JPH06339381A - ヒト顆粒球コロニー刺激因子をコードする遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 組換えＤＮＡ技術によりヒトＧ−ＣＳＦを大
量に製造するために用いられるヒト染色体由来の遺伝
子、及び該遺伝子を含有する組換えベクター、並びにそ
の組換えベクターで形質転換された哺乳動物細胞を提供
する。 【構成】 ヒト染色体遺伝子ライブラリーからスクリー
ニングした組換えＤＮＡ技術によりヒトＧ−ＣＳＦ活性
を有する糖蛋白質を製造するのに必要なヒト染色体由来
の遺伝子、及び該遺伝子を含有する組換えベクター並び
にその組換えベクターで形質転換された哺乳動物細胞か
らなる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規な主としてヒト顆粒
球系細胞のコロニー形成をさせるために必要な、特異的
な刺激因子、すなわちヒト顆粒球コロニー刺激因子をコ
ードする遺伝子等に関する。

【０００２】

【従来の技術】２層軟寒天培養法で、上層に標的細胞と
して骨髄細胞を、下層に腎細胞や胎児細胞を入れて培養
すると、上層の細胞の一部が増殖分化し、好中球系顆粒
球（以下「顆粒球（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ）」と称
す）や単球マクロファージからなるコロニーが形成され
ることから、生体内にコロニー形成を促進する因子が存
在することが知られていた（ＰｌｕｚｎｉｋとＳａｃ
ｈ；Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｃｏｍｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌ，６６巻
３１９頁（１９６５），ＢｒａｄｌｅｙとＭｅｔｃａｌ
ｆ；Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．Ｓｃ
ｉ．４４巻２８７頁（１９６６））。

【０００３】コロニー刺激因子（以下「ＣＳＦ」と略記
する）と総称されるこの因子は、正常に広く生体内分布
する細胞、たとえば、Ｔ細胞、単球マクロファージ、繊
維芽細胞、内皮細胞などより産生されることが知られて
いる。ＣＳＦには顆粒球・単球マクロファージの幹細胞
に作用して、その増殖を刺激し分化を誘導して、軟寒天
中で顆粒球や単球マクロファージから成るコロニーを形
成させる作用をもつ顆粒球−単球マクロファージＣＳＦ
（ＧＭ−ＣＳＦと略記する）、主として単球マクロファ
ージのコロニーを形成させる作用をもつ単球マクロファ
ージＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦと略記する）より未分化な多能
性幹細胞に作用する多能性ＣＳＦ（ｍｕｌｔｉ−ＣＳＦ
と略記する）、あるいは本発明の如き、主として顆粒球
系コロニーを形成させる作用をもつ顆粒球ＣＳＦ（Ｇ−
ＣＳＦと略記する）などのサブクラスが存在し、それぞ
れのサブクラスによって標的細胞の分化段階も異なるこ
とが考えられる様になってきた［Ａｓａｎｏ；代謝−Ｍ
ｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ，２２巻
２４９頁（１９８５），Ｙｕｎｉｓ等；“Ｇｒｏｗｔｈ
ａｎｄ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ”ｅ
ｄｉｔｅｄ ｂｙＧｕｒｏｆｆ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ
＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ，１巻，２０９頁（１９８３）］。

【０００４】従って個々のサブクラスを精製し、その化
学的性状や生物学的性状をより詳細に調べることは造血
機構や種々の血液学的疾患の病態の解析にきわめて重要
なことである。なかでもＧ−ＣＳＦの生物学的作用とし
て、骨髄性白血病細胞の分化誘導と成熟顆粒球の機能亢
進が注目されており、特に白血病の治療と予防へのＧ−
ＣＳＦの臨床的有用性が大いに期待されてきた。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】Ｇ−ＣＳＦの単離精製
のために従来行われてきた試みは、細胞培養法を用いて
その培養上清からＧ−ＣＳＦを単離する方法であるが、
Ｇ−ＣＳＦが低濃度しか産生されないこと、大量の培養
液から微量のＧ−ＣＳＦを得るには複雑な精製過程を必
要とするなどの難点をかかえ未だ大量の均一なＧ−ＣＳ
Ｆを得るには至っていなかった。従って、組換えＤＮＡ
技術を用いてＧ−ＣＳＦを大量に製造することが渇望さ
れていた。

【０００６】

【課題を解決するための手段】かかる状況において、本
発明者らはヒトＧ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドを
コードする遺伝子を単離し、当該遺伝子を宿主細胞内で
発現することに成功した。本発明は請求項１項に記載し
たアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むヒト染色体
由来の遺伝子、及び該遺伝子を含有する組換えベクタ
ー、並びにその組換えベクターで形質転換された哺乳動
物細胞を提供するものである。

【０００７】以下、本発明を詳細に説明する。本発明で
用いられるヒトＧ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドを
コードする遺伝子としては、ショ糖密度勾配遠心法によ
り１５〜１７Ｓ画分として得られる、ヒトＧ−ＣＳＦ活
性を有するポリペプチドをコードするメッセンジャーＲ
ＮＡ（ｍＲＮＡ）に相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）があ
る。

【０００８】本出願人は２系列のこのようなｃＤＮＡを
得た。そのうちの１つの系列のｃＤＮＡは配列番号６又
は７のポリペプチドをコードする遺伝子或いはその一部
を有するものであり、更に詳細には配列番号５の塩基配
列の５′−末端から３２〜３４ヌクレオチド位のＡＴＧ
から６５０〜６５２ヌクレオチド位のＣＣＣまでの配
列、１２２〜１２４位のＡＣＣから６５０〜６５２位の
ＣＣＣまでの配列又は配列番号５に記載された配列或い
はその一部を有するものである。この系列のｃＤＮＡを
ｃＤＮＡ（＋ＶＳＥ）と称する。

【０００９】他の系列のｃＤＮＡは配列番号９又は１０
のポリペプチドをコードする遺伝子あるいはその一部を
有するものであり、さらに詳細には配列番号８の塩基配
列の５′−末端から３１〜３３ヌクレオチド位のＡＴＧ
から６４０〜６４２ヌクレオチド位のＣＣＣまでの配
列、１２１〜１２３位のＡＣＣから６４０〜６４２位の
ＣＣＣまでの配列または配列番号８に記載された配列あ
るいはその一部を有するものである。この系列のｃＤＮ
ＡをｃＤＮＡ（−ＶＳＥ）と称する。

【００１０】上記の遺伝子は、例えばＧ−ＣＳＦ活性を
有するポリペプチドを産生する能力を有する哺乳動物細
胞等からＧ−ＣＳＦをコードするｍＲＮＡを調製した
後、既知の方法により２本鎖ｃＤＮＡに変換し、このＤ
ＮＡを含む組換体の集合（以下ｃＤＮＡライブラリーと
称する）から既知の方法によりスクリーニングすること
によって得られる。

【００１１】又、本発明で用いられる遺伝子はヒトＧ−
ＣＳＦ活性を有するポリペプチドをコードするヒト染色
体由来の遺伝子であってもよい。この遺伝子は転写調節
に関与する塩基配列を含んでいるものであり、詳しくは
配列番号１１に示される塩基配列または、その一部を有
するものである。

【００１２】該染色体由来の遺伝子は、例えばヒト細胞
からヒト染色体遺伝子を含む組換え体の集合（以下、ヒ
ト染色体遺伝子ライブラリーと称する）を調製した後、
既知の方法によりスクリーニングすることによって得る
ことができる。この場合ヒト染色体遺伝子の供給源とし
ては、ヒト細胞であれば全て実施することができ、肝，
腎等の摘出細胞や腫瘍細胞等の培養細胞等を用いること
ができる。

【００１３】また、ヒト細胞からヒト染色体遺伝子ライ
ブラリーを調製するには、既知の方法［Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ等；Ｃｅｌｌ １５巻６８７頁（１９７８）およびＭ
ａｎｉａｔｉｓ等；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎ
ｇ，Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ ２６９頁（１９８２）等を参照］に従って
行えばよく、例えばヒト胎児肝等からヒト染色体ＤＮＡ
をフェノール等にて抽出し、得られたＤＮＡを制限酵素
で部分的に、若しくは完全に消化させて、適当な長さに
断片化されたＤＮＡを得、この断片化されたＤＮＡをＴ
４ＤＮＡリガーゼ等を用いて、さらには必要に応じてＥ
ｃｏＲＩ等の切断部位を含むリンカーを付加して、λフ
ァージベクターＤＮＡ断片に挿入する。次いでインビト
ロパッケージング法によりλファージ粒子を得、それに
より大腸菌などの宿主細胞を形質転換させることによっ
て作成することができる。

【００１４】上記ベクターとして用いたλファージは、
例えばＣｈａｒｏｎ４ＡやＥＭＢＬ−３，４などが挙げ
られる。

【００１５】一方、前記ｍＲＮＡの供給源となる哺乳動
物細胞は本発明においては、ヒト口腔底癌由来の細胞株
ＣＨＵ−２（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ
ｅＤｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ Ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａ
ｎｉｓｍｅｓ（Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ）寄託番号Ｉ−４８３）
であるが、腫瘍細胞株にかぎらず、哺乳動物から分離で
きる細胞、あるいは樹立した他の細胞株でもよい。

【００１６】又、ｍＲＮＡの調製はすでに他のいくつか
の生理活性タンパクの遺伝子をクローン化する際、用い
られた方法、例えば、バナジウム複合体等を用いてリボ
ヌクレアーゼインヒビター存在下に界面活性剤処理、フ
ェノール処理を行う（ＢｅｒｇｅｒとＢｉｒｋｅｎｍｅ
ｉｅｒ ；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１８巻５１４３頁
（１９７９）を参照）か、グアニジンチオシアナート処
理後、ＣｓＣｌ密度勾配遠心を行う（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ
等；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１８巻５２９４頁（１９
７９）を参照）ことによって、全ＲＮＡを得た後、オリ
ゴ（ｄＴ）−セルロースやセファロース２Ｂを担体とす
るポリＵ−セファロース等を用いたアフィニティ−カラ
ム法あるいはバッチ法によりポリ（Ａ⁺ ）ＲＮＡ（ｍＲ
ＮＡ）を得ることができる。またショ糖密度勾配遠心法
等によりポリ（Ａ⁺ ）ＲＮＡを更に分画することもでき
る。

【００１７】上記の如くして得られたｍＲＮＡが、Ｇ−
ＣＳＦ活性をもつポリペプチドをコードするものである
ことを確認するためには、ｍＲＮＡをタンパク質に翻訳
させ、生理活性を調べるか、抗Ｇ−ＣＳＦ抗体を用いて
そのタンパクを同定する等の方法を行えばよい。例え
ば、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉ
ｓ）の卵母細胞にｍＲＮＡを注入して翻訳させたり（Ｇ
ｕｒｄｏｎ等；Ｎａｔｕｒｅ，２３３巻１７７頁（１９
７２）を参照）、あるいはウサギ網状赤血球（Ｒｅｔｉ
ｃｕｌｏｃｙｔｅ）系や小麦胚芽（Ｗｈｅａｔ ｇｅｒ
ｍ）系を利用した翻訳反応が行われている（Ｓｃｈｌｅ
ｉｆとＷｅｎｓｉｎｋ；“Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ”，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ，（１９
８１））。

【００１８】Ｇ−ＣＳＦ活性の検定は骨髄細胞を用いた
軟寒天培養法を適用して実施できる。それらの手法につ
いては総説がある（Ｍｅｔｃａｌｆ；“Ｈｅｍｏｐｏｉ
ｅｔｉｃ Ｃｏｌｏｎｉｅｓ”，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖ
ｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｈｅｉｄｅｉｂｅｒｇ，Ｎ
Ｙ（１９７７））。

【００１９】前述の如き方法で得たｍＲＮＡを鋳型にし
て１本鎖ｃＤＮＡを合成した後、この１本鎖ｃＤＮＡか
ら２本鎖ｃＤＮＡを合成し、適当なベクターＤＮＡとの
組換えプラスミドを作成する。これで大腸菌（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）などを形質転換して、形質
転換株のＤＮＡ群（ｃＤＮＡライブラリー）を得る。

【００２０】ｍＲＮＡから２本鎖ｃＤＮＡを得るには、
例えばｍＲＮＡの３′−末端にあるポリＡ−鎖に相補的
なオリゴ（ｄＴ）をプライマーとして逆転写酵素で処理
するか、またはＧ−ＣＳＦタンパクのアミノ酸配列の一
部に相応するオリゴヌクレオチドを合成し、これをプラ
イマーとして逆転写酵素で処理してｍＲＮＡに相補的な
ｃＤＮＡを合成する。２本鎖ｃＤＮＡは、アルカリ処理
でｍＲＮＡを分解・除去した後、得られた１本鎖ｃＤＮ
Ａを逆転写酵素又はＤＮＡポリメラーゼＩ（例えばＫｌ
ｅｎｏｗ断片等）処理後Ｓｌヌクレアーゼ等で処理して
得るか、あるいは、直接ＲＮａｓｅ ＨおよびＤＮＡポ
リメラーゼ（例えば、大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩ
等）等で処理することによっても得ることができる（例
えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ等；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌ
ｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２）およびＧｕｂｌｅｒと
Ｈｏｆｆｍａｎ；Ｇｅｎｅ２５巻２６３頁（１９８３）
を参照）。

【００２１】このようにして得られた２本鎖ｃＤＮＡを
適当なベクター、例えば、ｐＳＣ１０１，ｐＤＦ４１，
ＣｏｌＥ１，ｐＭＢ９，ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２７，
ｐＡＣＹＣ１などに代表されるＥＫ型プラスミドベクタ
ーや、λｇｔ．λｃ，λｇｔ１０，λｇｔＷＥＳなどに
代表されるファージベクターなどに組み込んだ後、大腸
菌（Ｘ１７７６；ＨＢ１０１；ＤＨ１，Ｃ６００株な
ど）等を形質転換してｃＤＮＡライブラリーを得ること
ができる（例えば、前出“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎ
ｉｎｇ”を参照）。

【００２２】２本鎖ｃＤＮＡをベクターと連結させるに
は、ＤＮＡ末端に連結可能な末端をつけるべく、適当な
化学合成ＤＮＡ断片を付加し、予め制限酵素を用いて開
裂させたベクターＤＮＡとＡＴＰ存在下にＴ4 ファージ
ＤＮＡリガーゼで処理することにより行うことができ
る。あるいは、予め制限酵素を用いて開裂させたベクタ
ーＤＮＡと２本鎖ｃＤＮＡのそれぞれにｄＧ，ｄＣ−鎖
（あるいはｄＡ，ｄＴ−鎖）を付加した後、例えば両Ｄ
ＮＡを含む溶液を徐冷することによっても行うことがで
きる（前記Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇを参
照）。

【００２３】こうして得られた組換えＤＮＡ体による宿
主細胞の形質転換は、例えば宿主細胞が大腸菌の場合Ｈ
ａｎａｈａｎ が詳細に記述している如き方法（Ｊ．Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．；１６６巻５５７頁（１９８３））、
すなわち、ＣａＣｌ₂ やＭｇＣｌ₂ 又はＲｂＣｌを共存
させて調製したコンピテント細胞に該組換えＤＮＡ体を
加えることにより実施することができる。

【００２４】目的とする遺伝子を保有する細胞を検索す
るには、インターフェロンｃＤＮＡのクローン化で用い
られたプラス−マイナス法（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ等；Ｐ
ｒｏｃ．Ｊｐｎ．Ａｃａｄ．５５巻Ｓｅｒ．Ｂ，４６４
頁（１９７９））や、ハイブリダイゼーション−トラン
スレーションアッセイ法（Ｎａｇａｔａ等；Ｎａｔｕｒ
ｅ２８４巻３１６頁（１９８０））など、又は該タンパ
ク質のアミノ酸配列をもとにして化学合成したオリゴヌ
クレオチドプローブを用いたコロニーあるいはプラーク
ハイブリダイゼーション法（Ｗａｌｌａｃｅ等；Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９巻８７９頁（１９８
１）およびＢｅｎｔｏｎとＤａｖｉｓｅ：Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ １９６巻１８０頁（１９７７））などを用いればよ
い。

【００２５】このようにしてクローン化されたヒトＧ−
ＣＳＦ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を
含む断片は適当なベクターＤＮＡに再び組み込むことに
より、他の原核生物または真核生物の宿主細胞を形質転
換させることができる。更にこれらのベクターに適当な
プロモーター及び形質発現に係る配列を導入することに
より、それぞれの宿主細胞に於いて遺伝子を発現させる
ことが可能である。

【００２６】哺乳動物由来の宿主細胞としては、ＣＯＳ
細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｃ
−１２７細胞、ＨｅＬａ細胞などがあげられ、これ等の
細胞を形質転換させるベクターとしては、ｐＳＶ２−ｇ
ｐｔ（ＭｕｌｌｉｇａｎとＢｅｒｇ；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ；７８巻２０７２頁
（（１９８１）を参照）等がある。これ等のベクターは
複製起源、選択マーカー、発現させようとする遺伝子の
前に位置するプロモーター、ＲＮＡスプライス部位、ポ
リアデニル化シグナルなどを含んでいる。

【００２７】哺乳動物細胞における遺伝子発現のプロモ
ーターとしてはレトロウィルス、ポリオーマウィルス、
アデノウィルス、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）な
どのプロモーターを用いればよい。例えばＳＶ４０のプ
ロモーターを使用する場合は、Ｍｕｌｌｉｇａｎなどの
方法（Ｎａｔｕｒｅ ２７７巻１０８頁（１９７９））
に従えば容易に実施することができる。

【００２８】複製起源としては、ＳＶ４０、ポリオーマ
ウィルス、アデノウィルス、牛パピローマウィルス（Ｂ
ＰＶ）等の由来のものを用いることができ、選択マーカ
ーとしては、ホスホトランスフェラーゼＡＰＨ（３’）
IIあるいはＩ（ｎｅｏ）遺伝子、チミジンキナーゼ（Ｔ
Ｋ）遺伝子、大腸菌キサンチン−グアニンホスホリボシ
ルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒド
ロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子等を用いることがで
きる。

【００２９】以上の如き宿主−ベクター系を用いてヒト
Ｇ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドを得るには、上記
ベクターの適当な部位に該遺伝子を組み込んだ組換えＤ
ＮＡ体により宿主細胞を形質転換させた後、得られた形
質転換体を培養すればよい。さらに細胞内または培養液
から該ポリペプチドを分離・精製するには、公知の手段
を用いて行うことができる。

【００３０】一般に真核生物の遺伝子はヒトインターフ
ェロン遺伝子等で知られているように、多形現象（ｐｏ
ｌｙｍｏｒｐｈｙｓｍ）を示すと考えられ（例えばＮｉ
ｓｈｉ等；Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９７巻１５３頁（１９
８５）を参照）、この多形現象によって１個またはそれ
以上のアミノ酸が置換される場合もあれば、塩基配列の
変化はあってもアミノ酸は全く変わらない場合もある。

【００３１】また例えば配列番号７あるいは配列番号１
０のアミノ酸配列の中の１個またはそれ以上のアミノ酸
を欠くか又は付加されたポリペプチド、あるいは１個ま
たはそれ以上のアミノ酸が１個またはそれ以上のアミノ
酸で置換されたポリペプチドでもＧ−ＣＳＦ活性を有す
ることがある。例えば、ヒトインターロイキン２（ＩＬ
−２）遺伝子のシステインに相当する塩基配列をセリン
に相当する塩基配列に変換して得られたポリペプチドが
インターロイキン２活性を保持することもすでに公知と
なっている（Ｗａｎｇ等；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４巻１
４３１頁（１９８４））。それゆえ、それ等天然に存在
するかあるいは人工合成されたポリペプチドがヒトＧ−
ＣＳＦ活性を有する限りそれ等のポリペプチドをコード
する遺伝子を含む組換ベクターによって形質転換された
動物細胞（形質転換体）を培養して得られた糖蛋白質は
全て本発明に含まれる。

【００３２】本発明のヒトＧ−ＣＳＦ活性を有する糖蛋
白質を得るために必要な遺伝子、該遺伝子を有する組換
えベクター及びこれを含有する形質転換体、並びにこの
形質転換体を培養し、取得した目的の糖蛋白質、夫々に
ついてその製法の概要を説明すると以下の通りである。

【００３３】（１） プローブの調製 腫瘍細胞株ＣＨＵ−２の培養上清から精製して得られた
均一ヒトＣＳＦタンパクについてＮ末端よりアミノ酸配
列を決定し、さらにブロムシアン分解、トリプシン処理
などにより断片化した後その断片についてもアミノ酸配
列を決定した［実施例３（ｉ），（ｉｉ），（ｉｉ
ｉ）］。そのアミノ酸配列中から配列番号１，２，３に
示される配列に対応する３種類のヌクレオチドプローブ
（ＩＷＱ），プローブ（Ａ）およびプローブ（ＬＣ）を
合成した（実施例４）。

【００３４】プローブ（Ａ）は連続した１４個のヌクレ
オチドからなる混合型プローブである。プローブ（ＩＷ
Ｑ）は、ヒトコレシストキニン遺伝子のクローン化で用
いられた如き（Ｔａｋａｈａｓｈｉ等；Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８２巻１９３１頁
（１９８５））デオキシイノシンを使用した３０個の連
続したヌクレオチドである。プローブ（ＬＣ）は実施例
３（ｉ）に示したアミノ酸配列のＮ末端から３２〜３９
番に相当する部分を、配列番号５に示した塩基配列を基
にして合成した２４個のヌクレオチドからなるプローブ
である。

【００３５】ヌクレオチドの化学合成は改良型ホスホト
リエステル法を固相法に適用して行うことができ、Ｎａ
ｒａｎｇの総説に記述されている（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒ
ｏｎ３９巻３−２２頁（１９８３））。使用するプロー
ブは、本発明で用いたプローブ以外の位置のアミノ酸配
列に基づくものであってもよい。

【００３６】（２） ｃＤＮＡライブイリーの構築 ＣＨＵ−２細胞にグアニジンチオシアナート溶液を加え
てホモジナイズし、ＣｓＣｌ密度勾配遠心法により全Ｒ
ＮＡを得る。この全ＲＮＡからオリゴ（ｄＴ）セルロー
スカラムによりポリ（Ａ⁺ ）ＲＮＡを選別した後、逆転
写酵素により１本鎖ｃＤＮＡを合成し、ＲＮａｓｅＨお
よびＥ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩを用いて、２本
鎖ｃＤＮＡを得た。得られた２本鎖のｃＤＮＡにｄＣ鎖
を付加し、ＰｓｔＩ切断部位にｄＧ鎖を付加したｐＢＲ
３２２ベクターとつなぎ合せて、大腸菌Ｘ１７７６株を
形質転換させ、ｐＢＲ３２２系ｃＤＮＡライブラリーを
構築した（実施例５，６）。同様にＥｃｏＲＩリンカー
を用いて、２本鎖ｃＤＮＡをλｇｔ１０ベクターと連結
し、λファージ系ｃＤＮＡライブラリーを構築した（実
施例７）。

【００３７】（３） スクリーニング ｐＢＲ３２２系ｃＤＮＡライブラリー由来の組換え体を
ワットマン５４１濾紙に固定し、³²Ｐで放射標識したプ
ローブ（ＩＷＱ）を用いて、コロニーハイブリダイゼー
ションを行った結果、１個のクローンが選別できた。こ
のクローンを、サザンブロッティング法（Ｓｏｕｔｈｅ
ｒｎ；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８巻５０３頁（１９７
５））を用いて更に詳細に検討したところ、プローブ
（Ａ）ともハイブリダイズした。このクローンの塩基配
列をジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ；Ｓｃｉｅｎｃｅ２１
４巻１２０５頁（１９８１））によって決定した。

【００３８】得られたｃＤＮＡインサートの塩基配列を
配列番号４に示す。配列番号４に示される如く、このｃ
ＤＮＡインサートはプローブ（ＩＷＱ）およびプローブ
（Ａ）を含む３０８塩基対からなり、実施例３(iii）に
示したアミノ酸配列を含む８３個のアミノ酸をコードす
るオープンリーディングフレームを有していることがわ
かった。この３０８塩基対を含むｐＢＲ３２２由来のプ
ラスミドを以下ｐＨＣＳ−１と略記する（実施例８）。

【００３９】ｐＨＣＳ−１から得られる３８塩基対を含
むＤＮＡ断片をニックトランスレーション法（前出、Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇを参照）にて放射標
識し、これをプローブとしてλｇｔ10由来のｃＤＮＡラ
イブラリーをプラークハイブリダイゼーション（Ｂｅｎ
ｔｏｎとＤａｖｉｓ；Ｓｃｉｅｎｃｅ１９６巻１８０頁
（１９７７）によりスクリーニングして５個のクローン
を得、ｃＤＮＡを含むと思われるクローンについてその
塩基配列を前述と同様の方法で決定した（配列番号
５）。

【００４０】配列番号５に示される如く、このｃＤＮＡ
インサートは一つの大きなオープンリーディングフレー
ムを有する。このｃＤＮＡによってコードされるアミノ
酸配列は配列番号５に示された如く演えきできる。

【００４１】実施例３（ｉ）に示されているＧ−ＣＳＦ
タンパクのＮ末端アミノ酸配列との比較により、本ｃＤ
ＮＡは５’−末端から３２〜３４ヌクレオチド位のＡＴ
Ｇ配列から始まり、１１９〜１２１位のＧＣＣ配列で終
わる９０塩基対によってコードされるシグナルペプチド
および１２２〜１２４位のＡＣＣ配列から始まり６５０
〜６５２位のＣＣＣ配列で終わる５３１塩基対によって
コードされる成熟Ｇ−ＣＳＦポリペプチドに相当する塩
基配列を含んでいることがわかった。従って配列番号６
に示されたアミノ酸配列のポリペプチドは２０７個のア
ミノ酸からなり、その分子量は２２２９２．６７ダルト
ンと計算された。同様に配列番号７に示されたアミノ酸
配列のポリペプチドは１７７個のアミノ酸からなり、そ
の分子量は１８９８６．７４ダルトンであった（実施例
９）。

【００４２】但しタンパク質の開始部位に関しては、３
２〜３４位あるいは６８〜７０位のＡＴＧも同様に考え
得る。ＥｃｏＲ１切断部位にこのｃＤＮＡ（＋ＶＳＥ）
を挿入したｐＢＲ３２２を保持するエシエリヒア・コリ
（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｘ１７７６株は、工業技術院微生物工
業技術研究所に寄託されている（ＦＥＲＭ ＢＰ−９５
４）。

【００４３】図１には、得られた遺伝子の制限酵素切断
部位を示した。また、このｃＤＮＡをｐＢＲ３２７［Ｓ
ｏｂｅｒｏｎ等；Ｇｅｎｅ９巻２８７頁（１９８０）］
とＥｃｏＲＩ部位で結合したプラスミドをｐＢＲＧ４と
称する。

【００４４】このようにして得られたｐＢＲＧ４を、制
限酵素ＥｃｏＲＩで処理して得られる約１５００塩基対
のｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片をニックトランスレーショ
ン法（前出のＭｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇを参
照）にて放射標識し、これをプローブとして、再びλｇ
ｔ１０由来のｃＤＮＡライブラリーをプラークハイブリ
ダイゼーション（前出ＢｅｎｔｏｎとＤａｖｉｓの文献
参照）によりスクリーニングした。この際、同時にλフ
ァージＤＮＡを固定したニトロセルロース濾紙を２枚作
成しておき、先に述べたプローブ（ＬＣ）にて同様のプ
ラークハイブリダイゼーションを行い、両プローブでポ
ジティブとなるファージを選別した。完全長と思われる
クローンを選別し、ジデオキシ法を用いてｃＤＮＡイン
サートの塩基配列を決定したところ配列番号８に示され
る如くであった。このｃＤＮＡは一つの大きなオープン
リーディングフレームを有し、コードされるアミノ酸配
列は配列番号８に示された如く演えきできる。

【００４５】実施例３（ｉ）に示されているＧ−ＣＳＦ
タンパクのＮ末端アミノ酸配列との比較により、本ｃＤ
ＮＡは５′−末端から３１〜３３ヌクレオチド位のＡＴ
Ｇ配列から始まり、１１８〜１２０位のＧＣＣ配列で終
わる９０塩基対によってコードされるシグナルペプチド
および１２１〜１２３位のＡＣＣ配列から始まり６４０
〜６４２位のＣＣＣ配列で終る５２２塩基対によってコ
ードされる成熟Ｇ−ＣＳＦポリペプチドに相当する塩基
配列を含んでいることがわかった。従って配列番号９に
示されたアミノ酸配列のポリペプチドは２０４個のアミ
ノ酸からなり、その分子量は２１９７７．３５ダルトン
と計算された。同様に配列番号１０に示されたアミノ酸
配列のポリペプチドは１７４個のアミノ酸からなり、そ
の分子量は１８６７１．４２ダルトンであった（実施例
１０）。但しタンパク質の開始部位に関しては、３１〜
３３位以外に５８〜６０位あるいは６７〜６９位のＡＴ
Ｇも同様に考え得る。

【００４６】ＥｃｏＲＩ切断部位に本ｃＤＮＡ（−ＶＳ
Ｅ）を挿入したｐＢＲ３２７を保持するエシェリヒア・
コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｘ１７７６株は工業技術院微生物
工業技術研究所に寄託されている（ＦＥＲＭ ＢＰ−９
５５）。図１には、得られた遺伝子の制限酵素切断部位
を示した。また、このｃＤＮＡをｐＢＲ３２７とＥｃｏ
ＲＩ部位で結合したプラスミドをｐＢＲＶ２と称する。

【００４７】（４） ヒト染色体遺伝子ライブラリーの
スクリーニング Ｍａｎｉａｔｉｓ等の記載した方法（前出Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇを参照）に従って調製されたヒ
ト染色体遺伝子ライブラリーを前述のｐＨＣＳ−１を用
いてスクリーニングした。スクリーニングに用いるプロ
ーブとしては、ｐＨＣＳ−１由来の３０８塩基対のＤＮ
Ａ断片の他、ｐＢＲＧ４由来の約１５００塩基対のＤＮ
Ａ断片やｐＢＲＶ２由来の約１５００塩基対のＤＮＡ断
片、あるいはこれ等のＤＮＡ断片の一部を含む適当な長
さのＤＮＡ断片、さらには前述のオリゴヌクレオチドプ
ローブ［（ＩＷＱ）、（Ａ）、（ＬＣ）］を用いても実
施することができる。

【００４８】ｐＨＣＳ−１由来のＤＮＡ断片をニックト
ランスレーション法［Ｒｏｏｐ等；Ｃｅｌｌ １５巻４
３１頁（１９７８）を参照］に従って［³²Ｐ］で放射標
識し、これをプローブとしてヒト染色体由来遺伝子ライ
ブラリーをプラークハイブリダイゼーション（前出のＢ
ｅｎｔｏｎとＤａｖｉｓの文献参照）によりスクリーニ
ングし、十数個のクローンを得た。得られたクローンか
らＤＮＡを回収した後、公知の方法［Ｆｒｉｔｓｃｈ
等；Ｃｅｌｌ １９巻９５９頁（１９８０）］に従って
制限酵素地図を作成した。

【００４９】次いで上記のＤＮＡプローブを用いてサザ
ン ブロッティング（前出Ｓｏｕｔｈｅｒｎの文献参
照）を行い、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで切り出される
約４キロ塩基対ＤＮＡ断片に、ヒトＧ−ＣＳＦポリペプ
チドをコードする領域が存在している可能性があること
がわかった。そこで約４キロ塩基対のＤＮＡ断片をｐＢ
Ｒ３２７のＥｃｏＲＩ部位にＥｃｏＲＩリンカーを用い
て挿入し、ｐＢＲＣＥ３βを得た。このプラスミドを塩
基配列を決定するためのＤＮＡとし、ジデオキシ法を用
いて約３キロ塩基対の塩基配列を決定したところヒトＧ
−ＣＳＦポリペプチドをコードする遺伝子であることが
判明した（図１１）。

【００５０】この約４キロ塩基対のＤＮＡ断片をＥｃｏ
ＲＩ部位に挿入したプラスミドｐＢＲ３２７（ｐＢＲＣ
Ｅ３β）を保持するＥ．ｃｏｌｉＸ１７７６株は、工業
技術院微生物工業技術研究所に寄託されている。（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−９５６）。

【００５１】配列番号５及び配列番号８に示されるｐＢ
ＲＧ４ｃＤＮＡインサートおよびｐＢＲＶ２ｃＤＮＡイ
ンサートとの比較によりこのＤＮＡ断片は、５個のエク
ソン部分を含むものでものであり、ｐＢＲＧ４およびｐ
ＢＲＶ２から演えきされるアミノ酸配列をコードするも
のであることがわかった。

【００５２】また、このＤＮＡ断片は、ヒトＧ−ＣＳＦ
ｍＲＮＡに転写されるべき前領域すなわち、ヒトＧ−Ｃ
ＳＦの染色体内遺伝子を含むものであり、さらには転写
調節に関与する塩基配列を有している［Ｂｅｎｏｉｓｔ
とＣｈａｍｂｏｎ；Ｎａｔｕｒｅ２９０巻３０４頁（１
９８１）およびＢｒｅａｔｈｎａｃｋとＣｈａｍｂｏ
ｎ；Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５０巻３４９頁
（１９８１）］。

【００５３】（５） 動物細胞用組換えベクターの構築 宿主細胞としてＣ１２７細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を使用
する場合の組換えベクター（ＢＰＶ由来）及びＣＨＯ細
胞を使用する場合の組換えベクター（ＤＨＦＲを含む）
の構築を＋ＶＳＥ系、−ＶＳＥ系ｃＤＮＡおよび染色体
由来遺伝子について各々行った。又、ＣＯＳ細胞につい
ても同様の組換えベクターの構築を行った。ここでは代
表的な例について述べるが詳しくは実施例を参照された
い。

【００５４】（Ａ）＋ＶＳＥ系組換えベクターの構築 前記（３）で得られたｃＤＮＡ（＋ＶＳＥ）断片をベク
ターｐｄＫＣＲに組み込みｐＨＧＡ４１０プラスミドと
した後（実施例１２）（図３）これをＥｃｏＲＩで部分
消化し、末端をブラントエンド（ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ）
にする。このＤＮＡにＨｉｎｄ IIIリンカーを付加し、
次いでＨｉｎｄ III処理をしＴ４ＤＮＡリガーゼ処理し
た後これで塩化ルビジウム法（前出Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ参照）を用い、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨＩ
株を形質転換した。得られたプラスミドをｐＨＧＡ４１
０（Ｈ）と命名する（図４）。ｐＨＧＡ４１０（Ｈ）を
ＳａｌＩで処理し、次いで末端をブラントエンド化した
後再びＨｉｎｄ III処理しＨｉｎｄ III−ＳａｌＩ断片
を回収する。

【００５５】一方、ウシ乳頭腫ウィルスの形質転換断片
を有するｐｄＢＰＶ−１プラスミドをＨｉｎｄ III、Ｐ
ｖｕIIで処理し大きいほうのＤＮＡ断片を分離し、これ
と先のＨｉｎｄ III−ＳａｌＩ断片を結合する。これを
用いてＥ．ｃｏｌｉ ＤＨＩ株を形質転換しｐＨＧＧ４
由来のＣＳＦ−ｃＤＮＡを有するプラスミド、ｐＴＮ−
Ｇ４を得る（図４）（実施例１３）。

【００５６】一方、ｐＨＧＡ４１０プラスミドかｐＨＧ
Ａ４１０（Ｈ）プラスミドとｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡプラ
スミドを用いてＣＨＯ細胞用組換えベクター（＋ＶＳ
Ｅ）であるｐＨＧＧ４−ｄｈｆｒを構築した（図５及び
図６）（実施例１５）。更にｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡから
ＤＨＦＲ遺伝子を含む約２ＫｂのＤＮＡ断片をＥｃｏＲ
ＩおよびＢａｍＨＩ処理により回収し、ｐＨＧＡ４１０
（Ｈ）のＨｉｎｄ III部位に挿入してｐＧ４ＤＲ１とｐ
Ｇ４ＤＲ２を構築した（図７）（実施例１５）。

【００５７】（Ｂ） −ＶＳＥ系組換えベクターの構築 前記（３）で得られたｃＤＮＡ（−ＶＳＥ）断片をベク
ターｐｄＫＣＲに組み込みｐＨＧＶ２プラスミドとした
後（実施例１８）これをＥｃｏＲＩで部分消化し、末端
をブラントエンド（ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ）にする。この
ＤＮＡにＨｉｎｄ IIIリンカーを付加し、次いでＨｉｎ
ｄ II 処理をしＴ４ＤＮＡリガーゼ処理した後、これで
塩化ルビジウム法（前出Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ参照）を用い、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨＩ株を形質転
換した。得られたプラスミドをｐＨＧＶ２（Ｈ）と命名
する（図９）。

【００５８】ｐＨＧＶ２（Ｈ）をＳａｌＩで処理し、次
いで末端をブラントエンド化した後再びＨｉｎｄ III処
理しＨｉｎｄ III−ＳａｌＩ断片を回収する一方、ウシ
乳頭腫ウィルスの形質転換断片を有するｐｄＢＰＶ−１
プラスミドをＨｉｎｄ III、Ｐｖｕ II で処理し大きい
方のＤＮＡ断片を分離し、これと先のＨｉｎｄ III−Ｓ
ａｌＩ断片を結合する。これを用いてＥ．ｃｏｌｉＤＨ
Ｉ株を形質転換しｐＨＧＶ２由来のＣＳＦ−ｃＤＮＡを
有するプラスミド、ｐＴＮ−Ｖ２を得る（図１２）（実
施例９）。

【００５９】＋ＶＳＥと同様にｐＨＧＶ２プラスミドか
ｐＨＧＶ２（Ｈ）プラスミドとｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡプ
ラスミドを用いてＣＨＯ細胞用組換えベクター（−ＶＳ
Ｅ）であるｐＨＧＶ２−ｄｈｆｒを構築した（図１０及
び１１）（実施例２１）。

【００６０】更にｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡからＤＨＦＲ遺
伝子を含む約２ＫｂのＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＢ
ａｍＨＩ処理により回収し、ｐＨＧＶ２（Ｈ）のＨｉｎ
ｄ III部位に挿入してｐＶ２ＤＲ１とｐＶ２ＤＲ２を構
築した（図１２）（実施例２１）。

【００６１】（ｃ） 染色体由来遺伝子を含む組換えベ
クターの構築 前記（４）で得られた配列番号１１で示される染色体遺
伝子を含むプラスミドｐＢＲＣＥ３βをＥｃｏＲＩで処
理した。一方Ｂａｎｅｒｊｉ等の文献（Ｃｅｌｌ ２７
巻２９９頁（１９８１））に記載されれているｐＳＶ
Ｈ⁺ Ｋ⁺ プラスミドをＫｐｎＩで処理してグロビリン遺
伝子を除き、さらにＨｉｎｄ IIIで部分消化してＳＶ４
０の後期遺伝子の一部を除いた後、再結合させて発現用
ベクターｐＭＬ−Ｅ⁺ を調製した。

【００６２】このベクターを、制限酵素ＥｃｏＲＩで処
理した後、アルカリホスファターゼ（宝酒造社製）で脱
リン酸して得られたベクターＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガー
ゼ（宝酒造社製）を加えて上記染色体ＤＮＡ断片と結合
させ、ＣＯＳ細胞用組換えベクターｐＭＬＣＥ３αを得
た（実施例２４）。図１３に示される如くこのプラスミ
ドは、ＳＶ４０遺伝子のエンハンサー、ＳＶ４０の複製
開始領域、ｐＢＲ３２２の複製開始領域およびｐＢＲ３
２２由来のβ−ラクタマーゼ遺伝子（Ａｍｐ^r）を含む
プラスミドで、ＳＶ４０遺伝子のエンハンサー下流にヒ
トＧ−ＣＳＦ染色体遺伝子が接続されている。

【００６３】Ｃ１２７細胞用の発現ベクターの構築は以
下の如くして行った。即ち、ＣＯＳ細胞での発現ベクタ
ーｐＭＬＣＥ３αより染色体由来のＣＳＦ遺伝子を含む
ＤＮＡ断片を制限酵素で切り出し、ウシ乳頭腫ウイルス
（ＢＰＶ）の複製起源を含むＤＮＡ断片およびＳＶ４０
初期プロモーターを有するＤＮＡ断片にＴ４ＤＮＡリガ
ーゼを用いて連結した。得られたｐＴＮＣＥ３αはＳＶ
４０初期プロモーターの下流に染色体由来ＣＳＦ遺伝子
が連結され、ＢＰＶの６５％部分を含む発現ベクターで
ある。

【００６４】一方、ＣＨＯ細胞用発現ベクターは、上記
と同様の染色体由来ＣＳＦ遺伝子とＳＶ４０初期プロモ
ーター部分を含むＤＮＡ断片及びｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ
由来のＤＨＦＲ遺伝子を含むＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリ
ガーゼにより連結したものである。得られたｐＴ２６Ｓ
ＶＣＥ３αはＳＶ４０プロモーター下流に染色体由来Ｃ
ＳＦ遺伝子、アデノウイルス主後期プロモーター下流に
ＤＨＦＲ遺伝子を有する発現ベクターである。

【００６５】（６） 動物細胞による形質発現 ここでは代表的な例について述べるが、その他の場合に
ついては各実施例を見られたい。 （Ａ）マウスＣ１２７細胞による形質発現 ｐＴＮ−Ｇ４プラスミドまたはｐＴＮ−Ｖ２プラスミド
をＢａｍＨＩで処理しておき、これを用いて培養増殖さ
せておいたＣ１２７細胞をリン酸−カルシウム法で形質
転換する。得られた形質転換細胞を培養しＣＳＦ生産能
の高いクローンを選別する。

【００６６】形質発現したＧ−ＣＳＦはこれらの形質転
換細胞の培養液から回収精製され、ヒト−Ｇ−ＣＳＦ活
性を示すことが確認された。又試料のアミノ酸分析及び
糖含有量分析により目的糖蛋白質の確認もなされた。
尚、糖含有分析に関しては、アミノ酸分析に用いたＣＳ
Ｆ試料をエルソン−モルガン法によるアミノ糖定量、オ
ルシノール硫酸法による中性糖の定量またチオバルビツ
ール法によるシアル酸の定量にてそれぞれ実施した。

【００６７】定量方法は生化学実験講座第４巻「糖質の
化学（下巻）」（東京化学同人）の１３章に記載されて
いる。各定量値から重量％を換算した結果、発現ベクタ
ー及び培養条件等の違いにより、得られたＧ−ＣＳＦの
糖含量は１〜２０（重量％）の範囲に分布していた。

【００６８】（Ｂ） ＣＯＳ細胞による形質発現 前記（５）−（Ｃ）で得たヒト染色体由来のＧ−ＣＳＦ
遺伝子を含むベクターｐＭＬＣＥ３αは、サルのＣＶ−
１細胞由来でＳＶ４０の複製起源（ｏｒｉｇｉｎ）欠損
変異株で形質転換されＳＶ４０の大型Ｔ抗原を表現して
いるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ等；Ｃｅｌｌ ３２巻
１７５頁（１９８１）を参照）を宿主細胞として、形質
発現をさせてみたところ、ヒトＧ−ＣＳＦ活性を示すこ
とがわかった（実施例２５）。さらにＣＯＳ細胞を回収
し、ｍＲＮＡを分析したところ配列番号５および配列番
号８に示されるアミノ酸配列それぞれに対応するｍＲＮ
Ａが存在していた。

【００６９】

【実施例】以下実施例をあげて本発明を詳細に説明する
が、その前にＣＳＦ活性の測定法について参考例で説明
しておく。

【００７０】＜参考例＞ＣＳＦ活性の測定方法 本発明において用いられたＣＳＦ活性（以下ＣＳＡと略
す）の測定方法は次のとおりである。 「ＣＳＡの測定方法」 （ａ） ヒト骨髄細胞を用いる場合：Ｂｒａｄｌｅｙ
Ｔ．Ｒ．，Ｍｅｔｃａｌｆ Ｄ．等の方法（Ａｕｓｔ．
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．４４巻２８７
〜３００頁，１９６６年）に準じて単層軟寒天培養法に
より行った。すなわちウシ胎児血清０．２ml，被検検体
０．１ml，ヒト骨髄非付着性細胞浮遊液０．１ml（１〜
２×１０⁵ 有核細胞），改変ＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ培養液
０．２ml，寒天を０．７５％含む改変ＭｃＣｏｙ´ｓ５
Ａ培養液０．４mlを混合して直径３５mmの組織培養プラ
スティックディッシュに入れて固まらせたのち、３７
℃，５％炭酸ガス／９５％空気，１００％湿度の条件で
培養を行い、１０日後に形成されたコロニー数（５０個
以上の細胞からなる集落を１コロニーとする）を数え、
１個のコロニーを形成する活性を１単位（Ｕｎｉｔ）と
してＣＳＡを求めた。

【００７１】（ｂ） マウス骨髄細胞を用いる場合：ウ
マ血清０．４ml，被検検体０．１ml，Ｃ３Ｈ／Ｈｅ（メ
ス）マウスの骨髄細胞浮遊液０．１ml（０．５〜１×１
０⁵ 有核細胞），寒天を０．７５％含む改変ＭｃＣｏ
ｙ’ｓ５Ａ培養液０．４mlを混合し直径３５mmの組織培
養用プラスティックディッシュに入れて固まらせたの
ち、３７℃，５％炭酸ガス／９５％空気、１００％湿度
の条件下にて５日間培養し、形成されたコロニー数（５
０個以上の細胞からなる集落を１コロニーとする）を数
え、１個のコロニーを形成する活性を１単位（Ｕｎｉ
ｔ）としてＣＳＡを求めた。

【００７２】尚、上記（ａ），（ｂ）の方法において用
いた「改変ＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ培養液及び（ａ）で用い
たヒト骨髄非付着性細胞浮遊液は次の如くして作成し
た。「改変ＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ培養液（２倍濃度）」Ｍ
ｃＣｏｙ’ｓ５Ａ培養液（ＧＩＢＣＯ社製）１２ｇ，Ｍ
ＥＭアミノ酸ビタミン培地（日水製薬社製）２．５５
ｇ、重炭酸ナトリウム２．１８ｇ，ペニシリンＧカリウ
ム５００００単位を２回蒸溜水５００mlに溶解後、０．
２２μｍのミリポアフィルターにて濾過滅菌を行った。

【００７３】「ヒト骨髄非付着性細胞浮遊液」健常人胸
骨せん刺により得た骨髄液をＲＰＭＩ １６４０培養液
にて５倍に希釈し、Ｆｉｃｏｌ−Ｐａｑｕｅ液（ファル
マシア社製）に重層し、４００×ｇ，３０分，２５℃に
て遠心を行い、界面の細胞層（比重＜１．０７７）を回
収する。この細胞を洗浄後、２０％ウシ胎児血清を含む
ＲＰＭＩ １６４０培養液にて５×１０⁶ Ｃｅｌｌ／ml
の濃度に調整し、２５cm² の組織培養用プラスチックフ
ラスコに入れ、炭酸ガス培養器にて３０分間インキュベ
ートしたのち、上清の非付着性細胞を回収し、再度２５
cm² プラスチックフラスコに入れ、２時間３０分インキ
ュベートしたのち、上清の非付着性細胞を集めて用い
た。

【００７４】実施例１ 「ＣＨＵ−２」の樹立 著明な好中球の増多が認められた口腔底癌患者の腫瘍を
ｎｕ／ｎｕマウスに移植した。この腫瘍は移植約１０日
後に著明な腫瘍の増大と好中球の増多が認められた。こ
の腫瘍を移植１２日後に無菌的に摘出し、１〜２mm³ 角
に細切し、これを以下の如く培養した。上記細切した腫
瘍塊１０〜１５片を５０mlのプラスチック遠心管に入
れ、５mlのトリプシン溶液（トリプシン０．２５％，Ｅ
ＤＴＡ ０．０２％含む）を加え、３７℃の温浴中で１
０分間振とうしたのち上清を捨て、再度、同トリプシン
溶液５mlを加え、３７℃で１５分間撹拌しながらトリプ
シン消化を行った。上清の細胞浮遊液を回収し、ウシ胎
児血清を１ml加えてトリプシンの作用を止めたのち氷中
に保存した。

【００７５】以上の操作を再度行い細胞浮遊液を回収
し、前回の分と合わせて１，５００ｒ．ｐ．ｍ．１０分
間の遠心により細胞ペレットを得た。この細胞ペレット
をウシ胎児血清を１０％含むＦ−１０にて２回洗浄した
のち、２５cm² のプラスチック培養フラスコに細胞濃度
５×１０⁶ 個／フラスコになるようにして植え込んだ。
ウシ胎児血清を１０％含有するＦ−１０培養液を用い、
炭酸ガスインキュベーター（炭酸ガス濃度５％，湿度１
００％）中にて一晩インキュベートしたのち、上清を非
付着細胞と共に除去し、新しい培養液を加えて培養を継
続した。

【００７６】培養開始後６日目に細胞がいっぱいに増殖
したので、この時点で培養液を新しいものに替えた。翌
日、この培養液を捨て、ＲＰＭＩ １６４０で５倍希釈
した抗マウス赤血球抗体（Ｃａｐｐｅｌ社製）２mlと同
じくＲＰＭＩ １６４０で２．５倍希釈したモルモット
補体（極東製薬社製）２mlを加え３７℃，２０分間イン
キュベートした。インキュベーション終了後ウシ胎児血
清を１０％含むＦ−１０にて２回洗浄しｎｕ／ｎｕマウ
ス由来のフィブロブラストを除去し引き続きウシ胎児血
清を１０％含むＦ−１０培養液を加えて、さらに２日間
培養を行った後細胞の一部を取り出し限界希釈法により
クローニングを行った。得られた１１個のクローンにつ
いてＣＳＦ活性を調べたところ、他のものよりも約１０
倍高い活性を示すクローン（ＣＨＵ−２）が得られた。

【００７７】実施例２ ＣＳＦの単離 上述の如くして樹立された細胞が完全に密に増殖した１
５０cm² の培養フラスコ２本より細胞を回収し、これを
ウシ胎児血清を１０％含有するＦ−１０培養液５００ml
に浮遊させたのち、１５８０cm² のガラス製ローラーボ
トル（Ｂｅｌｃｏ社製）に移し、０．５ｒ．ｐ．ｍ．の
速度で回転培養を行った。細胞がローラーボトルの内壁
に完全に密に増殖した時点で培養液を血清を含まないＲ
ＰＭＩ１６４０に交換し、４日間培養したのち培養上清
を回収し、ウシ胎児血清を１０％含有するＦ−１０を加
えて培養を続行する。

【００７８】３日間培養したのち再び血清を含まないＲ
ＰＭＩ １６４０に液替を行い、４日後に培養上清を回
収した。以下同様の操作をくり返すことにより、毎週１
ボトルより５００mlずつの血清を含まない培養上清が得
られ、しかもこの方法によりかなり長期間にわたって細
胞を維持し、培養上清を回収することが可能であった。
得られた培養上清５l を１バッチとし、これに０．０１
％ツィーン２０を添加後Ｈｏｌｌｏｗ ＦｉｂｅｒＤＣ
−４およびＡｍｉｃｏｎ ＰＭ−１０（アミコン社製）
を用いた限外濾過法により約１０００倍に濃縮したの
ち、これを以下の順序で精製した。

【００７９】（ｉ） 直径４．６cm，長さ９０cmのＵｌ
ｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ ５４カラム（ＬＫＢ社製）を用
い、０．１５Ｍ ＮａＣｌ及び０．０１％ツィーン２０
（半井化学社製）を含む０．０１Ｍトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．４）を用いて前記濃縮した培養上清５mlを流
速約５０ml／時間でゲル濾過した。尚カラムはあらかじ
めウシ血清アルブミン（分子量６７，０００），オボア
ルブミン（分子量４５，０００），チトクロームＣ（分
子量１２，４００）にてキャリブレーションを行った。
ゲル濾過終了後各フラクションより０．１mlずつを採取
し、１０倍に希釈した後、前述した「ＣＳＡの測定方法
（ｂ）」により活性を示す画分を調べた。この結果、先
ずＶｅ＝４００〜７００mlの画分がマクロファージ優位
のＣＳＡを示し、Ｖｅ＝８００〜１２００mlの画分が顆
粒球優位のＣＳＡを示すことがわかったので、後者の画
分を集めＰＭ−１０（アミコン社製）を用いる限外濾過
器によって約５mlに濃縮した。

【００８０】（ｉｉ） 上記濃縮画分にｎ−プロパノー
ル（東京化成社製，アミノ酸配列決定用）を３０％含む
０．１％トリフルオロ酢酸水溶液を添加し、氷中に１５
分程度放置したのち、１５，０００ｒ．ｐ．ｍ．１０分
の遠心により沈澱を除去した。次いで先のｎ−プロパノ
ールおよびトリフルオロ酢酸を含む水溶液で平衡化した
μＢｏｎｄａｐａｋ Ｃ １８カラム（Ｗａｔｅｒｓ社
製、セミ分取用，８mm×３０cm）に吸着後、３０〜６０
％の直線濃度勾配のｎ−プロパノールを含む０．１％ト
リフルオロ酢酸水溶液で順次溶出した。高速液体クロマ
ト装置は日立６８５−５０型を、検出は日立６３８−４
１型検出器（いずれも日立製作所製）を用い、２２０ｎ
ｍと２８０ｎｍの吸収を同時に測定した。溶出後、各画
分より１０μl を分取１００倍希釈したのち、前述の
「ＣＳＡの測定法（ｂ）」により活性を示す画分を調べ
た。この結果、ｎ−プロパノール４０％にて溶出される
ピークに活性が認められたので、このピークを集め再度
同じ条件で再クロマトを行い上記と同様にしてＣＳＡを
調べたところ、やはりｎ−プロパノール４０％の位置の
ピークに活性が認められたので、このピークを集め（４
フラクション＝４ml）凍結乾燥した。

【００８１】（ｉｉｉ） 上記凍結乾燥粉末をｎ−プロ
パノールを４０％含む０．１％トリフルオロ酢酸水溶液
２００μl に溶解し、ＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷカラム
（東洋曹達社製，７．５mm×６０cm）を用いた高速液体
クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）にかけた。溶出は同水溶
液により０．４ml／分の流速で行い、フラクションコレ
クターＦＲＡＣ−１００（ファルマシア社製）により
０．４mlずつ分取した。分取した各画分についてＣＳＡ
を前記と同様にして調べた結果、保持時間が３７〜３８
分の画分（分子量約２万に相当）に活性が認められたの
で、この画分を回収し、更に分析用μＢｏｎｄａｐａｋ
Ｃ１８カラム（４．６mm×３０cm）による精製を施し
たのち、メインピークを回収し凍結乾燥した。得られた
標品について前述の「ＣＳＡの測定方法（ａ）」によっ
て検定したところヒトＧ−ＣＳＦ活性を有することを認
めた。

【００８２】実施例３ アミノ酸配列の決定 （ｉ） Ｎ末端アミノ酸配列の決定 試料を気相式シークエンサー（アプライドバイオシステ
ム社製）を用いてエドマン（Ｅｄｍａｎ）分解し、得ら
れたＰＴＨアミノ酸を高速液体クロマトグラフィー装置
（ベックマン・インストルメンツ社製）およびＵｌｔｒ
ａｓｐｈｅｒｅ−ＯＤＳカラム（ベックマン・インスト
ルメンツ社製）を用いて常法により分析した。カラム
（５μｍ，直径４．６mm，長さ２５０mm）を開始緩衝液
（１５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．５，４０％ア
セトニトリルを含む水溶液）にて平衡化したのち、検体
（２０μl の開始緩衝液にて溶解）を注入して開始緩衝
液によるイソクラティック溶出により分離を行った。流
速は１．４ml／分、カラム温度は４０℃に保持した。

【００８３】ＰＴＨアミノ酸の検出は２６９ｎｍと３２
０ｎｍの紫外部吸収を利用した。あらかじめ標準ＰＴＨ
アミノ酸（シグマ社製）各２ｎｍｏｌを同一の系で分離
して保持時間を決定し、被検検体の保持時間から同定を
行った。この結果、Ｎ末端から４０残基目までのアミノ
酸配列は次の如く決定された。

【００８４】Ｈ₂ Ｎ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ
−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−
Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｃ
ｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｙ
ｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｌａ
−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−
Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−

【００８５】（ｉｉ） ブロムシアン分解 試料を７０％ギ酸に溶かし、昇華精製したブロムシアン
２００当量を加えて、３７℃で一夜反応させた。次に反
応物を凍結乾燥後、ＴＳＫ Ｇ３０００ＳＷカラム（東
洋曹達社製）を用いたＨＰＬＣで分画し４つのピークを
得た。ピークを分子量の大きい順にＣＮ−１，ＣＮ−
２，ＣＮ−３，ＣＮ−４と命名し、収率のよいＣＮ−
１，ＣＮ−２についてアミノ酸配列を自動気相式シーク
エンサー（アプライドバイオシステム社製）を用いて
（ｉ）と同様の条件で分析した。その結果、ＣＮ−１は
Ｇ−ＣＳＦタンパクのＮ末端からのペプチドであること
がわかった。さらにＣＮ−２は以下のアミノ酸配列を有
していた。 Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐ
ｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ
−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−

【００８６】（ｉｉｉ） トリプシン分解 試料を８Ｍ尿素を含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．４）に溶かし、０．１％２−メルカプトエタノール
を含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）を加え
て最終的に２Ｍの尿素となるように調整した。次いで試
料と酵素が５０：１となるようにＴＰＣＫ処理トリプシ
ン（シグマ社製商品名）を加え、２５℃で４時間反応さ
せた後、さらに同量のＴＰＣＫ処理トリプシンを加え
て、再度２５℃で１６時間反応させた。反応後、反応物
をＣ８カラム（山村化学社製）を用いた高速逆相カラム
クロマトグラフィーに付した。溶出は０．１％ＴＦＡを
含むｎ−プロパノールを用い、ｎ−プロパノール濃度を
５％〜６０％に直線的に上げて行った。２８０ｎｍの紫
外部吸収を測定して得られたピークのうち、メインピー
クについて（ｉ）と同条件下に自動気相式シークエンサ
ー（アプライドバイオシステム社製）を用いてアミノ酸
配列を分析した。その結果、メインピークは（ｉｉ）の
ＣＮ−２断片の一部を含む以下の配列を有するペプチド
であることがわかった。

【００８７】Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ａｌａ
−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−
Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌ
ｅｕ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅ
ｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ａｌａ
−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−

【００８８】実施例４ ＤＮＡプローブの作成 （ｉ） プローブ（ＩＷＱ）の合成 実施例３（ｉｉｉ）で得られたアミノ酸配列の中からＩ
ｌｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌ
ｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔで示される１０個のアミノ
酸の配列に基づいて、３０個の連続するヌクレオチドを
得た（配列番号１）。配列番号１の配列に於いて、例え
ば５’−末端から９位のヌクレオチドはｄＡおよびｄＧ
を等量含む混合物であることを示す。原料のヌクレオチ
ドは主にダイマーを使用し、必要に応じて随時モノヌク
レオチドも使用した。グラスフィルター付きカラムに出
発原料のヌクレオチド樹脂Ａｐ−ｄ（Ｇ）（ヤマサ醤油
社製）２０mgを入れ塩化メチレンにて洗浄を繰り返した
後、３％トリクロロ酢酸を含む塩化メチレン溶液にて、
４，４’−ジメトキシトリチル基を脱離せしめ、次いで
１mlの塩化メチレンでカラムを数回洗浄した。

【００８９】無水ピリジンで洗浄して溶媒を置換したの
ちヌクレオチドダイマー（ＤＭＴｒ）ＡｐＴｐ（ＮＨＲ
₃ )(日本ゼオン社製；ＮＨＲ₃ はトリエチルアンモニウ
ム，ＤＭＴｒはジメトキシトリチルを示す）２０mgと
０．２mlのピリジンを加えて真空ポンプにてカラム内を
真空乾燥した。次いで、２，４，６−トリメチルベンゼ
ンスルホニル−３−ニトロトリアゾリド（ＭＳＮＴ，和
光純薬社製）２０mgと無水ピリジン０．２mlを加えた
後、カラム内を窒素ガスで置換して、室温下に４５分間
時々振とうさせることによってヌクレオチド樹脂とダイ
マーを縮合させた。反応終了後、ピリジンにてカラムを
洗浄し、次いで未反応のＯＨ基を過剰の無水酢酸と４−
ジメチルアミノピリジンを含むピリジン溶液にてアセチ
ル化した後、再びカラムをピリジンで洗浄した。

【００９０】以下同様に、（ＤＭＴｒ）Ｉｐ（ＮＨ
Ｒ₃ ），（ＤＭＴｒ）ＧｐＧｐ（ＮＨＲ₃ ），（ＤＭＴ
ｒ）Ｉｐ（ＮＨＲ₃ ），（ＤＭＴｒ）ＣｐＴｐ（ＮＨＲ
₃ ）と（ＤＭＴｒ）ＴｐＴｐ（ＮＨＲ₃ ）の等量混合
物，（ＤＭＴｒ）ＡｐＡｐ（ＮＨＲ₃ ）と（ＤＭＴｒ）
ＡｐＧｐ（ＮＨＲ₃ ）の等量混合物，（ＤＭＴｒ）Ａｐ
Ｇｐ（ＮＨＲ₃ ）と（ＤＭＴｒ）ＧｐＧｐ（ＮＨＲ₃ ）
の等量混合物，（ＤＭＴｒ）ＧｐＡｐ（ＮＨＲ₃ ），
（ＤＭＴｒ）ＴｐＧｐ（ＮＨＲ₃ ），（ＤＭＴｒ）Ａｐ
Ａｐ（ＮＨＲ₃ ）と（ＤＭＴｒ）ＧｐＡｐ（ＮＨＲ₃ ）
の等量混合物，（ＤＭＴｒ）ＣｐＡｐ（ＮＨＲ₃ ），
（ＤＭＴｒ）ＡｐＡｐ（ＮＨＲ₃ ）と（ＤＭＴｒ）Ａｐ
Ｇｐ（ＮＨＲ₃ ）との等量混合物，（ＤＭＴｒ）ＧｐＣ
ｐ（ＮＨＲ₃ ），（ＤＭｔｒ）ＴｐＧｐ（ＮＨＲ₃ ），
（ＤＭＴｒ）Ｉｐ（ＮＨＲ₃ ）（ＤＭＴｒ）ＡｐＴｐ
（ＮＨＲ₃ ） ［（ＤＭＴｒ）Ｉｐ（ＮＨＲ₃ ）はヤマサ醤油社製，そ
の他は全て日本ゼオン社製］の順で、前述の操作を繰り
返すことによって縮合させた。

【００９１】最終段階の反応終了後、アセチル化するこ
となしに、ピリジン，塩化メチレン，エーテルの順で樹
脂を洗浄した後、乾燥させた。乾燥させた樹脂を１Ｍテ
トラメチルグアニジンおよび１Ｍα−ピコリンアルドキ
シムを含むジオキサン１ml，ピリジン０．５ml，水０．
２mlの混合液１．７mlに懸濁した後、一夜室温にて放置
した後、１００〜２００μl まで減圧濃縮した。この濃
縮液に少量（２〜３滴）のピリジンを加えた後、濃アン
モニア水２〜３mlを加え５５℃で６時間加温した。次い
で酢酸エチルを加えて抽出分離し、得られた水層を減圧
濃縮した後、５０ｍＭトリエチルアンモニウム酢酸溶液
（ｐＨ７．０）に溶解せしめてＣ−１８カラム（１.0×
１５cm，Ｗａｔｅｒｓ社製）を用いたカラムクロマトグ
ラフィーに付した。溶出は、５０ｍＭトリエチルアンモ
ニウム酢酸溶液（ｐＨ７．０）中１０％〜３０％の直線
濃度勾配のアセトニトリルで行い、アセトニトリル濃度
が２５％付近の位置で溶出されるピーク画分を減圧濃縮
した。

【００９２】この濃縮液に８０％酢酸を加えて室温下に
３０分間放置した後、酢酸エチルを加えて抽出・分離し
得られた水層を減圧下に濃縮した。得られた濃縮液は、
Ｃ１８カラム（センシュー科学社製，ＳＳＣ−ＯＤＳ−
２７２，６φ×２００mm）を用いた高速液体クロマトグ
ラフィーに付して、さらに精製した。溶出は５０ｍＭト
リエチルアンモニウム酢酸溶液（ｐＨ７．０）中１０％
〜２０％の直線濃度勾配のアセトニトリルを用いて行
い、１０Ａ₂₆₀ ｕｎｉｔｓ以上の収量で合成ＤＮＡが得
られた。

【００９３】（ｉｉ） プローブ（Ａ）の合成 実施例３（ｉｉｉ）で得られたアミノ酸配列の中からＭ
ｅｔ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｌａで示される５個
のアミノ酸の配列に基づいて１４個の連続するヌクレオ
チドを得た（配列番号２）。

【００９４】合成は、プローブ（ＩＷＱ）と同様な方法
で行いヌクレオチド樹脂ＡＰ−ｄ；（ＤＭＴｒ）ＣｐＡ
ｐ（ＮＨＲ₃ ），（ＤＭＴｒ）ＣｐＴｐ（ＮＨＲ₃ ），
（ＤＭＴｒ）ＣｐＧｐ（ＮＨＲ₃ ）および（ＤＭＴｒ）
ＣｐＣｐ（ＮＨＲ₃ ）の等量混合物；（ＤＭＴｒ）Ａｐ
Ｇｐ（ＮＨＲ₃ ），（ＤＭＴｒ）ＴｐＧｐ（ＮＨ
Ｒ₃），（ＤＭＴｒ）ＧｐＧｐ（ＮＨＲ₃ ）および（Ｄ
ＭＴｒ）ＣｐＧｐ（ＮＨＲ₃）の等量混合物；（ＤＭＴ
ｒ）ＡｐＡｐ（ＮＨＲ₃ ）；（ＤＭＴｒ）ＣｐＡｐ（Ｎ
ＨＲ₃ ）と（ＤＭＴｒ）ＣｐＧｐ（ＮＨＲ₃ ）の等量混
合物；（ＤＭＴｒ）Ｇｐ（ＮＨＲ₃ ）（いずれも日本ゼ
オン社製）の順に縮合させて約１０Ａ₂₆₀ ｕｎｉｔｓの
合成ＤＮＡを得た。得られたオリゴヌクレオチドの塩基
配列をＭａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法により調べたとこ
ろ配列番号２に示された塩基配列を有していることが確
認された。

【００９５】（ｉｉｉ） プローブ（ＬＣ）の合成 アプライドバイオシステム社のＤＮＡ合成機３８０Ａに
より、自動合成を行った。この方法はＣａｒｕｔｈｅｒ
ｓ等の記載した原理（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１
０３巻３１８５頁（１９８１））に基づいており、ホス
ホアミダイト法と称されている。

【００９６】５’のジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ）
を脱保護したｄＧ−Ｓ（Ｓは支持体）にテトラゾールで
予め活性化した（ＤＭＴｒ）−ｄＴのホスホアミダイト
体を縮合させた後、未反応の水酸基をアセチル化し、次
いで水存在下でヨウ素酸化を行ってリン酸体に導いた。
ＤＭＴｒ基を脱保護し、以後同様に縮合を繰り返して配
列番号３に示される如き配列の２４個のヌクレオチドを
合成した。得られたヌクレオチドを支持体から開裂せし
め脱保護した後、Ｃ１８カラム（センシュー科学社製Ｓ
ＳＣ−ＯＤＳ−２７２）を用いた逆相系高速液体クロマ
トグラフィーにて精製した。

【００９７】実施例５ ＣＨＵ−２細胞の培養とｍＲＮ
Ａの精製 １） ＣＨＵ−２細胞の培養と細胞の回収 樹立されたＣＨＵ−２細胞を１５０cm² の培養フラスコ
２本に完全に密に増殖させた後、これをウシ胎児血清を
１０％含有するＲＰＭＩ １６４０培養液５００mlに浮
遊させたのち、１５８０cm² のガラス製ローラーボトル
（Ｂｅｌｃｏ社製）に移し、０．５ｒ．ｐ．ｍ．の速度
で４日間回転培養を行った。細胞がローラーボトルの内
壁に完全に密に増殖した時点で、ローラーボトルから培
養液を除き、あらかじめ３７℃に加温したＥＤＴＡを
０．０２％含む生理食塩水１００mlを加え、３７℃で２
分間加温後、ピペット操作にて細胞をはく離せしめた。
得られた細胞懸濁液を１５００ｒ．ｐ．ｍ．１０分間の
遠心にて細胞ペレットを得る。細胞をＥＤＴＡを含まな
い生理食塩水５mlに再び懸濁し、１５００ｒ．ｐ．ｍ．
１０分間遠心にて細胞ペレットを得た（湿重量約０．８
ｇ）、このようにして得られた細胞はＲＮＡ抽出操作を
行うまで−８０℃にて凍結保存する。

【００９８】２） ｍＲＮＡの精製 上記の如くして得られたＣＨＵ−２細胞からのｍＲＮＡ
の単離は本質的に“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎ
ｇ”［Ｍａｎｉａｔｉｓ等，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ，１９６頁（１９８２）］に記載されてい
るようにして実施した。凍結保存されていたＣＨＵ−２
細胞（湿重量３．８ｇ）に２０mlの６Ｍグアニジン溶液
（６Ｍグアニジンチオシアナート，５ｍＭクエン酸ナト
リウム（ｐＨ７．０），０．１Ｍ β−メルカプトエタ
ノール，０．５％ザルコシル硫酸ナトリウム）に懸濁
し、Ｖｏｒｔｅｘミキサーにて２〜３分よく混合した
後、１８Ｇの注射針を装てんした２０ml容の注射器を用
いて１０回吸入排出を繰り返した。

【００９９】ベックマン社製ＳＷ４０Ｔｉローターに合
うポリアロマー製の遠心チューブに６mlの５．７Ｍ Ｃ
ｓＣｌ−０．１Ｍ ＥＤＴＡ，（ｐＨ７．５）を先に加
えておき、チューブが満たされるように上述の細胞が壊
れて粘稠になったグアニジン溶液約６mlを重層した。こ
のようにして調製された遠心チューブ４本を３０，００
０ｒ．ｐ．ｍ．、２０℃で１５時間遠心した後、得られ
たペレットを少量の７０％エタノールを用いて３回洗浄
した。

【０１００】各々のチューブから得られたペレットを合
して５５０μl の水に溶解せしめＮａＣｌ濃度が０．２
Ｍとなるように調整したのち、フェノールークロロホル
ム（１：１）処理、クロロホルム処理後、２．５倍容量
のエタノールを加えてエタノール沈澱を行い全ＲＮＡを
得た（湿細胞３．８ｇより全ＲＮＡ約１０．１mgを得
た）。

【０１０１】全ＲＮＡからポリ（Ａ⁺ ）−ＲＮＡの精製
は以下の如く行った。この方法はｍＲＮＡが３′末端に
ポリＡ鎖を付加していることを利用したアフィニティー
クロマトグラフィーである。オリゴ（ｄＴ）−セルロー
ス（Ｐ−Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製Ｔｙｐｅ
７）を用い、吸着は全ＲＮＡを吸着緩衝液（１０ｍＭト
リスー塩酸（ｐＨ７．５），０．５Ｍ ＮａＣｌ，１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ，０．１％ＳＤＳ溶液を含む）に溶解し、
６５℃で５分間加熱した後、同溶液にて充てんされたオ
リゴ（ｄＴ）−セルロースカラムに通過させて行い、溶
出はＴＥ溶液（１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、
１ｍＭ ＥＤＴＡを含む）で行った。未吸着通過液は再
び同カラムに通して同様に溶出操作を行い、１回目の溶
出液と混合した。このような操作を用いて、ポリ
（Ａ⁺ ）−ＲＮＡ４００μｇを得た。

【０１０２】このようにして調製したｍＲＮＡをＳｃｈ
ｌｅｉｆとＷｅｎｓｉｎｋの実験技術書（Ｐｒａｃｔｉ
ｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｈｅｉｄｅｒｂｅｒｇ，Ｂｅｒｌｉ
ｎ，（１９８１））中に記載されている方法と同様の操
作で、ショ糖密度勾配遠心法によりサイズ分画した。

【０１０３】すなわち、ＳＷ４０Ｔｉローター（Ｂｅｃ
ｋｍａｎ社製）用チューブに５％〜２５％のショ糖密度
勾配を作る。ショ糖溶液は０．１Ｍ ＮａＣｌ，１０ｍ
Ｍトリス−塩酸（ｐＨ７．５），１ｍＭ ＥＤＴＡ，
０．５％ＳＤＳの溶液にそれぞれ５％、２５％の割合い
でＲＮａｓｅフリーのショ糖（Ｓｃｈｗａｒｚ／Ｍａｎ
ｎ社製）を含んでいる。

【０１０４】上記で述べた如き方法で調製したｍＲＮＡ
（ポリ（Ａ⁺ ）−ＲＮＡ）８００μｇを２００μl 〜５
００μl のＴＥ溶液に溶解せしめ、６５℃で５分間加熱
後急冷した後、ショ糖密度勾配液の上にのせる。３００
００ｒ．ｐ．ｍ．にて20時間遠心後０．５mlずつの分画
を集め２６０ｎｍの吸光度を測り、同様に行った標準Ｒ
ＮＡ（２８Ｓ，１８Ｓ，５ＳのリボソームＲＮＡ）の位
置に基づいて、分画されたＲＮＡのサイズを決めると同
時に各分画のＧ−ＣＳＦ活性をアフリカツメガエル（Ｘ
ｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞系を用いて調
べた。

【０１０５】すなわち各分画のｍＲＮＡを１μｇ／μl
の濃度の水溶液に調製し、ツメガエル（生後約１年）か
ら取り出した卵母細胞１個に５０ｎｇのｍＲＮＡの割合
いで注入した後、96穴のマイクロタイタープレートの１
穴に卵母細胞を１０個ずつ入れ、それぞれ１００μl の
バース培地（８８ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＫＣｌ，
２．４ｍＭ ＮａＨＣＯ₃ ，０．８２ｍＭ ＭｇＳ
Ｏ₄ ，０．３３ｍＭ Ｃａ（ＮＯ₃ ）₂ ，０．４１ｍＭ
ＣａＣｌ₂ ，７．５ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．
６），ペニシリン１０mg／l ，ストレプトマイシン硫酸
１０mg／l ）中で４８時間室温で培養した後上清を回収
し、濃縮・精製してＧ−ＣＳＦ活性を測定する。この結
果、１５〜１７Ｓ画分にＧ−ＣＳＦ活性が認められた。

【０１０６】実施例６ ｃＤＮＡの合成（ｐＢＲ系ｃＤ
ＮＡライブラリーの構築） 前述の方法で得られたポリ（Ａ⁺ ）−ＲＮＡからＬａｎ
ｄ等の方法［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，
９巻２２５１頁（１９８１）］に基づき、Ｇｕｂｌｅｒ
とＨｏｆｆｍａｎの方法［Ｇｅｎｅ，２５巻 ２６３頁
（１９８３）］を加味してｃＤＮＡを合成した。

【０１０７】１） １本鎖ｃＤＮＡの合成 エッペンドルフ社製１．５ml容チューブに以下の如くの
順序で試薬を入れる。８０μl の反応緩衝液（５００ｍ
Ｍ ＫＣl ，５０ｍＭ ＭｇＣl ₂ ，２５０ｍＭトリス
−塩酸，ｐＨ８．３），２０μl の２００ ｍＭジチオ
スレイトール，３２μl の１２．５ｍＭ ｄＮＴＰ（ｄ
ＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰを各々１２．５
ｍＭ含む），１０μl のα−³²Ｐ−ｄＣＴＰ（アマシャ
ム製，ＰＢ １０２０５），３２μl のオリゴ（ｄＴ）
_12-18 （Ｐ−Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製，５０
０μｇ／ml），２０μl のポリ（Ａ⁺ ）−ＲＮＡ（２．
１μｇ／μl ），蒸溜水２０６μl の計４００μl の反
応液を６５℃で５分間加熱後、４２℃で５分間加温す
る。

【０１０８】この反応液に逆転写酵素（宝酒造製）１２
０単位を加え、さらに４２℃、２時間反応させた後、Ｒ
Ｎａｓｅインヒビター（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）２μl 、２０μ
l のＴＥ溶液、１６μl の１００ｍＭピロリン酸ナトリ
ウム、４８単位（４μl ）の逆転写酵素を追加して、今
度は４６℃２時間反応せしめた。０．５Ｍ ＥＤＴＡ
８μl ，１０％ＳＤＳ８μl を加えて反応を停止させた
後、フェノールークロロホルム処理、エタノール沈澱
（２回）を行い一本鎖ｃＤＮＡを得た。

【０１０９】２） １本鎖ｃＤＮＡへのｄＣ−鎖付加 上記で得られた一本鎖ｃＤＮＡを６０μl の蒸溜水に溶
解後、６０μl のｄＣ−鎖付加緩衝液（４００ｍＭカコ
ジル酸カリウム；５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ６．
９）；４ｍＭジチオスレイトール；１ｍＭ ＣｏＣ
ｌ₂ ；１ｍＭ ｄＣＴＰ）に加え、３７℃で５分間加温
した。この反応液にターミナルトランスフェラーゼ（２
７ｕｎｉｔ／μl ，Ｐ−Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ
社製）３μl を加えて３７℃で２．５分間反応した後、
フェノールークロロホルム処理（１回）、およびエタノ
ール沈澱（２回）を行い、１００ｍＭ ＮａＣｌを含む
ＴＥ溶液４０μl に溶解せしめた。

【０１１０】３） ２本鎖ｃＤＮＡの合成 上記４０μl のＤＮＡ溶液に４μl のオリゴ（ｄＧ）
_12-18 （２００μｇ／ml，Ｐ−Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａｌｓ社製）を加え６５℃５分間、続いて４２℃で３０
分間加温した後、反応液を０℃に保った。

【０１１１】この反応液に緩衝液８０μl （１００ｍＭ
トリス−塩酸、ｐＨ７．５，２０ｍＭＭｇＣｌ₂ ，５０
ｍＭ（ＮＨ₄ ）₂ ＳＯ₄ ，５００ｍＭ ＫＣｌ），４μ
l の４ｍＭ ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴ
Ｐ，ｄＴＴＰを各々４ｍＭ含む）、６０μl の１ｍＭ
β−ＮＡＤ及び２１０μl の蒸溜水、２０μl のＥ．ｃ
ｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ（宝酒造社製）、１５μ
l のＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）、１
５μl のＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅ Ｈ（宝酒造社製）
を加え１２℃にて１時間反応させた後、さらに４μl の
４ｍＭｄＮＴＰを追加し、２５℃で１時間反応して、フ
ェノールークロロホルム処理、エタノール沈澱（１回）
を行って、約８μｇの２本鎖ｃＤＮＡを得た。この２本
鎖ｃＤＮＡをＴＥ溶液に溶解せしめ、１．２％アガロー
スゲル電気泳動を行い、約５６０塩基対（ｂｐ）〜２キ
ロ塩基対（Ｋｂｐ）の大きさに相当する部分をワットマ
ンＤＥ８１（ワットマン社製）に吸着させ溶出回収した
ところ、約０．２μｇが回収された。

【０１１２】４） ２本鎖ｃＤＮＡへのｄＣ−鎖付加 上記の如く得られた２本鎖ｃＤＮＡを４０μl のＴＥ溶
液に溶解し、２）の項で述べたｄＣ−鎖付加緩衝液８μ
l を加え３７℃で２分間加温した後、１μl のターミナ
ルトランスフェラーゼ（２７ｕｎｉｔ／μl ）を加えて
３７℃で３分間反応せしめた。反応液を直ちに０℃に冷
却し０．５Ｍ ＥＤＴＡ１μl を加えて反応を停止した
後、フェノールークロロホルム処理、エタノール沈澱を
行い、得られた沈澱をＴＥ溶液１０μl に懸濁した。

【０１１３】５） ｐＢＲ系ｃＤＮＡライブラリーの構
築 市販のオリゴ（ｄＧ）鎖付加ｐＢＲ３２２ベクター（ベ
セスダリサーチラボラトリーズ社製、１０ｎｇ／μl ）
４μl と上記ｄＣ−鎖付加２本鎖ｃＤＮＡ２μl を７５
μl の０．１Ｍ ＮａＣｌを含むＴＥ溶液の中でアニー
ルさせた。アニールは６５℃、５分加温した後４０℃に
て２時間加温、その後、室温になるまで放置して行っ
た。

【０１１４】一方、Ｍａｎｉａｔｉｓらの実験書［Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ２４９頁（１９８２）］に記載
されている方法等を用いて大腸菌Ｘ１７７６株からコン
ピテント細胞を調製し、上記アニールされたプラスミド
により形質転換を行い、トランスフォーマント（形質転
換体）が得られた。

【０１１５】実施例７ ｃＤＮＡ合成（λファージ系ラ
イブラリーの構築） １） １本鎖ｃＤＮＡの合成 実施例５で述べた方法に従って３．８ｇの凍結保存ＣＨ
Ｕ−２細胞から２回オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムに
よる精製を経て４００μｇのポリ（Ａ⁺ ）−ＲＮＡを得
た。このポリ（Ａ⁺ ）−ＲＮＡ１２μg を溶解したＴＥ
溶液１０μl を１０μｇのアクチノマイシンＤ（シグマ
社製）を含む反応チューブに入れた後、以下の順序で試
薬類を加えた；２０μl の逆転写緩衝液（２５０ｍＭト
リス−塩酸（ｐＨ８．３），４０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ ，２
５０ｍＭ ＫＣｌ），２０μl の５ｍＭ ｄＮＴＰ（ｄ
ＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰを各々５ｍＭ含
む）、２０μlのオリゴ（ｄＴ）_12-18 （０．２μｇ／m
l Ｐ−Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製），１μl
の１Ｍジチオスレイトール，２μl の３０ｕｎｉｔ／μ
l のＲＮａｓｉｎ（プロメガバイオテク社），１０μl
の逆転写酵素（１０ｕｎｉｔ／μl 生化学工業社製），
１μl のα−［³²ｐ］ｄＡＴＰ（１０μＣｉアマシャム
社製），１６μl の水で計１００μl の液量の反応液に
なる。反応液を４２℃で２時間保った後、５μl の０．
５Ｍ ＥＤＴＡ及び１μl の２０％ＳＤＳを加えて反応
を停止した。フェノールークロロホルム（１００μl ）
処理、エタノール沈澱（２回）を行って約４μｇの１本
鎖 ｃＤＮＡを得た。

【０１１６】２） ２本鎖ｃＤＮＡの合成 上記の如く得られたｃＤＮＡを２９μl のＴＥ溶液に溶
解し以下の順序で試薬類を加えて反応液とした；２５μ
l のポリメラーゼ緩衝液（４００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐ
Ｈ７．６）；１６ｍＭ ＭｇＣｌ₂ ；６３ｍＭのβ−メ
ルカプトエタノール；２７０ｍＭ ＫＣｌ）；１０μl
の５ｍＭ ｄＮＴＰ；１．０μl の１５ｍＭ β−ＮＡ
Ｄ；１．０μl のα−［³²ｐ］ｄＡＴＰ（１０μＣｉ／
μl ）；０．２μl Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡリガーゼ（６０
ｕｎｉｔ／μl 宝酒造社製）；５．０μl のＥ．ｃｏｌ
ｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ社，１０ｕｎｉｔ／μl ）；０．１μl
のＲＮａｓｅ Ｈ（６０ｕｎｉｔ／μl 宝酒造社製）；
２８．７μl の蒸溜水。

【０１１７】反応液を１４℃で１時間インキュベートし
た後、室温にもどして、さらに１時間インキューベート
した。次いで５μl の０．５Ｍ ＥＤＴＡと１μl の２
０％ＳＤＳを加えて反応を停止させ、フェノールークロ
ロホルム処理、エタノール沈澱を行った。得られたＤＮ
Ａを０．５ｍＭ ＥＤＴＡ２０μl に溶解せしめ、３μ
l のＫｌｅｎｏｗ緩衝液（５００ｍＭトリス−塩酸（ｐ
Ｈ８．０），５０ｍＭＭｇＣｌ₂ ），３μl の５ｍＭ
ｄＮＴＰ，及び水４μl を加えて反応液を調製した後、
１μl のＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗ断片）（宝
酒造社製）を加えて３０℃１５分インキュベートした。
この反応液に７０μl のＴＥ溶液を加えて希釈し、さら
に５μl の０．５ＭＥＤＴＡ，１μl の２０％ＳＤＳを
加えて反応を停止した。反応液をフェノールークロロホ
ルム処理し、エタノール沈澱を行って約８μｇの２本鎖
ｃＤＮＡを得た。

【０１１８】３） ２本鎖ｃＤＮＡのメチル化 ２）の項で合成した２本鎖ｃＤＮＡの水溶液３０μl 、
メチル化緩衝液（５００ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．
０），５０ｍＭ ＥＤＴＡ）４０μl ，ＳＡＭ溶液（８
００μＭ Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチルメチオニン（Ｓ
ＡＭ），５０ｍＭβ−メルカプトエタノール）２０μl
，水１００μl を加えた混合液にＥｃｏＲＩメチラー
ゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社，２０
ｕｎｉｔ／μl ）１５μl を加えて全反応液を２００μ
l とし、３７℃２時間インキュベートした。フェノール
処理、エーテル処理を行った後、エタノール沈澱を行っ
てＤＮＡを回収した。

【０１１９】４） ＥｃｏＲＩリンカーの付加 上記メチル化された２本鎖ＤＮＡ約１．２μｇにリガー
ゼ緩衝液（２５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），１
００ｍＭ ＭｇＣｌ₂ ）１．５μl ，あらかじめリン酸
化されたＥｃｏＲＩリンカー０．５μl （１０ｍｅｒ，
宝酒造社製），１．５μl の１０ｍＭＡＴＰ，１００ｍ
Ｍジチオスレイトール１．５μl ，２μl のＨ₂ Ｏを加
え、反応液を１５μl としてＴ４ＤＮＡリガーゼ（３．
４ｕ／μl ，宝酒造社製）０．７μl を加えて４℃で一
晩反応させた後、６５℃にて１０分間加熱しリガーゼを
失活させた。

【０１２０】この反応液をさらに１００ｍＭトリス−塩
酸（ｐＨ７．５），５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ ，５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ，１００μｇ／mlのゼラチンの濃度で全液量が５
０μl になるように調製した後、ＥｃｏＲＩ（１０ｕｎ
ｉｔ／μl ）３．５μl 加え、３７℃、２時間反応させ
た。次いで０．５ＭのＥＤＴＡ２．５μl 、２０％ＳＤ
Ｓ０．５μl を加えた後フェノールークロロホルム処理
を行いエタノール沈澱によりＤＮＡを回収した。この後
Ｕｌｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ３４（ＬＫＢ社製）のゲル濾
過法あるいはアガロースゲル電気泳動法にて未反応のＥ
ｃｏＲＩリンカーを除去し、リンカー付加２本鎖ｃＤＮ
Ａ約０．５〜０．７μｇを回収した。

【０１２１】５） ２本鎖ｃＤＮＡとλｇｔ１０ベクタ
ーの結合 上記のリンカー付加２本鎖ｃＤＮＡを、２．４μｇの予
じめＥｃｏＲＩ処理したλｇｔ１０ベクター（ベクター
クローニングシステム社），リガーゼ緩衝液（２５０
ｍＭトリス塩酸，１００ｍＭ ＭｇＣｌ₂ ）１．４μl
，蒸溜水６．５μl を加えて、４２℃、１５分間処理
した後、１０ｍＭ ＡＴＰ１μl ，０．１Ｍジチオスレ
イトール１μl ，Ｔ₄ ＤＮＡリガーゼ０．５μl を加え
全量を１５μl とした後、１２℃で一晩反応させた。

【０１２２】６） インビトロパッケージング 上記５）で得られた組換え体ＤＮＡの約１／３をインビ
トロパッケージングキット（プロメガ バイオテク社）
を用いてパッケージングし、ファージプラークを得た。

【０１２３】実施例８ プローブ（ＩＷＱ）によりｐＢ
Ｒ系ライブラリーのスクリーニング コロニーの成育した寒天培地上にワットマン５４１濾紙
をのせ３７℃で２時間放置した。以下、ＴａｕｂとＴｈ
ｏｍｐｓｏｎの方法［Ａｎａｌ. Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２
６巻２２２頁（１９８２）］に準じて濾紙を処理した。

【０１２４】すなわち、５４１濾紙にコロニーを移した
後、クロラムフェニコール（２５０μｇ／μl ）を含ん
だ寒天培地に移し、さらに３７℃で一晩放置した。５４
１濾紙を取り出した後、室温下で０．５Ｎ ＮａＯＨ溶
液を浸した濾紙上に３分間放置し、これを２回くり返し
た。以下同様な操作を０．５Ｍトリス−塩酸（ｐＨ８）
溶液を用いて３分間、２回行ない、更に４℃下に０．０
５Ｍトリス−塩酸（ｐＨ８）溶液で３分、１．５mg／ml
のリゾチーム液（０．０５Ｍトリス−塩酸（ｐＨ８），
２５％ショ糖を含む）で１０分間、次いで３７℃下に１
×ＳＳＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ及び０．０１５Ｍクエ
ン酸ナトリウム）溶液で２分間、２００μｇ／mlプロテ
アーゼＫを含む１×ＳＳＣ溶液で３０分、再び室温下に
１×ＳＳＣ溶液で２分間、９５％エタノール溶液で２分
間、２回行った後、５４１濾紙を乾燥させた。

【０１２５】得られた乾燥５４１濾紙を室温下にフェノ
ール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２
４：１，１００ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．５），１０
０ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＥＤＴＡで平衡化したも
の）溶液に３０分間浸した。以下同様の操作を５×ＳＳ
Ｃ溶液で３分間、３回、次いで９５％エタノール溶液で
３分間、２回行った後、濾紙を乾燥させた。

【０１２６】プローブ（ＩＷＱ）を常法（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇを参照）に従って³²Ｐを用いて
放射標識した後、Ｗａｌｌａｃｅ等の方法（Ｎｕｃｌｅ
ｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９巻８７９頁（１９８１））
に従ってコロニーハイブリダイゼーションを行った。６
×ＮＥＴ［０．９Ｍ ＮａＣｌ，０．０９Ｍトリス−塩
酸（ｐＨ７．５），６ｍＭ ＥＤＴＡ］，５×Ｄｅｎｈ
ａｒｄｔ溶液，０．１％ＳＤＳ，０．１mg／ml変性ＤＮ
Ａ（仔牛胸腺ＤＮＡ）を含むハイブリダイゼーション緩
衝液中で６５℃、４時間、プレハイブリダイゼーション
を行った後、放射標識化したプローブ（ＩＷＱ）１×１
０⁶ ｃｐｍ／mlを含む前記ハイブリダイゼーション緩衝
液を用いて５６℃で一夜ハイブリダイゼーションを行っ
た。反応終了後５４１濾紙を室温下に０．１％ＳＤＳを
含む６×ＳＳＣ溶液で３０分、２回および５６℃、１．
５分間洗滌した後、オートラジオグラフィーを行った。

【０１２７】シグナルの出たクローンよりプラスミドを
分離した後、プローブ（ＩＷＱ）を用いてサザンプロッ
ティングを行った。ハイブリダイゼーションおよびオー
トラジオグラフィーは前述と同一の条件で行なった。同
様にプローブ（Ａ）を用いてサザンブロッティングを行
った。ハイブリダイゼーションは前述のハイブリダイゼ
ーション緩衝液を用い、４９℃で１時間行い、３９℃ま
で徐冷後さらに３９℃で１時間行なった。反応終了後、
ニトロセルロースフィルターを０．１％ＳＤＳを含む６
×ＳＳＣで室温下に３０分で２回洗滌し、次いで３９℃
で３分間洗滌した後、オートラジオグラフィーを行なっ
た。

【０１２８】この結果、１個のクローンがポジティブな
ものとして得られ、ジデオキシ法により塩基配列を決定
したところ配列番号４に示した如く、プローブ（ＩＷ
Ｑ）及びプローブ（Ａ）部分を含む３０８塩基対よりな
るＤＮＡであることが判明し、このインサートを含むｐ
ＢＲ３２２由来プラスミドをｐＨＣＳ−１と命名した。

【０１２９】実施例９ ｐＨＣＳ−１由来ＤＮＡプロー
ブによるλファージ系ライブラリーのスクリーニング ＢｅｎｔｏｎとＤａｖｉｓの方法［Ｓｃｉｅｎｃｅ １
９６巻，１８０頁，（１９７７）］に準じてプラークハ
イブリダイゼーションを行った。実施例８で得られたｐ
ＨＣＳ−１をＳａｕ３ＡおよびＥｃｏＲＩで処理して約
６００塩基対のＤＮＡ断片を得、このＤＮＡ断片を常法
に従いニックトランスレーションにより放射標識した。
ファージプラークの生じた寒天培地上にニトロセルロー
ス濾紙（Ｓ＆Ｓ社）をのせてファージを移し、０．５Ｍ
ＮａＯＨにてＤＮＡを変性させ、以下の順序で濾紙を
処理した。０．１Ｍ ＮａＯＨ，１．５Ｍ ＮａＣｌで
２０秒続いて０．５Ｍトリス−塩酸（ｐＨ７．５），
１．５Ｍ ＮａＣｌで２０秒２回，最後に１２０ｍＭ
ＮａＣｌ，１５ｍＭ クエン酸ソーダ，１３ｍＭ ＫＨ
₂ ＰＯ₄ ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．２で２０秒処理
した。

【０１３０】次いで濾紙を乾燥し、８０℃で２時間加熱
して ＤＮＡを固定した。５×ＳＳＣ，５×Ｄｅｎｈａ
ｒｄｔ溶液，５０ｍＭリン酸緩衝液，５０％ホルムアミ
ド，０．２５mg／mlの変性ＤＮＡ（鮭精巣ＤＮＡ），及
び０．１％ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション緩衝液
中で４２℃にて一晩プレハイブリダイゼーションを行
い、ニックトランスレーションにより放射標識化したｐ
ＨＣＳ−１プローブ４×１０⁵ ｃｐｍ／mlを含むハイブ
リダイゼーション緩衝液（５×ＳＳＣ，５×Denhａｒｄ
ｔ溶液，２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０），５０％
ホルムアミド，０．１％ＳＤＳ，１０％デキストラン硫
酸，０．１mg／mlの変性ＤＮＡ（鮭精巣ＤＮＡ）の混合
液）で４２℃にて２０時間ハイブリダイゼーションを行
った。

【０１３１】ニトロセルロース濾紙を室温下に０．１％
ＳＤＳを含む２×ＳＳＣで２０分間洗滌し、次いで４４
℃で、０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣで３０分
間、さらに室温下で０．１×ＳＳＣで１０分間洗滌した
後、オートラジオグラィーで検出した。

【０１３２】その結果、５個のポジティブなクローン
（Ｇ１〜５）が得られた。そこで、得られたクローンの
うち完全長ｃＤＮＡを含むと思われるクローンのＤＮＡ
塩基配列をジデオキシ法にて調べたところ配列番号５に
示される如き塩基配列が得られた。そこでこのｃＤＮＡ
をλｇｔ１０ベクターより切りだし、ｐＢＲ３２７［Ｓ
ｏｂｅｒｏｎ等；Ｇｅｎｅ９巻２８７頁（１９８０）］
とＥｃｏＲＩ部位で結合させ、プラスミドとして大量調
製した。このプラスミドをｐＢＲＧ４と称する。

【０１３３】実施例１０ ｐＢＲＧ４由来ＤＮＡプロー
ブおよびプローブ（ＬＣ）によるλファージ系ライブラ
リーのスクリーニング 実施例９で用いたＢｅｎｔｏｎとＤａｖｉｓの方法（前
出の文献を参照）に準じてプラークハイブリダイゼーシ
ョンを行った。ファージプラークの生じた寒天培地上に
ニトロセルロース濾紙（Ｓ＆Ｓ社製）をのせてファージ
を移し、０．５Ｍ ＮａＯＨにてＤＮＡを変性させ、以
下の順序で濾紙を処理した。

【０１３４】０．１Ｍ ＮａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌ
で２０秒、続いて０．５Ｍトリス−塩酸（ｐＨ７．
５）、１．５Ｍ ＮａＣｌで２０秒２回、最後に１２０
ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ソーダ、１３ｍＭ
ＫＨ₂ ＰＯ₄ 、１ｍＭ ＥＤＴＡ、（ｐＨ７．２）で２
０秒処理した。次いで濾紙を乾燥し、８０℃で２時間加
熱してＤＮＡを固定した。このようにして同一の濾紙を
２枚作製し、ｐＢＲＧ４由来ＤＮＡプローブとプローブ
（ＬＣ）によるスクリーニングにそれぞれ供した。ｐＢ
ＲＧ４由来ＤＮＡプローブによる場合は、ｐＢＲＧ４を
ＥｃｏＲＩで処理して約１５００塩基対のＤＮＡ断片を
得、このＤＮＡ断片を常法に従ってニックトランスレー
ションにより放射標識した。

【０１３５】上記濾紙を５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒ
ｄｔ溶液、５０ｍＭリン酸緩衝液、５０％ホルムアミ
ド、０．２５mg／mlの変性ＤＮＡ（鮭精巣ＤＮＡ）、及
び０．１％ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション緩衝液
中で４２℃にて一晩、プレハイブリダイゼーションを行
い、上記の放射標識した約１５００塩基対のＤＮＡプロ
ーブ（約１×１０⁶ ｃｐｍ／ml）を含むプレハイブリダ
イゼーション緩衝液［５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄ
ｔ溶液、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、５０％
ホルムアミド、０．１％ＳＤＳ、１０％デキストラン硫
酸、０．１mg／mlの変性ＤＮＡ（鮭精巣ＤＮＡ）の混合
液］で４２℃にて２０時間ハイブリダイゼーションを行
った。ニトロセルロース濾紙を室温下に、０．１％ＳＤ
Ｓを含む２×ＳＳＣで２０分間洗滌し、次いで４４℃
で、０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣで３０分間、
さらに室温下で０．１％ＳＳＣで１０分間洗滌した後、
オートラジオグラィーで検出した。

【０１３６】プローブ（ＬＣ）の場合は、濾紙を０．１
％ＳＤＳを含む３×ＳＳＣで、６５℃にて２時間前処理
した後、６×ＮＥＴ、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１０
０μｇ／mlの変性ＤＮＡ（鮭精巣ＤＮＡ）を含む溶液
中、６５℃で２時間、プレハイブリダイゼーションを行
った。

【０１３７】放射標識したプローブ（ＬＣ）（２×１０
⁶ ｃｐｍ／ml）を含むハイブリダイゼーション緩衝液
［６×ＮＥＴ、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１００μｇ
／ml変性ＤＮＡ（鮭精巣ＤＮＡ）］で６３℃にて一晩ハ
イブリダイゼーションを行った後、ニトロセルロース濾
紙を室温下に、０．１％ＳＤＳを含む６×ＳＳＣで２０
分間洗滌し、この洗滌を３回行った後、０．１％ＳＤＳ
を含む６×ＳＳＣにて、６３℃で２分間洗滌した。濾紙
を乾燥した後オートラジオグラフィーで検出した。

【０１３８】このようにして行ったスクリーニングに於
いて、２つのプローブの両方にポジティブなクローンを
選別し、そのうち完全長のｃＤＮＡを含むと思われるク
ローンの塩基配列をジデオキシ法にて調べたところ、配
列番号８に示される如き塩基配列が得られれた。そこで
このｃＤＮＡをλｇｔ１０ベクターより切りだし、ｐＢ
Ｒ３２７とＥｃｏＲＩ部位で結合させ、プラスミドｐＢ
ＲＶ２を得た。

【０１３９】実施例１１ ヒト染色体遺伝子ライブラリ
ーのスクリーニング １） ヒト染色体遺伝子ライブラリーの構築 ヒト染色体遺伝子ライブラリーはＭａｎｉａｔｉｓ（Ｈ
ａｒｖａｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から供与を受け
たが、これは次のようにして作られたものである。ヒト
胎児肝臓から染色体全ＤＮＡをフェノールなどで抽出
し、制限酵素ＨａｅIIIとＡｌｕＩで部分消化する。こ
うして得られたＤＮＡ断片の中から鎖長が１８〜２５Ｋ
ｂ程度のフラグメントをショ糖密度勾配遠心法により濃
縮し、次に制限酵素ＥｃｏＲＩの切断箇所を持つ短鎖合
成ヌクレオチドを介して大腸菌ファージλＣｈａｒｏｎ
４ＡのアームＤＮＡに接続し、感染性のあるファージＤ
ＮＡ組換え体を作成する。次に、さらに感染性を高める
目的でパッケージング法により完全なファージλ粒子に
してある。このようにして作られたヒト遺伝子ライブラ
リーは原理的にはほとんど全てのヒト遺伝子を含む鎖長
が１８〜２５ＫｂのヒトＤＮＡを含んだ組換え体の集合
であると考えられる。

【０１４０】２） ｐＨＣＳ−１由来ＤＮＡプローブに
よるヒト染色体遺伝子ライブラリーのスクリーニング ＢｅｎｔｏｎとＤａｖｉｓ の方法［Ｓｃｉｅｎｃｅ１
９６巻１８０頁（１９７７）］に準じてプラークハイブ
リダイゼイションを行った。実施例８で得られたｐＨＣ
Ｓ−１をＳａｕ３ＡおよびＥｃｏＲＩで処理して約６０
０塩基対のＤＮＡ断片を得、このＤＮＡ断片を常法に従
いニックトランスレーションにより放射標識した。ファ
ージプラークの生じた寒天培地上にニトロセルロースろ
紙（Ｓ＆Ｓ社）をのせてファージを移し、０．５Ｍ Ｎ
ａＯＨにてＤＮＡを変性させ、以下の順序でろ紙を処理
した。０．１Ｍ ＮａＯＨ，１．５Ｍ ＮａＣl で２０
秒，続いて０．５Ｍ トリス塩酸（ｐＨ７．５），１．
５Ｍ ＮａＣl で２０秒２回，最後に１２０ｍＭ Ｎａ
Ｃl ，１５ｍＭクエン酸ソーダ，１３ｍＭ ＫＨ₂ＰＯ
₄ ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，（ｐＨ７．２）で２０秒処理し
た。

【０１４１】次いでろ紙を乾燥し、８０℃で２時間加熱
してＤＮＡを固定した。５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒ
ｄｔ溶液、５０ｍＭリン酸緩衝液、５０％ホルムアミ
ド、０．２５mg／mlの変性ＤＮＡ（鮭精巣ＤＮＡ），及
び０．１％ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション緩衝液
中で４２℃にて一晩ハイブリダイゼーションを行いニッ
クトランスレーションにより放射標識したｐＨＣＳ−１
プローブ４×１０⁵ ｃｐｍ／mlを含むハイブリダイゼー
ション緩衝液［５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶
液、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、５０％ホル
ムアミド、０．１％ＳＤＳ、１０％デキストラン硫酸、
０．１mg／mlの変性ＤＮＡ（鮭精巣ＤＮＡ）の混合液］
で４２℃にて２０時間ハイブリダイゼーションを行っ
た。

【０１４２】ニトロセルロースろ紙を室温下に０．１％
ＳＤＳを含む２×ＳＳＣで２０分間洗浄し、次いで４４
℃で０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣで３０分間、
さらに室温下で０．１×ＳＳＣで１０分間洗浄した後、
オートラジオグラフィーで検出した。その結果、十数個
のポジティブなクローンが得られた。これらのクローン
から組換え体ＤＮＡをＭａｎｉａｔｉｓの方法で（Ｃｅ
ｌｌ１５巻６８７頁（１９７８））により調製した。得
られたＤＮＡはＥｃｏＲＩ，ＢａｍＨＩ，ＢｇｌII等の
各制限酵素にて処理した後、アガロースゲル電気泳動で
分析し、Ｆｒｉｔｓｃｈ等の方法（前出文献を参照）に
従って制限酵素地図を作成した。

【０１４３】上記スクリーニングに用いた放射標識され
たｐＨＣＳ−１由来のＤＮＡ断片のプローブを用いてサ
ザンハイブリダイゼーションを行い、その結果、プロー
ブとハイブリダイズした中からＥｃｏＲＩにより切断さ
れた約８キロ塩基対のＤＮＡ断片を選び、ｐＢＲ３２７
のＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングした。

【０１４４】さらに、このサブクローニングされたＤＮ
Ａについて上記の如き制限酵素による処理を行い、サザ
ンハイブリダイゼーションを繰り返し行うことにより、
ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで切り出される約４キロ塩基対
のＤＮＡ断片にヒトＧ−ＣＳＦポリペプチドをコードす
る遺伝子が存在することが判明した。そこでデオキシ法
を用いてこのＤＮＡ断片の約３キロ塩基対の配列を調べ
たところ配列番号１１に示される塩基配列が得られた。
また、このＤＮＡ断片の制限酵素切断部位は図２に示さ
れる如くであった。

【０１４５】ヒト染色体遺伝子のスクリーニングに用い
るプローブとして上述の他、ｐＢＲＧ４由来のＤＮＡ及
びｐＢＲＶ２由来のＤＮＡで行った。

【０１４６】両ＤＮＡとも、ＥｃｏＲＩで処理した１５
００塩基対のＤＮＡ断片を直接上記の如くニックトラン
スレーション法にて放射標識するか、ＥｃｏＲＩで処理
した後ＤｒａＩ処理して得られる約７００塩基対のＤＮ
Ａ断片を同様に放射標識したものを、前述と同条件にて
プラークハイブリダイゼーションすることによりクロー
ンを選別した後、サザンハイブリダイゼーションによる
分析を行って配列番号１１に示される塩基配列を有する
ＤＮＡ断片を得ることができた。得られたプラスミドを
ｐＢＲＣＥ３βと命名した。

【０１４７】実施例１２ ｐＨＧＡ４１０ベクターの調
製（動物細胞用、＋ＶＳＥ系） 実施例９で得られた配列番号５で示されるｃＤＮＡのＥ
ｃｏＲＩ断片を制限酵素ＤｒａＩにて３７℃で２時間で
処理した後、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片
（宝酒造社製）で処理し、末端を平滑末端とした。１μ
ｇのＢｇｌIIリンカー（８ｍｅｒ；宝酒造社製）をＡＴ
Ｐを用いてリン酸化した後、上記で得られた約１μｇの
ＤＮＡ断片混合物と結合させた。次いで制限酵素Ｂｇｌ
IIで処理してアガロースゲル電気泳動を行い、最も大き
いＤＮＡ断片だけを回収した。

【０１４８】このＤＮＡ断片は図１に示すようにヒトＧ
−ＣＳＦポリペプチドをコードする部分を含む約７１０
塩基対に相当していた。ベクターｐｄＫＣＲ（Ｆｕｋｕ
ｎａｇａ等；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ；８１巻５０８６頁（１９８４））を制限酵素Ｂ
ａｍＨＩで処理した後、アルカリフォスファターゼ（宝
酒造社製）で脱リン酸して得られたベクターＤＮＡをＴ
４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を加えてｃＤＮＡ断片
と結合させｐＨＧＡ４１０を得た（図３）。図３に示さ
れるごとくこのプラスミドは、ＳＶ４０初期遺伝子のプ
ロモーター、ＳＶ４０の複製開始領域、ウサギβ−グロ
ビン遺伝子の一部、ｐＢＲ３２２の複製開始領域および
ｐＢＲ３２２由来のβ−ラクタマーゼ遺伝子（Ａｍ
ｐ^r ）をふくみ、ＳＶ４０初期遺伝子のプロモーター下
流にヒトＧ−ＣＳＦ遺伝子が接続されている。

【０１４９】実施例１３ Ｃ１２７細胞用組替えベクタ
ーの構築（＋ＶＳＥ） １） ｐＨＧＡ４１０（Ｈ）の構築 実施例１２で得られたｐＨＧＡ４１０プラスミド（図
３）２０μｇを５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）、７ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、１００ｍＭ ＮａＣｌ、７
ｍＭ２−メルカプトエタノール、０．０１％ウシ血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）の反応液に溶解し、制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩ（宝酒造社製、１０〜１５単位）を加えて約３０分
３７℃にて反応させ、ＥｃｏＲＩによる部分消化を行っ
た。次いでフェーノール−クロロホルム（１：１）処理
を２回行いエーテル処理、エタノール沈澱を行ってＤＮ
Ａ断片を処理した。

【０１５０】このＤＮＡ断片を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、１０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ
のｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰからなる５
０μｌの液に溶解しＥ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼ−
Ｋｌｅｎｏｗ断片（宝酒造社製）５μl を加えて１４℃
２時間インキュベートしブラントエンド（ｂｌｕｎｔｅ
ｎｄ）にした。これから０．８％アガロースゲル電気泳
動により約５．８Ｋｂの断片６μｇを回収した。回収し
たＤＮＡ断片５μｇを再び５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、１０ｍＭ Ｄ
ＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰからなる反応液５０μl 中に溶解
し、Ｈｉｎｄ IIIリンカー（宝酒造社製）２μｇ、及び
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）１００単位を加え
て、４℃にて一晩反応した。

【０１５１】次いで、フェーノル処理、エーテル処理、
エタノール沈澱後、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）、７ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、６０ｍＭ ＮａＣｌの
溶液３０μl に溶解し、制限酵素Ｈｉｎｄ III１０単位
存在下３時間３７℃でインキュベートした。再びＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼにより処理した後、このＤＮＡを塩化ルビ
ジウム法（前記の「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ」参照）によりＥ．ｃｏｌｉ ＤＨＩ株に形質転換
し、アンピシリン耐性（Ａｍｐ^ｒ）のコロニーを得てｐ
ＨＧＡ４１０プラスミドのＥｃｏＲＩ部位がＨｉｎｄ I
IIに置きかわったプラスミドを保持する菌を選択した。
このようにして得られたプラスミドをｐＨＧＡ４１０
（Ｈ）と命名する（図４）。

【０１５２】２） 発現用組換えベクターｐＴＮ−Ｇ４
の構築 上記１）で得られたｐＨＧＡ４１０（Ｈ）（２０ μ
ｇ）を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、７
ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、１７５ｍＭ ＮａＣｌ、０．２ｍＭ
ＥＤＴＡ、７ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．
０１％ウシ血清アルブミンからなる反応液５０μl に溶
解し、制限酵素ＳａｌＩ（宝酒造社製）２０単位を加
え、３７℃にて５時間インキュベートした。次いでフェ
ーノル処理、エタノール沈澱後、ＤＮＡポリメラーゼＫ
ｌｅｎｏｗ断片（宝酒造社製）にて前出の反応と同様に
１４℃約２時間インキュベートし、ブラントエンドにし
た。これを、アガロース電気泳動で回収することなくエ
タノール沈澱したＤＮＡ断片を制限酵素Ｈｉｎｄ IIIに
て処理して、約２．７ｋｂのＨｉｎｄ III−ＳａｌＩ断
片を１％アガロースゲル電気泳動にて５μｇ回収した。

【０１５３】一方、ウシ乳頭腫ウイルス［ｂｏｖｉｎｅ
ｐａｐｉｌｌｏｍａ ｖｉｒｕｓ（ＢＰＶ)]を有する
プラスミドｐｄＢＰＶ−１（Ｓａｒｖｅｒ，Ｎ．，Ｓｂ
ｙｒｎｅ，Ｊ．Ｃ＆Ｈｏｗｌｅｙ，Ｐ．Ｍ．（１９８
２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７
９巻７１４７−７１５１；Ｄｒ．Ｈｏｗｌｅｙより入
手）をＮａｇａｔａらの方法の如く（Ｆｕｋｕｎａｇ
ａ，Ｓｏｋａｗａ，＆Ｎａｇａｔａ，（１９８４）Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１巻５０
８６−５０９０）Ｈｉｎｄ III及びＰｖｕIIで処理して
８．４ｋｂのＤＮＡ断片を得ておく。

【０１５４】この８．４ｋｂのＤＮＡ断片と上記の約
２．７ｋｂのＨｉｎｄ III−ＳａｌＩＤＮＡ断片を常法
に従ってＴ４ＤＮＡリガーゼにより処理し、前出の「Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」に記載された塩化
ルビジウム法によりＥ．ｃｏｌｉ ＤＨＩ株に形質転換
し、ｐＨＧＡ４１０由来Ｇ−ＣＳＦのｃＤＮＡを有する
プラスミドを保持するＥ．ｃｏｌｉコロニーを選別し
た。このプラスミドをｐＴＮ−Ｇ４と命名する（図
４）。

【０１５５】一方、アデノウイルスＴｙｐｅII〔蛋白質
核酸酵素２７巻１２月号（１９８２年），共立出版発
行〕よりＶＡＩ及びＶＡIIを含む約１７００ｂｐのＳａ
ｌＩ−Ｈｉｎｄ III断片を含むプラスミド△ｐＶＡより
ＶＡＩおよびＶＡIIを含む断片を回収した。この断片を
先に述べたｐＴＮＧ４のＨｉｎｄ III部位に挿入してｐ
ＴＮＧ４ＶＡαおよびｐＴＮＧ４ＶＡβを得た（図
４）。このプラスミドはアデノのＶＡ遺伝子によりＳＶ
４０の初期プロモーターからの転写産物の発現効率を高
めるようにしたものである。

【０１５６】実施例１４ Ｃ１２７細胞の形質転換及び
その発現（＋ＶＳＥ） 実施例１３で得たｐＴＮ−Ｇ４をマウスＣ１２７細胞に
形質転換する前に制限酵素ＢａｍＨＩで処理する。即ち
ｐＴＮ−Ｇ４プラスミド２０μｇを１０ｍＭＴｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ８．０），７ｍＭ ＭｇＣｌ₂ ，１００ｍ
Ｍ ＮａＣｌ，２ｍＭ ２−メルカプトルエタノ―ル，
０．０１％ＢＳＡの混合液１００μlに溶解せしめＢａ
ｍＨＩ（宝酒造社製）２０単位で処理し、フェノール処
理、エーテル処理、エタノール沈澱を行った。

【０１５７】マウスＣ１２７Ｉ細胞は１０％牛胎児血清
（ＧＩＢＣＯ社製）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ´ｓ ｍｉ
ｎｉｍａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ培地中で増殖させる。
径５cmのプレートに増殖したＣ１２７Ｉ細胞に、プレー
ト当たり上記調製ＤＮＡを１０μｇの割り合いでリン酸
−カルシウム法（Ｈａｙｎｅｓ，Ｊ＆Ｗｅｉｓｓｍａｎ
ｎ，Ｃ（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅ
ｓ．１１巻６８７−７０６参照）にて形質転換を行い、
グリセロール処理の後、１２時間３７℃でインキュベー
トした。

【０１５８】次に、この細胞を３枚の新しい径５cmプレ
ートに移し、１週間２回の割合いで培地交換をした。１
６日目にＦｏｃｉ（集塊）を形成した部分をそれぞれ新
しいプレートに移し、上述の培地で継代培養し、Ｇ−Ｃ
ＳＦ生産能の高いクローンを選別した。その結果〜１mg
／l のレベルのＧ−ＣＳＦ生産がみられた。更にクロー
ニングを続けた結果、１０mg／l 以上のレベルのＧ−Ｃ
ＳＦ産生を確認した。尚、宿主細胞には上記のＣ１２７
Ｉ細胞のほかＮＩＨ３Ｔ３細胞も用いることができる。

【０１５９】実施例１５ ＣＨＯ細胞によるＧ−ＣＳＦ
の発現（＋ＶＳＥ） １） ｐＨＧＧ４−ｄｈｆｒの構築 実施例１２で得たｐＨＧＡ４１０プラスミド２０μｇを
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、７ｍＭ
ＭｇＣｌ₂ 、１７５ｍＭ ＮａＣｌ、０．２ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、０．７ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．０
１％ＢＳＡを含む溶液１００μl に溶解し、制限酵素Ｓ
ａｌＩ（宝酒造社製）２０単位を加え、３７℃一晩反応
した後、フェノール処理、エーテル洗浄、エタノール沈
澱を行った。

【０１６０】次に、得られたＤＮＡ沈澱を５０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、１０ｍＭ ＤＴ
Ｔ、１ｍＭ のｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ＴＴＰ
からなる反応液１００μl に溶解し、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｄ
ＮＡポリメラーゼ−Ｋｌｅｎｏｗ断片（宝酒造社製１０
μl ）を加えて１４℃２時間反応させ、フェノ―ル処
理、エーテル洗浄、エタノール沈澱を行った。

【０１６１】このＤＮＡにＥｃｏＲＩリンカーを付加す
る。即ち上記ＤＮＡを５０μl の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ ＤＴＴ、０．５ｍＭ
スペルミジン、２ｍＭ ＡＴＰ、２．５ｍＭ ヘキサ
ミン塩化コバルト、２０μｇ／mlＢＳＡからなる反応液
に溶解し、ＥｃｏＲＩリンカー（宝酒造社製）を加え、
２００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を加え
４℃、１２〜１６時間反応した。フエーノル処理、エー
テル洗浄、エタノール沈澱を常法に従って行った後、該
ＤＮＡをＥｃｏＲＩで部分消化し、１％アガロースゲル
電気泳動で約２．７ｋｂのフラグメントを３μｇ回収し
た。

【０１６２】一方、ｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡプラスミド
（Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｇ．＆Ｓｈａｒｐ，Ｐ．Ａ（１
９８２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２巻１３０４〜
１３１９）をＥｃｏＲＩにて処理し、バクテリアアルカ
リフォスファターゼ（ＢＡＰ）処理して脱リン酸を行
う。即ち、ｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ２０μｇとＥｃｏＲＩ
２０単位を反応液５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）、７ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、１００ｍＭ ＮａＣ
ｌ、７ｍＭ ２−メルカプトエタノ―ル、０．０１％Ｂ
ＳＡの混合液１００μl に加え、３７℃１０時間反応さ
せ、続いて上記反応液にＢＡＰ５単位を加え、６８℃に
て３０分間反応した。その後フェノ―ル処理をし、電気
泳動にてｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡのＥｃｏＲＩ断片を回収
した（〜５μｇ）。

【０１６３】上記した約２．７ｋｂの断片とｐＡｄＤ２
６ＳＶｐＡの断片のそれぞれ０．５μｇずつをアニ―ル
した。このプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＤＨＩ株に塩化
ルビジウム法により形質転換してｐＨＧＧ４−ｄｈｆｒ
のプラスミドを保持するコロニ―を選択する。得られた
プラスミドをｐＨＧＧ４−ｄｈｆｒと命名した（図
５）。なお、上記の別法として、ｐＨＧＧ４プラスミド
をＳａｌＩ処理し、ＥｃｏＲＩリンカ―を付加すること
なしにＥｃｏＲＩで部分消化し約２．７ｋｂの断片を回
収し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラ―ゼーｋｌｅｎｏ
ｗ断片で該ＤＮＡ断片を処理し末端をブラントエンド化
する。

【０１６４】一方前述と同じ方法でｐＡｄＤ２６ＳＶｐ
Ａのブラントエンド化したＥｃｏＲＩ断片を調製し、両
者をＴ４ＤＮＡリガ―ゼ処理してｐＨＧＧ４−ｄｈｆｒ
を調製することもできる。また実施例１３の１）で得ら
れたｐＨＧＡ４１０（Ｈ）を実施例１３の２）記載した
如く、制限酵素Ｈｉｎｄ IIIおよびＳａｌＩにて処理
し、Ｈｉｎｄ III−ＳａｌＩ断片を上記ｐＡｄＤ２６Ｓ
ＶｐＡのブラントエンド化したＥｃｏＲＩに連結しても
ｐＨＧＧ４−ｄｈｆｒを得ることができる（図６）。

【０１６５】２） ｐＧ４ＤＲ１およびｐＧ４ＤＲ２の
構築 １）の項で述べたｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ１０μｇを５０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ（ＰＨ７．５）、７ｍＭ ＭｇＣ
l ₂ 、１００ｍＭ ＮａＣl 、７ｍＭ ２−メルカプト
エタノ―ル、０．０１％ＢＳＡを含む反応液５０mlに溶
解し、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩそれぞれ１
０単位を加え、３７℃１０時間反応させた。常法に従い
フェ―ノル処理、エ―テル洗浄を行った。１％低融点ア
ガロ―ス電気泳動にて、約２ＫｂのＤＮＡ断片を回収し
た後、ＤＮＡポリメラ―ゼ−Ｋｌｅｎｏｗ断片にて、常
法に従いブラントエンド化して、フェノ−ル処理、エ―
テル洗浄、エタノ―ル沈澱を行った。

【０１６６】一方、実施例１３の１）で得られたｐＨＧ
Ａ４１０（Ｈ）１０μｇを１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ＰＨ７．５）、７ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、６０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌを含む反応液５０μl に溶解し、Ｈｉｎｄ III１０
単位を加えて３７℃、６時間反応させた。常法に従い１
％低融点アガロ―ス電気泳動にてＤＮＡ断片を回収し、
更にＢＡＰ処理をした後、Ｋｌｅｎｏｗ断片にてブラン
トエンド化した。フェノ−ル処理、エ―テル洗浄を行っ
た後、先に述べた約２ＫｂのＤＮＡ断片とＴ４ＤＮＡリ
ガ―ゼを用いてブラントエンド結合させた。即ちそれぞ
れのＤＮＡ断片１μｇを６６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）、６．６ｍＭ ＭｇＣl ₂、５ｍＭ Ｄ
ＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰを含む反応液３０μｇに溶解せし
め、Ｔ４ＤＮＡリガ―ゼ５０単位を加え、６℃、１２時
間反応せしめた後、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨＩ株に形質転換し
た。このようにして、図７に示すｐＧ４ＤＲ１およびｐ
Ｇ４ＤＲ２を得た。

【０１６７】３） 形質転換と発現 ＣＨＯ細胞（ｄｈｆｒ^- 株、コロンビア大学Ｄｒ．Ｌ．
Ｃｈａｓｉｎより入手）を９cm径のプレ―ト（Ｎｕｎｃ
社製）中１０％仔牛血清を含むα最小必須培地（α−Ｍ
ＥＭ、アデノシン、デオキシアデノシン、チミジン添
加）で培養増殖し、これをリン酸−カルシウム法（Ｗｉ
ｇｌｅｒ等、Ｃｅｌｌ１４巻７２５頁（１９７８））に
よって形質転換した。

【０１６８】即ち１）で調製したｐＨＧＧ４−ｄｈｆｒ
プラスミド１μｇにキヤリア−ＤＮＡ（子牛胸線ＤＮ
Ａ）を適量加えて、ＴＥ溶液３７５μl に溶解し１Ｍ
ＣａＣｌ₂ １２５μl を加える。３〜５分氷上で冷やし
５００μl の２×ＨＢＳ（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、２８
０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ リン酸緩衝液）を加え
再び氷冷後、上記のＣＨＯ細胞培養液１mlと混合し、プ
レ―トに滴下した後、ＣＯ₂ インキュベ―タ―中で９時
間培養した。プレ―トから培地を除去し、ＴＢＳ（Ｔｒ
ｉｓ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）にて洗浄後、
２０％グリセロ―ル含有ＴＢＳ添加、再び洗浄した後、
非選択培地（前出α−ＭＥＭ培地、ヌクレオチド添加）
を添加して２日間インキュベ―トし選択培地（ヌクレオ
チド無添加）で１：１０に細胞を分割した。次いで２日
毎に選択培地にて培地交換を行いながら培養を続行し生
じたコロニ―を選別して新しいプレ―トに移した。

【０１６９】新しいプレ―トでは０．０２μＭメトトレ
キセ―ト（ＭＴＸ）存在下で増殖し、０．０５μＭ、更
に０．１μＭ ＭＴＸ存在下で増殖させてクロ―ニング
を行った。なおＣＨＯ細胞の形質転換はＣＨＯ細胞に対
しｐＨＧＧ４とｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡを同時形質転換
（Ｃｏ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）することによ
っても行うことができる（Ｓｃａｈｉｌｌ等．Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０巻４６５
４−４６５８（１９８３）参照）。

【０１７０】また、以下に述べる方法にによってもＣＨ
Ｏ細胞の形質転換を行った。即ち、上記２）の項で調製
したｐＧ４ＤＲ１あるいはｐＧ４ＤＲ２をあらかじめそ
れぞれＳａｌＩおよびＫｐｎＩで処理してＤＮＡ断片を
得て、そのうちの１０μｇを上記と同様にＣＨＯ細胞に
形質転換させた。このようにして形質転換された細胞を
選択培地にて上記の如く培養を続けると約７日目で明ら
かなコロニ―が１プレ―トにつき１００個以上出現し
た。コロニ―を一つ一つ選別することなしに、再び新し
いプレ―トに移しかえた後、０．０１μＭ ＭＴＸ存在
下に選択培地で培養を続けると、十数個のコロニ―が出
現した。更にこのような手法によりＭＴＸの濃度を０．
０２μＭ、０．０５μＭ、０．１μＭと上昇させ、生き
残ってきたコロニ―を選別した。また、得られた十数個
のコロニ―をそれぞれ選別した後、ＭＴＸ濃度を上昇さ
せても同様のコロニ―の選別を行うことができた。

【０１７１】又いわゆるポリシストロニック遺伝子を有
する組換えベクタ―を構築し、これを用いてＣＨＯ細胞
を形質転換することができた。即ち、ｐＡｄＤ２６ＳＶ
ｐＡをＰｓｔＩ処理し、２つの断片を回収しこれらとｐ
ＢＲＧ４由来のＣＳＦｃＤＮＡ断片を結合することによ
り、アデノウイルスプロモ―タ―、ＣＳＦｃＤＮＡ、Ｄ
ＨＦＲ、ＳＶ４０のポリＡ部位の順序に配列した組換え
ベクタ―を構築しＣＨＯ細胞にいれて実施した。

【０１７２】実施例１６ 発現物質のＧ−ＣＳＦ活性検
定（＋ＶＳＥ） 実施例１４及び実施例１５で得られたＣ１２７細胞及び
ＣＨＯ細胞の培養上清を夫々１Ｎ酢酸によりｐＨ４に調
整し、等容量のｎ−プロパノ―ルを加えた後、生じた沈
澱を遠心除去し、Ｃ８逆相系担体（山村化学社製）を充
填したオ―プンカラム（１φ×２cm）に通し、５０％ｎ
−プロパノ―ルで溶出させた。溶出液を水で２倍に希釈
した後、ＹＭＣ−Ｃ８カラム（山村化学社製）を用いた
逆相高速液体クロマトグラフィ―にて０．１％ＴＦＡを
含む３０〜６０％の直線濃度勾配のｎ−プロパノ―ルに
て溶出を行った。ｎ−プロパノ―ル濃度が４０％付近の
位置で溶出される画分を分取した後、凍結乾燥し、０．
１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ９）に溶解せしめた。このよ
うな過程を経ることによって、ヒトＧ−ＣＳＦはＣ１２
７及びＣＨＯ細胞上清から約２０倍に濃縮された。

【０１７３】コントロ―ルとして、前述の方法に従って
ヒトＧ−ＣＳＦ ｃＤＮＡを含まないプラスミドで細胞
を形質転換した後その培養上清を濃縮した。得られた標
品について参考例に記載された「ヒトＧ−ＣＳＡの測定
方法（ａ）」に基づいた方法にてヒトＧ−ＣＳＦ活性を
検定した。尚、発現効率が十分に高い場合には培養上清
を直接検定に供してもよい。ここでは濃縮した例につい
て結果を示した。その結果は表１の通りであった。

【０１７４】

【表１】

【０１７５】実施例１７ アミノ酸分析および糖分析
（＋ＶＳＥ） １） アミノ酸組成の分析 実施例１６で得た粗ＣＳＦ試料を更に実施例２の（ｉｉ
ｉ）の方法にしたがって精製した。この精製ＣＳＦ試料
を常法により加水分解し、そのタンパク部分のアミノ酸
組成を日立８３５アミノ酸自動分析装置（日立製作所社
製）を用いて特殊アミノ酸分析法により分析した。この
結果を表２に示した。尚、加水分解条件は次の如くであ
る。 ６Ｎ ＨＣｌ，１１０℃，２４時間，真空中 ４Ｎ メタンスルホン酸＋０．２％３−（２−アミ
ノエチル）インド―ル，１１０℃，２４時間，４８時
間，７２時間，真空中 試料は、４０％ｎ−プロパノ―ルと０．１％トリフルオ
ロ酢酸を含む溶液（１．５ml）に溶かした後、各々０．
１mlをとり、乾燥窒素ガスにより乾燥させた後、又は
の試薬を加えて真空封管し、加水分解に供した。

【０１７６】表中、実測値はの２４時間値との２
４，４８，７２時間値の合計４回の平均値である。但
し、Ｔｈｒ，Ｓｅｒ，１／２Ｃｙｓ，Ｍｅｔ，Ｖａｌ，
ＩｌｅおよびＴｒｐは以下の方法で算出した。（生化学
実験講座、タンパク質化学II（東京化学同人出版）を参
照）。 ・Ｔｈｒ，Ｓｅｒ，１／２Ｃｙｓ，Ｍｅｔはの２４，
４８，７２時間値の経時変化をとり、零時間に補外。 ・Ｖａｌ，Ｉｌｅはの７２時間値。 ・Ｔｒｐはの２４，４８，７２時間値の平均値。

【０１７７】

【表２】

【０１７８】２） 糖組成分析 上記アミノ酸組成分析で用いた精製ＣＳＦ試料２００ｎ
ｇに内部標準としてイノシト―ル２５ｎｍｏｌを加えた
後、１．５Ｎ ＨＣｌを含むメタノ―ル溶液（５００μ
l ）を加えて窒素ガス置換した封管中、９０℃で４時間
反応させた。開管後炭酸銀（Ａｇ₂ ＣＯ₃ ）を加えて中
和した後、無水酢酸５０μl を加え振とう後、室温にて
暗所に一晩放置した。上層をサンプルチュ―ブにとり、
窒素ガスにて乾燥した。沈澱にメタノ―ルを加え洗浄後
軽く遠沈し、上層を同じサンプルチュ―ブに加え乾燥し
た。これに５０μl のＴＭＳ化試薬（ピリジン：ヘキサ
メチルジシラザン：トリメチルクロロシラン＝５：１：
１に混合したもの）を加え４０℃で２０分反応させた
後、Ｄｅｅｐ Ｆｒｅｅｚｅｒに保存した。尚、スタン
ダ―ドとしてガラクト―ス（Ｇａｌ）、Ｎ−アセチルガ
ラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、シアル酸などを各５０
ｎｍｏｌ及びイノシト―ル２５ｎｍｏｌを合わせ同様の
操作を行った。

【０１７９】このサンプルについて以下に示す条件でガ
スクロマト分析を行った。 （分析条件） カラム：２％ＯＶ−１７ＶＩＮｐｏｒｔ ＨＰ６０〜８
０メッシュ，３ｍ，ガラス 温度：１１０℃〜２５０℃まで４℃／分の昇温 キャリヤ―ガス：最初は１．２〜１．６kg／cm² （窒素圧） 終了時は２〜２．５kg／cm² 感度：１０³ ＭΩレンジ０．１〜０．４Ｖ 圧 ：水素ガス ０．８kg／cm² 空気 ０．８kg／cm² サンプル量：２．５〜３．０μl 分析の結果、本発明のＣＳＦからガラクト―ス、Ｎ−ア
セチルガラクトサミンおよびシアル酸が確認された。

【０１８０】実施例１８ ｐＨＧＶ２ベクタ―の調製
（動物細胞用、−ＶＳＥ系） 実施例１０で得られた配列番号８で示されるｃＤＮＡの
ＥｃｏＲＩ断片を制限酵素ＤｒａＩにて３７℃で２時間
で処理した後、ＤＮＡポリメラ―ゼＩのＫｌｅｎｏｗ断
片（宝酒造社製）で処理し、末端を平滑末端とした。１
μｇのＢｇｌIIリンカ―（８ｍｅｒ；宝酒造社製）をＡ
ＴＰを用いてリン酸化した後、上記で得られた約１μｇ
のＤＮＡ断片混合物と結合させた。次いで制限酵素Ｂｇ
ｌIIで処理してアガロ―スゲル電気泳動を行い、最も大
きいＤＮＡ断片だけを回収した。このＤＮＡ断片は図１
に示すようにヒトＧ−ＣＳＦポリペプチドをコ―ドする
部分を含む約７００塩基対に相当していた。

【０１８１】ベクタ―ｐｄＫＣＲ（Ｆｕｋｕｎａｇａ
等；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ；
８１巻５０８６頁（１９８４））を制限酵素ＢａｍＨＩ
で処理した後、アルカリフォスファタ―ゼ（宝酒造社
製）で脱リン酸して得られたベクタ―ＤＮＡをＴ４ＤＮ
Ａリガ―ゼ（宝酒造社製）を加えてｃＤＮＡ断片と結合
させｐＨＧＶ２を得た（図８）。図８に示されるごとく
このプラスミドは、ＳＶ４０初期遺伝子のプロモ―タ
―、ＳＶ４０の複製開始領域、ウサギβ−グロビン遺伝
子の一部、ｐＢＲ３２２の複製開始領域およびｐＢＲ３
２２由来のβ−ラクタマ―ゼ遺伝子（Ａｍｐ^r ）を含
み、ＳＶ４０初期遺伝子のプロモ―タ―下流にヒトＧ−
ＣＳＦ遺伝子が接続されている。

【０１８２】実施例１９ Ｃ１２７細胞用組換えベクタ
―の構築（−ＶＳＥ） １） ｐＨＧＶ２（Ｈ）の構築 実施例１８で得られたｐＨＧＶ２プラスミド（図８）２
０μｇを用いて、実施例１３の１）に記載した方法と同
様にしてｐＨＧＶ２（Ｈ）と命名するプラスミドを得た
（図９）。

【０１８３】２） 発現用組換えベクタ―ｐＴＮ−Ｖ２
ならびにｐＴＮＶＡαおよびｐＴＮＶＡβの構築 上記１）で得られたｐＨＧＶ２（Ｈ）２０μｇを用い
て、実施例１３の２）に記載した方法と同様にしてｐＨ
ＧＶ２由来Ｇ−ＣＳＦのｃＤＮＡを有するプラスミドを
保持するＥ．ｃｏｌｉコロニ―を選別した。得られたプ
ラスミドをｐＴＮ−Ｖ２と命名する（図９）。

【０１８４】一方アデノウイルスＴｙｐｅII〔蛋白質核
酸酵素２７巻１２月号（１９８２年）、共立出版発行〕
よりＶＡＩおよびＶＡIIを含む約１７００ｂｐのＳａｌ
Ｉ−Ｈｉｎｄ III断片を含むプラスミド△ｐＶＡよりＶ
ＡＩおよびＶＡIIを含む断片を回収した。この断片を先
に述べたｐＴＮ−Ｖ２のＨｉｎｄ III部位に挿入してｐ
ＴＮＶＡαおよびｐＴＮＶＡβを得た（図９）。このプ
ラスミドはアデノのＶＡ遺伝子によりＳＶ４０の初期プ
ロモ―タ―からの転写産物の発現効率を高めるようにし
たものである。

【０１８５】実施例２０ Ｃ１２７細胞の形質転換およ
びその発現（−ＶＳＥ） 実施例１９で得たｐＴＮ−Ｖ２をマウスＣ１２７細胞に
形質転換する前に制限酵素ＢａｍＨＩで処理する。次い
でマウスＣ１２７Ｉ細胞を上記調製ＤＮＡで形質転換し
て発現させ（実施例１４参照）Ｇ−ＣＳＦ生産能の高い
クロ―ンを選別した。その結果〜１mg／l のレベルのＧ
−ＣＳＦ生産がみられた。

【０１８６】更にクロ―ニングを続けていくことによ
り、１０mg／l レベルのＧ−ＣＳＦ生産能を有するクロ
―ンが選別できた。同様にして実施例１９で得たｐＴＮ
ＶＡαおよびｐＴＮＶＡβでＣ１２７細胞をそれぞれ形
質転換し、Ｇ−ＣＳＦ生産能の高いクロ―ンを選別した
結果、ｐＴＮＶＡαについては２０mg／l 以上の高生産
クロ―ンを得ることができた。またｐＴＮＶＡβからは
数mg／l の生産能を有するクロ―ンを得ることができ
た。尚、宿主細胞には上記のＣ１２７Ｉ細胞のほかにＮ
ＩＨ３Ｔ３細胞も用いることができる。

【０１８７】実施例２１ ＣＨＯ細胞によるＧ−ＣＳＦ
の発現（−ＶＳＥ） １） ｐＨＧＶ２−ｄｈｆｒの構築 実施例１８で得たｐＨＧＶ２プラスミド２０μｇから実
施例１５の１）に記載した方法によって得られる約２．
７ｋｂの断片とｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡの断片のそれぞれ
０．５μｇずつをアニ―ルした。このプラスミドをＥ．
ｃｏｌｉ ＤＨＩ株に塩化ルビジウム法により形質転換
してｐＨＧＶ２−ｄｈｆｒのプラスミドを保持するコロ
ニ―を選択した。得られたプラスミドをｐＨＧＶ２−ｄ
ｈｆｒと命名した（図１０）。

【０１８８】尚、上記の別法として、ｐＨＶ２プラスミ
ドをＳａｌＩ処理し、ＥｃｏＲＩリンカ―を付加するこ
となしにＥｃｏＲＩで部分消化し、約２．７ｋｂの断片
を回収し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラ―ゼ−Ｋｌｅ
ｎｏｗ断片で該ＤＮＡ断片を処理し末端をブラントエン
ド化した。

【０１８９】一方前述と同じ方法でｐＡｄＤ２６ＳＶｐ
Ａのブラントエンド化したＥｃｏＲＩ断片を調製し、両
者をＴ4 ＤＮＡリガ―ゼ処理してｐＨＧＶ２−ｄｈｆｒ
を調製することもできた。また実施例１９の１）で得ら
れたｐＨＧＶ２（Ｈ）を実施例１３の２）で記載した如
く制限酵素、Ｈｉｎｄ IIIおよびＳａｌＩにて処理し、
Ｈｉｎｄ III−ＳａｌＩ断片を上記ｐＡｄＤ２６ＳＶｐ
Ａのブラントエンド化したＥｃｏＲＩ断片に連結しても
ｐＨＧＶ２−ｄｈｆｒを得ることができた（図１１）。

【０１９０】２） ｐＶ２ＤＲ１およびｐＶ２ＤＲ２の
構築 １）の項で述べたｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ１０ｇを５０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ＰＨ７．５）、７ｍＭ ＭｇＣ
ｌ₂ 、１００ｍＭ ＮａＣｌ、７ｍＭ ２−メルカプト
エタノ―ル、０．０１％ＢＳＡを含む反応液５０mlに溶
解し、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩそれぞれ１
０単位を加え、３７℃１０時間反応させた。常法に従い
フェ―ノル処理、エ―テル洗浄を行った。１％低融点ア
ガロ―ス電気泳動にて、約２ＫｂのＤＮＡ断片を回収し
た後、ＤＮＡポリメラ―ゼ−Ｋｌｅｎｏｗ断片にて、常
法に従いブラントエンド化して、フェノ−ル処理、エ―
テル洗浄、エタノ―ル沈澱を行った。

【０１９１】一方、実施例１９の１）で得られたｐＨＧ
Ｖ２（Ｈ）１０μｇを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（Ｐ
Ｈ７．５）、７ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、６０ｍＭ ＮａＣｌ
を含む反応液５０μl に溶解し、Ｈｉｎｄ III１０単位
を加えて３７℃、６時間反応させた。常法に従い１％低
融点アガロ―ス電気泳動にてＤＮＡ断片を回収し、更
に、ＢＡＰ処理をした後、Ｋｌｅｎｏｗ断片にてブラン
トエンド化した。フェノ−ル処理、エ―テル洗浄を行っ
た後、先に述べた約２ＫｂのＤＮＡ断片とＴ４ＤＮＡリ
ガ―ゼを用いてブラントエンド結合させた。即ち、それ
ぞれのＤＮＡ断片１μｇを６６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）、６．６ｍＭ ＭｇＣｌ₂、５ｍＭ Ｄ
ＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰを含む反応液３０μl に溶解せし
め、Ｔ４ＤＮＡリガ―ゼ５０単位を加え、６℃、１２時
間反応せしめた後、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨＩ株に形質転換し
た。このようにして、図１２に示すｐＶ２ＤＲ１および
ｐＶ２ＤＲ２を得た。

【０１９２】３） 形質転換と発現 上記１）で調製したｐＨＧＶ２−ｄｈｆｒプラスミドを
用いて、実施例１５の３）に記載の方法と同様にしてＣ
ＨＯ細胞株を形質転換して発現させた。なお、ＣＨＯ細
胞の形質転換はＣＨＯ細胞に対しｐＨＧＶ２とｐＡｄＤ
２６ＳＶｐＡを同時形質転換（Ｃｏ ｔｒａｎｓｆｏｒ
ｍａｔｉｏｎ）することによっても行うことができる。

【０１９３】また、以下に述べる方法にによってもＣＨ
Ｏ細胞の形質転換を行った。即ち、上記２）の項で調製
したｐＶ２ＤＲ１あるいはｐＶ２ＤＲ２をあらかじめそ
れぞれＳａｌＩおよびＫｐｎＩで処理してＤＮＡ断片を
得て、そのうちの１０μｇを上記と同様にＣＨＯ細胞に
形質転換させた。このようにして形質転換された細胞を
選択培地にて上記の如く培養を続けると約７日目で明ら
かなコロニ―が１プレ―トにつき１００個以上出現し
た。コロニ―を一つ一つ選別することなしに、再び新し
いプレ―トに移しかえた後、０．０１μＭ ＭＴＸ存在
下に選択培地で培養を続けると、十数個のコロニ―が出
現した。更にこのような手法によりＭＴＸの濃度を０．
０２μＭ、０．０５μＭ、０．１μＭと上昇させ、生き
残ってきたコロニ―を選別した。また、得られた十数個
のコロニ―をそれぞれ選別した後、ＭＴＸ濃度を上昇さ
せても同様のコロニ―の選別を行うことができた。

【０１９４】又、いわゆるポリシストロニック遺伝子を
有する組換えベクタ―を構築し、これを用いてＣＨＯ細
胞を形質転換することができた。即ち、ｐＡｄＤ２６Ｓ
ＶｐＡをＰｓｔＩ処理し、２つの断片を回収しこれらと
ｐＢＲＶ２由来のＣＳＦ ｃＤＮＡ断片を結合すること
により、アデノウィルスプロモ―タ―、ＣＳＦ ｃＤＮ
Ａ、ＤＨＦＲ、ＳＶ４０のポリＡ部位の順序に配列した
組換えベクタ―を構築しＣＨＯ細胞にいれて実施した。

【０１９５】実施例２２ 発現物質のＧ−ＣＳＦ活性検
定（−ＶＳＥ） 実施例２０および実施例２１で得られたＣ１２７細胞及
びＣＨＯ細胞の培養上清から、実施例１６に記載の方法
と同様にしてヒトＧ−ＣＳＦを得、そのヒトＧ−ＣＳＦ
活性を検定した。その結果は表３の通りであった。

【０１９６】

【表３】

【０１９７】実施例２３ アミノ酸分析および糖分析
（−ＶＳＥ） １） アミノ酸組成の分析 実施例２２で得た粗ＣＳＦ試料を更に実施例２の（ｉｉ
ｉ）の方法にしたがって精製した。この精製ＣＳＦ試料
を実施例１７の１）に記載の方法によってアミノ酸組成
分析に付した。この結果を表４に示す。

【０１９８】

【表４】

【０１９９】２） 糖組成分析 上記アミノ酸組成分析で用いた精製ＣＳＦ試料を用い
て、実施例１７の２）に記載したのと同じ方法及び同じ
分析条件によって糖組成を分析した。分析の結果、本発
明のＣＳＦからガラクト―ス、Ｎ−アセチルガラクトサ
ミン及びシアル酸が確認された。

【０２００】実施例２４ ＣＯＳ細胞用染色体由来遺伝
子含有組換えベクタ―の構築 実施例１１で得られた配列番号１１で示される染色体遺
伝子を含むプラスミドｐＢＲＣＥ３βをＥｃｏＲＩで処
理した。一方Ｂａｎｅｒｊｉ等の文献（Ｃｅｌｌ ２７
巻２９９頁（１９８１））に記載されれているｐＳＶＨ
⁺ Ｋ⁺ プラスミドをＫｐｎＩで処理してグロビン遺伝子
を除き、さらにＨｉｎｄ IIIで部分消化してＳＶ４０の
後期遺伝子の一部を除いた後、再結合させて発現用ベク
タ―ｐＭＬ−Ｅ⁺ を調製した。

【０２０１】このベクタ―を、制限酵素ＥｃｏＲＩで処
理した後、アルカリホスファタ―ゼ（宝酒造社製）で脱
リン酸して得られたベクタ―ＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガ―
ゼ（宝酒造社製）を加えて上記染色体ＤＮＡ断片と結合
させ、ｐＭＬＣＥ３αを得た。図１３に示される如くこ
のプラスミドは、ＳＶ４０遺伝子のエンハンサ―、ＳＶ
４０の複製開始領域、ｐＢＲ３２２の複製開始領域およ
びｐＢＲ３２２由来のβ−ラクタマ―ゼ遺伝子（Ａｍｐ
^r ）を含むプラスミドで、ＳＶ４０遺伝子のエンハンサ
―下流にヒトＧ−ＣＳＦ染色体遺伝子が接続されてい
る。

【０２０２】実施例２５ ＣＯＳ細胞でのヒトＧ−ＣＳ
Ｆ染色体遺伝子の発現 仔牛血清１０％を含むＤＭＥＭ（日水製薬社製，ダルベ
ッコ変法イ―グル培地「ニッスイ」）培地（１０ml）を
用いて、直径９cmのペトリ皿（Ｎｕｎｃ社製）中で約７
０％密にまで増殖させたＣＯＳ−１細胞（米国，Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ研究所Ｄｒ．Ｇｌｕｚ
ｍａｎより譲受）をリン酸−カルシウム法（Ｗｉｇｌｅ
ｒ等；Ｃｅｌｌ １４巻７２５頁（１９７８））および
ＤＥＡＥ−デキストラン：クロロキン法（例えば、Ｇｏ
ｒｄｏｎ等；Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８巻８１０頁（１９
８５）を参照）によって形質転換した。

【０２０３】リン酸−カルシウム法の場合は以下の如く
実施した。実施例２４で調製したプラスミドｐＭＬＣＥ
３α１６０μｇをＴＥ溶液３２０μl に溶解せしめ、
３．２mlの蒸溜水を加えた後さらに５０４μl の２Ｍ
ＣａＣl ₂ を加えた。この溶液に４mlの２×ＨＢＳ［５
０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，２８０ｍＭ ＮａＣl ，１．５ｍ
Ｍリン酸緩衝液，（ｐＨ７．１２）］を加えて２０〜３
０分間氷冷した後、ＣＯＳ−１細胞の増殖したペトリ皿
１枚につき１mlずつ滴下した。３７℃のＣＯ₂ インキュ
ベ―タ―にて４時間培養させた後、無血清のＤＭＥＭ培
地で細胞を洗浄し、次いで２０％のグリセロ―ルを含む
ＤＭＥＭ培地５mlを加えて室温で約３分間放置し、再び
無血清のＤＭＥＭ培地で洗浄した。無血清のＤＭＥＭ培
地を除いた後、仔牛血清１０％を含むＤＭＥＭ培地１０
mlを加えて一夜ＣＯ₂ インキュベ―タ―中で培養し、再
び同培地にて培地交換を行ってさらに３日間培養した。

【０２０４】ＤＥＡＥ−デキストラン：クロロキン法を
用いた場合は以下の如くである。リン酸カルシウム法と
同様にＣＯＳ−１細胞を７０％密にまで培養し、無血清
のＤＭＥＭ培地で細胞を２回洗浄した。これに２５０μ
ｇ／mlのＤＥＡＥ−デキストランおよび実施例２４で調
製した２μｇ／mlのプラスミドｐＭＬＣＥ３αを含む無
血清ＤＭＥＭ培地を加え、３７℃，１２時間培養した。
次いで、細胞を無血清ＤＭＥＭ培地で２回洗浄し、１０
％仔牛血清と１ｍＭクロロキンを含むＤＭＥＭ培地に
て、３７℃，２時間培養を続けた。その後細胞を無血清
ＤＭＥＭ培地で２回洗浄した後、１０％仔牛血清を含む
ＤＭＥＭ培地を添加し、３７℃にて３日間培養した。

【０２０５】このようにして得られたＣＯＳ−１細胞の
培養上清を１Ｎ酢酸によりｐＨ４に調整し、等容量のｎ
−プロパノ―ルを加えた後、生じた沈澱を遠心除去し、
Ｃ８逆相系担体（山村化学社製）を充填したオ―プンカ
ラム（１φ×２cm）に通し、５０％ｎ−プロパノ―ルで
溶出させた。溶出液を水で２倍に希釈した後、ＹＭＣ−
Ｃ８カラム（山村化学社製）を用いた逆相系高速液体ク
ロマトグラフィ―にて０．１％ＴＦＡを含む３０〜６０
％の直線濃度勾配のｎ−プロパノ―ルで溶出させた。ｎ
−プロパノ―ル濃度が４０％付近の位置で溶出される画
分を分取した後、凍結乾燥し、０．１Ｍグリシジン緩衝
液（ｐＨ９）に溶解せしめた。このような経過を経るこ
とによって、ヒトＧ−ＣＳＦはＣＯＳ−１細胞上清から
約２０倍に濃縮された。

【０２０６】コントロ―ルとして、前述の方法に従って
ヒトＧ−ＣＳＦ染色体遺伝子を含まないｐＭＬ−Ｅ⁺ で
ＣＯＳ−１細胞を形質転換した後、その培養上清を濃縮
した。得られた標品について参考例に記載された「ヒト
Ｇ−ＣＳＡの測定方法（ａ）」に基づいた方法にてヒト
Ｇ−ＣＳＦ活性を検定した。結果は表５の通りであっ
た。

【０２０７】

【表５】

【０２０８】実施例２６ Ｃ１２７細胞によるヒトＧ−
ＣＳＦ染色体遺伝子の発現 実施例２４で得られたｐＭＬＣＥ３αプラスミドをＥｃ
ｏＲＩで処理し、前出のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇに記載された方法によって、約４Ｋｂの断片を回
収して染色体由来のＧ−ＣＳＦ遺伝子の源とする。これ
をＤＮＡポリメラ―ゼＩ−Ｋｌｅｎｏｗ断片で処理し、
ブラントエンドにしておく（Ａ）。

【０２０９】一方、実施例１２で調製したｐＨＧＡ４１
０プラスミドから、上記と同様Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇの方法によりＳＶ４０プロモ―タ―部分
（ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩの約０．４Ｋｂ断片）を切り
出し、ＤＮＡポリメラ―ゼＩ−Ｋｌｅｎｏｗ断片で処理
する（Ｂ）。

【０２１０】更に、ウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ）を有
するプラスミドｐｄＢＰＶ−１（Ｓａｒｖｅｒ，Ｎ．，
Ｓｂｙｒｎｅ，Ｊ．Ｃ＆Ｈｏｗｌｅｙ，Ｐ．Ｍ．（１９
８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳ
Ａ７９巻７１４７〜７１５１；Ｄｒ Ｈｏｗｌｅｙより
入手）をＨｉｎｄ IIIおよびＰｖｕIIで処理し約８．４
ＫｂのＤＮＡ断片を得、これをＤＮＡポリメラ―ゼＩ−
Ｋｌｅｎｏｗ断片処理後、バクテリヤアルカリフォスフ
ァタ―ゼにて脱リン酸しておく（Ｃ）。

【０２１１】以上の（Ａ），（Ｂ）及び（Ｃ）のＤＮＡ
を各々０．１μｇずつ２０μl の反応液（５０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣl （ｐＨ７．６），１０ｍＭ ＭｇＣl
₂ ，１０ｍＭ ＤＴＴ，１ｍＭ ＡＴＰ）に溶解し、
Ｔ４ＤＮＡリガ―ゼ１８０単位を加えて、４℃にて一晩
反応した。この反応液を用い、前出のＭｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇに記載された塩化ルビジウム法によ
りｐＴＮＣＥ３αプラスミドを得た。

【０２１２】なお、染色体由来のＧ−ＣＳＦ遺伝子の源
としては、上記（Ａ）のかわりに、ｐＭＬＣＥ３α20μ
ｇを10ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣl （ｐＨ８．０），７ｍＭ
ＭｇＣl ₂ ，１００ｍＭ ＮａＣl ，７ｍＭ２−メル
カプトエタノ―ル，０．０１％ＢＳＡの混合液１００μ
l に溶解し、ＳｔｕＩ ２０単位を加え、３７℃，５時
間インキュベ―トした後、１．２％アガロ―スゲル電気
電気泳動にて約１．７８ＫｂのＤＮＡ断片を得て、この
断片を用いてもよい。このようにして得たｐＴＮＣＥ３
αプラスミドで実施例14と同様にしてマウスＣ１２７Ｉ
細胞を形質転換し、発現させ、Ｇ−ＣＳＦ生産能の高い
クロ―ンを選別した。

【０２１３】実施例２７ ＣＨＯ細胞によるヒトＧ−Ｃ
ＳＦ染色体遺伝子の発現 実施例２６のＣ１２７細胞の場合と同様にｐＭＬＣＥ３
αプラスミドをＳｔｕＩで処理して約１．７８ＫｂのＤ
ＮＡ断片を回収するか、或いはＥｃｏＲＩ処理して約４
ＫｂのＥｃｏＲＩ断片を回収して染色体由来のＧ−ＣＳ
Ｆ遺伝子の源とする。これをＤＮＡポリメラ―ゼＩ−Ｋ
ｌｅｎｏｗ断片で処理しておく（ａ）。

【０２１４】また、実施例２６と同じく、ｐＨＧＡ４１
０からＳＶ４０プロモ―タ―部分（ＥｃｏＲＩ−Ｅｃｏ
ＲＩ断片）を切り出して、約０．４Ｋｂの断片を得て、
同様にＤＮＡポリメラ―ゼＩ−Ｋｌｅｎｏｗ断片処理を
しておく（ｂ）。一方、ｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡプラスミ
ド（Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｇ＆Ｓｈａｒｐ，Ｐ．Ａ（１
９８２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，２巻１３０４〜
１３１９）をＥｃｏＲＩで処理した後、ＤＮＡポリメラ
―ゼＩ−Ｋｌｅｎｏｗ断片で処理し、続いてバクテリア
アルカリフォスファタ―ゼ処理して脱リン酸する
（ｃ）。

【０２１５】上記の（ａ），（ｂ）および（ｃ）を各々
０．１μｇずつ２０μl の反応液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ７．６），１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ ，１０
ｍＭＤＴＴ，１ｍＭ ＡＴＰ）に溶解し、Ｔ４ＤＮＡリ
ガ―ゼ１８０単位を加え、４℃にて一晩反応せしめた。
次いで、その反応液を前出のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇに記載された塩化ルビジウム法により、Ｅ．
ｃｏｌｉＤＨＩ株に形質転換しＴｅｔ^r のコロニ―を得
て、プラスミドｐＤ２６ＳＶＣＥ３αを含む菌を選択し
た。プラスミドｐＤ２６ＳＶＣＥ３αは図１４に示す通
りＳＶ４０の初期遺伝子にＣＳＦ遺伝子を連結し、更に
アデノウイルス主後期プロモ―タ―の下流にＤＨＦＲ遺
伝子を連結した形となっている。

【０２１６】一方、ｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡを実施例１５
の２）で述べた如くＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで処理
して得られた約２ＫｂのＤＨＦＲ遺伝子を含むＤＮＡ断
片と上述の（ａ）およびｐＨＧＡ４１０（Ｈ）のＥｃｏ
ＲＩ−ＳａｌＩ断片と連結させることによりＡｍｐ^r の
発現ベクタ―ｐＤＲＣＥ３α（図１４）を構築した。こ
のｐＤ２６ＳＶＣＥ３αプラスミドおよびｐＤＲＣＥ３
αプラスミドを実施例１５と同様にしてＣＨＯ細胞に形
質転換しＭＴＸ選択を繰り返してＧ−ＣＳＦ生産株を得
た。

【０２１７】実施例２８ 発現物質のＧ−ＣＳＦ活性検
定（ヒト染色体由来遺伝子） 実施例２６および実施例２７で得られたＣ１２７細胞お
よびＣＨＯ細胞の培養上清から、実施例２５に記載の方
法と同様にしてヒトＧ−ＣＳＦを得、そのヒトＧ−ＣＳ
Ｆ活性を検定した。その結果は表６の通りであった。

【０２１８】

【表６】

【０２１９】実施例２９ ヒトＧ−ＣＳＦの感染防御効
果 ＜試験方法＞１．シュ―ドモナス アエルギノ―ザ（Ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）感染に対する防御効
果 ８〜９週令（体重３５．３±１．３８ｇ）のＩＩＣＲ系
マウス（雄）にエンドキサン（シオノギ社社製、商品
名）２００mg／kgを腹腔内投与した後３群に分け、その
２群にヒトＧ−ＣＳＦ（２５０００ｕ／マウス又は５０
０００ｕ／マウス）を含む溶媒（生理食塩水中１％プロ
パノ―ル、０．５％（（Ｗ／Ｖ）マウス血清アルブミ
ン）を、そして別の１群には溶媒のみを、それぞれ２４
時間毎に０．１mlずつ４回皮下投与した。４回目の投与
後３時間して各々の群にシュ―ドモナス アエルギノ―
ザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）
ＧＮＢ−１３９（３．９×１０⁵ ＣＦＵ／マウス）を皮
下投与して感染させた。感染後２１時間して、さらにも
う一度ヒトＧ−ＣＳＦ（２５０００ｕ／マウス又は５０
０００ｕ／マウス）を含む溶媒又は溶媒のみをそれぞれ
対応する群に皮下投与した。感染後１０日目までの生存
マウス数により感染防御効果を調べた。

【０２２０】（菌液の調製）ハ―トインフュ―ジョン液
体培地（Ｄｉｆｃｏ社製、商品名）を用いて３７℃で一
夜シュ―ドモナス アエルギノ―ザＧＮＢ−１３９を振
とう培養する。培養液を生理食塩水に懸濁させて調製し
た。

【０２２１】〈結 果〉 実施例１７のアミノ酸組成分析に用いたのと同じＣ
ＨＯ細胞由来の精製ヒトＧ−ＣＳＦ試料（＋ＶＳＥ）に
ついて上記試験を行った。その結果を表７に示す。

【０２２２】

【表７】

【０２２３】同様にして前記実施例１７のアミノ酸組成
分析に用いたのと同じＣ１２７細胞由来の精製ヒトＧ−
ＣＳＦ試料を用いて上記試験の感染防禦効果を調べたと
ころ、ほぼ同様の結果が得られた。

【０２２４】 実施例２３のアミノ酸組成分析に用い
たのと同じＣＨＯ細胞由来の精製ヒトＧ−ＣＳＦ試料
（−ＶＳＥ）について上記試験を行った。結果を表８に
示す。

【０２２５】

【表８】

【０２２６】同様にして前記実施例２３のアミノ酸組成
分析に用いたのと同じＣ１２７細胞由来の精製ヒトＧ−
ＣＳＦ試料を用いて上記試験の感染防禦効果を調べたと
ころ、ほぼ同様の結果が得られた。

【０２２７】

【発明の効果】本発明のヒトＧ−ＣＳＦ活性を有する糖
蛋白質は、白血球減少症治療剤、骨髄性白血病治療剤、
造血機能回復促進剤或いは感染防禦剤等の有効成分とし
て極めて有用なものである。又、待望されていたこれら
医薬品を具現化せしめた遺伝子組換えによるヒトＧ−Ｃ
ＳＦの製法確立も、本発明の大きな成果ということがで
きよう。

【０２２８】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：３０ 配列の形：核酸 鎖の数：１本鎖 トロポジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ATNTGGCARC ARATGGARGA RYTNGGNATG 30

【０２２９】配列番号：２ 配列の長さ：１４ 配列の形：核酸 鎖の数：１本鎖 トロポジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GCRAANGCNG GCAT 14

【０２３０】配列番号：３ 配列の長さ：２４ 配列の形：核酸 鎖の数：１本鎖 トロポジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GTAGGTGGCA CACAGCTTCT CCTG 24

【０２３１】配列番号：４ 配列の長さ：３０８ 配列の形：核酸 鎖の数：２本鎖 トロポジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 CC CTG GAA GGG ATC TCC CCC GAG TTG GGT CCC ACC TTG GAC ACA CTG 47 CAG CTG GAC GTC GCC GAC TTT GCC ACC ACC ATC TGG CAG CAG ATG GAA 95 GAA CTG GGA ATG GCC CCT GCC CTG CAG CCC ACC CAG GGT GCC ATG CCG 143 GCC TTC GCC TCT GCT TTC CAG CGC CGG GCA GGA GGG GTC CTG GTT GCC 191 TCC CAT CTG CAG AGC TTC CTG GAG GTG TCG TAC CGC GTT CTA CGC CAC 239 CTT GCC CAG CCC TGA GCC AAG CCC TCC CCA TCC CAT GTA TTT ATC TCT 287 ATT TAA TAT TTA TGT CTA TTT 308

【０２３２】配列番号：５ 配列の長さ：１５３１ 配列の形：核酸 鎖の数：２本鎖 トロポジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 CGGAGCCTGC AGCCCAGCCC CACCCAGACC C ATG GCT GGA CCT GCC ACC CAG 52 Met Ala Gly Pro Ala Thr Gln -30 -25 AGC CCC ATG AAG CTG ATG GCC CTG CAG CTG CTG CTG TGG CAC AGT GCA 100 Ser Pro Met Lys Leu Met Ala Leu Gln Leu Leu Leu Trp His Ser Ala -20 -15 -10 CTC TGG ACA GTG CAG GAA GCC ACC CCC CTG GGC CCT GCC AGC TCC CTG 148 Leu Trp Thr Val Gln Glu Ala Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu -5 -1 1 5 CCC CAG AGC TTC CTG CTC AAG TGC TTA GAG CAA GTG AGG AAG ATC CAG 196 Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln 10 15 20 25 GGC GAT GGC GCA GCG CTC CAG GAG AAG CTG GTG AGT GAG TGT GCC ACC 244 Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu Val Ser Glu Cys Ala Thr 30 35 40 TAC AAG CTG TGC CAC CCC GAG GAG CTG GTG CTG CTC GGA CAC TCT CTG 292 Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu 45 50 55 GGC ATC CCC TGG GCT CCC CTG AGC AGC TGC CCC AGC CAG GCC CTG CAG 340 Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln 60 65 70 CTG GCA GGC TGC TTG AGC CAA CTC CAT AGC GGC CTT TTC CTC TAC CAG 388 Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln 75 80 85 GGG CTC CTG CAG GCC CTG GAA GGG ATC TCC CCC GAG TTG GGT CCC ACC 436 Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr 90 95 100 105 TTG GAC ACA CTG CAG CTG GAC GTC GCC GAC TTT GCC ACC ACC ATC TGG 484 Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp 110 115 120 CAG CAG ATG GAA GAA CTG GGA ATG GCC CCT GCC CTG CAG CCC ACC CAG 532 Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln 125 130 135 GGT GCC ATG CCG GCC TTC GCC TCT GCT TTC CAG CGC CGG GCA GGA GGG 580 Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly 140 145 150 GTC CTG GTT GCC TCC CAT CTG CAG AGC TTC CTG GAG GTG TCG TAC CGC 628 Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg 155 160 165 GTT CTA CGC CAC CTT GCC CAG CCC TGA GCCAAGCCCT CCCCATCCCA 675 Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro End 170 175 TGTATTTATC TCTATTTAAT ATTTATGTCT ATTTAAGCCT CATATTTAAA GACAGGGAAG 735 AGCAGAACGG AGCCCCAGGC CTCTGTGTCC TTCCCTGCAT TTCTGAGTTT CATTCTCCTG 795 CCTGTAGCAG TGAGAAAAAG CTCCTGTCCT CCCATCCCCT GGACTGGGAG GTAGATAGGT 855 AAATACCAAG TATTTATTAC TATGACTGCT CCCCAGCCCT GGCTCTGCAA TGGGCACTGG 915 GATGAGCCGC TGTGAGCCCC TGGTCCTGAG GGTCCCCACC TGGGACCCTT GAGAGTATCA 975 GGTCTCCCAC GTGGGAGACA AGAAATCCCT GTTTAATATT TAAACAGCAG TGTTCCCCAT 1035 CTGGGTCCTT GCACCCCTCA CTCTGGCCTC AGCCGACTGC ACAGCGGCCC CTGCATCCCC 1095 TTGGCTGTGA GGCCCCTGGA CAAGCAGAGG TGGCCAGAGC TGGGAGGCAT GGCCCTGGGG 1155 TCCCACGAAT TTGCTGGGGA ATCTCGTTTT TCTTCTTAAG ACTTTTGGGA CATGGTTTGA 1215 CTCCCGAACA TCACCGACGC GTCTCCTGTT TTTCTGGGTG GCCTCGGGAC ACCTGCCCTG 1275 CCCCCACGAG GGTCAGGACT GTGACTCTTT TTAGGGCCAG GCAGGTGCCT GGACATTTGC 1335 CTTGCTGGAC GGGGACTGGG GATGTGGGAG GGAGCAGACA GGAGGAATCA TGTCAGGCCT 1395 GTGTGTGAAA GGAAGCTCCA CTGTCACCCT CCACCTCTTC ACCCCCCACT CACCAGTGTC 1455 CCCTCCACTG TCACATTGTA ACTGAACTTC AGGATAATAA AGTGTTTGCC TCCAAAAAAA 1515 AAAAAAAAAA AAAAAA 1531

【０２３３】配列番号：６ 配列の長さ：２０７ 配列の形：アミノ酸 鎖の数： トロポジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Ala Gly Pro Ala Thr Gln Ser Pro Met Lys Leu Met Ala Leu Gln 16 Leu Leu Leu Trp His Ser Ala Leu Trp Thr Val Gln Glu Ala Thr Pro 32 Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu 48 Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys 64 Leu Val Ser Glu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu 80 Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 96 Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His 112 Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile 128 Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala 144 Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala 160 Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 176 Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser 192 Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 207

【０２３４】配列番号：７ 配列の長さ：１７７ 配列の形：アミノ酸 鎖の数： トロポジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys 16 Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln 32 Glu Lys Leu Val Ser Glu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu 48 Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu 64 Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln 80 Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu 96 Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp 112 Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly 128 Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala 144 Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu 160 Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln 176 Pro 177

【０２３５】配列番号：８ 配列の長さ：１５２１ 配列の形：アミノ酸 鎖の数：２本鎖 トロポジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 GGAGCCTGCA GCCCAGCCCC ACCCAGACCC ATG GCT GGA CCT GCC ACC CAG AGC 54 Met Ala Gly Pro Ala Thr Gln Ser -30 -25 CCC ATG AAG CTG ATG GCC CTG CAG CTG CTG CTG TGG CAC AGT GCA CTC 102 Pro Met Lys Leu Met Ala Leu Gln Leu Leu Leu Trp His Ser Ala Leu -20 -15 -10 TGG ACA GTG CAG GAA GCC ACC CCC CTG GGC CCT GCC AGC TCC CTG CCC 150 Trp Thr Val Gln Glu Ala Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro -5 -1 1 5 10 CAG AGC TTC CTG CTC AAG TGC TTA GAG CAA GTG AGG AAG ATC CAG GGC 198 Gln Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly 15 20 25 GAT GGC GCA GCG CTC CAG GAG AAG CTG TGT GCC ACC TAC AAG CTG TGC 246 Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys 30 35 40 CAC CCC GAG GAG CTG GTG CTG CTC GGA CAC TCT CTG GGC ATC CCC TGG 294 His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp 45 50 55 GCT CCC CTG AGC AGC TGC CCC AGC CAG GCC CTG CAG CTG GCA GGC TGC 342 Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys 60 65 70 TTG AGC CAA CTC CAT AGC GGC CTT TTC CTC TAC CAG GGG CTC CTG CAG 388 Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln 75 80 85 90 GCC CTG GAA GGG ATC TCC CCC GAG TTG GGT CCC ACC TTG GAC ACA CTG 438 Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu 95 100 105 CAG CTG GAC GTC GCC GAC TTT GCC ACC ACC ATC TGG CAG CAG ATG GAA 486 Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu 110 115 120 GAA CTG GGA ATG GCC CCT GCC CTG CAG CCC ACC CAG GGT GCC ATG CCG 534 Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro 125 130 135 GCC TTC GCC TCT GCT TTC CAG CGC CGG GCA GGA GGG GTC CTA GTT GCC 582 Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala 140 145 150 TCC CAT CTG CAG AGC TTC CTG GAG GTG TCG TAC CGC GTT CTA CGC CAC 630 Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His 155 160 165 170 CTT GCC CAG CCC TGA GCCAAGCCCT CCCCATCCCA TGTATTTATC TCTATTTAAT 685 Leu Ala Gln Pro End ATTTATGTCT ATTTAAGCCT CATATTTAAA GACAGGGAAG AGCAGAACGG AGCCCCAGGC 745 CTCTGTGTCC TTCCCTGCAT TTCTGAGTTT CATTCTCCTG CCTGTAGCAG TGAGAAAAAG 805 CTCCTGTCCT CCCATCCCCT GGACTGGGAG GTAGATAGGT AAATACCAAG TATTTATTAC 865 TATGACTGCT CCCCAGCCCT GGCTCTGCAA TGGGCACTGG GATGAGCCGC TGTGAGCCCC 925 TGGTCCTGAG GGTCCCCACC TGGGACCCTT GAGAGTATCA GGTCTCCCAC GTGGGAGACA 985 AGAAATCCCT GTTTAATATT TAAACAGCAG TGTTCCCCAT CTGGGTCCTT GCACCCCTCA 1045 CTCTGGCCTC AGCCGACTGC ACAGCGGCCC CTGCATCCCC TTGGCTGTGA GGCCCCTGGA 1105 CAAGCAGAGG TGGCCAGAGC TGGGAGGCAT GGCCCTGGGG TCCCACGAAT TTGCTGGGGA 1165 ATCTCGTTTT TCTTCTTAAG ACTTTTGGGA CATGGTTTGA CTCCCGAACA TCACCGACGC 1225 GTCTCCTGTT TTTCTGGGTG GCCTCGGGAC ACCTGCCCTG CCCCCACGAG GGTCAGGACT 1285 GTGACTCTTT TTAGGGCCAG GCAGGTGCCT GGACATTTGC CTTGCTGGAC GGGGACTGGG 1345 GATGTGGGAG GGAGCAGACA GGAGGAATCA TGTCAGGCCT GTGTGTGAAA GGAAGCTCCA 1405 CTGTCACCCT CCACCTCTTC ACCCCCCACT CACCAGTGTC CCCTCCACTG TCACATTGTA 1465 ACTGAACTTC AGGATAATAA AGTGCTTGCC TCCAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAA 1521

【０２３６】配列番号：９ 配列の長さ：２０４ 配列の形：アミノ酸 鎖の数： トロポジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Ala Gly Pro Ala Thr Gln Ser Pro Met Lys Leu Met Ala Leu Gln 16 Leu Leu Leu Trp His Ser Ala Leu Trp Thr Val Gln Glu Ala Thr Pro 32 Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu 48 Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys 64 Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu 80 Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser 96 Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu 112 Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu 128 Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala 144 Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu 160 Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg 176 Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu 192 Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 204

【０２３７】配列番号：１０ 配列の長さ：１７４ 配列の形：アミノ酸 鎖の数： トロポジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys 16 Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln 32 Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val 48 Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys 64 Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser 80 Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser 96 Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp 112 Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro 128 Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe 144 Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe 160 Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 174

【０２３８】配列番号：１１ 配列の長さ：２９６０ 配列の形：核酸 鎖の数：２本鎖 トロポジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列 CTGCCGCTTC CAGGCGTCTA TCAGCGGCTC AGCCTTTGTT CAGCTGTTCT GTTCAAACAC 60 TCTGGGGCCA TTCAGGCCTG GGTGGGGCAG CGGGAGGAAG GGAGTTTGAG GGGGGCAAGG 120 CGACGTCAAA GGAGGATCAG AGATTCCACA ATTTCACAAA ACTTTCGCAA ACAGCTTTTT 180 GTTCCAACCC CCCTGCATTG TCTTGGACAC CAAATTTGCA TAAATCCTGG GAAGTTATTA 240 CTAAGCCTTA GTCGTGGCCC CAGGTAATTT CCTCCCAGGC CTCCATGGGG TTATGTATAA 300 AGGGCCCCCT AGAGCTGGGC CCCAAAACAG CCCGGAGCCT GCAGCCCAGC CCCACCCAGA 360 CCC ATG GCT GGA CCT GCC ACC CAG AGC CCC ATG AAG CTG ATG G 403 Met Ala Gly Pro Ala Thr Gln Ser Pro Met Lys Leu Met A -30 -25 -20 GTGAGTGTCT TGGCCCAGGA TGGGAGAGCC GCCTGCCCTG GCATGGGAGG GAGGCTGGTG 463 TGACAGAGGG GCTGGGGATC CCCGTTCTGG GAATGGGGAT TAAAGGCACC CAGTGTCCCC 523 GAGAGGGCCT CAGGTGGTAG GGAACAGCAT GTCTCCTGAG CCCGCTCTGT CCCCAG CC 581 la CTG CAG CTG CTG CTG TGG CAC AGT GCA CTC TGG ACA GTG CAG GAA GCC 629 Leu Gln Leu Leu Leu Trp His Ser Ala Leu Trp Thr Val Gln Glu Ala -15 -10 -5 -1 ACC CCC CTG GGC CCT GCC AGC TCC CTG CCC CAG AGC TTC CTG CTC AAG 677 Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys 1 5 10 15 TGC TTA GAG CAA GTG AGG AAG ATC CAG GGC GAT GGC GCA GCG CTC CAG 725 Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln 20 25 30 GAG AAG CTG GTG AGT GAG GTGGGTGAGA GGGCTGTGGA GGGAAGCCCG 773 Glu Lys Leu(Val Ser Glu) 35 GTGGGGAGAG CTAAGGGGGA TGGAACTGCA GGGCCAACAT CCTCTGGAAG GGACATGGGA 833 GAATATTAGG AGCAGTGGAG CTGGGGAAGG CTGGGAAGGG ACTTGGGGAG GAGGACCTTG 893 GTGGGGACAG TGCTCGGGAG GGCTGGCTGG GATGGGAGTG GAGGCATCAC ATTCAGGAGA 953 AAGGGCAAGG GCCCCTGTGA GATCAGAGAG TGGGGGTGCA GGGCAGAGAG GAACTGAACA 1013 GCCTGGCAGG ACATGGAGGG AGGGGAAAGA CCAGAGAGTC GGGGAGGACC CGGGAAGGAG 1073 CGGCGACCCG GCCACGGCGA GTCTCACTCA GCATCCTTCC ATCCCCAG TGT GCC ACC 1130 Cys Ala Thr 40 TAC AAG CTG TGC CAC CCC GAG GAG CTG GTG CTG CTC GGA CAC TCT CTG 1178 Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu 45 50 55 GGC ATC CCC TGG GCT CCC CTG AGC AGC TGC CCC AGC CAG GCC CTG CAG 1226 Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln 60 65 70 CTG GTGAGTGTCA GGAAAGGATA AGGCTAATGA GGAGGGGGAA GGAGAGGAGG 1279 Leu AACACCCATG GGCTCCCCCA TGTCTCCAGG TTCCAAGCTG GGGGCCTGAC GTATCTCAGG 1339 CAGCACCCCC TAACTCTTCC GCTCTGTCTC ACAG GCA GGC TGC TTG AGC CAA CTC 1394 Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu 75 80 CAT AGC GGC CTT TTC CTC TAC CAG GGG CTC CTG CAG GCC CTG GAA GGG 1442 His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly 85 90 95 ATC TCC CCC GAG TTG GGT CCC ACC TTG GAC ACA CTG CAG CTG GAC GTC 1490 Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val 100 105 110 GCC GAC TTT GCC ACC ACC ATC TGG CAG CAG GTGAGCCTTG TTGGGCAGGG 1540 Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln 115 120 TGGCCAAGGT CGTGCTGGCA TTCTGGGCAC CACAGCCGGG CCTGTGTATG GGCCCTGTCC 1600 ATGCTGTCAG CCCCCAGCAT TTCCTCATTT GTAATAACGC CCACTCAGAA GGGCCCAACC 1660 ACTGATCACA GCTTTCCCCC ACAG ATG GAA GAA CTG GGA ATG GCC CCT GCC 1711 Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala 125 130 CTG CAG CCC ACC CAG GGT GCC ATG CCG GCC TTC GCC TCT GCT TTC CAG 1759 Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln 135 140 145 CGC CGG GCA GGA GGG GTC CTG GTT GCC TCC CAT CTG CAG AGC TTC CTG 1807 Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu 150 155 160 GAG GTG TCG TAC CGC GTT CTA CGC CAC CTT GCC CAG CCC TGA 1849 Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro End 165 170 175 GCCAAGCCCT CCCCATCCCA TGTATTTATC TCTATTTAAT ATTTATGTCT ATTTAAGCCT 1909 CATATTTAAA GACAGGGAAG AGCAGAACGG AGCCCCAGGC CTCTGTGTCC TTCCCTGCAT 1969 TTCTGAGTTT CATTCTCCTG CCTGTAGCAG TGAGAAAAAG CTCCTGTCCT CCCATCCCCT 2029 GGACTGGGAG GTAGATAGGT AAATACCAAG TATTTATTAC TATGACTGCT CCCCAGCCCT 2089 GGCTCTGCAA TGGGCACTGG GATGAGCCGC TGTGAGCCCC TGGTCCTGAG GGTCCCCACC 2149 TGGGACCCTT GAGAGTATCA GGTCTCCCAC GTGGGAGACA AGAAATCCCT GTTTAATATT 2209 TAAACAGCAG TGTTCCCCAT CTGGGTCCTT GCACCCCTCA CTCTGGCCTC AGCCGACTGC 2269 ACAGCGGCCC CTGCATCCCC TTGGCTGTGA GGCCCCTGGA CAAGCAGAGG TGGCCAGAGC 2329 TGGGAGGCAT GGCCCTGGGG TCCCACGAAT TTGCTGGGGA ATCTCGTTTT TCTTCTTAAG 2389 ACTTTTGGGA CATGGTTTGA CTCCCGAACA TCACCGACGT GTCTCCTGTT TTTCTGGGTG 2449 GCCTCGGGAC ACCTGCCCTG CCCCCACGAG GGTCAGGACT GTGACTCTTT TTAGGGCCAG 2509 GCAGGTGCCT GGACATTTGC CTTGCTGGAT GGGGACTGGG GATGTGGGAG GGAGCAGACA 2569 GGAGGAATCA TGTCAGGCCT GTGTGTGAAA GGAAGCTCCA CTGTCACCCT CCACCTCTTC 2629 ACCCCCCACT CACCAGTGTC CCCTCCACTG TCACATTGTA ACTGAACTTC AGGATAATAA 2689 AGTGTTTGCC TCCAGTCACG TCCTTCCTCC TTCTTGAGTC CAGCTGGTGC CTGGCCAGGG 2749 GCTGGGGAGG TGGCTGAAGG GTGGGAGAGG CCAGAGGGAG GTCGGGGAGG AGGTCTGGGG 2809 AGGAGGTCCA GGGAGGAGGA GGAAAGTTCT CAAGTTCGTC TGACATTCAT TCCGTTAGCA 2869 CATATTTATC TGAGCACCTA CTCTGTGCAG ACGCTGGGCT AAGTGCTGGG GACACAGCAG 2929 GGAACAAGGC AGACATGGAA TCTGCACTCG A 2960

【図面の簡単な説明】

【図１】ｐＢＲＧ４またはｐＢＲＶ２由来ヒトＧ−ＣＳ
ＦｃＤＮＡの制限酵素切断部位を示す。

【図２】ヒトＧ−ＣＳＦをコ―ドするヒト染色体遺伝子
制限酵素切断部位を示す。

【図３】ｐＨＧＡ４１０の概略構造を示す。

【図４】発現用組換えベクタ―ｐＴＮ−Ｇ４，ｐＴＮ−
Ｇ４ＶＡαおよびｐＴＮ−Ｇ４ＶＡβの構築プロセスを
示す。

【図５】ｐＨＧＧ４−ｄｈｆｒの構築プロセスを示す。

【図６】ｐＨＧＧ４−ｄｈｆｒの構築プロセスを示す。

【図７】ｐＧ４ＤＲ１およびｐＧ４ＤＲ２の構築プロセ
スを示す。

【図８】ｐＨＧＶ２の概略構造を示す。

【図９】発現用組換えベクタ―ｐＴＮ−Ｖ２，ｐＴＮ−
ＶＡαおよびｐＴＮ−ＶＡβの構築プロセスを示す。

【図１０】発現用組換えベクタ―ｐＨＧＶ２−ｄｈｆｒ
の構築プロセスを示す。

【図１１】発現用組換えベクタ―ｐＨＧＶ２−ｄｈｆｒ
の構築プロセスを示す。

【図１２】ｐＶ２ＤＲ１およびｐＶ２ＤＲ２の構築プロ
セスを示す。

【図１３】ｐＭＬＣＥ３αの概略構造を示す。

【図１４】ｐＤ２６ＳＶＣＥ３αとｐＤＲＣＥ３αの概
略構造を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (31)優先権主張番号 特願昭60−269456 (32)優先日 昭60(1985)12月２日 (33)優先権主張国 日本（ＪＰ） (31)優先権主張番号 特願昭60−270839 (32)優先日 昭60(1985)12月３日 (33)優先権主張国 日本（ＪＰ）

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記のアミノ酸配列をコ―ドする塩基配
   列を含むヒト染色体由来のヒト顆粒球コロニー刺激因子
   をコードする遺伝子。 Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro
2. 【請求項２】 ヒト染色体由来の遺伝子が下記塩基配列
   を含む請求項１記載のヒト顆粒球コロニー刺激因子をコ
   ードする遺伝子。 ACC CCC CTG GGC CCT GCC AGC TCC CTG CCC CAG AGC TTC CTG CTC AAG TGC TTA GAG CAA GTG AGG AAG ATC CAG GGC GAT GGC GCA GCG CTC CAG GAG AAG CTG TGT GCC ACC TAC AAG CTG TGC CAC CCC GAG GAG CTG GTG CTG CTC GGA CAC TCT CTG GGC ATC CCC TGG GCT CCC CTG AGC AGC TGC CCC AGC CAG GCC CTG CAG CTG GCA GGC TGC TTG AGC CAA CTC CAT AGC GGC CTT TTC CTC TAC CAG GGG CTC CTG CAG GCC CTG GAA GGG ATC TCC CCC GAG TTG GGT CCC ACC TTG GAC ACA CTG CAG CTG GAC GTC GCC GAC TTT GCC ACC ACC ATC TGG CAG CAG ATG GAA GAA CTG GGA ATG GCC CCT GCC CTG CAG CCC ACC CAG GGT GCC ATG CCG GCC TTC GCC TCT GCT TTC CAG CGC CGG GCA GGA GGG GTC CTG GTT GCC TCC CAT CTG CAG AGC TTC CTG GAG GTG TCG TAC CGC GTT CTA CGC CAC CTT GCC CAG CCC
3. 【請求項３】 請求項１記載のヒト染色体由来のヒト顆
   粒球コロニー刺激因子をコードする遺伝子を含有する組
   換えベクター。
4. 【請求項４】 請求項２記載のヒト染色体由来のヒト顆
   粒球コロニー刺激因子をコードする遺伝子を含有する組
   換えベクター。
5. 【請求項５】 請求項３記載の組換えベクターで形質転
   換された哺乳動物細胞。
6. 【請求項６】 請求項４記載の組換えベクターで形質転
   換された哺乳動物細胞。