생성 촉진시키는데 사용할 수 있다[Oppenheim et aI.,ImmunoIogyToday 7 : 45-56(1986); Dinerello, Bull..Inst. Pasteur 85 : 267-185(1987)]. 천연 hIL-1β보다 약 10%정도 생물학적 활성이 낮은 이 발명의 IL-1β 유도체는 연구도구로, 예를들면 IL-1 생물학적 활성의 검정시 음성대조용으로 활용성을 갖는다.
이 발명에 의해 생성되는 단백질은 용성이다. 상기 단백질 발현 이.콜라이 세포를 초음파 파쇄 및 원심분리로 용해시킬 경우 단백질은 펠릿이 아닌 상등액에서 발견된다. 이런 이유로 상기 단백질은 쉽게 작용성형태로 균질하게 정제할 수 있다.
이 발명의 플라즈미드가 이, 콜라이 균주 JM l01에 함유되어 미생물 기탁에 대한 부다페스트 조약의 규정에 따라 미합중국 균주 보존 협회(American Type CuIture CoIlection : ATCC : 12301 ParklawnDrive,Rockville,MD,USA)에 기탁되어 있다. 기탁된 플라즈미드와 그들의 부여 번호는 다음과 같다 :
플라즈미드 ATCC 번호
pDP506 67302
pDP516 67303
pDP516 - 22ap 67304
DP516-18 67305
제 5 도 내지 제 8 도는 상기 플라즈미드의 DNA서열 및 이들이 발현시키는 단백질의 아미노산 서열을 가리킨다. 제 9도 및 제 10 도는 본 발명의 2개의 다른 플라즈미드, pDP 516-23 및 pDP 516-16의 DNA서열및 그들이 발현시키는 단백질의 아미노산 서열을 가리킨다. 제 3 도 및 제5 내지 10도에서 번호 1과 117은pro hIL-1β의 위치 117에 상응하는 성숙 hILr1β의 아미노 말단 1위치를 가리킨다. 번호 153 및 269는성숙 hIL-1β의 카복시 말단 위치 153을 가리키며 이는 pro hIL-1β의 위치 269에 상응한다.
플라즈미드 pDP 506은 pro hIL-1β의 아미노산 서열 116 내지 269를 암호화하는 HgiA I에서 Pst IDNA 단편을 pUC 8의 Pst I 부위에 삽입하여 제조한다. pDP 516 시리즈의 플라즈미드는 pDP 506를EcoR I 및 Sal I으로 분해하여 선형 DNA를 생성시키고, 선형 DNA를 Ba1 31 엑소뉴클리에이스로 분해하며,3' 제거된 말만을 클레나우 반응으로 채우고, 평활 말단을 T4 DNA 리게이스로 연결시켜 DNA를 재환형화시켜 제조한다.. 이 발명의 다른 플라즈미드는 또한 아래에 기술하는 바와같이 pDP 506으로부터 제조한다.
균주 JM 101의 이콜라이 세포를 상기 플라즈미드로 형질전환시키고 세포를 배양하여 단백질을 발현시킨다. 세포를 초음파 파쇄하고, 용균물을 원심분리하며, 상등액을 음이온 교환시키고, 컬럼 크로마토그래피를 분류하여 단백질을 균질하게 .정제한다.
표 I은 이 발명의 플라즈미드 약간을 수록하고 있으며 문헌[Lehninger,Biochemistry,Second Edition,p.72,Worth Publishers,Inc.(1975)]에 기술된 바와같이 아미노산 잔기를 나타내가 위해 단일 문자기호를사용하여 그들이 발현시키는 단백질의 아미노산 서열을 나타내고 있다.
[표 1]
Figure kpo00001
성숙 hIL-1β 및 및및 hIL-1β 유도체의 N-말단 서열이 표 1에 나타나 있다. hIL-1β-유도된 단백질은 표1에 나타낸 플라즈미드·발현 벡터를 사용하여, 이콜라이에서 발현시켰다· 이콜라이에서 발현된hIL-1β-유도된 단백질은 표1에 나타낸 서열앞에 N-말단 Met 잔기를 함유하는데(표시되지 않음), 이는 아미노펩티데이스의 작용에 의해 이콜라이에서 제거된다. 고유의 성숙 hIL-1β의 서열과 다른 hIL-1β의 유도체에 존재하는 아미노산은 표1에서 밑줄을 그었다.2개의 수평 열상에 있는 수는 pro-hIL-1β(윗열) 및 성숙 hIL-1β(아랫열)의 아미노산 잔기 번호를 나타낸다. 점선은 성숙 hIL-lβ의 위치 5 내지153에 상응하는 pro hIL-1β의 위치 121 내지 269사이의 정상적인 아미노산 잔기를 가리킨다.
pDP 506의 구성
제 1도 및 제 2 도에 따르며, 플라즈마드 pDP 506 제 l조의 출발물질은 플라즈마드 pcD 1218로 이 플라즈미드는 유럽 특허원공보 제0161901호 및 상술한 오론 등(Auron et al.) 및 로젠바세르 등(Rossenwasser etal.)의 문헌에 기술되어 있다. pro hIL-1β를 암호화하는 DNA를 함유하는 1.6킬로 염기쌍(Kb) 절편(제 2 도의 수평선)을 BamHI 분해시켜 pcD 1218로부터 절단해 낸다. 제 2 도는 pro 및 성숙 hIL-1β의 아미노- 및 카복시- 말단에 상응하는 1,348/351 및 807 뉴클리오타이드 위치뿐만 아니라 1.6Kb 절편에서의제한부위를 수직선으로 나타내고 있다.1.6Kb 절편을 플라즈미드 pUC 9(BRL 및 Pharmacia에서 시판)의BamHI 부위에 아클론화시켜 하이브리드 플라즈미드 pUC 9-pro hIL-1β를 제조한다. 플라즈미드pUC-pro hIL-1β는 2개의 Acc I 부위를 함유한다.1.6Kb pcD 1218-유도된 단편의 ACC I 부위(제 2 도)에서부터 pUC중의 Acc I 부위까지의 0.5kb 비-암호화 영역은 pUC 9-pro hIL-1β를 Acc I으로분해하여 결실시키고, 이어서 연결시켜 플라즈미드 pUC 9-pro hIL-1β△Acc I을 생성시키며, 이를 사용하여 pro hIL-1β를 암호화하는 DNA를 이.콜라이에서 증폭시킨다.
제 3 도는 pro hIL-1β의 아미노산 112 내지 269를 암호화하는 뉴클리오타이드 서열을 보여주며, 위치114 및 115 코돈에 있는 HgiA I 부위뿐만 아니라 pUC g-pro hIL-1β△Acc I에서 por hIL-1β암호화
서열로부터 하부로 약 150 뉴클러오타이드에 존재하는 Pst I 제한 부위를 나타내고 있다. 제 3 도 내지 제 5 도에서 수평 및 수직선은 표시된 제한효소에 의해 인식되고 절단되는 서열을 시킨다..
pDP 506을 구성하기 위해서는 pUC g-pro hIL-1β△Acc I 을 HgiA I 및 Pst I 으로 분해하여 0.6kb제한단편을 수득하고, 성숙 hIL-1β 암호화 서열을 함유하는 0.6kb 단편을 pUC 8의 Pst I 부위에 삽입한다. 제 4 도는 Pst I 부위 및 이 부위로부터 11개의 아미노산 코돈에 의해 분리되는 상부 ATG/Met/출발코돈을 함유하는 pUC 8의 부위를 보여준다. 비록 HgiA I 및 Pst I의 인식 부위는 상이하나, 효소에의해 생성된 3' 돌출말단은 동일해서 T4 DNA 리게이스로 HgiA I 말단을 Pst I 말단에 연결시킴으로써 둘중 어느 효소로도 인식되지 않는 서열을 생성시킬 수 있다.
제 5 도에 나타낸 바와같이 pDP 506은 pUC 8의 13개 코돈에 의해 선행되는 pro hIL-1β의 아미노산 위치 1l5 내지 269를 암호화하는 서열을 함유한다. pUC 8부터 ATG/Met 해독 출발코돈은 16개의 아미노산코돈에 의해 hIL-1β의 위치 3(Va1)의 코돈으로부터 분리된다.
pDP 516, pDP 516-l6,-18,-22a 및 -23의 구성
pDP 506, pDP 516, pDP 5l6-16,-18,-22a 및 -23의 구성방법이 제 1 도에 도식적으로 정리되어있다. 플라즈미드 pDP 506을 EcoR I 및 Sal I으로 분해하고 이 선형 DNA를 Ba1 31 엑소뉴클리에이스로 약 10 내지 15초 분해하여 두 본쇄의 양 말단으로부터 뉴클리오타이드를 제거한다. 이 분해 과정의 말기에 제거된 3' 말단을 클레나우 반응으로 채워넣고, 생선된 평활 말단을 T4 DNA 리게이스로 연결하여DNA를 다시 원형화한다. 이 결과 일군(pooI)의 플라지미드가 생성되며, 후에 단백질 발현분석 및 DNA서열화에 의해 pDP 516, pDP 516-16,-18,-22A, 및 23으로 분류한다.
제 5 도에 나타낸 바와같이 pDP 506은 pUC 8에 의해 기여되는 영역에 Sma I 및 BamH I을 함유하고,이는 또한 본 발명의 플라즈미드를 제공하기 위해 사용될 수 있다. pDP 12와 같이 1ac 프로모터를·함유하는 기타의 특정 플라즈미드도 본 발명의 플라즈미드를 생산키 위해 사용될 수 있을 것으로 예상된다.
본 명세서에 기술된 모든 DNA 조작은 문헌[Maniatis et al.,MoIecular C1oning,A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York(1g82)]에 기술된 시약 및 조건으로 수행하였다.
플라즈미드 pDP 506△Pst, phIL-lβ, pGly-3, pPro-3, pLeu-3, pThr-3, pIle-3, pGlu-4,pTyr-4 및 pLys-4의 구성
플라즈미드 pDP 506은 2개의.Hind III부위를 함유한다. Hind III부위 한개는 hIL-lβ 암호화 서열내에있다. 이 부위는 성숙 hIL-1β의 고돈 16에 상응하는 pro hIL-1β의 코돈 133을 포함한다. Hind III부위는 pDP 506의 hIL-1β 암호화 서열의 하부에 있는 pUC 8-유도된 절편내 Pst I 부위에 인접해서 존재한다. pDP 506 중의 pUC 8-유도된 Hind Ⅲ부위는 하기 방법을 사용하여 pDP 506△Pst를 산출한다. 플라즈미드 pDP 506을 Pst I 및 Ba1 31로 분해하여 연결시킨다. 엑소뉴클리에이스는 Pst I 부위 주변의 약75염기쌍을 제거한다. 따라서 인접한 Hind III 부위도 결실된다. 생성된 플라즈미드는 pDP 506△Pst로 표시한다. 플라즈미드 pDP 506△Pst를 EcoR I 및 Hind III로 분해하고 EcoR I 에서 Hind III까지의 올리고뉴클리오타이드를 암호화 본쇄(A A T T C C A T A G A G G G T A T T A C A T A T G G C A C C T G T A A G A T C T C T G A A C T G C A C G C T C C G G G A C T C A C A G C A A A A A)를 갖는 73염기쌍의 EcoR I -Hind III 올리고뉴클리오타이드로 대치시켜 hIL-1β의 성숙한형태를 암호화하는 플라즈미드 phIL-1β를 생성시킨다.73염기쌍 올로고뉴클리오타이드는 라이보좀 결합부위(밑줄 그음), 해독 개시 코돈 ATG(밑줄 그음) 및 IL-1β 암호화 서열에 자연적으로 존재하지 않는Bgl II 제한부위 (밑줄 그음)를 hIL-1β의 위치 4와 5의 아미노산 조성에는 변화가 없이 포함한다.
변경된 적절한 암호화 서열을 갖는 일련의 35염기쌍 올리고뉴클러오타이드(EcoR I에서 Bgl II까지)를만들고, 이를 사용하고 phIL-1β의 35염기쌍 EcoR I -Bgl II를 대치하여 N-말단내에 아미노산 치환체를 갖는 hIL-1β의 여러가지 유도체를 생성시킨다. 플라즈미드 발현 벡터 명칭,hIL-1β-유도된 단백질 명칭, 및 생성된 hIL-1β 유도체의 N-말단 서열이 표l에 나와있다.
형질전환, 발현 및 정제
앰피실린-감수성 JM l01의 이콜라이 세포를 플라즈미드 DNA로 형질전환시킨다. 앰피실린(100ug/ml)및 IPTG(이소프로파니티오-β-갈락토사이드)를 보충한 L 브로뜨(L Broth)에서 세포를 37℃로 회전 진탕기(l50 rpm)상 배양한다. 재조합 콜론을 30의 클레트기록(New York 소재의 KIett ManufacturingCompany의 Klett-Summerson Photoelectric Colorimeter로 측정) 까지 증식시키고 이때 IPTG를 최종농도 1mM까지 가한다. 세포를 추가의 특성확인을 위해 여러가지 시간대에 수거한다.500m1 배양액으로부터의 세포를 수거하고 초음파 파쇄용 완충액(50mM 트리스 pH 8.0,lmM EDTA,lmM DTT)50m1중에 재현탁하고 5m1용적으로 7 내지 10초동안 초음파 파쇄시킨다. 파쇄된 샘플을 4℃에서 5분동안 원심분리한다.상등액 및 괠릿을 분리한다. 초음파 파쇄물을 밀리포어(Millipore) 필터(0.45μ)로 여과하고 신크톰인고포레이티드(Synchrom,Inc., Linden,Indiana) 의 신크로팍(Synchropak) 이 온 교환컬 럼 (2.1× 25cm) 에 적 용한다. 이 단계 및 후속적인 크로마트그래피 단계에서의 hIL-1β 함유 분획을 단핵세포 hIL-1β에 대한 토끼의 폴리클로날(Polyclonal) 항체를 사용하여 웨스턴 블랏(Western Blot) 검정으로 확인한다. hIL-1β함유 분획을 모아서 AMICON 농축기로 한외여과시켜 ] 내지 3m1로 농축시키고, LKB 인스트루먼츠 인고포레이니드(LKB·Instruments,Inc.,Gaithersburg, MD)의 ACA싸이징(sizing) 컬럼 크로마트그래피(2.4×100cm)로 정제한다. 두 컬럼에 사용한 완충액은 50mM 트리스 pll 8,lmM EDTA,lmM DTT이다. 고유형태의 hIL-1β를 문헌[Matsushima et al.Biochem.25 : 3424--3429 : 1986)]에 기술된 바와같이 골수성 단포 THP-1 세포주로 정제한다.
겔 분석을 위해 샘플을 1mM DTT를 함유하는 래믈리(Laemmli)샘플 완충액(Gubler et al.J.Immuno1.
136 : 2492-2497)에 용해하고 3분동안 비등시키며, 파마시아 페스트 시스템(Phamncia Phast system)을사용하여 15% 아크릴아마이드 또는 8 내지 25% 구배 아크릴아마이드 겔을 함유하는 SDS-PAGE 수직 슬랩(slab) 겔(BilRad and Hoeffer apparatus)에 적용한다. 겔을 쿠마시 블루(cooniassie blue)로 염색하고재조합 hI1-1β의 분자량을 분자량 표준품(BRL 예비염색된 또는 Pharmacia 분자량 markers)을 사용하여선형 회귀(regresion)분석으로 계산한다.
웨스턴 블랏 분석은 문헌[Towbin et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA76 : 4350-4356에 기술된 바와같이수행한다. 이.콜라이 단백질을 SDS-PAGE로 간만히 분리하여 0.45mm 나이트로셀룰로오스 페이퍼상에 전이 블랏(transblot)시킨다.나이트로셀룰로오스페이퍼를 토끼항-hIL-1β항체와반응시키고 서양매운냉이(horseradish) 퍼옥시데이스 접합된 염소 양-토끼 IgG 항체(BiIRad, Richmond, CA)와 배양함으로써재조합 hIL-1β밴드를 확인한다 .
pDP 516계의 플라즈미드로 형질전환시킨 세포의 콜로니를 각각 채취하여 앰피실린 및 1ac 유도물질IPTG를 보충한 L 브로뜨 1m1에서 밤새 증식시킨다. 밤새 배양후 각 세포 배양물 0.5m1를 원심분리하고단백질 용해 완충액에 재현탁시키며 SDS-PAGE에 들어간다. pDP 516의 것과 대략 동일한 외관적 분자량을 갖는 hIL-1β를 고도로 발현시키는 형질 전환체를 선별한다. 각각의 동정 클론으로부터의 플라즈미드DNA를 단리하고 서열화하며 상술한 바와같이 정제한다.
재조합 플라즈미드 pDP 506 및 pDP 516계의 플라즈미드를 운반하는 세포를 IPTG의 존재하여 증식시키면 재조합 hIL-1β가 배양 4시간 후에 총 세포성 단백질의 주요산물(15 내지 30중량%)이 된다.IL.-1-유도된 용성 만백질을 신크로팍 음이온 교환컬럼을 사용하여 크로마토그래피시킬 경우 IL-1 유도된 단백질은 신크로팍 음이온 교환 컬럼으로부터의 유출물에서 상망히 유출된다. hIL-1β 함유 분획을 모은다. 순도는 SDS-PAGE 및 웨스턴 블랏 분석으로 판정하였을 매 95% 이상이었다 모은 분획을 ACA 싸이징 컬럼 정제법에 의해 정재한다. 재조합 hIL-1β 단백질은 이 단계 이후 99% 이상의 순도를 보인다. 단백질의엔도톡신 농도는 hIL-1β 단백질 mg 당 3mg 미만이었다.
재조합 플라즈미드의 동정은 DNA 서열화에 의해 판정한다. 직접적 플라즈미드 서열화는 문헌[Chen etal.DNA4 : 165-170]에 기술된 방법으로 수행한다. 합성 16-mer 올리고뉴클리오타이드(GTGGAATTGT
GAGCG)를 프라이버로 사용한다. 재조합 단백질의 동정은 아미노산 조성 및 아미노 말단 24개 아미노산의서열화로 확정한다· 정제된 단백질은 베크만 스피닝 컵 서열기 모델 890M(Beckman spinning cupsequencer mode1 890M)상에서 분석한다.
상술한 방법과 동일하게 플라즈미즈 pGly-3, pPro-3, pLeu-3, pThr-3, pIle-3, pGlu-4, pTyr-4 및 pLys-4를 사용하여, 이.콜라이를 형질 전환시키고 상응하는 단백질을 발현시키며 정제한다.
생물활성.
정제된 재조합 hIL-1β 단백질은 문헌[Lachman et al.Meth.in Enzymo1.116 : 467-479]에 기술된 표준쥐의 흉선세포(C3H/HeJ 마우스)증식법 및 표준 치육의 섬유아세포 프로스타클란딘 E2(GingivalFibroblast Prostaglandin E2 : PGE2생성 검정법}(PGE2RIA kit NEN Research Products, E.I. duPont de Nemours and Compant, N.Billerica,MA)에 의해 평가한다. DP 506의 생물학적 활성은THP-1 세포주로부터 유도된 고유의 hIL-1β것의 약 10%o1다. DP 516, DP 516-16 및 DP 516-23의생물활성은 고유의 hI1-1β와 동일하거나 약간 우수했다.
표2는 흉선세포 증식 검정법으로 측정한 hI1-1β, DP 516-22a, DP 516-18 및 Glu-4의 생물학적 활성이다.IL-1의 N-말단에서 알라닌이 트레오닌으로 치환된 DP 516-22a는 생물활성이 거의 4배나 증가했음을 보여준다. 처음 2개의 아미노산이 대치된 다른 변이체, DP 516-18은 약 7배나 증가된 활성을 보였다.
[표 2]
이.콜라이에서 발현된 변경된 N-말단 서열을 갖는 hIL-β 유도체의 생물활성
Figure kpo00002
a정제된 단백질을 흉선세포 중식 검정법으로 분석한다.1단위는 최대 촉진의 절반을 제공하는 물질의 양과 동일하다. 수치는 5회의 독립적인 실험에서의 ±SEM을 의미하며 성숙 단핵세포 hIL-1β에 대해 표준학한 것이다.
b단핵세포 세포주 THP-1로부터 유도된 고유의 성숙 hI1-1β.
hIL1-1β의 N-말단 서열의 시험은 IL-1β의 위치 4에서의 양자를 갖고 있는 아르기닌 잔기가 염-결함형성 또는 수소 결함에 가담하여 단백질을 활성 형태를 안정화시키는 역할을 하고 있음을 보여준다. 아르기닌을 글루탐산으로 치환한 것(Glu-4), 즉 DP 516-18과 비교해서 1개의 아미노산이 대치된 것은 특이활성이 약 700 내지 7000배 감소하였다. 이 결과는 위치 4의 양성으로 하전된 아르기닌 잔기가 hIL-1β의 생물학적 활성에 중요함을 보여준다. Lys-4와 같이 위치 4의 Arg을 Lys으로 치환하면 hIL-1β-유도된 단백질의 특이 생물학적 활성에 거의 변화가 없다.
hI1-1β유도체 Tyr-4에서와 같이 아미노산 위치 4의 Arg을 Tyr잔기로 치환하면 특이 생물학적 활성이약 10배 감소한다. 이 결과가 표 3에 나타나 있으며 여기에서 N은 흉선세포 중식 검정법을 활용한 시험의횟수를 나타낸다.
[표 3]
Figure kpo00003
a1단위는 최대 촉진의 절반을 제공하는 물질의 양과 동일함
b단핵세포 세포주 THP-1으로부터 유도된 고유의 성숙 hIl-1β와 비교하여 활성을 계산함.
요약하면 본 발명자물은 부위 특이성 돌연변이(site specific mutagepesis)를 사용하여 여러가지 정도의생물활성을 갖는 일련의 제조함 hIL-1β 유사체를 제조하였다. hIL-1β의 아미노-말단 서열을 조작하여천연 hIL-lb와 비교할때 생물활성이 증가 또는 감소된 제조합 단백질을 생성시켰다. 특히 본 발명자들은hIL-1β의 4번째 위치에 있는 아르기닌이 hIL-1β의 기능에서 중심 잔기중 하나임을 밝혀냈다.. 성숙hIL-1β의 N-말단 4개 아미노산 잔기내에서 특수하 수행된 치환은 상기 분자의 특이 생물수 활성을 변동시킴이 입증되었다.
DP 516 분류물을 아미노산 서열화로 확인할 경우 단백질 분자의 약 89%가 N-말단 트레오닌으로 시작하고 약 11%가 메타이오닌으로 시작됨을 발견하었으며, 이는 아마도 이.클라이 아미노 펩티데이스가 최초 아미노산 메타이 오닌을 불완전하게 제거함으로써 기인하는 것 같다. 혼합된 아미노 말단은 원핵생물 유전자 발현시 통상적인 현상이다. 비록 제5 내지 10도 및 표 1과 2가 트레오닌으로 시작되는 이 발명의 제조합hIL-1β 단백질을 가리키고 있으나 일부 상기 분자는 트레오닌 앞에 있는 메타이오닌으로 시작할 수 있다.
1ac 프로모터를 함유하는 플라즈미드 발현 벡터가 이.콜라이에서 hIL-1β 치환체 및 본 명세서에 특별히기술된 것물 이외의 결실 변이체를 고도로 발현시키기 위해 사용될 수 있음이 예상된다. 청구범위는 이런상응물을 보호하기 위한 것이다.
본 명세서에서 인용된 모든 출판물은 본 명세서에 그대로 삽입되어 있다.'

Claims (31)

  1. 실질적으로 플라즈미드 pUC 8 및 성숙(mature) hIL-1β의 아미노산 서열 5 내지 153을 암호화하는DNA로 이루어지고, pUC 8의 1ac 프로모터 하부에 있는 ATG/Met 해독 출발 코돈이 위치 5의 TCA Ser코돈으로부터 아미노산 코돈 4 내지 l8개의 간격을 유지하는, 성숙 hIL-1β의 아이노산서열 5 내지 153을 함유하는 용성 단백질을 이.클라이
    Figure kpo00004
    에서 고도로 발현시킬 수 있는 플라즈미드.
  2. 제 1 항에 있어서, 성숙 hIL-1β의 아미노산 서열 5 내지 153을 암호화하는 DNA 절편이 pUC 8의Pst I부위에 삽입된 플즈미드.
  3. 제 2 항에 있어서, ATG/Met 해독 출발 코돈이 TCA/Ser 고돈으로부터 4 내지 8개 코돈의 간격을유지하는 플라즈미드.
  4. 제 3 항에 있어서, ATG/Met 해독 출발 코돈이 TCA/Ser 코돈으로부터 서열 Thr Asn Ala Pro ValArg을 암호화하는 6개 코돈의 간격을 유지하는 풀라즈미드.
  5. 제 4 항에 있어서, pDP516, 즉ATCC부여 번호67303인 플라즈미드.
  6. 제 3 항에 있어서, ATG Met/출발 코톤이 TCA/Ser 코돈으로부터 서열 Thr Pro ValArg을 암호화하는 4개 코돈의 간격을 유지하는 플라즈미드.
  7. 제 6 항에 있어서 pDP 516-22A, 즉 ATCC 부여번호 67304인 플라즈미드.
  8. 제 3 항에 있어서, ATG Met/출발 코돈이 TCA/Ser 코돈으로부터 서열 Thr Met Val Arg을 암호화하는.4개 코돈의 간격을 유지하는 플라즈미드.
  9. 제 8 항에 있어서, pDP 516-18, 즉 ATCC 부여 번호 67305 플라즈미드.(국내기탁,1988.9.l2,KFCC-10643) .
  10. 제 2 항에 있어서, ATG/Met 해독 출발 코돈이 TCA/Ser 코돈으로부터 서열 Thr Met Ile Thr AsnSer Arg Gly Set Val Asp Leu His Asp Ala Pro Val Arg을 암호화하는 18개 코돈의 간격을 유지하는 플라즈미드.·
  11. 제 9 항에 있어서, pDP 506, 즉 ATCC 부여번호 67302인 플라즈미드.
  12. 제 1 항에 있어서, ATG/Met 해독 출발 코돈이 TCA/Ser 코돈으로부터 4개 코돈의 간격을 유지하는플라즈미드.
  13. 제 12 항에 있어서, 4개 코돈이 Thr Met Gly Arg을 암호화하는 플라즈미드.
  14. 제 12 항에 있어서, 4개 코돈이 Thr Met Rro Arg을 암호화하는 플라즈미드.
  15. 제 12 항에 있어서, 4개 코돈이 Thr Met Leu Arg을 암호화하는 플라즈이드.
  16. 제 12 항에 있어서, 4개 코돈이 Thr Met Thr Arg을 암호화하는 플라즈미드.
  17. 제 12 항에 있어서, 4개 코돈이 Thr Met Val Glu을 암호화하는 플라즈미드.
  18. 제 12 항에 있어서, 4개 코돈이 Thr Met Val Tyr을 암호화하는 플라즈미드.
  19. 제 12 항에 있어서, 4개 코돈이 Thr Met Val Lys을 암호화하는 플라즈미드.
  20. 제 12 항에 있어서, 4개 코돈이 Thr Met Pro Val Arg을 암호화하는 플라즈미드.
  21. 제 1 항의 플라즈미드로 형필전환된 이.콜라이세포.
  22. 제 21 항에 있어서, 이.콜라이 균주가 JM 101인 세포.
  23. (1) 이.콜라이 세포를 제 1, 7, 9, 12, 15, 19 또는 20항중 어느 하나의 하이브리드 플라즈미드로 형질전환시키고,(2) 상기 세포를 배양하여 단백질을 발현시키며,(3) 상기 단백질을 균질하게 정제함을 포함하여용성 단백질 이.콜라이에서 고도로 발현시키는 방법.
  24. 위치 1 내자 4의 1개 이상에서 아미노산 치환체를 갖는 성숙 hIL-1β의 유도체.
  25. 제 24 항에 있어서, 위치 1 내지 2의 어느 1개 또는 2개에서만 아미노산 치환체를 갖는 유도체.
  26. 제 25 항에 있어서, 위치 1에서 아미노산 치환체를 갖는 유도체.
  27. 제 26 항에 있어서, 치환제가 Ala 대신 Thr인 유도체.
  28. 제 25 항에 있어서, 위치 1 및 2에서 2개의 아미노산 치환체를 갖는 유도체.
  29. 제 28 항에 있어서, 치환체가 Ala 및 Pro 대신 각각 Thr 및 Met인 유도체.
  30. 제 24 항에 있어서, 위치 1 내지 3에서 3개의 아미노산 치환체를 갖는 유도체..
  31. 제 30 항에 있어서, 치환체가 Ala, Pro 및 Arg 대신 각각 Thr, Met 및 Glu인 유도체.
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