JPS6270398A - ウシインタ−ロイキン−２遺伝子のクロ−ニングおよび同定 - Google Patents
ウシインタ−ロイキン−２遺伝子のクロ−ニングおよび同定Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明はウシインタ−ロイキン−２（以後ｂＩＬ−２と
略す）に関し、より詳細にはヒトインターロイキン−２
（ＩＬ−２）の相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）か
ら誘導されタプローブを使用して、ｂＩＬ−２ｍＲＮＡ
を含むウシメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）から合
成されたｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするこ
とによるｂＩＬ−２遺伝子のクローニングに関する。 従来技術 ＩＬ−２はリンパ球の反応性を調節することができ且つ
抗原特異的エフェクターＴリンパ球の長期ｉｎ ｖｉｔ
ｒｏ培養を促進（有機分裂誘発）することができる可溶
性タンパク質であって、過去においてマウス、ラットま
たはヒトのリンパ球細胞をマイトジエンで刺激すること
により産出された。 例えば、モーガン（Ｍｏｒｇａｎ）らのＳｃｉｅｎｃｅ
．１９３：１００７（１９７６）およびラセッティー（
Ｒｕｓｃｅｔｔｉ）らのＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１９
：１３１（１９９７）は、プールした正常ヒトリンパ球
を、同じヒト由来の血清およびマイトジエン植物凝集素
（フイトヘマグルチニン；以降ＰＨＡと略す）を含有す
るロスウエル・パーク・メモリアル・インスチチュート
−１６４０培地（Ｒｏｓｗｅｌｌ ＰａｒｋＭｅｍｏｒ
ｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ−１６４０ｍｅｄｉｕｍ；
以後ＲＰＭＩ−１６４０と略す）中で培養する方法を開
示した。 ギリス（Ｇｉｌｌｉｓ）およびスミス（Ｓｍｉｔｈ）の
Ｎａｔｕｒｅ，２６８：１５４（１９７７）は、ウシ胎
児血清（以後ＦＣＳと略す）を含むＲＰＭＩ−１６４０
培養中で正常ＤＢＡ／２マウス脾臓細胞をマイトジエン
コンカナバリンＡ（以後ＣｏｎＡと略す）で刺激したこ
とによるネズミＩＬ−２の産生を報告した。 フアラー（Ｆａｒｒａｒ）らのＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，
１２１：１３５３（１９７８）は、また正常マウス血清
（以後ＭＭＳと略す）を含む組織培養倍地中Ｃｏｍ Ａ
と共にインキュベートしたネズミ脾臓細胞からのＩＬ−
２の産生を開示した。 ギリスらは熱失活ＦＧＳ、ペニシリン−Ｇおよびゲンタ
マイシンを補足したＲＰＭＩ−１６４０組織培養培地中
で培養したネズミおよびラットの脾臓細胞からのＩＬ−
２の産生を報告した。ネズミおよびラットの脾臓細胞は
ＣｏｎＡ、ＰＨＡおよびアメリカヤマゴボウマイトジエ
ン（ｐｏｋｅｗｅｅｄｍｉｔｏｇｅｎ；以後ＰＫＭと略
す）を含む種々のマイトジエン類で刺激された。Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．，１２０：２０２７（１９７８）を参照
されたい。 ＩＬ−２はまたヒト末梢血液単核細胞を、同じヒト由来
の血清、ペニシリン、ゲンタマイシン、新しいＬ−グル
タミンおよびＰＨＡを補足したＲＰＭＩ−１６４０培地
中で培養することにより産生された。ギリスらのＪ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．，１２４：１９５４（１９８０）を参照
されたい。 ギリスらのＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２５：２５７０（
１９８０）は熱失活ＦＣＳ、２．５×１０−５Ｍ２−メ
ルカプトエタノール、Ｎ−２−ヒドロキシ−ピペラジン
−ＸＩ１−２−エテン−スルホン酸（以後ＨＥＰＥＳと
略す）緩衝液、ペニシリン、ストレプトマイシンおよび
新しいＬ−グルタミンを補足したＭＰＭＩ−１６４０中
で培養したＴ細胞白血病及びリンパ腫細胞胞株、特にＢ
１０．ＢＲマウス由来の放射線誘発脾臓リンパ腫（ＬＢ
ＲＭ−３３）からのＩＬ−２の産生を明らかにした。こ
の培養物はＣｏｎＡおよびＰＨＡを含む種々のマイトジ
エン類で刺激された。 これらのマウス、ラット及びヒト正常Ｔリンパ球から精
製されたＩＬ−２は多様な生物活性：例えば（１）胸脾
細胞有糸分裂の著しい促進、ワトソン（Ｗａｔｏｓｏｎ
）らのＪ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１５：８４９（１９７９
）およびギリスらのＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２４：１
９５４（１９８０）を参照；（２）抗原特異的ヘルパー
またはキラーＴ細胞株の長期 ｉｎ ｖｉｔｒｏ 増殖
の促進、ギリスらのＮａｔｕｒｅ．２６８：１５４（１
９７７）およびワトソンのＪ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１５
０：１５１０（１９７９）を参照；（３）ヌードマウス
脾臓細胞の培養における細胞障害性Ｔリンパ球（以後Ｃ
ＴＬと略す）反応性とプラーク形成細胞応答の誘発、ワ
トソンらの上記文献Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１５０：８
４９およびギリスらの上記文献Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，
１２４１９５４を参照；を保持することが見出された。 従って、ＩＬ−２が免疫応答を高揚して免疫不全Ｔ細胞
集団（ヌードマウス脾臓細胞）を正常レベルの細胞性／
体液性免疫に復帰させるのに有用であることを示してい
る。さらに、これらの結果はＩＬ−２の産生および応答
が異常免疫の臨床診断の際に有用でありうる免疫学的機
能の重要なパラメーターであることを示唆している。そ
の上、ヒトＩＬ−２が抗原特異的ヒト、マウスおよびラ
ットキラーＴ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖を可能にする
事実は、検索物質としてのヒトＩＬ−２の重要性を強調
するものである。 これらおよび類似の理由により、ヒトＩＬ−２は現在ヒ
トの臨床上の治療薬材として評価されつつある。ＩＬ−
２は免疫機能の重要な調節剤であり、また家畜の治療と
りわけストレスにより誘発されたウシの免疫不全の場合
に有効でありうる。 ウシが放牧地への輸送または放牧地から飼育地への輸送
の際に受けるストレスはステロイドホルモンの産生を高
め、そのステロイドホルモンが免疫応答の低下へと導く
という仮説はしばしば認められている。動物が飼育地へ
到着するとき、それらは低下した免疫反応性ゆえに普通
の最近やウィルスの感染の犠牲になってしまう（普通の
状況下では動物はこの種の感染に対抗する能力を有する
）。 いろいろなタイプの上部気道感染症が発生しうる。 この“輸送熱”症候群の結果は、この状態の動物が食欲
を失い、体重減少を起こし、さらにこれらの一般に拒否
される疾患の原因となる感染因子がもとで死ぬことさえ
あるということである。ギリスおよび共同研究者は、数
年前に、ステロイドホルモン類がＩＬ−２産生を減少さ
せるそれらの能力により免疫応答を劇的に低下させると
発表した。 実際に、ステロイド−抑制免疫応答にＩＬ−２をｉｎ
ｖｉｔｒｏ添加すると、免疫反応性が劇的に回復した。 これらの結果に基づいて、輸送熱症候群の治療における
ＩＬ−２の使用が、この症候群の排除をもたらし且つ輸
送により誘起される免疫不全の結果として失われる莫大
な金額の返還をもたらすであろうと示唆することは驚く
べきことでない。 都合が悪いことに、ｂＩＬ−２の産生方法は十分に明ら
かにされていない。その上、天然ｂＩＬ−２源はその治
療上の有効性を徹底的に研究するのに十分な量の均一な
ＩＬ−２を提供しうる利用可能な系であることを証明し
ていない。 比較的多量の均一なｂＩＬ−２を産生しうる１つの方法
は組換えＤＮＡ技術による。組換えＤＮＡ技術は、ひと
たび意図するタンパク質の遺伝子が単離および固定され
ると、そのタンパク質を経済的に産生するために開発さ
れた。タンパク質の産生に関するこの種の組換えＤＮＡ
技術の内容はＳｃｉｅｎｃｅ ｖｏｌ．１９６（１９７
７年４月）中の編集および補助論文に説明されている。 しかしながら、この文献に論じられている組換えＤＮＡ
技術を利用するためには、まずｂＩＬ−２をコードする
遺伝子を単離しなければならない。 発明の概要 本発明によれば、ｂＩＬ−２をコードする遺伝子がニッ
クトランスレーションされたヒトｃＤＮＡプローブを用
いてｃＤＮＡライブラリーから単離される。このプロー
ブはヒトＩＬ−２のヌクレオチド配列の一部に対応する
合成オリゴヌクレオチドプローブの使用によりヒトｃＤ
ＮＡライブラリーから単離する。全ウシＲＮＡは比較的
高レベルのｂＩＬ−２を産生することが知られているリ
ンパ腺細胞から抽出する。この全ＲＮＡ抽出物からポリ
Ａを含むｍＲＮＡを単離する。ｃＤＮＡライブラリーは
ポリＡ＋ｍＲＮＡを逆転写酵素により逆転写することに
よって作成される。このＤＮＡをＤＮＡポリメラーゼ■
で二本鎖となし、これを適当なクローニングベクター内
に挿入する。得られた組換えクローニングベクターは適
当な宿主を形質転換するために使用される。 形質転換宿主を同定して、プールに分ける。これらのプ
ールから得られたプラスミドＤＮＡは、放射性標識した
ヒトｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせる。プロー
ブに対して陽性の信号を与えるクローンのプールを同定
し、その推定上のプールをさらに分割してハイブリダイ
ゼーションによる検索を繰り返す。結局、ｂＩＬ−２遺
伝子を含む単一の形質転換細胞が同定される。この形質
転換細胞からプラスミドＤＮＡを調整し、ＤＮＡの塩基
配列決定により同定する。さらに、そのヌクレオチド配
列から対応するアミノ酸配列を決定する。ｂＩＬ−２遺
伝子のコーディング領域は、成熟ｂＩＬ−２を発現させ
るために、酵母と細菌の両方の発現系内にクローン化す
る。これらの発現系から得られた組換えｖＩＬ−２（以
後ｒｂＩＬ−２と略す）は、逆相高性能液体クロマトグ
ラフィー（ＨＰＬＣ）法により均一になるまで精製する
。 その後、発現したタンパク質産物がｂＩＬ−２であるこ
とを調べるためにパイオアッセイを実現し、そしてｒｂ
ＩＬ−２のアミノ酸組成とその配列について分析する。 発明の構成 ｂＩＬ−２産生細胞源： 好ましくは、比較的高レベルのｂＩＬ−２を産生するこ
とが知られている細胞からｃＤＮＡライブラリー（ｂＩ
Ｌ−２をコードする遺伝子はこのライブラリーから検索
されるだろう）を作成する。 これらの細胞源にはウシＴ細胞組織（すなわちリンパ腺
または脾臓）が含まれる。 活性化されたウシ末梢血液もまたｂＩＬ−２分子の源と
なりうる。本発明において使用するために、例えばフイ
コールハイパーク（ＦｉｃｏｌｌーＨｙｐａｑｕｅ）遠
心法のような標準方法を使って全血液から単核細胞を分
離することができる。採取した白血球は、血清含有培地
中でＴ細胞マイトジエンの存在下にｉｎ ｖｉｔｒｏ培
養することによって増殖させる。以下で説明するように
、本発明者らはマイトジエン刺激ウシ末梢血液細胞から
作成したｃＤＮＡライブラリーよりｂＩＬ−２遺伝子を
単離するのに成功した。 ｂＩＬ−２産生細胞からのＲＮＡの調製：チャーウィン
（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ）らのＢｌｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．
１８：５２９４（１９７９）およびマニアチス（Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ）らのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
，ａＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，コールド・
スプリング・ハーバー研究所、コールド・スプリング・
ハーバー、ニューヨーク（１９８２）に記載されるよう
な標準方法を使って、ウシＩＬ−２産生細胞から全ＲＮ
Ａを抽出する。 よく知られているように、細胞からＲＮＡを抽出する場
合、抽出の初期段階の間中リボヌクレアーゼ（ＲＮアー
ゼ）活性を最小限に抑えることが重要である。これを達
成するための１つの方法は、ＲＮアーゼを含む細胞タン
パク質を、ＲＮアーゼによるＲＮＡ加水分解の速度を超
える速度で変性することである。チャーウィンらの上記
文献およびマニアチスらの上記文献（１９６）の方法で
は、２−メルカプトエタノールのような還元剤と共にグ
アニジニウムチオシアネートを使用してタンパク質のジ
スルフイド結合を分解することにより、これを実施して
いる。ＲＮＡはフェノール／クロロホルム抽出、エタノ
ール沈殿または塩化セシウム沈降のような標準方法によ
りタンパク質から単離される。別法として、ＲＮＡは塩
酸グアニジンによる抽出およびそれに続くフェノール／
クロロホルム抽出によってタンパク質から分離すること
もできる。 次に、ポリＡ＋ｍＲＮＡを抽出タンパク質から分離する
。この分離操作を行うためにいくつかの技法が開発され
たが、１つの好適な方法はエドモンド（Ｅｄｏｍｏｎｄ
ｓ）らのＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ｄｃｉ．，６
８：１３３６（１９７１）、アラブ（Ａｖｉｖ）および
レイダー（Ｌｅｄｅｒ）のＰｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．，６９：１４０８（１９７２）およびマニ
アチスらの上記文献（１９７）に記載されるようなオリ
ゴ（ｄＴ）−セルロースカラムでポリＡ＋ｍＲＮＡをク
ロマトグラフ処理することである。オリゴ（ｄＴ）−セ
ルロースカラムは緩衝液で調製し、その後ｍＲＮＡをそ
のカラムから溶離する。ポリＡ＋ｍＲＮＡの完全性はゲ
ル電気泳動により証明される。 ｍＲＮＡからｃＤＮＡの調製： 先に調製および検定したｍＲＮＡに対応する二本鎖ｃＤ
ＮＡのライブラリーは、逆転写酵素を使用する既知技法
により作成される。本発明に関連して使用しうる１つの
このような方法は、カプラー（Ｇｕｂｌｅｒ）およびホ
フマン（Ｈｏｆｆｍａｎ）のＧｅｎｅ，２５：２６３−
２６９（１９８３）により修正された。マニアチスらの
上記文献（２３０）に詳述される方法である。簡単に述
べれば、ポリＡ＋ｍＲＮＡが第一のｃＤＮＡ鎖のための
プライマーとしてｍＲＮＡのポリＡ尾部にハイブリダイ
ズされたオリゴマーｄＴを使用することにより逆転写さ
れる。第二のｃＤＮＡ鎖はＤＮＡポリメラーゼ■、ＲＮ
アーゼＨおよび大腸菌ＤＮＡリカーゼの酵素類を使用し
て合成される。この方法は、マニアチスらの上記文献記
載の標準的なｃＤＮＡ合成法を単に使用する場合に必要
とされるＳ１ヌクレアーゼ（最初のｃＤＮＡ鎖の３′末
端に形成されるヘアピンループの切断を媒介する）を排
除する。二本鎖ｃＤＮＡは有利な手段によって分画化し
て比較的短いＤＮＡ鎖を除き、それにより小さなｃＤＮ
Ａ分画のむだなクローンを避ける。 本発明によれば、ｍＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを合成す
るために別の標準方法を使用し得ると理解するべきであ
る。１つのこのような別法はランド（Ｌａｎｄ）らのＮ
ｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，９：２２５１（１９８
１）に開示されている。ランドらの方法では、ヘアピン
ループが第二ｃＤＮＡ鎖のプライマーとして使用されな
い。むしろ、第一ｃＤＮＡ鎖の３′末端にはターミナル
デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）
を使用してｄＣＭＰ残基が付加される。これはポリーＣ
残基の３′尾部を生ずる。その後、第二鎖の合成が３′
尾部にハイブリダイズしたオリゴマーｄＧにより開始さ
れる。 この技法は、マニアチスらの方法においてヘアピンがＳ
１ヌクレアーゼで切断される場合に起こりうる第二ｃＤ
ＮＡ鎖の５′尾部の欠失部分を避けるのに役立つと言わ
れている。 ｃＤＮＡのクローニング： 次に、二本鎖ｃＤＮＡはクローニングベクター（このベ
クターは適合性の原核または真核宿主細胞を形質転換し
てそのベクターを複製するために使用される）に挿入さ
れる。その後形質転換細胞を同定し、その細胞からプラ
スミドＤＮＡを単離する。 本発明を実施するために、種々のクローニングベクター
を使用することができる。好適なものはプラスミドであ
るが、ベクターはバクテリオファージまたはコスミドで
ありうる。クローニングが哺乳動物細胞内で行われる場
合は、ウィルスをベクターとして使用することもできる
。 プラスミドを使用する場合、それは天然源から得られる
か、もしくは人工的に合成される。選ばれた特定のプラ
スミドは意図する形質転換用宿主（例えば大腸菌のよう
な細菌、酵母またはその他の単細胞微生物）と適合すべ
きである。そのプラスミドは使用される個々の宿主細胞
のための適切な複製開始点をもつべきである。また、プ
ラスミドは形質転換宿主細胞を容易に見分けることがで
き且つ形質転換を受けない細胞から容易に分離できるよ
うに表現型特性をもつべきである。この種の表現型特性
には増殖阻害物質（例えば抗生物質）に対して耐性を与
える遺伝子が含まれる。テトラサイクリン、ストレプト
マイシン、サルファ剤、ペニシリンおよびアンピシリン
を含む種々の抗生物質に対する耐性遺伝子をコードする
プラスミドは市販されている。 宿主細胞として大腸菌を使用する場合、本発明に関連し
て使用できる多数のクローニングプラスミドが市販され
ている。本発明の実施にとって好適なプラスミドはｐＢ
Ｒ３２２である。このプラスミドはサトクリフ（Ｓｕｔ
ｃｌｉｆｆｅ）のＣｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，４３：７７（１
９７９）に記載されるように、その塩基配列が完全に決
定されている。このプラスミドの利点は、それがアンピ
シリン耐性遺伝子中のＰｓｔ■部位を含めて１１個の特
異な既知制限部位を有するということである。この特徴
はホモポリマー付加法（ｈｏｍｏｐｏｌｙ−ｍｅｒ ｔ
ａｉｌｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）によってクローニングす
る際に特に有用である。 プラスミドの代わりにバクテリオファージを使用する場
合、この種のファージはプラスミドの選択に関して先に
示した特徴と実質的に同じ特徴をもつべきである。それ
には表現型マーカーおよび外来遺伝子結合用の連結可能
な末端の存在が含まれる。 好ましくは、本発明において、平滑末端を有する二本鎖
ｃＤＮＡがホモポリマー付加によってプラスミドベクタ
ー内に挿入される。当分野でよく知られているように、
この技法では相補的ホモポリマーがｃＤＮＡ鎖とプラス
ミドＤＮＡに付加される。その後、ベクターと二本鎖ｃ
ＤＮＡは相補的ホモポリマー尾部間の水素結合により一
緒に結合して、大腸菌のような宿主細胞を形質転換しう
る開環状ハイブリッド分子を形成する。 ホモポリマー付加の１つの方法では、約５０〜１５０個
のｄＡヌクレオチド残基を線状化プラスミドＤＮＡの３
′末端に付加する。同じ数のｄＴヌクレオチド残基を二
本鎖ｃＤＮＡの３′末端に付加し、その後ｃＤＮＡとプ
ラスミドを一緒に結合する。 別の好適な方法では、適当な制限酵素で切断したクロー
ニングベクターの３′末端にｄＧ尾部を付加する。例え
ば、ｐＢＲ３２２プラスミドを使用する場合、制限酵素
Ｐｓｔ■を用いてアンピシリン耐性遺伝子のところでそ
のプラスミドを消化する。 相補的ｄＣ尾部を二本鎖ｃＤＮＡの３′末端に付加し、
その後適当なアニーリング緩衝液を用いてそのｃＤＮＡ
をプラスミド内に挿入する。 二本鎖ｃＤＮＡはその他いろいろな標準方法によりプラ
スミドクローニングベクター内に挿入しうると理解すべ
きである。１つのこのような別法には、ＤＮＡリカーゼ
の使用により合成ヌクレオチドリンカーをｃＤＮＡ鎖の
両末端に結合されると、同じ制限酵素で切断したプラス
ミド内に挿入しうる接着末端が生ずる。シエラー（Ｓｃ
ｈｅ−ｌｌｅｒ）らのＳｃｉｅｎｃｅ，１９６：１７７
〜１８０（１９７７）；マニアチスらの上記文献（２１
９）を参照されたい。 上記のように作成した組換えＤＮＡプラスミドを使用し
て宿主細胞を形質転換する。宿主は適当な原核または真
核細胞のいずれであってもよいが、好ましくはそれは大
腸菌や酵母菌のようなよく知られた細菌である。この種
の宿主は容易に形質転換され、速やかに培養下で増殖す
ることができる。 サルモネラ菌や締炎菌のような他の種類の細菌を大腸菌
の代わりに使用してもよい。細菌の代わりに、例えば真
菌や藻類のような他の単細胞微生物を使用することもで
きる。どんな宿主が選ばれようと、それは組換えプラス
ミドを切断する制限酵素を含むべきでない。 大腸菌を宿主として使用する場合、好適な菌株はＭＭ２
９４およびＲＲ１である。プラスミドベクターによるＭ
Ｍ２９４宿主の性質転換法はよく知られており、マニア
チスらの上記文献（２５５）およびハナハン（Ｈａｎａ
ｈａｎ）のＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６：５５７（
１９８３）に記載されている。プラスミドベクターによ
るＲＲ１宿主の形質転換法もボリバー（Ｂｏｌｉｖａｒ
）らのＧｅｎｅ．２：９５（１９７７）およびピーコッ
ク（Ｐｅａｃｏｃｋ）らのＢｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ．Ａｃｔａ．，６５５：２４３（１９８１）に記載
されるように公知である。適切な宿主となり得るその他
の大腸菌株にはＤＨ１（米国２０８５２メリーランド州
、ロックヒル、パークローンドライブ１２３０１、アメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクション〔ＡＴＴＣ
〕寄託番号３３８４９）およびＣ６００が含まれる。こ
れらの菌株およびＭＭ２９４およびＲＲ１は広く商業的
に入手できる。 マニアチスらの上記文献およびハナハンの上記文献に記
載される方法を含めた形質転換法において、実際に形質
転換される宿主細胞は、その細胞によるプラスミドの取
込みが制限されるために、ほんの一部の細胞に限られる
。形質転換された細胞は、適当な培地および抗生物質の
ような表現型同定剤を含む寒天平板上でその細胞培養物
を培養することにより同定し得る。適当な耐性遺伝子（
例えば抗生物質耐性遺伝子）を有する細胞のみが生き残
るであろう。組換えｐＢＲ３２２プラスミドを用いて大
腸菌株ＭＭ２９４を性質転換する場合、形質転換細胞は
表現型同定剤としてテトラサイクリンを使用することに
より同定し得る。 放射性標識ｃＤＮＡスクリーニングプローブの調製： 上記のようにして作成したウシｃＤＮＡライブラリーを
スクリーニングするために、プローブとしてヒトＩＬ−
２をコードする遺伝子の大部分のヌクレオチド配列に対
応する７００塩基対（ｂｐ）から成る放射性標識ＤＮＡ
フラグメントが使用される。このプローブはヒトＩＬ−
２のヌクレオチド配列の一部に対応する放射性標識され
た合成オリゴヌクレオチドプローブを用いてヒトｃＤＮ
Ａライブラリーから単離する。 本発明のスクリーニング法において使用するｃＤＮＡプ
ローブを単離するために、まず初めに上記方法を使って
ヒトｍＲＮＡからヒトｃＤＮＡライブラリーを作成する
。ｍＲＮＡはＩＬ−２を産生することが知られているヒ
ト細胞株から抽出される。この種の細胞株にはＴ白血病
細胞株ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）またはそのクロー
ンのような種々のＴ細胞株が含まれる。この細胞株およ
びそのクローンは米国および外国の研究者により広く使
用されており、商業的にまたはＡＴＣＣから入手可能で
ある。ヒト細胞に由来する全ＲＮＡは、例えば２−メル
カプトエタノールと共にグアニジニウムチオシアネート
を使用するような上記標準方法により抽出できる。その
後、ホリＡ＋ｍＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）−セルロースに
よるクロマトグラフィーを使って抽出タンパク質から分
離する。 ヒトｍＲＮＡに対応する二本鎖ｃＤＮＡのライブラリー
は、先に論じたように、鋳型としてｍＲＮＡを使用して
第一のｃＤＮＡ鎖を形成するために逆転写酵素を使用す
ることにより作成される。次に、酵素ＤＮＡポリメラー
ゼ■および鋳型として第一鎖を使用して第二ｃＤＮＡ鎖
を合成する。この二本鎖ｃＤＮＡはベクター複製用の適
合性宿主細胞を形質転換するためのクローニングベクタ
ー内に挿入される。好ましくは、そのベクターは多数の
特異な制限部位をもつプラスミドｐＢＲ３２２のような
プラスミドから成る。ｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡ
は、上記のようなホモポリマー付加によりこのプラスミ
ド内に挿入することができる。その組換えプラスミドを
用いて、大腸菌株のような適合性宿主を形成転換する。 もちろん、その他の適当な宿主も使用できる。組換えプ
ラスミドにより形質転換された宿主細胞は、抗生物質の
ような標準的な表現型同定剤により同定される。 ヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための
プローブとして、放射性標識されたオリゴヌクレオチド
が合成される。ヒトＩＬ−２をコードする遺伝子のアン
チセンス鎖の一部から誘導されるプローブは次の組織：
５′−ＡＡ ＴＧＴ ＧＡＧＧＡＴ ＣＣＴ ＧＧＴ
ＧＡＧ−３′を有する。このプローブは第１図に示すセ
ンス鎖であり、比較的容易に合成しうる短鎖であるがヒ
トＩＬ−２遺伝子のプローブとして役立つ十分な情報を
含む長さであるという利点を有する。しかしながら、プ
ローブの組成は本発明の範囲または精神の他の部分に対
応し得ると理解すべきである。 合成オリゴヌクレオチドプローブは、ホスホジエステル
法またはトリエステル法のような公知技法により科学的
に容易に合成される。トリエステル合成法の詳細は例え
ばソード（Ｓｏｏｄ）らのＮｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．，４：２５５７（１９７７）およびヒロセ（Ｈｉｒ
ｏｓｅ）らのＴｅｔ．Ｌｅｔｔ．，２８：２４４９（１
９７８）に記載されている。合成後、オリゴヌクレオチ
ドプローブはＴ４ポリヌクレオチチドキナーゼおよび３
２Ｐ−ＡＴＰで標識される。標準的な標識方法はマニア
チスらの上記文献（１２２）に記載されている。有利に
は、０Ｈ５′末端を有するオリゴヌクレオチドプローブ
を合成することにより、一般に必要とされるホスファタ
ーゼ法を避けるのが望ましい。 ヒトｃＤＮＡライブラリーは、実施例３および４に詳述
される放射性標識合成プローブを用いてスクリーニング
する。その後、そのスクリーニング法によって固定され
た特定の陽性コロニーからプラスミドＤＮＡを調製する
。 ヒトプラスミドＤＮＡは以下で論ずるチェインターミネ
ーション法（Ｃｈａｉｎ−ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｍｅ
ｔｈｏｄ）によりその塩基配列を決定する。その塩基配
列決定の結果から、第１図に示すように、単離したプラ
スミドＤＮＡは実質的にヒトＩＬ−２遺伝子の完全なコ
ーディング領域を含むことが判明した。 単離したヒトプラスミドＤＮＡの実質的全長が、ウシｃ
ＤＮＡライブラリーをクリーニングするためのプローブ
として選ばれた。比較的大きいサイズのプローブ（３０
０〜５００ｂｐの範囲）は、ＩＬ−２をコードしないｃ
ＤＮＡフラグメントよりもむしろＩＬ−２を実際にコー
ドするｃＤＮＡとハイブリダイズする可能性を一般に高
める。以下で詳述するように、このプローブの使用によ
り、ｃＤＮＡライブラリーからｂＩＬ−２遺伝子を単離
するのに成功した。ヒトプラスミドＤＮＡフラグメント
のヌクレオチド配列の他の部分に対応するプローブも、
本発明の精神または範囲を逸脱することなく使用し得る
と理解するべきである。 ヒトｃＤＮＡプローブは、ウシｃＤＮＡライブラリープ
ールとハイブリダイズさせる前に放射性標識される。プ
ローブのサイズが比較的大きいために、いろいろな標識
方法を使用し得るが、好ましくは“ニックトランスレー
ション”でそのプローブを標識する。リグビー（Ｒｉｇ
ｂｙ）らのＴ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏ．，１１３：２３７
（１９７７）およびマニアチスらの上記文献（１０８）
に記載されるように、この公知技法では、ＤＮアーゼ■
での非常に制限された処理によりＤＮＡの広く分離され
た部位にニックが導入され、それによって各ニックに遊
離の３′−ＯＨ基が生じる。ＤＮＡポリメラーゼ■を使
用して３′−ＯＨ末端に適当な放射性標識デオキシヌク
レオチド三リン酸（３２ｐ−ｄＮＴＰ）を取り込ませ、
同時にニックの５′側からヌクレオチドを分解してＤＮ
Ａに沿ってニックの逐次移動（ニックトランスレーショ
ン）を生じさせる。 ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング：本発明のスク
リーニング法において、形質転換細胞は初めに約２５０
０個の形質転換細胞から成る比較的大きなグループにプ
ールされる。複製されたプラスミドは、アルカリ溶菌の
ようないくつかの公知方法のいずれかによって形質転換
細胞から抽出する。抽出したプラスミドはＰｓｔ■で切
断する。得られたＤＮＡフラグメントをアガロースゲル
での電気泳動により分画化し、次いでサザン（Ｓｏｕｔ
ｈｅｒｎ）のＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８：５０３（
１９７５）に記載されるサザンプロッティング法により
直接分析する。サザンブロッティング法でニトロセルロ
ースフィルターに固定したＤＮＡフラグメントは、標識
したＤＮＡプローブとハイプリダイズさせる。プローブ
とハイブリダイズする特定のＤＮＡフラグメントはオー
トラジオグラフィーで同定する。 オートラジオグラフィーにより強いハイブリッド形成バ
ンドを示すクローンの推定上のプールは、約５００個の
形質転換細胞から成るグループにさらに分割し、その後
標識ネズミｃＤＮＡプローブを使って上記のハイブリッ
ド形成スクリーニングを繰り返す。クローンの推定上の
プールを分割して形質転換細胞をスクリーニングするこ
の方法は、所望のプールの大きさが得られるまで繰り返
す。 その後、標識プローブとハイブリダイズする単一の形質
転換細胞が、グルンスタイン（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ）お
よびホグネス（Ｈｏｇｎｅｓｓ）のＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），７２：３９６１（１
９７５）に記載のよく知られたコロニーハイブリダイゼ
ーション法により同定される。この方法によって、本発
明者らは１つのこのような陽性コロニーを発見した。Ｂ
−ＩＬ−２−４と命名したプラスミドＤＮＡはこの特定
コロニーから得られる。 スクリーニングしたｃＤＮＡの同定： 上記のプラスミドＤＮＡは標準チェインターミネーショ
ン法によりその塩基配列を決定する。ヌクレオチドのこ
の塩基配列決定法はサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのＰｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、７０
：５４６３（１９７７）に初めて開示された。米国特許
第４３２２４９９号を参照されたい。 チェインターミネーション塩基配列決定法は、Ｍ１３ク
ローニングおよびシークエンシングと題するＡｍｅｒｓ
ｈａｍ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（以後ＡｍｅｒｓｈａｍＨａ
ｎｄｂｏｏｋと略す）。プレンハイム・クレセント、ロ
ンドン（１９８３）；メッシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）の
Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ
Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ
Ｎｏ。７９−９９，２，４３−４８（１９７９）；ノ
ランダー（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ）らのＧｅｎｅ，２６：
１０１（１９８３）；セレッチ（Ｃｅｒｒｅｔｔｉ）ら
のＮｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１１：２５９（１
９８３）およびビギン（Ｂｉｇｇｉｎ）らのＰｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）．８０：３９
６３（１９８３）に記載されている。Ｍ１３線維状ファ
ージをベクターとして使用して対象のＤＮＡ配列をクロ
ーニングする。これらのファージベクターはチェインタ
ーミネーション法で簡単に塩基配列を解析できる一本鎖
ＤＮＡ鋳型を与え、このチェインターミネーション法は
一本鎖鋳型分子に遊離３′−ＯＨ基を有する短いプライ
マー鎖を結合し、次にＤＮＡポリメラーゼ（クレノウフ
ラグメント）および４種類のデオキシリボヌクレオチド
三リン酸、すなわちｄＡＴＰ、ｄＮＴＰ、ｄＧＴＰ、お
よびｄＴＴＰ（集合的にｄＮＴＰと記す）（ｄＮＴＰの
うち１種は放射性標識される）を使用するチェインエク
ステンション反応（鎖伸長反応）により鋳型鎖をコピー
する。この合成反応では、３′−ＯＨ末端を欠くヌクレ
オチド特異的チェインターミネーター、例えば２′、３
′−ジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を
使用して、様々な長さの一連の鎖伸長ＤＮＡを合成する
。このターミネーターは伸長するＤＮＡ鎖中に取込まれ
るように普通の５′末端をもつが３′−ＯＨ末端を欠い
ている。ひとたびターミネーターがＤＮＡ鎖に取り込ま
れると、これ以上のデオキシヌクレオチド三リン酸は付
加されず、それによりＤＮＡ鎖の伸長が停止する。 ４つの別々の合成反応を実施し、各反応は４種のヌクレ
オチドｄＮＴＰ（すなわちｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
ＰおよびｄＴＴＰ）のうち１種は放射性標識され、こう
して合成鎖はポリアクリルアミドゲルで大きさにより分
別した後オートラジオグラフィーを行うことができる。 ４つの反応から得られた鎖伸長ＤＮＡは、オートラジオ
グラフィーからのフラグメントのパターンがクローン化
ＤＮＡの核酸配列に対応するように、別々のゲルレーン
に相並べて配置する。 第２図は先に作成したＢ−ＩＬ−２−４プラスミドＤＮ
Ａ中に含まれるｂＩＬ−２遺伝子のヌクレオチド配列を
示す（ヌクレオチドはその５′末端の始めから番号を付
けてある）。遺伝子の対応するアミノ酸組成も第２図に
示されており、アミノ酸残基は遺伝子のコーティング領
域の始め（ヌクレオチド番号１８）から番号を付けてあ
る。成熟タンパク質は星印を付けた２１位のＡｌａ残基
（ヌクレオチド番号６８）から始まり、１５５位のＴｈ
ｒ残基（ヌクレオチド番号４８２）まで延びている。 塩基配列決定法では、ＤＮＡ挿入物を含むプラスミドＤ
ＮＡをＭ１３ファージベクターにサブクローニングして
一本鎖ＤＮＡ鋳型を作る。共通のプライマーを用いてセ
ンス鎖とアンチセンス鎖の塩基配列を決定する。単一の
チェインターミネーション法を用いて全長フラグメント
の塩基配列を決定することから得られた結果をあてにす
るより、むしろ追加の合成プライマーを使用して、サブ
クローン化ＤＮＡフラグメントの長さの中間位置からチ
ェインターミネーション法を開始する。この合成プライ
マーの組成は共通のプライマーを使用して得られた塩基
配列の情報に基づいていた。この方法によって、サブク
ローン化ＤＮＡフラグメントの両鎖は重複する形でその
塩基配列が決定されるので、その塩基配列を二重に確か
めることができる。 上記のチェインターミネーション法を使用せずに、その
他の既知方法を使って、本発明の精神または範囲から逸
脱することなくクローン化ウシｃＤＮＡ挿入物の塩基配
列を決定することもできると理解するべきである。例え
ば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ
）。７４：５６０（１９７７）に記載されるようなマク
サム（Ｍａｘａｍ）およびギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ
）の化学的分解法を使用することができる。 ｃＤＮＡクローンからの機能的ｂＩＬ−２の発現： プラスミドｂＩＬ−２−４に含まれるｂＩＬ−２遺伝子
のｃＤＮＡコーティング領域が機能的ｂＩＬ−２をコー
ドするかどうか調べるために、遺伝子を酵母および細菌
の発現系にて発現させ、その後ＩＬ−２依存症ウシＴ細
胞の増殖を維持するその能力について試験する。 酵母系による発現 ｂＩＬ−２遺伝子の実質的に完全なコーティング領域の
ｃＤＮＡフラグメントは、ｂＩＬ−２の成熟体を酵母宿
主細胞から合成および分泌させるようにデザインされた
発現ベクター（第３図参照）内に挿入する。発現ベクタ
ー、例えばベクターｐＹａｆＢｏＩＬ−２は複製開始点
およびアンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｒ）を含むプラ
スミドｐＢＲ３２２由来の配列を含む（第３図の太線部
分）。また、発現ベクターは好ましくは酵母由来の配列
、例えば選択マーカーとしてのトリプトファン−１遺伝
子（Ｔｒｐ−１）および２μ酵母の複製開始点を含む（
第３図の細線部分）。理想的には、発現ベクターはさら
に効果的プロモーターとしての酵母α因子（例えば第３
図の点描ボックス部分）、および酵母宿主内でＧＭ−Ｃ
ＳＦを合成／分泌させるリーダー配列を含み、このリー
ダー配列の後にｂＩＬ−２のコーティング領域の配列（
斜線ボックス部分）が続く。α因子遺伝子の構造はカー
ジャン（Ｋｕｒｊａｎ）およびハーコビッッ（Ｈｅｒｓ
ｋｏｗｉｔｚ）のＣｅｌｌ．３０：９３３−９４３（１
９８２）に論じられている。 その後発現プラスミドでサッカロミセス・セレビシェ（
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
の適当な歯株を形質転換する。好適な歯株には酵母菌株
７９、Ｘ２１８１−１Ｂ、ＤＢＹ７４６、ＹＮＮ２８２
、２０Ｂ−１２、ＸＶ２１８１が含まれるが、これらに
限定されない。これらの菌株はすべてα因子プロモータ
ーと適合性であるために、およびＴｒｐ１、Ｌｒｐ＋形
質転換細胞を選択するためにα、Ｔｒｐ１、Ｌｅｕ２を
含む。これらの菌株は広く入手可能であり、例えば菌株
７９は９４７０２カリフォルニア州バークレー、カリフ
ォルニア大学、生物物理学および医療物理学部、酵母遺
伝子貯蔵センター（ＹａａｓｔＧｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏ
ｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ）から入手できる。 ｂＩＬ−２遺伝子を含む組換え体発現プラスミドによる
酵母宿主の形質転換は、よく知られた方法（スフェロプ
ラストを作り、洗浄し、その後プラスミドを取込ませる
）に従って行われる。この方法の標準的手法は確立され
ている。ベッグス（Ｂｅｇｇｓ）のＮａｔｕｒｅ（Ｌｏ
ｎｄｏｎ）．２７５：１０４（１９７８）およびヒンネ
ン（Ｈｉｎｎｅｎ）らのＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），７５：１９２９（１９７８）を
参照されたい。 酵母培養物の上清はＩＬ−２依存性ウシＴ細胞の増殖を
維持するそれらの能力において、酵母上清は比較的高レ
ベルのｂＩＬ−２配列を含まないプラスミドで酵母宿主
を形質転換した。検定の際に、対昭プラスミドから誘導
された上清からは生物活性が全く検出されなかった。 細菌宿主による発現 ｂＩＬ−２遺伝子の実質的に完全なコーディング領域の
ｃＤＮＡフラグメントはまた、ｂＩＬ−２の成熟体を細
菌宿主細胞から合成させるようにデザインされた発現ベ
クター内に挿入される。好ましくは、本質的でないが、
細菌細胞による発現の為に使用するプラスミドはλファ
ージＰＬプロモーターを含む。相応して、理想的には細
菌宿主例えば大腸菌はＰＬ転写の非耐熱性ｃ■リプレッ
サーを含む。さらに、大腸菌を宿主として使用する場合
、好ましくは発現ベクターは高いコピー数のＤＮＡ複製
のために複製開始点（例えばプラスミドｐＢＲ３２２由
来）を、そして形質転換された大腸菌宿主の有利な選択
のためにアンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｒ）（これも
プラスミドｐＢＲ３２２由来）を含む。これらの条件を
満たす発現ベクターの例にはプラスミドｐＰＬ−λ（フ
ァーマシア・ファイン・ケミカルズ社、商品番号２７−
４９４６−０１）およびプラスミドｐＰＬｃ２８（ＡＴ
ＣＣ寄託番号５３０８２）が含まれる。 ｂＩＬ−２の発現レベルを高めるために、ｂＩＬ−２ｃ
ＤＮＡから上流に非常に効果的な合成翻訳開始配列が使
用される。同じ翻訳開始配列がヒトＩＬ−２の発現のた
めに使われた。マーキーズ（Ｍａｒｑｕｉｓ）らのＪ．
Ｃｅｌｌ．Ｓｕｐｐｌｅ−ｍｅｎｔ，９Ｂ：２２１（１
９８５）を参照されたい。 高レベル翻訳開始配列は下記表１に記載の合成オリゴヌ
クレオチドに組込まれる。この合成オリゴヌクレオチド
はソード（Ｓｃｃｄ）らの上記文献およびヒロセ（Ｈｉ
ｒｏｓｅ）らの上記文献に詳述されるトリエステル法、
またはホスホジエステル法により合成される。 表１ 表１に示すように、合成オリゴヌクレオチドは接着Ｘｂ
ａ■−５′末端および開始コドンＡＴＧと成熟ｂＩＬ−
２タンパク質の最初のアミノ酸残基Ａｌａをコードする
配列を含む平滑３′末端を有するように合成される。Ｘ
ｂａ■制限部位とＭｅｔ開始コドンとの間のオリゴヌク
レオチドの中間部分は、翻訳開始配列から成る。オリゴ
ヌクレオチドの５′末端および中間部分は、オリゴヌク
レオチドがｂＩＬ−２遺伝子と共に連結される予定の特
定プラスミドの構成と適応する様々な組成のものであり
うると理解すべきである。 ｂＩＬ−２遺伝子含有発現ベクターによる細菌宿主の形
質転換後、熱誘発の際に、ｂＩＬ−２の高レベル発現が
以下に詳述するｂＩＬ−２依存性細胞検定法により確か
められた。酵母および細菌の両宿主により発現された組
換えＤＮＡ産物の高検定レベルは、第２図に示す本発明
者らにより単離された遺伝子がｂＩＬ−２遺伝子と一致
することを裏付けるものである。 ｒｂＩＬ−２の精製： 酵母および細菌宿主の発現系で産生されたｒｂＩＬ−２
はＨＰＬＣで精製する。本発明において使用するＨＰＬ
Ｃカラムは、好ましくはタンパク質ｒｂＩＬ−２と共に
最適に使用される十分な大きさの細孔径（すなわち約１
５〜２０ミクロンの細孔径）を有する逆相のオクタデシ
ル結合シリカカラムである。 本発明の実施に際して使用するのに適した逆相ＨＰＬＣ
カラムは市販品である。好適なカラムにはメイン州ミル
フォード、ウォーターズ・アソシエート社から市販され
ているカラムのプレパック（ＰｒｅｐＰＡＫ（Ｒ））、
ラジオパック（ｒａｄｉｏ ｐａｋ（Ｒ））およびポラ
シル（Ｐｏｒａｓｉｌ（Ｒ））の系列が含まれる。 好適なカラム充填材料はシリカゲルの表面に、例えばシ
ロキサン（ケイ素−酸素−ケイ素）によって共有結合さ
れた、オクタデシルシラン基を含む。 このタイプの充填材料の例はバイダック（Ｖｙｄａｃ（
Ｒ））Ｃ−４）（カリフォルニア州ヘスペリア、セパレ
ーショングループ）である。 カラムにかける前に、発現抽出物は必要に応じて希釈し
、またカラムは例えばトリフルオル酢酸（ＴＦＡ）、ヘ
プタフルオル酪酸（ＨＦＢＡ）または酢酸から成る適当
な緩衝溶液で平衡化する。 ＨＰＬＣカラムからのタンパク質の溶離は当分野でよく
知られた方法により行われる。カラムから結合タンパク
質を取り出す適当な溶離法には、例えばＴＦＡ、ＨＦＢ
Ａまたは酢酸中のアセトニトリルまたはＮ−プロパノー
ル緩衝液の線状勾配の使用が含まれる。アセトニトリル
を溶離剤として使用する場合、好適な勾配は約０．０５
〜２％ＴＦＡ中０〜１００％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリル
から成り、１分当たり約１〜３％アセトニトリルの割合
でカラムに加えられる。溶離剤がＮ−プロパノール緩衝
液である場合、好適な組成は０．９Ｍ酢酸および０．２
Ｍピリジン（ｐＨ４．０）中約６０％（Ｖ／Ｖ）Ｎ−プ
ロパノールである。この緩衝液溶離剤の好ましい勾配範
囲は０〜１００％、より好ましくは２０〜８０％である
。 溶離されたタンパク質は当分野でよく知られた検出系で
都合よく監視することができる。例えば、スタイン（Ｓ
ｔｅｉｎ）およびモシエラ（Ｍｏｓｃｈｅｒａ）のＭｅ
ｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７８：４３５（１９８１）に
配される自動蛍光検出装置が使用される。また、ＨＰＬ
Ｃカラムから回収された分画の相対的タンパク質度は、
２８０ｎｍの波長で紫外線分光光度計により溶離物質の
吸光度を測定して決定し得る。適当な自動紫外線吸収検
出装置は市販品である。例えばそれらは英国ケンブリッ
ジのＬＫＢインスツルメント社から市販されている。 回収されたＨＰＬＣ分画の生物活性は、以下で説明する
ｂＩＬ−２依存性Ｔ細胞増殖検定により分析される。分
画はまたゲル電気泳動により分析される。 十分なタンパク質精製が最初のＨＰＬＣ法で達成されな
い場合、同じカラムまたは別のカラム（例えば、異なる
組成または形の支持材料もしくは異なる化学組成の結合
相材料を有する充填材料を使用するカラム）の使用によ
り精製を繰り返すことができる。さらに、同一かまたは
異なる種類の溶離剤を使用してもよい。 十分なタンパク質精製が２回目のＨＰＬＣ法で得られな
い場合、均一性が達成されるまで３回またはそれ以上の
ＨＰＬＣ法を使用することができる。本発明者らは、Ｃ
１４結合相およびアセトニトリル溶離を使用する最初の
ＨＰＬＣ処理がｒｂＩＬ−２の実質的精製をもたらすが
、タンパク質産物は均一に精製されていないことを見出
した（第５図参照）。しかしながら、上と同じカラムを
使用するが遊離剤としてＮ−プロパノール／酢酸／ピリ
ジンを使用する２回目のＨＰＬＣ処理の後に、約１６０
００ダルトンの分子量を有する均一なｂＩＬ−２が単一
分画に回収された。 本発明の均一なｒｂＩＬ−２の活性は、上記のＨＰＬＣ
分画化の際に使用した有機緩衝液（ＴＦＡ／アセトニト
リル）または（ピリジン／酢酸／プロパノール）中に４
℃で保存したとき、少なくとも六ヶ月安定であることが
わかった。 アミノ酸分析： ｒｂＩＬ−２の均一性が達成されたために、本発明者ら
はこの組換えタンパク質産物のアミノ酸組成およびＮ−
末端部分のアミノ酸配列を解析することができた。この
情報は、発現産物が天然産物と同じ組成であり且つ発現
産物がｒｂＩＬ−２ｃＤＮＡの分析から推定されたアミ
ノ酸組成及び配列と一致することを確かめるのに有用で
ある。 上記のように調製した本発明の均一ｒｂＩＬ−２のサン
プルは、例えばニンヒドリンまたは気相検出を使用する
自動分析装置により、アミノ酸の組成と配列について分
析することができる。この種の装置は市販品であり、例
えば英国ケンブリッジのＬＫＢ社（４１５０型アルファ
）またはアブライド・バイオシステム社（４７０Ａ型）
から入手できる。これらの分析により、本発明者らは、
ｒｂＩＬ−２のアミノ酸組成がｒｂＩＬ−２ｂＤＮＡか
ら推定される対応配列（すなわち第２０残基がＤＮＡか
ら推定される対応配列（すなわち第２図のアミノ酸残基
番号２１〜４１）と同じであることを見出した。 治療用途： 先に述べたように、本発明に従って産生されたｒｂＩＬ
−２はウシやその他の動物の感染病、例えば乳房炎、呼
吸器および胃腸症候群、ならびに一般的寄生虫感染症を
治療するのに使用される。本発明者らはｒｂＩＬ−２の
比活性が約４．５×１０４単位／μｇ（タンパク質）で
あることを確かめた。 動物の病気を治療するためのｒｂＩＬ−２の好ましい投
与量は１回の用量あたり約１０４〜１０８単位／ｋｇ（
動物の体重）の範囲である。０．１〜１０ｍｇ（理想的
には約５〜６ｍｇ）の用量でのｒｂＩＬ−２治療は、１
２００ポンドの雄牛におけるＴ細胞媒介機能を回復させ
ることが期待される。治療上有効であるためには、ｒｂ
ＩＬ−２を多数回投与することが必要であると思われ、
このことも本発明の範囲に含まれる。 ｒｂＩＬ−２は非経口または径皮を含めた慣用方法で投
与される。非経口投与のために、ゴマ油や落花生油、も
しくは水性プロピレングリコール中のｒｂＩＬ−２の溶
液剤が使用され、同様に蒸留水、血清アルブミン、リン
ゲル液、ハンク液などの無菌、無毒性、非アレルギー溶
液剤も使用できる。この種の溶液剤は必要に応じて適当
に緩衝液化され、その液体希釈剤は初めに十分な塩類ま
たはグルコースで等張化される。これらの特定の水性溶
液剤は静脈内、筋肉内または皮下注射に特に適している
。これらの種々の無菌水性媒体はすべて当分野でよく知
られた標準的手法により容易に調製することができる。 ｂＩＬ−２活性の検定 先に示したように、酵母及び細菌の発現系からの発現産
物はＩＬ−２依存性ウシＴ細胞により検定される。この
種の検定法に関する細部はベーカー（Ｂａｋｅｒ）およ
び（Ｋｎｏｂｌｏｃｋ）のＶｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｐａｔｈ，３：３８１（１９８２）；ミラー
エッジ（Ｍｉｌｌｅｒ−Ｅｄｇｅ）およびスプリッター
（Ｓｐｌｉｔｔｅｒ）のＶｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍ
ｍｕｎｏ−ｐａｔｈ、７：１１９（１９８４）；ネーマ
ー（Ｎａｍｅｒ）およびマグナソン（Ｍａｇｎｕｓｏｎ
）のＩｍｍｕｎｏｌ．，５２：４６９（１９８４）；オ
ールドハン（Ｏｌｄｈａｍ）およびウイリアムズ（Ｗｉ
ｌｌｉａｍｓ）のＶｅｔ．Ｉｍｍｕ−ｎｏｌ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｐａｔｈ、１：２０１（１９８４）に記載されてい
る。要約すると、この検定法では、ＩＬ−２依存性細胞
を培養物から収穫し、洗浄して増殖培地を除き、８×１
０４細胞／ｍｌの濃度で完全ＲＰＭＩ−１６４０培地中
に再懸濁する。この細胞懸濁液（１００μｌ）を９６−
ウエルの微量滴定皿（商品番号３５９６、カスター）の
個々のウエル（くぼみ）に採置し、その後サンプルの連
続（ｌｏｇ２）希釈液または１単位／ｍｌサルＩＬ−２
標品（１００μｌ）を加える。微量滴定皿は空気中５％
のＣＯ２の湿潤雰囲気中３７℃で４８時間インキュベー
トし、その後自動サンプル採取装置で収穫する。（〔３
Ｈ〕−Ｔｄｒ）（比活性１．９ｃｉ／ｍＭ）を含む培地
５０μｌを加える。その滴定皿をさらに４時間インキュ
ベートし、その後自動サンプル採取装置で収穫する。〔
３Ｈ〕−Ｔｄｒ−標識ウエル内容物を含むガラス繊維フ
ィルター試験片を自然乾燥させ、トルエンをベースとす
る混合物（ｔｏｌｕｅｎｅ−ｂａｓｅ ｃｏｃｋｔａｉ
ｌ；マサチューセッツ州ボストン、ニューイングランド
ヌクレアー社、商品番号ＮＥＦ−９０３）の中に入れ、
液体シンチレーションカウンターで０．５分間計数する
。 ｂＩＬ−２の存在下では、標的ＩＬ−２依存性細胞は用
量に依存して〔３Ｈ〕−Ｔｄｒを取り込む。 ｂＩＬ−２の不在下では、標的ＩＬ−２依存性細胞は２
４時間以内に死滅し、基底レベルの〔３Ｈ〕−Ｔｄｒを
取り込むにすぎない。ｂＩＬ−２活性（単位／ｍｌ）は
、特定サンプルが標的細胞株の最大増殖の半分を生じさ
せる希釈度を測定することにより定量化される。例えば
、特定のｂＩＬ−２検定（全量２００μｌ）において１
：１０の希釈度でサンプルが半−最大標的細胞株増殖を
生じる場合、１単位は１０で割った２００μｌ（全量）
、すなわち２０μｌ中に含まれると言われる。そのとき
、サンプルは２０（１単位のμｌ数）で割った１０００
（１ｍｌのμｌ数）の力価、すなわち５０単位／ｍｌの
力価を有するであろう。 先に述べたように、酵母培養物からの組換えｂＩＬ−２
は１．３×１０６単位／ｍｌのｂＩＬ−２活性を示した
。また、細菌発現系から回収された発現産物は１０．２
×１０６単位／ｍｌ以上のｂＩＬ−２活性を示した。こ
うして、本発者らにより検定された第２図に記載の遺伝
子が実際にｂＩＬ−２遺伝子であると確認できた。 ｍＲＮＡの分析： ウシリンパ腺細胞からのｂＩＬ−２ｍＲＮＡの発現を分
析した。ＣｏＡ−刺激および非刺激ウシリンパ腺由来の
ＲＮＡのノザンプロットは、第２図に示すｂＩＬ−２２
ｃＤＮＡから誘導されたＲＮＡプローブを用いるハイブ
リダイゼーションにより分析した。プローブはＣｏｎＡ
の単一バンドと強くバイブリダイズしたが、非刺激リン
パ腺細胞に由来するＲＮＡの場合は、ハイブリダイゼー
ションが起こらなかった。 ウシゲノム配列の分析： ウシゲノムＤＮＡ中のＩＬ−２関連遺伝子の数は、３２
Ｐ−標識ｂＩＬ−２プローブとウシゲノムＤＮＡフラグ
メントのサザンブロックをハイブリダイズさせることに
より調べた。フラグメントはＤＮＡを比較的低い頻度で
切断することが期待される多数の異なる制限酵素でウシ
ゲノムＤＮＡを消化することにより調製した。ゲノムＤ
ＮＡのサザンプロットに対するＩＬ−２ｃＤＮＡプロー
ブによるハイブリダイゼーションのオートラジオグラフ
ィーは、ｂＩＬ−２遺伝子が単一コピーとして存在する
ことを示した。 本発明方法および産生物はさらに次の実施例により示さ
れる。実施例は単に代表的例にすぎず、それらは本発明
を例示し且つ当業者が本発明を利用するのを手伝けする
ものである。実施例は特許証により許可される保護に関
する特許請求の範囲を何ら制限するものではない。 実施例１ ポリＡ＋ｍＲＮＡの調製 約１×１０６細胞／ｍｌの濃度のウシ末梢血液白血球を
１０％（Ｖ／Ｖ）の２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍｌ
ペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよ
び２．５μｇ／ｍｌＣｏｎＡを補足したＲＰＭＩ−１６
４０培地５０ｍｌ中で培養した。細胞は空気中５％ＣＯ
２の湿潤雰囲気において約１６時間培養した。その後、
生細胞を遠心により収穫した。 全ＲＮＡは一般にチャーウィンらの上記文献に記載され
る方法を用いて、単細胞から抽出した。 この方法では、グアニジニウムチオシアネートを使用す
ることにより、ＲＮアーゼを含む細胞タンパク質を、Ｒ
ＮアーゼによるＲＮＡ加水分解の速度を超える速度で変
性した。ｍＲＮＡはエタノール沈殿により細胞タンパク
質から分離し、続いて８Ｍ塩酸グアニジン、２５ｍＭ酢
酸ナトリウムで再懸濁（抽出）した。次に、塩酸グアニ
ジン抽出ＲＮＡを等容量のフェノール／クロロホルム：
イソアミルアルコール（２５容量／２４容量：１容量）
で再抽出した。このような抽出操作から得られたＲＮＡ
含有水相は５０ｍＭ酢酸ナトリウムとなし、０．６容量
のエタノールの添加により沈殿させた。ＲＮＡは−２０
℃に冷却して遠心することにより回収した。 その後、マニアチスらの上記文献（１９７）に記載の方
法を使って、オリゴ（ｄＴ）−セルロースクロマトグラ
フィーカラムによりポリＡ＋ｍＲＮＡを抽出タンパク質
から分離した。簡単に述べれば、カラムは２０ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、０．５Ｍ ＮａＣｌ．１ｍ
Ｍエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）および０．１％
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）から成る緩衝液で調
製した。タンパク質沈殿物を水とこの緩衝液に溶解して
カラムにかけた。非吸着物質は同じ緩衝液での初期洗浄
、続いて０．１ＭＭａＣｌを含む同じ緩衝液での追加洗
浄により溶離した。保持されたポリＡ＋ｍＲＮＡは１０
ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭＥＤＴＡお
よび０．０５％ＳＤＳから成る低下したイオン強度の緩
衝液で溶離した。溶離したポリＡ＋ｍＲＮＡ１／１０容
量の酢酸ナトリウム（３Ｍ、ｐＨ５．２）および２．２
容量のエタノールを用いて−２０℃で沈殿させた。 オリゴ（ｄＴ）−セルロースカラムからのポリＡ＋ｍＲ
ＮＡの溶離後、ポリＡ＋ｍＲＮＡの完全性はマニアチス
らの上記文献（１９９）に詳述されたアガロースゲルに
よる電気泳動により確かめた。 実施例２ ｃＤＮＡライブラリーの作成 ｍＲＮＡに対応する二本鎖ｃＤＮＡのライブラリーは、
カプラーおよびホッフマンの上記文献により修正された
マニアチスらの上記文献（２２９）記載の標準方法を用
いることにより、実施例１で得られた精製ｍＲＮＡから
作成した。オリゴ−ｄＴはｍＲＮＡのポリＡ尾部とハイ
ブリダイズして、第一のｃＤＮＡ鎖の逆転写のためのプ
ライマーとして役立った。トリ骨髄芽球症ウイルス（Ａ
ＭＶ）の逆転写酵素は、ｍＲＮＡを鋳型として使用して
第一のｃＤＮＡ鎖を合成した。簡単に述べれば、第一の
ｃＤＮＡ鎖の合成は５０ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ８．
３）、１０ｍＭＭｇＣｌ２、１０ｍＭジチオトレイトー
ル（ＤＴＴ）、４ｍＭピロリン酸Ｎａ、１．２５ｍＭｄ
ＧＴＰ、１．２５ｍＭｄＡＴＰ、１．２５ｍＭｄＴＴＰ
、０．５ｍＭｄＣＴＰ、１５〜２０μＣｉの〔α−３２
ｐ〕ｄＣＴＰ（３．０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、１００μ
ｇ／ｍｌのオリゴ（ｄＴ１２−１８）、１５０μｇ／ｍ
ｌｍＲＮＡ（実施例１より）、３．０００単位のＡＭＶ
逆転写酵素／ｍｌを含有する２０〜４０μｌの反応容量
中で実施した。４３℃で３０分間反応させた後、ＥＤＴ
Ａを添加して２０ｍＭとすることにより反応を停止した
。反応生成物をフェノールで抽出し、岡山およびベルグ
のＭｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２：１６１−１７０
（１９８２）に記載されるように３Ｍ酢酸アンモニウム
を加えてエタノール沈殿させた。第二のｃＤＮＡ鎖は１
００μｌの２０ｍＭトリス・ｈＣｌ（ｐＨ７．５）、５
ｍＭＭｇＣｌ２、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１００
ｍＭＫＣｌ、０．１５ｍＭβ−ＮＡＤ、５０μｇ／ｍｌ
ＢＳＡ、４０μＭＤＮＴＰ、８．５単位／ｍｌの大腸菌
ＲＮアーゼＨ２３０単位／ｍｌＤＮＡポリメラーゼ■、
１０単位／ｍｌ大腸菌ＤＮＡリカーゼを含有する反応混
合物中で合成した。この混合物を１２℃で１時間反応さ
せた。次いでＥＤＴＡを加えて２０ｍＭとすることによ
り反応を停止した。得られた二本鎖ｃＤＮＡは上記のよ
うにフェノールで抽出した。 二本鎖ｃＤＮＡはセファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）
Ｓ−４００（ファーマシア・ファイン・ケミカルズ社）
カラムコロマトグラフィーで分子の大きさにより分画化
し、分子量マーカーとしてｐＢＲ３２２ＤＮＡの末端標
識フラグメントを用いるアルカリ性アガロース電気泳動
により測定した。５００ｂｐ以下の長さのＤＮＡ鎖をえ
り除いて、これらの短いｃＤＮＡ分画を無意味にクロー
ニングするのを避けた。 二本鎖ｃＤＮＡ分画は、マニアチスらの上記文献（２３
９から始まる）に記載の方法により、ｐＢＲ３２２プラ
スミド（ファーマシア・ファイン・ケミカル社）のＰｓ
ｔ■部位に挿入した。この方法では、二本鎖ｃＤＮＡの
３′末端にポリ（ｄｃ）の尾部を付加した。プラスミド
ｐＢＲ３２２はＰｓｔ■エンドヌクレアーゼで消化した
後、その３′末端にポリ（ｄＧ）の尾部を付加した。ｄ
Ｇ付加プラスミドＤＮＡとｄＣ付加ｃＤＮＡとはアーニ
リング緩衝液（０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス−
ｈＣｌ（ｐＨ７．８）および１０ｍＭＥＤＴＡ）を用い
てアニーリングレ、新規な組換えプラスミドを形成した
。 本明細書に記載の全ての制限酵素はマサチューセッッ州
ビバリーのニュー・イングランド・バイオラブズ社から
市販されている。 ハナハンの上記文献の方法を使用することにより、大腸
菌株ＭＭ２９４を組換えプラスミドで形質転換した（こ
の場合大腸菌細胞は高濃度のＭｇ２＋の存在下での増殖
により得られた）。形質転換宿主を平板培養し、その後
表現型同定剤としてテトラサイクリンを用いて形質転換
細胞を同定した。 この技法の使用により本発明者らは約３５，０００個の
独立した形質転換細胞を得た。 実施例３ ヒトＩＬ−２ｃＤＮＡスクリーニングプローブを使って
オリゴ（ｄＴ）−セルロースクロマトグラフィーカラム
により全ＲＮＡからポリＡ＋ｍＲＮＡを分離した。 ジャーカット細胞株はＡＴＣＣ（寄託番号ＡＴＣＣ−Ｃ
ＲＬ−８１６３）から入手できる。得られたポリＡ＋ｍ
ＲＮＡの完全性はアガロースゲル電気泳動により確かめ
られた。ヒトｍＲＮＡに対応する二本鎖ｃＤＮＡのライ
ブラリーは実施例２に記載の方法により作成した。５０
０ｂｐより大きい得られた二本鎖ｃＤＮＡ分画を、実施
例２に記載のホモポリマー付加法によりｐＢＲ３２２プ
ラスミドのＰｓｔ■部位に挿入した。この組換えプラス
ミドで大腸菌株ＭＭ２９４を形質転換し、形質転換細胞
は表現型同定剤としてテトラサイクリンを用いて同定し
た。この方法によって、本発明者らは約１×１０６個の
独立した形質転換細胞を同定した。 合成オリゴヌクレオチドプローブはソードらの上記文献
およびヒロセらの上記文献に詳述される標準トリエステ
ル法により化学的に合成し、その後ネズミｃＤＮＡライ
ブラリーをスクリーニングするのに使用するために３２
Ｐで標識した。このプローブは次のヌクレオチド配列： ５′−ＡＡＴＧＴ ＡＧＡ ＣＡＴ ＣＣＴ ＧＧＴＧ
ＡＧ−３′を有し、これは第１図のヌクレオチド１７３
〜１９２に対応する。標識を促進するために、オリゴヌ
クレオチドの５′末端はＯＨ末端となるように合成し、
それによりＤＮＡフラグメントを標識する際に一般に使
用しなければならないホスファターゼ処理を省いた。標
識方法は１６μｌの３２ＰＡＴＰ（７０００Ｃｉ／ｍＭ
）、１μｌ（１０Ｕ）のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ
および２μｌの１０ｘキナーゼ緩衝液■（０．５Ｍトリ
ス・ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、０．１ｍＭＭｇＣｌ２、５
０ｍＭジチオトレイトール、１ｍＭスペルミジンおよび
１ｍＭＥＤＴＡ）に合成オリゴヌクレオチド１μｌを加
えることを包含していた。３７℃で３０分間反応させた
後、合成ヌクレオチドをフェノール／クロロホルムで抽
出した。標識プローブはセフアデックスＧ−５０カラム
（ファーマシア・ファイン・ケミカルズ社）によるクロ
マトグラフィーまたは遠心を用いて非標識オリゴヌクレ
オチドから分離した。 ヒトｃＤＮＡライブラリーの初期スクリーニングを容易
にするために、形質転換した細菌培養物をプール（各プ
ールは約５，０００個の異なるクローンを含む）に分け
た。プラスミドＤＮＡはイシューホロビッッ（Ｉｓｈ−
Ｈｏｒｏｗｉｃｚ）およびバーク（Ｂｕｒｋｅ）のＮｕ
ｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，９：２９８９（１９８１
）に詳述される標準的なアルカリ溶菌法を従って宿主細
菌のサンプルから単離した。単離したプラスミドは標準
方法によりＰｖｕ■およびＨｉｎｄ■で完全消化した。 次にプラスミド消化物を０．８％アガロースゲルによる
電気泳動で分画化し、サザンらの上記文献の標準方法に
よりニトロセルロースフィルター上にのせた。ニトロセ
ルロースフィルターに固定したＤＮＡは、以下の実施例
４で詳述する方法を使って、標識合成オリゴヌクレオチ
ドプローブとハイブリダイズさせた。 ＤＮＡのハイブリッド形成バンドが得られたクローンの
推定上のプールは、放射性標識合成プローブでの直接コ
ロニーハイブリダイゼーションによりスクリーニングし
て、単一の陽性コロニーを同定した。 プラスミドＤＮＡは上記の方法により同定した陽性コロ
ニーから調製して、以下の実施例５に記載するように塩
基配列を決定した。単離したヒトプラスミドＤＮＡフラ
グメントのヌクレオチド配列（第１図に示す）は、実質
的にヒトＩＬ−２遺伝子のオープン・リーディング・フ
レームの完全なヌクレオチド配列を含むことが見出され
た。 第１図で下線を施したヒトＩＬ−２ｃＤＮＡクローンの
７０８ｂｐフラグメント（ヌクレオチド番号１２〜ヌク
レオチド番号７１９）が、上記の実施例２で調製したヒ
トプラスミドＤＮＡをスクリーニングするためのプロー
ブとして選ばれた。 このプローブフラグメントは制限酵素Ｐｓｔ■およびＲ
ｓａ■での消化、その後のアガロースゲル電気泳動によ
りヒトｃＤＮＡクローンから単離した。 ｃＤＮＡヌクレオチドプローブはマニアチスらの上記文
献（１０８）に記載の先に論じた標準方法によりニック
トランスレーションで放射性標識した。この方法によれ
ば、プローブは約５×１０８ＣＰＭ／μｇＤＮＡの比活
性に標識された。スクリーニング法で使用する前に、標
識プローブは水中１００℃で１０分間沸騰させその後氷
上で冷やすことにより変性した。 実施例４ ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング上記の実施例２
で作成したｃＤＮＡライブラリーの初期スクリーニング
を容易にするために、形質転換した細菌培養物をプール
（各プールは約２５００個の異なるクローンを含む）に
分けた。 イシューホロビッッおよびパークの上記文献に詳述され
る標準アルカリ溶菌法を用いて宿主細菌のサンプルから
プラスミドＤＮＡを単離した。単離したプラスミドをＰ
ｓｔ■で切断し、次いで適当な大きさのマーカーと共に
１．０％アガロースゲル電気泳動で処理して分画化した
。そのアガロースゲルをサザンらの上記文献記載の方法
によりニトロセルロースフィルター上にのせた。移行処
理後、フィルターを自然乾燥させ、真空下約８０℃で２
時間ベーキングすることによりＤＮＡフラグメントをニ
トロセルロースに固定した。 固定したＤＮＡは次に標識ｃＤＮＡプローブとハイブリ
ダイズさせた。要約すると、ベーキングしたヒトロセル
ロースを、６×ＳＳＣ、０．５％ＮＰ４０界面活性剤、
０．１％サルコシル、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ′ｓ溶液（
０．０２％フイコール、０．０２％ポリビニルピロリド
ン、０．０２％ＢＳＡ）および１００μｇ／ｍｌ変性サ
ケ精子ＤＮＡ（シグマ■型、ナトリウム塩）から成るプ
レハイブリダイゼーション緩衝液中５５℃で２〜４時間
インキュベートした。次にフィルターは上記のようなハ
イブリダイゼーション溶液中３２Ｐ−標識ｃＤＮＡプロ
ーブ（１０６ｃｐｍ／ｍｌ）（実施例３より）と共に５
５℃で一晩インキュベートした。一晩ハイブリダイゼー
ションを行った後、フィルターは６×ＳＳＣを用いて温
室で洗浄し、次いで４２℃で１時間さらに５５℃で１．
５時間６×ＳＳＣにて洗浄した。自然乾燥後、フィルタ
ーを−７０℃でオートラジオフラフィーに付した。 オートラジオグラフィーから本発明者らは強いハイブリ
ッド形成バンドを生じたプラスミドＤＮＡが得られたク
ローンの推定上の１つのプールを、約５００個の形質転
換細胞のプールにさらに分割し、ハイブリダイゼーショ
ンスクリーニング法を繰り返した。ＤＮＡの強いハイブ
リッド形成バンドが見られた推定上のサブプールはその
後平板培養した。得られたクローンは上記のハイブリッ
ド形成条件を用いて、グルンタインおよびホグネスの上
記文献記載の公知方法により、放射性標識したヌクレオ
チドプローブで検索した。 実施例５ スクリーニングしたｃＤＮＡの同定 ｂＩＬ−２−４と命名したプラスミドは実施例４に記載
の方法により同定した陽性コロニーからのｃＤＮＡを用
いて作成した。大腸菌を形質転換した宿主プラスミドの
サンプルは寄託番号５３１８４としてＡＴＣＣに寄託さ
れた。陽性宿主コロニーから単離したプラスミドＤＮＡ
由来のｃＤＮＡ挿入物は、以下で説明する変更を伴うア
マーシャムハンドブックに本質的に記載されるような標
準チエインターミネーション法により塩基配列を決定し
た。そのｃＤＮＡ挿入物をＰｓｔ■および／またはＲｓ
ａ■で消化し、その後Ｍ１３一本鎖線維状ファージベク
ターのｍｐ１８およびｍｐ１９（イリノイ州アーリント
ンハイツ、アマーシャム社）内にサブクローニングした
。ノランダーらの上記文献に記載されるｍｐ１８および
ｍｐ１９ファージベクターは次の特異なクローニング部
位：すなわちＨｉｎｄ■；Ｓｐｈ■；Ｐｓｔ■；Ｓａｌ
■；Ａｃｃ■；Ｈｉｎｃ■；Ｘｐｈ■；ＢａｍＨ■；Ｘ
ｍａ■；Ｓｍａ■；Ｋｐｎ■；Ｓｓｔ■；およびＥｃｏ
Ｒ■を含む。ｍｐ１８およびｍｐ１９ベクターの組成は
同じであるが、上記の制限部位の順序がｍｐ１９ベクタ
ー内では逆になっており、こうしてｃＤＮＡ挿入物の両
鎖はこれらの２つのベクターを用いることにより有利に
塩基配列が決定できる。対応するｃＤＮＡ鎖を挿入した
ｍｐ１８およびｍｐ１９ベクターを使ってＫ１２株の大
腸菌ＪＭ１０７（メリーランド州ベテスタ、ベテスタ・
リサーチ研究所）を形質転換し、それによりセンス鎖と
アンチセンス鎖の一本の鎖挿入物を含む一本鎖ＤＮＡ鋳
型を得た。 その一本鎖ＤＮＡ鋳型に一般的な合成プライマ−：５′
−ＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＧＧＴＴ−３′（ウイスコン
シン州ミルウォーキー、Ｐ−Ｌバイオケミカルズ社）を
アーニングして、上記のようにＤＮＡ合成を開始させた
。その後、伸長フラグメントをゲル電気泳動で大きさに
より分離し、オートラジオグラフィーを行い、それより
フラグメントのヌクレオチド配列を推論した。 ジデオキシ塩基配列決定反応において、放射性標識とし
てデオキシアデノシン５′（α−〔３５Ｓ〕チオ）トリ
ホスフェート（以後ｄＡＴＰ〔α−３５Ｓ〕と略す）を
用いた。また、アマーシャムハンドブックの３６頁に記
載のゲルを使用せずに、６％ポリアクリルアミドゲル（
７Ｍ尿素、１０８ｍＭトリス・ホウ酸〔ｐＨ８．１〕お
よび２ｍＭＥＤＴＡを含む厚さ０．４ｍｍの６％ポリア
クリルアミドゲル）を使用した。 上述のように、ｂＩＬ−２−４ｃＤＮＡのヌクレオチド
配列は第２図に示される。ｂＩＬ−２遺伝子のコーティ
ング領域はヌクレオチド番号１８（Ｍｅｔ残基）からヌ
クレオチド番号４８２（Ｔｈｒ残基）まで伸びており、
成熟タンパク質はヌクレオチド番号７８に対応するアミ
ノ残基（Ａｌａ）から始まる。ヌクレオチド配列から決
定された対応するアミノ酸をコドンの下に記載する。 実施例６ 成熟ｂＩＬ−２−４ｃＤＮＡクローンからｂＩＬ−２遺
伝子のコーティング領域と３′側面領域の一部を分離し
、リンキングオリゴヌクレオチドを用いてプラスミドｐ
α３内に挿入して組換え発現プラスミド（ｐＹαｆＢｏ
ＩＬ−２と命名）を作成し、それにより酵母宿主細胞内
でｂＩＬ−２を高レベルに発現させた。出発プラスミド
ｐα３は寄託番号５３２２０としてＡＴＣＣに寄託され
ている。第３図に示すように、ｐα３はプラスミドｐＢ
Ｒ３３２に由来する複製開始点とＡｍｐｒ耐性遺伝子を
含む（太線部分）。ｐＹαｆＧＭ−２プラスミドはまた
２μサークルの複製開始点および形質転換酵母宿主（Ｔ
ｒｐ−栄養要求株）選択用のＴｒｐ■遺伝子を含む（第
３図の細線部分）。出発プラスミドはさらにｂＩＬ−２
の高レベル転写および分泌を支配する酵母α因子プロモ
ーターおよびリーダー配列および開始コドンＡＴＧを含
む（第３図の点描ボックス部分）。ｂＩＬ−２配列（第
３図の斜線ボックス部分）は以下でさらに詳しく論じる
ように合成オリゴヌクレオチドの使用によりα因子配列
の下流（３′）末端に融合される。 ｐα３プラスミドはまた第３図に示すように接着Ｋｐｎ
Ｉ５′および３′末端を有するリンキングオリゴヌクレ
オチド（中空ボックス部分）、および目的にｃＤＮＡク
ローニングフラグメントへ都合よく連結するための種々
の制限酵素切断部位（Ｐｓｔ■、Ａｖｒ■およびＮｃｏ
■部位を含む）を含む。ｐＹαｆＢｏＩＬ−２プラスミ
ドを作るために、まず初めにｐα３プラスミドを、例え
ばマニアチスらの上記文献に記載されるような標準方法
により制限酵素Ｋｐｎ■およびＮｃｏ■で消化した。生
成した大きい方のフラグメントは、マニアチスらの上記
文献（１９９）に詳述される方法を使ってアガロースゲ
ルによる電気泳動で単離した。この消化方法によって、
第３図に示すリンキングオリゴヌクレオチドの複数のク
ローニング部位の大部分がその大きい方のフラグメント
から除かれる。 マニアチスらの上記文献に記載されるような標準方法を
用いて、ＩＬ−２遺伝子のコーディング領域と３′側面
領域の一部、すなわちＨｇｉＡ■（ヌクレオチド番号７
７）からＳｓｐ■と Ｓｓｐ■制限酵素の使用によりｂＩＬ−２−４クローン
から分離した。生成した小さい方のフラグメントをＴ４
ＤＮＡポリメラーゼで処理して、５′ＨｇｉＡ■末端の
３′突出部分を除去した。Ｎｃｏ■リンカーを単離した
ｃＤＮＡの３′末端に付加して、ｐα３ベクターのＮｃ
ｏ■部位内にｃＤＮＡフラグメントを連結できるように
した。組成：ＧＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＣのＮｃｏ■リン
カーは、例えばマニアチスらの上記文献に記載されるよ
うな標準方法により、ｃＤＮＡの３′末端に付加した。 その後、ｎｃｏ■リンカーをＮｃｏ■制限酵素で消化し
て接着３′末端を生成させた。この４５５塩基対（ｂｐ
）のＨｇｉＡ■−Ｎｃｏ■ｂＩＬ−２フラグメントはア
ガロースゲルによる電気泳動にかけて精製した。 次に、上記のｂＩＬ−２ｃＤＮＡフラグメントの５′末
端をｐα３クローニングベクターに連結するために、リ
ンキングオリゴヌクレオチドを作成した。このオリゴヌ
クレオチドの組成は、下の表２および第３図に示すよう
に、Ｋｐｎ■接着５′末端（その後にα因子プロセッシ
ング領域のＡＡＡ−ＡＧＡが続く）を含む。Ａｌａをコ
ードするコドンＧＣＡはα因子フロッシング部位の３′
側に位置し、成熟ｂＩＬ−２遺伝子の第一コドンとして
役立つ。この第一コドンはＨｇｉＡ■での消化、その後
に続くその３′突出部分の除去によりｂＩＬ−２ｃＤＮ
Ａから失われた。 表２ ｐＹαｆＢｏＩＬ−２プラスミドを作るために、Ｋｐｎ
■−Ｎｃｏ■消化ｐα３プラスミド、Ｋｐｎ■−平滑末
端−Ｎｃｏ■ｂＩＬ−２−４ｃＤＮＡフラグメントを用
いて三通りの連結が行われる。 その他の標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて同一の発現
ベクターを作成することができ、また上記の作成方法は
ｂＩＬ−２ｃＤＮＡフラグメントを調節してｐＹα５Ｂ
ｏＩＬ−２ベクター内に挿入するために使用しうる多様
な方法のうちの非制限的な１つの例であることを理解す
べきである。さらに、ｂＩＬ−２−４ｃＤＮＡフラグメ
ントは酵母宿主内でのｂＩＬ−２の高レベル発現用のそ
の他の適切なベクターに挿入することができるだろう。 ｐＹαｆＢｏＩＬ−２発現プラスミドを用いて、標準方
法により、Ｔｒｐ＋形質転換細胞選択用のＳ．セレビシ
ェ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母菌株７９（α．Ｔ
ｒｐ１−１．Ｌｅｕ２−１）を形質転換した。形質転換
に先立って、菌株７９は２×１０７細胞／ｍｌの密度に
なるまでＹＥＰＤ培地〔１％（ｗ／ｖ〕酵母エキス、２
％（ｗ／ｖ）ヘプトン、２％（ｗ／ｖ）グルコース〕中
で増殖させた。細胞を２２℃、１０００×ｇで５分間遠
心して収穫し、得られた沈殿物を減菌蒸留水で洗浄した
。 次いで、酵母細胞は１／１０容量のＳＥＤ（１Ｍソルビ
トール、２５ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、および５０
ｍＭジチオトレイトール）に再懸濁して、３０℃で１０
分インキュベートした。細胞−緩衝液混合物を３００ｘ
ｇで５分間遠心した。沈殿物を１／１０容量の１Ｍソル
ビトールで１回洗い、細胞を１／１０容量のＳＣＥ（１
Ｍソルビトール、０．１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ５
．８）、０．０１ＭＥＤＴＡ）に再懸濁した。細胞壁を
破壊する１０−３容量のグルスラーゼをこの溶液に加え
、その後時折穏やかに撹拌しながら３０℃で３０分イン
キュベートした。スフェロプラストの存在は１０μｌの
酵母細胞を顕微鏡用スライドガラス上の５％（ｗ／ｖ）
ＳＤＳ１滴中に希釈して、４００倍の位相差顕微鏡で“
ゴースト”について観察することにより検定した。その
後、細胞混合物を３００ｘｇで３分間遠心した。得られ
た沈殿物を１／１０容量の１Ｍソルビトールで２回洗浄
し、次にＣａＳ（１Ｍソルビトール、１０ｍＭＣａＣｌ
２）中で１回洗浄した。 その後、酵母スフェロプラスミドはベッグズの上記文献
から適応させた方法を用いて、先に作成した発現ベクタ
ーで形質転換した。スフェロプラスト沈殿物を１／２０
０容量のＣａＳに懸濁し、１００μｌのアルコートに分
けて１．５ｍｌのエッペンドルフ試験管に加えた。次い
で、１〜１０μｌのプラスミドＤＮＡを各アリコート（
０．５〜５μｇ）に加えた。この混合物を室温で１５分
インキュベートし、その後各アリコートに１ｍｌのＰＥ
Ｇ（２０％ＰＥＧ４０００、１０ｍＭＣａＣｌ２、１０
ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４））を加えてＤＮＡの
取込みを促進させた。室温で１５分後、混合物を３５０
ｘｇで５分間遠心した。得られた沈殿物は１５０μｌの
ＳＯＳ（１０ｍｌの２Ｍソルビトール、６．７ｍｌのＹ
ＥＰＤ培地、０．１３ｍｌの１ＭＣａＣｌ２、２７μｌ
の１％トリプトファン、および３、７ｍｌの水）に再懸
濁した。この混合物を平板に植えつける前に、選択平板
を３７℃でプレインキュベートした。その後、１８．２
ｍｌのソルビトール、２ｇ寒天、０．６ｇジフコ（Ｄｉ
ｆｃｏ）酵母窒素塩基（アミノ酸不含）、２ｇグルコー
ス、０．１ｍｌの１％アデニン、０．４ｍｌの１％ウラ
シルおよび必要に応じてアミノ酸類を含む溶融した表面
寒天（４５℃）３ｍｌを形質転換細胞の各アリコートに
加え、その試験管内容物を選択培地上に注いだ。この平
板を３０℃で２〜４日間インキュベートした。Ｔｒｐマ
イナス培地に発生したコロニーはＴｒｐ１遺伝子をもつ
プラスミドを含んでおり、すなわちそれらは形質転換さ
れたものであった。 バイオアッセイに先立って、形質転換細胞は２０〜５０
ｍｌのＹＥＰＤ中３０℃で定常期になるまで増殖させた
。細胞収穫時に、プロテアーゼ阻害剤のフッ化フェニル
メチルスルホニル（ＰＭＳＦ）およびペプスタチンＡを
それぞれ１ｍＭと１０μＭの最終濃度で加えた。その後
、細胞を４００ｘｇで遠心して除き、培地は０．４５ミ
クロンのセルロースアセテートフィルター（ニューヨー
ク州コーニングのコーニング・グラス・ワークス社）に
通してろ過した。無菌上清は４℃で保存した。標的ＩＬ
−２依存性ウシ細胞を用いて検定したとき、得られた上
清は約１．３×１０６単位／ｍｌのｂＩＬ−２活性を示
した。 実施例７ ｂＩＬ−２の細菌宿主による発現 第２図に示すＨｇｉＡｌ（ヌクレオチド番号７７）から
ｂＩＬ−２遺伝子の３′側面領域中のＰｓｔ■制限部位
（ヌクレオチド番号５３３）まで伸びるｂＩＬ−２遺伝
子のコーティング領域を発現ベクターに挿入して、大腸
菌によりｂＩＬ−２を発現させた。ｐＬｎｂｏｖＩＬ−
２と命名したこの発現ベクター（第４図に示す）はプラ
スミドｐＰＬ−λ（ニュージャージー州ピスタウェー、
ファーマシア・ファインケミカルズ社、商品番号２７−
４９４６−０１）から作成された。プラスミドｐＰＬ−
λのゲノムはファージＰＬプロモーターとＮ遺伝子を含
有する。第４図に示すように、ｐＰＬ−λプラスミドは
大腸菌内での高いコピー数のＤＮＡ複製のための複製開
始点（ｐＢＲ３２２由来）、および形質転換した大腸菌
宿主を選択するためのアンピシリン耐性遺伝子（これも
プラスミドｐＢＲ３２２に由来する）を含む。ｐＬＮｂ
ｏｖＩＬ−２プラスミドは寄託番号５３２０２としてＡ
ＴＣＣに寄託された。 ｐＬＮｂｏｖＩＬ−２プラスミドは２つの工程で作成さ
れた。第４図に示すように、第一工程はｐＰＬ−λプラ
スミド（制限酵素Ｈｐａ■で消化）、合成オリゴヌクレ
オチドＡ、および挿入物ＤＮＡフラグメント（ヒトＩＬ
−２ｃＤＮＡ遺伝子の一部を含む）を含んでいた。 ヒトＩＬ−２遺伝子をコードするｃＤＮＡは、実施例３
で記載したように、制限酵素Ｐｓｔ■およびＲｓａ■で
消化することによりヒトｃＤＮＡクローンから単離した
。次いで、このＤＮＡフラグメントを、制限酵素Ｓｍａ
■およびＰｓｔ■で消化しておいたクローニングベクタ
ーｐＵＣ−８（ファーマシア・ファイン・ケミカルズ社
、商品番号２７−４９１６−０１）内に連結した。得ら
れたプラスミドをＨｇｉＡ■とＨｉｎｄ■で消化すると
、第１図のヌクレオチド番号６６のＨｉｇｉＡ■部位か
らｐＵＣ−８中のＨｉｎｄ■部位（Ｐｓｔ■部位を４ヌ
クレオチド越える）まで伸びるヒトＩＬ−２ｃＤＮＡ遺
伝子の部分を含むＤＮＡフラグメントを単離することが
できた。その後の連結に先立って、ＩＬ−２遺伝子の３
′末端の５′突出部分を逆転酵素を使って修復した。 Ｈｐａ■で切断したｐＰＬ−λプラスミドは、平滑５′
末端とＨｇｉＡｌ−適合性３′末端を有するオリゴヌク
レオチドＡと連結し、さらにＨｇｉＡｌ５′末端と平滑
末端化されたＨｉｎｄ■末端を有する上記のヒトＩＬ−
２ｃＤＮＡフラグメントと連結した。 連結反応はマニアチスらの上記文献に記載されるように
、４μｇ／ｍｌのプラスミドＤＮＡを使用してベクター
対挿入物ＤＮＡ対オリゴヌクレオチドのモル比１：２０
：８で実施した。その後得られた組換えプラスミド（ｐ
ＬＮＩＬ−２と命名）を用いてＰＬプロモーターの非耐
熱性大腸菌ｃ■リプレッサーをコードする遺伝子をもつ
プラスミドｐＲＫ２４８ｃ■ｔｓ（ＡＴＣＣ番号３３７
６６）を含む大腸菌株（ＡＴＣＣ番号３１３４３）を形
質転換した。この形質転換方法では、全連結混合物をコ
ンピテント大腸菌ＲＲ１（ｐＲＫ２４８ｃ■ｔｓ）に添
加した。混合物は氷上に３０分放置し、次に３０℃で４
分インキュベートし、Ｌ−培地にて３０℃で１時間増殖
させた。その後形質転換宿主はテトラサイクリンおよび
アンピシリン、１７μｇ／ｍｌを含有するＬ平板上にま
いた。 次に、プラスミドｐＬＮＩＬ−２を第二工程で使用して
、第４図に示すプラスミドｐＬＮｂｏｖＩＬ−２を作成
した。ｐＬＮＩＬ−２Ｘｂａ■とＳｔｕ■で消化するこ
とにより、ヒトＩＬ−２のコーディング配列とオリゴヌ
クレオチドＡの一部をｐＬＮＩＬ−２から単離した。（
Ｓつ１部位は第１図の位置番号５００に依存する。）ｂ
ＩＬ−２のコーティング領域を含む挿入物ＤＮＡは、制
限酵素ＨｇｉＡ■およびＰｓｔ■で消化することにより
プラスミドｂＩＬ−２−４から単離した。単離したＤＮ
Ａフラグメントの両末端の３′突出部分はＴ４ＤＮＡポ
リメラーゼで消化して平滑末端とした。 Ｘｂａ■およびＳｔｕ■で消化ｐＬＮＩＬ−２ベクター
、ｂＩＬ−２挿入物ＤＮＡ、および第４図のオリゴヌク
レオチドＢを上記の工程１での連結反応において使用し
た相対濃度で連結させると、プラスミドｐＬＮｂｏｖ−
２が得られた。その後、得られた組換えプラスミドｐＬ
ＮｂｏｖＩＬ−２を用いて、上記方法により大腸菌株Ｒ
Ｒ１（ｐＲＫ２４８Ｃ■ｔｓ）を形質転換した。 第４図に示すように、合成オリゴヌクレオチドＢはｂＩ
Ｌ−２遺伝子の効率のよい翻訳開始のために使用された
。オリゴヌクレオチドＢの組成には切断したｐＬＮＩＬ
−２ベクターのＸｂａ■末端へ連結するためのＸｂａ■
接着５′末端、およびｂＩＬ−２ＤＮＡフラグメントの
５′末端へ連結するための平滑３′末端が含まれる。Ａ
ＴＧ開始コドンおよびｂＩＬ−２遺伝子のＮ末端アラニ
ンをコードするヌクレオチドＧＣＡはオリゴヌクレオチ
ドの３′末端に位置する。先に述べたように、オリゴヌ
クレオチドの中間配置は翻訳開始列から成る。オリゴヌ
クレオチドはソードらの上記文献およびヒロセらの上記
文献に詳述されるトリエステル法により化学的に合成さ
れた。しかしながら、オリゴヌクレオチドはホスホジエ
ステル法のような他の方法でも合成し得ることを理解す
べきである。 特に指定しない限り制限酵素による消化、連結反応、ア
ガロースゲル電気泳動によるＤＮＡフラグメントの単離
、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼによる一本鎖ＤＮＡ末端の消
化、および逆転写酵素による修復反応は全てマニアチス
らの上記文献に記載されるように実施した。 大腸菌株ＲＲ１（ｐＲＫ２４８ｃ■ｔｓ）内にｐＬＮｂ
ｏｖＩＬ−２を含む培養物は、１７μｇ／ｍｌのアンピ
シリンおよびテトラサイクリンを含有するＳ．Ｉ．培地
〔３２ｇ／ｌトリプトンおよび２０ｇ／ｌ酵母エキスを
補足したＭ−９培地（マニアチスらの上記文献）で３０
℃、一晩増殖させた。その後、それらをアンピリシリン
不含Ｓ．Ｉ．培地で１００倍に希釈し、６００ｎｍでの
吸光度が０．５になるまで増殖させ、４２℃に４時間保
持して沈降を促進させた。培養物の１ｍｌサンプルを４
℃で遠心して沈殿させ、ドライアイスとメタノールの混
合物にさらして凍結した。その沈殿物を１５０μｌの７
Ｍ塩酸グアニジンに再懸濁し、ドライアイス／メタノー
ルで凍結した。その後、グアニジン抽出物の生物活性の
存在を上記のｂＩＬ−２検定法で確かめた。本発明者ら
はｐＬＮｂｏｖＩＬ−２プラスミドが１０．２×１０６
単位／ｍｌ以上の生物活性を示すことを見出した。この
ことは第２図に示すｃＤＮＡがｂＩＬ−２遺伝子である
ことを裏付けるものである。 実施例８ 酵母検出物またはグアニジン抽出物（例えば上記の実施
例６および７）からのｒｂＩＬ−２は、ウオーターズ・
プレパラティブ・グラジエント・ジェネレーターを備え
たウォーターズＬＣ５００ＡプレパラティブＨＰＬＣク
ロマトグラフ〔ＬＫＢ２２３８ユビコード■吸光度計（
ＬＫＢインスツルメント社）を用いて２８０ｎｍでの吸
光度を監視する〕を使用するＨＰＬＣ処理により均一に
精製した。発現されたｒｂＩＬ−２を含む培地は約１０
０ｍｌ／分の流量でウォーターズ・プレパック・カラム
（Ｗａｔｅｒｓ ＰｒｅＰＡＫ ｃｏｌｕｍｎ；ウォー
ターズアソシエート社）に直接送った。このカラムは１
５〜２０ミクロン粒径のバイダックＣ−４樹脂を装填し
、予め０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡで平衡化した。約７ｌ
の培地を１度にカラムにかけた。 このカラムに０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ水溶液を流して
、２８０ｎｍでの吸光度がＬＫＢ２２３８ユビコード■
吸光度計の使用により基線（培地添加前）値に戻るまで
非結合成分を洗い流した。結合タンパク質の溶離は０．
１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ中０〜１００％アセトニトリルの
直線勾配（１分当たり２％の勾配）を約１００ｍｌ／分
の流量で流すことにより達成された。 １分ごとの分画を集め、先に詳述したＩＬ−２依存性ウ
シ細胞株検定法により分析した。第５図に示すように、
意有な活性が分画１０と１１にあらわれた。これらの分
画のポリアクリルアミドゲル電気泳動は、有意な濃度の
ｒｂＩＬ−２が最初のＨＰＬＣ法で得られるが、タンパ
ク質は均一に精製されていないことを示した。 最初のＨＰＬＣ法から得られたｂＩＬ−２活性を示す分
画（分画番号１０および１１）をプールして緩衝液Ａ（
０．９Ｍ酸性酸、０．２Ｍピリジン、ｐＨ４．０）で１
：２に希釈し、５０ｍｌ／分の流量で、予め緩衝液Ａお
よび２０％緩衝液Ｂ（０．９Ｍ酸性酸中６０％ｎ−プロ
パノール、０．２Ｍピリジン、ｐＨ４．０）で平衡化し
た同じプレバックカラムに再度装填した。装填後、初め
に緩衝液Ａでカラムを洗って非結合成分を除いた。次い
で、２０〜８０％勾配の緩衝液Ｂ（１分当たり１％の勾
配）を約１５ｍｌ／分の流量で流してカラムからタンパ
ク質を溶離した。 ２回目のＨＰＬＣ法から１分ごとの分画を集め、上記の
バイオアッセイ、ポリアクリスアミドゲル電気泳動およ
びアンデンフレンド（Ｕｎｄｅｎｆｒｉｅｎｄ）らのＳ
ｃｉｅｎｃｅ．１７８：８７１（１９７２）に記載のフ
ルオレサミンにより分析した。この分析から、第６図に
示すように、均一なｒｂＩＬ−２は分画番号３０〜３２
に主としてあらわれた。また、ｒｂＩＬ−２は約１６，
０００ダルトンの分子量を有することが測定され、ｂＩ
Ｌ−２活性を示す分画に検出された唯一のタンパク質産
物であった。分画３０〜３２における活性の回収率は２
回目のＨＰＬＣカラムにかけたものの約８６％であった
。 天然ｂＩＬ−２は約２０，０００〜２３，０００ダルト
ンの分子量を有することが報告されている。ブラウン（
Ｂｒｏｗｎ）らのＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１３３：３１８
４（１９８５）参照されたい。第２図に示したｂＩＬ−
２をコードするｃＤＮＡから予測されるｂＩＬ−２の分
子量は約１５，４５０ダルトンであり、これはポリアク
リルアミドゲル電気泳動分析により測定されたｒｂＩＬ
−２の分子量と一致する。天然ｂＩＬ−２と組換えｂＩ
Ｌ−２との間の分子量の差は、第２図の位置番号７０の
Ａｓｎ残基に存在しうるＮ−結合グリコシル化部位のた
めでありうる。前述のことから、応答性Ｔ細胞の増殖を
誘起するために、ｒｂＩＬ−２はグリコシル化を必要と
しないように思われる。 均一なｒｂＩＬ−２はアミノ酸組成について分析した。 精製産生物のサンプルはＨＣｌ（濃ＨＣｌから再蒸留し
たもの；ニューヨーク州ロチェスター、コダック社）中
で２４時間絶えず沸騰させることにより真空中で加水分
解した。加水分解後、サンプルを真空化で蒸発乾固し、
０．２Ｎクエン酸ナトリウム（ｐＨ２．２）に再懸濁し
た。このサンプルはアミノ酸残基を標準ニンヒドリン試
験で検出する単一カラムアミノ酸アナライザー（４１５
０型−アルファ；ＬＫＢインスツルメント社）に注入し
た。存在する個々のアミノ酸の量に対応する出力“ピー
ク”の面積は、ＬＫＢ２２２０型記録積分器を用いて積
分した。アミノ酸組成の分析結果は上記のウシｃＤＮＡ
から予測されたものと一致した。 ２回目のＨＰＬＣ法から得られた均一タンパク質はまた
標準方法でアミノ酸配列を決定した。 ｒｂＩＬ−２のサンプルを乾燥し、真空乾燥器にかけて
小容量となし、次いでアブライドバイオシステムズ７４
０型Ａシークエネーター（カリフォルニア州フォスター
シティー）および製造者により提供される試薬類とプロ
グラムを使用して自動化アミノ末端部分の最初の２０残
基は、第２図のアミノ酸残基番号２１〜４１に記載され
るｃＤＮＡから予測されたアミノ酸配列と同じであるこ
とが見出された。タンパク質のアミノ酸配列分析法にお
いて、フェニルチオヒダントインアミノ酸はデュポンゾ
ルバック（ＤｕＰｏｎｔ Ｚｏｒｂａｃｋ）ＯＤＳ４．
６ｍｍ×３０ｃｍカラムまたはＩＢＭ−シアノ４．５ｍ
ｍ×２５ｃｍカラムによる逆相ＨＰＬＣを用いて同定し
た。 実施例９ ｎＲＮＡの分析 ウシリンパ腺細胞から単離したｖｂＩＬ−２ｍＲＮＡの
発現は、ｂＩＬ−２ｃＤＮＡから誘導されたプローブを
用いるハイブリダイゼーションにより、ノザン法（Ｎｏ
ｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ）により分析した。これに関し
て、ノザン法用の全ＲＮＡはＣｏｎＡ刺激および非刺激
ウシリンパ腺細胞から、実施例１に記載のグアニジニウ
ムチオシアナネート法により単離した。ＲＮＡサンプル
はホルムアルデヒド（ＲＮＡを変性して、ゲル中を泳動
するＲＮＡの速度がその分子量に比例するようにする）
を含む１．１％アガロースゲルでの電気泳動を行つて大
きさにより分別した。ホルムアルデヒド含有アガロース
ゲルによるＲＮＡの標準的な電気泳動法はマニアチスら
の上記文献（２０２）に記載されている。 電気泳動後、ホルムアルデヒド変性ＲＮＡは標準方法（
例えばマニアチスらの上記文献２０３を参照）を使って
ナイロン膜（ハイボンド−Ｎ，アマーシャム社）に移行
させ、次いでグリーン（Ｇｒｅｅｎ）らのＣｅｌｌ，３
２，６８１（１９８１年３月）に記載の方法によりＳＰ
６ＲＮＡポリメラーゼでｉｎ ｖｉｔｒｏ転写された３
２Ｐ−標準ＲＮＡプローブとハイブリダイゼーションを
行った。３２Ｐ−ＲＮＡプローブはｐＧＥＭ−１ベクタ
ー（ウィスコンシン州マジソン、プロメガバイオテク社
）内でサブクローニングした第２図のｂＩＬ−２ｃＤＮ
Ａの４３４塩基対のＲｓａ■からＤｒａ■まで（ヌクレ
オチド番号２２〜５０６）のフラグメントから合成した
。ナイロン膜に結合したＲＮＡはスターク（Ｓｔａｒｋ
）の完全緩衝液；すなわち５×ＳＳＣ；５０ｍＭＫＨ２
ＰＯ４（ｐＨ２．５）；１１５０μｇ／ｍｌ変性サケ精
子ＤＮＡ；２×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液（０．０４ｗ／ｖ
％フイコール、０．０４ｗ／ｖ％ＢＳＡ）；０．１％Ｓ
ＤＳ；２０ｍＭＮａ２ＥＤＴＡ；および５０ｗ／ｖ％ホ
ルムアミド中６３℃で１６時間標識ＲＮＡプローブ（１
０６ｃｐｍ／ｍｌ）とハイブリダイズさせた。ハイブリ
ダイゼーション後、フィルターを６×ＳＳＣで６３℃、
２時間洗い、次に０．１×ＳＳＣで２時間洗い、その後
増感板を使用して−７０℃で４時間オートラジオグラフ
ィーを行った。ソートラジオグラフィーの結果はＣｏｎ
Ａで刺激したリンパ腺細胞からの全ＲＮＡ中に約１，１
００ヌクレオチドから成る強くハイブリダイズするバン
ドを示した。 しかし、ＣｏｎＡで刺激しなかったリンパ腺細胞からは
この種のバンドがあらわれなかった。ノザンプロット分
析の結果は、先に論じた末梢血液白血球から誘導された
ｒｖＩＬ−２の先に測定された生物活性のレベルと一致
する。 実施例１０ ウシゲノム配列の分析 ウシゲノムＤＮＡ中のＩＬ−２関連遺伝子の数を調べる
ために、標識ｂＩＬ−２ｃＤＮＡプローブはマニアチス
らの上記文献に詳述されるような標準方法により、ウシ
末梢血液白血球から単離したゲノムＤＮＡのサザンプロ
ツトとハイブリダイズさせた。１０μｇのゲノムＤＮＡ
は比較的少ない頻度で切断することが予期される制限酵
素で消化した。プローブは第２図のウシｃＤＮＡの５０
６ｂｐフラグメント（ヌクレオチド番号１〜５０６）を
含んでいた。マニアチスｒｎｏ上記文献（１０８）に記
載の標準方法により、このプローブをニツクトランスレ
ーシヨンで放射性標識した。ハイブリダイゼーシヨンに
先だつて、１０μｇのウシゲノムＤＮＡは標準技法を用
いてＢａｍＨＩ，ＥｃｏＲＩまたはＨｉｎｄＩＩで完全
消化した。消化したウシＤＮＡを適当な大きさのマーカ
ーと共に０．７％アガロースゲルによる電気永動で分画
化した。このアガロースゲルをサザンの上記文献に記載
の方法によりニトロセルロースフイルター上にブロツテ
イング（ｂｌｏｔｔｉｎｇ）した。移行処理後、このフ
イルターを自然乾燥し、８０℃で２時間ベーキングする
ことによりＤＮＡフラグメントをニトロセルロースに固
定した。その後、固定したＤＮＡを上記実施例４で説明
したように３２Ｐ−標識ｃＤＮＡプローブとハイブリダ
イズさせ、次に室温にて２×ＳＳＣ，０．５％ＳＤＳで
洗い、さらに６５℃にて０．１×ＳＳＣ，０．５％ＳＤ
Ｓで４５分間洗つた。自然乾燥後、フイルターを−７０
℃でオートラジオグラフイーにかけ、そのオートラジオ
グラフイーはＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩ
Ｉで消化したウシゲノムＤＮＡが単一のバンドであるこ
とを示した。これにより、ＩＬ−２遺伝子はウシゲノム
ＤＮＡ中に単一コピー遺伝子として存在すると思われる
。 本発明の分野に習熟した者には明らかであるように、本
発明はその精神または本質的特徴から逸脱することなく
先に詳述したものとは別の形で具体化されうる。それ故
、上記の本発明の実施態様はすべての点において例示と
して解釈されるべきであつて、限定するものではない。 本発明の範囲は前述の実施例に制限されるものではなく
、むしろ特許請求の範囲に記載されるものである。
略す）に関し、より詳細にはヒトインターロイキン−２
（ＩＬ−２）の相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）か
ら誘導されタプローブを使用して、ｂＩＬ−２ｍＲＮＡ
を含むウシメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）から合
成されたｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするこ
とによるｂＩＬ−２遺伝子のクローニングに関する。 従来技術 ＩＬ−２はリンパ球の反応性を調節することができ且つ
抗原特異的エフェクターＴリンパ球の長期ｉｎ ｖｉｔ
ｒｏ培養を促進（有機分裂誘発）することができる可溶
性タンパク質であって、過去においてマウス、ラットま
たはヒトのリンパ球細胞をマイトジエンで刺激すること
により産出された。 例えば、モーガン（Ｍｏｒｇａｎ）らのＳｃｉｅｎｃｅ
．１９３：１００７（１９７６）およびラセッティー（
Ｒｕｓｃｅｔｔｉ）らのＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１９
：１３１（１９９７）は、プールした正常ヒトリンパ球
を、同じヒト由来の血清およびマイトジエン植物凝集素
（フイトヘマグルチニン；以降ＰＨＡと略す）を含有す
るロスウエル・パーク・メモリアル・インスチチュート
−１６４０培地（Ｒｏｓｗｅｌｌ ＰａｒｋＭｅｍｏｒ
ｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ−１６４０ｍｅｄｉｕｍ；
以後ＲＰＭＩ−１６４０と略す）中で培養する方法を開
示した。 ギリス（Ｇｉｌｌｉｓ）およびスミス（Ｓｍｉｔｈ）の
Ｎａｔｕｒｅ，２６８：１５４（１９７７）は、ウシ胎
児血清（以後ＦＣＳと略す）を含むＲＰＭＩ−１６４０
培養中で正常ＤＢＡ／２マウス脾臓細胞をマイトジエン
コンカナバリンＡ（以後ＣｏｎＡと略す）で刺激したこ
とによるネズミＩＬ−２の産生を報告した。 フアラー（Ｆａｒｒａｒ）らのＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，
１２１：１３５３（１９７８）は、また正常マウス血清
（以後ＭＭＳと略す）を含む組織培養倍地中Ｃｏｍ Ａ
と共にインキュベートしたネズミ脾臓細胞からのＩＬ−
２の産生を開示した。 ギリスらは熱失活ＦＧＳ、ペニシリン−Ｇおよびゲンタ
マイシンを補足したＲＰＭＩ−１６４０組織培養培地中
で培養したネズミおよびラットの脾臓細胞からのＩＬ−
２の産生を報告した。ネズミおよびラットの脾臓細胞は
ＣｏｎＡ、ＰＨＡおよびアメリカヤマゴボウマイトジエ
ン（ｐｏｋｅｗｅｅｄｍｉｔｏｇｅｎ；以後ＰＫＭと略
す）を含む種々のマイトジエン類で刺激された。Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．，１２０：２０２７（１９７８）を参照
されたい。 ＩＬ−２はまたヒト末梢血液単核細胞を、同じヒト由来
の血清、ペニシリン、ゲンタマイシン、新しいＬ−グル
タミンおよびＰＨＡを補足したＲＰＭＩ−１６４０培地
中で培養することにより産生された。ギリスらのＪ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．，１２４：１９５４（１９８０）を参照
されたい。 ギリスらのＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２５：２５７０（
１９８０）は熱失活ＦＣＳ、２．５×１０−５Ｍ２−メ
ルカプトエタノール、Ｎ−２−ヒドロキシ−ピペラジン
−ＸＩ１−２−エテン−スルホン酸（以後ＨＥＰＥＳと
略す）緩衝液、ペニシリン、ストレプトマイシンおよび
新しいＬ−グルタミンを補足したＭＰＭＩ−１６４０中
で培養したＴ細胞白血病及びリンパ腫細胞胞株、特にＢ
１０．ＢＲマウス由来の放射線誘発脾臓リンパ腫（ＬＢ
ＲＭ−３３）からのＩＬ−２の産生を明らかにした。こ
の培養物はＣｏｎＡおよびＰＨＡを含む種々のマイトジ
エン類で刺激された。 これらのマウス、ラット及びヒト正常Ｔリンパ球から精
製されたＩＬ−２は多様な生物活性：例えば（１）胸脾
細胞有糸分裂の著しい促進、ワトソン（Ｗａｔｏｓｏｎ
）らのＪ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１５：８４９（１９７９
）およびギリスらのＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２４：１
９５４（１９８０）を参照；（２）抗原特異的ヘルパー
またはキラーＴ細胞株の長期 ｉｎ ｖｉｔｒｏ 増殖
の促進、ギリスらのＮａｔｕｒｅ．２６８：１５４（１
９７７）およびワトソンのＪ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１５
０：１５１０（１９７９）を参照；（３）ヌードマウス
脾臓細胞の培養における細胞障害性Ｔリンパ球（以後Ｃ
ＴＬと略す）反応性とプラーク形成細胞応答の誘発、ワ
トソンらの上記文献Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１５０：８
４９およびギリスらの上記文献Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，
１２４１９５４を参照；を保持することが見出された。 従って、ＩＬ−２が免疫応答を高揚して免疫不全Ｔ細胞
集団（ヌードマウス脾臓細胞）を正常レベルの細胞性／
体液性免疫に復帰させるのに有用であることを示してい
る。さらに、これらの結果はＩＬ−２の産生および応答
が異常免疫の臨床診断の際に有用でありうる免疫学的機
能の重要なパラメーターであることを示唆している。そ
の上、ヒトＩＬ−２が抗原特異的ヒト、マウスおよびラ
ットキラーＴ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖を可能にする
事実は、検索物質としてのヒトＩＬ−２の重要性を強調
するものである。 これらおよび類似の理由により、ヒトＩＬ−２は現在ヒ
トの臨床上の治療薬材として評価されつつある。ＩＬ−
２は免疫機能の重要な調節剤であり、また家畜の治療と
りわけストレスにより誘発されたウシの免疫不全の場合
に有効でありうる。 ウシが放牧地への輸送または放牧地から飼育地への輸送
の際に受けるストレスはステロイドホルモンの産生を高
め、そのステロイドホルモンが免疫応答の低下へと導く
という仮説はしばしば認められている。動物が飼育地へ
到着するとき、それらは低下した免疫反応性ゆえに普通
の最近やウィルスの感染の犠牲になってしまう（普通の
状況下では動物はこの種の感染に対抗する能力を有する
）。 いろいろなタイプの上部気道感染症が発生しうる。 この“輸送熱”症候群の結果は、この状態の動物が食欲
を失い、体重減少を起こし、さらにこれらの一般に拒否
される疾患の原因となる感染因子がもとで死ぬことさえ
あるということである。ギリスおよび共同研究者は、数
年前に、ステロイドホルモン類がＩＬ−２産生を減少さ
せるそれらの能力により免疫応答を劇的に低下させると
発表した。 実際に、ステロイド−抑制免疫応答にＩＬ−２をｉｎ
ｖｉｔｒｏ添加すると、免疫反応性が劇的に回復した。 これらの結果に基づいて、輸送熱症候群の治療における
ＩＬ−２の使用が、この症候群の排除をもたらし且つ輸
送により誘起される免疫不全の結果として失われる莫大
な金額の返還をもたらすであろうと示唆することは驚く
べきことでない。 都合が悪いことに、ｂＩＬ−２の産生方法は十分に明ら
かにされていない。その上、天然ｂＩＬ−２源はその治
療上の有効性を徹底的に研究するのに十分な量の均一な
ＩＬ−２を提供しうる利用可能な系であることを証明し
ていない。 比較的多量の均一なｂＩＬ−２を産生しうる１つの方法
は組換えＤＮＡ技術による。組換えＤＮＡ技術は、ひと
たび意図するタンパク質の遺伝子が単離および固定され
ると、そのタンパク質を経済的に産生するために開発さ
れた。タンパク質の産生に関するこの種の組換えＤＮＡ
技術の内容はＳｃｉｅｎｃｅ ｖｏｌ．１９６（１９７
７年４月）中の編集および補助論文に説明されている。 しかしながら、この文献に論じられている組換えＤＮＡ
技術を利用するためには、まずｂＩＬ−２をコードする
遺伝子を単離しなければならない。 発明の概要 本発明によれば、ｂＩＬ−２をコードする遺伝子がニッ
クトランスレーションされたヒトｃＤＮＡプローブを用
いてｃＤＮＡライブラリーから単離される。このプロー
ブはヒトＩＬ−２のヌクレオチド配列の一部に対応する
合成オリゴヌクレオチドプローブの使用によりヒトｃＤ
ＮＡライブラリーから単離する。全ウシＲＮＡは比較的
高レベルのｂＩＬ−２を産生することが知られているリ
ンパ腺細胞から抽出する。この全ＲＮＡ抽出物からポリ
Ａを含むｍＲＮＡを単離する。ｃＤＮＡライブラリーは
ポリＡ＋ｍＲＮＡを逆転写酵素により逆転写することに
よって作成される。このＤＮＡをＤＮＡポリメラーゼ■
で二本鎖となし、これを適当なクローニングベクター内
に挿入する。得られた組換えクローニングベクターは適
当な宿主を形質転換するために使用される。 形質転換宿主を同定して、プールに分ける。これらのプ
ールから得られたプラスミドＤＮＡは、放射性標識した
ヒトｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせる。プロー
ブに対して陽性の信号を与えるクローンのプールを同定
し、その推定上のプールをさらに分割してハイブリダイ
ゼーションによる検索を繰り返す。結局、ｂＩＬ−２遺
伝子を含む単一の形質転換細胞が同定される。この形質
転換細胞からプラスミドＤＮＡを調整し、ＤＮＡの塩基
配列決定により同定する。さらに、そのヌクレオチド配
列から対応するアミノ酸配列を決定する。ｂＩＬ−２遺
伝子のコーディング領域は、成熟ｂＩＬ−２を発現させ
るために、酵母と細菌の両方の発現系内にクローン化す
る。これらの発現系から得られた組換えｖＩＬ−２（以
後ｒｂＩＬ−２と略す）は、逆相高性能液体クロマトグ
ラフィー（ＨＰＬＣ）法により均一になるまで精製する
。 その後、発現したタンパク質産物がｂＩＬ−２であるこ
とを調べるためにパイオアッセイを実現し、そしてｒｂ
ＩＬ−２のアミノ酸組成とその配列について分析する。 発明の構成 ｂＩＬ−２産生細胞源： 好ましくは、比較的高レベルのｂＩＬ−２を産生するこ
とが知られている細胞からｃＤＮＡライブラリー（ｂＩ
Ｌ−２をコードする遺伝子はこのライブラリーから検索
されるだろう）を作成する。 これらの細胞源にはウシＴ細胞組織（すなわちリンパ腺
または脾臓）が含まれる。 活性化されたウシ末梢血液もまたｂＩＬ−２分子の源と
なりうる。本発明において使用するために、例えばフイ
コールハイパーク（ＦｉｃｏｌｌーＨｙｐａｑｕｅ）遠
心法のような標準方法を使って全血液から単核細胞を分
離することができる。採取した白血球は、血清含有培地
中でＴ細胞マイトジエンの存在下にｉｎ ｖｉｔｒｏ培
養することによって増殖させる。以下で説明するように
、本発明者らはマイトジエン刺激ウシ末梢血液細胞から
作成したｃＤＮＡライブラリーよりｂＩＬ−２遺伝子を
単離するのに成功した。 ｂＩＬ−２産生細胞からのＲＮＡの調製：チャーウィン
（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ）らのＢｌｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．
１８：５２９４（１９７９）およびマニアチス（Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ）らのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
，ａＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，コールド・
スプリング・ハーバー研究所、コールド・スプリング・
ハーバー、ニューヨーク（１９８２）に記載されるよう
な標準方法を使って、ウシＩＬ−２産生細胞から全ＲＮ
Ａを抽出する。 よく知られているように、細胞からＲＮＡを抽出する場
合、抽出の初期段階の間中リボヌクレアーゼ（ＲＮアー
ゼ）活性を最小限に抑えることが重要である。これを達
成するための１つの方法は、ＲＮアーゼを含む細胞タン
パク質を、ＲＮアーゼによるＲＮＡ加水分解の速度を超
える速度で変性することである。チャーウィンらの上記
文献およびマニアチスらの上記文献（１９６）の方法で
は、２−メルカプトエタノールのような還元剤と共にグ
アニジニウムチオシアネートを使用してタンパク質のジ
スルフイド結合を分解することにより、これを実施して
いる。ＲＮＡはフェノール／クロロホルム抽出、エタノ
ール沈殿または塩化セシウム沈降のような標準方法によ
りタンパク質から単離される。別法として、ＲＮＡは塩
酸グアニジンによる抽出およびそれに続くフェノール／
クロロホルム抽出によってタンパク質から分離すること
もできる。 次に、ポリＡ＋ｍＲＮＡを抽出タンパク質から分離する
。この分離操作を行うためにいくつかの技法が開発され
たが、１つの好適な方法はエドモンド（Ｅｄｏｍｏｎｄ
ｓ）らのＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ｄｃｉ．，６
８：１３３６（１９７１）、アラブ（Ａｖｉｖ）および
レイダー（Ｌｅｄｅｒ）のＰｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．，６９：１４０８（１９７２）およびマニ
アチスらの上記文献（１９７）に記載されるようなオリ
ゴ（ｄＴ）−セルロースカラムでポリＡ＋ｍＲＮＡをク
ロマトグラフ処理することである。オリゴ（ｄＴ）−セ
ルロースカラムは緩衝液で調製し、その後ｍＲＮＡをそ
のカラムから溶離する。ポリＡ＋ｍＲＮＡの完全性はゲ
ル電気泳動により証明される。 ｍＲＮＡからｃＤＮＡの調製： 先に調製および検定したｍＲＮＡに対応する二本鎖ｃＤ
ＮＡのライブラリーは、逆転写酵素を使用する既知技法
により作成される。本発明に関連して使用しうる１つの
このような方法は、カプラー（Ｇｕｂｌｅｒ）およびホ
フマン（Ｈｏｆｆｍａｎ）のＧｅｎｅ，２５：２６３−
２６９（１９８３）により修正された。マニアチスらの
上記文献（２３０）に詳述される方法である。簡単に述
べれば、ポリＡ＋ｍＲＮＡが第一のｃＤＮＡ鎖のための
プライマーとしてｍＲＮＡのポリＡ尾部にハイブリダイ
ズされたオリゴマーｄＴを使用することにより逆転写さ
れる。第二のｃＤＮＡ鎖はＤＮＡポリメラーゼ■、ＲＮ
アーゼＨおよび大腸菌ＤＮＡリカーゼの酵素類を使用し
て合成される。この方法は、マニアチスらの上記文献記
載の標準的なｃＤＮＡ合成法を単に使用する場合に必要
とされるＳ１ヌクレアーゼ（最初のｃＤＮＡ鎖の３′末
端に形成されるヘアピンループの切断を媒介する）を排
除する。二本鎖ｃＤＮＡは有利な手段によって分画化し
て比較的短いＤＮＡ鎖を除き、それにより小さなｃＤＮ
Ａ分画のむだなクローンを避ける。 本発明によれば、ｍＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを合成す
るために別の標準方法を使用し得ると理解するべきであ
る。１つのこのような別法はランド（Ｌａｎｄ）らのＮ
ｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，９：２２５１（１９８
１）に開示されている。ランドらの方法では、ヘアピン
ループが第二ｃＤＮＡ鎖のプライマーとして使用されな
い。むしろ、第一ｃＤＮＡ鎖の３′末端にはターミナル
デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）
を使用してｄＣＭＰ残基が付加される。これはポリーＣ
残基の３′尾部を生ずる。その後、第二鎖の合成が３′
尾部にハイブリダイズしたオリゴマーｄＧにより開始さ
れる。 この技法は、マニアチスらの方法においてヘアピンがＳ
１ヌクレアーゼで切断される場合に起こりうる第二ｃＤ
ＮＡ鎖の５′尾部の欠失部分を避けるのに役立つと言わ
れている。 ｃＤＮＡのクローニング： 次に、二本鎖ｃＤＮＡはクローニングベクター（このベ
クターは適合性の原核または真核宿主細胞を形質転換し
てそのベクターを複製するために使用される）に挿入さ
れる。その後形質転換細胞を同定し、その細胞からプラ
スミドＤＮＡを単離する。 本発明を実施するために、種々のクローニングベクター
を使用することができる。好適なものはプラスミドであ
るが、ベクターはバクテリオファージまたはコスミドで
ありうる。クローニングが哺乳動物細胞内で行われる場
合は、ウィルスをベクターとして使用することもできる
。 プラスミドを使用する場合、それは天然源から得られる
か、もしくは人工的に合成される。選ばれた特定のプラ
スミドは意図する形質転換用宿主（例えば大腸菌のよう
な細菌、酵母またはその他の単細胞微生物）と適合すべ
きである。そのプラスミドは使用される個々の宿主細胞
のための適切な複製開始点をもつべきである。また、プ
ラスミドは形質転換宿主細胞を容易に見分けることがで
き且つ形質転換を受けない細胞から容易に分離できるよ
うに表現型特性をもつべきである。この種の表現型特性
には増殖阻害物質（例えば抗生物質）に対して耐性を与
える遺伝子が含まれる。テトラサイクリン、ストレプト
マイシン、サルファ剤、ペニシリンおよびアンピシリン
を含む種々の抗生物質に対する耐性遺伝子をコードする
プラスミドは市販されている。 宿主細胞として大腸菌を使用する場合、本発明に関連し
て使用できる多数のクローニングプラスミドが市販され
ている。本発明の実施にとって好適なプラスミドはｐＢ
Ｒ３２２である。このプラスミドはサトクリフ（Ｓｕｔ
ｃｌｉｆｆｅ）のＣｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，４３：７７（１
９７９）に記載されるように、その塩基配列が完全に決
定されている。このプラスミドの利点は、それがアンピ
シリン耐性遺伝子中のＰｓｔ■部位を含めて１１個の特
異な既知制限部位を有するということである。この特徴
はホモポリマー付加法（ｈｏｍｏｐｏｌｙ−ｍｅｒ ｔ
ａｉｌｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）によってクローニングす
る際に特に有用である。 プラスミドの代わりにバクテリオファージを使用する場
合、この種のファージはプラスミドの選択に関して先に
示した特徴と実質的に同じ特徴をもつべきである。それ
には表現型マーカーおよび外来遺伝子結合用の連結可能
な末端の存在が含まれる。 好ましくは、本発明において、平滑末端を有する二本鎖
ｃＤＮＡがホモポリマー付加によってプラスミドベクタ
ー内に挿入される。当分野でよく知られているように、
この技法では相補的ホモポリマーがｃＤＮＡ鎖とプラス
ミドＤＮＡに付加される。その後、ベクターと二本鎖ｃ
ＤＮＡは相補的ホモポリマー尾部間の水素結合により一
緒に結合して、大腸菌のような宿主細胞を形質転換しう
る開環状ハイブリッド分子を形成する。 ホモポリマー付加の１つの方法では、約５０〜１５０個
のｄＡヌクレオチド残基を線状化プラスミドＤＮＡの３
′末端に付加する。同じ数のｄＴヌクレオチド残基を二
本鎖ｃＤＮＡの３′末端に付加し、その後ｃＤＮＡとプ
ラスミドを一緒に結合する。 別の好適な方法では、適当な制限酵素で切断したクロー
ニングベクターの３′末端にｄＧ尾部を付加する。例え
ば、ｐＢＲ３２２プラスミドを使用する場合、制限酵素
Ｐｓｔ■を用いてアンピシリン耐性遺伝子のところでそ
のプラスミドを消化する。 相補的ｄＣ尾部を二本鎖ｃＤＮＡの３′末端に付加し、
その後適当なアニーリング緩衝液を用いてそのｃＤＮＡ
をプラスミド内に挿入する。 二本鎖ｃＤＮＡはその他いろいろな標準方法によりプラ
スミドクローニングベクター内に挿入しうると理解すべ
きである。１つのこのような別法には、ＤＮＡリカーゼ
の使用により合成ヌクレオチドリンカーをｃＤＮＡ鎖の
両末端に結合されると、同じ制限酵素で切断したプラス
ミド内に挿入しうる接着末端が生ずる。シエラー（Ｓｃ
ｈｅ−ｌｌｅｒ）らのＳｃｉｅｎｃｅ，１９６：１７７
〜１８０（１９７７）；マニアチスらの上記文献（２１
９）を参照されたい。 上記のように作成した組換えＤＮＡプラスミドを使用し
て宿主細胞を形質転換する。宿主は適当な原核または真
核細胞のいずれであってもよいが、好ましくはそれは大
腸菌や酵母菌のようなよく知られた細菌である。この種
の宿主は容易に形質転換され、速やかに培養下で増殖す
ることができる。 サルモネラ菌や締炎菌のような他の種類の細菌を大腸菌
の代わりに使用してもよい。細菌の代わりに、例えば真
菌や藻類のような他の単細胞微生物を使用することもで
きる。どんな宿主が選ばれようと、それは組換えプラス
ミドを切断する制限酵素を含むべきでない。 大腸菌を宿主として使用する場合、好適な菌株はＭＭ２
９４およびＲＲ１である。プラスミドベクターによるＭ
Ｍ２９４宿主の性質転換法はよく知られており、マニア
チスらの上記文献（２５５）およびハナハン（Ｈａｎａ
ｈａｎ）のＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６：５５７（
１９８３）に記載されている。プラスミドベクターによ
るＲＲ１宿主の形質転換法もボリバー（Ｂｏｌｉｖａｒ
）らのＧｅｎｅ．２：９５（１９７７）およびピーコッ
ク（Ｐｅａｃｏｃｋ）らのＢｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ．Ａｃｔａ．，６５５：２４３（１９８１）に記載
されるように公知である。適切な宿主となり得るその他
の大腸菌株にはＤＨ１（米国２０８５２メリーランド州
、ロックヒル、パークローンドライブ１２３０１、アメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクション〔ＡＴＴＣ
〕寄託番号３３８４９）およびＣ６００が含まれる。こ
れらの菌株およびＭＭ２９４およびＲＲ１は広く商業的
に入手できる。 マニアチスらの上記文献およびハナハンの上記文献に記
載される方法を含めた形質転換法において、実際に形質
転換される宿主細胞は、その細胞によるプラスミドの取
込みが制限されるために、ほんの一部の細胞に限られる
。形質転換された細胞は、適当な培地および抗生物質の
ような表現型同定剤を含む寒天平板上でその細胞培養物
を培養することにより同定し得る。適当な耐性遺伝子（
例えば抗生物質耐性遺伝子）を有する細胞のみが生き残
るであろう。組換えｐＢＲ３２２プラスミドを用いて大
腸菌株ＭＭ２９４を性質転換する場合、形質転換細胞は
表現型同定剤としてテトラサイクリンを使用することに
より同定し得る。 放射性標識ｃＤＮＡスクリーニングプローブの調製： 上記のようにして作成したウシｃＤＮＡライブラリーを
スクリーニングするために、プローブとしてヒトＩＬ−
２をコードする遺伝子の大部分のヌクレオチド配列に対
応する７００塩基対（ｂｐ）から成る放射性標識ＤＮＡ
フラグメントが使用される。このプローブはヒトＩＬ−
２のヌクレオチド配列の一部に対応する放射性標識され
た合成オリゴヌクレオチドプローブを用いてヒトｃＤＮ
Ａライブラリーから単離する。 本発明のスクリーニング法において使用するｃＤＮＡプ
ローブを単離するために、まず初めに上記方法を使って
ヒトｍＲＮＡからヒトｃＤＮＡライブラリーを作成する
。ｍＲＮＡはＩＬ−２を産生することが知られているヒ
ト細胞株から抽出される。この種の細胞株にはＴ白血病
細胞株ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）またはそのクロー
ンのような種々のＴ細胞株が含まれる。この細胞株およ
びそのクローンは米国および外国の研究者により広く使
用されており、商業的にまたはＡＴＣＣから入手可能で
ある。ヒト細胞に由来する全ＲＮＡは、例えば２−メル
カプトエタノールと共にグアニジニウムチオシアネート
を使用するような上記標準方法により抽出できる。その
後、ホリＡ＋ｍＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）−セルロースに
よるクロマトグラフィーを使って抽出タンパク質から分
離する。 ヒトｍＲＮＡに対応する二本鎖ｃＤＮＡのライブラリー
は、先に論じたように、鋳型としてｍＲＮＡを使用して
第一のｃＤＮＡ鎖を形成するために逆転写酵素を使用す
ることにより作成される。次に、酵素ＤＮＡポリメラー
ゼ■および鋳型として第一鎖を使用して第二ｃＤＮＡ鎖
を合成する。この二本鎖ｃＤＮＡはベクター複製用の適
合性宿主細胞を形質転換するためのクローニングベクタ
ー内に挿入される。好ましくは、そのベクターは多数の
特異な制限部位をもつプラスミドｐＢＲ３２２のような
プラスミドから成る。ｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡ
は、上記のようなホモポリマー付加によりこのプラスミ
ド内に挿入することができる。その組換えプラスミドを
用いて、大腸菌株のような適合性宿主を形成転換する。 もちろん、その他の適当な宿主も使用できる。組換えプ
ラスミドにより形質転換された宿主細胞は、抗生物質の
ような標準的な表現型同定剤により同定される。 ヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための
プローブとして、放射性標識されたオリゴヌクレオチド
が合成される。ヒトＩＬ−２をコードする遺伝子のアン
チセンス鎖の一部から誘導されるプローブは次の組織：
５′−ＡＡ ＴＧＴ ＧＡＧＧＡＴ ＣＣＴ ＧＧＴ
ＧＡＧ−３′を有する。このプローブは第１図に示すセ
ンス鎖であり、比較的容易に合成しうる短鎖であるがヒ
トＩＬ−２遺伝子のプローブとして役立つ十分な情報を
含む長さであるという利点を有する。しかしながら、プ
ローブの組成は本発明の範囲または精神の他の部分に対
応し得ると理解すべきである。 合成オリゴヌクレオチドプローブは、ホスホジエステル
法またはトリエステル法のような公知技法により科学的
に容易に合成される。トリエステル合成法の詳細は例え
ばソード（Ｓｏｏｄ）らのＮｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．，４：２５５７（１９７７）およびヒロセ（Ｈｉｒ
ｏｓｅ）らのＴｅｔ．Ｌｅｔｔ．，２８：２４４９（１
９７８）に記載されている。合成後、オリゴヌクレオチ
ドプローブはＴ４ポリヌクレオチチドキナーゼおよび３
２Ｐ−ＡＴＰで標識される。標準的な標識方法はマニア
チスらの上記文献（１２２）に記載されている。有利に
は、０Ｈ５′末端を有するオリゴヌクレオチドプローブ
を合成することにより、一般に必要とされるホスファタ
ーゼ法を避けるのが望ましい。 ヒトｃＤＮＡライブラリーは、実施例３および４に詳述
される放射性標識合成プローブを用いてスクリーニング
する。その後、そのスクリーニング法によって固定され
た特定の陽性コロニーからプラスミドＤＮＡを調製する
。 ヒトプラスミドＤＮＡは以下で論ずるチェインターミネ
ーション法（Ｃｈａｉｎ−ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｍｅ
ｔｈｏｄ）によりその塩基配列を決定する。その塩基配
列決定の結果から、第１図に示すように、単離したプラ
スミドＤＮＡは実質的にヒトＩＬ−２遺伝子の完全なコ
ーディング領域を含むことが判明した。 単離したヒトプラスミドＤＮＡの実質的全長が、ウシｃ
ＤＮＡライブラリーをクリーニングするためのプローブ
として選ばれた。比較的大きいサイズのプローブ（３０
０〜５００ｂｐの範囲）は、ＩＬ−２をコードしないｃ
ＤＮＡフラグメントよりもむしろＩＬ−２を実際にコー
ドするｃＤＮＡとハイブリダイズする可能性を一般に高
める。以下で詳述するように、このプローブの使用によ
り、ｃＤＮＡライブラリーからｂＩＬ−２遺伝子を単離
するのに成功した。ヒトプラスミドＤＮＡフラグメント
のヌクレオチド配列の他の部分に対応するプローブも、
本発明の精神または範囲を逸脱することなく使用し得る
と理解するべきである。 ヒトｃＤＮＡプローブは、ウシｃＤＮＡライブラリープ
ールとハイブリダイズさせる前に放射性標識される。プ
ローブのサイズが比較的大きいために、いろいろな標識
方法を使用し得るが、好ましくは“ニックトランスレー
ション”でそのプローブを標識する。リグビー（Ｒｉｇ
ｂｙ）らのＴ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏ．，１１３：２３７
（１９７７）およびマニアチスらの上記文献（１０８）
に記載されるように、この公知技法では、ＤＮアーゼ■
での非常に制限された処理によりＤＮＡの広く分離され
た部位にニックが導入され、それによって各ニックに遊
離の３′−ＯＨ基が生じる。ＤＮＡポリメラーゼ■を使
用して３′−ＯＨ末端に適当な放射性標識デオキシヌク
レオチド三リン酸（３２ｐ−ｄＮＴＰ）を取り込ませ、
同時にニックの５′側からヌクレオチドを分解してＤＮ
Ａに沿ってニックの逐次移動（ニックトランスレーショ
ン）を生じさせる。 ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング：本発明のスク
リーニング法において、形質転換細胞は初めに約２５０
０個の形質転換細胞から成る比較的大きなグループにプ
ールされる。複製されたプラスミドは、アルカリ溶菌の
ようないくつかの公知方法のいずれかによって形質転換
細胞から抽出する。抽出したプラスミドはＰｓｔ■で切
断する。得られたＤＮＡフラグメントをアガロースゲル
での電気泳動により分画化し、次いでサザン（Ｓｏｕｔ
ｈｅｒｎ）のＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８：５０３（
１９７５）に記載されるサザンプロッティング法により
直接分析する。サザンブロッティング法でニトロセルロ
ースフィルターに固定したＤＮＡフラグメントは、標識
したＤＮＡプローブとハイプリダイズさせる。プローブ
とハイブリダイズする特定のＤＮＡフラグメントはオー
トラジオグラフィーで同定する。 オートラジオグラフィーにより強いハイブリッド形成バ
ンドを示すクローンの推定上のプールは、約５００個の
形質転換細胞から成るグループにさらに分割し、その後
標識ネズミｃＤＮＡプローブを使って上記のハイブリッ
ド形成スクリーニングを繰り返す。クローンの推定上の
プールを分割して形質転換細胞をスクリーニングするこ
の方法は、所望のプールの大きさが得られるまで繰り返
す。 その後、標識プローブとハイブリダイズする単一の形質
転換細胞が、グルンスタイン（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ）お
よびホグネス（Ｈｏｇｎｅｓｓ）のＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），７２：３９６１（１
９７５）に記載のよく知られたコロニーハイブリダイゼ
ーション法により同定される。この方法によって、本発
明者らは１つのこのような陽性コロニーを発見した。Ｂ
−ＩＬ−２−４と命名したプラスミドＤＮＡはこの特定
コロニーから得られる。 スクリーニングしたｃＤＮＡの同定： 上記のプラスミドＤＮＡは標準チェインターミネーショ
ン法によりその塩基配列を決定する。ヌクレオチドのこ
の塩基配列決定法はサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのＰｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、７０
：５４６３（１９７７）に初めて開示された。米国特許
第４３２２４９９号を参照されたい。 チェインターミネーション塩基配列決定法は、Ｍ１３ク
ローニングおよびシークエンシングと題するＡｍｅｒｓ
ｈａｍ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（以後ＡｍｅｒｓｈａｍＨａ
ｎｄｂｏｏｋと略す）。プレンハイム・クレセント、ロ
ンドン（１９８３）；メッシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）の
Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ
Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ
Ｎｏ。７９−９９，２，４３−４８（１９７９）；ノ
ランダー（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ）らのＧｅｎｅ，２６：
１０１（１９８３）；セレッチ（Ｃｅｒｒｅｔｔｉ）ら
のＮｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１１：２５９（１
９８３）およびビギン（Ｂｉｇｇｉｎ）らのＰｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）．８０：３９
６３（１９８３）に記載されている。Ｍ１３線維状ファ
ージをベクターとして使用して対象のＤＮＡ配列をクロ
ーニングする。これらのファージベクターはチェインタ
ーミネーション法で簡単に塩基配列を解析できる一本鎖
ＤＮＡ鋳型を与え、このチェインターミネーション法は
一本鎖鋳型分子に遊離３′−ＯＨ基を有する短いプライ
マー鎖を結合し、次にＤＮＡポリメラーゼ（クレノウフ
ラグメント）および４種類のデオキシリボヌクレオチド
三リン酸、すなわちｄＡＴＰ、ｄＮＴＰ、ｄＧＴＰ、お
よびｄＴＴＰ（集合的にｄＮＴＰと記す）（ｄＮＴＰの
うち１種は放射性標識される）を使用するチェインエク
ステンション反応（鎖伸長反応）により鋳型鎖をコピー
する。この合成反応では、３′−ＯＨ末端を欠くヌクレ
オチド特異的チェインターミネーター、例えば２′、３
′−ジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を
使用して、様々な長さの一連の鎖伸長ＤＮＡを合成する
。このターミネーターは伸長するＤＮＡ鎖中に取込まれ
るように普通の５′末端をもつが３′−ＯＨ末端を欠い
ている。ひとたびターミネーターがＤＮＡ鎖に取り込ま
れると、これ以上のデオキシヌクレオチド三リン酸は付
加されず、それによりＤＮＡ鎖の伸長が停止する。 ４つの別々の合成反応を実施し、各反応は４種のヌクレ
オチドｄＮＴＰ（すなわちｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
ＰおよびｄＴＴＰ）のうち１種は放射性標識され、こう
して合成鎖はポリアクリルアミドゲルで大きさにより分
別した後オートラジオグラフィーを行うことができる。 ４つの反応から得られた鎖伸長ＤＮＡは、オートラジオ
グラフィーからのフラグメントのパターンがクローン化
ＤＮＡの核酸配列に対応するように、別々のゲルレーン
に相並べて配置する。 第２図は先に作成したＢ−ＩＬ−２−４プラスミドＤＮ
Ａ中に含まれるｂＩＬ−２遺伝子のヌクレオチド配列を
示す（ヌクレオチドはその５′末端の始めから番号を付
けてある）。遺伝子の対応するアミノ酸組成も第２図に
示されており、アミノ酸残基は遺伝子のコーティング領
域の始め（ヌクレオチド番号１８）から番号を付けてあ
る。成熟タンパク質は星印を付けた２１位のＡｌａ残基
（ヌクレオチド番号６８）から始まり、１５５位のＴｈ
ｒ残基（ヌクレオチド番号４８２）まで延びている。 塩基配列決定法では、ＤＮＡ挿入物を含むプラスミドＤ
ＮＡをＭ１３ファージベクターにサブクローニングして
一本鎖ＤＮＡ鋳型を作る。共通のプライマーを用いてセ
ンス鎖とアンチセンス鎖の塩基配列を決定する。単一の
チェインターミネーション法を用いて全長フラグメント
の塩基配列を決定することから得られた結果をあてにす
るより、むしろ追加の合成プライマーを使用して、サブ
クローン化ＤＮＡフラグメントの長さの中間位置からチ
ェインターミネーション法を開始する。この合成プライ
マーの組成は共通のプライマーを使用して得られた塩基
配列の情報に基づいていた。この方法によって、サブク
ローン化ＤＮＡフラグメントの両鎖は重複する形でその
塩基配列が決定されるので、その塩基配列を二重に確か
めることができる。 上記のチェインターミネーション法を使用せずに、その
他の既知方法を使って、本発明の精神または範囲から逸
脱することなくクローン化ウシｃＤＮＡ挿入物の塩基配
列を決定することもできると理解するべきである。例え
ば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ
）。７４：５６０（１９７７）に記載されるようなマク
サム（Ｍａｘａｍ）およびギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ
）の化学的分解法を使用することができる。 ｃＤＮＡクローンからの機能的ｂＩＬ−２の発現： プラスミドｂＩＬ−２−４に含まれるｂＩＬ−２遺伝子
のｃＤＮＡコーティング領域が機能的ｂＩＬ−２をコー
ドするかどうか調べるために、遺伝子を酵母および細菌
の発現系にて発現させ、その後ＩＬ−２依存症ウシＴ細
胞の増殖を維持するその能力について試験する。 酵母系による発現 ｂＩＬ−２遺伝子の実質的に完全なコーティング領域の
ｃＤＮＡフラグメントは、ｂＩＬ−２の成熟体を酵母宿
主細胞から合成および分泌させるようにデザインされた
発現ベクター（第３図参照）内に挿入する。発現ベクタ
ー、例えばベクターｐＹａｆＢｏＩＬ−２は複製開始点
およびアンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｒ）を含むプラ
スミドｐＢＲ３２２由来の配列を含む（第３図の太線部
分）。また、発現ベクターは好ましくは酵母由来の配列
、例えば選択マーカーとしてのトリプトファン−１遺伝
子（Ｔｒｐ−１）および２μ酵母の複製開始点を含む（
第３図の細線部分）。理想的には、発現ベクターはさら
に効果的プロモーターとしての酵母α因子（例えば第３
図の点描ボックス部分）、および酵母宿主内でＧＭ−Ｃ
ＳＦを合成／分泌させるリーダー配列を含み、このリー
ダー配列の後にｂＩＬ−２のコーティング領域の配列（
斜線ボックス部分）が続く。α因子遺伝子の構造はカー
ジャン（Ｋｕｒｊａｎ）およびハーコビッッ（Ｈｅｒｓ
ｋｏｗｉｔｚ）のＣｅｌｌ．３０：９３３−９４３（１
９８２）に論じられている。 その後発現プラスミドでサッカロミセス・セレビシェ（
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
の適当な歯株を形質転換する。好適な歯株には酵母菌株
７９、Ｘ２１８１−１Ｂ、ＤＢＹ７４６、ＹＮＮ２８２
、２０Ｂ−１２、ＸＶ２１８１が含まれるが、これらに
限定されない。これらの菌株はすべてα因子プロモータ
ーと適合性であるために、およびＴｒｐ１、Ｌｒｐ＋形
質転換細胞を選択するためにα、Ｔｒｐ１、Ｌｅｕ２を
含む。これらの菌株は広く入手可能であり、例えば菌株
７９は９４７０２カリフォルニア州バークレー、カリフ
ォルニア大学、生物物理学および医療物理学部、酵母遺
伝子貯蔵センター（ＹａａｓｔＧｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏ
ｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ）から入手できる。 ｂＩＬ−２遺伝子を含む組換え体発現プラスミドによる
酵母宿主の形質転換は、よく知られた方法（スフェロプ
ラストを作り、洗浄し、その後プラスミドを取込ませる
）に従って行われる。この方法の標準的手法は確立され
ている。ベッグス（Ｂｅｇｇｓ）のＮａｔｕｒｅ（Ｌｏ
ｎｄｏｎ）．２７５：１０４（１９７８）およびヒンネ
ン（Ｈｉｎｎｅｎ）らのＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），７５：１９２９（１９７８）を
参照されたい。 酵母培養物の上清はＩＬ−２依存性ウシＴ細胞の増殖を
維持するそれらの能力において、酵母上清は比較的高レ
ベルのｂＩＬ−２配列を含まないプラスミドで酵母宿主
を形質転換した。検定の際に、対昭プラスミドから誘導
された上清からは生物活性が全く検出されなかった。 細菌宿主による発現 ｂＩＬ−２遺伝子の実質的に完全なコーディング領域の
ｃＤＮＡフラグメントはまた、ｂＩＬ−２の成熟体を細
菌宿主細胞から合成させるようにデザインされた発現ベ
クター内に挿入される。好ましくは、本質的でないが、
細菌細胞による発現の為に使用するプラスミドはλファ
ージＰＬプロモーターを含む。相応して、理想的には細
菌宿主例えば大腸菌はＰＬ転写の非耐熱性ｃ■リプレッ
サーを含む。さらに、大腸菌を宿主として使用する場合
、好ましくは発現ベクターは高いコピー数のＤＮＡ複製
のために複製開始点（例えばプラスミドｐＢＲ３２２由
来）を、そして形質転換された大腸菌宿主の有利な選択
のためにアンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｒ）（これも
プラスミドｐＢＲ３２２由来）を含む。これらの条件を
満たす発現ベクターの例にはプラスミドｐＰＬ−λ（フ
ァーマシア・ファイン・ケミカルズ社、商品番号２７−
４９４６−０１）およびプラスミドｐＰＬｃ２８（ＡＴ
ＣＣ寄託番号５３０８２）が含まれる。 ｂＩＬ−２の発現レベルを高めるために、ｂＩＬ−２ｃ
ＤＮＡから上流に非常に効果的な合成翻訳開始配列が使
用される。同じ翻訳開始配列がヒトＩＬ−２の発現のた
めに使われた。マーキーズ（Ｍａｒｑｕｉｓ）らのＪ．
Ｃｅｌｌ．Ｓｕｐｐｌｅ−ｍｅｎｔ，９Ｂ：２２１（１
９８５）を参照されたい。 高レベル翻訳開始配列は下記表１に記載の合成オリゴヌ
クレオチドに組込まれる。この合成オリゴヌクレオチド
はソード（Ｓｃｃｄ）らの上記文献およびヒロセ（Ｈｉ
ｒｏｓｅ）らの上記文献に詳述されるトリエステル法、
またはホスホジエステル法により合成される。 表１ 表１に示すように、合成オリゴヌクレオチドは接着Ｘｂ
ａ■−５′末端および開始コドンＡＴＧと成熟ｂＩＬ−
２タンパク質の最初のアミノ酸残基Ａｌａをコードする
配列を含む平滑３′末端を有するように合成される。Ｘ
ｂａ■制限部位とＭｅｔ開始コドンとの間のオリゴヌク
レオチドの中間部分は、翻訳開始配列から成る。オリゴ
ヌクレオチドの５′末端および中間部分は、オリゴヌク
レオチドがｂＩＬ−２遺伝子と共に連結される予定の特
定プラスミドの構成と適応する様々な組成のものであり
うると理解すべきである。 ｂＩＬ−２遺伝子含有発現ベクターによる細菌宿主の形
質転換後、熱誘発の際に、ｂＩＬ−２の高レベル発現が
以下に詳述するｂＩＬ−２依存性細胞検定法により確か
められた。酵母および細菌の両宿主により発現された組
換えＤＮＡ産物の高検定レベルは、第２図に示す本発明
者らにより単離された遺伝子がｂＩＬ−２遺伝子と一致
することを裏付けるものである。 ｒｂＩＬ−２の精製： 酵母および細菌宿主の発現系で産生されたｒｂＩＬ−２
はＨＰＬＣで精製する。本発明において使用するＨＰＬ
Ｃカラムは、好ましくはタンパク質ｒｂＩＬ−２と共に
最適に使用される十分な大きさの細孔径（すなわち約１
５〜２０ミクロンの細孔径）を有する逆相のオクタデシ
ル結合シリカカラムである。 本発明の実施に際して使用するのに適した逆相ＨＰＬＣ
カラムは市販品である。好適なカラムにはメイン州ミル
フォード、ウォーターズ・アソシエート社から市販され
ているカラムのプレパック（ＰｒｅｐＰＡＫ（Ｒ））、
ラジオパック（ｒａｄｉｏ ｐａｋ（Ｒ））およびポラ
シル（Ｐｏｒａｓｉｌ（Ｒ））の系列が含まれる。 好適なカラム充填材料はシリカゲルの表面に、例えばシ
ロキサン（ケイ素−酸素−ケイ素）によって共有結合さ
れた、オクタデシルシラン基を含む。 このタイプの充填材料の例はバイダック（Ｖｙｄａｃ（
Ｒ））Ｃ−４）（カリフォルニア州ヘスペリア、セパレ
ーショングループ）である。 カラムにかける前に、発現抽出物は必要に応じて希釈し
、またカラムは例えばトリフルオル酢酸（ＴＦＡ）、ヘ
プタフルオル酪酸（ＨＦＢＡ）または酢酸から成る適当
な緩衝溶液で平衡化する。 ＨＰＬＣカラムからのタンパク質の溶離は当分野でよく
知られた方法により行われる。カラムから結合タンパク
質を取り出す適当な溶離法には、例えばＴＦＡ、ＨＦＢ
Ａまたは酢酸中のアセトニトリルまたはＮ−プロパノー
ル緩衝液の線状勾配の使用が含まれる。アセトニトリル
を溶離剤として使用する場合、好適な勾配は約０．０５
〜２％ＴＦＡ中０〜１００％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリル
から成り、１分当たり約１〜３％アセトニトリルの割合
でカラムに加えられる。溶離剤がＮ−プロパノール緩衝
液である場合、好適な組成は０．９Ｍ酢酸および０．２
Ｍピリジン（ｐＨ４．０）中約６０％（Ｖ／Ｖ）Ｎ−プ
ロパノールである。この緩衝液溶離剤の好ましい勾配範
囲は０〜１００％、より好ましくは２０〜８０％である
。 溶離されたタンパク質は当分野でよく知られた検出系で
都合よく監視することができる。例えば、スタイン（Ｓ
ｔｅｉｎ）およびモシエラ（Ｍｏｓｃｈｅｒａ）のＭｅ
ｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７８：４３５（１９８１）に
配される自動蛍光検出装置が使用される。また、ＨＰＬ
Ｃカラムから回収された分画の相対的タンパク質度は、
２８０ｎｍの波長で紫外線分光光度計により溶離物質の
吸光度を測定して決定し得る。適当な自動紫外線吸収検
出装置は市販品である。例えばそれらは英国ケンブリッ
ジのＬＫＢインスツルメント社から市販されている。 回収されたＨＰＬＣ分画の生物活性は、以下で説明する
ｂＩＬ−２依存性Ｔ細胞増殖検定により分析される。分
画はまたゲル電気泳動により分析される。 十分なタンパク質精製が最初のＨＰＬＣ法で達成されな
い場合、同じカラムまたは別のカラム（例えば、異なる
組成または形の支持材料もしくは異なる化学組成の結合
相材料を有する充填材料を使用するカラム）の使用によ
り精製を繰り返すことができる。さらに、同一かまたは
異なる種類の溶離剤を使用してもよい。 十分なタンパク質精製が２回目のＨＰＬＣ法で得られな
い場合、均一性が達成されるまで３回またはそれ以上の
ＨＰＬＣ法を使用することができる。本発明者らは、Ｃ
１４結合相およびアセトニトリル溶離を使用する最初の
ＨＰＬＣ処理がｒｂＩＬ−２の実質的精製をもたらすが
、タンパク質産物は均一に精製されていないことを見出
した（第５図参照）。しかしながら、上と同じカラムを
使用するが遊離剤としてＮ−プロパノール／酢酸／ピリ
ジンを使用する２回目のＨＰＬＣ処理の後に、約１６０
００ダルトンの分子量を有する均一なｂＩＬ−２が単一
分画に回収された。 本発明の均一なｒｂＩＬ−２の活性は、上記のＨＰＬＣ
分画化の際に使用した有機緩衝液（ＴＦＡ／アセトニト
リル）または（ピリジン／酢酸／プロパノール）中に４
℃で保存したとき、少なくとも六ヶ月安定であることが
わかった。 アミノ酸分析： ｒｂＩＬ−２の均一性が達成されたために、本発明者ら
はこの組換えタンパク質産物のアミノ酸組成およびＮ−
末端部分のアミノ酸配列を解析することができた。この
情報は、発現産物が天然産物と同じ組成であり且つ発現
産物がｒｂＩＬ−２ｃＤＮＡの分析から推定されたアミ
ノ酸組成及び配列と一致することを確かめるのに有用で
ある。 上記のように調製した本発明の均一ｒｂＩＬ−２のサン
プルは、例えばニンヒドリンまたは気相検出を使用する
自動分析装置により、アミノ酸の組成と配列について分
析することができる。この種の装置は市販品であり、例
えば英国ケンブリッジのＬＫＢ社（４１５０型アルファ
）またはアブライド・バイオシステム社（４７０Ａ型）
から入手できる。これらの分析により、本発明者らは、
ｒｂＩＬ−２のアミノ酸組成がｒｂＩＬ−２ｂＤＮＡか
ら推定される対応配列（すなわち第２０残基がＤＮＡか
ら推定される対応配列（すなわち第２図のアミノ酸残基
番号２１〜４１）と同じであることを見出した。 治療用途： 先に述べたように、本発明に従って産生されたｒｂＩＬ
−２はウシやその他の動物の感染病、例えば乳房炎、呼
吸器および胃腸症候群、ならびに一般的寄生虫感染症を
治療するのに使用される。本発明者らはｒｂＩＬ−２の
比活性が約４．５×１０４単位／μｇ（タンパク質）で
あることを確かめた。 動物の病気を治療するためのｒｂＩＬ−２の好ましい投
与量は１回の用量あたり約１０４〜１０８単位／ｋｇ（
動物の体重）の範囲である。０．１〜１０ｍｇ（理想的
には約５〜６ｍｇ）の用量でのｒｂＩＬ−２治療は、１
２００ポンドの雄牛におけるＴ細胞媒介機能を回復させ
ることが期待される。治療上有効であるためには、ｒｂ
ＩＬ−２を多数回投与することが必要であると思われ、
このことも本発明の範囲に含まれる。 ｒｂＩＬ−２は非経口または径皮を含めた慣用方法で投
与される。非経口投与のために、ゴマ油や落花生油、も
しくは水性プロピレングリコール中のｒｂＩＬ−２の溶
液剤が使用され、同様に蒸留水、血清アルブミン、リン
ゲル液、ハンク液などの無菌、無毒性、非アレルギー溶
液剤も使用できる。この種の溶液剤は必要に応じて適当
に緩衝液化され、その液体希釈剤は初めに十分な塩類ま
たはグルコースで等張化される。これらの特定の水性溶
液剤は静脈内、筋肉内または皮下注射に特に適している
。これらの種々の無菌水性媒体はすべて当分野でよく知
られた標準的手法により容易に調製することができる。 ｂＩＬ−２活性の検定 先に示したように、酵母及び細菌の発現系からの発現産
物はＩＬ−２依存性ウシＴ細胞により検定される。この
種の検定法に関する細部はベーカー（Ｂａｋｅｒ）およ
び（Ｋｎｏｂｌｏｃｋ）のＶｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｐａｔｈ，３：３８１（１９８２）；ミラー
エッジ（Ｍｉｌｌｅｒ−Ｅｄｇｅ）およびスプリッター
（Ｓｐｌｉｔｔｅｒ）のＶｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍ
ｍｕｎｏ−ｐａｔｈ、７：１１９（１９８４）；ネーマ
ー（Ｎａｍｅｒ）およびマグナソン（Ｍａｇｎｕｓｏｎ
）のＩｍｍｕｎｏｌ．，５２：４６９（１９８４）；オ
ールドハン（Ｏｌｄｈａｍ）およびウイリアムズ（Ｗｉ
ｌｌｉａｍｓ）のＶｅｔ．Ｉｍｍｕ−ｎｏｌ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｐａｔｈ、１：２０１（１９８４）に記載されてい
る。要約すると、この検定法では、ＩＬ−２依存性細胞
を培養物から収穫し、洗浄して増殖培地を除き、８×１
０４細胞／ｍｌの濃度で完全ＲＰＭＩ−１６４０培地中
に再懸濁する。この細胞懸濁液（１００μｌ）を９６−
ウエルの微量滴定皿（商品番号３５９６、カスター）の
個々のウエル（くぼみ）に採置し、その後サンプルの連
続（ｌｏｇ２）希釈液または１単位／ｍｌサルＩＬ−２
標品（１００μｌ）を加える。微量滴定皿は空気中５％
のＣＯ２の湿潤雰囲気中３７℃で４８時間インキュベー
トし、その後自動サンプル採取装置で収穫する。（〔３
Ｈ〕−Ｔｄｒ）（比活性１．９ｃｉ／ｍＭ）を含む培地
５０μｌを加える。その滴定皿をさらに４時間インキュ
ベートし、その後自動サンプル採取装置で収穫する。〔
３Ｈ〕−Ｔｄｒ−標識ウエル内容物を含むガラス繊維フ
ィルター試験片を自然乾燥させ、トルエンをベースとす
る混合物（ｔｏｌｕｅｎｅ−ｂａｓｅ ｃｏｃｋｔａｉ
ｌ；マサチューセッツ州ボストン、ニューイングランド
ヌクレアー社、商品番号ＮＥＦ−９０３）の中に入れ、
液体シンチレーションカウンターで０．５分間計数する
。 ｂＩＬ−２の存在下では、標的ＩＬ−２依存性細胞は用
量に依存して〔３Ｈ〕−Ｔｄｒを取り込む。 ｂＩＬ−２の不在下では、標的ＩＬ−２依存性細胞は２
４時間以内に死滅し、基底レベルの〔３Ｈ〕−Ｔｄｒを
取り込むにすぎない。ｂＩＬ−２活性（単位／ｍｌ）は
、特定サンプルが標的細胞株の最大増殖の半分を生じさ
せる希釈度を測定することにより定量化される。例えば
、特定のｂＩＬ−２検定（全量２００μｌ）において１
：１０の希釈度でサンプルが半−最大標的細胞株増殖を
生じる場合、１単位は１０で割った２００μｌ（全量）
、すなわち２０μｌ中に含まれると言われる。そのとき
、サンプルは２０（１単位のμｌ数）で割った１０００
（１ｍｌのμｌ数）の力価、すなわち５０単位／ｍｌの
力価を有するであろう。 先に述べたように、酵母培養物からの組換えｂＩＬ−２
は１．３×１０６単位／ｍｌのｂＩＬ−２活性を示した
。また、細菌発現系から回収された発現産物は１０．２
×１０６単位／ｍｌ以上のｂＩＬ−２活性を示した。こ
うして、本発者らにより検定された第２図に記載の遺伝
子が実際にｂＩＬ−２遺伝子であると確認できた。 ｍＲＮＡの分析： ウシリンパ腺細胞からのｂＩＬ−２ｍＲＮＡの発現を分
析した。ＣｏＡ−刺激および非刺激ウシリンパ腺由来の
ＲＮＡのノザンプロットは、第２図に示すｂＩＬ−２２
ｃＤＮＡから誘導されたＲＮＡプローブを用いるハイブ
リダイゼーションにより分析した。プローブはＣｏｎＡ
の単一バンドと強くバイブリダイズしたが、非刺激リン
パ腺細胞に由来するＲＮＡの場合は、ハイブリダイゼー
ションが起こらなかった。 ウシゲノム配列の分析： ウシゲノムＤＮＡ中のＩＬ−２関連遺伝子の数は、３２
Ｐ−標識ｂＩＬ−２プローブとウシゲノムＤＮＡフラグ
メントのサザンブロックをハイブリダイズさせることに
より調べた。フラグメントはＤＮＡを比較的低い頻度で
切断することが期待される多数の異なる制限酵素でウシ
ゲノムＤＮＡを消化することにより調製した。ゲノムＤ
ＮＡのサザンプロットに対するＩＬ−２ｃＤＮＡプロー
ブによるハイブリダイゼーションのオートラジオグラフ
ィーは、ｂＩＬ−２遺伝子が単一コピーとして存在する
ことを示した。 本発明方法および産生物はさらに次の実施例により示さ
れる。実施例は単に代表的例にすぎず、それらは本発明
を例示し且つ当業者が本発明を利用するのを手伝けする
ものである。実施例は特許証により許可される保護に関
する特許請求の範囲を何ら制限するものではない。 実施例１ ポリＡ＋ｍＲＮＡの調製 約１×１０６細胞／ｍｌの濃度のウシ末梢血液白血球を
１０％（Ｖ／Ｖ）の２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍｌ
ペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよ
び２．５μｇ／ｍｌＣｏｎＡを補足したＲＰＭＩ−１６
４０培地５０ｍｌ中で培養した。細胞は空気中５％ＣＯ
２の湿潤雰囲気において約１６時間培養した。その後、
生細胞を遠心により収穫した。 全ＲＮＡは一般にチャーウィンらの上記文献に記載され
る方法を用いて、単細胞から抽出した。 この方法では、グアニジニウムチオシアネートを使用す
ることにより、ＲＮアーゼを含む細胞タンパク質を、Ｒ
ＮアーゼによるＲＮＡ加水分解の速度を超える速度で変
性した。ｍＲＮＡはエタノール沈殿により細胞タンパク
質から分離し、続いて８Ｍ塩酸グアニジン、２５ｍＭ酢
酸ナトリウムで再懸濁（抽出）した。次に、塩酸グアニ
ジン抽出ＲＮＡを等容量のフェノール／クロロホルム：
イソアミルアルコール（２５容量／２４容量：１容量）
で再抽出した。このような抽出操作から得られたＲＮＡ
含有水相は５０ｍＭ酢酸ナトリウムとなし、０．６容量
のエタノールの添加により沈殿させた。ＲＮＡは−２０
℃に冷却して遠心することにより回収した。 その後、マニアチスらの上記文献（１９７）に記載の方
法を使って、オリゴ（ｄＴ）−セルロースクロマトグラ
フィーカラムによりポリＡ＋ｍＲＮＡを抽出タンパク質
から分離した。簡単に述べれば、カラムは２０ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、０．５Ｍ ＮａＣｌ．１ｍ
Ｍエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）および０．１％
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）から成る緩衝液で調
製した。タンパク質沈殿物を水とこの緩衝液に溶解して
カラムにかけた。非吸着物質は同じ緩衝液での初期洗浄
、続いて０．１ＭＭａＣｌを含む同じ緩衝液での追加洗
浄により溶離した。保持されたポリＡ＋ｍＲＮＡは１０
ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭＥＤＴＡお
よび０．０５％ＳＤＳから成る低下したイオン強度の緩
衝液で溶離した。溶離したポリＡ＋ｍＲＮＡ１／１０容
量の酢酸ナトリウム（３Ｍ、ｐＨ５．２）および２．２
容量のエタノールを用いて−２０℃で沈殿させた。 オリゴ（ｄＴ）−セルロースカラムからのポリＡ＋ｍＲ
ＮＡの溶離後、ポリＡ＋ｍＲＮＡの完全性はマニアチス
らの上記文献（１９９）に詳述されたアガロースゲルに
よる電気泳動により確かめた。 実施例２ ｃＤＮＡライブラリーの作成 ｍＲＮＡに対応する二本鎖ｃＤＮＡのライブラリーは、
カプラーおよびホッフマンの上記文献により修正された
マニアチスらの上記文献（２２９）記載の標準方法を用
いることにより、実施例１で得られた精製ｍＲＮＡから
作成した。オリゴ−ｄＴはｍＲＮＡのポリＡ尾部とハイ
ブリダイズして、第一のｃＤＮＡ鎖の逆転写のためのプ
ライマーとして役立った。トリ骨髄芽球症ウイルス（Ａ
ＭＶ）の逆転写酵素は、ｍＲＮＡを鋳型として使用して
第一のｃＤＮＡ鎖を合成した。簡単に述べれば、第一の
ｃＤＮＡ鎖の合成は５０ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ８．
３）、１０ｍＭＭｇＣｌ２、１０ｍＭジチオトレイトー
ル（ＤＴＴ）、４ｍＭピロリン酸Ｎａ、１．２５ｍＭｄ
ＧＴＰ、１．２５ｍＭｄＡＴＰ、１．２５ｍＭｄＴＴＰ
、０．５ｍＭｄＣＴＰ、１５〜２０μＣｉの〔α−３２
ｐ〕ｄＣＴＰ（３．０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、１００μ
ｇ／ｍｌのオリゴ（ｄＴ１２−１８）、１５０μｇ／ｍ
ｌｍＲＮＡ（実施例１より）、３．０００単位のＡＭＶ
逆転写酵素／ｍｌを含有する２０〜４０μｌの反応容量
中で実施した。４３℃で３０分間反応させた後、ＥＤＴ
Ａを添加して２０ｍＭとすることにより反応を停止した
。反応生成物をフェノールで抽出し、岡山およびベルグ
のＭｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２：１６１−１７０
（１９８２）に記載されるように３Ｍ酢酸アンモニウム
を加えてエタノール沈殿させた。第二のｃＤＮＡ鎖は１
００μｌの２０ｍＭトリス・ｈＣｌ（ｐＨ７．５）、５
ｍＭＭｇＣｌ２、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１００
ｍＭＫＣｌ、０．１５ｍＭβ−ＮＡＤ、５０μｇ／ｍｌ
ＢＳＡ、４０μＭＤＮＴＰ、８．５単位／ｍｌの大腸菌
ＲＮアーゼＨ２３０単位／ｍｌＤＮＡポリメラーゼ■、
１０単位／ｍｌ大腸菌ＤＮＡリカーゼを含有する反応混
合物中で合成した。この混合物を１２℃で１時間反応さ
せた。次いでＥＤＴＡを加えて２０ｍＭとすることによ
り反応を停止した。得られた二本鎖ｃＤＮＡは上記のよ
うにフェノールで抽出した。 二本鎖ｃＤＮＡはセファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）
Ｓ−４００（ファーマシア・ファイン・ケミカルズ社）
カラムコロマトグラフィーで分子の大きさにより分画化
し、分子量マーカーとしてｐＢＲ３２２ＤＮＡの末端標
識フラグメントを用いるアルカリ性アガロース電気泳動
により測定した。５００ｂｐ以下の長さのＤＮＡ鎖をえ
り除いて、これらの短いｃＤＮＡ分画を無意味にクロー
ニングするのを避けた。 二本鎖ｃＤＮＡ分画は、マニアチスらの上記文献（２３
９から始まる）に記載の方法により、ｐＢＲ３２２プラ
スミド（ファーマシア・ファイン・ケミカル社）のＰｓ
ｔ■部位に挿入した。この方法では、二本鎖ｃＤＮＡの
３′末端にポリ（ｄｃ）の尾部を付加した。プラスミド
ｐＢＲ３２２はＰｓｔ■エンドヌクレアーゼで消化した
後、その３′末端にポリ（ｄＧ）の尾部を付加した。ｄ
Ｇ付加プラスミドＤＮＡとｄＣ付加ｃＤＮＡとはアーニ
リング緩衝液（０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス−
ｈＣｌ（ｐＨ７．８）および１０ｍＭＥＤＴＡ）を用い
てアニーリングレ、新規な組換えプラスミドを形成した
。 本明細書に記載の全ての制限酵素はマサチューセッッ州
ビバリーのニュー・イングランド・バイオラブズ社から
市販されている。 ハナハンの上記文献の方法を使用することにより、大腸
菌株ＭＭ２９４を組換えプラスミドで形質転換した（こ
の場合大腸菌細胞は高濃度のＭｇ２＋の存在下での増殖
により得られた）。形質転換宿主を平板培養し、その後
表現型同定剤としてテトラサイクリンを用いて形質転換
細胞を同定した。 この技法の使用により本発明者らは約３５，０００個の
独立した形質転換細胞を得た。 実施例３ ヒトＩＬ−２ｃＤＮＡスクリーニングプローブを使って
オリゴ（ｄＴ）−セルロースクロマトグラフィーカラム
により全ＲＮＡからポリＡ＋ｍＲＮＡを分離した。 ジャーカット細胞株はＡＴＣＣ（寄託番号ＡＴＣＣ−Ｃ
ＲＬ−８１６３）から入手できる。得られたポリＡ＋ｍ
ＲＮＡの完全性はアガロースゲル電気泳動により確かめ
られた。ヒトｍＲＮＡに対応する二本鎖ｃＤＮＡのライ
ブラリーは実施例２に記載の方法により作成した。５０
０ｂｐより大きい得られた二本鎖ｃＤＮＡ分画を、実施
例２に記載のホモポリマー付加法によりｐＢＲ３２２プ
ラスミドのＰｓｔ■部位に挿入した。この組換えプラス
ミドで大腸菌株ＭＭ２９４を形質転換し、形質転換細胞
は表現型同定剤としてテトラサイクリンを用いて同定し
た。この方法によって、本発明者らは約１×１０６個の
独立した形質転換細胞を同定した。 合成オリゴヌクレオチドプローブはソードらの上記文献
およびヒロセらの上記文献に詳述される標準トリエステ
ル法により化学的に合成し、その後ネズミｃＤＮＡライ
ブラリーをスクリーニングするのに使用するために３２
Ｐで標識した。このプローブは次のヌクレオチド配列： ５′−ＡＡＴＧＴ ＡＧＡ ＣＡＴ ＣＣＴ ＧＧＴＧ
ＡＧ−３′を有し、これは第１図のヌクレオチド１７３
〜１９２に対応する。標識を促進するために、オリゴヌ
クレオチドの５′末端はＯＨ末端となるように合成し、
それによりＤＮＡフラグメントを標識する際に一般に使
用しなければならないホスファターゼ処理を省いた。標
識方法は１６μｌの３２ＰＡＴＰ（７０００Ｃｉ／ｍＭ
）、１μｌ（１０Ｕ）のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ
および２μｌの１０ｘキナーゼ緩衝液■（０．５Ｍトリ
ス・ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、０．１ｍＭＭｇＣｌ２、５
０ｍＭジチオトレイトール、１ｍＭスペルミジンおよび
１ｍＭＥＤＴＡ）に合成オリゴヌクレオチド１μｌを加
えることを包含していた。３７℃で３０分間反応させた
後、合成ヌクレオチドをフェノール／クロロホルムで抽
出した。標識プローブはセフアデックスＧ−５０カラム
（ファーマシア・ファイン・ケミカルズ社）によるクロ
マトグラフィーまたは遠心を用いて非標識オリゴヌクレ
オチドから分離した。 ヒトｃＤＮＡライブラリーの初期スクリーニングを容易
にするために、形質転換した細菌培養物をプール（各プ
ールは約５，０００個の異なるクローンを含む）に分け
た。プラスミドＤＮＡはイシューホロビッッ（Ｉｓｈ−
Ｈｏｒｏｗｉｃｚ）およびバーク（Ｂｕｒｋｅ）のＮｕ
ｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，９：２９８９（１９８１
）に詳述される標準的なアルカリ溶菌法を従って宿主細
菌のサンプルから単離した。単離したプラスミドは標準
方法によりＰｖｕ■およびＨｉｎｄ■で完全消化した。 次にプラスミド消化物を０．８％アガロースゲルによる
電気泳動で分画化し、サザンらの上記文献の標準方法に
よりニトロセルロースフィルター上にのせた。ニトロセ
ルロースフィルターに固定したＤＮＡは、以下の実施例
４で詳述する方法を使って、標識合成オリゴヌクレオチ
ドプローブとハイブリダイズさせた。 ＤＮＡのハイブリッド形成バンドが得られたクローンの
推定上のプールは、放射性標識合成プローブでの直接コ
ロニーハイブリダイゼーションによりスクリーニングし
て、単一の陽性コロニーを同定した。 プラスミドＤＮＡは上記の方法により同定した陽性コロ
ニーから調製して、以下の実施例５に記載するように塩
基配列を決定した。単離したヒトプラスミドＤＮＡフラ
グメントのヌクレオチド配列（第１図に示す）は、実質
的にヒトＩＬ−２遺伝子のオープン・リーディング・フ
レームの完全なヌクレオチド配列を含むことが見出され
た。 第１図で下線を施したヒトＩＬ−２ｃＤＮＡクローンの
７０８ｂｐフラグメント（ヌクレオチド番号１２〜ヌク
レオチド番号７１９）が、上記の実施例２で調製したヒ
トプラスミドＤＮＡをスクリーニングするためのプロー
ブとして選ばれた。 このプローブフラグメントは制限酵素Ｐｓｔ■およびＲ
ｓａ■での消化、その後のアガロースゲル電気泳動によ
りヒトｃＤＮＡクローンから単離した。 ｃＤＮＡヌクレオチドプローブはマニアチスらの上記文
献（１０８）に記載の先に論じた標準方法によりニック
トランスレーションで放射性標識した。この方法によれ
ば、プローブは約５×１０８ＣＰＭ／μｇＤＮＡの比活
性に標識された。スクリーニング法で使用する前に、標
識プローブは水中１００℃で１０分間沸騰させその後氷
上で冷やすことにより変性した。 実施例４ ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング上記の実施例２
で作成したｃＤＮＡライブラリーの初期スクリーニング
を容易にするために、形質転換した細菌培養物をプール
（各プールは約２５００個の異なるクローンを含む）に
分けた。 イシューホロビッッおよびパークの上記文献に詳述され
る標準アルカリ溶菌法を用いて宿主細菌のサンプルから
プラスミドＤＮＡを単離した。単離したプラスミドをＰ
ｓｔ■で切断し、次いで適当な大きさのマーカーと共に
１．０％アガロースゲル電気泳動で処理して分画化した
。そのアガロースゲルをサザンらの上記文献記載の方法
によりニトロセルロースフィルター上にのせた。移行処
理後、フィルターを自然乾燥させ、真空下約８０℃で２
時間ベーキングすることによりＤＮＡフラグメントをニ
トロセルロースに固定した。 固定したＤＮＡは次に標識ｃＤＮＡプローブとハイブリ
ダイズさせた。要約すると、ベーキングしたヒトロセル
ロースを、６×ＳＳＣ、０．５％ＮＰ４０界面活性剤、
０．１％サルコシル、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ′ｓ溶液（
０．０２％フイコール、０．０２％ポリビニルピロリド
ン、０．０２％ＢＳＡ）および１００μｇ／ｍｌ変性サ
ケ精子ＤＮＡ（シグマ■型、ナトリウム塩）から成るプ
レハイブリダイゼーション緩衝液中５５℃で２〜４時間
インキュベートした。次にフィルターは上記のようなハ
イブリダイゼーション溶液中３２Ｐ−標識ｃＤＮＡプロ
ーブ（１０６ｃｐｍ／ｍｌ）（実施例３より）と共に５
５℃で一晩インキュベートした。一晩ハイブリダイゼー
ションを行った後、フィルターは６×ＳＳＣを用いて温
室で洗浄し、次いで４２℃で１時間さらに５５℃で１．
５時間６×ＳＳＣにて洗浄した。自然乾燥後、フィルタ
ーを−７０℃でオートラジオフラフィーに付した。 オートラジオグラフィーから本発明者らは強いハイブリ
ッド形成バンドを生じたプラスミドＤＮＡが得られたク
ローンの推定上の１つのプールを、約５００個の形質転
換細胞のプールにさらに分割し、ハイブリダイゼーショ
ンスクリーニング法を繰り返した。ＤＮＡの強いハイブ
リッド形成バンドが見られた推定上のサブプールはその
後平板培養した。得られたクローンは上記のハイブリッ
ド形成条件を用いて、グルンタインおよびホグネスの上
記文献記載の公知方法により、放射性標識したヌクレオ
チドプローブで検索した。 実施例５ スクリーニングしたｃＤＮＡの同定 ｂＩＬ−２−４と命名したプラスミドは実施例４に記載
の方法により同定した陽性コロニーからのｃＤＮＡを用
いて作成した。大腸菌を形質転換した宿主プラスミドの
サンプルは寄託番号５３１８４としてＡＴＣＣに寄託さ
れた。陽性宿主コロニーから単離したプラスミドＤＮＡ
由来のｃＤＮＡ挿入物は、以下で説明する変更を伴うア
マーシャムハンドブックに本質的に記載されるような標
準チエインターミネーション法により塩基配列を決定し
た。そのｃＤＮＡ挿入物をＰｓｔ■および／またはＲｓ
ａ■で消化し、その後Ｍ１３一本鎖線維状ファージベク
ターのｍｐ１８およびｍｐ１９（イリノイ州アーリント
ンハイツ、アマーシャム社）内にサブクローニングした
。ノランダーらの上記文献に記載されるｍｐ１８および
ｍｐ１９ファージベクターは次の特異なクローニング部
位：すなわちＨｉｎｄ■；Ｓｐｈ■；Ｐｓｔ■；Ｓａｌ
■；Ａｃｃ■；Ｈｉｎｃ■；Ｘｐｈ■；ＢａｍＨ■；Ｘ
ｍａ■；Ｓｍａ■；Ｋｐｎ■；Ｓｓｔ■；およびＥｃｏ
Ｒ■を含む。ｍｐ１８およびｍｐ１９ベクターの組成は
同じであるが、上記の制限部位の順序がｍｐ１９ベクタ
ー内では逆になっており、こうしてｃＤＮＡ挿入物の両
鎖はこれらの２つのベクターを用いることにより有利に
塩基配列が決定できる。対応するｃＤＮＡ鎖を挿入した
ｍｐ１８およびｍｐ１９ベクターを使ってＫ１２株の大
腸菌ＪＭ１０７（メリーランド州ベテスタ、ベテスタ・
リサーチ研究所）を形質転換し、それによりセンス鎖と
アンチセンス鎖の一本の鎖挿入物を含む一本鎖ＤＮＡ鋳
型を得た。 その一本鎖ＤＮＡ鋳型に一般的な合成プライマ−：５′
−ＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＧＧＴＴ−３′（ウイスコン
シン州ミルウォーキー、Ｐ−Ｌバイオケミカルズ社）を
アーニングして、上記のようにＤＮＡ合成を開始させた
。その後、伸長フラグメントをゲル電気泳動で大きさに
より分離し、オートラジオグラフィーを行い、それより
フラグメントのヌクレオチド配列を推論した。 ジデオキシ塩基配列決定反応において、放射性標識とし
てデオキシアデノシン５′（α−〔３５Ｓ〕チオ）トリ
ホスフェート（以後ｄＡＴＰ〔α−３５Ｓ〕と略す）を
用いた。また、アマーシャムハンドブックの３６頁に記
載のゲルを使用せずに、６％ポリアクリルアミドゲル（
７Ｍ尿素、１０８ｍＭトリス・ホウ酸〔ｐＨ８．１〕お
よび２ｍＭＥＤＴＡを含む厚さ０．４ｍｍの６％ポリア
クリルアミドゲル）を使用した。 上述のように、ｂＩＬ−２−４ｃＤＮＡのヌクレオチド
配列は第２図に示される。ｂＩＬ−２遺伝子のコーティ
ング領域はヌクレオチド番号１８（Ｍｅｔ残基）からヌ
クレオチド番号４８２（Ｔｈｒ残基）まで伸びており、
成熟タンパク質はヌクレオチド番号７８に対応するアミ
ノ残基（Ａｌａ）から始まる。ヌクレオチド配列から決
定された対応するアミノ酸をコドンの下に記載する。 実施例６ 成熟ｂＩＬ−２−４ｃＤＮＡクローンからｂＩＬ−２遺
伝子のコーティング領域と３′側面領域の一部を分離し
、リンキングオリゴヌクレオチドを用いてプラスミドｐ
α３内に挿入して組換え発現プラスミド（ｐＹαｆＢｏ
ＩＬ−２と命名）を作成し、それにより酵母宿主細胞内
でｂＩＬ−２を高レベルに発現させた。出発プラスミド
ｐα３は寄託番号５３２２０としてＡＴＣＣに寄託され
ている。第３図に示すように、ｐα３はプラスミドｐＢ
Ｒ３３２に由来する複製開始点とＡｍｐｒ耐性遺伝子を
含む（太線部分）。ｐＹαｆＧＭ−２プラスミドはまた
２μサークルの複製開始点および形質転換酵母宿主（Ｔ
ｒｐ−栄養要求株）選択用のＴｒｐ■遺伝子を含む（第
３図の細線部分）。出発プラスミドはさらにｂＩＬ−２
の高レベル転写および分泌を支配する酵母α因子プロモ
ーターおよびリーダー配列および開始コドンＡＴＧを含
む（第３図の点描ボックス部分）。ｂＩＬ−２配列（第
３図の斜線ボックス部分）は以下でさらに詳しく論じる
ように合成オリゴヌクレオチドの使用によりα因子配列
の下流（３′）末端に融合される。 ｐα３プラスミドはまた第３図に示すように接着Ｋｐｎ
Ｉ５′および３′末端を有するリンキングオリゴヌクレ
オチド（中空ボックス部分）、および目的にｃＤＮＡク
ローニングフラグメントへ都合よく連結するための種々
の制限酵素切断部位（Ｐｓｔ■、Ａｖｒ■およびＮｃｏ
■部位を含む）を含む。ｐＹαｆＢｏＩＬ−２プラスミ
ドを作るために、まず初めにｐα３プラスミドを、例え
ばマニアチスらの上記文献に記載されるような標準方法
により制限酵素Ｋｐｎ■およびＮｃｏ■で消化した。生
成した大きい方のフラグメントは、マニアチスらの上記
文献（１９９）に詳述される方法を使ってアガロースゲ
ルによる電気泳動で単離した。この消化方法によって、
第３図に示すリンキングオリゴヌクレオチドの複数のク
ローニング部位の大部分がその大きい方のフラグメント
から除かれる。 マニアチスらの上記文献に記載されるような標準方法を
用いて、ＩＬ−２遺伝子のコーディング領域と３′側面
領域の一部、すなわちＨｇｉＡ■（ヌクレオチド番号７
７）からＳｓｐ■と Ｓｓｐ■制限酵素の使用によりｂＩＬ−２−４クローン
から分離した。生成した小さい方のフラグメントをＴ４
ＤＮＡポリメラーゼで処理して、５′ＨｇｉＡ■末端の
３′突出部分を除去した。Ｎｃｏ■リンカーを単離した
ｃＤＮＡの３′末端に付加して、ｐα３ベクターのＮｃ
ｏ■部位内にｃＤＮＡフラグメントを連結できるように
した。組成：ＧＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＣのＮｃｏ■リン
カーは、例えばマニアチスらの上記文献に記載されるよ
うな標準方法により、ｃＤＮＡの３′末端に付加した。 その後、ｎｃｏ■リンカーをＮｃｏ■制限酵素で消化し
て接着３′末端を生成させた。この４５５塩基対（ｂｐ
）のＨｇｉＡ■−Ｎｃｏ■ｂＩＬ−２フラグメントはア
ガロースゲルによる電気泳動にかけて精製した。 次に、上記のｂＩＬ−２ｃＤＮＡフラグメントの５′末
端をｐα３クローニングベクターに連結するために、リ
ンキングオリゴヌクレオチドを作成した。このオリゴヌ
クレオチドの組成は、下の表２および第３図に示すよう
に、Ｋｐｎ■接着５′末端（その後にα因子プロセッシ
ング領域のＡＡＡ−ＡＧＡが続く）を含む。Ａｌａをコ
ードするコドンＧＣＡはα因子フロッシング部位の３′
側に位置し、成熟ｂＩＬ−２遺伝子の第一コドンとして
役立つ。この第一コドンはＨｇｉＡ■での消化、その後
に続くその３′突出部分の除去によりｂＩＬ−２ｃＤＮ
Ａから失われた。 表２ ｐＹαｆＢｏＩＬ−２プラスミドを作るために、Ｋｐｎ
■−Ｎｃｏ■消化ｐα３プラスミド、Ｋｐｎ■−平滑末
端−Ｎｃｏ■ｂＩＬ−２−４ｃＤＮＡフラグメントを用
いて三通りの連結が行われる。 その他の標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて同一の発現
ベクターを作成することができ、また上記の作成方法は
ｂＩＬ−２ｃＤＮＡフラグメントを調節してｐＹα５Ｂ
ｏＩＬ−２ベクター内に挿入するために使用しうる多様
な方法のうちの非制限的な１つの例であることを理解す
べきである。さらに、ｂＩＬ−２−４ｃＤＮＡフラグメ
ントは酵母宿主内でのｂＩＬ−２の高レベル発現用のそ
の他の適切なベクターに挿入することができるだろう。 ｐＹαｆＢｏＩＬ−２発現プラスミドを用いて、標準方
法により、Ｔｒｐ＋形質転換細胞選択用のＳ．セレビシ
ェ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母菌株７９（α．Ｔ
ｒｐ１−１．Ｌｅｕ２−１）を形質転換した。形質転換
に先立って、菌株７９は２×１０７細胞／ｍｌの密度に
なるまでＹＥＰＤ培地〔１％（ｗ／ｖ〕酵母エキス、２
％（ｗ／ｖ）ヘプトン、２％（ｗ／ｖ）グルコース〕中
で増殖させた。細胞を２２℃、１０００×ｇで５分間遠
心して収穫し、得られた沈殿物を減菌蒸留水で洗浄した
。 次いで、酵母細胞は１／１０容量のＳＥＤ（１Ｍソルビ
トール、２５ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、および５０
ｍＭジチオトレイトール）に再懸濁して、３０℃で１０
分インキュベートした。細胞−緩衝液混合物を３００ｘ
ｇで５分間遠心した。沈殿物を１／１０容量の１Ｍソル
ビトールで１回洗い、細胞を１／１０容量のＳＣＥ（１
Ｍソルビトール、０．１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ５
．８）、０．０１ＭＥＤＴＡ）に再懸濁した。細胞壁を
破壊する１０−３容量のグルスラーゼをこの溶液に加え
、その後時折穏やかに撹拌しながら３０℃で３０分イン
キュベートした。スフェロプラストの存在は１０μｌの
酵母細胞を顕微鏡用スライドガラス上の５％（ｗ／ｖ）
ＳＤＳ１滴中に希釈して、４００倍の位相差顕微鏡で“
ゴースト”について観察することにより検定した。その
後、細胞混合物を３００ｘｇで３分間遠心した。得られ
た沈殿物を１／１０容量の１Ｍソルビトールで２回洗浄
し、次にＣａＳ（１Ｍソルビトール、１０ｍＭＣａＣｌ
２）中で１回洗浄した。 その後、酵母スフェロプラスミドはベッグズの上記文献
から適応させた方法を用いて、先に作成した発現ベクタ
ーで形質転換した。スフェロプラスト沈殿物を１／２０
０容量のＣａＳに懸濁し、１００μｌのアルコートに分
けて１．５ｍｌのエッペンドルフ試験管に加えた。次い
で、１〜１０μｌのプラスミドＤＮＡを各アリコート（
０．５〜５μｇ）に加えた。この混合物を室温で１５分
インキュベートし、その後各アリコートに１ｍｌのＰＥ
Ｇ（２０％ＰＥＧ４０００、１０ｍＭＣａＣｌ２、１０
ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４））を加えてＤＮＡの
取込みを促進させた。室温で１５分後、混合物を３５０
ｘｇで５分間遠心した。得られた沈殿物は１５０μｌの
ＳＯＳ（１０ｍｌの２Ｍソルビトール、６．７ｍｌのＹ
ＥＰＤ培地、０．１３ｍｌの１ＭＣａＣｌ２、２７μｌ
の１％トリプトファン、および３、７ｍｌの水）に再懸
濁した。この混合物を平板に植えつける前に、選択平板
を３７℃でプレインキュベートした。その後、１８．２
ｍｌのソルビトール、２ｇ寒天、０．６ｇジフコ（Ｄｉ
ｆｃｏ）酵母窒素塩基（アミノ酸不含）、２ｇグルコー
ス、０．１ｍｌの１％アデニン、０．４ｍｌの１％ウラ
シルおよび必要に応じてアミノ酸類を含む溶融した表面
寒天（４５℃）３ｍｌを形質転換細胞の各アリコートに
加え、その試験管内容物を選択培地上に注いだ。この平
板を３０℃で２〜４日間インキュベートした。Ｔｒｐマ
イナス培地に発生したコロニーはＴｒｐ１遺伝子をもつ
プラスミドを含んでおり、すなわちそれらは形質転換さ
れたものであった。 バイオアッセイに先立って、形質転換細胞は２０〜５０
ｍｌのＹＥＰＤ中３０℃で定常期になるまで増殖させた
。細胞収穫時に、プロテアーゼ阻害剤のフッ化フェニル
メチルスルホニル（ＰＭＳＦ）およびペプスタチンＡを
それぞれ１ｍＭと１０μＭの最終濃度で加えた。その後
、細胞を４００ｘｇで遠心して除き、培地は０．４５ミ
クロンのセルロースアセテートフィルター（ニューヨー
ク州コーニングのコーニング・グラス・ワークス社）に
通してろ過した。無菌上清は４℃で保存した。標的ＩＬ
−２依存性ウシ細胞を用いて検定したとき、得られた上
清は約１．３×１０６単位／ｍｌのｂＩＬ−２活性を示
した。 実施例７ ｂＩＬ−２の細菌宿主による発現 第２図に示すＨｇｉＡｌ（ヌクレオチド番号７７）から
ｂＩＬ−２遺伝子の３′側面領域中のＰｓｔ■制限部位
（ヌクレオチド番号５３３）まで伸びるｂＩＬ−２遺伝
子のコーティング領域を発現ベクターに挿入して、大腸
菌によりｂＩＬ−２を発現させた。ｐＬｎｂｏｖＩＬ−
２と命名したこの発現ベクター（第４図に示す）はプラ
スミドｐＰＬ−λ（ニュージャージー州ピスタウェー、
ファーマシア・ファインケミカルズ社、商品番号２７−
４９４６−０１）から作成された。プラスミドｐＰＬ−
λのゲノムはファージＰＬプロモーターとＮ遺伝子を含
有する。第４図に示すように、ｐＰＬ−λプラスミドは
大腸菌内での高いコピー数のＤＮＡ複製のための複製開
始点（ｐＢＲ３２２由来）、および形質転換した大腸菌
宿主を選択するためのアンピシリン耐性遺伝子（これも
プラスミドｐＢＲ３２２に由来する）を含む。ｐＬＮｂ
ｏｖＩＬ−２プラスミドは寄託番号５３２０２としてＡ
ＴＣＣに寄託された。 ｐＬＮｂｏｖＩＬ−２プラスミドは２つの工程で作成さ
れた。第４図に示すように、第一工程はｐＰＬ−λプラ
スミド（制限酵素Ｈｐａ■で消化）、合成オリゴヌクレ
オチドＡ、および挿入物ＤＮＡフラグメント（ヒトＩＬ
−２ｃＤＮＡ遺伝子の一部を含む）を含んでいた。 ヒトＩＬ−２遺伝子をコードするｃＤＮＡは、実施例３
で記載したように、制限酵素Ｐｓｔ■およびＲｓａ■で
消化することによりヒトｃＤＮＡクローンから単離した
。次いで、このＤＮＡフラグメントを、制限酵素Ｓｍａ
■およびＰｓｔ■で消化しておいたクローニングベクタ
ーｐＵＣ−８（ファーマシア・ファイン・ケミカルズ社
、商品番号２７−４９１６−０１）内に連結した。得ら
れたプラスミドをＨｇｉＡ■とＨｉｎｄ■で消化すると
、第１図のヌクレオチド番号６６のＨｉｇｉＡ■部位か
らｐＵＣ−８中のＨｉｎｄ■部位（Ｐｓｔ■部位を４ヌ
クレオチド越える）まで伸びるヒトＩＬ−２ｃＤＮＡ遺
伝子の部分を含むＤＮＡフラグメントを単離することが
できた。その後の連結に先立って、ＩＬ−２遺伝子の３
′末端の５′突出部分を逆転酵素を使って修復した。 Ｈｐａ■で切断したｐＰＬ−λプラスミドは、平滑５′
末端とＨｇｉＡｌ−適合性３′末端を有するオリゴヌク
レオチドＡと連結し、さらにＨｇｉＡｌ５′末端と平滑
末端化されたＨｉｎｄ■末端を有する上記のヒトＩＬ−
２ｃＤＮＡフラグメントと連結した。 連結反応はマニアチスらの上記文献に記載されるように
、４μｇ／ｍｌのプラスミドＤＮＡを使用してベクター
対挿入物ＤＮＡ対オリゴヌクレオチドのモル比１：２０
：８で実施した。その後得られた組換えプラスミド（ｐ
ＬＮＩＬ−２と命名）を用いてＰＬプロモーターの非耐
熱性大腸菌ｃ■リプレッサーをコードする遺伝子をもつ
プラスミドｐＲＫ２４８ｃ■ｔｓ（ＡＴＣＣ番号３３７
６６）を含む大腸菌株（ＡＴＣＣ番号３１３４３）を形
質転換した。この形質転換方法では、全連結混合物をコ
ンピテント大腸菌ＲＲ１（ｐＲＫ２４８ｃ■ｔｓ）に添
加した。混合物は氷上に３０分放置し、次に３０℃で４
分インキュベートし、Ｌ−培地にて３０℃で１時間増殖
させた。その後形質転換宿主はテトラサイクリンおよび
アンピシリン、１７μｇ／ｍｌを含有するＬ平板上にま
いた。 次に、プラスミドｐＬＮＩＬ−２を第二工程で使用して
、第４図に示すプラスミドｐＬＮｂｏｖＩＬ−２を作成
した。ｐＬＮＩＬ−２Ｘｂａ■とＳｔｕ■で消化するこ
とにより、ヒトＩＬ−２のコーディング配列とオリゴヌ
クレオチドＡの一部をｐＬＮＩＬ−２から単離した。（
Ｓつ１部位は第１図の位置番号５００に依存する。）ｂ
ＩＬ−２のコーティング領域を含む挿入物ＤＮＡは、制
限酵素ＨｇｉＡ■およびＰｓｔ■で消化することにより
プラスミドｂＩＬ−２−４から単離した。単離したＤＮ
Ａフラグメントの両末端の３′突出部分はＴ４ＤＮＡポ
リメラーゼで消化して平滑末端とした。 Ｘｂａ■およびＳｔｕ■で消化ｐＬＮＩＬ−２ベクター
、ｂＩＬ−２挿入物ＤＮＡ、および第４図のオリゴヌク
レオチドＢを上記の工程１での連結反応において使用し
た相対濃度で連結させると、プラスミドｐＬＮｂｏｖ−
２が得られた。その後、得られた組換えプラスミドｐＬ
ＮｂｏｖＩＬ−２を用いて、上記方法により大腸菌株Ｒ
Ｒ１（ｐＲＫ２４８Ｃ■ｔｓ）を形質転換した。 第４図に示すように、合成オリゴヌクレオチドＢはｂＩ
Ｌ−２遺伝子の効率のよい翻訳開始のために使用された
。オリゴヌクレオチドＢの組成には切断したｐＬＮＩＬ
−２ベクターのＸｂａ■末端へ連結するためのＸｂａ■
接着５′末端、およびｂＩＬ−２ＤＮＡフラグメントの
５′末端へ連結するための平滑３′末端が含まれる。Ａ
ＴＧ開始コドンおよびｂＩＬ−２遺伝子のＮ末端アラニ
ンをコードするヌクレオチドＧＣＡはオリゴヌクレオチ
ドの３′末端に位置する。先に述べたように、オリゴヌ
クレオチドの中間配置は翻訳開始列から成る。オリゴヌ
クレオチドはソードらの上記文献およびヒロセらの上記
文献に詳述されるトリエステル法により化学的に合成さ
れた。しかしながら、オリゴヌクレオチドはホスホジエ
ステル法のような他の方法でも合成し得ることを理解す
べきである。 特に指定しない限り制限酵素による消化、連結反応、ア
ガロースゲル電気泳動によるＤＮＡフラグメントの単離
、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼによる一本鎖ＤＮＡ末端の消
化、および逆転写酵素による修復反応は全てマニアチス
らの上記文献に記載されるように実施した。 大腸菌株ＲＲ１（ｐＲＫ２４８ｃ■ｔｓ）内にｐＬＮｂ
ｏｖＩＬ−２を含む培養物は、１７μｇ／ｍｌのアンピ
シリンおよびテトラサイクリンを含有するＳ．Ｉ．培地
〔３２ｇ／ｌトリプトンおよび２０ｇ／ｌ酵母エキスを
補足したＭ−９培地（マニアチスらの上記文献）で３０
℃、一晩増殖させた。その後、それらをアンピリシリン
不含Ｓ．Ｉ．培地で１００倍に希釈し、６００ｎｍでの
吸光度が０．５になるまで増殖させ、４２℃に４時間保
持して沈降を促進させた。培養物の１ｍｌサンプルを４
℃で遠心して沈殿させ、ドライアイスとメタノールの混
合物にさらして凍結した。その沈殿物を１５０μｌの７
Ｍ塩酸グアニジンに再懸濁し、ドライアイス／メタノー
ルで凍結した。その後、グアニジン抽出物の生物活性の
存在を上記のｂＩＬ−２検定法で確かめた。本発明者ら
はｐＬＮｂｏｖＩＬ−２プラスミドが１０．２×１０６
単位／ｍｌ以上の生物活性を示すことを見出した。この
ことは第２図に示すｃＤＮＡがｂＩＬ−２遺伝子である
ことを裏付けるものである。 実施例８ 酵母検出物またはグアニジン抽出物（例えば上記の実施
例６および７）からのｒｂＩＬ−２は、ウオーターズ・
プレパラティブ・グラジエント・ジェネレーターを備え
たウォーターズＬＣ５００ＡプレパラティブＨＰＬＣク
ロマトグラフ〔ＬＫＢ２２３８ユビコード■吸光度計（
ＬＫＢインスツルメント社）を用いて２８０ｎｍでの吸
光度を監視する〕を使用するＨＰＬＣ処理により均一に
精製した。発現されたｒｂＩＬ−２を含む培地は約１０
０ｍｌ／分の流量でウォーターズ・プレパック・カラム
（Ｗａｔｅｒｓ ＰｒｅＰＡＫ ｃｏｌｕｍｎ；ウォー
ターズアソシエート社）に直接送った。このカラムは１
５〜２０ミクロン粒径のバイダックＣ−４樹脂を装填し
、予め０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡで平衡化した。約７ｌ
の培地を１度にカラムにかけた。 このカラムに０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ水溶液を流して
、２８０ｎｍでの吸光度がＬＫＢ２２３８ユビコード■
吸光度計の使用により基線（培地添加前）値に戻るまで
非結合成分を洗い流した。結合タンパク質の溶離は０．
１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ中０〜１００％アセトニトリルの
直線勾配（１分当たり２％の勾配）を約１００ｍｌ／分
の流量で流すことにより達成された。 １分ごとの分画を集め、先に詳述したＩＬ−２依存性ウ
シ細胞株検定法により分析した。第５図に示すように、
意有な活性が分画１０と１１にあらわれた。これらの分
画のポリアクリルアミドゲル電気泳動は、有意な濃度の
ｒｂＩＬ−２が最初のＨＰＬＣ法で得られるが、タンパ
ク質は均一に精製されていないことを示した。 最初のＨＰＬＣ法から得られたｂＩＬ−２活性を示す分
画（分画番号１０および１１）をプールして緩衝液Ａ（
０．９Ｍ酸性酸、０．２Ｍピリジン、ｐＨ４．０）で１
：２に希釈し、５０ｍｌ／分の流量で、予め緩衝液Ａお
よび２０％緩衝液Ｂ（０．９Ｍ酸性酸中６０％ｎ−プロ
パノール、０．２Ｍピリジン、ｐＨ４．０）で平衡化し
た同じプレバックカラムに再度装填した。装填後、初め
に緩衝液Ａでカラムを洗って非結合成分を除いた。次い
で、２０〜８０％勾配の緩衝液Ｂ（１分当たり１％の勾
配）を約１５ｍｌ／分の流量で流してカラムからタンパ
ク質を溶離した。 ２回目のＨＰＬＣ法から１分ごとの分画を集め、上記の
バイオアッセイ、ポリアクリスアミドゲル電気泳動およ
びアンデンフレンド（Ｕｎｄｅｎｆｒｉｅｎｄ）らのＳ
ｃｉｅｎｃｅ．１７８：８７１（１９７２）に記載のフ
ルオレサミンにより分析した。この分析から、第６図に
示すように、均一なｒｂＩＬ−２は分画番号３０〜３２
に主としてあらわれた。また、ｒｂＩＬ−２は約１６，
０００ダルトンの分子量を有することが測定され、ｂＩ
Ｌ−２活性を示す分画に検出された唯一のタンパク質産
物であった。分画３０〜３２における活性の回収率は２
回目のＨＰＬＣカラムにかけたものの約８６％であった
。 天然ｂＩＬ−２は約２０，０００〜２３，０００ダルト
ンの分子量を有することが報告されている。ブラウン（
Ｂｒｏｗｎ）らのＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１３３：３１８
４（１９８５）参照されたい。第２図に示したｂＩＬ−
２をコードするｃＤＮＡから予測されるｂＩＬ−２の分
子量は約１５，４５０ダルトンであり、これはポリアク
リルアミドゲル電気泳動分析により測定されたｒｂＩＬ
−２の分子量と一致する。天然ｂＩＬ−２と組換えｂＩ
Ｌ−２との間の分子量の差は、第２図の位置番号７０の
Ａｓｎ残基に存在しうるＮ−結合グリコシル化部位のた
めでありうる。前述のことから、応答性Ｔ細胞の増殖を
誘起するために、ｒｂＩＬ−２はグリコシル化を必要と
しないように思われる。 均一なｒｂＩＬ−２はアミノ酸組成について分析した。 精製産生物のサンプルはＨＣｌ（濃ＨＣｌから再蒸留し
たもの；ニューヨーク州ロチェスター、コダック社）中
で２４時間絶えず沸騰させることにより真空中で加水分
解した。加水分解後、サンプルを真空化で蒸発乾固し、
０．２Ｎクエン酸ナトリウム（ｐＨ２．２）に再懸濁し
た。このサンプルはアミノ酸残基を標準ニンヒドリン試
験で検出する単一カラムアミノ酸アナライザー（４１５
０型−アルファ；ＬＫＢインスツルメント社）に注入し
た。存在する個々のアミノ酸の量に対応する出力“ピー
ク”の面積は、ＬＫＢ２２２０型記録積分器を用いて積
分した。アミノ酸組成の分析結果は上記のウシｃＤＮＡ
から予測されたものと一致した。 ２回目のＨＰＬＣ法から得られた均一タンパク質はまた
標準方法でアミノ酸配列を決定した。 ｒｂＩＬ−２のサンプルを乾燥し、真空乾燥器にかけて
小容量となし、次いでアブライドバイオシステムズ７４
０型Ａシークエネーター（カリフォルニア州フォスター
シティー）および製造者により提供される試薬類とプロ
グラムを使用して自動化アミノ末端部分の最初の２０残
基は、第２図のアミノ酸残基番号２１〜４１に記載され
るｃＤＮＡから予測されたアミノ酸配列と同じであるこ
とが見出された。タンパク質のアミノ酸配列分析法にお
いて、フェニルチオヒダントインアミノ酸はデュポンゾ
ルバック（ＤｕＰｏｎｔ Ｚｏｒｂａｃｋ）ＯＤＳ４．
６ｍｍ×３０ｃｍカラムまたはＩＢＭ−シアノ４．５ｍ
ｍ×２５ｃｍカラムによる逆相ＨＰＬＣを用いて同定し
た。 実施例９ ｎＲＮＡの分析 ウシリンパ腺細胞から単離したｖｂＩＬ−２ｍＲＮＡの
発現は、ｂＩＬ−２ｃＤＮＡから誘導されたプローブを
用いるハイブリダイゼーションにより、ノザン法（Ｎｏ
ｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ）により分析した。これに関し
て、ノザン法用の全ＲＮＡはＣｏｎＡ刺激および非刺激
ウシリンパ腺細胞から、実施例１に記載のグアニジニウ
ムチオシアナネート法により単離した。ＲＮＡサンプル
はホルムアルデヒド（ＲＮＡを変性して、ゲル中を泳動
するＲＮＡの速度がその分子量に比例するようにする）
を含む１．１％アガロースゲルでの電気泳動を行つて大
きさにより分別した。ホルムアルデヒド含有アガロース
ゲルによるＲＮＡの標準的な電気泳動法はマニアチスら
の上記文献（２０２）に記載されている。 電気泳動後、ホルムアルデヒド変性ＲＮＡは標準方法（
例えばマニアチスらの上記文献２０３を参照）を使って
ナイロン膜（ハイボンド−Ｎ，アマーシャム社）に移行
させ、次いでグリーン（Ｇｒｅｅｎ）らのＣｅｌｌ，３
２，６８１（１９８１年３月）に記載の方法によりＳＰ
６ＲＮＡポリメラーゼでｉｎ ｖｉｔｒｏ転写された３
２Ｐ−標準ＲＮＡプローブとハイブリダイゼーションを
行った。３２Ｐ−ＲＮＡプローブはｐＧＥＭ−１ベクタ
ー（ウィスコンシン州マジソン、プロメガバイオテク社
）内でサブクローニングした第２図のｂＩＬ−２ｃＤＮ
Ａの４３４塩基対のＲｓａ■からＤｒａ■まで（ヌクレ
オチド番号２２〜５０６）のフラグメントから合成した
。ナイロン膜に結合したＲＮＡはスターク（Ｓｔａｒｋ
）の完全緩衝液；すなわち５×ＳＳＣ；５０ｍＭＫＨ２
ＰＯ４（ｐＨ２．５）；１１５０μｇ／ｍｌ変性サケ精
子ＤＮＡ；２×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液（０．０４ｗ／ｖ
％フイコール、０．０４ｗ／ｖ％ＢＳＡ）；０．１％Ｓ
ＤＳ；２０ｍＭＮａ２ＥＤＴＡ；および５０ｗ／ｖ％ホ
ルムアミド中６３℃で１６時間標識ＲＮＡプローブ（１
０６ｃｐｍ／ｍｌ）とハイブリダイズさせた。ハイブリ
ダイゼーション後、フィルターを６×ＳＳＣで６３℃、
２時間洗い、次に０．１×ＳＳＣで２時間洗い、その後
増感板を使用して−７０℃で４時間オートラジオグラフ
ィーを行った。ソートラジオグラフィーの結果はＣｏｎ
Ａで刺激したリンパ腺細胞からの全ＲＮＡ中に約１，１
００ヌクレオチドから成る強くハイブリダイズするバン
ドを示した。 しかし、ＣｏｎＡで刺激しなかったリンパ腺細胞からは
この種のバンドがあらわれなかった。ノザンプロット分
析の結果は、先に論じた末梢血液白血球から誘導された
ｒｖＩＬ−２の先に測定された生物活性のレベルと一致
する。 実施例１０ ウシゲノム配列の分析 ウシゲノムＤＮＡ中のＩＬ−２関連遺伝子の数を調べる
ために、標識ｂＩＬ−２ｃＤＮＡプローブはマニアチス
らの上記文献に詳述されるような標準方法により、ウシ
末梢血液白血球から単離したゲノムＤＮＡのサザンプロ
ツトとハイブリダイズさせた。１０μｇのゲノムＤＮＡ
は比較的少ない頻度で切断することが予期される制限酵
素で消化した。プローブは第２図のウシｃＤＮＡの５０
６ｂｐフラグメント（ヌクレオチド番号１〜５０６）を
含んでいた。マニアチスｒｎｏ上記文献（１０８）に記
載の標準方法により、このプローブをニツクトランスレ
ーシヨンで放射性標識した。ハイブリダイゼーシヨンに
先だつて、１０μｇのウシゲノムＤＮＡは標準技法を用
いてＢａｍＨＩ，ＥｃｏＲＩまたはＨｉｎｄＩＩで完全
消化した。消化したウシＤＮＡを適当な大きさのマーカ
ーと共に０．７％アガロースゲルによる電気永動で分画
化した。このアガロースゲルをサザンの上記文献に記載
の方法によりニトロセルロースフイルター上にブロツテ
イング（ｂｌｏｔｔｉｎｇ）した。移行処理後、このフ
イルターを自然乾燥し、８０℃で２時間ベーキングする
ことによりＤＮＡフラグメントをニトロセルロースに固
定した。その後、固定したＤＮＡを上記実施例４で説明
したように３２Ｐ−標識ｃＤＮＡプローブとハイブリダ
イズさせ、次に室温にて２×ＳＳＣ，０．５％ＳＤＳで
洗い、さらに６５℃にて０．１×ＳＳＣ，０．５％ＳＤ
Ｓで４５分間洗つた。自然乾燥後、フイルターを−７０
℃でオートラジオグラフイーにかけ、そのオートラジオ
グラフイーはＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩ
Ｉで消化したウシゲノムＤＮＡが単一のバンドであるこ
とを示した。これにより、ＩＬ−２遺伝子はウシゲノム
ＤＮＡ中に単一コピー遺伝子として存在すると思われる
。 本発明の分野に習熟した者には明らかであるように、本
発明はその精神または本質的特徴から逸脱することなく
先に詳述したものとは別の形で具体化されうる。それ故
、上記の本発明の実施態様はすべての点において例示と
して解釈されるべきであつて、限定するものではない。 本発明の範囲は前述の実施例に制限されるものではなく
、むしろ特許請求の範囲に記載されるものである。
第１Ａおよび１Ｂ図（一緒にして第１図と呼ぶ）はヒト
ＩＬ−２をコードする遺伝子のアミノ酸配列（上の列）
およびヌクレオチド配列（下の列）を示す図であり； 第２Ａおよび２Ｂ図（一緒にして第２図と呼ぶ）はｂＩ
Ｌ−２遺伝子のアミノ酸配列（下の列）およびヌクレオ
チド配列（上の列）を示すとともに成熟タンパク質は星
印から始まることを示す図であり； 第３図はｐＹαｆＢｏＩＬ−２プラスミドの作成方法並
びに、このプラスミドはその中に挿入されたｂＩＬ−２
遺伝子のコーデイング領域を有し、酵母宿主細胞を形質
転換して機能的ｂＩＬ−２を発現させる使用されること
を示す模式図であり；第４Ａおよび４Ｂ図（一緒にして
第４図と呼ぶ）はｐＬＮｂｏｖＩＬ−２プラスミドの構
造並びにこのプラスミドはその中に挿入されたｂＩＬ−
２遺伝子のコーデイング領域を有し、細胞宿主細胞を形
質転換して機能的ｂＩＬ−２を発現させるために使用さ
れることを示す模式図であり； 第５（５Ａおよび５Ｂ）図は組換えウシｒｂＩＬ−２の
ＨＰＬＣにゆおる部分精製を示し、ここで第５Ａ図は最
初のＨＰＬＣカラムから回収された活性分画のポリアク
リルアミドゲル電気永動図であり、レーンの下の数字は
最初のＨＰＬＣカラムから溶離された分画に対応し、分
子量マーカーは最初のカラム（左手側）に沿つて示され
、第５Ｂ図はｂＩＬ−２依存性Ｔ細胞増殖検定による同
じ分画からのアリコートも生物活性の存在についての分
析を示すグラフであり；
ＩＬ−２をコードする遺伝子のアミノ酸配列（上の列）
およびヌクレオチド配列（下の列）を示す図であり； 第２Ａおよび２Ｂ図（一緒にして第２図と呼ぶ）はｂＩ
Ｌ−２遺伝子のアミノ酸配列（下の列）およびヌクレオ
チド配列（上の列）を示すとともに成熟タンパク質は星
印から始まることを示す図であり； 第３図はｐＹαｆＢｏＩＬ−２プラスミドの作成方法並
びに、このプラスミドはその中に挿入されたｂＩＬ−２
遺伝子のコーデイング領域を有し、酵母宿主細胞を形質
転換して機能的ｂＩＬ−２を発現させる使用されること
を示す模式図であり；第４Ａおよび４Ｂ図（一緒にして
第４図と呼ぶ）はｐＬＮｂｏｖＩＬ−２プラスミドの構
造並びにこのプラスミドはその中に挿入されたｂＩＬ−
２遺伝子のコーデイング領域を有し、細胞宿主細胞を形
質転換して機能的ｂＩＬ−２を発現させるために使用さ
れることを示す模式図であり； 第５（５Ａおよび５Ｂ）図は組換えウシｒｂＩＬ−２の
ＨＰＬＣにゆおる部分精製を示し、ここで第５Ａ図は最
初のＨＰＬＣカラムから回収された活性分画のポリアク
リルアミドゲル電気永動図であり、レーンの下の数字は
最初のＨＰＬＣカラムから溶離された分画に対応し、分
子量マーカーは最初のカラム（左手側）に沿つて示され
、第５Ｂ図はｂＩＬ−２依存性Ｔ細胞増殖検定による同
じ分画からのアリコートも生物活性の存在についての分
析を示すグラフであり；
Claims (14)
- （１）ウシインタ−ロイキン−２の発現をコードする実
質的に純粋なＤＮＡ。 - （２）第２図のヌクレオチド番号７８からヌクレオチド
番号４８２まで延びる核酸配列を有する特許請求の範囲
第１項記載のＤＮＡ。 - （３）原核細胞または真核細胞宿主内でのウシインタ−
ロイキン−２の発現をコードする特許請求の範囲第１項
または第２項記載のＤＮＡ。 - （４）特許請求の範囲第１〜３項のいずれか１項に記載
の核酸配列によつてコードされるアミノ酸鎖。 - （５）ウシインタ−ロイキン−２の遺伝子から成り、場
合により、特許請求の範囲第２項または第３項の特徴に
よつてさらに定義されるＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ
ベクター。 - （６）ウシインタ−ロイキン−２の効果的合成をうなが
すための酵母接合フェロモンα因子のプロモーターおよ
びリーダー配列を有する発現ベクターから成る、特許請
求の範囲第５項記載の組換えＤＮＡベクター。 - （７）特許請求の範囲第５項または第６項記載のベクタ
ーによつて形質転換された宿主。 - （８）特許請求の範囲第７項記載の宿主により発現され
た組換えウシインタ−ロイキン−２。 - （９）１回またはそれ以上の逆相高性能液体クロマトグ
ラフィー法によつて宿主の細胞物質から精製された、特
許請求の範囲第８項記載の組換えウシインタ−ロイキン
−２。 - （１０）第２図のアミノ酸残基番号１からアミノ酸残基
番号１３５まで延びるアミノ酸配列から成るポリペプチ
ド主鎖を有する均一なウシインタ−ロイキン−２。 - （１１）ウシインタ−ロイキン−２を産生しうる細胞か
らポリＡ＾＋ｍＲＮＡを単離し；単離したｍＲＮＡに対
応するｃＤＮＡのライブラリーを作成し；得られたｃＤ
ＮＡをクローニングベクターに挿入することによりその
ｃＤＮＡをクローニングし；得られたクローニングベク
ターを用いて宿主細胞を形質転換し；ウシインタ−ロイ
キン−２遺伝子の一部に対応するオリゴヌクレオチドプ
ローブを用いるハイブリダイゼーシヨンにより、ウシイ
ンタ−ロイキン−２分子の少なくとも一部をコードする
プラスミドＤＮＡを含む形質転換細胞を同定し；そして
場合により得られたｃＤＮＡを発現ベクターに挿入し、
得られた発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換する
ことにより活性ウシインタ−ロイキン−２を発現させる
；各工程を含むウシインタ−ロイキン−２分子の少なく
とも一部をコードするＤＮＡまたは特許請求の範囲第１
〜３項のいずれか１項に記載のＤＮＡの調製方法。 - （１２）ウシインタ−ロイキン−２は１回またはそれ以
上の逆相高性能液体クロマトグラフィー法により宿主の
細胞物質から精製される、特許請求の範囲第１１項記載
の方法。 - （１３）特許請求の範囲第１〜３項のいずれか１項に記
載のＤＮＡを、宿主内で発現可能であるように調節配列
の制御下にある出発ベクターであつてウシインタ−ロイ
キン−２の効果的合成をうながすための酵母接合フェロ
モンα因子のプロモーターおよびリーダー配列を場合に
より含む該出発ベクターに挿入する工程から成る、ウシ
インタ−ロイキン−２の発現用ベクターの作成方法。 - （１４）特許請求の範囲第１１項または第１３項に従つ
て作成されたベクター、あるいは特許請求の範囲第５項
または第６項に記載のベクターを用いて宿主を形質転換
することから成る、ウシインタ−ロイキン−２を発現し
うる形質転換細胞の製法。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH1192390A (ja) * | 1997-09-17 | 1999-04-06 | Natl Fedelation Of Agricult Coop Assoc | ストレス状態改善剤 |
| JP2016174607A (ja) * | 2010-12-09 | 2016-10-06 | ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペン | 癌を治療するためのキメラ抗原受容体改変ｔ細胞の使用 |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE8701004D0 (sv) * | 1987-03-11 | 1987-03-11 | Astra Ab | Method for therapy of leukemias and certain other malignancies |
| DK0405315T3 (da) * | 1989-06-30 | 1995-09-25 | American Cyanamid Co | Anvendelse af et fagocyt-aktiverende stof: LPS eller IL-2 til fremstilling af et lægemiddel til behandling af Staphylococcus aureus-infektioner hos køer |
| US5106965A (en) * | 1989-11-27 | 1992-04-21 | Research Corporation Technologies, Inc. | Detection of human adenovirus |
| US5336488A (en) * | 1991-08-07 | 1994-08-09 | American Cyanamid Company | Method of treating or preventing mastitis in animals with involuting mammary glands by administering recombinant cytokines |
| JPH08503852A (ja) * | 1992-11-25 | 1996-04-30 | ユニバーシティ オブ ピッツバーグ オブ ザ コモンウェルス システム オブハイヤー エデュケーション | ヒト誘導性一酸化窒素シンターゼのｃＤＮＡクローンおよびその作製方法 |
| US6019801A (en) | 1994-07-12 | 2000-02-01 | Hydro-Quebec | Additives for lubricating agents used in the lamination of lithium sheets into thin films |
| DE19836559A1 (de) * | 1998-08-12 | 2000-03-23 | Antigen Gmbh | Gefäß zur Entnahme von Blut |
| AU2010363352B2 (en) * | 2010-11-02 | 2014-12-18 | Landmark Graphics Corporation | Systems and methods for generating updates of geological models |
| UY35468A (es) | 2013-03-16 | 2014-10-31 | Novartis Ag | Tratamiento de cáncer utilizando un receptor quimérico de antígeno anti-cd19 |
| EP3129470B1 (en) | 2014-04-07 | 2021-04-07 | Novartis Ag | Treatment of cancer using anti-cd19 chimeric antigen receptor |
| PL3280729T3 (pl) | 2015-04-08 | 2022-08-22 | Novartis Ag | Terapie cd20, terapie cd22 i terapie skojarzone komórką eksprymującą chimeryczny receptor antygenowy (car) cd19 |
| SG10201913823VA (en) | 2016-10-07 | 2020-03-30 | Novartis Ag | Chimeric antigen receptors for the treatment of cancer |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IE54046B1 (en) * | 1981-08-25 | 1989-05-24 | Celltech Ltd | Expression vectors |
| IE54592B1 (en) * | 1982-03-08 | 1989-12-06 | Genentech Inc | Anumal interferons, processes involved in their production, compositions containing them, dna sequences coding therefor and espression vehicles containing such sequences and cells transformed thereby |
| CA1341562C (en) * | 1982-03-31 | 2007-11-27 | Tadatsugu Taniguchi | Gene coded for interleukin-2 polypeptide, recombinant dna carrying the said gene, a living cell line possessing the recombinant dna, and method for producing interleukin-2 using the said cell |
| WO1985001515A1 (en) * | 1983-10-03 | 1985-04-11 | Sandoz Ag | T-cell growth factor of the gibbon ape |
| EP0159123B1 (en) * | 1984-03-06 | 1992-01-15 | Eli Lilly And Company | Vectors for expressing bovine growth hormone derivatives |
| GB2182003B (en) * | 1985-09-20 | 1988-10-26 | Kubota Ltd | Riding type mower |
-
1986
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-
1995
- 1995-09-07 JP JP7230357A patent/JP2610409B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH1192390A (ja) * | 1997-09-17 | 1999-04-06 | Natl Fedelation Of Agricult Coop Assoc | ストレス状態改善剤 |
| JP2016174607A (ja) * | 2010-12-09 | 2016-10-06 | ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペン | 癌を治療するためのキメラ抗原受容体改変ｔ細胞の使用 |
| JP2018029595A (ja) * | 2010-12-09 | 2018-03-01 | ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペン | 癌を治療するためのキメラ抗原受容体改変ｔ細胞の使用 |
| JP2022002516A (ja) * | 2010-12-09 | 2022-01-11 | ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア | 癌を治療するためのキメラ抗原受容体改変ｔ細胞の使用 |
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