JPH01110629A - 感染防禦剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はヒト顆粒球コロニー刺激因子（以下ヒトＧ−Ｃ
８Ｆと略記する）を有効成分とする感染防禦剤に関する
。

〔従来の技術〕

２層軟寒天培養法で、上層に標的細胞として骨髄細胞を
、下層に腎細胞や胎児細胞を入れて培養すると、上層の
細胞の一部が増殖分化し、好中球系顆粒球（以下［顆粒
球（ａｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ）　Ｊと称す。）や単球マ
クロファージからなるコロニーが形成されることから、
生体内にコロニー形成を促進する因子が存在することが
知られていた（Ｐｌｕｚｎｉｋと５ａｃｈ；　Ｊ、Ｃｅ
１１．Ｃｏｍｐ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ　、　。

６６巻３１９頁（１９６５）、　ＢｒａｄｌｅＶとＨｃ
ｔｃａｌｆ　　；Ａｕ５ｔ。

Ｊ、　　　Ｅｘｐ、　Ｂｉｏｌ　、　　ｌｅｄ　、　　
Ｓｃｉ、　　、　　４４巻２８７　頁（１９６６））。

Ｃ３Ｆと総称されるこの因子は、正常に広く生体内分布
する細胞、たとえば、Ｔ細胞、単球マクロファージ、繊
維芽細胞、内皮細胞などより産生されることが知られて
いる。Ｃ８Ｆには顆粒球・単球マクロファージの※♀細
胞に作用して、その増殖を刺激し分化を誘導して、軟寒
天中で顆粒球や単球マクロファージから成るコロニーを
形成させる作用をｂつ顆粒球−単球マク【コファージＣ
３Ｆ（ＧＭ−Ｃ３Ｆと略記する。）、主として単球マク
ロファージのコロニーを形成させる作用をもつ単球マク
ロファージＣ３Ｆ　（Ｍ−ｃｓＦと略記する。）、より
未分化な多能性幹細胞に作用する多能性Ｃ８Ｆ　（ｍｕ
　Ｉ　ｔ　１−Ｃ３Ｆと略記する。）、あるいは本発明
の如き、主として顆粒球系コロニーを形成させる作用を
もつ顆粒球Ｃ３Ｆ　（Ｇ−Ｃ３Ｆと略記する。）などの
りブクラスが存在し、それぞれのりブクラスによって標
的細胞の分化段階も異なることか考えられる様になって
ぎた［八５ａｎＯ：　代壓（−一ト１ｃｔａｂｏｌｉｓ
ｍ　　ａｎｄ　　Ｄｉｓｅａｓｅ、　　２２巻２４９頁
（１９８５）　、　Ｙｕｎｉｓ等：　”ＧｒＯＷｔｈ　
ａｎｄＨａｔｕｒａｔｉｏｎ　　Ｆａｃｔｏｒｓ　　”
　、　　ｅｄｉｔｅｄ　　ｂｙ　Ｇｕｒｏｆｆ。

Ｊｏｔ＋ｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆５ｏｎｓ、　ＮＹ、ユ巻、
２０９頁（１９８３）　］。

ヒトＧ−Ｃ３Ｆに関してはこれまでヒト正常組織由来の
Ｃ３Ｆやビｌ〜腫瘍細胞由来のＣ８Ｆについて多数報告
されている（例えば、５ｔａｎ＋ｅｙ等Ｆｅｄ、Ｐｒ０
Ｃ，３５２２７２（１９，７５）、Ｂｕｒｉ；１ｅｓｓ
等Ｂｌｏｏｄ　４９５７３（１９７７）、　５ｈａｈ等
Ｂｌｏｏｄ　５０８１１（１９７７）、Ｆｏｊｏ等Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、　１７３１０９（１９７８）　、　０ｋａ
ｂｃ等Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　３８３９１０（１９７８
）、　Ａｓａｎｏ等Ｂｌｏｏｄ　４９８４５（１９７７
）、Ｇｏｌｄｅ等８１００ｄ　５７１３２１（１９８１
）、Ｗｕ等Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｃｍ　２５４６２２６（
１９７９）、　Ｄｉｐｅｒｓｉｏ等Ｂｌｏｏｄ　５６７
１７（１９８０９などを参照）。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながらこれ等のヒトＣ３Ｆは完全に純化されたも
のではなく従ってヒトＣ３Ｆの医薬としての有用性また
は有効性については未だ不明のままでおった。

近年、感染症領域に於ける化学療法剤の進歩により、従
来の１４定の病原性を有する強毒物質産生菌は治療可能
となり、一方、医療の進歩と高齢化と共に、生体防禦能
の低下した宿主（ＣＯｍｐｒＯＩｌｌ　ｉ　５ｅｄｈｏ
ｓｔ）の増加により、病原性は弱いが薬剤および消毒剤
に耐性な病原菌による感染（日和見感染）が、臨床に於
いて新たな問題を引きおこしている。

この日和見感染症では、薬剤抵抗性の高い細菌や、有用
な抗生物ｒ１の少ない真菌により発症し、その治療には
従来の化学療法剤に加え、宿主の防禦能を賦活するよう
な薬剤の使用が望まれているが現在まで有効な薬剤は見
出されていない。

感染の初期には宿主のもつ防禦機能のうち白血球の貧食
殺菌作用が最も強く影響すると考えられている事がら好
中球やマクロファージの増殖、分化成熟を高めることに
より宿主の感染防禦能を六進することができれば有効な
感染治療薬となり得る可能性が示唆される。

従って純粋なヒ１−〇ＳＦの大量生産の研究が活発に行
われているが現在まで成功したものはない。

（問題点を解決するための手段〕 このような状況に於いて本発明者等は口腔底癌忠者の腫
瘍細胞から極めて高いヒトＧ−Ｃ８Ｆ産性能を有し、か
つ良好な増殖能を示づ細胞株ＣＩＵｌを樹立しく０．１
東ＣＪ１．受託番号［■−３１５４）、この細胞株の培
養上清からヒト好中球のコロニー形成促進活性を承り純
粋なヒ１−Ｇ−Ｃ３Ｆの単離に初めて成功した（特願昭
５９−１５３２７３Ｑ　＞。

次いで本発明者等は同じくヒ１〜ロ腔底癌由来の細胞株
ＣＨＵ　−２を樹立しくＣ，Ｎ、Ｃ，Ｍ、受託番号■−
４８３）　、この細胞株の培養上清からもＣ１−Ｉ　Ｕ
　−１由来のものと全く同一のＧ−Ｃ３Ｆを単離するこ
とに成功した。

さらに本出願人は、これらの細胞培養法よりも高濃度な
Ｇ−Ｃ３Ｆが得られ、かつ複雑な精製過程を必要としな
い組換えＤＮＡ技術によるＧ−Ｃ３Ｆの製造方法につい
て鋭意研究を重ねた結果、ついにこの技術によって大量
均一なヒｔ”Ｇ　　Ｃ３Ｆの取（７に成功した。（特願
昭６０−２６９４５５号、特願昭６０−２６９４５６号
、特願昭６０−２７０８３８＠、特願昭６０−２７０８
３９＠） そこで、本発明前らは感染動物モデルを用いて、これら
のヒトＧ−Ｃ３Ｆσ感染防禦効果を調べたところ、ヒト
Ｇ　−ＣＳ　Ｆがｉｎ　ｖｉｖｏに於いて顕著な好中球
の成熟能を有し、従って感染防禦効果を示したことから
感染症治療薬として有効であることを見出し本発明を完
成した。

即ら、本発明はヒトＧ−Ｃ３Ｆを有効成分とする感染防
禦剤を提供するものである。

本発明の感染防禦剤の有効成分であるヒトＧ−Ｃ３Ｆに
は、ヒトＧ−Ｃ３Ｆ産生細胞を培養して１７られる培養
上清から単離して得られるものの他、ヒトＧ−Ｃ３Ｆ活
性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を組み込ん
だ組換えベクターで宿主を形質転換して得られる形質転
換体が産生するヒトＧ−Ｃ３Ｆ活性を有するポリペプチ
ドまたは糖蛋白質も含まれている。

次に、本発明を実施するための最良の形態である遺伝子
組換え技術によって得られるヒトＧ−Ｃ８「について詳
しく説明する。

本発明のヒ１〜Ｇ−Ｃ３Ｆ活性を有するポリペプチドを
コードする遺伝子はショ糖密度勾配遠心法により１５〜
１７Ｓ画分として得られる、ヒトＧ−Ｃ３Ｆ活性を有す
るポリペプチドをコードするメッセンジｔ？−ＲＮＡ　
（ｍＲＮＡ）に相補的なりＮＡ（ｃＤＮＡ＞である。

本出願人は２系列のこのようなｃＤＮＡを得た。

そのうらの１つの系列のｃＤＮＡは図３（８）のポリペ
プチド■又は■をコードする遺伝子あるいはその一部を
有するものであり、ざらに詳細には図３（＾）の塩基配
列の５′−末端から３２〜３４ヌクレオチド位のＡＴＧ
から６５０〜６５２ヌクレオチド位のＣＣＣまでの配列
、１２２〜１２４位のＡＣＣから６５０〜６５２位のＣ
ＣＣまでの配列または図３（Ａ）に記載された配列ある
いはその一部を有するものである。

この系列のＣＤＮＡをｃＤＮＡ　（＋ＶＳＥ）と称する
。

他の系列のＣＤＮＡは図４（８）のポリペプチド■又は
■をコードする遺伝子あるいはその一部を有するもので
あり、ざらに詳細には図４（Ａ）の塩基配列の５′−末
端から３１〜３３ヌクレオチド位のＡＴＧから６４０〜
６４２ヌクレオチド位のＣＣＣまでの配列、１２１〜１
２３位のＡＣＣから６４０〜６４２位のＣＣＣまでの配
列または図４（＾）に記載された配列あるいはその一部
を有するものである。

コノ系列のｃＤＮＡをｃＤＮＡ　（−ＶＳＥ）と称する
。

本発明の遺伝子は例えばＧ−Ｃ３Ｆ活性を有するポリペ
プチドを産生ずる能力を有する浦乳動物細胞等からＧ−
Ｃ３ＦをコードするｍＲＮＡを調製した後、既知の方法
により２本鎖ＣＤＮＡに変換することによって得られる
。

前記、ｍＲＮＡの供給源となる哺乳動物細胞は本発明に
おいては、ヒドロ腔底癌山来の細胞株Ｃ間−２（Ｃｏｌ
ｌｅｃｔｉｏｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌｅ　Ｄｅ　Ｃｕ１ｔ
ｕｒｅｓ　Ｄｅ　）ｉｉｃｒｏ。

ｒｇａｎｉｓｍｅｓ　　（Ｃ，Ｎ、　Ｃ，Ｍ）寄託番号
ｌ−４８３）であるが、腫瘍細胞株にかぎらず、哺乳動
物から分離できる細胞、あるいは樹立した他の細胞株で
もよい。又、ｍＲＮＡの調製はすでに他のいくつかの生
理活性タンパクの遺伝子をクローン化する際、用いられ
た方法、例えば、バナジウム複合体等のりボヌクレアー
ゼインヒビター存在下に界面活性剤処理、フェノール処
理を行う（ＢｅｒｇｅｒとＢｉｒｋｅｎｍｅｉｅｒ　；
　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１８巻５１４３頁（１９７
９）を参照）か、グアニジンチオシアナート処理後、Ｃ
５Ｃ１密度勾配遠心を行う（ＣｈｉｒｇＷｉｎ等：　Ｂ
ｉＯＣｈｅｍｉｓｔｒｙ１８巻５２９４頁（１９７９）
を参照）ことによって、全ＲＮＡ＠得た後、オリゴ（ｄ
Ｔ）−セルロースやセファ０−ス２Ｂを担体とするポリ
ローセファロース等を用いたアフィニティーカラム法あ
るいはバッチ法によりポリ（Ａ　　＞ＲＮＡ　（ｍＲＮ
Ａ）を得ることができる。またショ糖密度勾配遠心法等
によりポリ（Ａ）ＲＮＡを更に分画することもできる。

上記の如くして得られたｍＲＮＡが、Ｇ−Ｃ３Ｆ活性を
もつポリペプチドをコードするものであることを確認す
るためには、ｍＲＮＡをタンパク質に翻訳させ、生理活
性を調べるか、抗Ｇ−Ｃ３Ｆ抗体を用いてそのタンパク
を同定覆る等の方法を行えばよい。例えば、アフリカッ
メガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　Ｉａｅｖｉｓ）の卵母細胞
にｍＲＮＡを注入して翻訳させたり（Ｇｕ　ｒｄｏｎ等
；　Ｎａｔｕｒｅ、　　２３３巻１７７頁（１９７２）
を参照）、あるいはウサギ網状赤血球（Ｒｅｔ　ｉｃｕ
　１ｏｃｙｔｅ　）系や小麦胚芽（Ｗｈｅａｔ　ｇｅｒ
ｍ）系を利用した翻訳反応が行われている（Ｓｃｈｌｅ
ｉｆとＷｅｎｓｉｎｋ　　；　“Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　
Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏ
ｇｙ”　、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、　ＮＹ
、　（１９８１））。

Ｇ−Ｃ３Ｆ活性の検定は骨髄細胞を用いた軟寒天培養法
を適用して実施できる。それらの手法については総説が
ある（Ｈｅｔｃａｌｆ　　：“ｌＩｅｍｏｐｏｉｅｔ　
１ｃＣＯＩＯｎｉ（３Ｓ”、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅ
ｒｌａｇ、　Ｂｅｒｌｉｎ、　ｔｌｅｉｄｅｉｂｅｒｇ
、　Ｎ　Ｙ　（１９７７）　）。

前述の如き方法で１ｑだｍＲＮＡを鋳型にして１重鎖ｃ
ＤＮＡを合成した後、この１重鎖ＣＤＮ肋＼ら２重鎖ｃ
ＤＮＡを合成し、適当なベクターＤＮＡとの組換えプラ
スミドを作成する。これで大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ　ｃｏｌ　ｉ　）などを形質転換して、形質転換株
のＤＮＡ群（以下、ＣＤＮＡライブラリーと称する）を
１ツる。

ｍＲＮＡから２本鎖ＣＤＮＡを得るには、例えばｍＲＮ
Ａの３′−末端にあるポリＡ−鎖に相補的なオリゴ（ｄ
Ｔ）をプライマーとして逆転写酵素で処理するか、また
はＧ−Ｃ３Ｆタンパクのアミノ酸配列の一部に相応する
オリゴヌクレオブトを合成し、これをプライマーとして
逆転写酵素で処理してｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを合
成する。

２重鎖ｃＤＮＡは、アルカリ処理でｍＲＮＡを分解・除
去した後、得られた１重鎖ｃＤＮＡを逆転写酵素又はＤ
ＮＡポリメラーゼ（例えばにＩｃｎｏｗ断片等）処理後
Ｓ１ヌクレアーゼ等で処理して得るか、あるいは、直接
ＲＮａｓｅ　　ト１およびＤＮＡポリメラーゼ（例えば
、大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＴ等）等で処理すること
によっても得ることができる（例えば、）ｌａｎｉａｔ
ｉｓ等：　Ｈｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ　、　Ｃ
ｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ（１９８２）およびＧｔＪｂｌｅｒとＩｌｏｆｆｍ
ａｎ　；　Ｇｅｎｅ２５Ｅｉ　２６３頁（１９８３）を
参照。）。

このようにして得られた２本ｍｃＤＮＡを適当なベクタ
ー、例えば、ｐＳＣＩＯＩ　、ＤＤＦ４１゜Ｃｏ　Ｉ　
Ｅｌ、　　ｐＭＢ９．　　ｐＢＲ３２２、ＤＢＲ３２７
。

ｐＡＣＹＣｌなどに代表されるＥＫ型プラスミドベクタ
ーや、λｇｔ、λＣ２λ（］ｔ１０．λｇｔＷＥｓなど
に代表されるファージベクターなどに組み込んだ後、大
腸菌（Ｘ１７７６　：　ｌ−Ｉ　Ｂ　１０１　：　Ｄ　
ｌ−１１、Ｃ６００株など）等を形質転換してＣＤＮＡ
ライブラリーを１ｑることかできる（例えば、前出”）
ｆｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　”を参照）。

２重鎖ｃＤＮＡをベクターと連結させるには、ＤＮＡ末
端に連結可能な末端をつけるべく、適当な化学合成りＮ
Ａ断片を追加し、予め制限酵素を用いて開裂させたベク
ターＤＮＡとＡＴＰ存在下にＴ４ファージＤＮＡリガー
ゼで処理刃ることにより行うことができる。あるいは、
予め制限酵素を用いて開裂させたベクターＤＮＡと２重
鎖ｃＤＮＡのぞれそ゛れにｄＧ、ｄＣ−鎖（あるいはｄ
Ａ、ｄＴ−鎖）を付加した後、例えば両ＤＮＡを含む溶
液を徐冷することによっても行うことができる（前記Ｍ
ＯＩｅＣｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇを参照）。

こうして得られた組換えＤＮＡ体による宿主細胞の形質
転換は、例えば宿主細胞が大腸菌の場合１１ａｎａｈａ
ｎが詳細に記述している如き方法（Ｊ。

Ｈｏｔ　、Ｂｉｏｌ、　　≧１四巻５５７頁（１９８３
））　、すなわら、Ｃａ（：Ｉ　　やＭｑＣ１２又は［
ｂＣＩを共存させて調製したコンピテント細胞に該組換
えＤＮＡ体を加えることにより実施することができる。

目的とする遺伝子を保有する細胞を検索するには、イン
ターフェロンＣＤＮＡのクローン化で用いられたプラス
−マイナス法（丁ａｎｉｇｕｃｈｉ等；Ｐｒｏｃ、　Ｊ
ｐｎ　、Ａｃａｄ、５５巻Ｓｅｒ　、　１３．　４６４
頁（１９７９）　）や、ハイブリダイぜ一ジョンー１〜
ランスレージョンアッセイ法（Ｎａｇａｔａ等：　Ｎａ
ｔｕｒｅ　２８４巻３１６頁（１９８０）　）など、又
は該タンパク質のアミノ酸配列をもとにして化学合成し
たオリゴヌクレオブトプローブを用いたコロニーあるい
はプラークハイブリダイゼーション法（Ｗａｌｌａｃｅ
等；ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　、　、　９巻
８７９頁（１９８１））などを用いればよい。

このようにしてクローン化されたヒｌ−Ｇ−Ｃ３Ｆ活性
を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含む断片は
適当なベクターＤＮＡに再び組み込むことにより、他の
原核生物または真核生物の宿主細胞を形質転換させるこ
とができる。更にこれらのベクターに適当なプロモータ
ー及び形質発現に係る配列を導入することにより、それ
ぞれの宿主細胞に於いて遺伝子を発現させることが可能
である。

原核生物宿主細胞としては、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａｃｏｌｉ、　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ
　、　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ等
が挙げられる。目的の遺伝子をこれ等の宿主細胞内で形
質発現させるには、宿主と適合し得る種由来のレプリコ
ン、すなわち複製起源および調節配列を含んでいるプラ
スミドベクターで宿主細胞を形質転換させればよい。ま
たベクターは形質転換細胞に表現形質（表現型）の選択
性を付与覆ることができる配列をもつものが望ましい。

例えば、Ｅ、Ｃ０Ｉｉは、それを宿主とするベクターで
あるｐＢ　Ｒ３２２を用いて形質転換することができる
（Ｂｏｌｉｖｅｒ等：　Ｇｅｎｅ　２１５９５頁（１９
７５）を参照）。

ｐＢ　Ｒ３２２はアンピシリンおよびテトラ゛リイタリ
ン耐性の遺伝子を含んでおり、どららかの耐性を利用す
ることによって形質転換細胞を同定することができる。

原核生物宿主の遺伝子発現に必要なプロモーターとして
は、Ｂ−ラクタマーゼ遺伝子のプロモーター（ｃｈａｎ
ｏ等；　Ｎａｔｕｒｅ　２７５巻６１５頁（１９７Ｂ）
）　、やラクトースプロモーター（Ｇｏｃｄｄｃ　Ｉ等
；　Ｎａｔｕｒｅ　２Ｂ１巻５４４頁（１９７９）を参
照。）およびトリプトファンプロモーター（ＧＯＯｄｄ
ｅ＋等：Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、）同巻４
０５７頁（１９８０）を参照）等があげられ、どのプロ
モーターも本発明のヒトＧ−Ｃ８Ｆ活性をもつポリペプ
チドの産生に使用することができる。

真核生物のうち、真核微生物の宿主細胞としては、例え
ばｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
等が挙げられ、プラスミドｙ　Ｒｐ　７　（Ｓｔｉｎｃ
ｈｃｏｍｂ等：　Ｎａｔｕｒｅ２８２巻３９頁（１９７
９）などを参照）等によって形質転換することができる
。このプラスミドは、トリプトファンを生産する能力を
欠く酵母株に対する選択マーカーとなるＴＲＰＩ遺伝子
を有し、トリプトファンの非存在下で発育させることに
よって形質転換体を選択することができる。遺伝子発現
に利用可能なプロモーターとしては、酸性ホスファター
ゼ遺伝子プロモーター（Ｈｉｙａｎｏｈａｒａ等：Ｐｒ
ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８
０巻１頁（１９８３）やアルコールデヒドロゲナーゼ遺
伝子プロモーター（Ｖａ　１ｅｎｚｕｅｌａ等；　Ｎａ
ｔｕｒｃ２９８　ｇ３４７頁（１９８２）　）などが挙
げられる。

吐乳動物由来の宿主細胞としては、ＣＯ８細胞、チャイ
ニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｃ−１２７細胞
、）−１０Ｌ　ａ細胞などがあげられ、これ等の細胞を
形質転換させるベクターとしては、ｐｓｖ２−ｑｐｔ　
（ＨｕｌｌｉａａｎとＢｅｒｇ；Ｐｒ０Ｃ，Ｎａｔｌ、
ＡＣａｄ、ＳＣｉ、ＵＳ＾：四巻２０７２頁（（１９８
１）を参照）等がある。これ等のベクターは複製起源、
選択マーカー、発現させようとする遺伝子の前に位置す
るプロモーター、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル
化シグナルなどを含んでいる。

補乳動物細胞における遺伝子発現のプロモーターとして
はレトロウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウィル
ス、シミアンウィルス４０　（ＳＶ４０）などのプロモ
ーターを用いればよい。例えばＳＶ４０のプロモーター
を使用する場合は、Ｈｕｌｌｉｇａｎなどの方法（Ｎａ
ｔｕｒｅ　２７７巻１０８頁（１９７９）　）に従えば
容易に実施することができる。

複製起源としては、ＳＶ４０、ポリオーマウィルス、ア
デノウィルス、牛パピローマウィルス（ＢＰＶ）等の由
来の・しのを用いることができ、選択マーカーとしては
、ホスホトランスフエラーＬ’ＡＰＩ−１（３’　）ｎ
あるいはＩ　（ｎｅｏ）ｉ転子、ヂミジンキナービ（丁
Ｋ）３ｍｍ壬子大腸菌キサンチンーグアニンホスホリボ
シルトランスフエラービ（ＥｃｏＱｐｔ）遺伝子、ジヒ
ドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ＞３ｍｍ壬子を用いること
ができる。

以上の如き宿主−ベクター系を用いてヒトＧ−Ｃ５Ｆ活
性を有するポリペプチドを冑るには、上記ベクターの適
当な部位に該遺伝子を組み込んだ組換えＤＮＡ体により
宿主細胞を形質転換させた俊、ｊｑられた形質転換体を
培養プればよい。ざらに細胞内または培養液から該ポリ
ペプチドを分離・精製するには、公知の手段を用いて行
うことができる。

一般に真核生物の遺伝子はヒトインターフェロン遺伝子
等で知られているように、多形現象（ｐｏｌｙｍｏｒｐ
ｈｙｓｍ　）を承りと考えられ（例えば　Ｎ１５ｈｉ等
；　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　、９７巻１５３頁（１９８
５）を参照）、この多形現象によって１個またはそれ以
上のアミノ酸が置換される場合もあれば、塩基配列の変
化はあってもアミノ酸は全く変わらない場合もある。

また例えば図３（Ｂ）アミノ酸配列の中の１＠またはそ
れ以上のアミノ酸を欠くか又は付加されたポリペプチド
、あるいは１個またはそれ以上のアミノ酸が１個または
それ以上のアミノ酸で置換されたポリペプチドでもＧ−
Ｃ３Ｆ活性を有することがある。例えば、ヒトインター
ロイキン２（ＩＬ−２）ｉ伝子のシスティンに相当する
塩基配列をセリンに相当する塩基配列に変換して得られ
たポリペプチドがインターロイキン２活性を保持するこ
ともすでに公知となっている（Ｗａｎ（］等；５ｃｉｅ
ｎｃｅ、２２４巻１４３１頁（１９８４））　、それゆ
え、それ等天然に存在するかあるいは人工合成されたポ
リペプチドがヒトＧ−Ｃ３Ｆ活性を有する限りそれ等の
ポリペプチドを有する糖蛋白質は全て本発明に含まれる
。　本発明のヒトＧ−Ｃ３Ｆ活・１件をもつポリペプチ
ドをコードする遺伝子、該遺伝子を有する組換えベクタ
ー及びこれを有する形質転換体、さらにこの形質転換体
において発現されたヒトＧ−Ｃ３Ｆ活性を有するポリペ
プチドまたは糖蛋白質を得る方法について簡単に説明す
ると以下の通りである。

（１）プローブの調製 腫瘍細胞株ＣＨＵ−２の培養上清から精製して１７られ
た均一ヒトＣ８Ｆ・タンパクについてＮ末端よりアミノ
酸配列を決定し、ざらにブロムシアン分解、トリプシン
処理などにより断片化した後その断片についてもアミノ
酸配列を決定した。

［実施例３　（ｉ）、　（ｉｉ）、　（ｉｉｉ）　］そ
のアミノ酸配列中から図１に示される配列に対応する３
種類のヌクレオチドプローブ（Ａ）、プローブ（ＬＣ）
およびプローブ（ＩＷＱ）を合成した。（実施例４）プ
ローブ（Ａ）は連続した１４個のヌクレオチドからなる
混合型プローブである。

プローブ（ＩＷＱ　）は、ヒトコレシストキニン遺伝子
のクローン化で用いられた如き（Ｔａｋａｈａｓｈ　ｉ
等ｉ　ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ　、
　、　ｔＪｓＡ　、　８２巻１９３１頁（１９８５））
デオキシイノシンを使用した３０個の連続したヌクレオ
チドである。プローブ（ＬＣ）は実施例３（ｉ）に示し
たアミノ酸配列のＮ末端から３２〜３９番に相当する部
分を、図３に示した塩基配列を基にして合成した２４個
のヌクレオチドからなるプローブである。

ヌクレオチドの化学合成は改良型ホスホ１〜リエステル
法を同相法に適用して行うことができ、Ｎａｒａｎｇの
総説に記述されている（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　３９
巻３−２２頁（１９８３）　）。

使用するプローブは、本発明で用いたプローブ以外の位
置のアミノ酸配列に基づくものであってもよい。

（２）ＣＤＮＡライブイリーの構築 ＣＩ−Ｉ　Ｕ　−２細胞にグアニジンチオシアナート溶
液を加えてホモジナイズし、ＣｓＣ１密度勾配遠心法に
より全ＲＮＡを得る。

この全ＲＮＡからオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムによ
りポリ（Ａ　　）ＲＮＡ８選別した後、逆転写酵素によ
り１本鎖ＣＤＮＡを合成し、ＲＮａｓｅト１およびＥ、
ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼ■を加えて、２本鎖ＣＤＮ
Ａを１７だ。得られた２本鎖のｃＤＮＡにｄＣ鎖を付加
し、ｐｓｔ　Ｉ切断部位にｄＧ鎖を付加したｐ　Ｂ　Ｒ
３２２ベクターとつなぎ合せて、大腸菌Ｘ１７７６株を
形質転換させ、ｐ　Ｂ　Ｒ３２２系ｃＤＮＡライブラリ
ーを構築した。（実施例５，６）同様に、ＥＣ０ＲＩリ
ンカ−を用いて、２重鎖ｃＤＮＡをλｑｔｉｏベクター
と連結し、λフアージ系ＣＤＮＡライブラリーを構築し
た。（実施例（３）スクリーニング Ｄ　Ｂ　Ｒ３２２系ｃＤＮＡライブラリー由来の組換え
体をワットマン５４１濾紙に固定し、３２Ｐで放射標識
したプローブ（ＩＷＱ）を用いて、コロニーハイブリダ
イゼーションを行った結果、１個のりローンが選別でき
た。このクローンを、サザンブロツティング法（Ｓｏｕ
ｔｈｅｒｎ　：　Ｊ　、　Ｍｏｌ　、Ｂｉｏｌ、　９８
巻５０３頁（１９７５））を用いて更に詳細に検討した
ところ、プローブ（Ａ）ともハイブリダイズした。

このクローンの塩基配列をジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ
　；　５ｃｉｅｎｃｅ　　２１４巻１２０５頁（１９８
１））によッテ決定した。

得られたＣＤＮＡインサートの塩基配列を図２に示す。

図２に示される如く、このｃＤＮＡインサートはプロー
ブ（ＩＷＱ＞およびプローブ（＾）を含む３０８塩基対
からなり、実施例３（ｉｉｉ）に示したアミノ酸配列を
含む８３個のアミノ酸をコードするＡ−プンリーディン
グフレームを有していることがわかった。

この３０８塩基対を含むｐ　Ｂ　Ｒ３２２由来のプラス
ミドを以下ｐＨＣ３−１と略記する。（実施例８）ｐ）
（Ｃ３−１から１ｑられる３０Ｂ塩基対を含むＤＮＡ断
片をニックトランスレーション法（前出、）１０１ｅｃ
ｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇを参照）にて放射標識し、こ
れをプローブとしてλｇｔ１０由来のＣＤＮＡライブラ
リーをプラークハイプリダイピージョン（Ｂｅｎｔｏｎ
とＤａｖｉｓ　　：５ｃｉｅｎｃｅ　　１９６巻１８０
頁（１９７７）によりスクリーニングして５個のクロー
ンを得、ｃＤＮＡを含むと思われるクローンについてそ
の塩基配列を前述と同様の方法で決定した。（図３（Ａ
）） 図３（Ａ）に示される如く、このＣＤＮＡインサートは
一つの大ぎなオープンリーディングフレームを有する。

このＣＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列は図３
（Ａ）に示された如く演えきできる。

実施例３（ｉ）に示されているＧ−Ｃ３ＦタンパクのＮ
末端アミノ酸配列との比較により、本Ｃ［）ＮＡは５′
−末端から３２〜３４ヌクレオヂド位のＡＴＧ配列から
始まり、１１９〜１２１位のＣＣＣ配列で終わる９０塩
基対によってコードされるジグノールペプチドおよび１
２２〜１２４位のＡＣＣ配列から始まり６５０〜６５２
位のＣＣＣ配列で終わる５３１塩基対によってコードさ
れる成熟Ｇ−Ｃ３Ｆポリペプチドに相当する塩基配列を
含んでいることがわかった。従って図３（Ｂ）に示され
たアミノ酸配列■のポリペプチドは２０７個のアミノ酸
からなり、その分子間は２２２９２．６７ダルトンと計
算された。同様にアミノ酸配列■のポリペプチドは１７
７個のアミノ酸からなり、その分子量は１８９８６．７
４ダルトンであった。（実施例９） 但しタンパク質の開始部位に関しては、３２〜３４位あ
るいは６８〜７０位のＡＴＧも同様に考え（ｑる。

ＥＣ０Ｒ１切断部位にこのｃＤＮＡ　（＋ＶＳＥ）を挿
入した、ｐ　ＢＲ３２２を保持するエシェリヒア・コリ
（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　Ｘ１７７６株は、工業技術院微生
物工業技術研究所に寄託されている（ＦＥＲＭ奇託番＠
ＢＰ−９５４）。

図５には、ｊｑられた遺伝子の制限酵素切断部位を示し
た。

また、このｃＤＮＡをＩ）ＢＲ３２７［５ｏｂｅｒｏｎ
等：Ｇｅｎｅ　９巻２８７頁（１９８０）　］とＥｃｏ
ＲＩ部位で結合したプラスミドをｐ８ＲＧ４と称する。

このようにして得られたｐＢＲＧ４を、制限酵素ＥＣ０
ＲＩで処理して得られる約１５００塩基対のｃＤＮＡを
含むＤＮＡ断片をニックトランスレーション法（前出の
ＨＯＩｅＣｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｅ参照）にて放
射標識し、これをプローブとして、再びλｇｔ１０由来
のｃＤＮＡライブラリーをプラークハイプリダイピージ
ョン（前出ＢｅｎｔＯ口とＤａｖ　ｉ　ｓの文献参照）
によりスクリーニングした。この際、同時にλフアージ
ＤＮＡを固定したニトロセルロース濾紙を２枚作成して
おぎ、先に述べたプローブ（１，Ｃ）にて同様のプラー
クハイブリダイゼーションを行い、両プローブでポジテ
ィブとなるファージを選別した。完全長と思われるクロ
ーンを選別し、ジデオキシ法を用いてｃＤＮＡインサー
トの塩基配列を決定したところ図４（＾）に示される如
くであった。

このＣＤＮＡは一つの大ぎなオープンリーディングフレ
ームを有し、コードされるアミノ酸配列は図４（＾）に
示された如く演えきできる。

実施例３（ｉ）に示されているＧ−Ｃ３ＦタンパクのＮ
末端アミノ酸配列との比較により、本ｃＤＮＡは５′−
末端から３１〜３３ヌクレオチド位のＡＴＧ配列から始
まり、１１８〜１２０位のＣＣＣ配列で終わる９０塩基
対によってコードされるシグナルペプチドおよび１２１
〜１２３位のＡＣＣ配列から始まり６４０〜６４２位の
ＣＣＣ配列で終る５２２塩基対によってコードされる成
熟Ｇ−Ｃ３Ｆポリペプチドに相当する塩基配列を含んで
いることがわかった。

従って図４（８）に示されたアミノ酸配列■のポリペプ
チドは２０４個のアミノ酸からなり、その分子量は２１
９７７．３５ダル１〜ンとδ］算された。同様にアミノ
酸配列■のポリペプチドは１７４個のアミノ酸からなり
、その分子量は１８６７１．４２ダルトンであった。（
実施例１０） 但しタンパク質の開始部位に関しては、３１〜３３位以
外に５８〜６０位あるいは６１〜６９位のＡＴＧも同様
に考え得る。

ＥＣ０ＲＩ切断部位に本ｃＤＮＡ　（−ＶＳＥ）を挿入
したｐＢＲ３２７を保持するエシェリヒア・コリ（Ｅ、
　ｃｏｌｉ）　Ｘ１７７６株は工業技術院微生物工業技
術研究所に寄託されている（ＦＥＲＭ奇託番号ＢＰ−９
５５）。

図５には、得られた遺伝子の制限酵素切断部位を示した
。

また、このＣＤＮＡをｐＢＲ３２７とＦＣＯＲ１部位で
結合したプラスミドをｐＢＲＶ２と称する。

（４）大腸菌用組換えベクターの構築 （Ａ）＋ＶＳＥ系組換えベクター かくして１ｑられたｐＢＲＧ４プラスミド（実施例９）
からＧ−Ｃ３ＦポリペプヂドのＣＤＮＡ断片を制限酵素
により切り出して来て、これと■　ｔａｃプロモーター
を含有するｐＫＫ２２３−３（ファルマシア社製）から
調製した断片とアニーリングした合成リンカ−を連結（
ライゲーション）し組換えベクターを構築するか（実施
例１１）（図６）、 ■　Ｐ、プロモーターを含むｐ　Ｐ　Ｌ　−ｌａｍｂｄ
ａ（ファルマシア社製）から調製した３種の断片とアニ
ーリングした合成リンカ−を連結し、再調整して組換え
ベクターを構築するか（実施例１２）（図７）、 あるいは ■　ｔｒｐプロモーター含有ｐＯＹＩプラスミドから調
製した断片とアニーリングした合成リンカ−を連結して
組換えベクターを構築する。（実施例１３）（図８）。

（Ｂ）−ＶＳＥ系組換えベクター ｐＢＲＶ２プラスミド（実施例１０）を用いて同様に３
種の組換えベクターを構築する（実施例１８）（図９２
図１０２図１１）。

（５）大腸菌を宿主とする形質転換体の調製と培養、発
現。

次に上記＋ＶＳＥ系及び−ＶＳＥ系についての各々３種
の組換えベクターを用いて前出のＨｏ１ｅｃｕｆａｒ　
Ｃｌ０ｎｉｎ（］に記載されている塩化カルシウム法又
は塩化ルビジウム法で、夫々Ｅ、　　ｃｏｌｉ　ＤＨ１
株、　Ｅ、　　ｃｏｌｉ　Ｎ４８３０株或いはＥ、　　
ｃｏｌｉ　ＪＭＩＯ５株を形質転換した（実施例１１．
１２．１３および１８）。得られた形質転換株をアンピ
シリン含有ルリア（Ｌｕｒｉａ　）培地でまず培養し次
いで必要に応じて、適宜誘導をかけ、培養を行い形質発
現せしめた。

（実施例１４および１９）。

（６）大腸菌からのＧ−Ｃ３Ｆポリペプヂドの回収精製
とアミノ酸分析 形質転換株の培養液を遠心にか（プ集菌した後リゾブー
ム処理をし、凍結−融解をくりかえし溶菌させて上清を
得るか塩酸グアニジン処理後遠心で上ｉａ液を得る。

これをＵＩｔｒＯ（Ｉｅｌ　ＡＣＡ５４カラム（ＬＫＢ
社製）でゲル濾過し、活性画分を限外濾過器で濃縮した
。

次に、ｎプロパツールを含むトリフルオロ酢酸水溶液を
添加し、氷中放置、遠心分離し、逆相Ｃ１８カラムに吸
着、溶出操作を施す。溶出後各両分の活性を調べ、活性
ピークを集め再度同様の精製操作を行った後凍結乾燥し
た。この凍結乾燥粉末を溶解し、高速分子ふるいクロマ
トグラフィにかけることにより取得したポリペプチドを
５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ目的と
するＧ−Ｃ３Ｆポリペプチドを示す単一のバンドを確認
した。（実施例１５および１９）ごの様にして得られた
ポリペプチドはヒトＧ−Ｃ３Ｆ活性を示した。（実施例
１６および１９）更に、得られたＧ−ＣＳＦポリペプチ
ドのアミノ酸分析はアミノ酸組成を日立８３５アミノ酸
自動分析装置（日立製作所製）を使用し、特殊アミノ酸
分析法によって分析した。

又、Ｎ末端アミノ酸分析は気相式シークエンサーを用い
てエドマン分解し、高速液体クロマトグラフィー及び、
旧ｔｒａｓｐｈｅｒｅ　−ＯＤ　Ｓカラムを用いて行っ
た。（実施例１７及び２０） （７）動物細胞用組換えベクターの構築宿主細胞として
Ｃ１２７細胞、Ｎ１ｌ−１３Ｔ３細胞を使用する場合の
組換えベクター（ＢＰＶ由来）およびＣＨＯ細胞を使用
する場合の組換えベクター（ｄｈｆｒ由来）の構築を＋
ＶＳＥ系、−ＶＳＥ系について各々行った。ここではＣ
１２７細胞およびＣＨＯ細胞用組換えベクターの構築に
ついて略記するが詳しくは実施例を参照されたい。

（＾）＋ＶＳＥ系組換えベクターの構築上記（３）　で
４１ｔｔたＣＤＮＡ　（十ＶＳＥ）断片をベクターＤｄ
ＫＣＲに組み込みｐＨＧＡ４１０プラスミドとしだ後（
実施例２１）（図１２）これを［１’ｃｏＲＩで部分消
化し、末端をプラントエンド（ｂｌｕｎｔ　ｅｎｄ　）
にする。このＤＮＡにト１ｉｎｄＩＩＩリンカ−を付加
し、次いでト１ｉｎｄ［［処理をしＴ４ＤＮＡリガービ
処理した後これて塩化ルビジウム法（仝出Ｍｏ１ｅｃｕ
ｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ参照）を用い、Ｅ、Ｃｏ１１Ｄ
ＨＩ株を形質転換した。得られたプラスミドをｐＨＧＡ
４１０　（ｔ−１＞と命名する。（図１３）ｐＨＧＡ４
１０　（トｌ）を５ａｌＩで処理し、次いで末端をプラ
ントエンド化した後再びｌ」ｉｎｄ■処理しＨｉ　ｎｄ
Ｉ［ｌ−３ａ　Ｉ　Ｉ断片を回収する一方、ウシ乳頭腫
ウィルスの形質転換断片を有するｐｄｓｐｖ−１プラス
ミドをト１ｉｒ１ｄｎｌ、ｐｖｕ■で処理し大きいほう
のＤＮＡ断片を分離し、これと先のＨｉ　ｎｄＩ［ｌ−
３ａ　Ｉ　Ｉ断片を結合する。

これを用いてＥ、ｃｏｌｉ　ＤＨＩ株を形質転換しｐｔ
−＋ＧＶ２由来のＣ３Ｆ−ＣＤＮＡを有するプラスミド
、ｐＴＮ−Ｇ４を１ｑる。（図１３）（実施例２２）。

一方、ｐｔ−ＩＧＡ４１０プラスミドかｐＩ−（ＧＡ４
１０（トＩ）プラスミドとｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡプラス
ミドを用いてＣＨＯ細胞用組換えベクター（＋ＶＳＥ）
であるｐｔ−ｌＧＧ４−ｄｈｆｒを構築した（図１４８
およびｂ）（実施例２４）。

（Ｂ）−ＶＳＥ系組換えベクターの構築・上記（３）　
で４！’３ｔＬ／、：ｃＤＮＡ　（ＶＳＥ）断片をベク
ターｐｄＫＣＲに組み込みｐＨＧＶ２プラスミドとしだ
後（実施例２７）これをＥＣ０ＲＩで部分消化し、末端
をプラントエンド（ｂｌｕｎｔ　ｅｎｄ　）にする。こ
のＤＮＡに）ｌ　ｉ　ｎｄｌＩＩリンカ−を付加し、次
いで＠　ｉ　ｎｄｌｌｌ処理をしＴ４ＤＮＡリガーゼ処
理した後、これで塩化ルビジウム法（金山Ｈｏ１ｅｃｕ
ｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ参照）を用い、Ｅ、ｃｏｌｉ　
Ｄｔ−ＩＩ株を形質転換した。得られたプラスミドをｐ
ＨＧＶ２（ト１）と命名する（図１６）。

ｐｌ−ＩＧＶ２　（）−１＞を５ａｌｌで処理し、次い
で末端をプラントエンド化した後再びＨｉｎｄｌｎ処理
しＨｉ　ｎｄｌｌｌ−３ａ　Ｉ　Ｉ断片を回収する一方
、ウシ乳頭腫ウィルスの形質転換断片を有するｐｄＢＰ
Ｖ−１プラスミドをＨｉｎｄｌＩＩ、ｐｖｕＩで処理し
大きい方のＤＮＡ断片を分離し、これと先のｌ−１ｉ　
ｎｄＩ［ｌ−３ａ　Ｉ　Ｉ断片を結合する。これを用い
てＥ、ｃｏｌｉ　ＤＨ１株を形質転換し１ｌＧＶ２由来
のＣ３Ｆ−ｃＤＮＡを有するプラスミド、ｐＴＮ−Ｖ２
を得る。（図１６）（実施例２８）。

十ＶＳＥと同様にｐＨＧＶ２プラスミドかｐＩ−１ＧＶ
２　（１１）プラスミドとｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡプラス
ミドを用いてＣｌ−１０細胞用組換えベクター（−ＶＳ
Ｅ）　であるｐＨＧＶ２−ｄｈｆｒを４ｉＪした（図１
７８およびｂ）（実施例３０）。

（８）動物細胞による形質発現 ここではマウスＣ１２７１１［１胞による形質発現を例
にしてその概要を説明する。詳しくは各実施例を見られ
たい。

ｐＴＮ−Ｇ４プラスミドまたはｐＴＮ−Ｖ２プラスミド
をＢａｍ）−ＩＩで処理しておく、これを用いて培養増
殖させておいたＣ−１２７細胞をリン酸−カルシウム法
で形質転換する。形質転換細胞は培養されＣ３Ｆ生産能
の高いクローンが選別される。形質発現Ｇ−Ｃ３Ｆの糖
蛋白質はこの形質転換細胞の培養液から回収精製され、
ヒトーＧ−Ｃ３Ｆ活性を示すことが確認された。又試料
のアミノ酸分析及び糖含有量分析により目的糖蛋白質の
　　　　　−確認もなされた。

尚、糖含有分析に関しては、アミノ酸分析に用いたＣ３
Ｆ試料をエルラン−モルガン法によるアミノ糖定量、オ
ルシノール硫酸法による中性糖の定量あるいはチオバル
ビッール法によるシアル酸の定量をそれぞれ実施した。

定量方法は生化学実験講座第４巻「糖質の化学（下巻）
」（東京化学同人）の１３章に記載されている。各定量
値から重ω％を換算した結果、宿主細胞、発現ベクター
及び培養条１１等の違いにより、得られたＧ−Ｃ８Ｆの
糖含量は１〜２０（重量％）の範囲に分布していた。

本発明の有効成分であるヒトＧ−Ｃ３Ｆは前述した遺伝
子組換えの手法によって得ることができるほか、例えば
前述の特許出願（特願昭５９＝　１５３２７３号）に開
示された方法に従ってヒトＧ−Ｃ８Ｆ産生細胞（ＣＨＵ
−１またはＣＨＵ−２）から得るか、或いはＧ−Ｃ３Ｆ
産生細胞と自己増殖能を有する悪性腫瘍細胞とを細胞融
合して１ｑられるハイブリドーマをマイトジェンの存在
または非存在かで培養することによって得ることもでき
る。

これ等の方法で得たヒトＧ−Ｃ３Ｆは全て本発明に含ま
れる。

得られたヒトＧ−Ｃ３Ｆ含有液は必要により公知の手段
でさらに精製、濃縮した後凍結保存と−するかまたは凍
結乾燥、真空乾燥などの手段により水分を除去して保存
することができる。

また所望によりヒトＧ−Ｃ３Ｆを適当な衝撃液に溶解し
た後、ミリポアフィルタ−等で無菌濾過して注射剤とす
ることもできる ざらに本発明の感染防禦剤はヒトまたは動物医薬用に適
した医薬製剤としての形態をとるために必要な製薬担体
や賦形剤を、ざらには安定化剤、吸着防止剤を含むこと
かできる。

本発明の感染防禦剤に含まれるヒトＧ−Ｃ３Ｆの投与量
、投与回数は対象の疾患患者の病状を配慮して決めるこ
とができるが、通常成人−人当たり０．１〜５００μ９
好ましくは５〜１００μ９のヒトＧ−Ｃ３Ｆを有する製
剤を１週間に１〜７回投与することができる。しかし本
発明はヒトＧ−Ｃ３Ｆの含有量によって限定されるもの
ではない。

本発明のヒトＧ−Ｃ３Ｆを有効成分とする感染防禦剤が
使用され１７る対象感染菌としては種々の菌を挙げるこ
とができ、特に限定されるものではないが、中でもスタ
フィロコッカス属、ストレプトコツカス属などのグラム
陽性球菌、ニジエリシア属、セラチア属、タレブシエラ
属などの腸内細菌やヘモフィルス等を含むグラム陽性通
性嫌気性菌、シ１−トモナス属、アルカリ土類金属など
のダラム陰性好気性菌、バクテロイデス等のダラム陰性
嫌気性菌、キャンデイグ属、アルペルギル金属などの真
菌およびリステリア菌のような細胞内奇牛菌などによる
単独感染菌又はいくつかの菌による複合感染に対して高
い感染防禦効果が得られる。

〔実　施　例〕

以下実施例をあげて本発明の詳細な説明するが、その前
にＣ３Ｆ活性の測定法およびＣＨＵ−１からのヒトＧ−
Ｃ８Ｆの単離およびその理化学的性質について参考例で
説明しておく。

く参考例＞Ｃ３Ｆ活性の測定方法 本発明において用いられたＣ３Ｆ活性（以下Ｃ３Ａと略
す）の測定方法は次のとおりである。

ｒｃｓＡの測定方法」 （ａ）ヒト骨髄細胞を用いる場合： Ｂｒａｄｌｅｙ　Ｔ、　Ｒ，、Ｈｅｔｃａｌｆ　Ｄ、等
の方法（八ｕｓｔ、　　Ｊ、　　ｅｘｐ　　、　　Ｒｉ
ｏｔ、　ｍｅｄ　　、　　Ｓｃｉ　　、　　４４巻　２
８７〜３００頁、　１９６６年）に準じて単層軟寒天培
養法により行った。すなわらウシ胎児血清０．２７！、
被検検体０．１ｄ、ヒ（〜骨髄非付若性細胞浮遊液０．
Ｗ！（１〜２Ｘ１０５有核細胞）、改変）１ｃｃｏｙ’
　Ｓ　５Ａ培養液０．２ｒｄｌ、寒天を０．７５％含む
改変ＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ培養液０．４ｍｌを混合して直
径３５ｍの組織培養プラスティックデイツシュに入れて
固まらせたのち、３７°Ｃ，５％炭酸ガス／９５％空気
、　１００％湿度の条イ１で培養を行い、１０日後に形
成されたコロニー数（５０個以上の細胞からなる集落を
１コロニーとする）を数え、１個のコロニーを形成する
活性を１単位（Ｕｎｉｔ）としてＣ８Δを求めた。

（ｂ）マウス骨髄細胞を用いる場合： ウマ血清０．、’１７．被検検体０．１ｄ、　Ｃ３１−
１／ｌｌｅ（メス）マウスの骨髄細胞浮遊液０．１ｉｆ
（０，５〜１Ｘ１０５有核細胞）、寒天を０．７５％含
む改変）１ｃｃｏｙ’　ｓ　５ＡＪ８養液０．４７を混
合し直径３５％の組織培養用プラスティックデイツシュ
に入れて固まらヒたのら、３７℃、５％炭酸ガス／９５
％空気、１００％湿度の条件下にて５日間培養し、形成
されたコロニー数（５０個以上の細胞からなる集落を１
コロニーとする）を数え、１個のコロニーを形成する活
性を１単位（Ｕｎｉｔ）としてＣ３Ａを求めた。

尚、上記（ａ）　、　（ｂ）の方法において用いた［改
変ＭＣＣ０Ｖ’　Ｓ　５　Ａ　１８養液および（ａ）で
用いたヒト骨髄非付盾性細胞浮遊液は次の如くして作成
した。

［改変ＨｃＣｏｙ’　ｓ　５Ａ培養液（２倍濃瓜）」Ｈ
ｃＣｏｙ’　ｓ　５ＡＩ養液（ＧＩＢＣＯ社製）１２ｇ
。

Ｍ、ＥＭアミノ酸ビタミン培地（日永製薬社製）２．５
５　ｇ重炭酸ナトリウム２．１８ＬペニシリンＧ力リウ
ム５００００単位を２回前溜水５００７！に溶解後、０
．２２μｍのミリポアフィルタ−にて濾過滅菌を行った
。

ｆヒト骨髄非付谷性細胞浮遊液」 健常人胸骨μん刺により得た骨髄液をＲＰＭ１１６４０
培養液にて５倍に希釈し、ＦｉＣＯｌ　−Ｐａｑｕｅ液
（ファルマシア社製）に重層し、４００Ｘ　９　、３０
分。

２５℃にて遠心を行い、界面の細胞層（比重く１．０７
７）を回収する。この細胞を洗浄後、２０％ウシ胎児血
清を含むＲＰＭ　Ｉ　１６４０培養液にて５×１０６Ｃ
ｅｌｌ／ｄのａｒｍに調整し、２５ｃｒＡの組織培養用
プラスチックフラスコに入れ、炭酸ガス培養器にて３０
分間インキュベートしたのち、上清の非付着性細胞を回
収し、再度２ＳＣ＝プラスチツクフラスコに入れ、２時
間３０分インキュベートしたのち、上清の非付着性細胞
を集めて用いた。

〈参考例２〉ヒトＧ−Ｃ３Ｆの単離 ヒトＧ−Ｃ３Ｆ産生細胞ＣＨＵ−１（ＣＮＣＨ受託番ｆ
ｆｉ　ｌｌ−３１５Ｊ　）の培養上清から以下の実施例
２に記載の方法によってヒトＧ−Ｃ３Ｆを単離精製した
。

このようにして得られたヒトＧ−Ｃ８Ｆは以下の理化学
的性質を有していた。

■分子量ニドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法による測定で 約１９，０００±１．００００ ■等電点：　ｐ　ｌ　＝５．５±０．１　、　ｐＩ＝５
．８±０．１゜ｐｌ＝６．１±０．１の三つの等電点の
うち少なくとも１つを有する。

■紫外部吸収：　２８０ｎｍに極大吸収を有し、２５０
ｎｍに極少値をもつ。

（４）Ｎ末端から２１残基目迄のアミノ酸配列が次の如
くである。

１１２Ｎ−Ｔｈｒ−ｐ　ｒｏ−Ｌｃｕ−Ｇ　Ｉ　Ｖ−Ｐ
　ｒｏ−Ａ　ｌ　ａ−ｓｅｒ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐ　ｒ
Ｏ−Ｇ　Ｉ　ｎ−３ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌ
ｙｓ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｇ　ｌ　ｎ−Ｖａ
　Ｉ　−■アミノ酸組成二以下の表−Ｉに示すアミノ酸
組成を有する。

（以下余白） 表−■ なお、上に記じたヒ］〜Ｇ−Ｃ３Ｆの理化学的性質は以
下の方法によって６′「認したものである。

（ｉ）分子量 ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ　）により行った。

電気泳動装置はＰＲＯＴＥＡＮ　　１６ｃｍ（バイオラ
ット社製）、ゲルはＴ−１５％、Ｃ＝２．６％のポリア
クリルアミドスラブゲル（１４０ｓＸ　１６０　繭Ｘ　
１゜５ｍ）及び濃縮ゲル（Ｔ＝３％、Ｃ＝２０％）を用
いた。試料はあらかじめ０．６４Ｍ２−メルカプトエタ
ノールにドデシル硫酸太１〜リウムを濃度が２％になる
ように加えた溶液中で３分間煮沸し変性ざぜておいたも
のを４μ７用いた。

３０ｍＡ定電流で４時間電気泳動した後、ゲルを取り出
し、次いで、０９２５％クーマシーブリリアントブルー
Ｒ２５０（シグマ社製）による染色にてバンドを検出し
た。　分子量マーカーとしてホスホリラーゼ３　（Ｐｈ
ｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ　Ｂ　：分子量９２，５００）
、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、　６７．０００）　、
；Ｊボアルブミン（ＯＶＡ、　４５，０００＞　、カル
ボニックアンヒドラーゼ（Ｃａｒｂｏｎｉｃ　Ａｎｈｙ
ｄｒａｓｅ、　３１，０００）、ソイビーン　トリプシ
ンインヒビター（５ｏｙｂｅａｎ丁ｒｙｐｈｓｉｎ　Ｉ
ｎｈｉｂｉｔｏｒ、　２１，５００）　、リゾブー−ム
（ＬｙｓＯＺｙｍＱ、　１４，４００）を同様に処理し
て用いた。

本発明の如き蛋白質の分子量を測定する場合、その値は
測定方法の如何にかかわらず、一般に若干の【［Ｊをも
って異なった値が得られるのが常であり、本発明におけ
るヒトＧ−Ｃ３Ｆに必っては、上述の方法によって５回
測定した結果を示した。

（ｉｉ）　　等電点 フラットベツド型等電点電気泳動装置ＦＢＥ−３０００
（ファルマシア社製）を用いた。

ｐＨ４〜６．５のＰｈａｒｍａｌｙｔｅ　（ファルマシ
ア社製）を含むポリアクリルアミドゲル（Ｔ−５％、Ｃ
−３％、　１１５　ｇｘ２３０　Ｍ）にて、３０Ｗ定電
力（最大電圧２０００Ｖ）で２時間泳動を行った後、３
０％メタノール／１０％トリクロール酢酸／３５％スル
ホサリチル酸により固定し、次いでクマーシーブリリア
ントブルーＲ−２５０染色を行った。

等電点マーカーとしてＬＯＷ　ｐＩ　Ｋｉｔ　ｐＨ２，
５〜６．５（ファルマシア社製）を用い　た。

ｐ［１４〜６．５の間で分離を検討したところｐＩ＝５
．５２．５．８０．６．１３の３本のバンドが認められ
た。

このうちｐＩ＝５．５２および５．８０の２本のバンド
が主たる成分であった。別途同様にして当該Ｃ３Ｆの等
電点を５回測定した結果の値を示した。

（ｉｉｉ）紫外部吸収 試料をｎ−プロパツールを４０％含む０．１％トリフル
オロ酢酸をレファレンス（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）とし、
分光光度Ｓ１を用いて紫外部吸収を調べた結果を示した
。

（ｉｖ）アミノ酸配列の決定 実施例３の方法によって行った。

（Ｖ）蛋白質部分のアミノ酸組成 試料を常法により加水分解し、その蛋白部分のアミノ酸
自動分析装置を用いて分析した。尚、加水分解条件は次
の如くである。

■６ＮＨＣ，ｆｆ　　１１０℃　２４時間■４Ｎメタン
スルホンｌ＋０．２％３−（２−アミノ酸組成）インド
ール、　１１０　’Ｃ，２４時間、４８時間。

７２時間 ○Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、　１　／２Ｃｙｓ、）ｌｅｔ、Ｇａ
１Ｎｌ１２は補正○Ｖａｔ、Ｉｌｅは７２時間値 実施例１．ｒｃＨＵ−２」の樹立 著明な好中球の増多が認められた口腔底層患者の腫瘍を
ｒ＋ｕ／ｎｕマウスに移植した。このＩｉ！ｉｇは移植
約１０日後に著明な腫瘍の増大と好中球の増多が認めら
れた。この腫瘍を移植１２日後に無菌的に摘出し、１〜
２Ｉｆｗｎ３角に細切し、これを以下の如く培養した。

上記細切した腫瘍塊１０〜１５片を５０戒のプラスチッ
ク遠心管に入れ、５ｄのトリプシン溶液（１〜リプシン
０．２５％、ＥＤＴＡ　Ｏ，０２％含む）を加え、３７
°Ｃの温浴中で１０分間振とうしたのち上清を捨て、再
度、同トリプシン溶液５戒を加え、３７°Ｃで１５分間
攪拌しながらトリプシン消化を行った。

上清の細胞浮遊液を回収し、ウシ胎児血清を１ｄ加えて
トリプシンの作用を止めたのら氷中に保存した。

以上の操作を再度行い細胞浮遊液を回収し、前回の分と
合わせて１．５０Ｏｒ、ｐ、ｌＩｌ、１０分間の遠心に
より細胞ペレットを１９だ。

この細胞ペレットをウシ胎児血清を１０％含むＦ−１０
にて２回洗浄したのら、２５ｃｄのプラスチック培養フ
ラスコに細胞濃度５Ｘ１０６個／フラスコになるように
して植え込んだ。ウシ胎児血清を１０％含有覆るＦ−１
０培養液を用い、炭酸ガスインキュベーター（炭酸ガス
濃瓜５％、湿度１００％）中にて一部インキユベートし
たのち、上清を非付着細胞と共に除去し、新しい培養液
を加えて培養を継続した。培養開始後６８目に細胞がい
っばいに増殖したので、この時点で培養液を新しいもの
に替えた。翌日、この培養液を捨て、ＲＰＭ　Ｉ　１６
４０で５倍希釈した抗マウス赤血球抗体（Ｃａｐｐｅ　
Ｉ社製＞２Ｉｄと同じ＜　ＲＰＭ　Ｉ　１６４０で２．
５倍希釈したモルモット補体く極東製薬社製）２戒を加
え３７℃。

２０分間インキュベートした。

インキュベーション終了後ウシ胎児血清を１０％含むＦ
−１０にて２回洗浄しｎＬＩ／ｎｕマウス由来のフィブ
ロブラストを除去し引き続きウシ胎児血清を１０％含む
Ｆ−１０２１液を加えて、さらに２日間培養を行った後
細胞の一部を取り出し、限界希釈法によりクローニング
を行った。

得られた１１個のクローンについてＣ３Ｆ活性を調べた
とごろ、他のものよりも約１０倍高い活性を示すクロー
ン（ＣＨＵ−２＞が得られた。

実施例２．Ｃ８Ｆの単離 上述の如くして樹立された細胞が完全に密に増殖した１
５０ｃｆｆｌの培養フラスコ２本より細胞を回収し、こ
れをウシ胎児血清を１０％含有するＦ−１０培養液５０
Ｍに浮遊したのち、１５８０ｃａｉのガラス製ローラー
ボトル（Ｂｅ　Ｉ　ｃｏ社製）に移し、０．５ｒ、　ｐ
、　ｍ、の速度で回転培養を行った。

細胞がローラーボトルの内壁に完全に密に増殖した時点
で培養液を血清を含まないＲＰＭ　Ｉ　１６４０に交換
し、４日間培養したのち培養上清を回収し、ウシ胎児血
清を１０％含有するＦ−１０を加えて培養を続行する。

３日間培養したのち再び血清を含まないＲＰＭ　Ｉ　１
６４０に液替を行い、４日後に培養上清を回収した。

以下同様の操作をくり返すことにより、毎週１ボトルよ
り５００ｄずつの血清を含まない培養上清が得られ、し
かもこの方法によりかなり長期間にわたって細胞を維持
し、培養上清を回収するこ左が可能であった。

得られた培養上清５．１１を１バツチとし、これにｏ、
　ｏｉ％ツイーン２０を添加後１１ｏ１１ｏｗ　Ｆｉｂ
ｅｒ　ＤＣ−４およびＡｍ１ｃｏｎ　ＰＭ−１０（アミ
コン社製）を用いた限外濾過法により約１ｏｏｏ倍に濃
縮したのち、これを以下の順序で精製した。

（ｉ）　　直径４．６Ｃｍ、長さ９０ＣｍのＵｌｔｒｏ
ｇｅｌ八ｃＡ５４カラへ（ＬＫＢ社製）を用い、０．ｆ
５　Ｍ　ＮａＣ１および０．０１％ツイーン２０（半柱
化学社製）を含む０．０１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７
，４＞を用いて前記濃縮した培養上清５ｄを流速約５０
ｄ／時間でゲル濾過した。尚カラムはあらかじめウシ血
清アルブミン（分子ｆｆ１６７．０００）　、オボアル
ブミン（分子母４５，０００）　、チトクロームＣ（分
子看１２．４００＞にてキャリブレーションを行った。

ゲル濾過終了後各フラクションより０．１ｍｌずつを採
取し、１０倍に希釈した後、前述したｒＣ３Ａの測定方
法（ｂ）」により活性を示す両分を調べた。この結果、
先ずＶｅ＝４００〜７００ｍ１の両分がマクロファージ
優位のＣ３Ａを示し、Ｖ　ｅ　＝　８００〜１２００ｍ
１の画８分が顆粒球優位のＣ８Ａを示すことがわかった
ので、後者の両分を集めＰＭ−１０（アミコン社製）を
用いる限外濾過器によって約５ｒＩ１１に濃縮した。

（ｉｉ）　　上記濃縮画分にｎ−プロパツール（東京化
成社製、アミノ酸配列決定用）を３０％含む０．１％ト
リフルオロ酢酸水溶液を添加し、水中に１５分程度放置
したのら、１５．００Ｏｒ、　ｐ、　ｍ、　１０分の遠
心により沈澱を除去した。次いで先のｎ−プロパツール
およびトリフルオロ酢酸を含む水溶液で平衡化したｔｔ
　Ｂｏｎｄａｐａｋ　Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ社製
、セミ分収用、　８ｍＸ３０ｃｍ＞に吸着後、３０〜６
０％の直ｔｆＡａ度勾配のｎ−プロパツールを含む０．
１％トリフルオロ酢酸水溶液で順次溶出した。高速液体
クロマト装置は日立６８５−５０型を、検出は日立６３
８−４１型検出器（いずれも日立製作所′＠Ｊ）を用い
、２２０ｎｍと２８０ｎｍの吸収を同時に測定した。溶
出後、各画分より１０μρを分取１００倍希釈しただの
ち、前述の「Ｃ３Ａの測定法（ｂ）」により活性を示す
両分を調べた。この結果、ｎ−プロパツール４０％にて
溶出されるピークに活性が認められたので、このピーク
を集め再度同じ条件で再クロマトを行い上記と同様にし
てＣ３Ａを調べたところ、やはりｎ−プロパツール４０
％の位置のピークに活性が認められたので、このピーク
を集め（４フラクション−４ｄ）凍結乾燥した。

（ｉｉｉ）上記凍結乾燥粉末をｎ−プロパツールを４０
％含む０．１％トリフルオロ酢酸水溶液２００μｌに溶
解し、ＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷカラム（東洋四速社製、
　　７．５ｇＸ　６０ｃｍ　＞を用いた高速液体クロマ
トグラフィ（ＨＰＬＣ）にかＧプだ。溶出は同水溶液に
より０．４ｍｌ／分の流速で行い、フラクションコレク
ターＦＲＡＣ−１００（ファルマシア社製）により０．
４ｄずつ分取した。分取した各両分についてＣ８Ａを前
記と同様にして調べた結果、保持時間が３７〜３８分の
画分（分子量約２万に相当）に活性が認められたので、
この両分を回収し、更に分析用μＢｏｎｄａｐａｋ　Ｃ
１８カラム（４，ｓｅｘ　３０ｃｍ　）による精製を施
したのち、メインピークを回収し凍結乾燥した。得られ
た標品について前述の「Ｃ８Ａの測定方法（ａ）」によ
って検定したところヒトＧ−Ｃ３Ｆ活性を有することを
認めた。

実施例３．アミノ酸配列の決定 （ｉ）Ｎ末端アミノ酸配列の決定 試料を気相式シークエンサー（アプライドバイオシステ
ム社製）を用いてエドマン（Ｅｄｍａｎ）分解し、得ら
れたＰ　Ｔ　Ｈアミノ酸を高速液体クロマトグラフィー
装置（ベックマン・インストルメンツ社製）および旧ｔ
ｒａｓｐｈｃｒｅ−ＯＤＳカラム（ベックマン・インス
トルメンツ社製）を用いて常法により分析した。カラム
（５μｍ、直径４．６ｍ、長さ２５０＃）を開始緩衝液
（１５ｍＭｍＭす［〜リウム緩衝液ρｌ−１４，５，４
０％アセトニトリルを含む水溶液）にて平衡化したのち
、検体（２０μｍの開始緩衝液にて溶解）を注入して開
始緩衝液によるイソクラティック溶出により分離を行っ
た。流速は１．４ｍｆ！／分、カラム温度は４０°Ｃに
保持した。

ＰＴ１１アミノ酸の検出は２６９ｎｍと３２０ｎｍの紫
外部吸収を利用した。あらかじめ標準ＰＴＨアミノ酸（
シグマ社製）各２ｎｍｏｌを同一の系で分離して保持時
間を決定し、被検検体の保持時間から同定を行った。

この結果、Ｎ末端から４０残塁目までのアミノ酸配列は
次の如く決定された。

Ｈ２Ｎ−ＴＦｌｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−
Ａ　Ｉ　ａ−３ｅ　ｒ−３ｅ　ｒ−Ｌｅｕ　−Ｐｒｏ　
−ＧＩ　　ｎ−８ｅｒ−Ｐｈｅ−１−ｅｕ　−Ｌｅｕ−
Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌ　ｕ−Ｇ　ｌ　ｎ−Ｖａ
　Ｉ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ　−Ｉ　Ｉ　ｅ　−Ｇｌ　ｎ−Ｇ
Ｉ　ｙ−Ａｓｐ−Ｇ　ｌ　ｙ−△１ａ−Ａ　Ｉ　ａ−Ｌ
ｅｕ−Ｇ　Ｉ　ｎ−Ｇ　Ｉ　ｕ−Ｌ　ｙｓ　−Ｌｅｕ−
Ｃｙｓ　−Ａ　Ｉ　ａ−Ｔ　ｈ　ｒ−Ｔ　ｙｒ　−１ｊ
／５− （ｉｉ）　　ブロムシアン分解 試料を７０％ギ酸に溶かし、昇華精製したブロムシアン
２００当量を加えて、３７℃で一夜反応させた。

次に反応物を凍結乾燥後、ＴＳＫ　　Ｇ３００Ｏ３Ｗカ
ラム（東洋四速社製）を用いたＨ　Ｐ　Ｌ　Ｃで両分し
４つのピークを得た。ピークを分子量の大ぎい順にＣＮ
−１，ＣＮ−２，ＣＮ−３，ＣＮ−４と命名し、収率の
よいＣＮ−１，ＣＮ−２についてアミノ酸配列を自動気
相式シークエンサ−（アプライドバイオシステム社製）
を用いて（ｉ）と同様の条件で分析した。

その結果、ＣＮ−１はＧ−Ｃ３ＦタンパクのＮ末端から
のペプチドであることがわかった。ざらにＣＮ−２は以
下のアミノ酸配列を有していた。

Ｐｒｏ　−Ａ　Ｉ　ａ−Ｐｈｅ−Ａｌ　ａ−８ｅ　ｒ　
−Ａ　ｌ　ａ−Ｐｈｅ−ＧＩ　ｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａ
　Ｉ　ａ−Ｇ　Ｉ　ｙ−ＧＩ　Ｖ−Ｖａ　ｌ　−Ｌｅｕ
　−ｖａ　ｌ　−Ａ　ｌ　ａ−３ｅｒ−Ｈｉ　５−Ｌｅ
ｕ　−１ｎ− （ｉｉｉ）　　トリプシン分解 試料を８Ｍ尿素を含む０．１〜１トリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，４＞に溶かし、０．１％２−メルカプトエタノー
ルを含む０．１Ｍ　トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）を
加えて最終的に２Ｍの尿素となるように調整した。次い
で試料と酵素が５０＝１となるようにＴＰＣＫ処理トリ
プシン（シグマ社製商品名）を加え、２５℃で４時ｅ４
反応ざＵた後、さらに同量のＴＰＣＫ処理トリプシンを
加えて、再度２５℃で１６時間反応させた。反応後、反
応物を０８カラム（山村化学社製）を用いた高速逆相カ
ラムクロマトグラフィーに付した。溶出は０．１％ＴＥ
Ａを含むｎ−プロパツールを用い、ｎ−プロパツール濃
度を５％〜６０％に直線的に上げて行った。２８０ｎｍ
の紫外部吸収を測定してｊｑられたピークのうち、メイ
ンビークについて（ｉ）と同条件下に自動気相式シーク
エンサー（アプライドバイオシステム社製）を用いてア
ミノ酸配列を分析した。その結果、メインピークは（ｉ
ｉ）のＣＮ−２断片の一部を含む以下の配列を有するペ
プチドであることがわかった。

Ｇ　Ｉ　ｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−ｙａ　Ｉ　−Ａ　Ｉ　ａ
　−ＡＳｐ−Ｐｈｅ−Ａｌ　ａ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ　−１
Ｉ　ｅ−Ｔｒｐ−Ｇ　Ｉ　ｎ−Ｇ　ｌ　ｎ−Ｍｅｔ　−
Ｇ　ｌ　ｕ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｌｅｕ　−Ｇ　Ｉ　ｙ−Ｍｅ
ｔ　−Ａ　Ｉ　ａ−Ｐｒｏ−Ａ　ｌ　ａ−Ｌｅｕ−Ｇ　
ｌ　ｎ−Ｐｒｏ−Ｔｈ　ｒ−Ｇ　Ｉ　ｎ−Ｇ　Ｉ　Ｖ−
Ａ　ｌ　ａ　−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ａ　ｌ　ａ−Ｐｈｅ−
Ａ　Ｉ　ａ−ｅｒ− 実施例４．ＤＮＡプローブの作成 （＋）プローブ（ＩＷＱ）の合成 実施例３．（ｉｉｉ）で得られたアミノ酸配列の中から
Ｉ　Ｉ　ｅ−Ｔｒｐ−Ｇ　Ｉ　ｎ−Ｇ　Ｉ　ｎ−Ｍｅｔ
　−Ｇ　Ｉ　ｕ　−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｌ　ｅｕ　−Ｇ　ｌ　
ｙ−Ｍｅｔで示される１０個のアミノ酸の配列に基づい
て、３０個の連続するヌクレオチドを得たく図１）。図
１の配列に於いて、例えば５′−末端から９位のヌクレ
オチドはｄＡおよびｄＧを等ω含む混合物であることを
示す。原料のヌクレオチドは主にダイマーを使用し、必
要に応じて随時モノヌクレオチドも使用した。グラスフ
ィルター付きカラムに出発原料のヌクレオチド樹脂Ａｐ
−ｄ　（Ｇ）（ヤマサ鵠油社製）２０１ｆｔｇを入れ塩
化メチレンにて洗浄を繰り返した後、３％トリクロロ酢
酸を含む塩化メチレン溶液にて、４，４′−ジメトキシ
トリチル基を脱Ｍμしめ、次いで１ｄの塩化メチレンで
カラムを数回洗浄した。無水ピリジンで洗浄して溶媒を
置換したのちヌクレオチドダイマー（ＤＭＴｒ）ＡｐＴ
ｐ　（ＮＨＲ３＞（日本ゼオン社製；　Ｎ曲３はトリエ
チルアンモニウム、ＤＭＴｒはジメトキシトリデルを示
す）　２０ｍｇと０．２１ｎｉのピリジンを加えて真空
ポンプにてカラム内を真空乾燥した。次いで、２，４．
６−トリメチルベンゼンスルホニルー３−ニトロｌ〜リ
アゾリド（ＭＳＮＴ、和光紬薬社製）　２ｏｍｇと無水
ピリジン０．２ｒｎｉを加えた後、カラム内を窒素ガス
で置換して、室温下に４５分間時々撮とうさせることに
よってヌクレオチド樹脂とダイマーを縮合させた。反応
終了後、ピリジンにてカラムを洗浄し、次いで未反応の
ＯＨ基を過剰の無水酢１ｍ−４−ジメチルアミノピリジ
ンにてアセデル化した後、再びカラムをピリジンで洗浄
した。以下同様に、（ＤＨＴｒ）ＩｐＩＮＨＲ３）　、
　（ＤＨＴｒ）ＧｐＧＥ）（ＮｌｌＲ３）　、　（ＤＨ
Ｔｒ）ＩｐＩＮＨＲ３）　、　（ＯＨＴｒ）ＣＤＴＩ）
（Ｎ町）と（ＤＨＴｒ）ＴＤＴｐＩＮｌｌＲ３）の等量
混合物。

（ＤＨＴｒ）＾ｐＡｐＩＮＨＲ３）と（ＤＨＴｒ）八〇
ＧＩ）（ＮＨＲ３）の等量混合物、　（Ｄ）ｌＴｒ）Ａ
Ｉ）ＧＤ（ＮｌｌＲ３）と（開Ｔｒ）Ｇｌ）ＧＤ（Ｎｌ
ｌＲ３）の等量混合物、　（ＤＨｒｒ）ＧｐＡｐＩＮｌ
ｌＲ３）　、　（開Ｔｒ）ＴｐＧｐＩＮ曲３　）　、　
（ＤＨＴｒ）＾ｐＡｐＩＮｌｌＲ３）と（ＤＨＴｒ）Ｇ
ｐＡｐＩＮｌｌＲ３）の等量混合物、　（ＤＨＴｒ）Ｃ
１）ＡＩ）（ＮｌｌＲ３）　。

（開Ｔｒ）ＡＩ）ＡＥ）（ＮＨＲ３）と（ＤＨＴｒ）＾
１）Ｇｌ）（ＮＨＲ３）との等ＭＧ合物、　（［））ｌ
’ｒｒ）ＧｐＣｐＩＮｌｌＲ３）　、　（Ｄ）ｆｒｒ）
ＴｐＧｐＩＮｌｌＲ３）　、　（ＤＨＴｒ）ＩＤ（ＨＥ
ＩＲ３）、（ＤＭＴｒ）ＡＩ）ＴＩ）（ＮｌｌＲ３）［
（ＤＨ［ｒ）ＩｐＩＮｌｌＲ３）はヤマサ起油社製、そ
の他は全て日本ゼオン社製］の順で、前述の操作を繰り
返すことによって縮合させた。最終段階の反応終了後、
アセデル化覆ることなしに、ピリジン、塩化メチレン、
ニーデルの順で樹脂を洗浄した後、乾燥させた。乾燥さ
せた樹脂を１Ｍテトラメヂルグアニジンおよび１Ｍα−
ピコリンアルドキシムを含むジオキサン１ｍ、ピリジン
０．５ｄ、水０．２−の混合液１．７ｄに懸濁した後、
−夜室温にて放置した後、１００〜２００　　μｍまで
減圧濃縮した。

この濃縮液に少量（２〜３滴）のピリジンを加えた後、
濃アンモニア水２〜３威を加え５５℃で６時間加温した
。次いで酢酸エチルを加えて抽出分離し、得られた水層
を減圧濃縮した後、５０ｍＭトリエチルアンモニウム酢
酸溶液（ＩＩ　７．ｏ）に溶解せしめてＣ−１８カラム
（１，ＯＸ　１５ｃｍ、　Ｗａ　ｔ　ｅ　ｒＳ社製）を
用いたカラムクロマトグラフィーに付した。溶出は、５
０ｍＭトリエチルアンモニウム酢酸溶液（ｐＨ７，０）
中１０％〜３０％の直線濃度勾配のアセトニトリルで行
い、アセ１〜ニトリル′ａ度が２５％付近の位置で溶出
されるピーク画分を減圧濃縮した。

この濃縮液に８０％酢酸を加えて室温下に３０分間放置
した後、酢酸エチルを加えて抽出・分離し得られた水層
を減圧下に濃縮した。得られた濃縮液は、ＣＩ８カラム
（センシュー科学社製、５ＳＣ−ＯＤＳ−２７２，５φ
Ｘ　２００＃）を用いた高速液体クロマトグラフィーに
付して、さらに精製した。

溶出は５０ｍＭトリエチルアンモニウム酢酸溶液（１１
７，０）中１０％〜２０％の直線濃度勾配のアセトニト
リルを用いて行い、１０Ａ　２６０Ｕｎ！［５以上の収
量で合成りＮＡが得られた。

得られたオリゴヌクレオチドは）ＩａＸａｍ−Ｇ　ｉ　
Ｉ　ｂｃｒｔ法（Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍ　、　６５巻
４９９頁（１９８０）により塩基配列を調べた結果、図
１に示された配列を有していることが確認された。

（ｉｉ）プローブ（八）の合成 実施例３．　Ｈ；）で１ｑられたアミノ酸配列の中から
Ｍｅｔ−ｐｒｏ−Ａ　Ｉ　ａ−Ｐｈｅ−Ａ　ｌ　ａで示
される５個のアミノ酸の配列に基づいて１４個の連続す
るヌクレオチドを得た。（図１）合成は、プローブ（Ｉ
ＷＱ）と同様な方法で行いヌクレオチド樹脂ＡＰ−ｄ　
（Ｔ）（ヤマサ起油礼製）に（Ｄ）ｌＴｒ）ＣＤＡｐＩ
ＮＨ３）　　：　（ＤＭＴｒ）ＧｐＧｐＩＮｌｌＲ３）
；　　（ＤＨＴｒ）ＣｐＡＩ）（ＮｌｌＲ３）　　、　
　（ＤＨＴｒ）ＣＤＴＩ）（ＮＯＲ３）　　。

（ＤＨＴｒ）ＣＤＧｐＩＮｌｌＲ３）および（Ｄ）ｌＴ
ｒ）Ｃｔ）Ｃ１）（ＮＯＲ３）の等景況合物：　（Ｄ）
ｌＴｒ）ＡＩ）Ｇｌ）（ＮＯＲ３）　　、　　（Ｄ）汀
ｒ）ＴｐＧｐＩＮＯＲ３）　、　（ＤＭＴｒ）Ｇｌ）Ｇ
ｐＩＮｌｌＲ３）および（Ｄｕ丁ｒ）ＣｐＧｐＩＮＨＩ
？３）の等景況合物；　（Ｄ）ｌＴｒ）八１）ＡＩ）（
ＮｌｌＲ３）　　：（ＤＨ’ｒｒ）ＣｐＡｐＩＮｌｌＲ
３）と（ＤＨＴｒ）ＣｐＧｐＩＮｌｌＲ３）の等景況合
物（Ｄ）ｌＴｒ）ＧｐＩＮＨす、）（いずれも日本ゼオ
ン社製）の順に縮合させて約１０Ａ　２６０　Ｉｎ！［
３の合成りＮＡを１７だ。得られたオリゴヌクレオチド
の塩基配列をＨａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法により調べ
たところ図１に示された塩基配列を有していることが確
認された。

（ｉｉｉ）プローブ（ＬＣ）の合成 アプライドバイオシステム社のＤＮＡ合成機３８０Ａに
より、自動合成を行った。この方法はＣａｒｕｔｈｅｒ
ｓ等の記載した原理（Ｊ、△ｍ、Ｃｈｅｍ。

Ｓｏｃ　、、　　１０３巻３１８５頁（１９８１））に
基づいており、ホスホアミダイト法と称されている。

５′のジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ）を脱保護した
ｄＧ−３（Ｓは支持体）にテトラゾールで予め活性化し
た（ＤＭＴｒ）−ｄＴのホスホアミダイト体を縮合させ
た後、未反応の水Ｍｌをアセデル化し、次いで水存在下
でヨウ素酸化を行ってリン酸体に導いた。ＤＨＴｒ基を
脱保護し、以後同様に縮合を繰り返して図１に示される
如き配列の２４個のヌクレオチドを合成した。得られた
ヌクレオチドを支持体から開裂せしめ脱保護した後、０
１８カラム（センシュー科学社製５ＳＣ−ＯＤＳ−２７
２）を用いた逆相系高速液体クロマトグラフィーにて精
製した。

実施例５．　ＣＩＩＵ−２細胞の培養とｍＲＮへの精製
１）　　ＣＨＬＪ−２細胞の培養と細胞の回収樹立され
たＣＨＵ−２細胞を１５０ｃｒｊｒの培養フラスコ２本
に完全に密に増殖させた後、これをウシ胎児血清を１０
％含有するＲ　ＰＭ　Ｉ　１６４０培養液５００ｄに浮
遊させたのち、１５８０ｃＩＡのガラス製ローラーボト
ル（３ｅ　ｌ　ｃｏ社製）に移し、０．５ｒ、　ｐ、　
ｍ、の速度で４日間回転培養を行った。細胞がローラー
ボトルの内壁に完全に密に増殖した時点で、ローラーボ
トルから培養液を除き、必らかじめ３７°Ｃに加温した
ＥＤＴＡを０．０２％含む生理食塩水１００ｍ１を加え
、３７°Ｃで２分間加温後、ピペット操作にて細胞をは
く離μしめた。得られた細胞懸濁液を１５０Ｏｒ、　Ｏ
，ｍ、　１０分間の遠心にて細胞ペレットを得る。

細胞をＥＤＴＡを含まない生理食塩水５ｄに再び懸濁し
、１５００ｒ、　ｐ、　ｍ、　ｉｏ分間遠心にて細胞ペ
レットを得た（湿重量約０．８ｇ）、このようにして得
られた細胞はＲＮＡ抽出操作を行うまで一８０°Ｃにて
凍結保存する。

２）ｍＲＮＡの精製 上記の如くして（ｑられたＣＨＵ−２細胞からのｍＲＮ
Ａの単離は本質的に”）ｆｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎ
ｉｎｇ　”［ＨａｎｉａｔｉＳ等、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ
ｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒ、　　１９６頁（１９８２）］
に記載されているようにして実施した。

凍結保存されていたＣ　ＨＵ　−２細胞（湿重量３．８
９）に２０ｍの６Ｍグアニジン溶液（６Ｍグアニジンヂ
オシアナート、５ｍＭクエン酸すトリウム（ｐＨ７，０
＞　、　　０．１Ｍ／β−メルカプトエタノール、０．
５％ザルコシル硫酸ナトリウム）に懸濁し、ＶＯｒｔｅ
Ｘミキサーにて２〜３分よく混合した後、１８Ｇの注射
器を装てんした２０ｄ容の注射器を用いて１０回吸入排
出を繰り返した。ベックマン社製ＳＷ・　４０Ｔｉロー
ターに合うポリアロマ−製の遠心チューブに６ｒｎｌの
５．７Ｍ　　Ｃ３ＣＩ−０，１ＭＥＤＴＡ。

（ｐＨ７，５＞を先に加えておき、チューブが満たされ
るように上述の細胞が壊れて粘稠になったグアニジン溶
液的６ｒｎ１を重層した。このようにして調製された遠
心チューブ４本を３０．０００ｒ、　ｐ、　ｍ、、２０
℃で１５時間遠心した後、得られたペレットを少量の７
０％エタノールを用いて３回洗浄した。

各々のチューブから得られたベレットを合して５５０μ
Ｉの水に溶解ＵしめＮａＣ１濃度が０．２Ｍとなるよう
に調整したのち、フェノール−クロロホルム（１：１）
処理、クロロボルム処理後、２．５倍容吊のエタノール
を加えてエタノール沈澱を行い全ＲＮＡｅｉ９だ。（湿
細胞３．８ｇより全ＲＮＡ的１０．ｌｆｆ１ｇを１９だ
。）全ＲＮＡからポリ（Ａ　　＞−ＲＮＡの精製は以下
の如く行った。この方法はｍＲＮＡが３′末端にポリＡ
鎖を付加していることを利用したアフィニティークロマ
トグラフィーである。オリゴ（ｄＴ）−セ）Ｉロース（
ｐ−Ｌ　　Ｂｉｏｃｈｅｉｉｃａｌｓ社製Ｔｙｐｅ７）
を用い、吸着は全ＲＮＡを吸着緩衝液（１０ｍＭトリス
−塩酸（ｐＨ７，５＞　、　　０．５Ｍ　　ＮａＣｌ、
　　１ｍＭ　　ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ溶液を含む。

）に溶解し、６５℃で５分間加熱した後、同溶液にて充
てんされたオリゴ（ｄＴ）−セルロースカラムに通過さ
せて行い、溶出はＴＥ浴溶液１０ｍＭトリス−塩酸（Ｄ
Ｈ７，５）　、１ｍＭ　　ＥＤＴＡを含む。）で行った
。未吸着通過液は再び同カラムに通して同様に溶出操作
を行い、１回目の溶出液と混合した。

このような操作を用いて、ポリ（Ａ＞−ＲＮＡ　　・４
００μｇを１９だ。

このようにして調整したｒｒｌＲＮＡを５ｃｈｌｅｉｆ
とｗｅｎｓ　ｉ　ｎｋの実験技術＠　（Ｐｒａｃｔｉｃ
ａｌ　ＨｅｔｈＯｄＳ　ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、　Ｎ
ｅｗＹｏｒｋ、　ｌｌｅｉｄｅｒｂｅｒｇ、　Ｂｅｒｌ
ｉｎ、　（１９８１））中に記載されている方法と同様
の操作で、ショ糖密度勾配遠心法によりサイズ画分した
。

すなわら、５Ｗ４０Ｔｒ　ｏ−ター（Ｂｅｃｋｍａｎ社
製）用チューブに５％〜２５％のショ糖密度勾配を作る
。

ショ糖溶液は０．ＩＭ　　ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス−
塩Ｍ、　　　（ｐＨ７，５＞　　、　　１ｍＭ　　　Ｅ
ＤＴＡ、　　　０．５％ＳＤＳの溶液にそれぞれ５％、
２５％の割合いでＲＮａｓｅフリーのショ糖（Ｓｃｈｗ
ａｒｚ　／）ｌａｎｎ社製）を含んでいる。

上記で述べた如き方法で調製したｍＲＮＡ　（ポリ（Ａ
　　）−ＲＮＡ）　８００μＱを２００μｍ〜５００μ
ｍのＴＥ浴溶液溶解せしめ、６５℃で５分間加熱後急冷
した後、ショ糖密度勾配液の上にのせる。

３００００ｒ、　ｐ、　ｍ、にて２０時間遠心後０．５
ａｄ！ずつの分画を集め２６０ｎｍの吸光度を測り、同
様（行った標準ＲＮＡ　（２８３，１８８，５３のリポ
ソームＲＮＡ）の位置に基づいて、分画されたＲＮＡの
サイズを決めると同時に各分画のＧ−Ｃ３Ｆ活性をアフ
リカッメガエル（ｘｅｎｏｐｕｓ　Ｉａｅｖｉｓ）の卵
母細胞系を用いて調べた。すなわち各分画のｍＲＮＡを
１μｇ／μｍの濃度の水溶液に調製し、ツメガエル（生
後約１年）から取り出した卵母細胞１個に５０ｎｇのｍ
　ＲＮ　Ａの割合いで注入した後、９６穴のマイクロタ
イタープレートの１穴に卵母細胞を１０個ずつ入れ、そ
れぞれ１００μｍのパース培地（８８ｍ）ｌＮａＣｌ　
、　１ｍＭＫＣＩ　、　　２．４ｍＭ　ＮａＨＣＯ３。

０．８２　ｍＨＭｇＳＯ４、０，３３ｍＨｃａ　（ＮＯ
３＞　２　。

０．４１　ｍＨＣａＣ１２、７，５ｍＭトリス−塩酸（
ｐＨ７，６）　、ペニシリン１０１ｎｌ／Ｉ　、ストレ
プトマイシン硫酸１０ｍ９７ｆｌ　）中で４８時間室温
で培養した後土清を回収し、濃縮・精製してＧ−Ｃ３Ｆ
活性を測定する。

この結果、１５〜１７３画分にＧ−Ｃ８Ｆ活性が認めら
れた。

実施例６．ｃＤＮＡの合成（ＰＢＲ系ｃＤＮＡライブラ
リーの構築） 前述の方法で１９られたポリ（Δ　）−ＲＮＡから１−
ａｎｄ等の方法［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ
　、　９巻２２５１頁（１９８１）］に基づき、Ｇｕｂ
ｌｅｒとｌＩｏｆｆｍａｎの方法［Ｇｅ　ｎ　ｅ、　２
５１２６３頁（１９８３）　］を加味してＣＤＮＡを得
た。

１）１本ｒＡｃＤＮＡ（７）合成 エツベンドルフ社製１．５ｄ容デユープに以下の如くの
順序で試薬を入れる。８０μｇの反応緩衝液（５００ｍ
Ｍ　　ＫＧ、！！　、　５０ｍＭ　　ＭＱＣ，Ｉｌ　２
．２５０ｍＭトリス−塩酸、　ＤＨ８，３）　、　２０
μｍの２００　ｍ）ｆジチオスレイトール、３２μ！ｌ
の１２．５ｍＭ　　ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄ
ＣＴＰ、’ｄＴＴＰを各々１２．５ｍＭ含む）、１０μ
＋の５２−３”Ｐ−ｄＣＴＰ（アマジャム製、　ＰＢ　
１０２０５）　、　３２μｍのオリゴ（ｄＴ）　　　　
　（Ｐ−Ｌ　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製。

５００μ（］　／ｄ）、２０μｍのポリ（Ａ　　）−Ｒ
ＮＡ（２，１μｇ／μｍ）、蒸溜水２０６μｍの訓　４
００μｍの反応液を６５°Ｃで５分間加熱後、４２°Ｃ
で５分間加温する。この反応液に逆転写酵素（宝酒Ｂ’
！！＞１２０単位を加え、ざらに４２°Ｃ１２時間反応
させた後、ＲＮａＳｅインヒビター（Ｂｅｔｈｃｓｄａ
　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社Ｍ）２
μｌ　、２０μ＋のＴＥ温溶液１６μｍの１００　ｒｎ
Ｍピロリン酸すｌ−リウム、４８単位（４μｍ）の逆転
写酵素を追加して、今度は４６°Ｃ２時間反応Ｉしめた
。０．５Ｍ　　ＥＤＴＡ　　８μｍ。

１０％ＳＤＳ　　８μｍを加えて反応を停止させた後、
フェノール−クロロホルム処理、エタノール沈澱（２回
）を行い一本鎖ＣＤＮＡを得た。

２）１本鎖ＣＤＮＡへのｄＣ−鎖付加 上記で得られた一本鎖ＣＤＮＡを６０μｍの蒸溜水に溶
解後、６０μＩのｄＣ−鎖付加緩衝液（４００ｍＭカコ
ジル酸カリウム；５０ｍＭ　トリス−塩酸Ｄ）ｌ−１６
，９）　　：　４ｍＭジヂオスレイトール；’１ｍＭＣ
ｏＣｌ２　；１ｍＭ　　ｄＣＴＰ）に加え、３７°Ｃで
５分間加温した。この反応液にターミナルトランスフェ
ラーゼ（２７ｕｎｉｔ／μｌ　、　Ｐ−Ｌ　　Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｃａＩｓ社製）３μｍを加えて３７℃で２，５
分間反応した後、フェノール−クロロホルム処理（１回
）、及びエタノール沈澱（２回）行い、１００ｍＭＮ　
ａ　　・ＣＩを含むＴＥ溶液４０μｍに溶解ｕしめた。

３）２本鎖ＣＤＮＡの合成 上記４（）μｍのＤＮＡ溶液に４μｍのオリゴ（ｄＧ）
１２−１３　（２００μｇ／ｎｄ２．　Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏ
ｃｈｃｍｉｃａｌｓ社製）を加え６５°Ｃ５分間、続い
て４２℃で３０分間加温した後、反応液をＯ′Ｃに保っ
た。　この反応液に緩衝液８０μｌ　　（１００ｍＭト
リス−塩酸、ＤＨ７，５，２０ｍＭＭｇＣＩ　　２　　
、　５０ｍＭ　　（ＮＨ４）２　　ＳＯ４、５００ｍＭ
　　ＫＣＩ＞、４μｌの４ｍＭ　　ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ
、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰを各々４ｍＭ含む）、
６０μ＋の１ｍＭβ−ＮＡＤ、及び２１０μｍの蒸溜水
、２０μｍのＥ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼ■（宝
酒造社製）、１５μｌの　Ｅ、　　ｃｏｌｉＤＮＡリガ
ーｔｌ；（宝酒造社）、１５μｍのＥ、ｃｏｌｉ　ＲＮ
ａｓｃ　ｔ−１（宝酒造社）を加え１２℃にて１時間反
応させた後、ざらに４μｍの４ｍＭｄＮＴＰを追加し、
２５℃で１時間反応して、フェノール−クロロホルム処
理、エタノール沈澱（１回）を行って、約８μｑの２本
鎖ＣＤＮＡを１７た。この２本鎖ＣＤＮＡをＴＥ温溶液
溶解せしめ、１．２％アガロースゲル電気泳動を行い、
約５６０塩基対（ｂｐ）〜２キロ塩基対（Ｋｂｐ）の大
きざに相当する部分をワットマンＤＥ８１　（ワットマ
ン社製）に吸着させ溶出回収したところ、約０．２μｑ
が回収された。

４）２本鎖ＣＤＮＡへのｄＣ−鎖付加 上記の如く得られた２本鎖ＣＤＮＡを４０μｍのＴＥ温
溶液溶解し、２）の項で）ホべたｄＣ−鎖付加緩衝液８
μｍを加え３７℃で２分間加温した後、１μｍのターミ
ナルトランスフ１ラーゼ（２７ｕｎｉｔ／μｍ）を加え
て３７°Ｃで３分間反応せしめた。反応液を直ちに０℃
に冷却し０．５Ｍ　　ＥＤＴＡ１μｍを加えて反応を停
止した後、フェノール−クロロホルム処理、エタノール
沈澱を行い、得られた沈澱をＴＥ溶液１０μｍに懸濁し
た。

ＳＦ　ｐＢＲ系ＣＤＮＡライブラリーの構築市販のオリ
ゴ（ｄＧ）鎖付加ｐＢＲ３２２ベクタ−（ベセスダリサ
ーヂラボラトリーズ社製、１０ｑｇ／μｍ）４μｍと上
記ｄＣ−鎖付加２本鎖ｃＤＮＡ２μｍを７５μｍの０．
ＩＭ　ＮａＣｌを含むＴＥ温溶液中でアニールさせた。

アニールは６５℃、５分加温した後４０℃にて２時間加
温、その後、室温になるまで放置して行った。

一方、Ｍａｎｉａｔｉｓらの実験１ｊ［Ｈｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｆｌａｒｂｏｒ、　　２４９
頁（１９８２）］に記載され−でいる方法等を用いて大
腸菌Ｘ１７７６株からコンピテント細胞を調製し、上記
アニールされたプラスミドにより形質転換を行い、トラ
ンスフォーマント（形質転換体）が得られた。

実施例７．ｃＤＮＡ合成（λフアージ系ライブラリーの
構築） １）１本鎖ＣＤＮＡの合成 実施例５で述べた方法に従って３．８ｇの凍結保存ＣＩ
−ＩＬＩ−２細胞から２回オリゴ（ｄＴ）セルロースカ
ラムによる精製を経て４００μＱのポリ（Ａ　　＞−Ｒ
ＮＡを（ｑた。

このポリ（Ａ　　）−ＲＮＡ１２μｇを溶解したＴＥ溶
液１０μｍを１０μｇのアクチノマイシンＤ（シグマ社
製）を含む反応デユープに入れた後、以下の順序で試薬
類を加えた；２０μｍの逆転写緩衝液（２５０ｍＭ　ト
リス−塩酸（ｐＩ−１８，３）　、　４０ｍＭＭ０ＣＩ
２，２５０　ｍＭ　　ＫＣＩ＞２０μｌの５ｍＭｄＮＴ
Ｐ　（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰを各々
５ｍＭ含む）、２０μｌのオリゴ（ｄＴ）１２−ＩＢ　
　（０，２μｇ／１ａｌｌ　　Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｃａｌｓ礼製）、１μＩのＩＭジチオスレイト−ル、
２　μｍの３０ｕｎｉｔ／μｍのＲＮａＳｅ（プロメガ
バイオチク社）。

１０μｍの逆転写酵素（１０ｕｎｉｔ／μｍ生化学工業
社製）、１μｌのα−［３２ｐ］　ｄＡｒＰ　（１０μ
Ｃｉアマシ【ｌム社製）、１６μｍの水で計　１００μ
ｍの液量の反応液になる。反応液を４２℃で２時間保っ
た後、５μｍの０．５Ｍ　　ＥＤＴＡ及び１μＩの２０
％ＳＤＳを加えて反応を停止した。フェノール−クロロ
ホルム（１００μｍ）処理、エタノール沈澱（２回）を
行って約４μｇの１本鎖　ｃＤＮＡを１ｑた。

２）２重鎖ｃＤＮＡの合成 上記の如く得られたｃＤＮＡを２９μｍのＴＥ温溶液溶
解し以下の順序で試薬類を加えて反応液とした；２５μ
ｍのポリメーラーゼ緩衝液（４００ｍＭｔｌｅｐｅｓ　
　（ｐＨ７，６）　；１６ｍＭ　　ＭＯＣ１２：６３ｍ
Ｍのβ−メルカプトエタノール １０μ＋の５ｍＭ　　ｄＮＴＰ：　　１．０μｍの１５
ｍＭβ−ＮＡＤ：　１．０μｍのα−［３２ｐ］ｄＡＴ
Ｐ（１０μＣｉ／μｌ　）　　：　　０．２μＩ　Ｅ，
　　ｃｏｌｉ　ＤＮＡリガーｔ’　（　６０ｕｎｉｔ／
μＩ宝酒造社製）：　５．０μ＋のＥ。

ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼＩ　（Ｎｅｗ　Ｅｎａｌ
ａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ礼，　１０ｕｎｉｔ／μｌ　）
　：　０．１μｌのＲＮａＳｅＨ（６０ｕｎｉｔ／μｍ
宝酒造社製）　：２８．７　　μｌの蒸溜水。

反応液を１４℃で１時間インキュベートした後、室温に
もどして、さらに１時間インキニーベートした。次いで
５μｍの０．５Ｍ　　ＥＤＴＡと１μｍの２０％ＳＯＳ
を加えて反応を停止させ、フェノール−クロロホルム処
理、エタノール沈澱を行った。

得られたＤＮＡを０．５關　ＥＤＴＡ２０μｍに溶解せ
しめ、３μｍの１＜＋−ｅｎｏｗ緩衝液（　５００ｍＭ
トリス−塩酸（ｐＨ　ａ．ｏ）　、　５０ｍＭ　　Ｍ（
ｊｃ　１２　　＞　。

３μｍの５ｍＭ　　ｄＮＴＰ，及び水４μｌを加えて反
応液を調製した後、１μｍのＤＮＡポリメラーゼ（ＫＩ
　ｅｎｏｗ断片）（宝酒造社製）を加えて３０℃１５分
インキュベートした。

この反応液に７０μｍのＴＥ温溶液加えて希釈し、さら
に５μｍの０．５Ｍ　　ＥＤＴＡ，１μｍの２０％ＳＤ
Ｓを加えて反応を停止した。反応液をフェノール−クロ
ロホルム処理し、エタノール沈澱を行って約８μ９の２
重鎖ｃＤＮＡを得た。

３）２本鎖ＣＤＮＡのメチル化 ２）の項で合成した２重鎖ｃＤＮＡの水溶液３０μｍ、
メチル化緩衝液（５００ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ　８．
０）　、　５０ｍＭ　　ＥＤＴＡ＞　４０μ＋　、　Ｓ
Ａ）ｌ溶液（　８００μＭＳ−７デノシルーし一メチル
メチオニン（ＳＡＭ）、５０ｍＭ　　β−メルカプトエ
タノール）２０μｍ，水１００μｍを加えた混合液にＥ
ＣＯＲＩＣＯＲ−ゼ（Ｎｅｗ　［ｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏ
ｌａｂｓ社。

２０ｕｎｉｔ／μｌ　）　１５μｌを加えて全反応液を
２００μｍとし、３７℃２時間インキュベートした。フ
〒ノール処理、エーテル処理を行った後、エタノール沈
澱を行ってＤＮＡを回収した。

４）　　ＥｃｏＲＩリンカ−の付加 上記メチル化された２本鎖ＤＮＡ約１．２μｇにリガー
ゼ緩衝液（２５０ｍＭトリス−塩酸　（ｐＨ７，５）　
、　　１００ｍＭ　　ＭＱＣ１２）　　１．５μｌ　、
あらかじめリン酸酸化されたＥＣ０ＲＩリンカ−０，５
μｍ　　（１０ｍｅｒ、宝酒造社ｉ１）、１．５μｌの
１０ｍＭＡＴＰ、　　１００ｍＭジヂオスレイトール１
．５μｍ　。

２μｍの１１２０を加え、反応液を１５μ］としてＴ４
ＤＮＡリガーゼ（３，４ｕ／μｔ　、宝酒造社製）０．
７μｍ加えて４℃で一晩反応させた後、６５°Ｃにて１
０分間加熱しりガーゼを失活させた。この反応液をさら
に１００ｍＭ　トリス−塩酸（ｐＨ７，５）　。

５ｒＴＩＭ　　ＭｇＣ１２、５０ｍＭ　　ＮａＣｌ　、
　　１００μ（１／ｍＩｌのゼラチンの′ａ度で仝液量
が５０μｍになるように調製した後、ＥｃｏＲＩ　（１
０ｕｎｉｔ／μｌ　）３．５μＩ加え、３１℃、２時間
反応させた。次いで０、５ＭのＥＤＴＡ　２．５μｍ、
２０％５ＤＳ０．５μｍを加えた後フェノール−クロロ
ボルム処理を行いエタノール沈澱によりＤＮＡを回収し
た。この後Ｕｌｔｒｏｇｅｌ　ＡｃＡ３４　（Ｌ　Ｋ　
Ｂ社製）のゲル濾過法あるいはアガロースゲル電気泳動
法にて未反応のＥＣ０ＲＩリンカ−を除去し、リンカ−
付加２木鎖ｃＤＮＡ約０．５〜０．７μｑを回収した。

５）２末鎖ｃＤＮＡとλｇｔｉｏベクターの結合上記の
リンカ−付加２本鎖ＣＤＮＡを２．４μｇの予じめＥＣ
０ＲＩ処理したλに］ｔ１０ベクター（ベクタークロー
ニングシステム社）、リガーゼ緩衝液（２５０ｍＭトリ
ス１ｍ、　１００　ｍＭ　　Ｍｃ＋ＣＩ２　＞１．４μ
ｍ、蒸溜水６．５μｍを加えて、４２°Ｃ１１５分間処
理した後１０ｍＭ、ＡＴＰ１μｌ　、０．１Ｍジチオス
レイトール１μＩ　、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ０．５μｍを
加え仝母を１５μｍとした後、１２°Ｃで一晩反応させ
た。

６）インビトロパッケージング 上記５）で得られた組換え体ＤＮＡの約１７３をインビ
トロパッケージングキット（プロメガ　バイオチク社）
を用いてパッケージングし、ファージプラークを１９だ
。

実施例８．プローブ（ＩＷＱ）によりｐＢＲ系ライブリ
ーのスクリーニング コロニーの成育した寒天培地上にワットマン５４１′ａ
紙をのせ３７℃で２時間放置した。以下、ＴａＵｂとＴ
ｈｏｍｐｓｏｎの方法［Ａｎａｌ、　Ｂｉｒｃｈｅｎ　
、１２６巻２２２頁（１９８２）］に準じて濾紙を処理
した。

すなわら、５４１濾紙にコロニーを移した後、クロラム
フェニコール（２５０μｇ／μｍ）を含んだ寒天培地に
移し、さらに３７°Ｃで一部装置した。

５４１濾紙を取り出した後、室温下で０．５　Ｎ　　Ｎ
ａ０１１溶液を浸した濾紙上に３分間数置し、これを２
回くり返した。以下同様な操作を０．５Ｍトリス−塩酸
（ｐＨ８）溶液を用いて３分間、２回行ない、さらに４
°Ｃ下に０．０５Ｍトリス−塩酸（ｐＨ８＞溶液で３分
、１．５ｍｙ／Ｉｎ１のりゾチーム液（０，０５Ｍトリ
ス−塩酸（ｐＨ８＞、２５％ショ糖を含む）で１０分間
、次いで３７℃下に１　Ｘ５ＳＣ（０，１５ＭＮａＣＩ
および０．０１５クエン酸ナトリウム）溶液で２分間、
２００μｇ／ｄプロデアーピｋを含む１ＸＳＳＣ溶液で
３０分、再び室温下に１ＸＳＳＣ溶液で２分間、９５％
エタノール溶液で２分間、２同行った後、５４１濾紙を
乾燥させた。冑られた乾燥５４１濾紙を室温下にフェノ
ール：クロロボルム：イソアミルアルコール ＩＪスーｍｌ（１）Ｈ８．５）、　　１００ｍＭ　　Ｎ
ａＣ１。

１０ｍＭ　　　ＥＤＴＡで平衡化したもの）溶液に３０
分間浸した。以下同様の操作を５ＸＳＳＣ溶液で３分間
、３回次いで９５％エタノール溶液で３分間、２回行っ
た後、濾紙を乾燥させた。

プローブ（ＩＷＱ＞を常法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌ
ｏｎｉｎｑを参照）に従って３２Ｐを用いて放射標識し
た後、ＷａｌｌａＣ（！等の方法（　Ｎｕｃｌｅｉｃ　
Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　９巻８７９頁（１９８１））に
従ってコロニーハイブリダイゼーションを行った。６Ｘ
ＮＥＴ　［　０．９Ｍ　　ＮａＣＩ。

０、０９Ｍトリス−塩Ｍ　（１）Ｈ　７．５＞　、　６
ｒｒ１Ｍ　　ＥＤＴＡ１、　５ＸＤｅｎｈａｒｄｔ溶液
，０．１％ＳＤＳ，　　０．１＃Ｉｇ／ｍ１変性ＤＮＡ
　（仔牛胸腺ＤＮＡ）を含むハイブリダイゼーション緩
衝液中で６５°Ｃ、４時間、プレハイブリダイビージョ
ンを行った後、放射標識化したプローブ（ＩＷＱ）’ｌ
ｘ１０６　ｃｐｍ／ｉを含む前記ハイブリダイピージョ
ン緩衝液を用いて５６°Ｃで−夜ハイブリダイビージョ
ンを行った。反応終了後５４１ｉｒａ紙を室温下Ｇ、：
　０．１％ＳＤＳを含ムロ　ｘ　ｓｓｃ溶液で３０分、
２回および５６℃、１．５分間洗滌した後、オートラジ
オグラフィーを行った。

シグナルの出たクローンよりプラスミドを分離した後、
プローブ（ＩＷＱ）を用いてサザンプロツテイングを行
った。ハイブリダイゼーションおよびオートラジオグラ
フィーは重連と同一の条件で行なった。

同様にプロー１（＾）を用いてサザンブロツティングを
行った。ハイブリダイゼーションは前述のハイブリダイ
ゼーション緩衝液を用い、４９℃で１時間行い、３９℃
まで徐冷後さらに３９℃で１時間行なった。反応終了後
、ニトロセルロースフィルターを０．１％ＳＤＳを含む
６ＸＳＳＣで室温下に３０分で２回洗滌し、次いで３９
℃で３分間洗滌した後、オートラジオグラフィーを行な
った。

この結果、１個のクローンがポジティブなものとして得
られ、ジデオキシ法により塩基配列を決定したところ図
２に示した如く、プローブ（ＩＷＱ　）及びプローブ（
＾）部分を含む３０８塩基対よりなるＤＮＡであること
が判明し、このインシートを含むＤ　Ｂ　Ｒ３２２由来
プラスミドをｐ）−ＩＣ３−１と命名した。

実施例９．　ｐＨＣ３−１由来ＤＮＡプローブによるλ
フアージ系ライブラリーのス クリーニング Ｂ（３ｎｔＯｎとＤａｖ　ｉ　ｓの方法［５ｃｉｅｎｃ
ｅ　　１９６巻、１８０頁、　（１９７γ）］に準じて
プラークハイブリダイゼーションを行った。実施例８で
得られたｐＨＣ３−１を５ａｕ３ＡおよびＥＣ０ＲＩで
処理して約６００塩基対のＤＮＡ断片を得、このＤＮＡ
断片を常法に従いニックトランスレーションにより放射
標識した。ファージプラークの生じた寒天培地上にニト
ロセルロース濾紙（Ｓ＆Ｓ社）をのせてファージを移し
、０．５Ｍ　　Ｎａ０ｆ−１にてＤＮＡを変性させ、以
下の順序で濾紙を処理した。０．１ＭＮａＯＨ，１，５
Ｍ　　ＮａＣｌで２０秒統御て０．５Ｍトリス−塩酸（
ｐＨ７，５）、　　１．５Ｍ　　ＮａＣ１で２０秒２回
、Ｒ後に１２０ｍＭ　　Ｎ　ａ　Ｃｌ　、　１５ｍＭク
エン酸ソーダ、１３ｍＭ　　ＫＨ２ＰＯ４、’１ｍＭ　
　ＥＤＴＡ、　ｐＨ７，２で２０秒処理した。

次いで濾紙を乾燥し、８０℃で２時間加熱してＤＮＡを
固定した。５ＸＳＳＣ，５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ溶液、５
０ｍＭリン酸緩衝液、５０％ホルムアミド。

０．２５　ｍ９／ａｌｌの変性ＤＮＡ　（鮭精巣ＤＮＡ
）、及び０．１％ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション
緩衝液中で４２℃にて一部プレハイブリダイゼーション
を行い、ニックトランスレーションにより放射標識化し
たｐト＋ｃｓ−ｉプローブ４ｘｌＯ５ｃｐｍ／ｄを含む
ハイブリダイゼーション緩衝液（５ＸＳＳＣ，５ｘＤｅ
ｎｈａｒｄｔ溶液、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６，０
）　、　５０％ホルムアミド、０．１％ＳＯＳ。

１０％デキストラン硫Ｍ、　　０．１＃Ｉｆｆ／ｒｎｌ
の変性ＤＮＡ（鮭精巣ＤＮＡ）の混合液）で４２℃にて
２０時間ハイブリダイゼーションを行った。

ニトロセルロース濾紙を室温下に０．１％ＳＯ８を含む
２ＸＳＳＣで２０分間洗滌し、次いで４４℃で、０．１
％ＳＯ８を含む０．ｌＸ５ＳＣで３０分間、ざらに室温
下で０．ｌＸ５ＳＣで１０分間洗滌した後、オートラジ
オグライーで検出した。

その結果、５個のポジティブなりローン（Ｇ１〜５）が
得られた。そこで、得られたクローンのうち完全長ＣＤ
ＮＡを含むと思われるクローンのＤＮＡ塩基配列をジデ
オキシ法にて調べたところ図３（Ａ）に示される如き塩
基配列が得られた。そこでこのｃＤＮＡをλ０１ｌｏベ
クターより切りだし、　ｐａＲ３２７［５ｏｂｅｒｏｎ
等；Ｇｅｎｅ９巻２８７頁（１９８０）　］とＥＣ０Ｒ
Ｉ部位で結合させ、プラスミドとして人聞調製した。こ
のプラスミドをｐＢＲＧ４と称する。

実施例１０．　ｐＢＲＧ４由来ＤＮＡプローブおよびプ
ローブ（ＬＣ）によるλフアー ジ系ライブラリーのスクリーニング 実施例９で用いたＢｅｎｔＯｎとｏａｖ　ｒ　ｓの方法
（前出の文献を参照）に準じてプラークハイブリダイゼ
ーションを行った。ファージプラークの生じた寒天培地
上にニトロセルロース濾紙（Ｓ＆Ｓ社製）をのせてファ
ージを移し、０．５Ｍ　　Ｎａ０）−１にてＤＮＡを変
性させ、以下の順序で濾紙を処理した。

０、ＩＭ　　ＮａＯＨ，１，５Ｍ　　ＮａＣｌで２０秒
、続イテ０．５Ｍトリスー塩ｗｉ（１）Ｈ７，５＞、１
．５ＭＮａＣｌで２０秒２回、最後に１２０ｍＭＮａＣ
＋、１５ｍ１ＶｌクエンＩ’／−ダ、１３ｍＭ　　Ｋ　
Ｉ２　ＰＯ２，１ｍＭ　　ＥＤＴＡ、（ｐＨ７，２＞で
２０秒処理シタ。

次いで濾紙を乾燥し、８０℃で２時間加熱してＤＮＡを
固定己だ。このようにして同一の濾紙を２枚作製し、ｐ
ＢＲＧ４由来ＤＮＡプローブとプローブ（ＬＣ）による
スクリーニングにそれぞれ供した。

ｐＢＲＧ４由来ＤＮＡプローブによる場合は、１）　Ｂ
　ＲＧ　４をＥｃｏＲＩで処理して約１５００塩基対の
ＤＮＡ断片をＬこのＤＮＡ断片を常法に従ってニックト
ランスレーションにより放射標識した。

上記濾紙を５ＸＳＳＣ１５ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、
５０ｎ＋ＭリンＭ緩衝液、５０％ホルムアミド、０．２
５　Ｉｎ’Ｊ／ｍｆｌの変性ＤＮ△（鮭精巣ＤＮＡ）　
、及び０．１％ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション緩
衝液中で４２℃にて一晩、プレハイブリダイビージョン
を行い、上記の放射標識した約１５００塩基対のＤＮＡ
プローブ（約１ｘｌＯ６ｃｐｍ／ｍｌ＞を含むプレハイ
ブリダイゼーション緩衝液［５ｘＳＳＣ１５ｘ　Ｄｅｎ
ｈａｒｄｔ溶液、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６，０＞
　、５０％ホルムアミド、０．１％ＳＤＳ、１０％デキ
ストラン硫酸、０．ＩＩｎｇ／ｍの変性ＤＮＡ　（鮭精
巣ＤＮＡ）の混合液］で４２℃にて２０時間ハイブリダ
イゼーションを行った。ニトロセルロース濾紙を室温下
に、０．１％ＳＯ３を含む２ＸＳＳＣで２０分間洗滌し
、次いで４４℃で、０．１％ＳＤＳを含む０．ｌＸ５Ｓ
Ｃで３０分間、さらに室温下で０．１％ＳＳＣで１０分
間洗滌した後１，１−トラジオグライーで検出した。

プローブ（ＬＣ）の場合は、濾紙を０．１％ＳＤＳを含
む３ＸＳＳＣで、６５°Ｃにて２時間前処理した後、６
ＸＮＥＴ、　１　ｘＤｅｎｈａｒｄｔ溶液、１００μｃ
＋　／戒の変性ＤＮＡ　（鮭精巣ＤＮＡ）を含む溶液中
、６５℃で２時間、プレハイブリダイピージョンを行っ
た。

放射標識した７Ｏ−７（ＬＣ）（２ｘ１０”　　ｃｐｍ
／ｍ１）を含むプレハイブリダイゼーション緩衝液［６
ＸＮＥＴ、’ｌ　ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１００μ
ｇ　、”成度性ＤＮＡ　（鮭精巣ＤＮＡ）］で６３℃に
て一部ハイブリダイピーションを行った後、ニトロセル
ロース濾紙を室温下に、０．１％ＳＤＳを含む６ＸＳＳ
Ｃで２０分間洗滌し、この洗滌を３回行った後、０．１
％ＳＤＳを含む６ＸＳＳＣにて、６３℃で２分間洗滌し
た。

濾紙を乾燥した後オートラジオグラフィーで検出した。

このようにして行ったスクリーニングに於いて、２つの
プローブの両方にポジティブなりローンを選別し、その
うら完全長のＣＤＮＡを含むと思われるクローンの塩基
配列をジデオキシ法にて調べたところ、図４（八）に示
される如き塩基配列が得られれた。そこでこのＣＤＮＡ
をλ（ＪｔｌＯベクターより切りだし、Ｄｔ３Ｒ３２７
とＥＣｏＲＩ部位で結合させ、プラスミドｐＢＲＶ２を
得た。

実施例１１．大腸菌用組換えベクター（＋ＶＳＥ）の構
築および形質転換［ｔａｃプロ モーター含有ベクターを用いた例］ １）組換えベクターの構築 ■　ベクターの調製 ｔａｃプロモーター含有ベクターｐＫｌ（２２３−３（
ファルマシア社製）５μＱを３０μｍの反応液（４０ｍ
Ｍ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、７ｍＭ　　ＭＣＩＣＩ２．１
００ｍＭ　　ＮａＣＩ、７ｍＭ　　２−メルカトプ１〜
エタノール）中、ＥＣ０ＲＩ　（宝酒造社製）８単位で
３７℃、２時間処理した。

次いで、アルカリホスファターゼ（宝酒造社装〉３μｍ
を加え６０°Ｃ１３０分間処理し、常法に従いフェノー
ル処理３回、エーテル連理及びエタノール沈澱を行って
ＤＮＡ断片を回収した。

このＤＮＡを５０ｍＭＴｒ　ｉ　５−ＨＣｌ　、５ｍＭ
ＭｇＣ鴨、１０ｍＭ　　ＤＴＴ、１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄ
ＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰからなる５０μｍの混合液
に溶解し、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ−ＫｌｅｎＯＷ
断片（宝酒造社ｉ１＞３μｌを加えテ１４°Ｃ１２時間
反応Ｖしめ、末端をプラントエンド（ｂｌｕｎｔｅｎｄ
　）にした。

■　合成リンカ−の調製 合成リンカ−１ＣＧＡＡＴＧＡＣＣＣＣＣＣＴＧＧＧＣ
Ｃ及びＣＡＧＧＧＧＧＧＴＣＡＴＴＣＧの配列を有する
オリゴヌクレチオド３μｑを５０ｍ）ｆＴｒ　ｉ　５−
ＨＣｌ　、１０ｍＭ　　ＭｇＣ１２，１０ｍＭ２−メル
カプトドエタノール、１ｍＭ　　ＡＴＰからなる反応液
４０μｍ中でＴ４ポリヌクレチオドキナーピ４単位存在
下、３７℃、６０分間反応せしめ、リン酸化した。

次いで該リン酸化オリゴヌクレヂオドを夫々０．２　Ｉ
９を１００ｍＭ　　ＮａＣｌを含むＴＥ（１０ｍｌｖｌ
Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　　、　ｐＨ８，０、１ｍＭ　　　Ｅ
ＤＴＡ）２０μｍに溶解し、６５℃、１０分間処理した
後、室温まで徐冷することによりアニーリングを行った
。

■　Ｇ−Ｃ３ＦのＣＤＮＡ断片の調製 実施例９で得た図３（Ａ）で示すｃＤＮＡを含有するｐ
ＢＲＧ４６０　μ（Ｊを６ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−１−ＩＣ
Ｉ、６ｍＭ　　ＭｇＣｌ２．６ｍＭ　　２−メルカトブ
トエタノールからなる反応液２００μｍ中、制限酵素Ａ
ｐ　ａ　ｌ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ
ｓ社製）ｉｏｏ単位、Ｄｒａｌ　（宝酒造社製）５０単
位で３７℃、３時間処理し、１６２％アガロースゲル電
気泳動にて約５９０ｂｐのＡｐａｌ−Ｄｒａｌ断片約２
μｇを回収した。

■　上記各断片の連結 ■、■、■各断片を夫々的０．１μｇとり、２０μｍの
連結反応液（６６ｍＭ　　Ｔｒ　ｉ　５−）−１ｃＩ、
６．６ｍＭ　　ＭＣ７ＣＩ２．１０ｍＭ　　ＤＴＴ、　
１ｍＭＡＴＰ＞に溶解しＴ４ＤＮＡリガーゼ１７５単位
を加えて４℃で一部反応し組換えベクターを）ｑだ。

（図６） ２）形質転換 上記■で１ｑられた組換えベクターを含む反応液２０μ
ｍを用いて塩化ルビジウム法（前出Ｔ、Ｈａｎｉａｔｉ
ｓ等（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　ｃｌｏｎｉｎｇ）　２５
２頁（１９８２）参照〕によりＥ、ｃｏｌｉ　ＪＨ１０
５株を形質変換した。

１ｑられた形質転換株はアンピシリン耐性のコロニー培
養液よりプラスミドを分離し、制限酵素ＢａｍＨＩ、Ａ
ＣＣＩＩ、ＡｐａＩで処理したところ目的の形質転換株
であることが確認できた。

実施例１２．大腸菌用組換えベクター（＋ＶＳＥ）の構
築および形質転換［ＰＬプロモ ーター含有ベクターを使用した例］ １）組換えベクターの構築 ■　ベクターの調製 ＰＬプロモーターを含むベクターｐＰＬ−ｌａｍｂｄａ
（ファルマシア社製＞　　１００μＣＩを制限Ｗ！ｆ索
ＢａｍｔｌＩ、５０単位で反応液（１０ｍＭ　　Ｔｒ　
ｉ　５−ＦＩＣＩ、ｐＨ７，６，７ｍＭ　　ＭＱＣ１２
，１００ｍＭ　　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　　ＤＴＴ＞１０
０μ＋中、３７℃、−晩処理した。

これから、１％アガロースゲル電気泳動にて、約４Ｋｂ
ｐの断片的４９μｇと約１．２Ｋ　ｂ　ｐの断片的１１
μ０を回収した。

上記の断片のうら、まず約４Ｋｂｐの方を前記のＴＥＷ
衝液１００μｍに溶解し、アルカリホスファターゼ（宝
酒造社製）５μｍと６０℃、６０分間反応せしめ脱リン
酸化した。

残りの約１．２Ｋ　ｂ　ｐの断片の方は緩衝液（１０ｍ
）ｆＴｒ　ｉ　５−ｔ−ＩＣＩ　、１０ｍＭ　Ｍｃｉｃ
　Ｉ２．６ｍＭＫＣｌ、１ｍＭ　　ＤＴＴ＞２０μｌＬ
、：溶解し、制限酵素Ｍｂｏ　ＩＩ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｃ
＋Ｉａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）２０単位で３７℃、
−晩処理した。

次いで、４％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により約
２００ｂｐのＢａｍＨＩ−ＭｂｏＩＩ断片約０．９μ（
Ｊと約３１０ｂｐのＭｂｏＩＩ−ＢａｍＨＩ断片約１．
９μｇを回収した。

■　合成リンカ−の調製 合成リンカ−ＴＡＡＧＧＡＧＡＡＴＴＣＡＴＣＧＡＴお
よび−ｒＣＧＡＴＧＡＡＴＴＣＴＣＣＴＴＡＧを実施例
１１の■と同様にしてリン酸化しアニーリングし、合成
Ｓ／Ｄリンカ−を１９だ。

■　発現用ベクターの調製 上記■で調製した約４Ｋｂｐ断片０．１μｇ及び０［Ｐ
［領域を有するＢａｍＨＩ−ＭｂｏＩＩ断片、ｔＬ１領
域を有するＭｂｏＩ［−ＢａｍＨＴ断片、夫々０．０５
μｇとアニールした合成Ｓ／Ｄリンカ−０，１μ（ｌを
４０μｍの反応液（６６ｍＭ　　Ｔｒ　ｉ　ｓ−ト１ｃ
Ｉ　　、　　６．６ｍＭ　　　Ｍａｉｌ　　２　、　ｉ
ｏｍＭ　　　　ＤＴＴ、１ｍＭＡＴＰ）中、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼ（宝酒造社製）１７５単位存在１’−１２℃、
−晩反応−せしめた。

この反応液２０μｍを用い、Ｅ、　ｃｏｌｉＮ９９ｃ　
ｌ”株（ファルマシア社製）をＣａＣ＋、、法（前出の
”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　ｃｌｏｎｉｎｇ”参照）にて
形質転換した。

該形質転換株を培養し、そのアンピシリン耐性のコロニ
ーの培養液よりプラスミドを分離して、制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩ、ＢａｍＨＬ　ＳｍａＩで処理したところ目的のプ
ラスミドであることが確認された。

次に、このプラスミドを２μｑとり、２０μｍの緩９７
液　（１０ｍＭ　　　Ｔｒ　　ｉ　　５−ｆ−１ｃ　　
ｌ　　、　６ｍＭＭＣＩＣＩ２．５０ｍＭ　　ＮａＣ＋
　）中、制限酵素ＣＩ　ａ　Ｉ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｑｌａ
ｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を３７℃、２時間反応さＵ
た後６５℃１０分間で失活させた。

更にその反応液１μｍを２０μｍの前記連結反応液及び
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）１７５単位を用いて
１２℃、−晩反応した後、上記と同様にしてＥ、ｃｏｌ
ｉ　Ｎ９９ｃＩ　　株（ファルマシア社製）を再び形質
転換した。アンピシリン耐性コロニー培養液からプラス
ミドを分離しＥ、Ｃ０ＲＩ、ＢａｍＨＩで処理し、目的
のプラスミドを確認した。

■　Ｇ−Ｃ３Ｆ発現用絹換えベクター及び形質転換体の
調製 ■で得られた発現用プラスミドを制限酵１ｃｌａｌで処
理し、末端をブラン１ヘエンドにした後実施例１１と同
様にしてＧ−Ｃ３ＦのｃＤＮＡ断片を組み込み組換えベ
クターを１ｑた。これを用い、前出のＭｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇに記・戎されているＣａＣ１ｚ法に
てＥ、ｃｏｌｉ　Ｎ４８３０株（ファルマシア社製）を
形質転換した。なお、目的の形質転換体の確認ら実施例
１１と同様に行った。（図７） 実施例１３．大腸菌用組換えベクター（十ＶＳＦ）の構
築と形質転換［ｔｒｐプロモー タ含有ベクターを用いた例］ １）組換えベクターの構築 ■　ベクターの調製 １）ＢＲ３２２のＣ１ａ１部位にトリプトファンプロモ
ーターを含む約３３０ｂｐのＨｐａｌｌ［−ＴａｑＩ断
片を挿入し作製したｐＯＹ１プラスミド１０！ｌ（Ｊ　
ヲｌＯｍ）ｆＴｒｉｓ−ＨＣＩ　、６ｍＭ　ＭｃａＣす
、５０ｍＭＮａＣｌの反応液３０μｍ中、制限酵素Ｃ１
ａｌ　　７単位ＰＶＬＪＩＩ　　８単位で３７℃３時間
処理した。　次いで、アルカリホスファターピ（宝酒造
社製）２μｍを加え６０℃、１時間反応せしめた。

これから１％アガロースゲル電気泳動により約２．６Ｋ
　ｂ　ｐの断片を約２．５μｇ回収した。

■　合成リンカ−の調製 合成リンカ−ＣＧＣＧＡＡＴＧＡＣＣＣＣＣＣＴＧＧＧ
ＣＣ及びＣＡＧＧＧＧＧＧＴＣＡＴＴＣＧを実施例１１
の■と同様にしてリン酸化し、アニーリングした。

■　組換えベクターの調製 上記■で調製ベクターの断片的１μｇ、及び■の合成リ
ンカ−約１μｇと、実施例１１の■で調製したＧ−Ｃ３
ＦのＣＤＮＡ断片約１μｑを前記の連結反応液２０μｍ
中、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社￥４＞　　１７５単
位と１２℃で一部反応ｕしめ組換えベクターを’ＩＮだ
。（図８） ２）形質転換 上記■の反応液２０μ＋を前出１ＮＯ１ｅＣｕｌａｒ　
　ｃｌ。

ｎｉｎｇＪの塩化ルビジウム法でＥ、Ｇｏ　Ｉ　ｉ　Ｄ
Ｉ−Ｉ　Ｉ株に形質転換した。

実施例１１と同様にしてアンピシリン耐性の］口二一か
らプラスミドをとり、制限酵素ＡＤａＩ、Ｄｒａｌ、　
Ｎ　ｒ　ｕ　Ｉ、Ｐｓｔｌで目的とする形質転換体が１
ｑられていることを確認した。

実施例１４．：形質転換株の培養 １）実施例１１で１ｑた形質転換株（Ｔａｃ含右含有培
養 アンピシリン２５μ（］　／ｄ又は５０μ（］　／ｍ１
を含むルリア（Ｌｕｒｉａ）培地１００ｄに、３７°Ｃ
１−晩培養した該形質転換株の培養液１７２を加え３７
°Ｃて２〜３時間培養する。

次いで、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド２ｍ
Ｍにして３７°Ｃ，２〜４時間培養した。

２）実施例１２で１ｎた形質転換株（Ｐ、含有）の培養 アンピシリン２５μ（］　／ｄ又は５０μ（Ｊ　／ｄを
含むルリア培地１００＋ｉに２８°Ｃ−晩培養した該形
質転換株の培養液１ｍｌを加え２８℃で約４時間培養し
た。

その後、これを４２°Ｃにし２〜４時間培養を行った。

１３）実施例１３で得た形質転換株（を叩含有）の培養
０．５％グルコース、０．５％カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ
社製）、アンピシリン２５μｇ／ｍ１又は５０μ（１／
ｄを含むＭ９培地１００Ｉｄｌに３７°ｄ−晩培養した
該形質転換株の培養液１ｄを加えて３７℃で４〜６時間
培養する。

次いで、３−β−インドールアクリル酸（ＩＡＡ）５０
Ｍｇ／ｄを加えて３７℃で４〜８時間培養した。

実施例１５．二大腸菌からのＧ−Ｃ３Ｆポリペプチドの
回収・精製 １）回収 実施例１４で培養した形質転換株、夫々について以下の
回収操作を行った。

培養液１００ＩＲ１を遠心分離にかけて菌体を集め、２
０ｍＭ　　　Ｔｒ　　ｉ　　５−ＨＣｌ　　（ｐＨ７，
５）　　、　３０ｍＭＮａＣ１混合液５Ｉｄに懸濁させ
た。

次いで、各々１ｍＭ、１０ｍＭ、０．２μｇ／ｄになる
ように０．２Ｍフェニルメチルスルホニルフルオライド
、０．２Ｍ　　ＥＤＴＡ、リゾチームを加え、０℃で３
０分間放置した。

次に凍結−融解を３回くりかえし或いは更に超音波処理
を行って溶菌させた。１ｑられた溶菌液を遠心分離にて
上清を１ｑるか、或いは８Ｍ塩酸グアニジンを用いて、
最終的に６Ｍ塩酸グアニジンにした後、３０．００Ｏｒ
、　ｐ、　ｍ、、５時間の遠心分離を行い、その上澄液
を取１７シた。

２）精製 （ｉ）　　１）で得た上澄液を直径４．６ｃｍ、長さ９
０ＣｍのＵｌｔｒｏｏｅｌ　　ＡｃＡ３４カラム（ＬＫ
Ｂ社製）にて、０．１５Ｍ　　ＮａＣ１および０．０１
％ツイーン２０（半月化学社製）を含む０．０１Ｍトリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）を用いて流速約５Ｍ／時
間でゲル濾過した。

次いで、前述したｒＣ３Ａの測定方法（ｂ）」により活
性を示す両分をとりｐＭ−１０（アミコン社製）を用い
る限外濾過器によって約５ｗｌ１に濃縮した。

（ｉ；）上記濃縮画分にｎ−プロパツール（東京化成社
製、アミノ酸配列決定用）とトリフルオロ酢酸を加え最
終濃度がそれぞれ３０％および０．１％となるように調
製し、水中に１５分程度放置したのち、１５．０００ｒ
、　ｐ、化１０分の遠心により沈澱を除去した。次いで
先のｎ−プロパツールおよびトリフルオロ酢酸を含む水
溶液で平衡化したμＢＯｎｄａｐａｋＣ１８カラム（Ｗ
ａｔｅｒＳ社製、セミ分収用、３３Ｘ３０ｃｍ＞に吸着
後、３０〜６０％の直線濃度勾配のｎ−プロパツールを
含む０．１％トリフルオロ酢酸水溶液で順次溶出した。

高速液体クロマト装置は日立６８５−５０型を、検出は
日立６３８−４１型検出器（いずれも日立製作所製）を
用い、２２０　ｎｍと２８０ｎｍの吸収を同時に測定し
た。溶出後、各両分より１０μｍを分取１００倍希釈し
たのら、前述のｒｃｓＡの測定方法（ｂ）」により活性
を示す両分を調べた。

この結果、ｎ−プロパツール４０％にて溶出されるピー
クに活性が認められたので、このピークを集め再度同じ
条件で再クロマトを行い上記と同様にしてＣ３Ａを調べ
たところ、やはりｎ−プロパツール４０％の位置のピー
クに活性が認められたので、このピークを集め（４フラ
クシヨン＝４１１Ｉｉ）凍結乾燥した。

（ｉｉｉ）上記凍結乾燥粉末をｎ−プロパツールを４０
％含む０．１％トリフルＡ口酢酸水溶液２００μｍに溶
解し、ＴＳＫ−Ｇ３００Ｏ３Ｗカラム（東洋曹達社製、
　　７．５ｍｎＸ６０ｃｍ＞を用いた高速液体クロマト
グラフィー（１−Ｉ　Ｐ　Ｌ　Ｃ）にか１プだ。溶出は
同水溶液により０．４ｄ／分の流速で行い、フラクショ
ンコレクターＦＲＡＣ−１００（ファルマシア社製）に
より０．４ｄずつ分取した。分取した各両分についてＣ
３Ａを前記と同様にして調べ活性画分を回収し、更に分
析用ｕ　Ｂｏｎｄａｐａｋ　Ｃ１８カラム（４，６ｇ　
Ｘ　３０ｃｍ　）による精製を施したのら、メインピー
クを回収し凍結乾燥した。

得られたタンパク質を２−メルカプトエタノールで９Ａ
ｌｌして５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（１５，０％
）電気泳動（１５ｍＭ、６時間）にかけ、クマシーブル
ーで染色したところ目的とするＧ−Ｃ３Ｆポリペプチド
が単一のバンドとして確認できた。

実施例１６０発現物！（７）Ｇ−Ｃ３Ｆ活性の検定（＋
ＶＳＥ）実施例１５で得たＣ３Ｆ試料を前述のく参考例
〉Ｃ３Ｆ活性の測定方法（ａ）に従って検定した。

この結果を表−１に示す。

表−１ 実施例１７．アミノ酸分析 １）アミノ酸組成の分析 実施例１５て精製したＣＳト試料を常法により加水分解
し、そのタンパク部分のアミノ酸組成を日立８３５アミ
ノ酸自動分析装置（日立製作所社製）を用いて特殊アミ
ノ酸分析法により分析した。この結果を表−２に示した
。尚、加水分解条件は次の如くである。

■　６Ｎ　ＦｌｃＩ、　　１１０°Ｃ１２４時間、真空
中■　４Ｎ　メタンスルホン酸＋０．２％３−（２−ア
ミノエチル）インドール、１１０℃、２４時間。

４８時間、７２時間、真空中 試料は、４０％ｎ−プロパツールと０．１％トリフルア
３０酢酸を含む溶液（１，５ｍｌ＞に溶かした後、各々
０．１ｍｌをとり、乾燥窒素ガスにより乾燥させた後、
■又は■の試薬を加えて真空封管し、加水分解に供した
。

表中、実測値は■の２４時間値と■の２４．４８．７２
時間値の合ｊ−１４回の平均値である。但し、Ｈｈｒ。

Ｓ’ｅｒ、１／２Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｖａ　ｌ、Ｉ　Ｉ　
ｅおよびＴｒｐは以下の方法で算出した。〔生化学実験
講座、タンパク買化学■（東京化学同人出版）を参照〕
。

−７１１ｒ、Ｓｅｒ、１／２Ｃｙｓ、Ｍｅｔは■の２４
．４８．７２時間値の経時変化をとり、零時間に補外。

−Ｖａｌ、Ｉｌｅは■の７２時間値。

・　Ｔｒｐは■の２４．４８．７２時間値の平均値。

（以下余白） 表−２（アミノ酸分析表） ２）　　Ｎ末端アミノ酸分析 試料を気相式シークエンリー（アプライドバイオシステ
ム社製）を用いてエドマン（Ｅｄｍａｎ）分解し、１７
られたＰ　Ｔ　Ｈアミノ酸を高速液体クロマ１へグラフ
ィー装置（ベックマン・インストルメンツ社製）および
Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ　−Ｑ［）３カラム（ベックマ
ン・インストルメンツネ１製）を用いて常法により分析
した。カラム（５μｍ、直径４．６ｍ、長さ２５０ｍｍ
＞を開始緩衝液（１５ｒＴＩＩＶｌ酎酸〕１〜リウム緩
衝液ｐ）−１４，５，４０％アヒトニトリルを含む水溶
液）にて平衡化したのら、検体（２０μｍの開始緩衝液
にて溶解）を注入して開始緩衝液によるイソクラデイッ
ク溶出により分離を行った。流速は１．４Ｉｎｌ／分、
カラム温度は４０°Ｃに保持した。

ＰＴＩＩアミノ酸の検出は２６９ｎｍと３２０ｎｍの紫
外部吸収を利用した。あらかじめ標準ＰＴＨアミノ酸（
シグマ礼装）各２ｎｍｏ＋を同一の系で分離して保持時
間を決定し、被検検体の保持時間から同定を行った。

その結果、Ｐ　Ｔ　１−１−メヂＡニンおよびＰＴＨ−
スレオニンが検出された。

実施例１８　　人腸菌用組換えベクター（−ＶＳＥ　）
の構築と形質転換 １）−ｒａｃプロモーター含有ベクターを用いた例実施
例１１■における「実施例９で得た図３（＾）で示すＣ
ＤＮＡを含有するｐＢＲＧ４Ｊのかわりに１実施例１０
で得た図４（Ａ）で示すｃＤＮＡを含有するＤＢＲＶ２
Ｊを用いる他は、実施例１１と全く同様の操作を行い、
ｊ７られた形質転換株が目的とする形質転換株であるこ
とを確認した（図９）。

２＞ＰＬプロモーター含有ベクターを用いた例ｃＤＮＡ
　（−ＶＳＥ）　をｆｆｌいｔ実施例１２１！り返し、
１７られた形質転換体が目的の形質転換体であることを
確認した（図１０）。

３）ｔｒｐプロモーター含有ベクターを用いた例ｃＤＮ
Ａ　（−ＶＳＥ　）　’ｆＪＦＪイテｔｄＭ例１３ヲｔ
ｌＲｆ）返し、目的とする形質転換体が冑られているこ
とを確認した（図１１）。

実施例１９　　　発現物質のＧ−Ｃ３Ｆ活性の検定（−
ＶＳＥ） 実施例１８で１９だ形質転換株を各々、実施例１４に記
載の方法で培養し、次いで該培養した大腸菌から実施例
１５に記載の方法によって、Ｇ−Ｃ３Ｆポリペプチドを
回収し精製して単一のバンドとしてヒ１−Ｇ−Ｃ３Ｆポ
リペプチドを得た。

かくして１ツられたＣ３Ｆ試料を前述のく参考例〉Ｃ３
Ｆ活性の測定方法（ａ）に従って検定した。この結果を
表−３に示す。

実施例２０アミノ酸分析（−ＶＳＥ） １）アミノ酸組成の分析 実施例１９で精製したＣ３Ｆ試料のアミノ酸組成分析を
実施例１７の１）に記載の方法により行った。

得られた結果を表−４に示す。

（以下余白） 表−４（アミノ酸分析表） ２＞Ｎ末端アミノ酸分析 試料を実施例１７の２〉に記載の方法に従って、Ｎ末端
アミノ酸分析に付した。

その結果、Ｐ　Ｔ　Ｈ−メチオニンおよびＰ　Ｔ　Ｈ−
スレオニンが検出された。

実施例２１．ＰＨＧＡ　４１０ベクターの調製（動物細
胞用、＋ＶＳＥ系） 実施例９で得られた図３（Ａ）で示されるｃＤＮＡのＥ
Ｃ０ＲＩ断片を制限酵素□　ｒ　ａ　１にて３７℃で２
時間で処理した後、ＤＮＡホリメラーゼエのに１ｅｎＯ
Ｗ断片（宝酒造社製）で処理し、末端を平滑末端とした
。１μｑのＢｇｌ　ＩＩリンカ−（８ｍｅｒ：宝酒造社
製）をＡＴＰを用いてリン酸化した後、上記で得られた
約１μｑのＤＮＡ断片混合物と結合させた。次いで制限
酵素ＢｑｌＩＩで処理してアガロースゲル電気泳動を行
い、最も大きいＤＮＡ断片だけを回収した。

このＤＮＡ断片は図５に示すようにヒトＧ−Ｃ３Ｆポリ
ペプチドをコードする部分を含む約７１０塩基対に相当
していた。ベクターＤｄＫＣＲ（Ｆｕｋｕｎａｇａ等；
　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ；８
１巻５０８６頁（１９８４））を制限酵素３ａｍＨＩで
処理した後、アルカリフＡスフ７タービ（宝酒造社製）
で脱リン酸して１ｒｆられたベクターＤＮＡをＴ４ＤＮ
△リガーしく宝酒造社製）を加えてｃＤＮＡ断片と結合
させＰＨＧＡ　４１０を１７た。（図１２）。図１２に
示されるごとくこのプラスミドは、ＳＶ４０初期遺伝子
のプロモーター、ＳＶ４０の複製開始領域、ウーリギβ
−グロビン遺伝子の一部、ｐＢＲ３２２の複）４開始領
域およびＩ）ＢＲ３２２由来のβ−ラクタマーゼ遺伝子
（ＡｒＴ１ｐ’）をふくみ、ＳＶ４０初期遺伝子のプロ
モーター下流にヒｈＧ−Ｃ３Ｆ遍伝子が接続されている
。

実施例２２．０１２７細胞用組替えベクターの構築（＋
ＶＳＥ） １）、　ｐｌ−Ｉ　Ｇ　Ａ　４１０　（Ｈ）の構築実施
例２１で得られた（図１２．）　ｐＨＧＡ　４１０プラ
スミド２０μＱを５０　ｍＨＴｒ　ｉ　５−ＨＣｌ　（
ｐＨ７、５）　　、　７　　ｍ＋Ｍ　ｇｃＩ　２　、１
００　　ｍｌ　　ＮａＣ１，７ｍＨ２−メルカプ］・エ
タノール、０．０１％ウシ而清面ルブミン（ＢＳＡ）の
反応液に溶解し、制限酵素ＥＣ０ＲＩ（宝酒造社製、１
０〜１５単位）を加えて約３０分３７°Ｃにて反応させ
、ＥｃｏＲ■による部分消化を行った。次いでフエーノ
ールークロロホルム（１：１）処理を２回行いエーテル
処理、エタノール沈澱を行ってＤＮＡ断片を処理した。

このＤＮＡ断片を５０　ｍＨＴｒ　ｉ　５−ｔ−１ｃ　
ｌ、５　　ｍ）Ｉ　ＭＱＣｌ　２　．１０　　ｍＨＤＴ
Ｔ、１耐１のｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
からなる５０μｍの液に溶解し［、ｃｏｌｉ　ＤＮＡポ
リメラーピーに＋ｅｎｏｗ断片く宝酒造社製）５μｍを
加えて１４℃２時間インキュベートしプラントエンド（
ｂｌｕｎｔ　ｅｎｄ）にした。

これから０．８％アガロースゲル電気泳動により約５．
８Ｋｂの断片６μｑを回収した。

回収したＤＮＡ断片５μ（］を再び５ＱｍＨＴｒｉＳ−
１ＩＣＩ　　（Ｆ）Ｈ７，６）　　、　１０　　ｍＨ！
ｖｌ　ｇｃ　１２　．１０　ｍＭ　ＤＴＴ、　１ｍＨＡ
ＴＰからなる反応液５０μΩ中に溶解し、ＨｉｎｄＩＩ
ｌリンカ−（宝酒造社製）２μＱ、及びＴ４ＤＮＡリガ
ービ（宝酒造社製）１００単位を加えて、４°Ｃにて一
晩反応した。

次いて、フエーノル処理、エーテル処理、エタノール沈
澱後、１０　ｍＨＴｒ　ｉ　５−Ｈｃ　ｌ　　（ＤＨ７
゜５）　、７　ｍＨＭｇＣ１２，６０ｍＭ　ＮａＣｌの
溶液３０μｍに溶解し、制限酵素ＨｉｎｄＩ［１１０単
位存在下３時間３７°Ｃてインキュベートした。再びＴ
４ＤＮＡリガーゼにより処理した後、このＤＮＡを塩化
ルビジウム法（前記の［Ｈｏ１ｅｃｕｌａｌ　Ｃｌｏｎ
ｉｎｇＪ参照）によりＥ、ｃｏｌｉ　Ｄｌｌ１株に形質
転換し、アンピシリン耐性（Ａｍｐｒ）のコロニーを（
７て、ｐＨＧＡ４１０プラスミドのＥＣＯＲＩ部位がＨ
ｉｎｄＩＩＩに置きかわったプラスミドを保持する菌を
選択した。このようにして得られたプラスミドをｐＨＧ
Ａ　４１０　（ｔ−１＞と命名する。（図１３）２）１
発現用組換えベクターｐＴＮ−Ｇ４の構築上記１）で得
られたＰＨＧＡ４１０　（１−１）　（２０μｇ）を１
　０　　ｍＨＴｒ　　ｉ　　５−Ｈｃ　　Ｉ　　（ｐＨ
７，５）　　、７ｎ＋ＨＭＱｃｌ　２　、１７５　　ｍ
ＨＮａｃｌ　　、　０．２ｍ）ｌＥＤＴＡ、７ｍＭ２−
メルカフトエタノール、０．０１％ウシ血清アルブミン
からなる反応液５０μｍに溶解し、制限酵素５ａｌＩ（
宝酒造社製）２０ｍ位を加え、３７°Ｃにて５時間イン
キュベートした。次いでフェール処理、エタノール沈澱
後、ＤＮＡポリメラーゼに＋ｅｎｏｗ断片（宝酒造社製
）にて前出の反応と同様に１４℃約２時間インキュベー
トし、プラントエンドにした。これを、アガロースで回
収することなくエタノール沈澱したＤＮＡ断片を制限酵
素１−ｌ　ｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩにて処理して、約２．７
ｋｂのＩ−ｌ　ｉ　ｎｄ　ｌｌｌ−３ａ　Ｉ　Ｉ断片を
１％アガロースゲル電気泳動にて５μｑ回収した。

一方、ウシ乳頭腫ウィルス［ｂｏｖｉｎｅ　ｐａｐＩ　
Ｉ　ｌｏｍａｖｉｒｕｓ　（８ＰＶ）］を有するプラス
ミドｐｄＢＰＶ−１（Ｓａｒｖｅｒ、ｎ、、５Ｂｙｒｎ
ｅ、Ｊ、Ｃ＆ｌＩｏｗｌｅｙ、Ｐ、Ｍ、（１９８２）　
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ７９巻
７１４７−７１５１；［）ｒ、ｔｌｏｗｌｅｙより入手
）をＮａ（ｌａｔａらの方法の如＜（Ｆｕｋｕｎａｇａ
、Ｓｏｋａｗａ、Ｎａｇａｔａ、　（１９８４）Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ　、　ＵＳＡ８１巻
５０８６−５０９０）　Ｈｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩ及びｐｖ
ｕ［で処理して８，４ｋｂのＤＮＡ断片を得ておく。

この８，４ｋｂのＤＮＡ断片と上記の約２．７ｋｂの１
１　ｉ　ｒ）ｄｍ−３ａ　Ｉ　ｌＤＮＡ断片を常法に従
ってＴ４ＤＮＡリガービにより処理し、前出の［Ｈｏ１
ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｊに記載された塩化ル
ビジウム法によりＥ、ｃｏｌｉ　ＤＨＩ株に形質転換し
、ｐＨＧＡ４１０山来Ｇ−Ｃ３ＦのＣＤＮＡを有するプ
ラスミドを保持する［、Ｃ０Ｉｉコロニーを選別したこ
のプラスミドをｐＴＮ−Ｇ４と命名する（図１３）。

実施例２３Ｃ１２７細胞の形質転換及びその発現（十Ｖ
ＳＥ） 実施例２２で得たｐＴＮ−Ｇ４をマウスＣ１２７細晧に
形質転換する前に制限酵素３ａｍＨＩで処理する。即ち
ＰＴＮ−Ｇ４プラスミド２０μｑを１０　　ｍＨＴｒｉ
ｓ−ｔｌｃＩ　　（ＤＨ８，０）、　　７ｍＨＭＣＩＣ
１２、１００ｍＨＮａＣｌ、　　２　　ｍＭ　　２−メ
カプトルエタノール、　０．０１％Ｂ５Ａ１００μｍに
溶解せしめ３ａｍＨＩ（宝酒造社製＞２０ｍ位で処理し
、フェノール処理、エーテル処理、エタノール沈澱を行
った。

マウスＣｌ２７Ｉ細胞は１０％牛脂児血清（ＧＩＢＣＯ
）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｉｎｉｍａｌ　ｅｓ
ｓｅｎｔｉａｌａｌ培地中で増殖させる。径５ｃｒｎの
プレートに増殖したＣ１２７１細胞に、プレート当たり
上記調製ＤＮＡを１０μｑの割り合いでリン酸−カルシ
ウム法（ｌｌａｙｎｅｓ、Ｊ＆Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ、Ｃ
（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄＲｅｓ　１１巻
６８７−７０６参照）にて形質転換を行い、グリセロー
ル処理の後、１２時間３７℃でインキュベ−１〜した。

、次ぎに、この細胞を３枚の新しい径５ｃｍプレートに
移し、１週間２回の割り合いで培地交換をした。１６１
日目にＦＯｃｉ（集塊）を形成した部分をそれぞれ新し
いプレー１〜に移し、上述の培地で継代培養し、Ｇ−Ｃ
３Ｆ生産能の高いクローンを選別した。その結果〜’Ｉ
ｍｙ／ｆｌのレベルのＧ−Ｃ３Ｆ生産がみられた。

尚、宿主細胞には上記のＣ１２７１細胞のはかＮＩＨ３
Ｔ３細胞も用いることができる。

実施例２４０ＨＯ細胞によるＧ−Ｃ３Ｆの発現（＋ＶＳ
Ｅ） １）、　　ｐＨＧＧ４−ｄｈｆｒの構築実ＩＪ１！ｉ例
２１で得たｐＩ−ＩＧＡ４１０プラスミド２０μｑを１
０　ｍ）ｌ　−ｒｒ　ｉ　５−）−１ｃ　ｌ　（ｐＨ７
，５）、７ｍＭＭｑＣ鴨、１７５　ｍＨＮａＣｌ、ｏ、
　２ｍ）ｌ　　ＥＤＴＡ、０．７　ｍＭ　２−メ）Ｖｈ
プトエタ／−ル０．０１％ＢＳＡを含む溶液１００μｍ
に溶解し、制限酵素３ａｌｌ（宝酒造社製）２０ｍ位を
加え３７°Ｃ−晩反応した後、フェノール処理、エーテ
ル洗浄、エタノール沈澱を行った。

次ぎに、ｊｑられたＤＮＡ沈澱を５０ｍ）ｌＴｒｉＳ−
）−１０１、５ｍＨＭＣＪ　Ｇ　　Ｉ　　２　１　０ｍ
ＨＤＴＴ、１ｍ）ｌのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、
ＴＴＰからなる反応液１００μ！に溶解し、Ｅ、ｃｏｌ
ｉ　ＤＮＡポリメラーピ−１＜ｌ０ｎＯＷ断片（宝酒造
社製１０μｍ）を加えて１４°Ｃ２時間反応させ、フェ
ノール処理、エーテル洗浄、エタノール沈澱を行った。

このＤＮＡにＥＣ０ＲＩリンカ−を付加する。

即ち上記ＤＮＡを５０μｌの５０ｍＨＴｒｉｓ−トＩＣ
Ｉ　　（ｐＨ７，４＞　　、　１０　　ｍＨＤＴＴ、　
　０．　５ｍ）Ｉスペルミジン、２　ｍＨＡＴＰ、　２
．５　ｍＨＡ。

キサミン塩化コバルト、２０μｇ／ｍｌ［３ｓＡからな
る反応液に溶解し、ＥｃｏＲＩリンカ−（宝酒造社製）
を加え、２００単位のＴ４ＤＮＡリガーＬ（宝酒造社製
）を加え４℃、１２〜１６時間反応した。フエーノル処
理、エーテル洗浄、エタノール沈澱を常法に従って行っ
た後、該ＤＮＡをＥｃｏＲＩて部分消化し、１％アガロ
ースゲル電気泳動て約２．７ｋｂのフラグメントを３μ
ｑ回収した。

一方、ＤＡｄＤ２６ＳＶＤＡプラスミド（にａｕｆｍａ
ｎ、Ｒ，Ｇ、＆５ｈａｒｐ、Ｐ、Ａ（１９８２）Ｈｏ１
．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　２巻１３０４〜１３１９）を
ＥＣ０ＲＩにて処理し、バクｉリアアルカリフォスファ
ターｔ’　（ＳＡＰ）処理して脱リン酸を行う。即ら、
ｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ２０μｑとＥＣ０ＲＩ断Ｈ単位を
反応液５Ｑｎ＋Ｍｌｒｉ　　５−Ｈｃ　　ｌ　　　（ｐ
Ｈ７，５）　　、　７　　…ＭＭＱＣ１２，１００ｍＨ
Ｎａｃ　Ｉ、７　ｍＭ　２−メルカプトエタノール、０
．０１％Ｂ５Ａ１００μｍに加え、３７°Ｃ１０時間反
応させ、続いて上記反応液にＢＡＰ５単位を加え、６８
℃にて３０分間反応した。　その後フェノール処理をし
、電気泳動にてｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡのＥＣ０ＲＩ断Ｈ
を回収した（〜５μｇ）。

上記した約２，７ｋｂの断Ｊ・１とｐＡｄＤ２６ＳＶｐ
Ａの断１１のそれぞれ０．５μｑずつをアニールした。

このプラスミドをＥ、ｃｏｌｉ　ＤＨ１株に塩化ルビジ
ウム法により形質転換してｌ）　ＨＧ　Ｇ　４〜ｄ　ｈ
　ｆ　ｒのプラスミドを保持するコロニーを選択する。

ｊ５れたプラスミドをｐＨＧＧ４−ｄ　ｈ　ｆｒと命名
した（図１４８）。

なお、上記の別法として、ｐＨＧＧ４プラスミドを３ａ
ｌＪ処理し、ＥＣ０ＲＩリンカ−を付加することなしに
ＥＣ０ＲＩで部分消化し約２．７ｋｂの断片を回収し、
Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼ−ｋｌｅｎｏｗ断片
で該ＤＮＡ断片を処即し末端をプラントエンド化する。

一方前述と同じ方法てｐＡｄＤ２６ｓＶｐＡのプラント
エンド化したＥＣ０ＲＩ断片を調製し、両者をＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ処理してｐＨＧＶ２−ｄｈｆｒを調製するこ
ともできる。

また実施例２２で１７られたｐＨＧＡ４１０　（ト１）
を実施例２２の２）記載した如く、制限酵素ト１ｉｎｄ
■ａ３よび３ａｌＩにて処理し、）−１ｉｎｄｎＩ−３
ａ１■断ｊ１を上記ｐＡｄＤ２６ＳｖｐＡのプラントエ
ンド化したＥｃｏＲＩに連結してもｐ　ＨＧ　Ｇ　４−
ｄｈｆｒを（７ることができる。（図１４ｂ）。

２）形質転換と発現 ＣＨＯ細胞（ｄｈｆｒ−株、コロンビア大学叶、［、Ｃ
ｈａｓｉｎより入手）を９ｃｍ径のプレート（Ｎｕｎｃ
社製）中１０％仔牛血清を含むα最少必須培地（α−Ｍ
ＥＭ、アデノシン、デオキシアデノシン、チミジン添加
）で培養増殖し、これをリン酸−カルシウム法（Ｗｉｇ
ｌｃｒ等、Ｃｅ１ｌ１４ｉ７２５頁（１９７８）　）に
よって形質転換した。

即ら１）で調製したｐＨＧＧ４−ｄｈｆｒプラスミド１
μｑにキャリアーＤＮＡ　（子牛胸腺ＤＮへ）を適量加
えて、ＴＥ溶液３７５μｍに溶解しＩＭ　　ｃａｃ１２
１２５μｌを加える。３〜５分氷上で冷やし５００μｍ
の２Ｘ）−１８３（５０關）−１ｅｐｅｓ　、　２８０
　　ｍａｌ　　ＮａＣＩ　、　１．５ｍ）Ｉ　　リン酸
緩衝液）を加え再び水冷後、上記のＣＨＯ細胞培谷液１
ｒｄ、と混合し、プレートに移し、ＣＯ２インキュベー
ター中で９時間培養した。

以下洗浄、２０％グリレロール含有ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ−
Ｂｕｆｆｃｒｅｄ　５ａｌｉｎｅ）添力旧再び洗浄とし
だ後非選択培地（前出α−ＭＥＭ培地、ヌクレオチド添
加）を添加して２日間インキュベー１〜し選択培地（ヌ
クレオチド照温１）０）で１：１０に細胞を分υ１した
。

次いで２日毎に選択培地にて培地交換を行いながら培養
を続行し生じた集塊（ｆｏｃｉ）を選別して新しいプレ
ー１〜に移した。

新しいプレー１へでは０．０２μＭメトトレキレート（
ＭＴＸ）存在−ドで増殖し再び０．１μＭＭＴＸ存在下
で増９肖させてクローニングを行った。

なおＣＨＯ細胞の形質転換はＣｔ−＋　Ｏ細胞に対しｐ
ｌ−Ｉ　Ｇ　Ｇ　４とｐＡ、ｄＤ２６ＳＶｐＡを同時形
質転換（ｃｏｔ　ｒａｎｓｒｏｒｍａｔ　；　ｏｎ　）
することによっても行うことができる。（Ｓｃａｈｉｌ
ｌ等、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕｓ
八へｐ巻４６５４−４６５８（１９８３）参照）又いわ
ゆるポリシストロニツタ遺伝子を用いる方法で組換えベ
クターを構築し、これを用いてＣＨＯ細胞を形質転換す
ることができる。例えばｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡをＰｓｔ
　Ｉ処理し、２つの断片を回収しこれらとｐＢＲＧ４由
来のＣ３ＦｃＤＮＡ断片を結合することにより、アデノ
ウィルスプロモーター、Ｃ３ＦｃＤＮＡ、Ｄｔ−ＩＦＲ
，ＳＶ４０のポリＡ部位の順序に配列した組換えベクタ
ーを構築しＣＩ−１０細胞にいれて実施した。

実施例２５　　発現物質のＧ−Ｃ３Ｆ活性の検定（＋Ｖ
ＳＥ） 実施例２３及び実施例２４で得られたＣ１２７細胞及び
ＣＨＯＩＩ胞の培養上清を夫々１Ｎ酢酸によりＤ　Ｈ４
に調整し、等容量のｎ−プロパツールを加えた後、生じ
た沈澱を遠心除去し、Ｃ８逆相系担体（山村化学社ｒ！
Ａ）を充填したオープンカラム（１φＸ２ｃｍ）に通し
、５０％ｎ−プロパツールで溶出させた。溶出液を水で
２倍に希釈した後、ＹＭＣ−０８カラム（山村化学社″
！Ａ）を用いた逆相高速液体クロマトグラフィーにて０
．１％ＴＦ八を含む３０〜６０％の直線濃磨勾配のｎ−
プロパツール溶出さけた。ｎ−プロパツール：Ｑ度が４
０％付近の位置で溶出される両分を分取した後、凍結乾
燥し、０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ９）に溶解ｕしめ
た。このような過程を経ることによって、ヒ１−Ｇ−Ｃ
８ＦはＣ１２７及びＣＨＯＩＩ胞上清から約２０倍に濃
縮された。

コントロールとして、前述の方法に従ってヒトＧ−Ｃ３
Ｆ　ｃＤＮＡを含まないプラスミドで細胞を形質転換し
た俊その培養上清を濃縮した。得られた標品について参
考例に記載された［ヒトＧ−Ｃ３Ａの測定方法（ａ）」
に基づいた方法にてヒトＧ−Ｃ８Ｆ活性を検定した。尚
、発現効率が十分に高い場合には培養上清を直接検定に
供してもよい。ここでは濃縮した例について結果を示し
た。

ぞの結果は表−５の通りであった。

（以下余白） 表−５ヒトＧ−Ｃ３Ｆ活性の検定 実施例２６：アミノ酸分析および糖分析（十ＶＳＥ　）
１）アミノ酸組成の分析 実施例２５で１ｑた粗Ｃ５Ｆ試料を更に実施例２の（ｉ
ｉｉ）の方法にしたがって精製した。この精製Ｃ８Ｆ試
料を常法により加水分解し、そのタンパク部分のアミノ
酸組成を日立８３５アミノ酸自動分析装置（日立製作所
社製）を用いて特殊アミノ酸分析法により分析した。こ
の結果を表−６に示した。

尚、加水分解条件は次の如くである。

■　６Ｎ　ト（Ｃ１，１１０℃、２４時間、真空中■　
４Ｎ　メタンスルホン酸＋０．２％３−（２−アミノエ
チル）インドール、１１０℃、２４時間。

４８時間、７２時間、真空中 試料は、４０％「１−プロパツールと０．１％トリフル
オロ酢酸を含む溶液（１，５ｄ）に溶かした後、各々０
．１７をとり、乾燥窒素ガスにより乾燥させた後、■又
は■の試薬を加えて真空封管し、加水分解に供した。

表中、実測値は■の２４時間値と■の２４．４８．７２
時間値の合計４回の平均値である。但し、７１１ｒ。

Ｓｅｒ、１／２Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｖａ　ｌ、Ｉ　Ｉｅお
よびＴｒＤは以下の方法で線用した。（生化学実験講座
、タンパク貿化学■（東京化学同人出版）を参照） −１’−ｈｒ、Ｓｅｒ、１／２ＣＶＳ、Ｍｅｉは■の２
４．４８．７２時間値の経時変化をとり、零時間に補性
。

−Ｖａｔ、Ｉｌｅは■の７２時間値。

・　Ｔｒｐは■の２４．４８．７２時間値の平均値（以
下余白） 表−６（アミノ酸分析表） ２）糖組成分析 上記アミノ酸組成分析で用いた精製Ｃ３Ｆ試料２００ｎ
ｇに内部標準としてイノシトール２５ｎ　　ｍＯｌを加
えた後、１．５ＮＨＣ＋を含むメタノール溶液（５００
μｍ）を加えて窒素ガス置換した封管中、９０℃で４時
間反応させた。開管復炭酸銀（Ａｇ２　ＣＯ３＞を加え
て中和した後、無水酢酸５０μｍを加え振どう後、室温
にて暗所に一晩放置した。

上層をサンプルチューブにとり、窒素ガスにて乾燥した
。沈澱にメタノールを加え洗浄後軽く遠沈し、上層を同
じリンプルデユープに加え乾燥した。

これに５０μｍのＴＭＳ化試薬（ピリジン：へキリメヂ
ルジシラＩアン：トリメデルクロロシラン＝５：１：１
に混合したもの）を加え４０℃で２０分反応させた後、
Ｄｅｅｐ　Ｆｒｅｅｚｅｒに保存した。尚、スタンダー
ドとしてガラクトース（Ｇａ　ｌ　）　、Ｎ−アセチル
ガラクトサミン（Ｇａ　Ｉ　　ＮＡｃ）、シアル酸など
を各５０ｎｍＯ＋及びイノシトール２５ｎ　　ｍ。

１を合わせ同様の操作を行った− このサンプルについて以下に示す条件でガスクロマド分
析を行った。

（分析条付） カラム：２％ＯＶ　−１７ＶＩＮｐｏｒｔ　ＨＰ６０〜
８０メツシュ、３ｍ、ガラス 温度：１１０°Ｃ〜２５０°Ｃまで４°Ｃ／分の室温キ
レリヤーガス：最初は１．２〜１．６ＫｉＭＣ屑（窒素
圧）　　　終了時は２〜２．５　Ｋｇ／　ｃｒｔｉ感度
：　１０３ＭΩレンジ０．１〜０．４Ｖ圧　：水素カス
　０．８Ｋｇ／ｃｎｉ 空気　　　０．８に３／ｃｒｉ サンプル呈：２．５〜３．０μｍ 分析の結果、本発明のＣ３Ｆからガラクトース、Ｎ−ア
セチルガラクト＋）ミンおよびシアル酸が確認された。

実施例２７．ＰＨＧＶ２ベクターの調製（動物細胞用、
−ＶＳＥ系） 実施例１０で得られた図４（Ａ）で示されるｃＤＮＡの
ＥｃｏＲＩ断片を制限酵素［）ｒａ工にて３７°Ｃで２
時間で処理した後、ＤＮＡホリメラービ■のＫＩｅｎＯ
Ｗ断片（宝酒造社製）で処理し、末端を平滑末端とした
。１μｑのＢｇＩＩＩリンカ−（８ｍｅ　ｒ　；宝酒造
社製）をＡＴＰを用いてリン酸化した後、上記で得られ
た約１μｑのＤＮＡ断・片混合物と結合させた。次いで
制限酵素Ｂｇｌ　ＩＩで処理してアガロースゲル電気泳
動を行い、最も大ぎいＤＮＡ断片だけを回収した。

このＤＮＡ断ハは図５に示すようにヒトＧ−Ｃ３Ｆポリ
ペブブドをコードする部分を含む約７１０塩基対に相当
していた。ベクターｐｄＫＣＲ（Ｆｕｋｕｎａｇａ等；
　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ｔｌＳＡ；
　８１巻５０８６頁（１９８４））を制限酵素ＢａｍＨ
Ｉで処理した後、アルカリフｔスフ７・ターピ（宝酒造
社製）で脱リン酸して１ｑられたベクターＤＮＡをＴ４
ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を加えてｃＤＮＡ断片と
結合さＩ！ｐＨＧＶ２ヲｉＳだ（図１５）　。図１５に
：示すｌ’Ｌルごとくこのプラスミドは、ＳＶ４０初期
遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の複製開始領域、ウサ
ギβ−グロビン遺伝子の一部、ｐＢＲ３２２の複製開始
領域およびｐＢＲ３２２由来のβ−ラクタマーピ遺伝子
（Ａｍｐ’　）を含み、ＳＶ４０初期遺伝子のプロモー
ター下流にヒ１〜〇−Ｃ３Ｆ遺伝子が接続されている。

実施例２８　　Ｃ１２７細胞用組換えベクターの構築（
−ＶＳＥ） １）　ｐＨＧＶ２　（１−ｌ）の構築 実施例２１で得られた（図１５）ｌＧＶ２プラスミド２
０μジを用いて、実施例２２の１）に記載した方法によ
ってｐＨＧＶ２（ｔ−１＞と命名するプラスミドを得た
。（図１６）。

２）発現用組換えベクターｐＴＮ−Ｖ２の構築上記１）
で１７られたｐＨＧＶ２（ト１）２０μびを用いて、実
施例２２の２）に記載した方法によってｐ）−ＩＧＶ２
山来Ｇ−Ｃ３ＦのｃＤＮＡを有するプラスミドを保持す
るＥ、Ｃ０Ｉｉコロニーを選別した。このプラスミドを
ｐＴＮ−Ｖ２と命名する（図１６）。

実施例２９　　Ｃ１２７細胞の形質転換およびその発現
（−ＶＳＥ） 実施例２８テ得７．：　ｐ　Ｔ　Ｎ　−Ｖ　２をマウス
Ｃ１２７細胞に形質転換する前に制限ｒＲ素ＢａｍｈＩ
で処理する。

次いでマウスＣｌ２７Ｉ細胞を上記調製ＤＮＡで形質転
換して発現させ（実施例２３参照）Ｇ−Ｃ３Ｆ生産能の
高いクローンを選別した。その結果〜１ｍｇ／、ｌ！の
レベルのＧ−Ｃ３Ｆ生産がみられた。

尚、宿主細胞には上記の０１２７Ｉ細胞のほかにＮＩＨ
３Ｔ３細胞も用いることができる。

実施例３０Ｇ）１０細胞によるＧ−Ｃ３Ｆの発現（−Ｖ
ＳＥ） １）　１）ＨＧＶ２−ｄ　１１　ｆ　ｒ（７）構築実施
例２７で得たｐｔ−ＩＧＶ２プラスミド２０μ９から実
施例２４の１）に記載した方法によって１７られる約２
，７ｋｂ１７）断片とＤＡｄＤ２６ＳＶｐＡの断片のそ
れぞれ０．５μ３ずつをアニールした。このプラスミド
をＥ、ｃｏｌｉ　　ＤＨＦ株に塩化ルビジウム法により
形質転換してｐＨＧＶ２−ｄｈｆｒのプラスミドを保持
するコロニーを選択する。得られたプラスミドをｐＨＧ
Ｖ２−ｄｈｆｒと命名した。（図１１ａ）。

尚、上記の別法として、ｐＨＶ　２プラスミドを５ａｌ
Ｉ処理し、ＥＣ０ＲＩリンカ−を付加することなしにＥ
ＣＯＩ　Ｉで部分消化し、約２．７ｋｂの断片を回収し
、Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＤＮＡポリメラーゼ−ＫＩ　ｅｎＯ
Ｗ断片で該ＤＮＡ断片を処理し末端をプラントエンド化
する。

一方前述と同じ方法でｐＡｄＤ２６ＳＶＩ）Ａのプラン
トエンド化したＥＣ０ＲＩ断片を調製し、両者をＴ４　
ＤＮＡ’Ｊガ−Ｌ’％理しＴｐＨＧＶ２−ｄｈｆｒを調
製することもできる。

また実施例２８で得られたｐＨＧＶ２（ｔ−１＞を実施
例２８の２）で記載した如く制限酵素、ｌ−１ｉｎｄｌ
ｌおよび５ａｌＩにて処理し、ト１　ｉ　ｎｄｌ［ｌ−
３ａ　Ｉ■断片を上記ｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡのプラント
エンド化したＥＣ０ＲＩ断片に連結して’ｂ　ｐＨＧ　
Ｖ２−ｄｈｆｒを得ることができる（図１７ｂ）。

２）形質転換と発現 上記１）で調製したｐＨＧＶ２−ｄｈｆｒプラスミドを
用いて、実施例２４の２）に記載の方法によってＣＨＯ
細胞株を形質転換して発現させた。

なお、ＣＨＯ細胞の形質転換はＣＨＯ細胞に対しｐＨＧ
Ｖ２とｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡを同時形質転＠　（Ｃｏｔ
ｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）　ｆることによっても行
うことができる。

又、いわゆるポリジストロニック遺伝子を用いる方法で
組換えベクターを構築し、これを用いてＣＨＯ細胞を形
質転換することができる。例えばｐＡｄＤ２６ＳＶＤＡ
をＰｓ↑■処理し、２つの断片を回収しこれらとｐＢＲ
Ｖ２由来のＣ３ＦｃＤＮＡ断片を結合することにより、
アデノウィルスプロモーター、Ｃ８Ｆ　　ｃＤＮ△、Ｄ
　ＨＦ　Ｒ。

ＳＶ４０のポリＡ部位の順序に配列した組換えベクター
を構築しＣＨＯ細胞にいれて実施した。

実施例３１発現物貿Ｇ−Ｃ３Ｆ活性の検定（−ＶＳＥ） 実施例２９および実施例３０で得られたＣ１２７細胞及
びＣＨＯ細胞の培養上清から、実施例２５に記載の方法
によってヒトＧ−Ｃ３Ｆをｊη、そのヒ１〜Ｇ−Ｃ３Ｆ
活性を検定した。その結果は表−７の通りであった。

（以下余白） 表−７ヒ１〜〇−Ｃ８Ｆ活性の検定 実施例３２アミノ酸分析および糖分析（−ＶＳＥ　）１
）アミノ酸組成の分析 実施例３１で（９た粗Ｃ８Ｆ試村を更に実施例２の（ｉ
ｉｉ）の万゛法にしたがって精製した。この精製Ｃ８「
試料を実施例２６の１）に記載の方法によってアミノ酸
組成分析にイ・」シた。この結果を表−８に示す。

（以下余白） 表−８（アミノ酸分析表） ２）糖組成分析 上記アミノ酸組成分析で用いた精製Ｃ３Ｆ試料をもらい
て、実施例２６の２）に記載したのと同じ方法及び同じ
分析条件によって糖組成を分析した。

分析の結果、本発明のＣ３Ｆからガラクトース、Ｎ−ア
セブルガラクトリミン及びシアル酸が確認された。

実施例３３　　ヒトＧ−Ｃ３Ｆの感染防御効果く試験方
法〉 ８〜９週令（体重３５．３±１．３８ｇ）のＩＣＲ系マ
ウス（ｍ）にエンドキサン（ジオツギ社製、商品名）　
　２００ｍｇ／　Ｋｙを腹腔内投与した後３群に分け、
その２群にヒトＧ−Ｃ３Ｆ　（２５０００ｕ／マウス又
は５００００　ｕ／マウス）を含む溶媒（生理食塩水中
１％プロパツール、０．５％（（Ｗ　／Ｖ）マウス血清
アルブミン）を、そして別の１群には溶媒のみを、それ
ぞれ２４時間毎に０．１ｄずつ４回皮下投与した。４回
目の投与後３時間して各々の群にシュードモナス　アエ
ルギノーザ（Ｐｓｅｕｄ。

ｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）　ＧＮ　［３−１
３９（３，９ｘｌＯ”　Ｃ：。

ＦＵ／マウス）を皮下投与して感染させた。感染後２１
時間して、ざらにもう−度ヒ１−Ｇ−Ｃ３Ｆ（２５００
０Ｌｌ／？ウス又は５００００　ｕ／ｖウス）を含む溶
媒又は溶媒のみをそれぞれ対応する群に皮下投与した。

感染後１０日目までの生存マウス数により感染防御効果
を調べた。

（菌液の調製） ハートインフュージョン液体培地（Ｄｉｆｃ。

社製、商品名）を用いて３７℃で一夜シュードモナス　
アエルギノーザＧＮＢ−１３９を娠とう培養する。培養
液を生理食塩水に懸濁させて調製した。

２、キャンデイダ（Ｃａｎｄｉｄａ）感染に対する防禦
効界 ８週令（体重４０．５±１．６０ｇ）のＩＣＲ系マウス
Ｕｔ）にエンドキサン（ジオツギ社製、商品名）２００
　ｍＦＩ／Ｋｌを腹腔内役！プシだ後２群に分け１群に
ヒトＧ−Ｃ８Ｆ（５００００ｕ／マウス）を含む溶媒（
生理食塩水中１％のプロパツール、１０％（Ｗ／Ｖ）同
種マウス血清）を、別の１群には溶媒のみをそれぞれ２
４時間毎に０．１ｄずつ４回皮下投与した。４回目の投
与後４時間して各々の群にキャンデイグアルビカンス（
Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ）　Ｕ　−５０−１
（白血病患者尿分離株、東北大細菌学教室分与）　５．
６　ｘｌＯ”　ＣＦＵ／マウスを静脈内投与して感染さ
せた。感染後１０日目までの生存マウス数により感染防
禦効果を調べた。

〔菌液の調製〕

酵母エキス会心りブロー液体培地（２％デキストロース
（Ｉ！正生化学社製１０％トリプトケースペプＩ・ン（
Ｂ８［社製：商品名）　、ｐＨ５，６）を用いて３７℃
で一夜Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓＵ　−５０−
１を振とう培養する。培養液を生理食塩水で２回洗浄し
た後、生理食塩水に懸濁させて調製した。　　−７週令
（体重３４．７±１．２４ｇ＞のＩＣＲ系マウス（ｍ）
にエンドキサン（ジオツギ社製、商品名）２００　ｍＦ
Ｉ／に’ｊを腹腔内投与した後２群に分ｔノ１群にヒｔ
”Ｇ−Ｃ３Ｆ　（５００００ｕ／マｒ、；ｚス）　ヲ含
ム溶Ｗ（生理食塩水中１％ｎプロパツール、１０％（Ｗ
／Ｖ）同種マウス血清）を、別の１群には溶媒のみをそ
れぞれ２４時間毎にｏ、ｉｙずつ４回皮下投与した。４
回目の投与後４時間して各々の群にリステリア・モノサ
イトジェネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ　ｍｏｎｏｃｙｔｏｇ
ｅｎｅＳ）　４６　（東北大細菌学教室分与）　１．Ｏ
Ｘｌ０７ＣＦＵ／マウスを静脈内投与して感染させた。

感染後１２日目までの生存マウス数により感染防禦効果
を調べた。

〔菌液の調製〕

プレインハートインフュージョン液体培地（Ｄｉｆｃｏ
社製、商品名）を用いて３７℃でＬｉ５ｔｅｒｉａ　ｍ
ｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ　４６を娠どう培養する。培
養液を生理食塩水に懸濁させて調製した。

〈結　果〉 ■天然型ヒトＧ−Ｃ３Ｆの感染防禦効果参考例２に記載
したＣＨＵ−１から１ｑられたヒトＧ−Ｃ３Ｆに付いて
上記試験１，２および３を行った。得られた結果を表−
９、表−１０および表＝１１に示す。

表−９ シュードモナス　アエルギノーザに対する効果表−１０ キ（・ンディグ　アルビカンスに対重る感染防禦効果表
−１１ リステリア　モノリイトジエネスに対重る感染防禦効果 ■道転子組換えから得られたヒ１−Ｇ−Ｃ８Ｆの感染防
禦効果 ｉ）実施例１５で得た大腸菌からのＧ−Ｃ３Ｆ（十ＶＳ
Ｅ）ポリペプチドについで上記試験１．試験２および試
験３を行った。

その結果を表−１２，１３，１４に示づ。

（以下余白） 表−１２ シュードモナス　アエルギノーザに対する効果表−１３ キ丸・ンディダ　アルビカンスに対する感染防禦効果表
−１４ リステリア　−［ノサイトジエネスに対する感染防ｉｉ
）実施例１９で１７だ大腸菌からのＧ−Ｃ３Ｆ　（−Ｖ
ＳＥ　）ポリペプチドについて上記試験１を行った。そ
の結果を表−１５に示す。

表−１５ １ｉｉ）実施例２６のアミノ酸組成分析に用いたのと同
じＣＨＯ細胞由来の精製ヒトＧ−Ｃ３Ｆ試料（十ＶＳＥ
）について上記試験１を行った。

その結果を表−１６に示す。

表−１６ 同様にして前記実施例２６のアミノ酸組成分析に用いた
のと同じＣ１２７細胞由来の精製ヒトＧ−Ｃ３Ｆ試料を
用いて上記試験１の感染防禦効果を調べたところ、はぼ
同様の結果が得られた。

ｉｖ）　　実施例３２のアミノ酸組成分析に用いたのと
同じＣＨＯ細胞由来の精製ヒトＧ−Ｃ３Ｆ試料（−ＶＳ
Ｅ）について上記試験１を行った。

その結果を表−１７に示す。

表−１７ 用いたのと同じＣ１２７細胞由来の精製ヒトＧ−Ｃ８Ｆ
試料を用いて上記試験１の感染、防禦効果を調べたとこ
ろ、はぼ同様の結果が１９られた。

実施例３４ 実施例２で得られたヒ１−Ｇ−Ｃ３Ｆ凍結乾燥標品を注
射剤用溶解剤に溶解して所望の投与単位数になるように
分注して注射剤とした。

実施例３５ 実施例１５てｊ７られた大腸菌からのヒトＧ−Ｃ３Ｆポ
リペプチド凍結乾燥標品を注射剤用溶解剤に溶解して所
望の投与単位数になるように分注して注射剤とした。

〔発明の効果〕

本発明の感染防禦剤は、上述の通り、従前入手が極めて
困難であったヒトＧ−Ｃ８Ｆを、大吊且つ高品質で取得
する技術の完成、という本出願人によって１ｑられた成
果の上に達成できたものであって、種々の菌による感染
に対し、高い感染防禦効果が得られるほか、これまで、
化学療法剤だけでは困難とされていた感染症の治療に大
さく貢献するものであり、その効果は極めて大きい。

【図面の簡単な説明】

図１はプローブ（ＩＷＱ）、プローブ（Ａ＞およびプロ
ーブ（ＬＣ）の配列を示す。 図２はｐｔ−＋ｃｓ−ｉインサートの塩基配列を示す。 図３（Ａ）はｐＢＲＧ４のｃＤＮＡインナートの塩基配
列を示す。 図３（Ｂ）（Ｉ＞はＤＢＲＧ４　　ＣＤＮＡから演えぎ
したヒトＧ−Ｃ３Ｆ前駆体のアミノ酸配列を示す。 図３　（Ｂ）　（ＩＩ）はｐＢＲＧ４　　ｃＤＮＡから
演えきしたヒト成熟Ｇ−Ｃ３Ｆのアミノ酸配列を示す。 図４　（Ａ）ＬＪｏＢＲＶ２のｃＤＮＡイン４Ｊ−トの
塩基配列を示す。 図４　（Ｂ）（Ｉ）はｐＢＲＶ２　　ＣＤＮＡ／）’ら
演えきしたヒトＧ−Ｃ３Ｆ前駆体のアミノ酸配列を承り
。 図４　（Ｂ）（ｎ）はｐＢＲＶ２　　ｃＤＮＡから演え
ぎしたヒト成熟Ｇ−Ｃ３Ｆのアミノ酸配列を示す。 図５はｐＢＲＧ４またはｐＢＲＶ２山来ヒ１〜Ｇ−Ｃ３
Ｆ　　ｃＤＮＡの制限酵素切断部位を示す。 図６はｔ　ａ　Ｃプロモーター含有ベクターの調製プロ
セスの一部を示す（＋ＶＳＥ系）。 図７は合成Ｐ、プロモーター含有ベクターの調製プロセ
スを示す（＋ＶＳＥ系）。 図８はｔ　ｒ　ｐプロモーター含有ベクターの調製プロ
セスを示す（＋ＶＳＥ系）。 図９はｔａｃプロモーター含有ベクターの調製プロセス
の一部を示す（−ＶＳＥ系）。 図１０は合成Ｐ、プロモーター含有ベクターの調製プロ
レスを示す（−ＶＳＥ系）。 図１１はｔ　ｒ　ｐプロモーター含有ベクターの調製プ
ロセスを示す（−ＶＳＥ系）。 図１２はｐＨＧＡ４１０の概略構造を示す。 図１３は発現用組換えベクターｐＴＮ−Ｇ４の構築プロ
セスを示す。 図１４ａおよび図１４ｂはｐＨＧＧ４−ｄｈｆｒの構築
プロセスを承り。 図１５はｐ１］ＧＶ２の概略構造を示す。 図１６は発現用組換えベクターｐＴｌｌＶ２の構築プロ
セスを承り。 図１７ａおよび図１７ｂは発現用組換えベクターｐＨＧ
Ｖ２−ｄｈｆｒの構築プロセスを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　ヒト顆粒球コロニー刺激因子を有効成分とする感染
   防禦剤。 ２　ヒト顆粒球コロニー刺激因子が好中球コロニー刺激
   因子であることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
   の感染防禦剤。 ３　ヒト顆粒球コロニー刺激因子がヒト顆粒球コロニー
   刺激因子産生細胞の培養上清から得られたものであるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の感染防禦剤
   。 ４　ヒト顆粒球コロニー刺激因子が次の理化学的性質を
   有するものであることを特徴とする特許請求の範囲第３
   項記載の感染防禦剤。 「理化学的性質」 （１）分子量：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリル
   アミドゲル電気泳動法による測定で 約１９，０００±１，０００。 （２）等電点：ｐＩ＝５．５±０．１、ｐＩ＝５．８±
   ０．１、ｐＩ＝６．１±０．１の三つの等電点のう ち少なくとも１つを有する。 （３）紫外部吸収：２８０ｎｍに極大吸収を有し、２５
   ０ｎｍに極少値をもつ。 （４）Ｎ末端から２１残基目迄のアミノ酸配列が次の如
   くである。 【遺伝子配列があります】 ５　ヒト顆粒球コロニー刺激因子がヒト顆粒球コロニー
   刺激因子活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
   を含む組換えベクターを含有する形質転換体から産生さ
   れたヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプ
   チドまたは糖蛋白質であることを特徴とする特許請求の
   範囲第１項に記載の感染防禦剤。 ６　ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプ
   チドをコードする遺伝子が以下に示されるポリペプチド
   配列またはその一部をコードするものである特許請求の
   範囲第５項に記載の感染防禦剤。 【遺伝子配列があります】 （ただしｍは０または１を表わす） ７　ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプ
   チドをコードする遺伝子が以下に示されるポリペプチド
   配列またはその一部をコードするものである特許請求の
   範囲第５項に記載の感染防禦剤。 【遺伝子配列があります】 （ただしｍは０または１を表わす） ８　ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプ
   チドをコードする遺伝子が以下に示される塩基配列また
   はその一部を有するものである特許請求の範囲第５項に
   記載の感染防禦剤。 【遺伝子配列があります】 （ただしｍは０または１を表わす） ９　ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプ
   チドをコードする遺伝子が以下に示される塩基配列また
   はその一部を有するものである特許請求の範囲第５項記
   載の感染防禦剤。 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 （ただしｍは０または１を表わす） １０　ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペ
   プチドをコードする遺伝子が図３（Ａ）に示される塩基
   配列またはその一部を有するものである特許請求の範囲
   第５項記載の感染防禦剤。 １１　ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペ
   プチドをコードする遺伝子が図４（Ａ）に示される塩基
   配列またはその一部を有するものである特許請求の範囲
   第５項記載の感染防禦剤。 １２　ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペ
   プチドをコードする遺伝子が微生物又はウィルス由来の
   レプリコンに接続されたものである特許請求の範囲第５
   項〜第１１項のいずれかに記載の感染防禦剤。 １３　形質転換体が大腸菌を形質転換することによつて
   得られるものである特許請求の範囲第５項記載の感染防
   禦剤。 １４　形質転換体が動物細胞を形質転換することによっ
   て得られるものである特許請求の範囲第５項記載の感染
   防禦剤。 １５　ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペ
   プチドが下記のアミノ酸配列またはその一部で表わされ
   る特許請求の範囲第５項に記載の感染防禦剤。 【遺伝子配列があります】 （但しｍは０又は１を表わし、 ｎは０又は１を表わす） １６　ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有する糖蛋白
   質が下記のアミノ酸配列またはその一部で表わされるポ
   リペプチドと糖鎖部とを有するものである特許請求の範
   囲第５項に記載の感染防禦剤。 【遺伝子配列があります】 （ただしｍは０または１を表わす）