JPS617296A - インタ−ロイキン１の遺伝子の精製、クロ−ニング及び特性づけ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 肢歪且豆 本発明はインターロイキｙ　１　（以下ｒ　Ｉ　Ｌ　−
Ｉ　Ｊと称する）に関する。より詳しくは、精製された
ＩＬ−１，ＩＬ−１の等質状態への精製方法、精製され
たＩＬ−１のアミノ酸配列から得られる合成オリゴヌク
レオチドノローゾを使用してＩＬ−１の遺伝子をクロー
ニングしてＩＬ−１メツセンジヤーリホ核酸（ｒｍＲＮ
ＡＪ　）から合成される相補的デオキシリボ核酸（「ａ
ＤＮＡＪ）ライブラリーなスクリーニングすること、及
びスクリーニングされたＩＬ−／遺伝子の特性づけに関
するものである。

発明の背景 従来文献におりて「リンパ球活性化因子Ｊ即ち「ＬＡＦ
Ｊとして知られて込るＩＬ−／はマクロファージにより
免疫応答を行いながら産生されるホルモンである。この
蛋白質因子は広範囲の免疫学的及び非−免疫学的応答を
支配する。例えば、！Ｌ−／は、内因性成因は白血球発
熱物質、Ｂ−細胞活性化因子（ＢＡＦ）、表皮胸腺細胞
活性化因子（ＥＴＡＦ）、白血球内因性メディエータ（
ＬＥＭ）、慢性関節リエーマチにおける骨吸収因子及び
各種のその他の活性として称されてＡる活性を仲介する
ものと考えられている。その様なものとして、ＩＬ−／
は上記活性を含むものとして本発明において定義される
免役応答の治療の仲介を行うものとして有望である。

（１０−］） 研兜者はこれまでにＩＬ−／の多くの生物学的特性を明
らかにしてきたが、しかし、このホルモンの化学的性質
はよく理解されてｂない。今日まで、これは少なくとも
部分的に必要な研究を行うために十分な縫の梢製された
形態でのＩＬ−／が利用可能でなかったことにより妨げ
られてきたものである。

過去に２いて、ヒト及びネズミ源から得られたＩ　Ｌ　
−／を梢製し、部分的に特性評価を行う試みがなされて
いる。例えばマイゼエル（Ｍｌｚｅｌ、／、２，２Ｊ、
　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　２１６７−．２／７．２　（／り
７り）〕はマクロファージ細胞系統Ｐ３１ｒｌＤ１から
のネズミＩＬ−／の産生を報告している。培養液からの
ＩＬ−／が（ｌｉｆｌアンモニウム沈殿、ジエチルアミ
ノエチル（ｒＤＥＡＥＪ　）セルロースカラムクロマト
グラフィー、限外濾過及び８ｅｐｈａａｒｙｌ　Ｓ　、
２００カラムクロマトグラフイーに付された。得られた
活性画分は／、２．θθθ〜／ｌ、θθＯダルトンの範
囲の分子量を二何することが判明した。ポリアクリルア
ミドゲル中における等′嘔点゛亀気体動によりＩＬ−／
のｐｌ（ｌ／〕 はＪ、０−ｊ、４ｔの範囲にあることが判明した。

引き続く報告にお込て、マイゼエル等（Ｍｌｚｅｌｅｔ
　ａｌ、、／、２１　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３４１−
ＩＪ７Ｃ／り！／）〕は、上掲のマイゼエルの文献にお
−で使用された同一のＰ３ｔｒＤ、細胞系統からのＩＬ
−／を硫酸アンモニウム沈殿、フェニルセファロースク
ロマトゲラフィー、Ｕｌｔｒｏｇｅｌ　ＡｃＡ　Ｉｌｌ
ゲルｆ過クロりｖトゲラフイー及びｖｉＡ製用平坦−床
ＩＥＦにより「見かけ上の等質状態」までａ製すること
を論じている。得られたＩＬ−／は約弘Ｊ−！、／のｐ
ｌ及び約／４’、θＯθダルトンの分子量を有すること
が判明した。

ブライデス等（Ｂ１ｙｄ＠ｍ　　ａｔ　ａｔ、　／　／
Ｉ　Ｊ、　ｒｍｍｕｎｏｌ／ｌ、３／−１６３ｇ（／り
７７）〕　は５ｌｐｈａｄｓｘ　Ｇ　−／　００カラム
クロマトグラフイーによりにトの末梢血液白血球から調
製されたＩＬ−／の濃縮方法を開示した。との方法は粗
製ＩＬ−／の≠〜ｊ倍の濃度が得られると報告された。

粗製ＩＬ−／の調製の際に使用された血清からアルジミ
ンを除去するためにＤＥＡＥ　−Ｂｌｏ　−Ｇｅｌ　Ａ
アニオン交換クロマトグラフィーが使用された。次−で
集められた活性画分がヒドロキシアパタイトカラムに吸
着され、次いでＣＭ　−Ｂｌｏ　−Ｇｅｌ　Ａ　カチオ
ン交換樹脂に適用された。これらの研究者はこれらの操
作により約、１ｏｑ６の最初のＩＩ、−／が回収された
と報告している。得られたＩＬ−／は約７３，０００ダ
ルトンの分子量及び約＆、ｆ〜７．−のｐＩを有するこ
とが判明した。

トガワ等（Ｔｏｇａｗａ　　ａｔ　ａｌ、、　／、２．
２　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ。

、２／／、２〜．２／／ｒ　（／り７り）〕によりヒト
白血球から調製された粗製ＩＬ−／を先ず膜沢過に付し
、次いでＢｌｏ　−Ｇｅｌ　Ｐ−１００りｏ’ｖトゲラ
フイーカラムにかけたところ、これは２個の主たる活性
ピークを示し、その一つは１．２，０００〜．２コ、ｏ
ｏｏダルトンの範囲にあるピークをもう一つは約ｒｏ、
ｏｏ。

〜７θ、０００　ダルトンの範囲のピークを示した。

低分子量領域の活性画分をプールし、次いで青色５ｅｐ
ｈａｒｏｓｅカラム、ＤＫＡＩＤ−セルロースイオン交
換クロマトグラフィーカラム及びヒドロキシルアパタイ
トクロマトグラフィーカラムにかけた。トガワ等はこれ
らの操作の各々から得られる低分子量ＩＬ−／活性が、
２チのヒト血清で戻され、濃縮され、及びＢｏｏ　−Ｇ
ｅｌ　Ｐ　−１００上で再りｏ’ｖトゲラフを行なわれ
ると和尚な部分の高分子薫活性が出現することを発見し
た。

うｙ　ハ”ｑン（Ｌａａｈｍａｎ、　弘、２　Ｆａｄｅ
ｒａｔｌｏｎ　Ｐｒｏａｅｅ−ｄｌｎｇｓ　ｊ６ｊｓ’
　−，２６１７！　（／りｔ３）〕は、急性単核細胞白
血病或いは急性骨髄性単核細胞白血病患者から得られた
末梢血液単核細胞或いは自作病細胞からＩＬ−／を調製
することを報告した。殆んどの血清蛋白質から低分子量
活性を分離するために中空糸透過沢過及び限外沢過が使
用された。この低分子量活性はアンホリン（Ａｍｐｈｏ
ｌｌｎｅ　）及びシ胃糖勾配中におけるＩＥＦに付され
た。この方法によシＩＬ−／活性は約ｔ、ｌ〜７．−の
ｐｒ及び約／／、０００ダルトンの分子′計を有するこ
とが判明した。ラッハマンは上記方法からのＩＬ−／活
性の全体回収率は悪く、約４Ｌ％の範囲であると報告し
た。

適量の均質なヒ）ＩＬ−／の利用可能件、は関節（／ｌ
） 炎及びエリテマトーデスなどの自動免疫障害の研究及び
可能性のある治療におりて貴重であり得る。

又、これまでに利用可能であったよりもより純度が高く
且つ多量のヒ）ＩＬ−／は首尾よく傷及び火傷の治癒を
達成するために有用となり得るものである。

比較的多量の均質なヒ）ＩＬ−／を提供するための潜在
的な方法は組み換えＤＮＡ技術によるものである。組み
換えＤＮＡ技術は、蛋白質をコードする遺伝子が一度単
離され、且つ同定されると所望の蛋白質を経済的に製造
するために開発されてきた。その様な蛋白質製造のため
の組み換えＤＮＡ技術の説明は５ｏｌａｎｏｅ誌の／り
を巻（ｌり７７年ｖ月）の編集及び賛助論文に示されて
いる。しかしながら、この文献に論じられている組み換
えＤＮＡ技術を利用するためにはヒトＩＬ−／をコ序す
る遺伝子を先ず単離しなければならない。

発明の概要 本発明はＩＬ−／、ヒ）ＩＬ−／の等質状悲までの精製
、及び等質ＩＬ−／のアミノ酸組成及び部分的アミノ酸
配列の決定に関するものである。

本発明に従えば、ＩＬ−／の粗製調製物をイオン交換ク
ロマトグラフィーとアフィニティークロマトグラフィ一
方法との組み合わせにより精製された。この精製方法の
アフィニティークロマト−！−５−グラフィ一部分は不
溶性マトリックスに結合した染料配位子を利用した。従
来技術に基づ込て、同一の精製方法は他の哺乳動物種、
例えばネズミ、ウシ、あるーはブタのＩＬ−／からのＩ
Ｌ−／に対して首尾よく使用することが出来るものと思
われる。

一度等質状態にまで精製されると、ＩＬ−／分子のアミ
ノ酸組成及び配列が分析された。分子のアミノ酸組成は
アミノ酸アナライザーを使用して確認された。ＩＬ−／
分子のＮ−末端部分のアミノ酸配列は、直接エドマン（
Ｅｄｍａｎ）分解技術によシ、又、最初に分子を分別し
、高圧液体クロマトグラフィー（ｒＨｐＬｃＪ　）によ
り断片を分離し、次いでＩＬ−／ペプチドを含有するＨ
　Ｐ　Ｌ　Ｃ画分をエドマン分解法により分析すること
により求めた。

本発明の更に別の側面に従えば、ヒ）ＩＬ−／をコード
する遺伝子がｅ　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリーから上記の如
く求めたヒ）ＩＬ−／のアミノ酸配列の部分に対応する
合成オリゴヌクレオチドプローブを用いて単離された。

全ヒ）ＲＮＡは比較的高割合のＩＬ−／を産生ずると考
えられた細胞から抽出された。ポリアデニル化ｍ　ＲＮ
　Ａは全ＲＮＡ抽出物から単離された。ａＤＮＡライブ
ラリーはサイズ分ＷＩ！ポリアデニル化ｍ　ＲＮ　Ａの
逆転写酵素による逆転写によって構成された。ＤＮＡは
ＤＮＡポリメラーゼ■を用いて二本鎖にし、適当なりロ
ーニングベクター中に挿入した。得られた組み換えクロ
ーニングベクターを使用して適当な宿主を形質転換させ
た。

形質転換された宿主を同定し、プールに組み分けした。

これらのプールから調製されたプラスミドＤＮＡを放射
線標識されたオリゴヌクレオチドプローブとハイブリッ
ド化した。プローブに対して陽性の信号を与えたクロー
ンのプールを同定Ｌ、次いで推定されたプールを小分け
し、ハイブリッド化スクリーニングを繰返した。この操
作により単一の形質転換体を最終的に同定した。この形
質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、制限エンドヌ
クレアーゼ消化によｐ特徴付けを行った。このＩＬ−／
遺伝子を配列して、その核酸及びアミノ酸組成を確立し
た。又Ｉ　Ｌ　−／：Ｒ伝子をＥ。

ｃａｌｌ／酵母細胞系中でクローニングして成熟ＩＬ−
／を発現させ、次いで生物学的アッセイを行って発現さ
れた蛋白質生成物がＩＬ−／であるととを確認した。

ＩＬ−／の粗製調製物は末梢血液白血球から調製される
。白血球は全血から周知の技術、例えば所定量のＦｌｏ
ｏｌｌ／Ｈｙｐａｑｕａ溶液に対する遠心分離などの技
術により分離される。血液から取り出された白血球はＩ
Ｌ−／分泌を誘発する適当な刺戟剤を含有する培養培地
中においてｉｎ　ｖｌｔｒｏで培養される。最適な培−
４勘間後に上澄液を遠心分離により取得し、使用される
まで貯蔵される。

全血から取り出される白血球から得る代りにむしろＩＬ
−／は又任童の単核細胞に富んだ源から得られる単核細
胞から調製することが出来る。その様な単核細胞源とし
ては、単身白血病性肺臓細胞、リンパ細胞及び肺胞マク
ロファージなどがＭげられる。

末梢血液白血球を培養するために使用される培地は市販
の培地、例えばイーグルの最小必須培地（ｒＭｌｌｉ：
Ｍｌ　）或いはＲｏａｗｅｌｌ　Ｐａｒｋ　Ｍｅｍｏｒ
ｉａｌＩｎａ日＋ｔｕｔｓ　（ｒＲＰＭＩ　Ｊ　）培地
により構成することが出来る。個々に或すは組み合わせ
て培養培地中に添加することのできる添加剤としては、
グルタミン、ＨＥＩ：ＰＥＳ緩衝液及びゲンタマイシン
、ペニシリン、ストレフトマイシンｔＫトノ各褌抗生物
質が挙げられる。過去に２いては、血清も又通常添加剤
として使用されていた。しかしながら、本発明者等は、
本発明の方法においては血清が培養液中に使用されない
場合に、培養土漬液からのＩＬ−／の梢製が容易に行わ
れることを見出した。血清を使用しなｈ場合には、培養
液中に産生されるＩＬ−／の量が３〜≠倍減少するが、
血清がな−と又産生される全蛋白質がｉｏｏ倍減少し、
それはＩＬ−／のｆｌ＃製に含まれる複雑さを少なくす
るものである。

本発明について使用される好ましい刺戟剤としては、ス
タフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙ−１ｏｏ
ｏａｏｕｍ　ａｕｒｅｕ＠）　、或いはエシェリヒア瞼
コリ（［Ｅ、　ａｏｌｌＪ　、　Ｅａｏｈｅｒｉｏｈｌ
ａ　ｏｏｌｉ　）から抽出されたりボボリサッヵライド
（ｒＬＰｓＪ）が挙げられる。更に、ホルボールエステ
ル類、例えばホルボールミリステート７３−アセテート
を刺戟剤として使用することが出来る。

白血球を培養してＩＬ−／の分泌を誘発する方法は各種
環境条件下において行うことが出来る。

しかしながら、好ましくは約３５〜３ｇ℃の温度朝間に
おいて空気巾約ｊ〜７０％Ｃ０２の加湿化雰囲気内にお
いて維持されるのがより。末梢血液白血球を活性化剤に
より刺戟することにより放出される■Ｌ−／の量は時間
と共に変化する。本発明者等は〜７２ ＩＬ−／発現の最適割合は刺戟後約ＷＢにお因で到達す
ることを見出した。

ブツセ４フ分性 本発明において、ＩＬ−／活性度及び本発明の′Ｎ製、
クローニング及びＩＬ−／発現操作の際の試料の蛋白質
含量を追跡するために胸腺細胞増殖アッセイ、ＩＬ−／
転換アッセイ及び蛋白質アッセイが使用される。又、ｓ
ｉ操作の際のＩＬ−／活性を分析するためにドデシル硫
酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（「５
Ｄｓ−ＰＡＧＥＪ　）及び二次元ゲル電気泳動が使用さ
れる３、胸瞭細胞増殖アッセイ このアッセイはＩＬ−／の試料のＣＤ−／マウスに由来
する胸腺細胞の増殖を誘発する能力を誘発する能力を確
認するものである。このアッセイにおいて、１０−　／
２週令のＣＤ−／ｆｆウス（ＣｈａｒｌｅａＲｌｖｅｒ
　Ｂｒｅｅｄｉｎｇ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｌｅａ　、
ノリ２ランド州、ウィルミントン）から得られた約７×
１０’個の胸腺細胞を３倍達次希釈のＩＬ−／含有試料
の存在下において丸底マイクロプレートウェル（Ｃｏｒ
ｎｌｎｇ　Ｐｌａａｔｌｏａ、二ニーヨーク州、コーニ
ング）に植付ける。胸腺細胞は、ＳＯ単位／ｍ、ｌ　（
ｒＵ／ｍＡｔＪ　）のペニシリン、ｊＱマイクログラム
／ｍ１（ｒμｔｔ／ｒｒｔ１．Ｊ）のストレプトマイシ
ン、コミリモル（ｒｒｒ＋ＭＪ）のグルタミン、０．２
ｍＭのゲンタマイシン、１０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液、（
−緒に「補給ＭＥＭ」と称する）、ｐＨ７，４Ｚをｊ　
％　Ｖ／ｖヒト血清及ヒ１０−’モル（ｒＭＪ）、２−
メルカプトエタノールと共に含む／６０マイクロリット
ル（「μｌ」）のＭＥＭ中において培養される。試料は
空気中ｒ％ＣＯ２の雰囲気内で３７℃におりて７．２時
間　培養される。その後、培養物を約Ｖ時間０．１マイ
クロキューリ（「μＣ１」）のトリチウム化したチモジ
ン（ｒ　’Ｈ−ＴｄｒＪ　）　（Ｎ＠ｗ　Ｅｎｇｌａｎ
ｄ　Ｎｕｏｌｅａｒ　、　マサチューセッツ州、ボスト
ン１．２　Ｃ１７ｍＭ特異活性）でパルス処理した。そ
の後培養物を例えば多重自動化試料採取器を用いてガラ
ス繊維フィルター片上に採取する。５Ｈ−Ｔｄｒの導入
は次すで液体シンチレーション計数により測定される。

この操作の詳細はギリス停により開示されてｂる（Ｇｌ
ｌｌｌａ（帽 ｅｔ　ａｌ、、／２０　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　　、２
０Ｊ７（／り７ｇ）〕。

との胸腺細胞増殖アッセイ方法により、ＩＬ−７の存在
下において培養されたＣＤ−／胸腺細胞のみが照射線量
に応じて’Ｈ−Ｔｄｒ　　を導入する。

ＩＬ−／の不存在下に培養されたＣＤ−／細胞はバック
グラウンド水準の　Ｈ−Ｔｄｒを導入するにすぎない。

ＩＬ−／活性は、上掲のギリス等によりインターロイキ
ン−２活性を求めるために使用された操作と同様にして
　Ｉ（−Ｔｄｒ導入データの線状部分から計算される。

ＩＬ−／活性の単位は実験室の標準に対比して最大胸腺
細胞’Ｈ−Ｔｄｒ導入のＳθ俤を発生する試料の希釈率
の逆数として求められる。例えば、ある試料が柴犬胸腺
細胞５Ｈ−Ｔｄｒ導入の５ｏ（４を／Ｉ／！；の希釈率
で発生するならばｆＬ−／のｌ単位（ｒＵＪ　）はｉｓ
ｏμｌアッセイ容積の／／ｉｓに見出され、即ち１０μ
ノが活性のｌＵを含有すると込うことができる。従って
、全試料は１００ＵのＩＬ−／活性／　ｍ、ｌを含有す
ることになる（　１０００　（羞１／罰）＋１０μｌ！
（Ｕ肖り）〕（上掲のギリス等の文献診照）。

（，２Ｊ） ＩＬ−／転換アッセイ ＩＬ−／活性の第コの代替的アッセイ法は、ＩＬ−／は
、本発明者尋によってインターロイキンーコ（ｒＩＬ−
λ」）非産生体ネズミ肺瘍＾ｉｌｌ胞系統、　Ｌ　Ｂ　
ＲＭ　−３３−／ｌ１ｔ３．をＩＩ、−λ産生体に転換
すると見い出されたギ実を利用するもので、この方法を
用いることができる。このアッセイにおりて、ＬＢＲＭ
−ＪＪ−ＩＡ５細胞、ＡＴＣＣ隘ＣＲＬ４０７りはｔｏ
μｐ／ｍｌのミドマイシンＣを添加して不活性化され、
３７℃で７時間インキスペードされる。／　００ｍｌの
不活性化ＬＢＲＭ−３３−ＩＡ５細胞（ｓｘｉｏ細胞／
ｍｌ）　　はＩｌ、−／含有液体試料の逐次希釈液と共
に等容量の有糸分裂促進剤（ミトゲン）フィトヘムアグ
ルチニン（ｒｐＨＡＪ）（／優最終濃度）の存在下にお
りてり６−ウェル平底プレート中において培養する。６
〜２４時間後１脩（↓−４Ｉ　Ｌ　−／誘発、ミドマイ
シンＣ−抑制のＬＢＲＭ−ｊＪ−ＩＡ５細胞（従って、
ＩＬ−／活性）により発生されたＩＬ−λの活性の存在
をｊＯμｌのＩＬ−、，２依存性Ｃ４’ＬＬ−，２Ｍ胞
（ｒ×１０１１細胞／　ｍｌ　）を添加して直接的に確
認する。

マイクロウェル培養物を更に９時間インキュベート後、
０．５μＣＩの５Ｈ−Ｔｄｒによりダ時間のパルス処理
を行５　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ、
　ｖサチューセッツ州、ボストン、−２Ｃ１／ｌηＭ特
異活性〕。

その後、チミジン−パルス処理された培養物を多重自動
化試料採取器（ＭＡＳＨＩＩ　；Ｍｉａｒｏｂｌｏｌｏ
−ｇｉａａｌ　　Ａａａｏｃｌａｔｅｉ＋　、メリーラ
ンド州、ベテスダ）を用いてガラス繊維フィルター片上
に採取する。’Ｈ−Ｔｄｒ導入は液体シンチレーション
計数によジ測定する。この方法の詳細は上記ギリス等の
文献及び米国特許第ｇ　４ｔ／　／、り２２号明細書に
示されている。このアッセイにおりては、ＩＬ−一の存
在下において培養されたＣＴＬＬ−λ細胞のみが照射ａ
ｔに応じて５Ｈ−Ｔｄｒを導入する。ＩＬ−，２（従っ
てＩＬ−／）の不存在下に蕊・いて培養されたＣＴＬＬ
−，２ｉ胞はバックグラウンド水準の’Ｈ−Ｔｄｒを導
入するにすぎない。この「転換」アッセイはより迅速で
ある（、２ヒ時間以内に完結）ということ、及び上記胸
腺細胞増殖アッセイよりも／、　０００−７０．０００
倍感度が高いという利点を有する。しかしながら、「転
換」及び「増殖」の両アッセイを本発明にお込て使用す
ることが出来る。１蛋白質アツセイ 精製試料の蛋白質含量は旧ｏｒａｄ社（カリフォルニア
州、リッチモンド）から市販されている旧ｏｒａｄ蛋白
質アッセイにより求められる。このアッセイはウシ血清
アルブミンを標準として用いるものである。このアッセ
イの原理及び詳細はブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒ
ｄ　、　７．２　Ａｎａｌ、　Ｂｌｏ−ｏｂａｍ、　　
、２弘了（／り７ｔ）〕に論じられている。

ゲル電気泳動 培養上澄液及びクロマトクラフィーカラム画分は５ＤＳ
−ＰＡＧＥにより分析して本発明のＩ＃製操作を追跡す
る。このアッセイはレムリ（Ｌａ＊−ｍｍｌｌ、２２７
　　Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ　）Ａｔθ（／り７
０）〕のゲル重層方法に従りて行われる。このアッセイ
はｌｏ−，２ｏ％勾配のポリアクリルアミドゲルを用い
る０、７１ｍｍのＳＤＢ　　スラブゲルな用いるもので
ある。これらのゲルは−にの３ｏｍｈ電流におい（易） て運転される。得られたゲル試料は例えばオークリ−等
（０ａｋｌｅｙ　　ｅｔ　ａｌ、、　　＃）ｊＡｎａｌ
、Ｂｌｏａｈｅｍ−３ｔ／　（／りざＯ）〕　によｅｔ
Ｈ己滅されている方法により銀染色される。

高塩濃度を含有するこれらのアッセイ試料は先ず０．／
　ｍＭ　ＮＨ４ＨＣＯ３中のθ、００／％ＳＤＳに対し
て透析され次いで真空乾燥される。乾燥残流を５ＤＳ−
ＰＡＧＥ操作に先立ち還元緩衝液（，２１ＳＤＳ）、／
１．２−メルカプトエタノール中に溶解する。。

二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動本発明のｆ＃製
操作完結後にＩＬ−／をサモンズ等（Ｓａｍｍｏｎｓ　
　ａｔ　　ａｌ、、　　λＥｌａｏｔｒｏｐｈｏｒｅａ
ｉａ１３ｊ（１９Ｉｒ／）〕　によｐ記載されている方
法により二次元ボリアクリルアミドゲル電気泳動により
分析する。との方法にお込ては、凍結乾燥されたＩＬ−
／試料を水中／　Ｔｏ　（ｗ／Ｖ）シクロヘキシルアミ
ノエタン１．２９６　（Ｗ／ｖ）　８　Ｄ　Ｓ　、λチ
コーメルカブトエタノール、ｉｏｎグリセロールで構成
されたＳＤＳ可溶化緩衝液、２０μ！中に再懸濁さくコ
ア） せる。これらの試料を／θθ”ＣＩｃ　／θＡ■加熱す
る。２時間のプレフォーカシング後試料（１０゜℃にお
いてＳＤＢ中で７０分間可溶化）を第一次元のゲルに適
用し、１００ボルトの定電圧において、２０時間フォー
カシングな行なう。第一次元のフォーカシングゲルを直
接的にｐＨ勾配ゲル走査針によｐ走査する。その後ゲル
を平衡化緩衝液〔水中２．Ｊ　％　（Ｖ／ｖ）グリセロ
ール；　ｊ（１）％（Ｖ／ｖ）Ｔｒｉａ−８ＤＳ緩衝液
（ＪＯＩ／　Ｔｒｉｍ、コｌ／Ｄ８Ｄ／ｌ。

濃ＨＣによ、Ｑ　ｐＨｊ、ｒにｖ４製）、／　’１６　
（ｗ／Ｖ）８　Ｄ　Ｓ　；　ＯＪ　％　（ｖ／Ｖ）　、
２−メルカプトエタノール〕中で２分間濯ぎ、第二次元
ゲル上の頂部におき、法論で低温溶融アガロースで覆う
。第二次元電気泳動（アクリルアミドの１０−．２０優
線状勾配）を染料前面がゲルの底部に達するまで弘Ｏｍ
Ａ／ゲルの定電流において行なう。１０％（ｖ／ｖ）エ
タノ。

−ル及び１０９ｂ　（ｖ／Ｖ　）氷酢酸中で固定後、ゲ
ルを上掲のサモンズ等の文献における色硝酸銀法により
染色する。

上記方法により調製された血液白怖球培養物から得られ
る上澄液は、カチオン交換クロマトグラフィー、アニオ
ン交換クロマトグラフィー、及びカラムマトリックスに
結合された染料配位子を用いたアフィニティクロマトグ
ラフィーにより精製される。全てのクロマトグラフィー
画分はＩＬ−ｌ活性及び蛋白質濃度が分析される。適当
な場合にはｐＨ及び伝導率が測定される。各クロマトグ
ラフィ一工程の後に、試料をＳＤＳ　−ＰＡＧＥで分析
する。更に、アフィニティクロマトグラフィー操作の完
結後に活性画分を上記二次元ポリアクリルアミドゲル電
気泳動によシ分析する。

カチオン交換クロマトグラフィー用の適当なカラムはス
ルホプロピルセファデックスＣ−２１（Ｃ−２１（Ｐｈ
ａｒ　　Ｆｉｎｅ　　Ｃｈｅｍｌａａｌｍ　、　　二！
−ジャージ州、ビス力タウェイ）によシ構成される。好
ましくは、カラムはＩＬ−／試料の適用前に緩衝液で平
衡化され、次いでＩＬ−／試料がカラムに適用された後
にＩＬ−ｌ活性の溶出を行うことなく非結合蛋白質を除
去するために同−緩衝液或いは異った緩衝液で洗浄する
。ＩＬ−／のカラムからの溶出はＩＬ−／をカラムから
解離するために十分なｐＨの綴部化された溶離剤を用す
て行われる。

カチオン交換クロマトグラフィー法からのプールされた
活性画分は更にアニオン交換クロマトグラフィーによｐ
ｆｌＩｌ製される。本発明者等はこの目的のために適し
た適当なカラム材料はＤＥＡＥ−セファセル（５ｅｐｈ
ａｏｅｌ　）であることを見出した。。

Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ　−５ｅｐｈａｏｅｌカラムを緩衝液で
平衡化させ、試料濃縮液をカラムに適用する３、溶出は
先ず出発緩衝液で行い、引続き同一緩衝液中に線形塩勾
配を用いて行う。両分を集め、上記の如く分析を行う。

ＤＥＡＥ−セファセルカラムからプールされた活性画分
中のＩＬ−／は更に支持体マトリックスに結合した合成
トリアジニル織物染料配位子を用いたアフィニティ力ラ
ムクロマトグラフィーによシ鞘製される。ｆ色或いは赤
色を含む各種染料色を使用することが出来る。この染料
は例えばアガロース、ポリアクリルアミド、セルロース
或いは（３θ） シリカベース無機材料により構成される適当なカラムマ
トリックスにトリアジン環へのエーテル結合を介して或
いは又染料の一級アミン或いはアントラキノン基を介し
て結合されている。直接的に支持体マトリックスに結合
されずにこの染料は高分子量デキストランに結合され、
デキストランが次いでカラムマトリックスに固定される
ことも可能である。マトリックスに結合した青色及び赤
色染色配位子の部分的化学構造をそれぞれ第１図及び第
２図に示す。これらの染料構造は、例えばスルホン化ア
ントラキノン基の位置をトリアジン環に対して交換する
か或いはスルホン酸置換基の代りにスルホン酸塩を置換
することにより修正して類似体を形成することが出来る
ことが了解されるべきである。フルトン［Ｆｕｌｔｏｎ
、　　Ｄｙｅ−ＬｌｇａｎｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐ
ｈｙ　、　　？サチューセツツ州、レキシントン、５ｔ
ｕｄｉｏ　ｔ　、　　Ｉｎｏ、　（／りｔｏ）〕参照。

ｓｐ−セファデックス（５ｅｐｈａｄｅｘ　）及びＤＩ
ＩＥＡＥ−セファセル（５ｓｐｈａｏｅｌ　）上でＮ製
されたＩＬ−／含有画分を染料配位子カラムに適用する
前にプールされた活性画分のイオン強度を低下するとと
が必袂な場合がある。又、ＭｆＫ　　或いはＣａのよ５
な二価カチオンの存在はＩＬ−／の染料配位子への結合
を高め得る。カラムは適当な緩衝液、例えばＴｒｉｍ−
ＨＣＩで平衡化され、次いでＩｌ、−７活性を含有する
プールされたＤＥＡＥ画分をカラムに適用する。その後
カラムを同一の出発緩衝液で洗浄し、次いで溶出を同一
の緩衝液成因は特別の可溶性配位子中において線形塩勾
配を用いて行う。画分を集め上記の如く分析する。

本発明者等は赤色トリアジニル織物染料は、上記カラム
条件下において使用すると、ＩＬ−／の結合に特に高度
に特異的であることを発見した。

第２図に対応するこの赤色染料の商品名は［プロジオン
（Ｐｒｏｏｉｏｎ　）Ｊレッド（反応性レッド／、２０
　）　（Ｉｍｐｅｒｉａｌ　Ｃｈ＊ｍ１ｏａｌ　Ｉｎｄ
ｕａｔｒｌａ＠）である。本発明者等は又、青色トリア
ジニル織物染料は、上記カラム条件下において使用する
と、■Ｌ−／の結合に高度に特異的、即ち赤色トリアジ
ニル織物染料の場合の約ｔｏｎ　　程度特異的であるこ
とをも発見した。背色染料の商品名はシバクロン■ブル
ー３　Ａ　Ａ　（Ｃ１ｂａａｒｏｎ■Ｂｌｕｅ　　Ｊ乙
Ａ）（Ｃ１ｂａ　ＡＧ　）である。

上記精製方法により、本発明者尋は出発上澄液から約５
３％の高収率を維持しながらタタ俤の純度を越えてヒ）
ＩＬ−／蛋白質を精製した。上記アッセイ操作により、
本発明者等はヒ）ＩＬ−／が約ＩＺ３００ダルトンの分
子量の単−分子量種より構成されることを決定した。こ
の分子量は従来ヒト或いはネズミのＩＬ−／につ−て報
告されて込だものよシも実質的に重いものである。更に
、他の観察者らの報告とは反対に、本発明者等によって
はその他の分子量のＩＬ−／の種は見出されなかった。

上掲のラッハマン、トガワ等、マイゼル等、及びブライ
デス等の文献を参照。しかしながら、本発明を使用して
本発明者等により経験されたＩＬ−／の高い収率により
上記精製方法の際に相当量の他の低分子量のｘｒ、−７
種が失われたとは思われない。従って等質なヒ）ＩＬ−
／の真の分子量は／Ｚ！００ダルトンである。

アミノ酸組成分析 他の蛋白質による汚染のな込ＩＬ−／の生物学的研究を
可能にしたことに加えて、等質なＩＬ−／を調製するこ
とが出来ることはＩＬ−７分子のアミノ酸組成を決定す
ることを可能にした。この情報を用いて、臨床的試験及
び究極的には臨床的用途のためのＩＬ−／遺伝子のクロ
ーニング及び大量の純粋ＩＬ−／の産生な助けることが
可能である。

アフィニティクロマトグラフィー操作からの精製！Ｌ−
／の試料をニンヒドリン検出を用いた自動化アナライザ
ーを用いてアミノ酸組成の分析を行った。観察されたピ
ークは市販の記録積算計を用いて積分した。この技術に
よｐ本発明者等は下記の例グにおける表Ｉにまとめて示
したＩＬ−７分子のアミノ酸組成を決定した。

アミノ酸残基システィン（Ｃｙａ）は加水分解に不安定
であるのでとの残基は自動化ニンヒドリン分析によって
は検出されな込。Ｃｙａ残基の存在は以下に述べるアミ
ノ酸配列分析によｐ検出した。

（３ｔ） 又、自動化ニンヒドリン分析は、アスパラギン酸残基と
アスパラギン残基とを区別せず、又、グルタミン酸残基
とグルタミン残基の区別もしな−。

しかしながら、以下に述べるアミノ酸配列分析から７個
のアスパラギン残基及び６個のグルタミン残基がＩＬ−
７分子のＮ−末婦部分（４ｔ）個のアミノ酸残基よりな
る）に検出された。この様に表■においてはグルタミン
酸及びグルタミン残基と同様にアスパラギン酸及びアス
パラギン残基も一緒に掲げられてｂる。

ＩＬ−７分子のＮ−末端部分のアミノ酸配列分析本発明
者等は又ＩＬ−／分子のアミノ酸配列を検討した。本発
明者等は、上記方法により調製さとして、この分子は自
動化アミノ酸配列装置に使用される化学的分析技術に容
易に従うことが出来ず、従って、全分子のアミノ酸配列
は標準的分析操作により決定することが出来なかった。

その結果、本発明者等は、λつの技術の組み合わせを用
いて蛋白質分子のＮ−末端部分の配列を分析した。

第１の技術として、本発明者等は上記方法によシ等）Ｊ
Ｒ状態に精製されたかなシ大きな／／μ９を越えるＩＬ
−／を自励化配列決定装置を用いてアミノ末端エドマン
分解配列分析に付した。この技術により１Ｌ−７分子の
Ｎ−末端部分の最初の、２０個の残基は次の配列により
構成されることが見出された孟 ＮＨ２−Ａｌｔ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−８＠ｒ−Ｌ
ｅｕ−Ａｍｎ−Ｃｙａ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａａ
ｐ−８ｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｌｙａ−８ｅｒ−Ｌｅｕ
−Ｖａ　１−Ｍｅ　ｔ− を番目の残基はＣｙａと推定された。自動化配列決定操
作のｒ番目のサイクルにお込ては、その他の如何なる残
基も高収率で得られず、これはξ番目の残基がＣｙａ　
（これはエドマン分解によｐ背定的には検出されな込）
、グリコジル化スレオニン残基或いはグリコジル化セリ
ン（Ｂａｒ）残基により構成されるとの結論を示す。こ
れらの後者の一つの可能性は以下に論する如く、アミノ
酸組成分析からグルコサミン成因はガラクトサミンは観
察されないので除去された。これによりｒ番目の残基が
Ｃｙａで構成されるとの結論が導かれる。

第一のアミノ酸配列分析技術として、本発明者等はアル
ギン残基における分子を酵素トリプシンを用込て分別し
た。トリプシンがＩＬ−７分子を又リジン部位において
切断することを防止するためにリジン分子の側鎖を特別
のブロッキング剤を用すて促成した。好ましくは、トリ
プシンをＬ−／−トシルアミノ−８−フェニルエチルク
ロロメチルケトン（「ＴＰＣＫ」）で処理して、同時に
存在し得るキモトリプシンなどのその他の汚染酵素を不
活性化し、ＩＬ−／蛋白質が他の残基におりて切断され
る可能性を最少にする。トリプシンを使用する代りに、
他の酵素を用いて他の残基部位においてＩＬ−７分子を
切断することも可能であることは了解されるべきである
。

ＩＬ−７分子の切断後得られたペプチド類をＨＰＬＣ操
作によＱ疎水性に基づいて分離した。本発明において使
用されるＨＰＬＣ技術は蛋白質■Ｌ−／パー／ペプチド
類に利用されるべき十分に大きな孔径、即ち少なくとも
３ｏｏＸの孔径を有する逆相のオクタデシル結合シリカ
カラムを用いるのが好まし−。

本発明の実施に当ｐ使用するに適した逆相ＨＰＬＣカラ
ムは市販の商品である。この目的に好ましいカラムは５
ｅｐａｒａｔｉｏｎｓ　　Ｇｒｏｕｐ、　（カリフォル
ニア州、ヘスペリア）よシ市販されて込るＶｙｄａｏ　
２／Ｊ’　Ｔ　Ｐ逆相カラムである。このカラムは、シ
ロキサン（シリコン−酸素−シリコン）結合により、５
ミクロンの平均粒径に分類された３θｏＸ孔径のシリカ
ゲル表面に共有的に結合されたオクタデシルシラン基よ
りなる。他の逆相カラムの使用も本発明の範囲内である
ことが了解されるべきである。

オクタデシルシラン基 ド類はアセトニトリルの線形勾配を用いて溶出される。

この目的のための好まし−勾配はトリフルオロ酢酸（Ｔ
　Ｆ　Ａ　）　、ｐＨ，２，０中のθ〜りｊ東Ｖめのア
セトニトリル勾配である。

溶出されたペプチド類は市販の検出計を用いて（３と） 追跡するのが便利である。例えば、ＨＰ　Ｌ　Ｃカラム
から溶出された両分中の相対的蛋白質濃度は自動化紫外
線分光光度計を用いて２３０ｎｍ波長における溶出物質
の吸光度を測定することによシ求めることができる。適
当な自動化紫外線吸収検出装置はＷａｔｅｒｓ　　Ａａ
ａｏｅｌａｔｅａ　（メイン州、ミルフォード）から利
用可能である。或いは父、蛋白質の溶出はスティン及び
モスケラ（Ｓ　ｔ　ｅ　ｔ、ｒｌｌｔｏＭｏ　ａ　−ｏ
ｈｅｒａ、７１　Ｍｏｔｈ、　　Ｋｎｚｙｍｏｌ−４Ｌ
３！（／りｔ／）〕により記載されている自動化螢光検
出装置を用いて追跡することも出来る。

溶出されたＨＰＬＣ画分の配列の分析は上記ゲル電気泳
動により行われ、各ＨＰＬＣ画分に含まれるペプチド類
の数を決定する。その後、ペプチド類を真空濃縮し、次
いでアミノ酸配列の分析を行う。これは市販の商品であ
る自動化配列決定装置を用−て行うのが好ましｂｏこの
技術により本発明者等はヒ）ＩＬ−７分子のＮ−末端部
分近辺のｘＬ−ｉ分子の主たる部分は次のアミノ酸残基
の配列により構成されることを発見した：　−８ｅｔ−
（３り） Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−８ｏｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔ
ｙｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｉ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｈｌ
ａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａａｐ−Ｍｅｔ
−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｖｍｌ−Ｐｂｅ。

このアミノ酸断片のアミノ末端部分の最初のＶつの残基
は、自動化エドマン分解技術により上記で決定された配
列のＣ−末端部分の最後のＶつの残基に対応し、従って
ＩＬ−７分子のＮ−末端部分の最初のＩＩｔ、２個の残
基は次の配列よ多構成されるとの結論に導かれるｒ　　
ＮＨ２−Ａ、ｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−８ｏｒ−
Ｌｅｕ−Ａａｎ−Ｃｙａ−Ｔｈｒ−Ｌａｕ−Ａｒｇ−Ａ
ａｐ−８ｓｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｌｙａ−８ｅｒ−Ｌｅ
ｕ−Ｖａｌ−Ｍａｔ−８ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ
−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙａ−Ａｌａ−Ｌｓｕ−Ｈｌｓ−
Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａａｐ−Ｍｅｔ−Ｇ
ｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｖａ　ｌ　−Ｖａ　１−Ｐｈｓ
。

ヒトＩＬ−／産生細胞からのＲＮＡの１．１ヒ）ＩＬ−
／産生細胞からの全ＲＮＡは標準的方法、例えばチルギ
ン等（Ｃｈｉｒｇｗｌｎ　　ａｔ　　ａｌ、。

／ｒ　　Ｂｌｏｏｈｅｍｉａｔｒｙ　　ｊ、２り＋ｔ（
／り７り）〕及びマニアティス等（Ｍａｎｌａｔｌａ　
　ｅｔ　　ａｌ、、　ＭｏｌｅｏｕｌａｒＣｌｏｎｌｎ
ｇ、　ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃ
ｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ　　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ　、　　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
、　　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（／９♂２）〕に開示されて
いる方法により抽出される。

周知の如く、細胞からＲＮＡを抽出するに際し、抽出の
初期段階においてリボヌクレアーゼ（ｆｆＮａａａＪ）
活性を最小にすることが重要である。これを達成する７
つの方法は、ＲＮａｍｅ含む細胞蛋白質をＲＮＡａｓｅ
によるＲＮＡ加水分解の速度を越える速度で変性するこ
とである。上記チルギン等及び上記マニアティス等の／
りｔの方法においては、これはグアニジニウムチオシア
ネートをＪ−メルカブトエタノールなどの還元剤と共に
使用して行われている（蛋白質ジスルフィド結合を破壊
する）。ＲＮＡは標準的技術、例えばフェノール／クロ
ロホルム抽出、エタノール沈Ｓ或Ｚは七シウムクロライ
ドによる沈降などにより蛋白質から単離される。

次に、ポリアデニル化ｍ　ＲＮ　Ａを抽出蛋白質から分
離する。との分虚操作を行うために幾つかの技術が開発
されているが、／っの好まし騒方法は、ポリアデニル化
ｍＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）−チル。

−ス上でエドモンド等ＣＢｄｍｏｎｄｍ　ａｔ　ａｌ、
、　　ＡｔＰｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　Ａａａｄ、　
　Ｓｏｉ、　　／３３Ａ　　（／り７／）〕、アヴイプ
及びレダー（Ａｖｌｖ　ａｎｄ　Ｌｅｄｅｒ、　　Ａり
Ｐｒｏｏ、　　Ｎａｔｌ、　　Ａ、ａａｄ、　　Ｓｏｌ
、　　／４ｔθＪ’（／２７．２））、及び上記マニア
ティスの／？７、に記載されて込るように、クロマトグ
ラフを行う仁とである。オリゴ（ｄＴ）−セルロースカ
ラムは負荷Ｎ＆衝液を用すて調製され、ｍＲＮＡをカラ
ムに適用する。その後カラムを先ず緩衝溶液で洗浄して
未ポリアデニル化ｍＲＮＡを除去し、次いでポリアデニ
ル化ｍＲＮＡを緩衝化された低イオン強度の溶離剤を用
いてカラムから溶出する。ポリアデニル化ｍＲＮＡの完
全性はゲル電気泳動により検旺される。

ポリアデニルｍＲＮＡは次いでｍ　ＲＮ　Ａの異なった
大きさの群に応じたメチル水銀アガロースゲル画分を介
して電気泳動により大きさを決定され、次いで例えばパ
ルＳター［Ｐａ１ｍ１ｔｅｒ、　　、２４ｔ♂Ｊ。

Ｂｌｏｌ、　　Ｃｈｅｍ、　　２０９よ（ｌり７３）］
、ペルハム及びジャクンンＣＰｅ１ｈａｒｏ　ａｎｄ　
Ｊａｏｋａｏｎ、　ｌｒ７．　Ｅｕｒ。

Ｊ、　Ｂｌｏｏｈｅｍ、　Ｊ＋’Ａ　（／り７ｚ）〕、
及びリー等〔Ｌｅｅ　　ｅｔ　　ａｔ、、　　、２６３
　Ｊ、　　Ｂｌｏｌ、　　Ｃｈｅｍ、　　３１７り≠（
／り７ｒ）〕によりＮＱ載されてｈる標準的なウサギ網
状赤血球溶解物技術を用いてｉｎ　ｖｌｔｒｏ　−Ｃ翻
訳される３、ウサギ網状赤血球アッセイ用のキットは多
くの供給諒、例えばＢｅｔｈａａｄａ　Ｒａａｅａｒａ
ｈＬａｂｏｒａｔｏｒｌａｓ　（メリーランド州、ゲク
ルスブルグ）などから市販されている。或いは又ｍ　Ｒ
Ｎ　Ａの翻訳は、ストマ弊［：　Ｓｔｏｍａ　ａｔ　ａ
ｌ、、　７り、’Ｍａｔｈ。

Ｋｎｚｙｍ、　Ａ　Ｉ　（／　９♂／）〕によｐｍｌ載
されている標準的技術を用いてカエルのクセアオバス・
ラウイス（Ｘｅａｏｐｕａ　１ａｅｖｌａ　　ｒｘ＋１
ａｅｖｉａ　Ｊ　）の卵母細胞へのｍ　ＲＮ　Ａのｉｉ
注射によジ行うととも出来る。網状赤血球溶′Ｉｓ物翻
訳或いはｍ　ＲＮ　Ａ微量注射卵母細胞により放出され
た液体を次いで上記アッセイを用いてＩＬ−／の活性の
存在の試験を行う。ｉｎ　ｖｌｔｒｏにおいて翻訳した
際にＩＬ−／活性を与えたｍ　ＲＮ　Ａゲル画分をｏＤ
ＮＡ構成のためのｍ　ＲＮ　Ａ　源として選択する。

Ｘ、ラグイ！！１ノ母昶１胞翻訳操作に２いては、約ｓ
０ナノリットル（ｒｎｌＪ）のｍＲＮＡ（無菌Ｈ２Ｏ中
にｏ、ｚ〜／　Ｉｌｌ　／ｍｌの濃度で溶＃）を各卵母
細胞に注射する。卵母細胞をＸ、ラグイ（Ｎａａｎｏ、
ライスコンシン州、フォートアトキソン）から採取しｉ
ｓｏ　ｍｌの卵母細胞インキエベーシ曹ン培地（ｒｔｍ
Ｍ　ＮａＣ１、／　ｒｎＭ　ＫＣＩ、　２．！ｒｎＭ　
ＮａＨＣＯ３，０，１２ｒｎＭ　ＭｇＳＯ４・７　Ｈ２
Ｏ、０，ＪＪ　ｍＭ　Ｃａ　（ＮＯ５）２・４’Ｈ２０
，０，４Ｌ／　ｍＭ　ＣａＣｌ２　・Ａ　Ｈ２Ｏ，７，
１ｍＭ　Ｔｒｌａベース、／ｒ単位／ｍｌ　（／／　ｔ
ｔｇ／ｍ、ｌ　）　ヘ＝　シＩ）　ｙ　Ｇ　カリウム及
び／Ｊｒμｇ／ｌｎｌストレプトマイシン）中において
インキニベートする。培地の最終ｐＨをＭＣＩで７．６
に調整し、次いで濾過にょｐ殺菌する、。

注射後、卵母細胞を０．ＩＮの新たな卵母細胞インキ瓢
ベージ曹ン培地中に入れ、　／、！μノの無菌の円錐状
のポリプロピレンチ４−ブ内でカ℃で／ｇ時間込で上記
アッセイ法を周込てＩＬ−／活性の存在の試験を行う。

ｍ　ＲＮ　Ａからのａ　Ｄ　Ｎ　Ａの調製上記の如く調
製され分析されたｍ　ＲＮ　Ａに対応する二本鎖ｏ　Ｄ
　Ｎ　Ａのライブラリーは逆転写酵素を用いた公知の技
術によｐ構成される。本発明において使用されるその様
な方法の７つは上記マニアティス等の文献、２３０に詳
細に説明されて込る。

簡単に述べると、ポリアデニル化ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡ
のポリアデニル化尾部にハイブリット化されたオリゴ−
ｄＴを用いて第１のａＤＮＡ鎖のプライマーとして逆転
写する。これにより第一のＤＮＡ鎖の一体的プライマー
として役立つ最初のａＤＮＡ鎖の３′末端に「ヘヤピン
」ループが生ずる。

次いで、第一のａＤＮＡ鎖を酵素ＤＮＡポリメラーゼ■
を周込て合成し、ベヤビンループＳ／ヌクレアーゼによ
り切断し、二本鎖ａ　Ｄ　Ｎ　Ａ分子を生成する。二本
鎖ｏ　１）　Ｎ　Ａは任意の便利な手段を用いて分別し
てより短い鎖を除去し、それにょｐ不用な小さなａＤＮ
Ａ画分のクローニングを回避する。

本発明に従えば、別の標準的操作方法を周込てｍＲＮＡ
から二本鎖ａＤＮＡを調製することが出来ることが理解
されるべきである。その様な／っの代替技術はランド等
（Ｌａｎｄ　ａｔ　ａｌ　　タＮｕｃｌ。

Ａｏｌｄａ　Ｒｅａ−，２，２１／　（／りＩｒ／）〕
　にょｐ開示されて込る。ランド等の方法にお込ては、
ヘヤビンループは第一のａＤＮＡ鎖のプライマーとして
は使用されな−。その代りに、第１のａＤＮＡ鎖の３′
末端が、末端デオキシヌクレオチジルストランスフェラ
ーゼ（ｒＴｄＴＪ　）を用−てｄＣＭＰ残基で尾部が付
着される。これはボＩＪ−Ｃ残基の３′尾部を生成する
。次−で、第一の鎖の合成は、３′尾部にハイブリッド
化されたオリゴ−ｄＧにより開始される。この技術はマ
ニアティス等の方法におりてヘヤピンがＳ／ヌクレアー
ゼで切断されるならば生じ得る第一のａＤＮＡ鎖のｔ′
尾部の部分を失うことを避けるのに役立つと騒われてい
る。

ａＤＮＡのクローニング 次に、二本鎖。ＤＮＡを、ベクターの複製のために相客
れることのできる原核生物或すは真核生物の宿主細胞を
形質転換するために使用されるり（侭） ローニングベクター中に挿入する。その後形質転換体が
同定され、プラスミドＤＮＡがそれから調製される。

本発明を実施するためには各種のクローニングベクター
を利用することが出来る。好まし込ベクターはプラスミ
ドであるが、ベクターはバクテリオファージ或−はコス
ミドであってもよ−。クローニングが補乳動物細胞内で
行われる場合にはウィルスも又ベクターとして使用する
ことができる。

プラスミドが使用される場合には、それは天然源から得
られても或いは人工的に合成されてもよい。選ばれる特
別のプラスミドは、考えられて因る形質転換宿主がＥ、
ＱＯｌｌのような細菌、酵母その他の単細胞微生物であ
るか否かに応じて適合性を有すべきである。プラスミド
は使用されるべき特別の宿主細胞に対して適切な複製源
を有するべきである。又、プラスミドは形質転換された
宿主細胞が容易に同定され、かつ形質転換を行わない細
胞から容易に分離されることを可能にする表現型特性を
有するべきである。その様な表現型特性は（弘７） 成長抑制物質、例えば抗生物質などに対する耐性を与え
る遺伝子を包含し得る。各イ■抗生物質、例えばテトラ
サイクリン、ストレプトマイシン、サルファ剤、ペニシ
リン及びアンピシリンなどに耐性を有する遺伝子をコー
ド化するプラスミドが市販されて込る。

Ｂ、ｏｏｌｌが宿主細胞として使用される場合には、本
発明におりて使用することのできる多くの可能性のある
クローニングプラスきドが市販されて−る。本発明を実
施するために好まし−プラスミドはｐＢＲｊ、２λであ
る。このプラスミドはサツトクリフ（５ｕｔｅｌｌｆｆ
ｅ、　１１３　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ
Ｓｙｍｐ、　　Ｑｕａｎｔ、　　旧ｏ１．　７７　（／
り７り）〕に示されているように完全に配列決定されて
因る。このプラスミドの重要な利点はアンピシリン耐性
遺伝子におけるＰａｔ１部位を含む７７個の公知の独特
の制限部位を有することである。この特徴はホモポリマ
ーテーリング法によるクローニングに特に有用である。

プラスミドの代ｐにバクテリオファージが使用される場
合には、その様なファージはプラスミドの選択に当って
述べた上記の実質的に同一の特性を有するべきである。

これは、表現型マーカー及び外来遺伝子の付着のための
連結可能な末端の存在を含むものである。

好ましくは、本発明にお−てはプラントエンドを有する
二本鎖ａＤＮＡをホモポリマーテーリングによりプラス
ミドベクター中に挿入する。周知の如く、この技術にお
いてはｏＤＮＡの鎖及びプラスミドＤＮＡに相補的なホ
モポリマートラックが付加される。ベクター及び二本鎖
ｏＤＮＡは次いでａ　補的なホモポリマーのテール間に
水素結合により結合され、Ｅ、ａｏｌｉなどの宿主細胞
を形質転換することのできる開かれた垢状のハイブリッ
ド分子を形成する。

ホモポリマーテーリングの１つの方法におりては約！θ
〜／Ｊ’ＯｄＡのヌクレオチド残基が線形化プラスミド
ＤＮＡの３′末端に付加される。同様な数のｄＴヌクレ
オチド残基が二本鎖ｏ　Ｄ　Ｎ　Ａの３′木端に付加さ
れ、次すでｃＤＮＡ及びプラスミドが一緒に結合される
。

別の好ましい方法においては、ｄＧデテール適当な制限
酵素により切断されたクローニングベクターの３′末端
に付加される。例えばｐＢＲｊ、２．２プラスミドが使
用される場合には、制限酵素Ｐａｔ■を使用してこのプ
ラスミドをアンピシリン耐性遺伝子において消化するこ
とが出来る。プラスミド中にａＤＮＡセグメントを適当
なアニーリング緩衝液を用−て挿入する前に二本鎖ｏＤ
ＮＡの３′末端に相補的ｄＣテールが付加される。

二本鎖ａ　Ｄ　Ｎ　Ａはその他の各種標準的方法により
プラスミドクローニングベクター中に挿入することが出
来ることが了解されるべきである。１つのその様な代替
的技術はＤ　Ｎ　Ａ　ＩＪガーゼを用いてｏＤＮＡ鎖の
末端に合成されたヌクレオチドリンカーを付着すること
を含むものである。これらのリンカ−は制限酵素で切断
されて同一酵素で切断されたプラスミド内に挿入するだ
めの付着末端を発生する。シェラ−等［５ａｈｅｌｌｅ
ｒ　ａｔ　ａｌ、、　／りｔＳａｌｅｎａｓ　／７７−
　／♂Ｏ（／り７７）〕、上掲マニアティス等の文献、
２／り参照。

上記の如く調製された組み換えＤＮＡプラスミドを使用
して宿主細胞の形質転換を行う。宿主は任意の適当な原
核生物成因は真核生物細胞でよりが、好ましくは、良く
規矩された細菌、例えばＥ。

ａｏｌｉ或いは酵母菌株がよい。その様な宿主は容易に
形質転換され、培養液中で迅速な生育が可能である。他
の形態の卸１閑、例えばサルモネラ或すはニューモコッ
ヵス（Ｐｎ＠ｕｍｏａｏｏｏｕａ　）などもＥ。

ｏｏｌｌの代９に使用することが出来る。細菌の代ｐに
その他の単細胞生物、例えば真菌類（ｆｕｎｇｉ）及び
藻類（ａｌｇａｅ　）なども使用することが出来る。

いずれの宿主が選ばれるにせよ、それは組み換えプラス
ミドを切断する制限酵素を含有すべきではない。

Ｅ、ｏｏｌｌが宿主として使用される場合には、好まし
い菌株はＭＭλりＶ及びＲＲ／である。プラスミドベク
ターによるＭＭ、２り≠の形質転換の実験方法は上記マ
ニアティス等の文献の、２．２７において、及びハナー
ン（Ｈａｎａｈａｎ　／　６　ｔ　Ｊ、　　Ｍｏｌ。

（Ｓ／） Ｂｉｏｌ、　　ｊ１７　（／りざ３）〕に示されている
ように良く知られて因る。ＲＲ／宿主のプラスミドベク
ターによる形質転換の実験方法も又、ポリバー等［Ｂｏ
ｌｉｖａｒ　　ａｔ　　ａｌ、、　　、２　Ｇｏｎｅ　
　タｊ（／り７７）］及びピーコック等（Ｐｅａｏｏｏ
ｋ　ａｔ　ａｌ、、　　ＡｊｊＢｌｏｏｈｅｍ、　　　
Ｂｌｏｐｈｙｓ、　　　Ａｏｔａ−，２１１ｔ３　　（
／りｌ／　）〕に示されているように良く知られてｈる
。適当な宿主として役立ち得るその他のＥ、　ｏｏｌｉ
の菌株としては、ＤＨ／　（ＡＴＣＣＮｎ！３１４１２
）及びｃｔｏｏが挙げられる。これらの菌株及びＭＭ、
２りμ及びＲＲ／菌株は広く市販されている。

上記マニアティス等による文献及び上記ハナーン等によ
る文献に開示されて−るものを含む形質転換の実験方法
においては、細胞による制限されたプラスミドの摂取に
より僅かに少量部分の宿主細胞が実際に形質転換される
にすぎない。形質転換された細胞は、適当な生育培地及
び抗生物質などの表現型同定物質を含有する寒天上に細
胞培簀液を置くことによｐ同定することが出来る。適当
な耐性遺伝子（例えば抗生物質に対する）を有する細胞
のみが生残る。組与換えｐＢＲＪ、２．２プラスミドが
Ｌａｏｌｌ菌株ＭＭ、２り≠の形質転換に用−られる場
合には形質転換された細胞はテトラサイクリンを表現型
同友物質として用することにより同定することができる
。

合成オリゴヌクレオチドスクリーニングプローブの１部
製 上記の如く決定されたヒ）ＩＬ−７分子のアミノ酸配列
のＮ−末端部分の７部に対応する放射線標識された合成
オリゴヌクレオチドをプローブとして用−てｏ　Ｄ　Ｎ
　Ａライブラリーのスクリーニングを行う。この合成オ
リゴヌクレオチドプローブのライブラリークローンから
調製されたプラスミドｏ　Ｄ　Ｎ　Ａとのハイブリッド
化は引続いてオートラジオグラフィーにより同定する。

ＩＬ−７分子のアミノ酸組成のＮ−末端部分は次の残基
によし構成されることが決定された：ＮＨ２−Ａｌａ−
Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｓｏｒ−Ｌａｕ−Ａｓｎ−Ｃ
ｙａ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａａｐ−８ｅｒ−Ｇｌ
ｙ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−８ｏｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｍａｔ
−８ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−
Ｌｙａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｈｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇ
ｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌ
ｎ−Ｖａｌ。

この配列情報を合成オリゴヌクレオチドプ謡つ゛の基礎
として使用する。６０↓各−４カー７−Ｊダ酸配−３’
ｌＪ−の橢吻ＩＪ−ｔｌ１９一部分は一比較的容易に化
学的に合成さね一本発明者等はＩＬ−／遺伝子を含有す
るものと思われるプラスミドＤＮＡをスクリーニングす
るためのグローブに使用するための合成オリゴヌクレオ
チドを上記アミノ酸配列から開発した。このプローブは
、第１のＭｅｔ残基から下流の上記アミノ酸配列により
コード化されるアンチセンス配列に対応する次の配列に
よす構成されてｈる：ｔ’−ＡＣＴＴＧ　　ＴＴＧ　　
ＴＴＣＣＡＴ　ＧＴＣＴＴＧＧＣＣＴＴＧ　ＣＡＧ　Ｇ
ＴＧ　ＣＡＧ　ＧＧＣＴＴＴ　　ＣＡＧＴＴＣＧＴＡ　
ＧＧＧ　ＧＣＣＧＧＡ　ＣＡＴ−Ｊ’。

（ｉ＋） このプローブは容易に合成されるに十分に短すという利
点を有すると共にＩＬ−／遺伝子のプローブとして有用
な重要な情報を含有するに十分長いものである。上記説
明のオリゴヌク−レオチド配列は、本発明の合成プロー
ブの好ましい組成であるが、ＩＬ−７分子のＮ−末端ア
ミノ酸配列のその他のセグメントに対応するその他の組
成のプローブも又本発明の趣旨或いは範囲から離れるこ
となく使用することが出来ることが了解されるべきであ
る。

合成オリゴヌクレオチドプローブはホスホジエステル或
いはトリエステル方法などの公知の技術により化学的に
合成することが出来る。トリエステル合成技術の詳細は
スッド等Ｃ５ｏｏｄ　ａｔ　ａｌ、。

ｉｌ　Ｎｕｏｌ、　Ａａｌｄ　Ｒｅｓ、　　２ｊ！７　
（／り７７）〕及びヒロセ等（Ｈｌｒｏａｅ　ａｔ　ａ
ｌ、、　　、２１　Ｔｅｔ、　　Ｌｅｔｔ。

ｊ４’≠２（／り７ざ）〕　に示されている。合成後オ
リゴヌクレオチドグローブをＴＶポリヌクレオチドギナ
ーゼ及びｊ−２Ｐ−ＡＴＰで標識化する。標識化操作か
らの標準的な実験方法は上記マニアティ（５Ｓ） ス等の文献／ココに示されてｂる。オリゴヌクレオチド
プローブはＯＨｊ末端を用いて合成することにより典型
的に必要とされるホスファターゼ操作を回避するのが有
利である。

ａＤＮＡライブラリーのスクリーニング本発明のスクリ
ーニング操作にお−て、形質転換体は各々約２ｏｏｏ個
の形質転換体で構成されて込る群にプールされる。、複
製されたプラスミドは、例えばアルカリ性溶解などの数
個の公知の技術の任意のものを用いて形質転換体から抽
出される。プラスミドＤＮＡはいずれもハイブリッドプ
ラスミド上の独特の部位であるＰｖｕＩＩ及びＨ１ｎｄ
■制限部位にお込てプラスミドを切断することによフ調
製される。得られたＤＮＡセグメントをアガロースゲル
上の電気泳動により分別し、次すで直接的にサザン（５
ｏｕｔｈ＠ｒｎ％、りＩ　Ｊ、　Ｍｏ１．旧ｏ１、ｇｏ
３（／り７ｊ）〕により記載されているサザンブロッテ
ィングにより分析する。サザンプロッテイング操作（５
ｏｕｔｈ＠ｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ　ｐｒｏｏｅｄｕｒ
＊　）におけるニトロセルロースフィルターに結合する
ＤＮＡを標識化されたオリゴヌクレオチドプローブとハ
イブリッド化する。プローブにハイブリッド化する特異
的ＤＮＡ断片はオートラジオグラフィーにより同矩する
。

オートラジオグラフィーに従って信号を与える特別のク
ローンのプールをプレートから取ｐ出し、同一の上記オ
リゴヌクレオチドプローブを用いたニトロセルロースフ
ィルター上における直接細菌る。本発明において発明者
醇は７つのその様な淋ｅコロニーを見出した。ＩＩ、−
／Ｘ−／４’と称されるプラスミドＤＮＡはこの特別の
同定された陽性コロニーから調製される。

スクリーニングされたｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの特性づけ上記の
如く得られたプラスミドＤＮＡは制限酵素マツピングに
より特徴付けられる。制限酵素マツピングに対する各種
術策は上記マニアティス等の文献の３７≠によＱ論じら
れてｂる。７つの標準的技術は線状ＤＮＡの末端−標識
化断片の部分的消化を含むものである。この技術はスミ
ス及びビルンスチール（Ｓｍ１ｔｈ　ａｎｄ　Ｂｌｒｎ
ａｔｌｅｌ、　　ｊＮｕｏｌ　　Ａｏｌｄ　　Ｒａｍ、
　　、２３１７　（／り７６）〕にょ夛開発された。Ｉ
Ｌ−／遺伝子の領域におけるＩＬ−／Ｘ−／μプラスミ
ドの部分的制限酵素地図は第３図に示される。制限部位
間の距離は塩基対（ｒｂｐＪ　）で与えられて因る。括
弧内に示されるＰａｔ　ｌ制限部位はクローニング操作
にょシ発生したものである。

第３図に図示されたプラスミド■ＤＮＡの地図は連鎖−
停止方法を周込て配列決定されたものであ６゜このヌク
レオチド配列決定の方法はサンガー等（Ｓｉｎｇｅｒ　
ａｔ　ａｌ、　７θＰｒｏｏ、　Ｎａｔｌ、　Ａｏａｄ
。

８ａｉ、　（ＵＳＡ）　ｊｌｌｔＪ　（／り７７）〕に
よ９勺められたものであった。又、米国特許第各３．２
シグタタ号明細書参照。連鎖停止配列決定の方法はＭ／
Ｊｅｌｏｎ１ｎｇ　ａｎｄ　Ｓｅｑｕｅｎａｌｎｇと題
されたＡｍｅｒａｈａｍＨａｎｄｂｏｏｋ　（Ｌｏｎｄ
ｏｎ、　Ｂｌａｎｈｅｉｍ　ＣｒｅａｅｎｔＣｔｔｒｓ
　）　）　（以下、Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｈａｎｄｂｏｏ
ｋ　　と（５ｇ） 称する）、メッシングＣＭｅａｎｉｎｇ　、２　Ｒｅｏ
ｏｍｂｉｎａｎｔＤＮＡ　Ｔｅｏｈｎｌａａｌ　　Ｂｕ
ｌｌｅｔｌｎ、　ＮＩ　ＨＰｕｂ目−ｃａｔｉｏｎ　　
Ｎ［１７り〜タタ、　λ、ＩＩＬ３〜≠ｒ　（ｌり７り
）〕、ノグラフィー（Ｎｏｒｒａｎｄ＊ｒ　ａｔ　ａｌ
、、　＋２６　Ｇｏｎｅｔｏ／（１ｙｒ３）　）、セレ
ッテイ等［：　Ｃｅｒｒａｔｔｌａｔ　　ａｌ、、／／
　　Ｎｕａｌ、　　Ａｏｌｄｓ　　Ｒｅｍ、２ｊ９り（
／り１ｒ３）、及びビギン等（Ｂｌｇｇｌｎ　ｅｔ　ａ
ｌ、　ＪｒＯＰｒｏｏ、　Ｎａｔｌ−Ａｃａｄ、　　Ｓ
ａｉ　（ＵＳＡ）３りｚ３（／りざ３）〕などに示され
ている。興味の対象となるＤＮＡ配列をクローン化する
ためにＭ／３繊維状ファージがベクターとして使用され
る。これらのファージベクターは連鎖停止方法により容
易に配列化される一本鎖ＤＮＡ鋳型を与え、この方法は
、遊ｌｌｍ３′ヒドロキシル基を有する短いプライマー
鎖を有する一本鎖鋳型分子を開始し、次いでＤＮＡポリ
メラーゼを用いて全ての参つのデオキシリボヌクレオチ
ドトリホスフェート、即ちｄＡＴＰｌ　ｄＣＴＰ、ｄＧ
ＴＰ及びｄＴＴＰ　（集合的にｒｄＮＴＰａＪと称する
）をそれらの一つを放射標識して用いた連鎖延長反応に
おいて鋳型鎖を複写することを含むものである。この合
成反応において、３′−ヒドロキシル末端を欠すてｂる
ヌクレオチド特異的連鎖停止剤、例えばλ′、３′ジデ
オキシヌクレオチドトリホスフエ−）　（ｒｄｄＮＴＰ
Ｊ　）を使用して一連の異なった長さの連鎖延長を生成
する。この停止剤はそれが成長ＤＮＡ鎖に導入されるこ
とができるように正常なｊ′末端を有するが、しかし３
′−ヒドロキシル末端を欠くものである。停止剤が一度
ＤＮＡ鎖中に一体化されると更にデオヤシヌクレオチド
トリホスフエートが付加されることが出来ず、鎖の成長
が停止する。各々四つのヌクレオチドｄＮＰＴａ、即ち
ｄＡＴＰ、　ｄＣＰＴ、　ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰの一つ
のｄｄＮＴＰを有する四つの別々の合成反応が行われる
。正常なｄＮＴＰｓの一つは合成された鎖がポリアクリ
ルアミドゲル上で大きさによシ分類された後にオートラ
ジオグラフすることができるように放射線ｍａｔされる
。四つの反応からの連鎖延長物はオートラジオグラフィ
からの断片のパターンがりｐ−ン化されたＤＮＡのＤＮ
Ａ配列に対応するように別々のゲルレーン中にｌ１４＃
）合わせて置かれる。

上記技術により求められた第３図に示されるプラスミド
ｏＤＮＡのＤＮＡ及び対応するアミノ酸配列を第Ｖ図に
図示する。ヌクレオチド類は第Ｖ図に示した配列の始め
から番号が伺されている。

アミノ酸はＩＬ−／蛋白質の成熟ＮＨ２−末端、即ち矢
印で示されたＡｌａ残基から始まり停止コドンＴＡＡに
隣接して位置するＳｅｒ残基（Ｎｎ／ｊ、３）ま　曽で
番号が付されている。ＡｌａコドンからＴＡＧ停止コド
ンまでのＩＬ−／遺伝子のコード化領域は第３図の箱部
分として示されている。第３図に示される制限酵素切断
部位は又第Ｖ図にも示されている。

配列決定操作の準備に際して、第３図に示されたプラス
ミドａＤＮＡ部分は各８１制限エンドヌクレアーゼで消
火させ、次いで得られたＤＮＡ断片をＭ／３ファージベ
クター中にクローン化して１本鎖ＤＮＡＭ型を形成する
。センス及びアンチセンス鎖の中間位置から上流及び下
流の配列決定にはユニバーザルなプライマーが使用され
る。単一の連鎖停止（鎖成長停止）方法を用旨たフラグ
メントの全長の配列決定から得られた配列結果を信用す
るよシもむしろ追加の合成的に生成されたプライマーを
用−て鎖の長さに清って他の中間位置から連鎖停止方法
が開始される。この方法により第３図に示されるプラス
ミドｏ　Ｄ　Ｎ　Ａの両鎖は重複して配列され、それに
より配列を重複して確認するのに役立つ。

上記連鎖停止技術を用いる代りに本発明の趣旨から離れ
ることな（ＩＬ−／の遺伝子の配列を行うためにその他
の公知の方法を利用することが可能であることが了解さ
れるべきである。例えば、７１１　Ｐｒｏａ、　Ｎａｔ
’ｌ　Ａａａｄ、　８ｏ１−（ＵＳＡ）　　６６０　（
／り７７）に示されて−るマクサム（Ｍａｘａｍ　）及
びギルバー）　（Ｇｌ　ｌｂ＠ｒｔ　）の化学的分解方
法を使用することができる。

上記の如く調製され及び精製されたＩＬ−／のアミノ酸
配列の研究はスターン等の方法（５ｔｅｒｎａｔ　ａｌ
、、　Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｏａｄ、　Ｓｏｌ、
　（ＵＳＡ）ｌｒ７／（／り、ｒｐ））に従って行われ
た。エンドペプチダーゼ、シアノーゲンプロマイドを用
いてＩＬ−／をメチオニン残基において切断し、次いで
得られたフラグメントを標準的エドマン分解方法により
分析した。乙の方法により本発明者等はＩＬ−／蛋白質
のＣ−末端は次のアミノ酸配列Ｉ　Ｑｉｎ−Ｐｈｅ−Ｖ
ａｌ−８ｅｒ−８ｅｒ−よｐ構成されていることを１ａ
認した。これは、「天然のＪ、ＩＬ−／は、ｍＲＮＡか
らの翻訳後にこの分子末端からアミノ酸の除去に去され
ることが明らかなので重要である。

ａＤＮＡクローンからの機能的ＩＬ−／の発現ＩＬ−／
Ｘ−／ＧクローンのｏＤＮＡコード領域が機能的ＩＬ−
／をコード化するか否かを決定するためにクローンが原
核生物／真核生物宿主系において発現される。ＩＬ−／
Ｘ−／４ａクローンのコード化領域を含有するハイブリ
ッドｃＤＮＡフラグメントがλ組の複製配列、即ちベク
ターの原俵生物宿主細胞における増幅のための第１の配
列及び外来構造蛋白質即ちＩＬ−／の真核生物宿主細胞
における高割合の発現のための第一の配列を有するシャ
トル発現ベクター中に挿入される。形質転換された真核
生物宿主細胞を採取し、上記の詳述した胸腺細胞増殖ア
ッセイ及び！Ｌ−λ転換アッセイを使用して成熟ＩＬ−
／の発現のアッセイを行う。

各種タイプのシャトルベクターが開発されている。通常
のタイプは、原核生物細胞、典型的にはＬｏｏｌｌ中に
お込てＤＮＡ複製の信号を与える複製及びプロモーター
配列のオリジン（ｏｒｉｇｉｎ）及び真核生物細胞、最
も普通には酵母細胞においてＤＮＡ複製の信号を与える
複製及びプロモーター配列の対比オリジンを含む。シャ
トルベクターは又、形質転換された原核生物細胞の選択
のための薬剤耐性遺伝子のような表現形マーカーも含む
。

シャトルベクターは形質転換された真核生物細胞の選択
のための対比の表現形マーカー変更を有する。理想的に
は、高割合のＩＬ−／の発現のためには望ましくなり蛋
白質の発現を避けるために真植生物のプロモーター配列
から全ての蛋白質コード化配列が除去される。又、この
目的のために天然或すは合成の開始コドン配列、即ちＡ
ＴＧが■Ｌ−／遺伝子の挿入されたコード化領域のｊ′
末端に付着される。

本発明を実施するための好ましいシャトルベクターはｐ
ＹＡＤＨで表わされる。模式的に第５図に図示されるよ
うにｐＹＡＤＨプラスミドは、Ｅ。

ｃｏｉｌ中における高複写ＤＮＡ発現のための複製起点
（プラスミドｐ　Ｂ　ＲＪ、２．２から）及び形質転換
されたＬａｏｌｌ細胞の選択のためのアンピシリン（１
”ＡｍｐＲＪ）耐性遺伝子を含む。このシャトルベクタ
ーは又λμの円の複製起、ル、及び酵母（ｔｒｐマイナ
ス）４＋ｐ−栄養要求変異種における形質転換された酵
母宿主の選択のための酵母Ｔｒｐ　Ｉ遺伝子をも含む。

このシャトルベクターは更に、このプラスミドの酵母及
びＥ、ａｏ目の宿主の両者におりての伸長のためのアル
コールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｒ、ＡＤＨＪ　）から
の酵母プロモーター配列をも含む。このプロモーター配
列は、この遺伝子の酵母中における高割合の発現率によ
ｐ、及びこの遺伝子の完全なりＮＡ配列が知られて−る
ので、本発明において使用するのに特に有利である。開
始ＡＴＧコドンを含む全ての蛋白質コード化配列ハＡ　
Ｄ　Ｈプロモーター断片から除去された。このｐＹＡＤ
Ｉ（シャトルベクターは制限酵素、即ちＥａｏＲＩ及び
Ｓｔｕ　Ｉで切断するための多くの独特”　な基質部位
を含む。

第５図に図示される如く、ｐＹＡＤＨＩＬ−／プラスミ
ドは、ＩＬ−／遺伝子のコード化領域をプラスミドｐＹ
ＡＤＨ中に導入することによｊＤＩＬ−／遺伝子の発現
のための発現ベクターとして調製される。このシャトル
ベクターの試料はＡＴＣＣ（／、２ｊ＆／　Ｐａｒｋｌ
ａｗｎ　　Ｄｒｉｖｅ、　ＲｏｏｋｖｌｌｌｅＭａｒｙ
ｌａｎｄ州−ｏｒｒａ）に寄託Ｎ［ｌＪタタ６７で寄託
されている。ＩＬ−／遺伝子のコード化領域は上記で調
製されたｃＤＮＡプラスミドから除去されて込る。ＩＬ
−／遺伝子のコード化領域の正確にｊ′末端に独特の制
限酵素切断部位がないためにコード化領域の主たる部分
はプラスミドｏ　Ｄ　Ｎ　Ａから制限酵素Ｈｐａ　Ｈ及
びＰｔｚＬＩによｐ切断される。

ＨｐａｌＩ部位は遺伝子コード化領域のｊ′末端からや
や下流に位置している。その後遺伝子の切断されたｊ′
末端を富有する合成オリゴヌクレオチドは「天然」の主
たるＩＬ−／ｃＤＮＡ断片への便利な゛　　　除去され
たので、合成 オリゴヌクレオチドはＡＴＧ開始コドンでもってそのｊ
′末端で合成される。

このＩＬ−／ａＤＮＡ断片を合成オリゴヌクレオチドと
共に、合成オリゴヌクレオチドの５′末端と主たるＩＬ
−／ｃＤＮＡ断片の３′末端の立体配置に対応する適当
な制限酵素で予め消化されたシャトルベクターｐＹＡＤ
Ｈ中に挿入する。得られた組み換えシャトルベクターｐ
ＹＡＤＨＩＬ−／を用いてシャトルベクターの高嶺再増
幅のために原核生物宿主、例えばＥ、ｃｏｉｌを形質転
換する。

この最初の形質転換方法の後、組み換えシャトルベクタ
ーなＥ、ｏｏｌｌ宿王から単離し、次いでＩＬ−／の高
割合発現のために真核生物宿主、例えば酵母細胞を形質
転換するために使用する。形質転換された酵母宿主を採
取し、得られた上澄液について上記胸腺細胞増幅及び／
又はＩＬ−／転換アッセイを利用して生物学的活性のア
ッセイを行う３゜本発明の方法及び生成物を以下の具体
例により更に説明する。

例／ ＩＬ−／製造 ヒトの全血（Ｐｏｒｔｌａｎｄ　ｓオレゴン赤十字から
得られた混合物）から得られた３ｊθ〜４ｔｏ　ｏｗｌ
の白血球濃縮物をＨｌｓｔｏｐａｑｕｅ　（Ｓｉｇｍａ
　　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎ）’ｔミズーリー州
、セントルイス）上に積層されたＣａ＋＋、Ｍ？のな込
すン酸緩衝地水（「ＰＢＳＪ）と混合し希釈し、次込で
室温においてｔｏｏｘｉで３θ分間遠心分離を行った。

白血球よりなる界面層を回収し、ＰＢＳで洗浄し、室温
にお込で≠Ｏθ×ＩでｌＯ分間遠心分離を行った。細胞
を更に一回Ｃａ、Ｍｇ　　のないＰＢＳ中で洗浄し、各
洗浄後コ００ＸｇでＩＯ分間遠心分離を行った。

コ×１０　細胞／　ｍｌの濃度で得られた単核細胞をス
ピナーフラスコ内でＭＥＭ培地中で培養した。

この培地はｋＯＵ　／　ｍ、ｌペニシリン、！ｉｏμｇ
　／　ｍ、ｌストレプトマイシン１．２ｍＭグルタミン
、０．．１ｍＭゲンタマイシン、１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ
、　　ｐＨ７，４’を補給した。却１胞は、０．０１グ
／ｍノの加熱不活性化したホルマリン固定サレタスタフ
ィロコッカス・アウレウス（５ｔａｐｈｙｌｏａｏｏｏ
ｕｉ　ＪＩＬＩｒｅｕａｂ　　Ｉｇａｏｒｂ、ＴｈｅＥ
ｎｚｙｍｅ　　Ｃｅｎｔｅｒ、　Ｉｎａ、　　マサチェ
２セツツ州、マルデン）を添加するととにより　Ｉ　Ｌ
　−／　１（７生の刺戟を与えられた。汚染蛋白質の産
生を減少させるために血清は培養培地には添加しなかっ
た。空気中ｊ％ＣＯ２の加湿された雰囲気にお−で３５
℃で３時間インキュベーション後培養物を室温にお−て
３０分間７０００Ｘ１／で遠心分離を行ｂ、成因で上澄
液を除去して使用するまでポリプルピレンボトルに一、
２０℃で貯蔵した。

例コ イオン交換クロマトグラフィー 例１で調製されたＩＬ−／含有上Ｍ液をカチオン交換ク
ロマトグラフィー及びアニオン交４鏝クロマトグラフィ
ーでｓ製した。これらのクロマトグラフィー操作はＶ℃
で行われ、それらに使用されたゲルはＩＬ−／活性の樹
脂への非特異画成λｌを減少させるためにθ、／％Ｔｒ
ｌｔｏｎ−Ｘ及び１０％’ｌ／／ｖウシ胎児血１′にで
予備処理した。りｐマドグラフィー操作に先立ち、培養
上澄液は上記方法で分析した。粗製ＩＬ−／溶液は／、
り♂Ｘ　１０７Ｕの典型的な全活性、Ａ、、３７Ｘ１０
Ｉ′Ｕ／ツ試利の特異活性及び３．７　／　Ｘ　１０５
μｇの全蛋白質含すを有していた、。

Ａ、カチオン交換クロマトグラフィー 培養上澄液のイオン強度は／Ｍクエン彪す）　ＩＪウム
緩衝液ｐＨ４ｔ、Ｏを１０ｍＭクエン酸塩の最終濃度ま
で添加して調整し、又、濃塩酸でｐＨ４ｔ、θまで減少
させた。この様に調整された上澄液を予め／　！Ｏｒｎ
Ｍ　ＮａＣ１、ｐＨＩ／ｌ、０と共に同一のＷ　’ｊ７
ｊ液で平衡化しておいたスルホプロピル５ｅｐｈａｄｅ
ｘ　（ｒ　ＳＰ　Ｓ　Ｊ　）　Ｃ−，２３（Ｐｈａｒｍ
ａａＩａ　Ｆｆｎｅ　Ｃｈａｒｒ＋１ｃａｌａ。

ニューシャーシー州、ビス力タウエイ）の３０Ｘ／、ｔ
（至）のカラムに適用した。培養上澄液は≠００ｍ１１
時間の速度でカラムに適用した。

負荷か完結後、カラムをｌＯカラム容の１０ｍＭ−２Ｎ
−モルホリノエタンスルホンＩ′口（「ＭＥＳ」）緩衝
液ｐＨｊ、　０で洗浄し、未結合蛋白質を除去した。

結合蛋白質を次いでカラムに５０ｍ１ｊ／時間の速度で
適用した≠カラム容の１０　ｍ　ＭのＴｒｉａ　−ＨＣ
ｌ、　ｐＨ♂、／でカラムから溶出した。カラムのｐＨ
は約３カジム容の俗喘液を適用後に上昇したのがみとめ
られ、それによりＩＬ−／ビークの溶出がもたらされた
。カラム画分を集め、上記の如く分析した、。

本発明者らはカチオン交換カラムから溶出したＩＬ−／
が約７．／×１０　Ｕの活性及び約２．１０Ｘｉｏ’Ｕ
／グの特異活性を示し、それにより最初のＩＬ−／の約
５６％を保持しながら約−飾３倍のＩＬ−／の活性の増
大を達成することを見出した。又、約ざｏ％の汚染蛋白
質がカチオン交換クロマトグラフィー操作により除去さ
れた。

Ｂ、アニオン交換クロマトグラフィー カチオン交換カラムからのプールされた譲縮液が史にＤ
　Ｅ　Ａ　Ｅ　−５ｅｐｈａｃｅｌ　（Ｐｈａｒｒｎａ
ｏｌａ　ＦｉｎｅＣｈｅｍｌａａｌａ、二ｘ−ジャージ
州、ヒス力タウェイ）のカラム上でアニオン交換クロマ
トグラフィーによシ更に精製された。Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ　
−５ｅｐｈａｏａｌカラムは１０ｍＭ　Ｔｒｌａ　−Ｈ
Ｃｌ　、　ｐＨ１，／で平衡化された３゜ＩＬ−／はと
の同一の平賀化緩偵ｊ液でｓＰｓカラムから溶出された
のでＳＰｓプールを２０ｍ１／時間の速度で直接的にＤ
　Ｅ　Ａ　Ｅ　−５ａｐｈａｃｓｌカラムに負荷し、そ
れにより透析による活性の損失を回避した。負荷後、カ
ラムをｊカラム容の同一の平１町化緩衝液で洗浄し、次
いで溶出をＶカラム容のｉ。

ｍＭ　Ｔｒｌａ−ＨＣＩ％ｐＨざ、／中の０−弘００ｍ
Ｍ　ＮａＣ１の線形勾配を用いて行った。

本発明者等はＩＬ−／活性が０．Ｃ＃−０，／、２ＭＮ
ａＣｌの鋭込ビークにおいて溶出されたことを見出した
。溶出画分の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、幾つかの高分子
量汚染物質並びに約／７．！００、／！、００Ｑ及び／
、２，０００ダルトンの三つの主たる分子量のバンドを
示した。カラム溶出液の分析は７、７３　Ｘ　１０６Ｕ
の全活性、コ、ｊ♂Ｘ　／　０６Ｕ　７Ｍ９の特異活性
、３×／θ５μｇの全蛋白質及び３Ｆ％の収率を示した
。

例３ アフィニティクロマトグラフィー 例λからの活性画分をプールして、／　ＯｍＭＴｒｌａ
−ＨＣＩ緩衝液、ｐａｒ、／中で予備平衡１ヒしておい
たアガロースマトリックスに結合された染料配位子ｒ　
Ｐｒｏｃ＋１ｏｎ　Ｊ赤色染料（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅ
ａａａｒａｈ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　　メリ
ーランド州、ベテスダ、　Ｃａｔ、　ＮｒＬＪ’９．２
ｔ　　ＳＡ　）の１０×／、ｔ（Ｉｎカラムを用いたア
フィニティクロマトグラフィー技術によシ更に精製した
。ＩＬ−／の染料配位子カラムへの結合を最適化するた
めに、ＤＥＡＥ　−８ｅｐｈａｏｅｌブールのイオン強
度はプールを１０ｒｎＭＴｒｌｓ−ＨＣＩ緩衝液ｐＨ８
’、／中で／＋４’で希釈することにより≠ＯｍＭ未満
に低下させた。染料配位子カラムは先ず弘カラム容の同
−出発緩佃Ｊ液で洗浄して未結合蛋白質を除去し、次い
で溶出をｌＳカラム容の１０ｍＭ　Ｔｒｌａ　−ＨＣＩ
緩衝液、ｐＨ１，／　中のＯ〜／、　ＯＭ　Ｎａ　ＣＩ
で構成されて込る醐形勾配で行った。本発明者等はＩＬ
−／活性が典型的には０、３０−０．　ｊｊＭ　ＮａＣ
１における鋭込ビークにお込て溶出されたことを見出し
た。カラム画分を集め上記の如く分析した。

ＩＬ−／の活性画分の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、約／７
．Ｊｒ００ダルトンの分子量を有する単一蛋白質バンド
を示した。上記の高分子祉バンドはカラムから溶出され
／！、ＯＤＤ及び／、２，０００ダルトンの低分子量の
バンドはより旨い塩濃反において溶出された。活性ＩＬ
−／画分について行われた分析は、約Ｊ、、２　Ｘ　１
０６Ｕ（ｒＪ　Ｉ　Ｌ　−／〕全ｉ（４、約り、ｚｘｔ
ｏ　Ｕ／ツの特異活性及び約Ａ、ｊμ９の全蛋白質含量
を示した。これはタタ俤を越えるＩＬ−／の総括純度及
び出発上澄液からの約３７％の収率に相当する。５ＤＳ
−ＰＡＧＥ及び染料配位子アフィニティクロマトグラフ
ィー後に集められた両分の銀染色から得られた単一の蛋
白質バンドから、又、分析された両分の特異活性からも
、ＩＬ−／分子の本質的な等質性は本発明によＶ）ＩＬ
−／の高収率を維持しながら達成されたことは明らかで
ある。

染料配位子アフィニティクロマトグラフィーから得られ
た等質なＩＬ−／は又上記の如く銀染色と共に二次元ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動によっても分析された。

この操作も首尾一貫して全く同一の分子量、即ち／７，
３００ダルトンにおいてμつの染色スポットをもたらし
、同一色を銀染色において染色した。これらのスポット
は出発上澄液のいずれのロットが使用されたかの如何に
拘らず、常に同一の位置及び同一の相対割合にあった。

最も強いスポットは６．３〜よ、りのｐＩを示した。

他の３つのスポットはｐＨ勾配がよｐ酸性になるにつれ
て、染色度が弱くなる。これらの結果はおそらく異った
アミド化の状態によシヒトＩＬ−／はＩｎ　ｖｉｖｏに
おいて異った荷電状態にあることを示してｂる。銀染色
が各スポットに対して全く同一の色をもたらすという事
実は同一の親蛋白質は全ての場合において染色している
可能性が最も強いことを示している。

例Ｖ アフィニティクロマトグラフイーーー色柊例３の代替法
として、例λからの活性画分をプールし、次いで染料配
位子がアガロースマトリックスに架橋されたＣ１ｂａｏ
ｒｏＰＢｌｕｅ　３４　Ａ染料（Ｂｅｔｈｅａｄａ　　
Ｒｅａｅａｒｏｈ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓメリー
ランド州、ベセスダ、Ｃａｔ、ＮｃＬ−ｔりｏｔａ　Ｓ
Ａ）で構成されている他は例３において使用されたのと
本質的に同一のアフィニティクロマトグラフィー技術に
より更に精製する。活性画分につｂて行われた分析は約
ｊ、０Ｘ１０’ＵのＩＬ−／の全活性及び約７、ｔＸＩ
ＯＵ／ツの特異活性を示し、それは赤色染料由来ＩＬ−
／中に存在してｂた活性の約１０％であった。よｐ高い
純度を達成するためには、青色染料配位子アフィニティ
クロマトグラフィーからの活性画分を集め、その操作を
繰り返すことが出来る。

例よ アミノ酸組成分析 例３或いは弘からの精製ＩＬ−／をｒ、　７　Ｎ　ＨＣ
Ｉ（濃ＨＣＩ　（Ｋｏｄａｋ　、　　二！−−ヨーク州
、ロチニスター）から再蒸留）中において、真空中で２
弘時間及び≠ｇ時間沸騰させて、ペプチド結合の加水分
解及び遊耐アミノ酸の放出を行なった。加水分解後、試
料を真空乾燥し、次いで０．．２Ｎのクエン酸ナトリウ
ム、ｐＨ，２，，２中に再懸濁させた。これらの試料を
次いでニンヒドリン検出を用いる嘔−カラムＬ　Ｋ　Ｂ
　Ｍｏｄｅｌ　ｔｌ／！０−　Ａｌｐｈａ　（英国、ケ
ンブリッジ）アミノ酸アナライザー中に注入した。存在
する特別のアミノ酸の僅に対応する出力「ピーク」の面
積をＬＫＢ　Ｍｏｄｅｌ　、２．２．２０　記録積分計
にょｐ積分した。

本技術により決定されたヒトＩＬ−／のアミノ酸組成を
下記の表Ｉに示す。表■に示される如く、上記アミノ酸
分析からはグルコサミン或いはガラクトサミンは観察さ
れず、これはヒ）ＩＬ−／は単−分子量種としてポリア
クリルアミドゲル上を移動するという、本発明者等の従
来の発見に一致するものである。これらの観察の一方或
いは両方はもしヒトのＩＬ−／が、付着した炭水加物部
分を含むならば反対となるであろう。この様にして、ヒ
ｌ−Ｉ　Ｌ　−／が糖蛋白質であることは有９そうにな
−。

表　　１ Ａｓｐ／Ａａｎ　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　／　　弘Ｔｈｒ　　　　　　　１ Ｂａｒ　　　　　　　／　／ Ｇｌｕ／Ｇｉｎ　　　　　　２２ Ｐｒｏ　　　　　　　６ Ｇｌ）’　　　　　　　／　／ Ａｌａ　　　　　　　１ Ｃｙｓ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
７米Ｖａｌ　　　　　　　／／ Ｍ・ｔ４を 山　　　　　　　　　　ｔ Ｌａｕ　　　　　　　　　　　／／ Ｔｙｒ　　　　　　　　　　　４ｔ ｐｈ・　　　　　　　　　　／１ Ｈｌａ　　　　　　　　　　　３ Ｌｙｅ　　　　　　　　　　　／Ｊ Ａｒｇ　　　　　　　　　　　３ 米アミノ酸配列分析よシ決定 （７ｇ） 例６ 分子のＮ−末端部分のアミノ酸配列分析例３或いは≠の
染料配位子アフィニティクロマトグラフィーからの等質
ＩＬ−／を含有する画分を先ず脱イオン蒸留水で７０倍
に希釈し、／　Ｎ　ＨＣＩでｐＨ≠、０に調整し、次い
でｏ、ｓｍノ床容量の５ＰＳＣ−，２ｊ　　クロマトグ
ラフィーカラムに進用した。ＩＬ−／の適用前にカラム
をθ、／Ｍクエン酸ナトリウム、０．ＯｊＭ　ＮａＣ１
，ｐＨ４’、πｍ成されている緩衝液で平衡化させた。

ＩＬ−／の負荷後カラムを１０ｍノの同一緩衝液で洗浄
し、次込で、２ｏ　ｍ、ｌの脱イオン蒸留水で洗浄した
。その後、ＩＬ−／を１０ｍＭホウ酸ナトリウムｐＨり
、Ｏで溶出した。

第１の配列決定分析操作にお−で、上記の如く濃縮した
／／、／μｇの等質なＩＬ−／を真空乾燥し次い”？？
　Ａｐｐｌ　ｉｅｄ　　Ｂｌｏａｙａｔｅｍａ　Ｍｏｄ
ｅｌ　４′７０蛋白質配列決定器を周込て直接的に自動
化アミノ末端Ｅｄｍａｎ分解に付した。この方法によｐ
本発明者等は、ＩＬ−７分子のＮ−末端部分が次の配列
のアミノ酸残基よすなることを発見した： （７り） ＮＨ２−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−８ｅｒ−Ｌ
ａｕ−Ａａｎ−Ｃｙａ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｍ
ｐ−８ｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｌｙａ−８ｅｒ−Ｌｅ　
ｕ　−Ｖａ　ｌ　−Ｍｅ　ｔ− 第一の配列決定分析操作において等質なＩＬ−／を酵素
トリプシンで分別し、次−で自動化配列決定分析に付し
た。ＩＬ−７分子のトリプシンによる分別前にリジン残
基の側鎖を特別の試薬無水シトラコン酸で保護した。こ
の目的のために、ＳＰＳ　　Ｃ−，２！；カラム溶出液
からの画分な真空中で／ｖｔｌの最終容積まで濃縮した
。／μｔの無水シトラコン酸（Ｐｌｅｒｏｅ　）を１ｉ
ＩＬ−／に添加し、次りでｐＨをｔＮＮａＯＨでｒ、　
Ｊに調整した。反応混合物を７５分間攪拌し、室温で７
時間放置した。

その時点において、第一の７μｍ２の無水シトラコン酸
を添加し、反応混合物を更に１５分間攪拌し、次いで混
合物をよＮ　ＮａＯＨでｒ、３の最終ｐＨに諺整した。

室温において更に／時間放置後ｉｏｏμｔの／　Ｍ　Ｔ
ｒｌａ　−ＨＣＩ、ｐＨ７，４’及びｌｏｏμｔの７Ｍ
　ＮＨＩＩＨＣＯ５、ｐＨ７，ｆを反応混合物に姉加し
て保護工程（ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｐｒｏａａａ＠）を完
結させた。

次に、λμｇをＴＰＣＫ−処〕里トリプシン（Ｗｏｒｔ
ｈｌｎｇｔｏｎ　）　（１０μｌ−の７０ｍＭ　ＨＣＩ
、　　ｐＨ２，０中）を反応混合物に添加し、ＩＬ−／
分子をアルギニン残基において切断した。トリプシン添
加後、混合物をゆっくり５秒間攪拌し、次いで３７℃に
おいて一時間インキュベートした。インキュベージロン
時間の完了後、更に一μｇのＴＰＣＫ−処理トリプシン
を添加し、混合物を更に一時間３７℃でインキュベート
した。混合物を次いで室温に冷却し、り０％のギ酸（Ｂ
ａｋｅｒ　）でｐ）ｆ、２．５に調整した。室温で弘時
間放置後酸１生化された混合物を０、　、ｔ　ｍｌＯ＆
Ｍグアニジン−ＨＣｌを添加して希釈し、次いで予め水
中０．／　％　Ｔ　Ｆ　Ａ　（’ｔ’／ｖ）で平衡化し
ておいた弘ｊＸ、２ｊｏｍｍのＶｙｄａａ　、２Ｉｌｒ
　ＴＰカラムにＢｅａｋｍａｎ　Ｍｏｄｅｌ　／／、２
ポンプ（ＢｅｃｋｍａｎＩｎａｔｒｕｍｅｎｔｓ　、　
　Ｄｉｖｉａｌｏｎ　ｏｆ　Ｓｍ１ｔｈ　　Ｋｉｌｎｓ
Ｂｅａｋｍａｎ　）を用いて約／　ｍｌｙ’３−）−の
流速で注入した。

この負荷されたカラムを先ず水中０．／％ＴＦＡ（ｖ／
ｖ）で洗浄し、未結合成分を除去し、次いで工Ｌ−／ペ
プチド類を０．　ｊ　’１７分の割合で１ｍ７７分の流
速でＯ，／＊ＴＦＡ（ｖ／Ｖ）中０〜１００％アセトニ
トリルの線形勾配でカラムから溶出させた。

ペプチド類の溶出は、、２Ｊｏｎｍ波長における紫外線
分光光度法により検出した。

ＩＬ−／ペプチド類を含有する個々の画分成層は４以上
の両分より構成されて込るプールの配列決定を、自動化
アミノ末端ＥｄｍａＨ分解によｐ行った。配列決定前に
ＩＬ−／を含有するＨＰＬＣ画分をゲル電気泳動により
分析して、各両分中のペプチドの数を決定した。その後
、ペプチド類を真空濃縮して約３０μｔの最終容積にし
て調整されたフィルター上にスポットし、次−で件℃に
おいて加熱室で乾燥した。乾燥フィルターをＡｐｐＨｅ
ｄＢｉｏｍｙａｔｅｔｎｓ　ＭｏｄｅＩ　Ｎ［Ｌ　１１
７θＡ　自動化蛋白質配列決定器中に入れた。この操作
によｐ本発明者等は、Ｎ−末端部分近辺のヒ）ＩＬ−／
分子の主たる断片は次のアミノ酸残基の配列より構成さ
れていることを発見したｌ　　Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ
−Ｍｅｔ−８ｏｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−
Ｌｅｕ−Ｌｙｉ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｈｌａ−Ｌｅｕ−Ｇ
ｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａａｐ−Ｍａｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌ
ｎ−Ｇｌｎ−（、ｒｚ） Ｖａ　１−Ｖａ　ｌ　−Ｐｈ　ｓ。

この配列のＮ−末端の最初の四つの残基は上記において
直接自動化蛋白質配列決定により求められたＣ−末端の
最後の四つの残基と一致し、この中間配列は上記Ｎ−末
端配列の続きであるとの結論に導く。

例７ 例／の第１段落において説明したようにして調製された
単核細胞をＲＰＭＩ−１４ｔＯ培地中にｌＯ係ウシ胎児
血清（Ｖ／ｖ）と共にプラスチック培養フラスコに入れ
た。１３７℃における一時間のインキュベージ１ン後、
非付着細胞を傾瀉分離し、フラスコに次−で：ｌＯ１１
１７ｍ、ｌ　Ｅ、　ｏｏｌ　ｌ　Ｌ　Ｐ　Ｓを含有する
追加の血清補給ＲＰＭＩ−＃μＯ培地を再び満たした。

７６時間後、利殖ＬＰＳ刺戟細胞なＲＮＡとして採取し
た３、 全ＲＮＡは付−４件単核細胞から上記Ｃｈｌｒｇｗｉｎ
等の方法により抽出した。この操作において、グアニジ
ニウムチオシアネートを使用してＲＮａａｅによるＲＮ
Ａ加水加水分速度を越える速度でＲＮ（ｇ３） ａａｅを含む細胞蛋白質を変性した。ｍＲＮＡは細胞蛋
白質からセシウムクロライドの密なりッションを介して
超遠心分離により除去した。

その後、ポリアデニル化ｍ　ＲＮ　Ａを上記マニアナイ
ス等の文献ｌり７により開示されている方法を用−てオ
リゴ（ｄＴ）−セルロースクロマトグラフィーカラム上
て抽出蛋白質から分離した。簡単に述べると、カラムを
２０ｒｎＭ　Ｔｒｉａ−ＣＩ　（ｐＨ７，＆）、０、！
　Ｍ　Ｎａ１ｌ　、　／　ｒｎＭエチレンジアミン四酢
酸（「ＥＴＤＡ」）及び０．７係ＳＤＲによシ構成され
ている適用緩衝液で準備した。蛋白質ペレットを水及び
適用緩衝液に溶解し、次込でカラムに負荷した。非吸着
物質を先ず適用緩衝液で洗浄し、次いで０．１Ｍ　Ｎａ
Ｃ１を含有する適用緩衝液による追加の洗浄により溶出
した。保持されたポリアデニル化ｍ　ＲＮ　Ａはｉｏｒ
ｎＭ　Ｔｒｉａ−ＣＩ　（ｐＨ７，ｚ　）、１ｍＭ］ｌ
ｉ！ＤＴＡ及び０．Ｏｊ俤ＳＤＳによジ構成されてｈる
減少されたイオン強度の緩衝液を用−て溶出した。溶出
されたポリアデニル化ｒａＲＮＡを−に℃において／／
１０容酢酸ナトリウム（ＪＭＳｐＨ、ｒ、、ｚ）及びコ
０．２容のエタノールを用すて沈殿させた。ポリアデニ
ル化ｍＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）−セルロースカラムから
溶出後、ポリアデニル化ｍＲＮＡの完全性を上り己マニ
アティス等の文献／タタにおいて詳説されて騒るアガロ
ースゲルによる電気体動により確認した。

ポリアデニル化ｍ　ＲＮ　Ａはメチル水銀アガロースに
よる電気体動により大きさの分類を行った。

ｒｎＲＮＡの異った大きさの群に対応するゲル画分を成
因で上述の如さ、ウサギ網状赤血球溶解物を使用して或
いはカエルＸ、ラエビス卵母細胞に注射して１ｎ　ｖｌ
ｔｒｏで翻訳した。網状赤血球翻訳ｆｉｌｎはｍ　ＲＮ
　Ａ注射卵母細胞により放出された液体について、上記
アッセイを用すてＩＬ−／活性の存在を試験した。Ｉｎ
　ｖｔｔｒｏで翻訳された際に、工Ｌ−／活性を生じた
ｍ　ＲＮ　Ａゲル画分をａ　Ｄ　Ｎ　Ａ構成のためのｍ
ＲＮＡ源として選択した。

例？ ｅ　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリーの構成 ｍＲＮＡに対応する二本鎖ｅ　Ｄ　Ｎ　Ａのライブラリ
ーを例７の１＃製ｍ　ＲＮ　Ａから上記マニアナイスら
の文献、２２りにより詳説されてｂる標準的操作方法を
用いて調製した。オリゴ−ｄＴをｒｎ　ＲＮ　Ａのポリ
アデニル化された尾部にハイブリッド化させ、第１のａ
ＤＮＡ鎖の逆転写のためのプライマーとして用すた。酵
素鳥類骨髄芽球症ウィルス（ｒＡＭＶＪ　）の逆転写酵
素がｍ　ＲＮ　Ａを鋳型として用１．ｎ”ｒ第１（７）
ＤＮＡ鎖を合成した。この方法の結果、最初のａＤＮＡ
鎖の３′末端にヘセビンループが形成され、それは第２
のａＤＮＡ鎖の一体的プライマーとして役立った。ｍＲ
ＮＡ鎖をＮａＯＨで分解後、第一のｃＤＮＡ鎖をＤＮＡ
ポリメラーゼ■を用いて合成した。次すでヘヤピンをヌ
クレアーゼｓｌで除去して二本鎖ｏ　Ｄ　Ｎ　Ａ分子を
形成した３゜この二本鎖ａＤＮＡを５ｅｐｈａｏｒｙｌ
　Ｓ　−４１００（Ｐｈａｒｒｎａａｌａ　　Ｆｌｎｅ
　Ｃｈｅｍｌｏａｌｍ　）カラムクロマトグラフィーに
より大きさ分類に分別し、末端標識化されたｐＢＲｊ、
２．２ＤＮＡの断片を分子１ｉｔマーカーとして用いる
アルカリアガロース電気原動を使用する分析により追跡
した。、、！；００ｂｐ未溝の長さを有するＤＮＡ鎖は
これらの望ましくな込ａＤＮＡ画分の不必要なりローニ
ングを避けるために除外した。

上記の如く調製された二本鎖ａ　Ｄ　Ｎ　Ａ画分を上記
マニアナイス等の文献の、２３りに始まる方法によりｐ
ＢＲｊ、２２プラスミド（Ｐｈａｒｒｎａｃｌａ　Ｆｉ
ｎｅＣｈｅｍｌａａｌｍ　）のＰａｔ　１部位中に挿入
した。この操作において二本鎖ｏ　Ｄ　Ｎ　Ａはその３
′末端においてポリ（ｄＣ）でテーリングされた。　　
プラスミドｐＢＲＪ、２．２をＰａｔ　　Ｉエンドヌク
レアーゼで〆白化し、次いで３′末端にボＩＪ（ｄＧ）
でテーリングした３゜テーリングされたプラスミドＤＮ
Ａ及びテーリングされたａＤＮＡをアニーリング緩倫液
（Ｑ　／　ＭＮａＣｌ、１０ｍＭ　Ｔｒｌｇ　−ＣＩ　
（ｐＨ７４）及び１０ｍＭＥＴＤＡ）でアニーリングし
、新規な組換えプラスミドを形成した。ここに記載され
る全ての制限酵素はＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　　Ｂｌｏｌ
ａｂａ、マサチューセッツ州、ベバリーから市販されて
いるものである。。

これらの組み換えプラスミドは上、＋己ハナーンの操作
方法を用いてＥ、　ｃｏ口函株ＭＦＶ１．２タグ中に形
質転換された。ここに用−られたＥ、０ｏｌｌ＋細胞は
高められた割合のＭｇ２＋中における生育にょｐ調製さ
れた。形質転換宿主をプレート増養し、次すで形質転換
体を表現形同定剤としてテトラサイクリンを使用して同
定した。この技術を使用することにより、本発明者等は
約−×１０６個の独立の形質転換体を得た。

例？ 合成オリゴヌクレオチドスクリーニングプローブの調製 上記例ｔにおけるようにして！！１４　ｆｆしたａ　Ｄ
ＮＡライブラリーのスクリーニングにおけるプローブと
して合成オリゴヌクレオチドを使用した。このプローブ
は次の組成よシ構成されているものであったｒ　　ｊ’
ＡＣＴＴＧ　　ＴＴＧ　　ＴＴＣＣＡＴ　　ＧＴＣＴＴ
Ｇ　ＧＣＣＴＴＧ　ＣＡＧ　ＧＴＧ　ＣＡＧ　ＧＧＣＴ
ＴＴＣＡＧ　ＴＴＣＧＴＡ　ＧＧＧ　ＧＣＣＧＧＡ　Ｃ
ＡＴ　ｊ’。

このオリゴヌクレオチドプローフ゛は上ｄ己スート等の
文献及び上記ヒロセ停の文献に１睨されてｂるトリエス
テル法により化学的に合成されたものであった。

化学合成が完了後、オリゴヌクレオチドプローブのｊ′
−末端を５２ｐで標識化した。標識化を容易にするため
にオリゴヌクレオチドのｊ′末端はＯＨ末端で合成され
、それによＪＤＮＡ断片の標識化をする際に典型的に使
用されなければならないホスファターゼ処理を除去した
。椋職化方法は／μｔの合成オリゴヌクレオチドをｌｔ
μｔの　Ｐ−ＡＴＰ（，３０００ａｔ／ｍＭ）、７μｍ
（＃）Ｕ）のＴ４ｊポリヌクレオチドキナーゼ及びコμ
ｔの１０Ｘキナーゼ緩衝液■に添加することを含むもの
であった。１０×キナーゼ緩衝液Ｉは０．ｊＭ　Ｔｒｉ
ａ　−ＣＩ　（ｐＨ７，Ａ）、０、　／　Ｍ　ＭｇＣ１
ｇ、１０ｍＭジチオスレイトール、／ｍＭスペルミジン
及び／ｍＭＥＴＤＡより構成されているものであった。

反応は３７℃で３０分間行われ、その後合成されたオリ
ゴヌクレオチド類をフェノール／クロロホルムで抽出し
た。標識化されたプローブを未標識化オリゴヌクレオチ
ド類から５ｅｐｂａｄｅｘ　Ｇ　−ｊＯカラム（Ｐｈａ
ｒｍａｃｌａ　ＦｉｎｅＣｈｅｍｌｏａｌｍ　）上のク
トマトグラフイー或いはそれを通しての遠心分離によｐ
分離した。１例ｉ。

ｏ　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリーのスクリーニング上記例り
におりて調製した。ＤＮＡライブラリーの最初のスクリ
ーニングを容易に行うために形質転換細菌培養物を各々
、約２ｏｏｏ個の形質転換体の異ったクローンを有する
群にプール分けした。プラスミドＤＮＡをイシスーホロ
ヴイッツ及びパーク（Ｉａｈ　−Ｈｏｒｏｗｌａｚ　ａ
ｎｄ　Ｂｕｒｋｅ　、　　タＮｕａ１．Ａｏｌｄｉ＋　
　Ｒｅｓ、、２りｔり（／りｒ／）〕　に詳説されて込
る標準的アルカリ溶解法により宿主卸１菌の試料から除
去した。単離されたプラスミドをλつの７ラグメントに
分離した。これは先ずプラスミドを完全にＰｖｕ　Ｕ及
びＨｌｎｄｍ　で消化することにより達成された。この
目的のために、プラスミド類を、２０ｔｉｔの／　Ｘ　
Ｈｌｎｄ　■緩衝液（７ｍＭ。

Ｔｒｉｍ、　（ｐＨ７、≠）、７ｍＭ塩化マグネシウム
、６０ｍＭ　ＮａＣ１）に再溶解し、次いで／μｔのＰ
ｖｕ　ＩＩＩ及びｌμｔのＨｌｎｄ　ｍ制限エンドヌク
レアーゼな（りＯ） 添加した。この混合物を３７℃で一時間インキユベート
した。

次に、プラスミド消化物を適当な大きさのマーカーを用
いてｏ、ｒ％アガロースゲルによる電気ｔＫ動により分
別した。アガロースゲルは上記サザンにより説明されて
いる係準的方法を用いてニトロセルロースフィルター上
にプロットさせた。この転移操作後、フィルターを風乾
し、約ｒθ℃で真空下に一時間焼成し、ＤＮＡ断片をニ
トロセルロースに結合させた。

結合されたＤＮＡを次いで標識化されたオリゴヌクレオ
チドプローブと７）イブリッド化した。簡単に述べると
、焼成されたニトロセルロースを６×クエン酸ナトリウ
ム塩水（ｒｓｓｃＪ　）（ＪＸＳＳＣは１００ｍ）のＨ
２０中／７ｊ′、３９のＮａＣ１及びｒｒ、、ｚｇのク
エン酸ナトリウムによｐ構成され、ｐＨは１０　Ｎ　Ｎ
ａＯＨで７．０に調整されてｌる）中に予備浸漬し、次
いでＡＸＳ８０％０３％ＮＰ≠Ｏ洗剤、０．７％ザレオ
シル５．．ｔ　Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ　　の溶液（ｏ、
ｏ２チＦｌａｏｌｌ、　０．０．２５６ポリビニルピロ
リ（り／） トン、０．０．２％ＢＳＡ）及び／　００　ｔｉｌｌ／
　ｍ、ｌの変性鮭精液Ｄ　Ｎ　Ａ　（Ｓｌｇｒａａ　　
Ｔｙｐｅ　ＩＵ、ナトリウム塩）よｐ構成されている前
ハイブリッド化緩衝液中において５０℃でλ〜μ時間イ
ンキュベートした。

フィルターを、次−で上記ハイブリッド化溶液中にお込
て５２ｐ−標識化オリゴヌクレオチドプローブ（１０’
　ａｐｍ／μｐ　）　（例３からのもの）でｊｏ”ｃに
おいて一晩インキエベートした。−晩のハイブリッド化
彼、フィルターを室温で十分にｔｘｓｓＣで洗浄し、成
因でｊＯ℃で＋ｘｓｓｃにより！分間洗浄した。風乾後
フィルターを一７０℃でオートラジオグラフィーに付し
た。

オートラジオグラフィーから本発明者等は幾つかのハイ
ブリッド化バンドを見出した。プラスミドＤＮＡがハイ
ブリッド化バンドを生成したクローンのプールをプレー
トから取多出し次−で上記と同一のハイブリッド化条件
下にお−て標識化されたオリゴヌクレオチドプローブを
用いたニトロセルロースペーパー上の直接細菌コロニー
ハイブリッド化に使用した。この方法により、単一のコ
ロニーが同定された。

例／／ スクリーニングされたｃＤＮＡの制限酵素マツピング ＩＬ−／Ｘ−／μと称されるプラスミドが例１０に示さ
れた操作により同定された陽性のコロニーから調製され
た。Ｅ、ｃｏｉｌ菌株ＲＲ／中に形質転換されたＩＬ−
／Ｘ−／＆プラスミドの試料はＡＴＣＣに寄託番号３タ
タ２ｊで寄託されている。その後このＩＬ−／Ｘ−／ｌ
Ａプラスミドを、線形化されたＤＮＡの末端標識化され
た断片の部分消化を含む上記スミス及びプリンスチール
により開発された技術を用いて制限酵素マツピングによ
り分析した。

ＤＮＡ断片をそれらのｊ′末端においてポリヌクレオチ
ドキナーゼ及び　Ｐ−ＡＴＰを用いて　Ｐ−ホスホリル
基で標識化した。標識化したＤＮＡ鎖を次いで非対称的
に適当な制限酵素で切断して各々その一方の末端で標識
された二つの断片を与えた。これらの標識化された断片
をゲル電気泳動により単離した。これらの二つの断片の
各々を適当な制限酵素により部分的に消化した。大きな
スペクトルの消化断片が生成されるが、標識化された断
片は各々共通の標識化された末端を有する単純な重複系
列を形成する。これらの断片をゲル電気泳動により分別
し、次いでオートラジオグラフィーにより検査した。ゲ
ル上の断片の位置は、プラスミドＤＮＡＫ沿った制限部
位の順序に直接対応する。

この操作により本発明者等は、ＩＬ−／遺伝子の領域に
おけるＩＬ−／Ｘ−１４ｃのプラスミドの制限部位を第
３図に示されるように部分的にマツピングした。遺伝子
の制限部位間に示される番号は塩基対にある部位間の近
似的距離に対応する。

例１．２ スクリーニングされたｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの配列化第３図に
示されるＤＮＡセグメントの配列決定は以下に述べる変
化を除いては上記ＡｍｅｒｓｈａｍＨａｎｄｂｏｏｋに
記載されている方法と本質的に同一のジデオキシ連釦−
停止方法により行った。Ｉ）　ＮＡ上セグメントＨｌｎ
ｄ　ｍ及びＰａｔ　Ｉ制限エンドヌ（り４Ｌ） フレアーゼで消化し、次いで得られたＤＮＡ断片をＭ２
Ｓ一本釦フィラメント状ファージベクターの菌株ｍｐ／
Ｊ’及びｍｐ／り（Ａｍｅｒｓｈａｍ、イリノイ州アー
リントンハイツ）にクローン化させた。上記ノランダー
等の文献に示されているこれらのｍｐＩＩ及びｍｐ／タ
ファージベクターは次の独特のクローニング部位を含有
する：　Ｈｉｎｄ　ＩＩＴ　；　Ｓｐｂ　Ｉ　；Ｐａｔ
　Ｉ　；Ｓａｌ　Ｉ　；Ａｃｅ　Ｉ　；ＨｌｎｃＩＩ　
；Ｘｂａ　Ｉ　；ＢａｍＨＩ　；Ｘｍａ　：［；Ｓｍａ
　Ｉ　；Ｋｐｎ　Ｉ　；Ｓｓｔ　Ｉ　；及びＥｃ。

ＲＩ　０ｍｐ　／ｒ及びｍｐ／タベクターの組成は上記
制限部位の順序がｍｐ１５Ｐベクターにおいては反対に
なっていることを除いては同一であり、従って、ＤＮＡ
セグメントの測鎖をこれらの二つのベクターを用いて便
利に配列決定することが出来る。これらのｍｐ／Ｊ’及
びｍｐ／タベクターは第３図のｃＤＮＡセグメントの断
片をその中に挿入されて菌株に／、２のＥ、　ｃａｌｌ
　　ＪＭ　１０３及びＪ　Ｍ　１０！　（Ｂｅｔｈｅａ
ｄａＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉａｇ　　
、メリーランド州、ベセスダ）を形質転換するために使
用され、センス及びアンチセンス鎖の１本釦インサート
を含有（タオ） する複製１本＠ＤＮＡ鋳型を生成した。

合成のユニバーサルのプライマー：　ｊ’−ＣＣＣＡＧ
ＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴ−Ｊ’　（Ｐ　−Ｌ　　Ｂｌｏｃ
ｈｅｍｌｃａｌｇ、ウィスコンシン州、ミルウォーキー
）ヲアニーリングして、１本鎖ＤＮＡ鋳型にし、上記ヌ
クレオチドμ７６〜μ７７（第μ図）の位置から上流及
び下流のＤＮＡ合成を開始するのに使用した。その後、
延長断片をゲル電気泳動により大きさ分離し、オートラ
ジオグラフにかけ、断片のヌクレオチド断片を推定した
。三つの追加のプライマーを使用して、第μ図のＤＮＡ
のセンス釦に沿った中間位置からの合成を開始した。ヌ
クレオチドＪ７／　−ＩＪｒ（第１図）に対応するｊ／
−ＣＴＧＧＡＧＡＧＴＧＴＡＧＡＴＣＣ−３’の組成を
有するプライマーを使用して。

ヌクレオチドＮｒ１６ｔＩｒから下流方向へのセンス鎖
の合成を開始した。このブライマー釦の組成はユニバー
サルなプライマーを使用して予め得られた配列情報から
確立された。組成：　ｊ′−ＧＡＴＡＴＡＡＣＴＧＡＣ
ＴＴＣＡＣ−３／　　（第１図のヌクｖオーｉ−ドＩｊ
／〜ｒｔｒに対応）の第２の合成プライマーを使用して
ヌクレオチドＮｎ、ｒＡ、ｒから下流方向のセンス鎖の
配列化をした。配列ニオ’−ＧＡＴＴＣＧＴＡＧＣＴＧ
ＧＡＴＧＣ，？’（ヌクレオチド南２３３〜Ｎｎ　、２
／ｒに対応）を有する第３のプライマーを使用してヌク
レオチドＮｎ２／Ｉから上流方向のアンチセンス釧の配
列化を行った。

上記の「歩み寄り（ｗａｌｋ　ｄｏｗｎ　）　Ｊ　　法
により、第３図のプラスミドｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの両釦は重
複した方法で配列決定され、それによりそれらのヌクレ
オチド配列が確認された。本発明の趣旨から離れること
なく釦に治った他の位置から釦延長を開始するためにそ
の他の合成プライマーを使用することが可能であったこ
とが了解されるべきである。上記ブライマー鎖は上記文
献のスート等及び上記ヒロセ等の文献に詳説されている
トリエステル法により化学的に合成されたものである。

しかしながら、ホスホジエステル法などによるその他の
公知の技術を使用して、プライマー鎚を合成することが
できることが了解されるべきである。

デオキシアデノシンｊ′（アルファー〔Ｓ〕チオ）トリ
ホスフェート（以下に「ｄＡＴＰ（：α−３５８）Ｊと
称する）をジデオキシ配列反応における放射活性標識と
して使用した・又、ＡｍｅｒｓｈａｍＨａｎｄｂｏｏｋ
の、？６頁に示されているゲルを使用する代υに６憾の
ポリアクリルアミドゲルを使用した（Ａｍポリアクリル
アミドゲル、θ、４ＡＩＩ１１厚、７Ｍ尿素１００ｍＭ
　Ｔｒｉ８ホウ酸塩（ｐｕｆｆ、／）及びコｍＭＥＤＴ
Ａ含有）。

上記の如く第３図のプラスミドＤＮＡのヌクレオチド配
列は第４図に図示されている。このＤＮＡのセグメント
は成熟ＩＬ−／をコードするＩＬ−７遺伝子の領域を含
むことが見出された。これらのヌクレオチド類は第４図
のＤＮＡセグメントの始めから番号を付されている。ヌ
クレオチド配列及び蛋白質配列分析により求められた対
応するアミノ酸は適当なコドンの上に示されている。Ｉ
Ｌ−、／遺伝子のアミノ酸配列は、ＩＬ−７分子の成熟
ＮＨ２−末端、即ち第４図において矢印で印されている
Ａｌａ残基（ここからアミノ酸残基の付番が始まる）か
ら停止コドンＴＡＡの直前のＳｅｔ残（７ｇ） 基（Ｎ［１１ｓ３）まで延びている。各種制限酵素切断
部位も第１図に示されている。第４図におけるＩＬ−／
遺伝子のコード化領域は第３図における箱で囲んだ部分
に図示されている。

ＩＬ−／のアミノ酸配列研究は上記スターン等の文献の
方法に従って行われたが、この方法においてはシアノー
ゲンプロマイドを用いてＩＬ−／をメチオニン残基にお
いて切断した。得られた断片は標準的イオン交換方法に
より大きさにより分離された。単離されたペプチド断片
は次いでＡｐｐｌｉｅｄ　　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　　
Ｍｏｄｅｌ　’１７０蛋白質配列決定器を用いて自動化
アミノ末端Ｅｄｍａｎ　　分解により配列決定された。

この方法により本発明者等は、ヌクレオチド配列により
得られた結果、即ちＩＬ−／蛋白質のＣ−末端がアミノ
酸配列：　Ｇｉｎ−Ｐｂｅ−Ｖａｌ−８ｅｒ−８ｅｒに
より構成されていることを確認した。これは、「天然」
のＩＬ−／はｍ　ＲＮ　Ａからの翻訳後この分子末端か
らのアミノ酸除去により生成されないことを確立する。

これは、第１図のＩＬ−／遺伝子のヌクレオチド配列（
り９） から相当な量のＲＮＡ配列がＩＬ−／のその前駆体から
の成熟に際し、ＩＬ−／遺伝子のＮ−末端から除去され
ているのが明らかであるので重要である。

例／Ｊ 成熟ＩＬ−Ｉの発現 ＩＬ−／遺伝子のコード化領域を第３図のｃＤＮＡクロ
ーンから除去し、次いでｐＹＡＤＨシャトルベクター中
に挿入して組み換え発現プラスミドｐＹＡＤＨＩＬ−／
を形成した。ｐＹＡＤＨＩＬ−／シャトル発現ベクター
を調製するための再構成図式を第３図に示す。このプラ
スミドはＥ。

ｃｏｌｉ宿主細胞中で増幅され１次いで成熟ＩＬ−ｌの
高割合発現のために酵母宿主細胞を形質転換するために
使用される。発現されたＩＬ−／の官能性は上記胸腺細
胞増殖及びＩＬ−２転換アツセイを用いて確認された。

Ｈｐａｎ部位（第４図の塩基すｌ！７）から遺伝子の３
１側面領域に至るＩＬ−／遺伝子のコード化領域の主た
る部分を上記マニアティス等の文献の１０１１に示され
ている標準的実験方法においてＨｐａ■及びＰｓｔＩ制
限酵素を使用することにより第３図及び第≠図に図示す
るｃ　Ｄ　Ｎ　Ａプラスミドセグメントから除去した。

このＩＬ−／遺伝子セグメントは、遺伝子の！′末端に
正確に対応する便利な制限部位が見出されなかったので
遺伝子のｊ′末端から、２９ヌクレオチド下流に位置す
るＨｐａｎ部位においてｃ　Ｄ　Ｎ　Ａクローンから切
断した。切り出されたＩＬ−／遺伝子セグメントのＪ’
−ＰｓｔＩ部位はＴ≠ＤＮＡポリメラーゼで満たされ以
下に述ベルシャトルベクターの５ｔｕＩ部位と適合性の
あるプラントエンドを形成した。

ＩＬ−／遺伝子のコード化領域の！′末端部分を戻し添
加するため及びコード化領域の！′末端において翻訳開
始コドンな創り出すために合成オリゴヌクレオチドを化
学的に合成ｌ−た。このオリゴヌクレオチドの組成は下
記表Ｈに示す如（Ｅｃｏ　ＲＩ付着ｊ′末端に続いてＡ
ＴＧ開始コドンがあり、次いでＩＬ−／遺伝子のコード
化領域のＪ−／末端（Ｈｐａｎ部位に至る）を含む。表
■に示されたオリゴヌクレオチドは上記スート等及び上
記ヒロセ等の文献に詳説されているトリエステル技術に
より、化学的に合成されたものであるが、このオリゴヌ
クレオチドはホスホジエステル法などの他の方法により
調製することができることが了解されるべきである。

又、ＩＬ−／遺伝子のコード化領域をＨｐａ　ＩＩ部位
において切断する代りに第１図のプラスミドｃ　Ｄ　Ｎ
　Ａを遺伝子のｊ′側面領域における制限酵素において
切断することも可能である。その後側面領域のヌクレオ
チド類は標準的技術により逐次除去することができる。

ｐＹＡＤ）ｌシャトルベクターは、この合成オリゴヌク
レオチド及び切り出されたＩＬ−／遺伝子のコード化領
域の主たる部分と連結するために上・記マニアティス等
の文献の／Ｑμにおいて示されている標準的技術により
ベクターを制限エンドヌクレアーゼＥｃｏ　ＲＩ及びＳ
ｔｕ　Ｉを用いて完全に消化することにより調製された
゛。ｐＹＡＤＨプラスミドの消化から得られた所望のよ
り大きな断片はθ、７憾アガロースゲル上１００ボルト
において、２．２℃で２時間電気泳動を行うことにより
単離された。

第５図に示す如く１合成りＮＡオリゴマー、ＩＬ−／遺
伝子のコード化領域の切り出された主たる部分及び所望
の線形化されたｐＹＡＤＨ断片は、１００μＩのｐｙ　
　ＡＤＨベクター断片（ＥｃｏＲＩ−Ｓｔｕ　Ｉ　）　
、グＯμｇの主たるＩＬ−／　　ｃＤＮＡ断片（Ｈｐａ
ＩＩ　−Ｐｓｔ　Ｉ　Ｃプラント〕）、ｊμｌの合成オ
リゴヌクレオチド（ＥｃｏＲＩ　−ＨｐａＩＩ　）、／
　ｐｉのＴ４ｔ　ＤＮＡリガーゼ及び十分なＴ≠リガー
ゼ緩衝液（０，４’　Ｍ　Ｔｒｉｍ　（ｐ　Ｈ７，ＩＩ
　）、（７，／ＭＭｇＣ１２，０、／　Ｍジチオスレ（
￥’；ｂ　、　１０　ｍ　Ｍスペルミジン、１０ｍＭ　
ＡＴＰ及びＩｎＩ！７ＺｍｌＢＳＡ）より構成されてお
り、　２０μｌの反応容量を形成する反応混合物中で一
緒に連結された。反応は７３℃において１３時間インキ
ュベートすることにより行われた。

得られたｐＹＡＤＨＩＬ−／と称される組み換えプラス
ミドを次いで上記ポリバー等及び上記ピーコック等の文
献に示されているような標準的形質転換技術を用いてＥ
、　ｃｏｌｉ菌株ＲＲ／中に形質転換させた。宿主細胞
を培養してｐＹＡＤＨＩＬ−／プラスミドを増幅し、次
いでプラスミドを上記マニアティス等の文献３ｔ♂及び
上記イシューホロビッツ及びパーク等により詳説されて
いる標準的アルカリ方法により宿主細菌から除去した。

プラスミドＤＮＡを上記マニアティス等の文献のり３に
示されているセシウムクロライド−エチジウムブロマイ
ド密度勾配における平衡になるまで遠心分離して精製し
た。本発明の範囲及び趣旨から離れることなく、その他
のＥ、　ｏｏｌｉから増幅されたプラスミドＤＮＡを抽
出／濃縮する技術を使用することが出来ることを了解す
べきである。

上記の如く調製された増幅ｐＹＡＤＨＩＩＬ−ｌプラス
ミドを次いで使用して標準的技術によりＳ、セレビジア
エ（Ｓ、Ｃｅｒｅｖｉａｌａｅ　）のプロターゼ欠陥酵
母菌株２０Ｂ−／ｊ（アルファ、ｐｅｐ４Ｌ、３゜Ｔｒ
ｐ／）を形質転換させた。形質転換に先立ち、：１ＯＢ
−／２菌株なＹＰ−グルコース培地（，２００ｍ１　）
中の培養液中で生育させて、２　Ｘ　１０７細胞個／ｍ
ｅの培養物を得た。これらの細胞を、２ｊ　”Ｃにおい
てｔ分間１ＯＯＯｘ、９の遠心分離で採取し、次いで得
られたペレットを無菌蒸留水で洗浄した。

これらの酵母細胞を次いで２ｏ　ｍｌの８ＥＤ（／Ｍソ
ルビトール、、）、３ｍＭ　ＥＴＤＡ（ｐＨｒ、０〕、
及び３０ｍＭジチオスレイトール）中に再懸濁させて濃
縮し、３０”Ｃ，でｉｏ分間インキ−ベートした。細胞
（／θ２） 一緩衝液混合物を次いで３０θ×Ｉで５分間遠心分離し
た。ペレットを２ｏｏｍｌの／Ｍソルビトールで一度洗
浄し、細胞を２ｏｍｌのＳ　ＣＥ　（／Ｍソルビトール
、０，１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨｊ、Ｊ’）、Ｏｌ
ｌＭＥＴＤＡ）中に再懸濁した。細胞壁を破壊スるため
にグルスラーゼをｏ、　、ｚ　ｍＡ！の量で溶液に添加
し１次いで溶液を時々静かに振盪しながら３０℃で３０
分間インキュベートした。

スフ二口プラストの存在は、１０μｌの酵母細胞を顕微
鏡スライド上の一滴のｔｌドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ
　Ｄ　Ｓ　）　（ｗｔ／ｖｏｌ、　）中に稀釈し、ｐｏ
。

×位相差における「ゴースト」を観察して分析したＯ 細胞混合物を次いで３００　Ｘ　ｇで３分間遠心分離し
た。得られたペレットを、２ｏｍｌの／Ｍソルビトール
で２回洗浄した。ペレットを次いで１回８ＴＣ（／Ｍソ
ルビトール、１０ｍＭ　ＣａＣ１、／九ＴｒｉｓＨＣｉ
　（ｐＨ７，４’　）　）で洗浄した。

酵母スフ二ロプラストを次いでペックス〔Ｂｅｇｇａ、
　　　２７！　　　Ｎａｔｕｒｅ　　　（Ｌｏｎｄｏｎ
　　）　　＃）！（／り７ｆ）〕から適用された方法に
おいて予め調製されたプラスミドベクターを用いて形質
転換した。ペレット化されたプロトプラストをｌ、θμ
ｌの５ＴＣＫ懸濁させ、次いで１０μｌの使い捨てチュ
ーブ（ＦａＩｃｏｎす、２０３り）中のｔｏｏｍｌのア
リコートに分割した。

次いでｌ〜７０μｌのＤＮＡプラスミドを各アリコート
（Ｏ，！〜！μＩ〕に添加した。混合物を室温で７０分
間静置し、次いで１１ｎＡ’のＰＥＧ（，２０４ＰＫＧ
Ｉｔ０００．１０ｍＭ　ＣａＣｌ２．１０ｍＭ　Ｔｒｉ
ｍ　−ＩＨＣＩ　（ｐＨ７，４／’））を各アリコート
に添加してＤＮＡ摂取を促進した。室温において１０分
後、混合物を３１ＯＸＩにおいて５分間遠心分離した。

得られたペレットを１ｊＯｐｌのＳＤ８（１０ｍｌの２
Ｍツルピトー　ル、Ａ、７　μｌのＹＥＰ　（θ、／３
ｍｌの７ＭのＣａＣ１゜：Ｚ”）ｐｉの／４ｏイシン、
及び３．７ｒｕｌのＨ２Ｏ）　）に再懸濁させた。この
混合物を３０”Ｃで２０分間インキュベートした。

その後、プロトプラス）／ＤＮＡ混合物を／１．２Ｍソ
ルビトール及び３憾寒天を含む酵母最少培地の存在下に
おいてｔＳ℃で且つトリプトファンなしにプレート培養
した。この最少培地はｌ：）ｊ７Ｄｉｆｃ。

酵母、９素塩基、ｏ、Ｊ′４カザミノ酸、２０７）グル
コースより構成されているものであった。プロトプラス
）／ＤＮＡ混合物をこの培地中に維持することによりＴ
ｒｐ　／遺伝子を含有する形質転換体のみが生き残った
。

生物学的子ノセイの前に、形質転換体を最少培地から富
有培地（／＝ｆｉ酵母エキス、２係ペプトン１．２噛グ
ルコース）に接種し、後期指数的生長相まで３０℃でｉ
ｓ　−，２ｏ時間生育させた。採取時にプロテアーゼｍ
Ｗ　剤フェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳ
　Ｆ　’）を／ｍＭまで添加した。培養物を次いで≠Ｏ
Ｏｘｇで遠心分離して細胞をペレット化した。その後細
胞を１度０，１ｖｏ１．の冷Ｈ２０中において洗浄した
。破壊するために細胞を／ｍＭＰＭＳ　Ｆを含有する０
、／　ｖｏｌ、の冷Ｈ２０に再懸濁させ、ガラスピーズ
（％容）を用いて２分間渦巻き攪拌させた。細胞残骸及
びガラスピーズを遠心分離によりペレット化した。得ら
れた上澄液はＩＬ−／活性を示すことが判明した。これ
は上澄液を上記胸腺細胞増殖及びＩＬ−／転換アッセ・
イの両者において利用することによυ確認された。

本発明の分野の当業者には明らかな如く、本発明の趣旨
即ち本質的特徴から離れることなく特に開示された実施
態様以外の形態で本発明を実施することが可能である。

従って、上記本発明の特別の実施態様はあらゆる面にお
いて例示的なものであり限定的なものではない。本発明
の範囲は前記説明に含まれる具体例に限定されるもので
はなく冒頭の特許請求に掲げられる通りのものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は青色染料配位子の部分的構造式を図示するもの
である。 第一図は赤色染料配位子の部分的構造式を図示するもの
である。 第３図はＩＬ−／遺伝子の部分的制限地図を図示するも
のである。 第μ図は一枚よりなり、第３図のヌクレオチド断片に含
まれるＩＬ−／遺伝子のヌクレオチド配列及び対応する
アミノ酸配列を図示するものであり、ヌクレオチドは第
μ図に示された配列の始めから番号を付されており、ア
ミノ酸は蛋白質の成熟ＮＨ２−末端、即ち矢印で示され
たＡｌａ残基から残基番号ｌｊ３の停止コドンＡＴＴま
で番号が付されている。及び 第５図は官能性ＩＬ−／を発現する目的で酵母宿主を形
質転換するために使用されたシャトルベクターにおける
ＩＬ−遺伝子の解読領域をクローン化するために使用さ
れた術策を図示するものである。 出願人代理人　　　猪　股　　　　清 ＦＩＧ、２ ＦＩＧ、４（Ａ） Ｐｒｏ　　ＩＩｓ　　Ｐｈｅ　　Ａａｎ　　Ａｌａ　　
ＧｉｎＣＣＴ　　ＧＡＧ　　ＣＴＣＧＣＣＡＧＴ　　Ｇ
ＡＡＰｒｏ　　Ｇｌｕ　　Ｌｅｕ　　Ａｌａ　　Ｓａｒ
　　Ｇｌｕ　　１ＧＡＴ　　ＧＡＣＴＴＧ　　ＴＴＣＴ
ＴＴ　　ＣＡＡＡＩ！ｐ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｐ
ｈｅ　ＧｌｕＴＣＣＴＴＣＣＡＧ　　ＧＡＣＣＴＧ　　
ＧＡＣ９ａｒ　Ｐｂｅ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｔ、ｅｕ　Ａ
ｓｐＣＴＡ　　ＣＧＡ　　ＡＴＣＴＣＣＧＡＣＣＡＣＬ
ｅｕ　Ａｒｇ　Ｔｉｅ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　１ｌｉｅＧＣ
Ｇ　　ＴＣＡ　　ＧＴＴ　　ＣＴＴ　　ＧＴＧ　　ＧＣ
ＣＡｌａ　　Ｓｅｒ　　Ｖａｌ　　Ｖａｌ　　Ｖａｌ　
　ＡｌａＣＣＣＴＧＣＣＣＡ　　ＣＡＧ　　ＡＣ（ｔ　
　ＴＴＣＰｒｏ　Ｃｙａ　　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　
ＰｈｅＣＣＣＴＴＣＡＴＣＴＴＴ　　ＣＡＡ　　ＧＡＡ
Ｐｒｏ　　Ｐｈｅ　　Ｉｌｅ　　Ｐｈａ　　Ｇｌｕ　　
Ｃ１ｕＡｓｐ　Ｌｙｓ　　Ｔｉｅ　　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　
　Ａｌａ、ｙ８　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｔｒｐ＾６
ｐ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　にＩｎ１ｅｔ　Ｍｅｔ　Ａｌａ　
Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　ｔｉｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　ＧｌｕΩ
亮　日月　去　　カール−ジエーーマー　　アメリ五仝
辛岡ワＳノソトソＡＩ　　Ｓノア　ｋ　Ｊし　壬Ｉズ　
丁７々１チ　　　　　　　　　　　　　ブリュ Ｏ発　明　者　　ブルース、ニー、モス　　アメリリー
　　　　　　　　　　−セカ ０発　明　者　　バージニア、エル、プ　　アメリライ
ス　　　　　　　　　ニュ、 ンド、エヌイー、８２１５ 力合衆国ワシントン州、シアトル、ボイアー、アベイ−
スト、２６１７

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、約１７，５００ダルトンの分子量及び次の部分アミ
   ノ酸配列によって特徴付けられる等質な蛋白質としての
   インターロイキン１； 【アミノ酸配列があります】 ２、第４図における残基Ｎｏ．４３〜残基Ｎｏ．１５２
   のアミノ酸配列を更に含んでなる、特許請求の範囲第１
   項記載の等質なインターロイキン１。 ３、免疫応答を仲介する能力を有し、次のアミノ酸残基
   配列を含む等質な蛋白質； 【アミノ酸配列があります】 ４、第４図における残基Ｎｏ．４３〜残基Ｎｏ．１５２
   のアミノ酸配列を含んでなる、特許請求の範囲第３項記
   載の等質な蛋白質。 ５、約１７，５００ダルトンの分子量及び次の近似アミ
   ノ酸組成を有する単一蛋白質種により本質的に構成され
   ている等質なヒトインターロイキン１； ￥アミノ酸￥　　￥分子当りの残基の数￥ Ａｓｐ／Ａｓｎ　１４ Ｔｈｒ　　　　　　８ Ｓｅｒ　　　　　１１ Ｇ１ｕ／Ｇｌｎ　２２ ｐｒｏ　　　　　　６ Ｇｌｙ　　　　　１１ Ａｌａ　　　　　　８ Ｃｙｓ　　　　　少なくとも１ Ｖａｌ　　　　　１１ Ｍｅｔ　　　　　　４ ｌｌｅ　　　　　　６ Ｌｅｕ　　　　　１１ Ｔｙｒ　　　　　　４ Ｐｈｅ　　　　　１１ Ｈｉｓ　　　　　　３ Ｌｙｓ　　　　　１３ Ａｒｇ　　　　　　３ ６、更に次のＮ−末端アミノ酸残基の配列により特徴付
   けられる、特許請求の範囲第５項記載の等質なヒトイン
   ターロイキン１分子； 【アミノ酸配列があります】 ７、特許請求の範囲第６項記載の配列の連続部分を形成
   する次のアミノ酸残基の配列により更に特徴付けられる
   、特許請求の範囲第６項記載の等質なヒトインターロイ
   キン１分子； 【アミノ酸配列があります】 ８、第４図の残基Ｎｏ．４３〜残基Ｎｏ．１５２のアミ
   ノ酸配列により更に特徴付けられる、特許請求の範囲第
   ７項記載の等質なヒトインターロイキン１分子。 ９、インターロイキン１の粗製溶液から等質なインター
   ロイキン１を製造する方法であって、インターロイキン
   １の粗製溶液を支持体マトリックスに結合されたトリア
   ジニル染料配位子に接触させる工程、粗製溶液の未結合
   成分をマトリックスから洗い出す工程、及び等質なイン
   ターロイキン１を配位子から溶出する工程を含んでなる
   ことを特徴とする方法。 １０、インターロイキン１の該粗製溶液が末梢血液白血
   球及び単核細胞よりなる群から選ばれた細胞から調製さ
   れる、特許請求の範囲第９項記載の方法。 １１、該単核細胞が単核細胞白血病性脾臓細胞、リンパ
   細胞及び肺胞マクロファージよりなる群から得られる、
   特許請求の範囲第１０項記載の方法。 １２、インターロイキン１をトリアジニル染料配位子と
   接触させる前に、粗製インターロイキン１の溶液をイオ
   ン交換クロマトグラフィーにより先ず部分的に精製する
   ことを含んでなる、特許請求の範囲第９項、１０項或い
   は１１項記載の方法。 １３、粗製インターロイキン１の溶液のイオン交換クロ
   マトグラフィーが、 粗製溶液を陽性或いは陰性に荷電した基のいずれかを有
   する第１のマトリックス上を通過させ、第１のマトリッ
   クスから結合したインターロイキン１を溶出し、及びイ
   ンターロイキン１の活性を示す画分をプールし、且つ、 第１のマトリックスから溶出されプールされた活性画分
   を第１の基とは反対の極性に荷電した基を有する第２の
   マトリックス上を通過させ、第２のマトリックスから結
   合したインターロイキン１を溶出し、及びインターロイ
   キン１の活性を示す活性画分をプールする、 ことを含んでなる、特許請求の範囲第９項〜第１２項の
   いずれか一項に記載の方法。 １４、マトリックスの少なくとも１つがデキストランゲ
   ルの重合体、ポリアクリルアミドゲルの重合体、及びセ
   ルロースの荷電誘導体よりなる群から選ばれたマトリッ
   クスにより構成される、特許請求の範囲第９項〜第１３
   項のいずれか一項に記載の方法。 １５、トリアジニル染料配位子が赤色染料配位子及び青
   色染色配位子よりなる群から選ばれる、特許請求の範囲
   第９項〜第１４項のいずれか一項に記載の方法。 １６、該トリアジニル赤色染料配位子が共にアミノベン
   ゼン環架橋により結合された第１及び第２のｓ−トリア
   ジン環を含んでなり、該第１及び第２のｓ−トリアジン
   環は各々スルホン化ナフトリンを含んでなる置換基を有
   し、該スルホン化ナフトリンがアゾ架橋でそれに結合さ
   れたスルホン化ベンゼン環を含む置換基を有する、特許
   請求の範囲第９項〜第１５項のいずれか一項に記載の方
   法。 １７、トリアジニル青色染色配位子が二置換ｓ−トリア
   ジン環を含み、置換基の一方が該ｓ−トリアジン環にス
   ルホン化ベンゼン環で結合されたアントラキノンを含み
   、他方の置換基がスルホン化ベンゼン環を含む、特許請
   求の範囲第９項〜第１５項のいずれか一項に記載の方法
   。 １８　トリアジニル染料配位子がアガロース、ポリアク
   リルアミド類、セルロース及びシリカ−ベース無機材料
   よりなる群から選ばれたマトリックスに結合されている
   、特許請求の範囲第９項〜第１７項のいずれか一項に記
   載の方法。 １９、トリアジニル染料配位子が高分子量デキストラン
   に結合され、それが次いでマトリックスに結合されてい
   る、特許請求の範囲第９項〜第１８項のいずれか一項に
   記載の方法。 ２０、ヒトＩＬ−１分子の発現をコード化する実質的に
   純粋なＤＮＡ。 ２１、次のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含んでな
   る、特許請求の範囲第２０項記載の実質的に純粋なＤＮ
   Ａ： 【アミノ酸配列があります】 ２２、次の核酸配列にハイブリッド化するＤＮＡを含ん
   でなる、特許請求の範囲第２０項又は第２１項記載の実
   質的に純粋なＤＮＡ： 【核酸配列があります】 ２３、第４図の核酸塩基Ｎｏ．４２８〜核酸塩基Ｎｏ．
   ８８６の核酸配列により更に特徴付けられる、特許請求
   の範囲第２０項、２１項又は２２項のいずれか一項に記
   載の実質的に純粋なＤＮＡ。 ２４、第４図の核酸塩基Ｎｏ．８０〜核酸塩基Ｎｏ．８
   ８６の核酸配列により更に特徴付けられる、特許請求の
   範囲第２０〜第２３項のいずれか一項に記載の実質的に
   純粋なＤＮＡ。 ２５、第４図の残基Ｎｏ．１〜残基Ｎｏ．１５３のアミ
   ノ酸配列により特徴付けられる、特許請求の範囲第２０
   項〜第２３項のいずれか一項に記載の実質的に純粋なＤ
   ＮＡ。 ２６、第４図の核酸塩基８０〜８２に相当する残基から
   Ｎｏ．１５３の残基までのアミノ酸配列により特徴付け
   られる、特許請求の範囲第２０〜第２５項のいずれか一
   項に記載の実質的に純粋なＤＮＡ。 ２７、第３図における制限エンドヌクレアーゼ地図によ
   り特徴付けられる、特許請求の範囲第２０項〜第２６項
   のいずれか一項に記載の実質的に純粋なＤＮＡ。 ２８、第３図の制限ヌクレアーゼ断片と実質的に完全に
   ハイブリッド化している本質的に純粋なＤＮＡ分子。 ２９、ＩＬ−１の遺伝子を含むｃＤＮＡ配列を含んでな
   る組み換えＤＮＡクローニングベクター。 ３０、第４図の核酸塩基Ｎｏ．４２８〜核酸塩基Ｎｏ．
   ８８６の核酸配列により特徴付けられる、特許請求の範
   囲第四項記載の組み換えＤＮＡクローニングベクター。 ３１、第４図の核酸塩基Ｎｏ．８０〜核酸塩基Ｎｏ．８
   ８６の核酸配列により特徴付けられる、特許請求の範囲
   第２９項〜第３０項のいずれか一項に記載の組み換えＤ
   ＮＡクローニングベクター。 ３２、第４図の残基Ｎｏ．１〜残基Ｎｏ．１５３のアミ
   ノ酸配列をコードする核酸配列を含んでなる、特許請求
   の範囲第２９項又は第３０項記載の組み換えＤＮＡクロ
   ーニングベクター。 ３３、第３図の部分制限エンドヌクレアーゼ地図により
   特徴付けられる、特許請求の範囲第２９項〜第３２項の
   いずれか一項に記載の組み換えＤＮＡクローニングベク
   ター。 ３４、特許請求の範囲第２９項〜第３３項のいずれか一
   項に記載のクローニングベクターにより形質転換された
   宿主。 ３５、第４図の残基Ｎｏ．１〜残基Ｎｏ．１５３のアミ
   ノ酸配列をコード化するＤＮＡ配列の一部分に相補的な
   ｃＤＮＡに対応する合成オリゴヌクレオチドハイブリッ
   ド化プローブ。 ３６、次のヌクレオチド配列を含んでなる、特許請求の
   範囲第３５項記載の合成オリゴヌクレオチドハイブリッ
   ド化プローブ： 【ヌクレチド配列があります】 ３７、第３図の部分的制限ヌクレアーゼ地図を有するプ
   ラスミドＩＬ−１Ｘ−１４（ＡＴＣＣＮｏ．３９９２５
   ）。 ３８、特許請求の範囲第３７項記載のプラスミドにより
   形質転換された宿主。 ３９、第４図の核酸塩基第８０〜核酸塩基第８８６の核
   酸配列を有するプラスミド。 ４０、特許請求の範囲第３９項のプラスミドにより形質
   転換された宿主。