JPS62132899A - 新規なポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕 本発明は新規なポリペプチド、特に主としてヒト顆粒球
系細胞のコロニー形成をさせるために必要な、特異的な
刺激因子、すなわちコロニー刺激的因子（以下ｒｃｓＦ
Ｊと略記する）活性を有するポリペプチドに関し、且つ
該ポリペプチドをコードする遺伝子を組み込んだ組換え
ベクター並びに、これを含む形質転換体、及びそれから
産生されるＣ５Ｆ組成物に関する。 〔従来の技術〕 ２層軟寒天培養法で、上層に標的細胞として骨髄細胞を
、下層に腎細胞や胎児細胞を入れて培養すると、上層の
細胞の一部が増殖分化し、好中球系顆粒球（以下「顆粒
球（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ）　Ｊと称す。）や単球マ
イクロファージからなるコロニーが形成されることから
、生体内にコロニー形成を促進する因子が存在すること
が知られていた（Ｐｌｕｚｎｉｋと５ａｃｈ：　Ｊ、　
Ｃｅ１１．Ｃｏｍｐ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ　、　。 並巻３１９頁（１９６５）、　Ｂｒａｄｌｅ’／とＨｅ
ｔｃａｌｆ　　；Ａｕ５ｔ。 Ｊ、　　Ｅｘｐ、ＢｉｏｌｌＭｅｄ、　　Ｓｃｉ、、　
４４巻２８γ頁（１９６６））。 Ｃ３Ｆと総称されるこの因子は、正常に広く生体内分布
する細胞、たとえば、Ｔ細胞、単球マクロファージ、繊
維芽細胞、内皮細胞゛などより産生されることが知られ
ている。Ｃ３Ｆには顆粒球・単球マクロファージの幹細
胞に作用して、その増殖を刺激し分化を誘導して、軟寒
天中で顆粒球や単球マクロワ１−ジから成るコロニーを
形成させる作用をもつ顆粒球−単球マクロファージＣ３
Ｆ（ＧＭ−Ｃ３Ｆと略記する。）、主として単球マクロ
ファージのコロニーを形成さける作用をもつ単球マクロ
ファージＣ３Ｆ　（Ｍ−Ｃ３Ｆと略記する。）、より未
分化な多能性り♀細胞に作用する多能性Ｃ５Ｆ　＜ｍｕ
　ｌ　ｔ　１−Ｃ３Ｆと略記スル。）、あるいは本発明
の如き、主として顆粒球系コロニーを形成させる作用を
もつ顆粒球Ｃ３Ｆ（Ｇ−Ｃ３Ｆと略記する。）などのり
！クラスが存在し、ぞれぞれのサブクラスによつ（Ｐｆ
、的細胞の分化段階も異なることが考えられる様になっ
てぎた［ＡＳａｎＯ：代１４−）ｆｅｔａｂｏｌｉｓｍ
　ａｎｄ　ｔ）ｉｓｅａｓｅ、　２２巻２４９頁（１９
８５）　、　Ｙｕｎｉｓ等；　”Ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ
）１ａｔｕｒａｔｉｏｎ　　ＦａＣｊＯｒＳ　　”　、
　　ｅｄｉｔｅｄ　　ｂｙＧｕｒＯｆｆ。 Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆５ｏｎｓ、　ＮＹ、ユ巻、２
０９頁（１９８３）　］。 従って個々のリーブクラスを精製し、その化学的性状や
生物学的性状をより詳細に調べることは造血機構や種々
の血液学的疾患の病態の解析にきわめて重要なことであ
る。中でもＧ−Ｃ３Ｆの生物学的作用として、骨髄性白
血病細胞の分化誘導と成熟顆粒球の機能六進が注目され
ており、特に白血病の治療と予防へのＧ−Ｃ８Ｆの臨床
的有用性が大いに期待されている。 〔発明が解決しようとする問題点〕 Ｇ−Ｃ３Ｆの単離精製のために従来行われてきた試みは
、細胞培養法を用いて、その培養上清からＧ−Ｃ８Ｆを
単離する方法であるが、Ｇ−Ｃ３Ｆが低濃度しか産生さ
れないこと、大母の培養液から微最のＧ−Ｃ３Ｆを１ｑ
るには複雑な精製過程を必要とするなどの難点をかかえ
未だ大量の均一なＧ−Ｃ３Ｆを（ワるには至っていない
。従って、組換えＤＮＡ技術を用いてＧ−Ｃ３Ｆを大Ｒ
に製造づることか渇望されていた。 （問題点を解決するための手段） 本発明は特許請求の範囲第１項に記載したアミノ酸配列
で表わされるヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有する
ポリペプチドを提供するものである。又該ポリペプチド
を産生ずるために用いられる組換えベクター、及びこれ
で宿主を形質転換体して１９だ形質転換体とそれから産
生されるＧ−Ｃ８Ｆ組成物も同時に提供するものである
。 なお、本発明にとり特に重要な構成要件はヒトＧ−Ｃ３
Ｆ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であっ
て、詳しくはショ糖密度勾配遠心法により１５〜１７Ｓ
画分として得られる、ヒトＧ−Ｃ３Ｆ活性を有するポリ
ペプチドをコードするメッセンジｖ　−ＲＮＡ　（ｍＲ
ＮＡ）に相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）であり、より詳し
くは図３（Ｂ）のポリペプチド■又は■をコードする遺
伝子あるいはその一部を有するものであり、ざらに詳細
には図３（Ａ）の塩基配列の５′−末端から３２〜３４
ヌクレΔチ下位のＡＴＧから６５０〜６５２ヌクレオチ
ド位のＣＣＣまでの配列、１２２〜１２４位のＡＣＣか
ら６５０〜６５２位のＣＣＣまでの配列または図３（Ａ
）に記載された配列あるいはその一部を有するものでお
る。 本発明の遺伝子は例えばＧ−Ｃ３Ｆ活性を有するポリペ
プチドを産生ずる能力を有する吐乳動物細胞等からＧ−
Ｃ８ＦをコードするｍＲＮＡを調製した後、既知の方法
により２末鎖ｃＤＮＡに変換することによって１７られ
る。 前記、ｍＲＮＡの供給源となる吐乳動物細胞は本発明に
おいては、ヒドロ腔底癌由来の細胞株ＣＩＩｔＪ−２（
Ｃｏｌ　１ｅｃｔｉｏｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌｃ　Ｄｅ　
Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　Ｄｅ　）ｌｉｃｒｏ。 ｒｇａｎｉｓｍｅｓ　　（Ｃ，Ｎ、　Ｃ，Ｍ）寄託番Ｑ
■−４８３）であるが、腫瘍細胞株にかぎらず、吐乳動
物から分離できる細胞、あるいは樹立した他の細胞株で
もよい。又、汀１ＲＮＡの調製はすでに他のいくつかの
生理活性タンパクの遺伝子をクローン化する際、用いら
れた方法、例えば、バナジウム複合体等のりボヌクレア
ーゼインヒビター存在下に界面活性剤処理、フェノール
処理を行う（ＢｅｒｇｅｒとＢｉｒｋｅｎｍｅｉｅｒ　
：　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１８巻５１４３頁（１９
７９）を参照）か、グアニジンチオシアナート処理後、
Ｃ５Ｃ１密瓜勾配遠心を行う（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ等；　
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１８巻５２９４頁（１９７９
）を参照）ことによって、全ＲＮへを得た後、オリゴ（
ｄＴ）−セルロースやゼファロース２Ｂを担体とするポ
リＵ−セファロース等を用いたアフィニティーカラム法
あるいはバッチ法によりポリ（Ａ　　）ＲＮＡ　（ｍＲ
ＮＡ＞を得ることができる。またショ糖密度勾配遠心法
等によりポリ（Ａ　　）ＲＮＡを更に分画することもで
きる。　　上記の如くして得られたｍＲＮＡが、Ｇ−Ｃ
３Ｆ活性をもつポリペプチドをコード覆るものであるこ
とを確認するためには、ｍＲＮＡをタンパク質に翻訳さ
せ、生理活性を調べるか、抗Ｇ−Ｃ３Ｆ抗体を用いてそ
のタンパクを同定する等の方法を行えばよい。例えば、
アフリカッメガエル（ＸｅｎＯｐｕＳ　Ｉａｅｖｉｓ）
の卵母細胞にｍＲＮＡを注入して翻訳させたり（Ｇｕｒ
ｄＯｎ等：　Ｎａｔｕｒｅ、　　２競巻　１７７頁（１
９７２）を参照）、あるいはウナギ網状赤血球（Ｒｅｔ
ｉＣＵＩＯＣｙｔｅ）系や小麦胚芽（Ｗｈｅａｔｇｅｒ
ｍ　）　　系を利用した翻訳反応が行われている（Ｓｃ
ｈｔｅｉｆと−ｅｒｉｓｉｎｋ　　；　“Ｐｒａｃｔｉ
ｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　１ｎ）１ｏｌｅｃｕｌａｒ　
Ｂｉｏｌｏｇｙ”、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａ（
１，ＮＹ。 （１９８１））。　Ｇ−Ｃ３Ｆ活性の検定は骨髄細胞を
用いた軟寒天培養法を適用して実施できる。それらの手
法については総説がある（Ｈｅｔｃａｌｔ　；“ｔｌｅ
ｍｏｐｏｉｅｔｉｃ　Ｃ０ＩＯｎｉｅＳ”、　Ｓｐｒｉ
ｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、　Ｂｅｒｌｉｎ、　Ｈｅｉｄ
ｅｌｂｅｒｇ、　ＮＹ（１９７７））。 前述の如き方法で得たｍＲＮＡを鋳型にして１重鎖ｃＤ
ＮＡを合成した後、この１本鎖ＣＤＮＡ／１１ら２本鎖
ＣＤＮＡを合成し、適当なベクターＤＮＡとの組換えプ
ラスミドを作成する。これを大腸菌（Ｅｓｃｈｃｒｉｃ
ｈｉａ　ｃｏｌ　ｉ　）などを形質転換して、形質転換
株のＤＮＡ群（以下、ＣＤＮＡライブラリーと称する。 ）を１ｑる。 ｍＲＮＡから２本鎖ＣＤＮＡを１ｑるには、例えばｍＲ
ＮＡの３′−末端にあるポリへ−鎖に相補的なオリゴ（
ｄＴ）をプライマーとして逆転写酵素で処理するか、ま
たはＧ−Ｃ８Ｆタンパクのアミノ酸配列の一部に相応す
るオリゴヌクレオチドを合成し、これをブライマーとし
て逆転写酵素で処理してｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを
合成する。 ２重鎖ｃＤＮＡは、アルカリ処理でｍＲＮＡを分解・除
去した後、得られた１末鎖ｃ［）ＮＡを逆転写酵素又は
ＤＮＡポリメラーゼ（例えばＫ　ｌ　ｅｎＯＷ断片等）
処理後Ｓ＋ヌクレアーゼ等で処理して得るか、あるいは
、直接ＲＮ　ａ　Ｓ　ｅ　　ＨおよびＤＮＡポリメラー
ピ（例えば、大腸菌のＤＮＡポリメラーゼ１等）等で処
理することによっても得ることができる（例えば、）ｌ
ａｎｉａｔｉｓ等：　ＭＯｌｅＣｕｌａｒｃｌｏｎｉｎ
ｇ　、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒＬａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２）およびＧｕｂｌＯｒとｔ
ｌｏｆｆｍａｎ　：　Ｇｅｎｅ２５ｉ　２６３頁（１９
８３）を参照。）。 このようにして得られた２重鎖ｃＤＮＡを適当なベクタ
ー、例えば、ｐＳＣｌｏｌ　、　ｐＤＦ４１゜Ｃｏ　Ｉ
　Ｅｌ、ｐＭＢ９．ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２７。 ｐＡＣＹＣＩなどに代表されるＥＫ型プラスミドベクタ
ーや、λｇｔ、λＣ２λｇｔｉｏ、λｑｔＷＥｓなどに
代表されるファージベクターなどに組み込んだ後、大腸
菌（Ｘ１７７６　：　ＨＢ　１０１　：　Ｄ）−１１、
Ｃ６００株など）等を形質転換してＣＤＮＡライブラリ
ーを得ることができる（例えば、前出”）ｌｏｌｅｃｕ
ｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｏ　”を参照）。 ２重鎖ｃＤＮＡをベクターと連結させるには、ＤＮＡ末
端に連結可能な末端をつけるべく、適当な化学合成ＤＮ
Ａ断片を追加し、予め制限酵素を用いて開裂させたベク
ターＤＮＡとＡＴＰ存在下にＴ４ファージＤＮＡリガー
ゼで処理づることにより行うことができる。あるいは、
予め制限酵素を用いて開裂させたベクターＤＮＡと２重
鎖ｃＤＮＡのそれぞれにｄＧ、ｄＣ−鎖（あるいはｄＡ
、ｄＴ−鎖）を付加した後、例えば両ＤＮＡを含む溶液
を徐冷することによっても行うことができる（前記ＭＯ
ＩｅＣｔＪＩａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇを参照）。 こうして得られた組換えＤＮＡ体による宿主細胞の形質
転換は、例えば宿主細胞が大腸菌の場合＋１８ｎａｈａ
ｎが詳細に記述している如き方法（Ｊ。 Ｈｏｔ　、　Ｂｉｏｌ、　　；　　１６６巻５５７頁（
１９８３））　、すなわち、ＣａＣｌ２やＭｇＣｌ２又
はＲｂＣ１を共存ざゼて調製したコンビプント細胞に該
組換えＤＮＡ体を加えることにより実施することができ
る。 目的とする遺伝子を保もする細胞を検索するには、イン
ターフェロンｃＤＮＡのクローン化で用いられたプラス
−マイナス法（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ等：Ｐｒｏｃ、Ｊｐ
ｎ　、Ａｃａｄ、　５５巻Ｓｅｒ　、　３．　４６４頁
（１９７９）　）や、ハイブリダイピージョン−トラン
スレーションアッセイ法（Ｎａｇａｔａ等：　Ｎａｔｔ
ｊｒｅ　２８４巻３１６頁（１９８０）　）など、又は
該タンパク質のアミノ酸配列をもとにして化学合成した
オリゴヌクレオチドプローブを用いたコロニーあるいは
プラークハイブリダイゼーション法（Ｗａｌｌａｃｅ等
：　Ｎｕｃｌｅｉｃ＾ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　、　、　９巻
８７９頁（１９８１））などを用いればよい。 このようにしてクローン化されたヒトＧ　−Ｃ３Ｆ活性
を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含む断片は
適当なベクターＤＮＡに再び組み込むことにより、他の
原核生物または真核生物の宿主細胞を形質転換させるこ
とができる。更にこれらのベクターに適当なプロモータ
ー及び形質発現に係る配列を導入することにより、それ
ぞれの宿主細胞に於いて遺伝子を発現させることが可能
である。 原核生物宿主細胞としては、　例えばＥｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ　ｃｏｌｉ、　ＢａＣ１１ｌｔｌＳ　５ｕｂｔｉ
ｌｉｓ　、　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌ
ｕｓ等が挙げられる。　目的の遺伝子をこれ等の宿主細
胞内で形質発現させるには、宿主と適合し得る種由来の
レプリコン、すなわち複製起源および調節配列を含んで
いるプラスミドベクターで宿主細胞を形質転換させれば
よい。またベクターは形質転換細胞に表現形質（表現型
）の選択性を付与することができる配列をもつものが望
ましい。 例えば、Ｅ、ｃｏｌｉは、それを宿主とするベクターで
あるｐ　３　Ｒ３２２を用いて形質転換することができ
る（ＢｏｌｉＶｅｒ等；Ｇｃｎｅ２巻９５頁（１９７５
）を参照）。 ｐＢ　Ｒ３２２はアンピシリンおよびテトラサイクリン
耐性の遺伝子を含んでおり、どららかの耐性を利用覆る
ことによって形質転換細胞を同定することができる。原
核生物宿主の遺伝子発現に必要なプロモーターとしては
、β−ラクタマーゼ遍遺伝のプロモーター（ｃｈａｎｇ
等：　Ｎａｔｕｒｅ　２７５巻６１５頁（１９７８））
　、やラクトースプロモーター（ＧＯ（！ｄｄｅ　１等
；　Ｎａｔｕｒｅ　２８１巻５４４頁（１９７９）を参
照。）およびトリプトファンプロモーター（Ｇｏｅｄｄ
ｅ　Ｉ等；Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、）同巻
４０５７頁（１９８０）を参照）等があげられ、どのプ
ロモーターも本発明のヒトＧ−Ｃ３Ｆ活性をもつポリペ
プチドの産生に使用覆ることができる。 以上の如き宿主−ベクター系を用いてヒトＧ−ｃｓｒ：
活性を有するポリペプチドを得るには、上記ベクターの
適当な部位に該遺伝子を組み込んだ組換えＤＮＡ体によ
り宿主細胞を形質転換させた後、得られた形質転換体を
培養プればよい。さらに細胞内または培養液から該ポリ
ペプチドを分離・精製するには、公知の手段を用いて行
うことができる。 一般に真核生物の遺伝子はヒトインターフェロン遺伝子
等で知られているように、多形現象（ｐｏｌｙｍｏｒｐ
ｈｙｓｍ　＞を示すと考えられ（例えばＮ１５ｈｉ等；
　Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ　、９７巻１５３頁（１９８５）
を参照）、この多形現象によって１個またはそれ以上の
アミノ酸が置換される場合もあれば、塩基配列の変化は
あってもアミノ酸は全く変わらない場合もある。 また図３（Ｂ）アミノ酸配列の中の１個またはそれ以上
のアミノ酸を欠くか又は付加されたポリペプチド、ある
いは１個またはそれ以上のアミノ酸が１個またはそれ以
上のアミノ酸で置換されたポリペプチドでもＧ−Ｃ３Ｆ
活性を有することがある。例えば、ヒ］・インターロイ
キン２　（ｉＬ−２＞遺伝子のシスティンに相当する塩
基配列をゼリンに相当する塩基配列に変換してｊｑられ
たポリペプチドがインターロイキン２活性を保持するこ
ともすでに公知となっている（ｗａｎｇ等；　５Ｃｉｅ
ｒｔＣｅ　。 」μ巻１４３１頁（１９８４）　）。それゆえ、それ等
天然に存在するかあるいは人工合成されたポリペプチド
がヒトＧ−Ｃ３Ｆ活性を有する限りそれ等のポリペプチ
ドをコードする遺伝子は全て本発明に含まれる。 本発明のヒトー〇−Ｃ３Ｆ活性をもつポリペプチド、及
びこれをコードする遺伝子を有する組換えベクター及び
これを有する形質転換体、さらにはその発現ヒト−〇−
Ｃ３Ｆ組成物を得る方法について筒単に説明すると以下
の通りである。 （１）プローブの調製 腫瘍細胞株ＣＨＵ−２の培養上清から精製してｊｑられ
た均一ヒトＣ３Ｆ・タンパクについてＮ末端よりアミノ
酸配列を決定し、さらにブロムシアン分解、トリプシン
処理などにより断片化した後その断片についてもアミノ
酸配列を決定した。 ［実施例３　（ｉ）、　（ｉｉ）、　（ｉｉｉ）　］そ
のアミノ酸配列中から図１に示される配列に対応する２
種類のヌクレオチドプローブ（Ａ）、およびプローブ（
ＩＷＱ）を合成した。（実施例４）プローブ（Ａ）は連
続した１４個のヌクレオチドからなる混合型プローブで
ある。 プローブ（ＩＷＱ　）は、ヒトコレシストキニン遺伝子
のクローン化で用いられた如ぎ（Ｔａｋａｈａｓｈｉ等
；Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ　、　、
　ＵＳＡ、牝巻１９３１頁（１９８５））デオキシイノ
シンを使用した３０個の連続したヌクレオチドである。 ヌクレオチドの化学合成は改良型ホスホトリエステル法
を同相法に適用して行うことができ、Ｎａｒａｎｇの総
説に記）ホされている（丁ｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　３９
巻３−２２頁（１９８３）　）。 使用するプローブは、本発明で用いたプローブ以外の位
置のアミノ酸配列に基づくものであってもよい。 （２）ＣＤＮＡライブイリーの構築 ＣＩ」Ｕ−２細胞にグアニジンチオシアナート溶液を加
えてホモジナイズし、ＣｓＣｌ密度勾配遠心法により全
ＲＮＡを得る。 この全ＲＮＡからオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムによ
りポリ（Ａ　　＞ＲＮＡを選別した後、逆転写酵素によ
り１末鎖ｃＤＮＡを合成し、ＲＮａｓｅＨおよびＥ、ｃ
ｏｌｉＤＮＡポリメラーゼ■を加えて、２本鎖ＣＤＮＡ
を得た。得られた２本鎖ＣＤＮＡにｄＣ鎖を付加し、Ｐ
Ｓｔ　：［切断部位にｄＧ鎖を付加したｐＢ　Ｒ３２２
ベクターとつなぎ合せて、大腸菌Ｘ１７７６株を形質転
換させ、ｐ　３　Ｒ３２２系ｃＤＮパライブラリ−を構
築した。（実施例５，６）同様に、ＥｃｏＲＩリンカ−
を用いて、２重鎖ｃＤＮＡをλ０ｔ１０ベクターと連結
し、λファージ系ｃＤＮＡライブラリーを構築した。（
実施例（３）スクリーニング ｐＢ　Ｒ３２２系ｃＤＮＡライブラリー由来の組換え体
をワットマン５４１濾紙に固定し、３２ｐで放射標識し
たプローブ（ＩＷＱ＞を用いて、コロニーハイブリダイ
ゼーションを行った結果、１個のクローンが選別できた
。このクローンを、サザンブロツテイング法（Ｓｏｕｔ
ｈｅｒｎ：　Ｊ、　）ｌｏｌ　、　Ｂｉｏｌ、　９８巻
５０３頁（１９７５））を用いて更に詳細に検討したと
ころ、プローブ（Ａ）ともハイブリダイズした。 このクローンの塩基配列をジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ
　：　５ｃｉｅｎｃｅ　　２１４巻１２０５頁（１９８
１））によって決定した。 得られたＣＤＮＡイン１Ｊ−トのＩｎ配列を図２に示す
。図２に示される如く、このＣＤＮＡインサートはプロ
ーブ（ＩＷＱ）およびプローブ（Ａ）を含む３０８塩基
対からなり、実施例３（ｉｉｉ）に示したアミノ酸配列
を含む８３個のアミノ酸をコードするオープンリーディ
ングフレームを有していることがわかった。 この３０８塩基対を含むｐ　Ｂ　Ｒ３２２由来のプラス
ミドを以下ｐＨｃｓ−１と略記する。（実施例８）ｐｈ
ｃｓ−１から得られる３０８塩基対を含むＤＮＡ断片を
ニックトランスレーション法（前出、Ｍｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇを参照）にて放射標識し、これをプ
ローブとしてλｇｔｉｏ由来のｃＤＮＡライブラリーを
プラークハイブリダイゼーション（ＢｅｎｔＯｎとＤａ
ｖｉｓ　　；５ｃｉｅｎｃｅ　　１９６ｉ　１８０頁（
１９７７）によりスクリーニングして５個のクローンを
得、ｃＤＮＡを含むと思われるクローンについてその塩
基配列を前述と同様の方法で決定した。（図３（Ａ）） 図３（Ａ）に示される如く、このＣＤＮＡインサートは
一つの大きなオープンリーディングフレームを有する。 このｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列は図３
（Ａ）に示された如く演えきできる。 実施例３（ｉ）に示されているＧ−Ｃ３ＦタンパクのＮ
末端アミノ酸配列との比較により、本ｃＤＮＡは５゛−
末端から３２〜３４ヌクレオチド位のＡＴＧ配列から始
まり、１１９〜１２１位のＣＣＣ配列で終わる９０塩基
対によってコードされるシグナルペプヂドおよび１２２
〜１２４位のＡＣＣ配列から始まり６５０〜６５２位の
ＣＣＣ配列で終わる５３１塩基対によってコードされる
成熟Ｇ−Ｃ３Ｆポリペプブドに相当する塩基配列を含ん
でいることがわかった。従って図３（Ｂ）に示されたア
ミノ酸配列■のポリペプチドは２０７個のアミノ酸から
なり、その分子量は２２２９２．６７ダルトンと計ｑさ
れた。同様にアミノ酸配列■のポリペプチドは１８９８
６．７４ダルトンであった。（実施例９） 但しタンパク質の開始部位に関しては、３２〜３４位あ
るいは６８〜７０位のＡＴＧも同様に考え得る。 ＥｃｏＲ１切断部位にこのＣｒ）ＮＡを挿入した、ｐＢ
　Ｒ３２２を保持するエシェリヒア・コリ（Ｅ。 ｃｏｌｉ）　Ｘ１７７Ｇ株は、工業技術院微生物工業技
術技術研究所に寄託されている（ＦＥＲＭ奇託＠号ｐ−
８３５２）。 図４には、得られた遺伝子の制限酵素切断部位を示した
。 （４）組換えベクターの構築 かくして得られたｐＢＲＶ２プラスミド（実施例９）か
らＧ−Ｃ３ＦポリペプチドのｃＤＮＡ断片を制限酵素に
より切り出して来て、これと■　ｔａｃプロモーターを
含有するｐＫＫ２２３−３（ファルマシア社製）から調
製した断片とアニーリングした合成リンカ−を連結（ラ
イゲーション）し組換えベクターを構築するか（実施例
■　Ｐ、プロモーターを含むＩ）　Ｐ　Ｌ　−ｌａｍｂ
ｄａ（ファルマシア社製）から調製した３種の断片とア
ニーリングした合成リンカ−を連結し、再調整して組換
えベクターを構築するか（実施例１１）■あるいはｔｒ
ｐプロモーター含有ｐＯＹＩプラスミドから調製した断
片とアニーリングした合成リンカ−を連結して組換えベ
クターを構築する。 （実施例１２） （５）形質転換体の調製と培養、発現。 次に上記３種の組換えベクターを用いて前出のＭｏ１ｅ
ｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇに記載されている塩化カル
シウム法又は塩化ルビジウム法で、夫々Ｅ、ｃｏｌｉＤ
Ｈ１株、　Ｅ、　　ｃｏｌｉ　Ｎ４８３０株或いはＥ、
ｃｏｌｉＪＭ１０５株を形質転換した。（実施例１０．
１１゜１２）得られた形質転換株をアンピシリン含有ル
リア（Ｌｕｒｉａ　）培地でまず培養し次いで必要に応
じて、適宜誘導をかけ、培養を行い形質発現せしめた。 （実施例１３） （６）大腸菌からのＧ−Ｃ３Ｆポリペプチドの回収精製
とアミノ酸分析 形質転換株の培養液を遠心にかけ集菌した後リゾデーム
処理をし、凍結−融解をくりかえし溶菌させる。次いで
塩酸グアニジン処理後遠心で上澄液を得る。 これをＵｌｔｒｏｏｅｌ　ＡＣＡ５４カラム（ＬＫＢ社
製）でゲル濾過し、活性画分を限外「・π過器で濃縮し
た。 次に、ｎプロパツールを含む１〜す゛ノルオロ酢酸水溶
液を添加し、氷中放置、遠心分離し、逆相Ｃ１８カラム
に吸着、溶出操作を施す。溶出俊各両分の活性を調べ、
活性ピークを集め凍結乾燥した。 この凍結乾燥粉末を溶解し高速液体クロマトグラフィに
かけ、再度上記と同様の精製操作を行い取得したポリペ
プチドを５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にか
け目的とするＧ−Ｃ８Ｆポリペプチドを示す単一のバン
ドを確認した。（実施例１４）この様にして得られたポ
リペプチドはヒトＧ−Ｃ３Ｆ活性を示した。（実施例１
５）更に、得られたＧ−Ｃ３Ｆポリペプチドのアミノ酸
分析はアミノ酸組成を日立８３５アミノ酸自動分析装置
（日立製作断裂）を使用し、特殊アミノ酸分析法によっ
て分析した。又、Ｎ末端アミノ酸分析は気相式シークエ
ンサーを用いてエドマン分解し、高速液体クロマトグラ
フィー及び、引ｔｒａｓｐｈｅｒｅ　−０ＤＳカラムを
用いて行った。（実施例１６）〔実施例〕 以下実施例をあげて本発明の詳細な説明覆るが、その前
にＣ３Ｆ活性の測定法について参考例で説明しておく。 く参考例＞Ｃ８Ｆ活性の測定方法 本発明において用いられたＣ８Ｆ活性（以下Ｃ３Ａと略
す）の測定方法は次のとおりである。 ｒｃｓＡの測定方法」 （ａ）ヒト骨髄細胞を用いる場合： Ｂｒａｄｌｅｙ　Ｔ、　Ｒ，、Ｍｅｔｃａｌｆ　Ｄ、等
の方法（Ａｕｓｔ、　　Ｊ、　ｅｘｐ　、　Ｂｉｏｌｏ
ｍｅｄ　、Ｓｃｉ　、　４４巻２８７〜３００頁、　１
９６６年）に準じて単層軟寒天培養法により行った。す
なわらウシ胎児血清０．２戒、被検検体０．１！ｎｌ、
ヒト骨髄非付着性細胞浮遊液０．１ｍ１（１〜２Ｘ１０
５有核細胞）、改変）１ｃｃｏｙ’　Ｓ　５Ａ培養液０
．２５ｆ、寒天を０．７５％含む改変ＨｃＣｏｙ’　ｓ
　５Ａ培養液０．４Ｉ７ＸＩ２を混合して直径３５ｍの
組織培養プラスティックディツシュに入れて固まらせた
のち、３７℃、５％炭酸ガス／９５％空気。 １００％湿度の条件で培養を行い、１０日後に形成され
たコロニー数（５０個以上の細胞からなる集落を１コロ
ニーとする）を数え、１個のコロニーを、形成する活性
を１単位（Ｕｎｉｔ）としてＣ３Ａを求めた。 （ｂ）マウス前軸細胞を用いる場合： ウマ血清０．４ｍｇ、被検検体０．１ｍ１．０３Ｈ／ｌ
１ｅ（メス）マウスの骨髄細胞浮遊液０．１ｄ（０，５
〜１Ｘ１０５有核細胞）、寒天を０．７５％含む改変Ｍ
ｃＣｏｙ’　ｓ　５Ａ培養液０．４ｍｌを混合し直径３
５緬の組織培養用プラスティックディツシュに入れて固
まらせたのち、３７℃、５％炭酸ガス／９５％空気、１
００％湿度の条件下にて５日間培養し、形成されたコロ
ニー数（５０個以上の細胞からなる集落を１コロニーと
する〉を数え、１個のコロニーを形成する活性を１単位
（Ｕｎｉｔ）としてＣ３Ａを求めた。 尚、上記（ａ）　、　（ｂ）の方法において用いた［改
変ＭｃＣｏｙ’　ｓ　５Ａ培養液および（ａ）で用いた
ヒト骨髄非付着性細胞浮遊液は次の如くして作成した。 「改変ＨｃＣｏｙ’　ｓ　５Ａ培養ａ　（２倍ｍ［）　
Ｊ）ｉｃＣｏｙ’　ｓ　５Ａ培養液（ＧＩＢＣＯ社製）
１２ｇ。 ＭＥＭアミノ酸ビタミン培地（日永製薬社製）２．５５
ｇ！炭酸ナトリウム２．１８ＳＦ、ペニシリンＧカリウ
ム５００００単位を２同然溜水５００ｍに溶解後、０．
２２μｍのミリポアフィルタ−にて濾過滅菌を行った。 「ヒト骨髄非付着性細胞浮遊液」 健常人胸骨せん刺により得た骨髄液をＲＰＭ１１６４０
ｍ養液にて５倍に希釈し、Ｆｉｃｏｌ　−Ｐａｑｕｅ液
（ファルマシア社製）に重層し、４００ｘ　ｇ　、　３
０分。 ２５°Ｃにて遠心を行い、界面の細胞層（比重＜１．０
７７）を回収する。この細胞を洗浄後、２０％ウシ胎児
血清を含むＲＰＭ　Ｉ　１６４０＠養液にて５Ｘ１０６
Ｃｅ１１／ｄの′ａ瓜に調整し、２５ｄの組織培養用プ
ラスチックフラスコに入れ、炭酸ガス培養器にて３０分
間インキュベートしたのち、上清の非付着性細胞を回収
し、再［２５ｃｕｔプラスチツクフラスコに入れ、２時
間３０分インキュベートしたのち、上清の非付着性細胞
を集めて用いた。 実施例１．ｒｃＨｕ−２Ｊの樹立 著明な好中球の増多が認められた口腔式癌患者の腫瘍を
ｎ　ｕ／ｎ　ｕマウスに移植した。この腫瘍は移植約１
０日後に著明な腫瘍の増大と好中球の増多が認められた
。この腫瘍を移植１２日後に無菌的に摘出し、１〜２７
１！ｌ１３角に細切し、これを以下の如く培養した。 上記細切した腫瘍塊１０〜１５片を５０ｍのプラスチッ
ク遠心管に入れ、５戒のトリプシン溶液（トリプシン０
．２５％、ＥＤＴＡ　０．０２％含む）を加え、３７℃
の温浴中で１０分間振とうしたのち上清を捨て、再度、
同トリプシン溶液５ｒｎｌを加え、３７℃で１５分間攪
拌しながらトリプシン消化を行った。上清の細胞浮遊液
を回収し、ウシ胎児血清を１１ｎ１加えてトリプシンの
作用を止めたのち水中に保存した。 以上の操作を再度行い細胞浮遊液を回収し、前回の分と
合わせて１．５０Ｏｒ、ｐ、ｍ、１０分間の遠心により
細胞ペレットを得た。この細胞ペレットをウシ胎児血清
を１０％含むＦ−１０にて２回洗浄したのち、２５ｃｄ
のプラスチック培養フラスコに細胞濃度５Ｘ１０６個／
フラスコになるようにして植え込んだ。 ウシ胎児血清を１０％含有するＦ−１０培養液を用い、
炭酸ガスインキュベーター（炭酸ガス濃度５％。 湿度１００％〉中にて一部インキユベートしたのち、上
清を非付着細胞と共に除去し、新しい培養液を加えて培
養を継続した。培養開始後６日目に細胞がいっばいに増
殖したので、この時点で培養液を新しいものに替えた。 翌日、この培養液を捨て、ＲＰＭ　Ｉ　１６４０で５倍
希釈した抗マウス赤血球抗体（Ｃａｐｐｅ　１社製）２
ｒＩＩＩｔと同じ＜　ＲＰＭ　Ｉ　１６４０で２．５倍
希釈したモルモット補体く＠東製薬社製）２ｄを加え３
７℃、　２０分間インキュベートした。インキュベーシ
ョン終了後ウシ胎児血清を１０％含むＦ−１０にて２回
洗浄しｎｕ／ｎｕマウス由来のフィブロブラストを除去
し、引き続きウシ胎児血清を１０％含むＦ−１０Ｐｉｆ
ｉ液を加えて、ざらに２日間培養を行った後細胞の一部
を取り出し、限界希釈法によりクローニングを行った。 １ｑられた１１コのクローンについてＣ３Ｆ活性を調べ
たところ、他のものよりも約１０倍高い活性を示すクロ
ーン（ＣＩ−ＩＬＪ−２）が得られた。 実施例２．０ＳＦの単離 上述の如くして樹立された細胞が完全に密に増殖した１
５０ｏｙｆの培養フラスコ２本Ｊ、り細胞を回収し、こ
れをウシ胎児血清を１０％含有するＦ−１０培養液５０
０ｒｎｉに浮遊したのち、１５８０ｃＩｉのガラス製ロ
ーラーボトル（Ｂｅ　ｔ　ｃｏ社製）に移し、０．５ｒ
、　ｐ、　ｍ、の速度で回転培養を行った。細胞がロー
ラーボトルの内壁に完全に密に増殖した時点で培養液を
血清を含まないＲＰＭ　Ｉ　１６４０に交換し、４日間
培養したのち培養上清を回収し、ウシ胎児血清を１０％
含有するＦ−１０を加えて培養を続行する。 ３日間培養したのち再び血清を含まないＲＰＭ１１６４
０に液替を行い、４日後に培養上清を回収した。 以下同様の操作をくり返すことにより、毎週１ボトルよ
り５００ｍ１ずつの血清を含まない培養上清が（ｑられ
、しかもこの方法によりかなり長期間にわたって細胞を
維持し、培養上清を回収することが可能であ−っだ。 ）ｑられた培養上清５１を１バツチとし、これに０．０
１％ツイーン２０を添加４％　Ｈｏｌｌｏｗ　Ｆｉｂｅ
ｒ　ＤＣ−４およびＡｍ１ｃｏｎ　ＰＭ−１０（アコン
社製）を用いた限外濾過法により約１０００倍に濃縮し
たのち、これを以下の順序で精製した。 （ｉ）　　直径４．６ｒｍ、長さ９０ｃｍの川ｔｒｏｇ
ｅ＋　ＡＣＡ５４Ｃ１８カラム社’Ｎ）を用い、０．１
５　Ｍ　ＮａＣｌおよび０．０１％ツイーン２０（牛丼
化学社製）を含ムｏ、ｏｔ　ＭトＩＪス塩ｖＬＭ街液（
Ｄ）−１７，４＞　ヲ用イて前記濃縮した培養を清５ｄ
を流速約５０ｍ１／時間でゲル濾過した。尚カラムはあ
らかじめウシ血清アルブミン（分子量８７，０００＞　
、オボアルブミン（分子量４５，０００）　、チトクロ
ームＣ（分子量１２．４００）にてキヤリプレーション
シを行った。ゲル瀘過終了後各フラクションよりＯ，１
ｒＩＩｌずつを採取し、１０倍に希釈した後、前述した
ｒｃｓＡの測定方法（ｂ）」により活性を示す両分を調
べた。この結果、先ずＶｅ＝４００〜７００７の両分が
マクロファージ優位のＣ３Ａを示し、Ｖｅ＝　８００〜
１２００ｄの両分が顆粒球優位のＣ３Ａを示すことがわ
かったので、後者の両分を集めＰＭ−１０（アミコン社
製）を用いる限外濾過器によって約５ｄに濃縮した。 （１１）上記濃縮画分にｎ−プロパツール（東京化成社
製、アミノ酸配列決定用）を３０％含む０．１％トリフ
ルオロ酢酸水溶液を添加し、水中に１５分程度放置した
のち、１５．０ＯＯｒ、　ｐ、　ｍ、　１０分の遠心に
より沈澱を除去した。次いで先のｎ−プロパツールおよ
びトリフルオロ酢酸を含む水溶液で平衡化したμＢＯｎ
ｄａＤａｋ　Ｃ１８カラム（Ｗａ　ｔ　ｅ　ｒ　ｓ社製
、セミ分取用、　８　ｍＸ　３０ｃｍ　＞に吸＠後、３
０〜６０％の直線濃度勾配のｎ−プロパツールを含む０
．１％トリフルオロ酢酸水溶液で順次溶出した。高速液
体クロマト装置は日立６８５−５０型を、検出は日立６
３８−４１型検出器（いずれも日立製作断裂）を用い、
２２０ｎｍと２８０ｎｍの吸収を同時に測定した。溶出
後、各両分より１０μｍを分取１００倍希釈しただのち
、前述のｒＣ３Ａの測定法（ｂ）」により活性を示す両
分を調べた。この結果、ｎ−プロパツール４０％にて溶
出されるピークに活性が認められたので、このピークを
集め再度同じ条件で再クロマトを行い上記と同様にして
　Ｃ５Ａを調べたところ、ヤはりｎ−プロパツール４０
％の位置のピークに活性が認められたので、このピーク
を集め（４フラクシヨン＝４ｒｎ１）凍結乾燥した。 （ｉｉｉ）上記凍結乾燥粉末をｎ−プロパツールを４０
％含む０．１％トリフルオＯ酢酸水溶液２００μｍに溶
解し、ＴＳＫ−Ｇ３００Ｏ３Ｗカラム（東洋曹達社製、
　　７．５ａｍＸ６０ｃｍ）を用いた高速液体クロマト
グラフィ（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）にかけた。溶出は同水溶液に
より０．４ｄ／分の流速で行い、フラクションコレクタ
ーＦＲＡＣ−１００（ファルマシア社製）により０．４
−ずつ分取した。分取した各両分についてＣ３Ａを前記
と同様にして調べた結果、保持時間が３７〜３８分の画
分（分子量約２万に相当）に活性が認められたので、こ
の両分を回収し、更に分析用１１　Ｂｏｎｄａｐａｋ　
Ｃ１８カラム（４，６＃Ｘ３０ｃｍ）による精製を施し
たのち、メインピークを回収し凍結乾燥した。得られた
標品について前述の「Ｃ８Ａの測定方法（ａ）」によっ
て検定したところヒトＧ−Ｃ３Ｆ活性を有することを認
めた。 実施例３．アミノ酸配列の決定 （：）　Ｎ末端アミノ酸配列の決定 試料を気相式シークエンサー（アプライドバイオシステ
ム社製）を用いて１ドマン（１：ｄｍａｎ）分解し、得
られたＰＴＨアミノ酸を高速液体クロマトグラフィー装
置（ベックマン・インストルメンツ社製）およびｔｆｌ
ｔｒａｓｐｈｅｒｅ　−０ＤＳカラム（ベックマン・イ
ンストルメンツ社製）を用いて常法により分析した。カ
ラム（５μｍ、直径４．６馴、長さ２５０ｍ＞を開始緩
衝液（１５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４，５，４０
％アセトニトリルを含む水溶液）にて平衡化したのち、
検体（２０μｍの開始緩衝液にて溶解）を注入して開始
緩衝液によるイソクラティック溶出により分離を行った
。流速は１．／７／分、カラム温度は４０℃に保持した
。 ＰＴＨアミノ酸の検出は２６９ｎｍと３２０ｎｍの紫外
部吸収を利用した。あらかじめ標準ＰＴＨ７ミノ酸（シ
グマ社製）各２ｎｍｏｌを同一の系で分離して保持時間
を決定し、被検検体の保持時間から同定を行った。この
結果、Ｎ末端から２１残基目までのアミノ酸配列は次の
如く決定された。

【アミノ酸配列があります】

（１１）ブロムシアン分解 試料を７０％ギ酸に溶かし、昇華精製したブロムシアン
２００当ｍを加えて、３７℃で一夜反応させた。 次に反応物を凍結乾燥後、ＴＳＫ　　Ｇ３００Ｏ３Ｗカ
ラム（東洋曹達社製）を用いたＨＰＬＣで両分し４つの
ピークを得た。ピークを分子量の大きい順にＣＮ−１，
ＣＮ−２，ＣＮ−３，ＣＮ−４と命名し、収率のよいＣ
Ｎ−１，ＣＮ−２についてアミノ酸配列を自動気相式シ
ークエンサー（アプライドバイオシステム社製）を用い
て（１）と同様の条件で分析した。 その結果、０Ｎ−１はＧ−Ｃ３Ｆ゛タンパクのＮ末端か
らのペプチドであることがわかった。さらにＣＮ−２は
以下のアミノ酸配列を有していた。 Ｐｒｏ−Ａ　ｌ　ａ−Ｐｈｅ−Ａｌ　ａ−３ｅｒ−Ａｌ
　ａ−Ｐｈｅ−Ｇｌ　ｎ−Ａｒｇ−Ａｒ（］−Ａ　Ｉ　
ａ−Ｇ　Ｉ　Ｖ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｖａ　Ｉ　−Ｌｅｕ　−
Ｖａ　Ｉ　−Ａ　Ｉ　ａ−３ｅ　ｒ−１１ｉ　５−Ｌｅ
ｕ　−１ｎ− （ｉｉｉ）　トリプシン分解 試料を８Ｍ尿素を含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐｆ
−１７，４）に溶かし、０．１％２−メルカプトエタノ
ールを含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）を
加えて最終的に２Ｍの尿素となるように調整した。次い
で試料と酵素が５０＝１となるようにＴＰＣに処理トリ
プシン（シグマ社製商品名）を加え、２５°Ｃで４時間
反応させた後、さらに同岳のＴＰＣＫ処理トリプシンを
加えて、再度２５°Ｃで１６時間反応させた。反応後、
反応物をＣ８カラム（山村化学社製）を用いた高速逆相
カラムクロマトグラフィーに付した。溶出は０．１％Ｔ
ＥＡを含むｎ−プロパツールを用い、ｎ−プロパツール
ｍＷを５％〜６０％に直線的に上げて行った。２８０ｎ
ｍの紫外部吸収を測定して得られたピークのうち、メイ
ンピークについて（ｉ）と同条件下に自動気相式シーク
エンサー（アプライドバイオシステム社製）を用いてア
ミノ酸配列を分析した。その結果、メインピーりは（ｉ
ｉ）のＣＮ−２断片の一部を含む以下の配列を有するペ
プチドであることがわかった。 Ｇ　ｌ　ｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａ　Ｉ　−Ａ　Ｉ　ａ
　−ＡＳｐ−Ｐｈｅ−ＡＩ　ａ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−１１
ｅ−Ｔｒｌ）Ｇｉｎ−Ｑｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇ　Ｉ　ｕ−Ｇ
　Ｉ　ｕ−Ｌｅｕ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｍｅｔ　−Ａ　Ｉ　ａ
−Ｐｒｏ−Ａ　ｌ　ａ−Ｌ　ｅｕ　−Ｇ　ｌ　ｎ　−Ｐ
ｒｏ−Ｔｈ　ｒ　−Ｇ　ｌ　ｎ　−Ｇ　Ｉ　’ｊ−Ａ　
ｌ　ａ　−Ｍｅ　ｔ−Ｐｒｏ　−Ａ　ｌ　ａ−Ｐｈｅ　
−Ａ　Ｉ　ａ　−ｅｒ− 実施例４．ＤＮＡプローブの作成 （１）プローブ（ＩＷＱ）の合成 実施例３．（ｒ；）で得られたアミノ酸配列の中からＩ
　ｌ　ｅ−Ｔｒｐ−Ｇ　ｌ　ｎ−Ｇ　ｌ　ｎ−Ｍｅ　ｔ
　−Ｇｌ　ｕ−Ｇｆ　ｕ−Ｌｅｕ−ＧＩ　ｙ−Ｍｅｔで
示される１０個のアミノ酸の配列に基づいて、３０個の
連続するヌクレオチドを得た（図１）。図１の配列に於
いて、例えば５′−末端から９位のヌクレオチドはｄＡ
およびｄＧを等母金む混合物であることを示す。原料の
ヌクレオチドは主にダイマーをを使用し、必要に応じて
随時モノヌクレオチドも使用した。グラスフィルター付
きカラムに出発原料のヌクレオチド樹脂Ａｐ−ｄ　（Ｇ
）（ヤマサ鵠油社製＞２ｏｍｇを入れ塩化メチレンにて
洗浄を繰り返した後、３％トリクロロ酢酸を含む塩化メ
チレン溶液にて、４，４′−ジメトキシトリデル基を税
離ｖしめ、次いで１ｒｎｔｌの塩化メチレンでカラムを
数回洗浄した。無水ピリジンで洗浄して溶媒を置換した
のちヌクレオチドダイマー（ＤＭＴｒ＞ＡｐＴｐ　（Ｎ
ＨＲ３＞（日本Ｌオン社製：　ＮｌｌＲ３はトリエチル
アンモニウム、ＤＭＴｒはジメトキシトリチルを示す）
　’ｚｏｍｇと０．２ｍｌのピリジンを加えて真空ポン
プにてカラム内を真空乾燥した。 次いで、２，４．６−トリメチルベンゼンスルホニルー
３−ニトロトリアゾリド（ＭＳＮＴ、和光紬薬社製）２
０ｍｙと無水ピリジン０．２ｍを加えた後、カラム内を
窒素ガスで置換して、室温下に４５分間時々撮とうさせ
ることによってヌクレオチド樹脂とダイマーを縮合させ
た。反応終了後、ピリジンにてカラムを洗浄し、次いで
未反応の０８１４を過過剰の無水酢酸−４−ジメチルア
ミノピリジンにてアセデル化した後、再びカラムをピリ
ジンで洗浄した。以下同様に、（［）ＨＴｒ）Ｉｐ（Ｎ
ｌｌＲ３）　、　（Ｄ）ｆｒｒ）ＧＤＣＩ）（ＮｌｌＲ
３）　　、　　（ＤＨＴｒ）Ｉｐ（ＮｌｌＲ３）　　、
　　（ＤＨＴｒ）ＣｐＴｐ（ＮｌｌＲ３）と（ＤＨｒｒ
）ＴＥ）Ｔｌ）（ＮｌｌＲ３）の等早漏合物。 （開Ｔｒ）ＡｐＡｔ）（ＮｌｌＲ３）と（ＤＭＴｒ）Ａ
ｐＧｐ（ＮｌｌＲ３）の等早漏合物、　（ＤＨＴｒ）＾
ｐＧＤ（ＮｌｌＲ３）と（Ｄ）ｔ’ｒｒ）ＧＤＧＩ）（
ＮｌｌＲ３）の等通湯合物、　（ＤＭＴｒ）Ｇｌ）Ａｐ
（ＮｌｌＲ３）　、　（ＤＨＴｒ）丁ｐＧｌ）（ＮＨＲ
３）　、　（ＤＨＴｒ）ＡｐＡｐ（ＮｌｌＲ３）と（Ｄ
）ｉＴｒ）Ｇｌ）Ａｐ（ＮｌｌＲ３）の等早漏合物、　
（ＤＭＴｒ）Ｃｐ八へ）（ＮｌｌＲ３）　。 （ＤＨＴｒ）へＩ）ＡＩ）（ＮｌｌＲ３）と（ＤＨｒｒ
）八ｐＧｐ（Ｎ町）との等早漏合物、（開Ｔｒ）ＧＤＣ
ｔ）（ＮＨＲ３）　、　（ＤＨＴｒ）Ｔｌ）Ｇｌ）（Ｎ
ｌｌＲ３）　　、　　（ＤＨＴｒ）Ｉｐ（ＮｔｌＲ３→
、（ＤＨＴｒ）＾ｐＴＩ）（ＮｌｌＲ３）　　［（ＤＭ
Ｔｒ）Ｉｐ（ＮｌｌＲ３）はヤマサ鵠油社製、その他は
全て日本ピオン社製］の順で、前述の操作を繰り返すこ
とによって縮合させた。最終段階の反応終了後、アセチ
ル化することなしに、ピリジン。 塩化メチレン、エーテルの順で樹脂を洗浄した後、乾燥
させた。乾燥させた樹脂を１Ｍテトラメチルグアニジン
および１Ｍα−ピコリンアルドキシムムを含むジオキサ
ン１ｍ、ピリジン０．５ｄ、水０．２ｍｌの混合液１．
７ｒ１１１に懸濁した後、−夜室温にて放置した後、１
００〜２００　　μｍまで減圧濃縮した。 この濃縮液に少量（２〜３滴）のピリジンを加えた後、
濃アンモニア水２〜３ｍｌを加え５５℃で６時間加温し
た。次いで酢酸エチルを加えて抽出分離し、得られた水
層を減圧濃縮した後、５０ｍＭトリエチルアンモニウム
酢酸溶液（ｐＨ７，０＞に溶解せしめＴＣ−１８カラム
（１，ＯＸ１５ｃｍ、　Ｗａ　ｔ　ｅ　ｒＳ社製）を用
いたカラムクロマトグラフィーに付した。溶出は、５０
ｍＭトリエチルアン−しニウム酢酸溶液（ＤＨ７，０）
中１０％〜３０％の直線濃度勾配のアセトニトリルで行
い、アセトニトリル瀧度が２５％付近の位置で溶出され
るピーク画分を減圧濃縮した。 この濃縮液に８０％酢酸を加えて室温下に３０分間放置
した後、酢酸エチルを加えて抽出・分離し得られた水層
を減圧下に濃縮した。１ｑられた濃縮液は、０１８カラ
ム（センシュー科学社製、５ＳＣ−ＯＤＳ−２７２、６
φＸ２００ＩｎＩｎ）を用いた高速液体クロマトグラフ
ィーに付して、ざらに精製した。 溶出は５０ｍＭトリエチルアンモニウム酢酸溶液（ｐＨ
７，０＞中１０％〜２０％の直線濃度勾配のアセトニト
リルを用いて行い、１０Ａ　２６ｇＵｎｌｔＳ以上の収
量で合成ＤＮＡが得られた。 得られたオリゴヌクレオチドは）ｆａｘａｍ−Ｇｉ　１
ｂｅｒｔ法（Ｍａｔｈ、Ｅｎｚｙｍ　：　６５巻４９９
頁（１９８０）により塩基配列を調べた。結果、図１に
示された配列を有していることが確認された。 （ｉｉ）プローブ（Ａ）の合成 実施例３．　（ｉｉｉ）で得られたアミノ酸配列の中か
らＭｅｔ−Ｐｒｏ　−Ａ　ｌ　ａ−Ｐｈｅ　−Ａ　Ｉ　
ａで示される５個のアミノ酸の配列に基づいて１４個の
連続するヌクレオチドを得た。（図１）合成は、プロー
ブ（ＩＷＱ＞と同様な方法で行いヌクレオチド樹脂ＡＰ
−ｄ　（Ｔ＞（ヤマサ鵠油社製）に（ＤＨＴｆ’）Ｃ１
）Ａｔ）（ＮＨＲ３）　　：　（ＤＨＴｒ）Ｇｌ）Ｇｌ
）（ＮＨＲ３）：　（ＤＭＴｒ）ＣＤＡＤ（ＮＩＩ１１
３　）　、　（ＤＭＴｒ）ＣｐＴＩ）（ＮｌｌＲ３）　
。 （ＤＨＴｒ）ＣｐＧｐ（聞Ｒ３）および（ＤＨＴｒ）Ｃ
ｐＣＩ）（ＮＨＲ３）の等早漏合物；（開Ｔｒ）ＡｐＧ
ｐ（ＮＨＲ３）　、　（ＤＭＴｒ）ＴｏＧ。 （ＮｌｌＲ３）　、　（ＤＨＴｒ）ＧｐＧｐ（ＮＨＲ３
）および（ＤＨＴｒ）ＣｐＧｐＧｐ（ＮＨＲ３）の等早
漏合物：　（Ｄ）ｔＴｒ）ＡＤＡＩ）（ＮＨＲ３）　　
：（口ＭＴｒ）ＣＩ）Ａｐ（ＮＨＲ３）と（ＤＨＴｒ）
ＣＩ）Ｇｌ）（ＮＨＲ３）の等早漏合物（Ｄ）ＩＴｒ）
Ｇｌ）（ＮｔｌＲ，）　　（イずれも日本Ｌオン社製）
の順に縮合させて約１０Ａ　２６０　ｕｎｉｔｓの合成
ＤＮＡを得た。得られたオリゴヌクレオチドの塩基配列
をＨａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法により調べたところ図
１に示された塩基配列を有していることが確認された。 実施例５．　ＣｔｌＵ−２細胞の培養とｍＲＮＡの精製
１）ＣＨＵ−２細胞の培養と細胞の回収樹立されたＣ　
ＨＵ　−２細胞を１５０ＣＩ７ｔの培養フラスコ２本に
完全に密に増殖させた後、これをウシ胎児血清を１０％
含有するＲ　ＰＭ　Ｉ　１６４０＠養液５００ｄに浮遊
させたのち、１５８０ＣＩｉｔのガラス製ローラーボト
ル（ＱｅｌＣＯ社製）に移し、０．５ｒ、ｐ、ｍ、の速
度で４日間回転培養を行った。細胞がローラーボトルの
内壁に完全に密に増殖した時点で、ローラーボトルから
培養液を除ぎ、あらかじめ３７℃に加温したＥＤＴＡを
０．０２％含む生理食塩水１００ｄを加え、３７℃で２
分間加温後、ピペット操作ににて細胞をはく離ｕしめた
。得られた細胞懸濁液を１５０Ｏｒ、　Ｅ）、　ｍ、　
１０分間の遠心にて細胞ペレットを得る。細胞をＥＤＴ
Ａを含まない生理食塩水５ｍｌに再び懸濁し、１５００
ｒ、ｐ、ｍ、１０分間遠心にて細胞ペレットを得た（湿
重量的ｏ、ａｇ）、このようにして得られた細胞はＲＮ
Ａ抽出操作を行うまで一８０℃にて凍結保存する。 ２）ｍＲＮＡの精製 上記の如くして得られたＣＨＬＪ−２細胞からのｒＴＩ
　ＲＮ　Ａの単離は本質的に”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃ
ｌｏｎｉｎｇ　”［Ｈａｎｉａｔｉｓ等、　Ｃｏ１ｄ　
Ｓｐｒｉｎｇ　ｔｌａｒｂｏｒ、　　１９６頁（１９８
２）］に記載されているようにして実施した。 凍結保存されていたＣＨＵ−２細胞（湿重母３．８ｇ）
に２０ｍの６Ｍグアニジン溶液（６Ｍグアニジンヂオシ
アナート、５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７，０）　
、　　０．１Ｍ／β−メルカプトエタノール、０．５％
ザルコシル硫酸ナトリウム）に懸濁し、Ｖｏｒｔｅｘミ
キサーにて２〜３分よく混合した後、１８Ｇの注射針を
装てんした２０−容の注射器を用いて１０回吸入排出を
繰り返した。ベックマン社製５ＷＷ４０Ｔｉローターに
合うポリアロマ−製の遠心チューブに６ｍｌの５．７Ｍ
　　ＣｓＣｌ−０，ＩＭＥＤＴＡ。 （ｐＨ７，５）を先に加えておき、チューブが満たされ
るように上述の細胞が壊れて粘稠になったグアニジン溶
液的６ｄを重層した。このようにして調製された遠心チ
ューブ４本を３０．００Ｏｒ、　ｌ）、　ｍ、、２０°
Ｃで１５時間遠心した後、（ｑられたペレットを少量の
７０％エタノールを用いて３回洗浄した。 各々のチューブから得られたペレットを合して５５０μ
ｍの水に溶解せしめＮａＣｌ濃度が０．２Ｍとなるよう
に調整したのち、フェノール−クロロホルム（１：１）
処理、クロロボルム処理後、２．５倍容量のエタノール
を加えてエタノール沈澱を行い全ＲＮＡを得た。（湿細
胞３．８ｇより全ＲＮＡ的１０．１＃２ｆｆヲｌｌ。） 全ＲＮＡからポリ（Ａ”　）−ＲＮＡの精製は以下の如
く行った。この方法はｍＲＮＡが３′末端にポリＡ鎖を
付加していることを利用したアフィニティークロマトグ
ラフィーである。オリゴ（ｄＴ）−セルロース（Ｐ−Ｌ
　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社Ｍ、　Ｔｙｐｅ７）を
用い、吸着は全ＲＮＡを吸着緩衝液（１０ｍＭトリス−
塩ｍ　（ｐｔ−１７，５）　、　　０．５Ｍ　　ＮａＣ
ｌ。 １ｍＭ　　ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ溶液を含む。）に
溶解し、６５℃で５分間加熱した後、同溶液にて充てん
されたオリゴ（ｄＴ）−セルロースカラムに通過させて
行い、溶出はＴＥ溶液（１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７
，５）　、１ｍＭ　　ＥＤＴＡを含む。）で行った。未
吸着通過液は再び同カラムに通して同様に溶出操作を行
い、１回目の溶出液と混合した。このような操作を用い
て、ポリ（Ａ）−ＲＮＡ４００μ０を得た。 このようにして調整したｍＲＮＡを５ＣｈｌｅｉｆとＷ
ｅｎｓ　ｉ　ｎｋの実験技術書（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　
Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、　ＮｅｗＹ
ｏｒｋ、　Ｉｌｅｉｄｅｒｂｅｒｇ、　Ｂｅｒｌｉｎ、
　（１９８１））中に記載されている方法と同様の操作
で、ショ糖密度勾配遠心法によりサイズ画分した。 すなわら、５Ｗ４０Ｔ　ｉローター（ＢｅＣｋｌｌｌａ
ｎ社製）用チューブに５％〜２５％のシ１糖密度勾配を
作る。 ショ糖溶液は０．１Ｍ　　ＮａＣ１，１０ｍＭトリス−
−塩Ｍ、（ｐＨ７，５＞、１ｍＭ　　ＥＤＴＡ、０．５
％ＳＤＳの溶液にそれぞれ５％、２５％の割合いでＲＮ
ａＳｅフリーのショ糖（Ｓｃｈｗａｒｚ　／Ｈａｎｎ社
′ｔＡ）を含んでいる。 上記で述べた如き方法で調製したｍＲＮＡ　（ポリ（Ａ
　　＞−ＲＮＡ＞８００μｇを２００μｍ〜５００μ！
のＴＥ溶液に溶解ｕしめ、６５℃で５分間加熱後急冷し
た後、ショ糖密度勾配液の上にのせる。３００００ｒ、
ｐ、ｍ、にて２０時間遠心後、０．５ｍｉずつの分画を
集め２６０μｍの吸光度を測り、同様に行った標準ＲＮ
Ａ　（２８Ｓ、１８Ｓ。 ５ＳのリポソームＲＮＡ）ら分画されたＲＮＡのサイズ
を決めると同時に、各分画のＧ−Ｃ３Ｆ活性をアフリカ
ッメガエル（ＸｅｎＯｐｕＳ　Ｉａｅｖｉｓ）の卵母細
胞系を用いて調べた。すなわち各分画のｍＲＮＡを１μ
ｇ／μｍのＳ度の水溶液に調製し、ツメガエル（生後約
１年）から取り出した卵母細胞１個に５０ｎｏのｍ　Ｒ
Ｎ　Ａの割合いで注入した後、９６穴のマイクロタイタ
ープレートの１穴に卵母細胞を１０個ずつ入れ、それぞ
れ１００μｍのバース培地（８８ｍＭ　　ＮａＣｌ、１
ｍＨＫＣｌ、２．４ｍＭ　　ＮａＨｃｏ３，０．８２ｍ
Ｍ　　ＭｇＳＯ４，。 、３３ｍＭ　　Ｃａ（Ｎｏ　　）　　　　　０．４１ｍ
Ｍ　　Ｇ　　　２ｇ ａ　Ｃ＋　２　、　７．５ｍＭ　トリス−塩Ｍ　（１７
，６＞　。 ペニシリン１０ｍｔｉ／　ｌ　、ストレプトマイシン硫
酸１０ｍｙ／　ｌ　）中で４８時間室温で培養した後上
清を回収し、濃縮・精製してＧ−Ｃ３Ｆ活性を測定する
。 この結果、１５〜１７８画分にＧ−Ｃ３Ｆ活性が認めら
れた。 実施例６．ｃＤＮＡの合成（ＰＢＲ系ＣＤＮＡライブラ
リーの構築） 前述の方法で得られたポリ（Ａ”　）　−ＲＮＡからＬ
ａｎｄ等の方法［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ
　、　９巻２２５１頁（１９８１）］に基づき、ａｕｂ
＋ｅｒとＨＯｆｆｌｌｌａｎの方法［（３ｅｎｅ、２５
巻２６３頁（１９８３）　］を加味してＣＤＮＡを得た
。 １）１本鎖ＣＤＮＡの合成 エッペンドルフ社製１．５ｄ容チューブに以下の如くの
順序で試薬を入れる。８０μｍの反応緩衝液（５００ｍ
Ｍ　　ＫＣＩ　、　５０ｍＭ　　Ｍ（ＪＣ１２、２５０
ｍＭトリス−塩１！、　ｐＨ８，３）　、　２０μ＋の
２００　ｍ）ｆジチオスレイトール、３２μｌの１２．
５ｍ）１　　ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ
、ｄＴＴＰを各々１２．５ｍＭ含む）、１０μ＋のα−
３２Ｐ−ｄＣＴＰ（アマジャム製、　ＰＢ　１０２０５
）　、　３２μｍのオリゴ（ｄＴ）　　　　　（Ｐ−Ｌ
　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製。 ５００μｇ／威）、２０μｍのポリ（Ａ　　＞−ＲＮＡ
（２，１μｇ／μｍ）、蒸溜水２０６μｍの計　４００
μｍの反応液を６５℃で５分間加熱後、４２℃で５分間
加温する。この反応液に逆転写酵素（宝酒造製）１２０
単位を加え、さらに４２℃、２時間反応させた後、ＲＮ
ａＳｅインヒビター（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒ
ｃｈＬａｂＯｒａｔＯｒｉｅＳ社製＞２μ＋　、２０μ
ｍのＴＥ溶液、１６μｍの１００　ｍＭピロリン酸ナト
リウム、４８単位（４μｍ）の逆転写酵素を追加して、
今度は４６℃２時間反応せしめた。０．５Ｍ　　ＥＤＴ
Ａ　　８μｍ。 １０％ＳＤＳ　　８μｍを加えて反応を停止させた後、
フェノール−クロロホルム処理、エタノール沈澱（２回
）を行い一本鎖ＣＤＮＡを得た。 ２）１重鎖ｃＤＮＡへのｄＣ−鎖付加 上記で得られた一本鎖ＣＤＮＡを６０μｍの蒸溜水に溶
解後、６０μｍのｄＣ−鎖付加緩衝液（４００ｍＭカコ
ジル酸カリウム：５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ６，９）
：　４ｍＭジヂオスレイトール；’１ｍＭＣｏＣｌ２；
１ｍＭ　　ｄｃＴＰに加え、３７℃で５分間加温した。 この反応液にターミナルトランスフエラーｔ：Ｚ　（２
７ｕｎｉｔ／μｌ　、　Ｐ−Ｌ　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａｌｓ社製）３μｍを加えて３７℃で２，５分間反応し
た後、フェノール−クロロホルム処理（１回）、及びエ
タノール沈澱（２回）行い、１００ｍＭ　　ＮａＣ１を
含むＴＥ溶液４０μｍに溶解せしめた。 ３）２本鎖ＣＤＮＡの合成 上記４０μｍのＤＮＡ溶液に４μｍのオリゴ（ｃｊＧ）
　　　　（２００μ（Ｉｔ　／ｍｌ、　Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社！りを加え６５℃５分間、続いて
４２℃で３０分間加温した後、反応液を０℃に保った。 この反応液に緩肖液８０μｍ　（１００ｍＭトリス−塩
酸、ｐＨ７，５゜２０ｍＭ　ＭＱＣ＋　２　、５０ｍＭ
　（ＮＨ４）　２５０４　。 ５００ｍＭ　　ＫＣＩ）、４μｍの４ｍＭ　　ｄＮＴＰ
（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰを各々４ｍ
Ｍ含む）、６０μｌの１ｍＭβ−ＮＡＤ、及び２１０μ
ｍの蒸溜水、２０μｍのＥ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラ
ーピ■（宝酒造社製）、１５μｍのＥ。 ｃｏｌｉ　ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社）、１５μｍのＥ
。 ｃｏ’ｌｉ　ＲＮａｓｅ　Ｈ（宝酒造社）を加え１２℃
にて１時間反応させた後、さらに４μｍの４ｍＭｄＮＴ
Ｐを追加し、２５℃で１時間反応して、フェノール−ク
ロロホルム処理、エタノール沈澱（１回）を行って、約
８μｇの２重鎖ｃＤＮＡを得た。この２本鎖ＣＤＮＡを
ＴＥ温溶液溶解せしめ１６２％アガロースゲル電気泳動
を行い、約５６０塩基対（ｂｐ）〜２キロ塩基対（Ｋｂ
ｐ）の大きさに相当する部分をワットマンＤＥ８１（ワ
ットマン社製）に吸着させ溶出回収したところ、約０．
２μｇが回収された。 ４）２重鎖ｃＤＮＡへのｄＣ−鎖付加 上記の如く得られた２本鎖ＣＤＮＡを４０μｍのＴＥ温
溶液溶解し、２）の項で述べたｄＣ−鎖付加緩衝液８μ
ｍを加え３７℃で２分間加温した後、１μｍのターミナ
ルトランスフェラーゼ（２７ｔＪｎｉｔ／μｍ）を加え
て３７℃で３分間反応せしめた。反応液を直らにＯ′Ｃ
に冷却し０．５Ｍ　　ＥＤＴＡ１μｍを加えて反応を停
止した後、フェノール−クロロホルム処理、エタノール
沈澱を行い、得られた沈澱をＴＥ溶液１０μｍに懸濁し
た。 ５）　　ｐＢＲ系ｃＤＮＡライブラリーの構築市販のオ
リゴ（ｄＧ）鎖付加ｐＢＲ３２２ベクター（ベセスダリ
サーチラボラトリーズ社製、１０ｎｇ／μｍ）４μｍと
上記ｄＣ−鎖付加２本鎖ＣＤＮＡ２μｍを７５μｌの０
．ＩＭ　　ＮａＣｌを含むＴＥ温溶液中でアニールさゼ
た。アニールは６５℃、５分加温した後４０℃にて２時
間加温、その後、室温になるまで放置して行った。 一方、Ｈａｎｉａｔｉｓらの実験塵［ＭＯｌｅＣｔＪｌ
ａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ。 Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　　２４９頁
（１９８２）］に記載されている方法等を用いて大腸ｉ
！ｉ　Ｘ　１７７６株からコンピテント細胞を調製し、
上記７二−ルされたプラスミドにより形質転換を行い、
トランスフｔ−マント（形質転換体）が得られた。 実施例７．ＣＤＮＡ合成（λフアージ系ライブラリーの
構築） １）１末鎖ｃＤＮＡの合成 実施例５で述べた方法に従って３．８ｇの凍結保存ＣＨ
Ｕ−２細胞から２回オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムに
よる精製を経て４００μｇのポリ（Ａ　　＞−ＲＮＡを
得た。 このポリ（Ａ”　）−ＲＮＡ１２μｇを溶解した狂溶液
１０μｌを１０μｇのアクチノマイシンＤ（シグマ社製
）を含む反応チューブに入れた後、以下の順序で試薬類
を加えた；２０μｍの逆転写緩衝液（２５０ｍＭトリス
−塩酸（ｐＨ８，３＞　、　４０ｍＭＭＣＩＣＩ２，２
５０　ｍＭ　　ＫＣＩ＞２０μ＋の５ｍＭｄＮＴＰ　（
ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰを各々５ｍＭ
含む）、２０μｌのオリゴ（”　１２−ＩＢ　　（０，
２μ＋Ｊ　／ｒｒｄｌ　　Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａｌｓ社１）ｉμｍの１Ｍジチオスレイトール、２　μ
ｍの３０ｕｎｉｔ／μｍのＲＮａｓｅ　（プロメガバイ
オチク社）。 １０μｍの逆転写酵素（１０ｕｎｉｔ／μｍ生化学工業
社製）、１μＩのα−［３２ｐ］　ｄＡｒＰ　（１０μ
Ｃｉアマジャム社製）、１６μｍの水で計　１００μｍ
の液■の反応液になる。反応液を４２℃で２時間保った
後、５μｍの０．５Ｍ　　ＥＤＴＡ及び１μｍの２０％
ＳＤＳを加えて反応を停止した。フェノール−クロロホ
ルム（１００μｍ）処理、エタノール沈澱（２回）を行
って約４μりの１本鎖　ＣＤＮＡを１ｑた。 ２）２本鎖ＣＤＮＡの合成 上記の如く得られたｃＤＮＡを２９μｍのＴＥ温溶液溶
解し以下の順序で試薬類を加えて反応液とした＝２５μ
ｍのポリメラーゼ緩衝液（４００ｍＭｔｌｅｐｅｓ　（
ｐＨ７，６）　：１６ｍＭ　　ＭｏＣｌ３；６３ｍ）ｌ
のβ−メルカプトエタノール：　　２７０ｍＭ　　ＫＣ
Ｉ　）　：１０μｌの５ｍＭ　　ｄＮＴＰ：　　１．０
μｍの１５ｍＭβ−ＮＡＤ：　１．０μｍのα−［３２
ｐ］　ｄＡＴＰ（ｔ。 μＣｉ／μｌ　）　　：　　０．２μＩ　Ｅ、　　ｃｏ
ｌｉ　ＤＮＡリガーゼ（６０ｕｎｉｔ／μｌ宝酒造社ｉ
Ｑ）　：　５．０μ＋のＥ。 ｃｏｌｉＤＮ＾ポリメラーピＩ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａ
ｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社、　１０ｕｎｉｔ／μｍ　）　
：　０．１．ｃｚｌのＲＮａｓｅＨ（６０ｕｎｉｔ／μ
ｌ宝酒造社”ＪＪ＞　：２８．７　　μ＋の蒸溜水。 反応液を１４℃で１時間インキュベートした後、室温に
もどして、さらに１時間インキニーベートした。次いで
５μｍの０．５Ｍ　　ＥＤＴＡと１μｍの２０％ＳＤＳ
を加えて反応を停止させ、フェノール−クロロホルム処
理、エタノール沈澱を行った。 得られたＤＮＡを０．５ｍＭ　　ＥＤＴＡ２０μｌ　ニ
溶解せしめ、３μｍのＫｌｅｎｏｗ＄−９７液（５００
ｍＭトリス−塩酸（ｐ）−１８，０）　、　５０＋ｙｔ
ＨＭＱＣＩ　２　＞　。 ３μｍの５ｍＭ　　ｄＮＴＰ、及び水４μｍを加えて反
応液を調製した後、１μｍのＤＮＡポリメラービ（１（
ＩｅｎＯＷ断片）　（宝酒造社製）を加えて３０℃１５
分インキュベートした。 この反応液に７０μｍのＴＥ溶液を加えて希釈し、ざら
に５μｍの０．５Ｍ　　ＥＤＴＡ、１μｍの２０％ＳＤ
Ｓを加えて反応を停止した。反応液をフェノール−クロ
ロホルム処理し、エタノール沈澱を行って約８μｇの２
本鎖ＣＤＮＡを得た。 ３）２本鎖ＣＤＮＡのメチル化 ２）の項で合成した２本鎖ＣＤＮＡの水溶液３０μＩ、
メチル化緩衝液（５００ｍＭトリス−塩酸（ｐｆ−１８
，０）　　、　　５０ｍＭ　　　　ＥＤＴＡ）　　４０
μｌ　　、　　ＳＡＨ溶液（８００μＭＳ−アデノシル
ーし一メチルメチオニン（ＳＡＭ）、５０ｍＭ　　β−
メルカプトエタノール）２０μｍ、水１００μｍを加え
た混合液にＥＣ０ＲＩメチラーｔｌ；（Ｎｅｗ　Ｅｎｇ
ｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社。 ２０ｕｎｉｔ／μｌ　）１５μｌを加えて全反応液を２
００μｍとし、３７℃２時間インキュベートした。フェ
ノール処理、エーテル処理を行った後、エタノール沈澱
を行ってＤＮＡを回収した。 ４）　　ＥＣ０ＲＩリンカ−の付加 上記メチル化された２本鎖ＤＮＡ約１．２μｇにリガー
ゼ緩衝液（２５０ｍＭトリス−塩酸　（ｌ１７．５）、
１００ｍＭ　　ＭｇＣｌ２　）１．５μｌ　、あらかじ
めリン酸酸化されたＥＣ０ＲＩリンカ−０，５μｍ　　
（１０ｍｅｒ、宝酒造社製）、１．５μｌの１０ｍＭＡ
ＴＰ、　　１００ｍＭジチオスレイトール１．５μｌ　
。 ２μｍの８２０を加え、反応液を１５μｍとしてＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ（３，４ｕ／μｌ　、宝酒造社）０．７μ
ｍ加えて４℃で一晩反応させた後、６５℃にて１０分間
加熱しりガーゼを失活させた。この反応液をさらに１０
０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７，５＞　。 ５ｍＭ　　ＭｇＣｌ２，５０ｍＭ　　ＮａＣｌ、１００
μ（］　／ｄのゼラチンの濃度で全液間が５０μｍにな
るように調製した後、ＥｃｏＲＩ　（１０ｕｎｉｔ／μ
ｍ　）３．５μｍ加え、３７℃、２時間反応さゼた。次
いで０、５ＭのＥＤＴＡ　２．５μｍ、２０％ＳＤＳ　
Ｏ，５μｍを加えた後フェノール−クロロホルム５ｉａ
理を行いエタノール沈澱によりＤＮＡを回収した。この
後Ｕｌｔｒｏｇｅｌ　Ａｃへ３４（ＬＫＢ社！＆りのゲ
ル濾過法あるいはアガロースゲル電気泳動法にて未反応
のＥＣ０ＲＩリンカ−を除去し、リンカ−付加２重鎖Ｃ
ＤＮＡ約０．５〜０．７μ９を回収した。 ５）２本鎖ＣＤＮＡとλＣＪｔ１０ベクターの結合上記
のリンカ−付加２本鎖ＣＤＮＡを２．４μｑの予じめＥ
Ｃ０ＲＩ処理したλｑｔ１０ベクター（ベクタークロー
ニングシステム社）、リガーゼ緩衝液（２５０ｍＭ　ト
リス塩Ｍ、　１００　ｍＭ　　ＮａＣｌ２）１．４μｍ
、蒸溜水６．５μｍを加えて、４２°Ｃ１１５分間処理
した後１０ｍＭ　　ＡＴＰ１μｌ　、０．１Ｍジチオス
レイトール１μｌ　、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ０．５μｍ
を加え全はを１５μｍとした後、１２℃で一晩反応させ
た。 ６）インビトロパッケージング 上記５）で得られた組換え体ＤＮＡの約１／３をインビ
トロパッケージングキット（プロメガ　バイオチク社）
を用いてパッケージングし、ファージプラークをｊｑだ
。 実施例８．７０−ブ（ＩＷＱ）によるｐＢＲ系ライブリ
ーのスクリーニング コロニーの成育した寒天培地上にワットマン５４１濾紙
をのせ３７℃で２時間放置した。以下、ＴａｕｂとＴｈ
ＯｍｐＳＯｎの方法［Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ　、　
　１２６巻２２２頁（１９８２）］に準じて濾紙を処理
した。 すなわら、５４１濾紙にコロニーを移した後、クロラム
フェニコール（２５０μｇ／μｍ）を含んだ寒天培地に
移し、さらに３７℃で一晩放置した。 ５４１′ａ紙を取り出した後、室温下で０．５Ｎ　　Ｍ
ａｉｌ溶液を浸した濾紙上に３分間放置し、これを２回
くり返した。以下同様な操作を０．５Ｍトリス塩酸（ｐ
　Ｈ８）溶液を用いて３分間、２回行ない、ざらに４℃
下に０．０５Ｍトリス塩酸（ｐＨ８＞溶液で３分、１．
５４／ｒｎｉのリゾチーム液（０，０５Ｍトリス塩ｊｌ
！２　（１１Ｂ）、　２５％ショ糖を含む）で１０分間
、次いで３７℃下に１　Ｘ５ＳＣ（０，１５Ｍ　　Ｎａ
Ｃ１および０．０１５クエン酸ナトリウム）溶液で２分
間、２０６μｇ／ｒＩ１１プロテアーゼｋを含むｌＸ５
ＳＣ溶液で３０分、再び室温下にｌＸ５ＳＣ溶液で２分
間、９５％エタノール溶液で２分間、２回行った後、５
４１濾紙を乾燥させた。得られた乾燥　５４１１紙を室
温下にフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコー
ル（２５：２４：１，１００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８，
５）　　、　　　１００ｍＭ　　　Ｎａ１ｌ、　　１０
ｍＭＥＤＴＡで平衡化したもの）溶液に３０分間浸した
。 以下同様の操作を５ＸＳＳＣ溶液で３分間、３回次いで
９５％エタノール溶液で３分間、２回行った後、濾紙を
乾燥させた。 プローブ（ＩＷＱ＞常法を「ＭＯｌｅｃｕｌａｒ　ＣＣ
ｌ０ｎｉｎを参照」に従って３２ｐを用いて放射標識し
た後、Ｗａｌｌａｃｅ等の方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ
１ｄｓ　Ｒｅｓ、　９巻８１９頁（１９８１））に従っ
てコロニーパイプリダイゼ−ションヲ行った。６ＸＮＥ
Ｔ　［０，９Ｍ　　ＮａＣｌ。 ０．０９Ｍトリス塩酸（１）１７．５）　、　６ｍＭ　
　ＥＤＴＡＩ　。 ５　Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、０．１％ＳＤＳ、０．
１ｍｇ７威変性ＤＮＡ　（仔牛胸腺ＤＮＡ）を含むバイ
プリダイビージョン緩衝液中で６５℃、４時間、プレハ
イブリダイゼーションを行った後、放射標識化したプロ
ーブ（ＩＷＱ）１Ｘ１０６ＣｐＩＩＩ／ｒｄを含む前記
ハイブリダイゼーション緩衝液を用いて５６℃で一夜ハ
イブリダイゼーションを行った。反応終了後５４１濾紙
を室温下に０．１％ＳＤＳを含む５　Ｘ　ＳＳＣ溶液で
３０分、２回および５６℃、１．５分間洗滌した後、オ
ートラジオグラフィーを行った。 シグナルの出たクローンよりプラスミドを分離した後、
プローブ（ＩＷＱ）を用いてサザンプロッティングを行
った。ハイブリダイゼーションおよびオートラジオグラ
フィーは前述と同一の条件で行なった。 同様にプローブ（Ａ）を用いてサザン　プロッティング
を行った。ハイブリダイゼーションは前述のハイブリダ
イゼーションｔｆＪｔ液を用い、４９℃で１時間行い、
３９℃まで徐冷後ざらに３９℃で１時間行なった。反応
終了後、ニトロセルロースフィルターをｏ、ｉ％ＳＤＳ
を含む６ＸＳＳＣで室温下に３０分で２回洗滌し、次い
で３９℃で３分間洗滌した後、オートラジオグラフィー
を行なった。 この結果、１個のクローンがポジティブなものとして得
られ、ジデオキシ法により塩基配列を決定したところ図
２に示した如く、プローブ（ＩＷＱ　）及びプローブ（
Ａ）部分を含む３０８塩基対よりなるＤＮＡであること
が判明し、このインサートを含むｐＢ　Ｒ３２２由来プ
ラスミドをｐＨＣ８−１と命名した。 実施例９．　ｐ）−１ｃｓ−１由来ＤＮＡプローブによ
るλフアージ系ライブラリーのス クリーニング ＢｅｎｔＯｎとＤａｖｉｓの方法［５ｃｉｅｎｃｅ　　
１９６巻、１８０頁、　（１９７７）］に準じてプラー
クハイブリダイゼーションを行った。実施例８で得られ
たｐＨＣ３−１を５ａＵ３ＡおよびＥＣ０ＲＩで処理し
て約６００塩基対のＤＮＡ断片を１９、このＤＮＡ断片
を常法に従いニックトランスレーションにより放射標識
した。ファージプラークの生じた寒天培地上にニトロセ
ルロース濾紙（Ｓ＆Ｓ社）をのせてファージを移し、０
．５Ｍ　　ＮａＯＨにてＤＮＡを変性ざゼ、以下の順序
で濾紙を処理した。０．ＩＭＮａＯＨ，１，５Ｍ　　Ｎ
ａＣｌで２０秒続いて０．５Ｍトリス塩１（ｐＨ７，５
＞、　　１．５Ｍ　　ＮａＣｌで２０秒２回、最後に１
２０ｍＭ　　ＮａＣ１，１５ｍＭクエン酸’）−ダ、１
３ｍＭ　　ＫＨ２ＰＯ４，１ｍＭＥＤＴＡ、　ｐＨ７，
２で２０秒処理した。 次いで濾紙を乾燥し、８０’Ｃで２時間加熱してＤＮＡ
を固定した。５ＸＳＳＣ，５ＸＤｅｎｈａｒｄｔ溶液、
５０ｍＭリン酸緩衝液、　５０％ホルムアミド。 ０．２５　ｍｇ／ｒｄの変性ＤＮＡ　（鮭精巣ＤＮＡ）
、及び０．１％ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション緩
衝液中で４２℃にて一部プレハイブリダイゼーションを
行い、ニックトランスレーションにより放射標識化した
ｐＨＣ３−１プローブ４Ｘ１０”　　ＣＩ）ｍ／戒を含
むハイブリダイゼーション緩衝液（５ＸＳＳＣ，５ｘＤ
ｅｎｈａｒｄｔ溶液、２０ｍＭリンＷＩＬ緩衝液（ｐＨ
６，０）　、　５０％ホルムアミド、０．１％ＳＯＳ。 １０％デキストランＦＡ酸、　　０．１ｍｒｊ／１ａｌ
ｌの変性ＤＮＡ（鮭精巣ＤＮＡ）の混合液）で４２°Ｃ
にて２０時間ハイブリダイゼーションを行った。 ニトロセルロース濾紙を室温下に０．１％ＳＤＳを含む
２ＸＳＳＣで２０分間洗随し、次いで４４℃で、０．１
％ＳＤＳを含む０．１ｘＳＳＣで３０分間、さらに室温
下で０．ｌＸ５ＳＣで１０分間洗滌した後、オートラジ
オグライーで検出した。 その結果、５個のポジティブなりローン（Ｇ１〜５）が
得られた。そこで、得られたクローンのうち完全長ｃＤ
ＮＡを含むと思われるり〔１−ンのＤＮＡ塩基配列をジ
デオキシ法にて調べたところ図３（Ａ）に示される如き
塩基配列が得られた。そこでこのＣＤＮＡをλｇｔｉｏ
ベクターより切りだし、Ｄ　Ｂ　Ｒ３２７［５ｏｂｅｒ
ｏｎ等：　Ｇｅｎ０９巻２８７頁（１９８０）　］と２
０００１１部で結合させ、プラスミドとして大量調製し
た。このプラスミドをＩ）８ＲＧ４と称する。 実施例１０．　　［ｔ　ａ　Ｃプロモーター含有ベクタ
ーを用いた例］ １）組換えベクターの構築 ■　ベクターの調製 ｔａｃプロモーター含有ベクターＤＫＫ　２２３−３（
ファルマシア社製）５μｇを３０μｍの反応液（５０ｍ
Ｍ　　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣｌ、７ｍＭ　）ｆｇｃｔ、、
１００ｍＭ　　ＮａＣｌ、７ｍＭ　　２−メルカトブト
エタノール）中、ＥＣ０ＲＩ　（宝酒造社製）８単位で
３７℃、２時間処理した。 次いで、アルカリホスファターゼ（宝酒造社製）３μｍ
を加え６０℃、３０分間処理し、常法に従いフェノール
処理３回、エーテル処理及びエタノール沈澱を行ってＤ
ＮＡ断片を回収した。 このＤＮＡを５０ｍＭＴｒ　ｉ　５−ＨＣＩ、５ｍＭＭ
ｇＣ１２，１０ｍｖ　　ＤＴＴ、１ｍＭのｄＡＴＰ。 ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ＴＴＰからなる５０μｍの混合液
に溶解し、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ−ＫＩｅｎＯＷ
断片（宝酒造社製）３μｍを加えて１４℃、２時間反応
せしめ、末端をプラントエンド（ｂｌｕｎｔｅｎｄ　）
にした。 ■　合成リンカ−の調製 合成リンカ−１ＣＧＡＡＴＧＡＣＣＣＣＣＣＴＧＧＧＣ
Ｃ及びＣＡＧＧＧＧＧＧＴＣＡＴＴＣＧの配列を有する
オリゴヌクレチオド３μｑを５０ｍＭＴｒ　ｉ　５−Ｈ
ＣＩ　、１０ｍ１’ｖｉ　　ＭｇＣ１２、ｔｏｍＭ２−
メルカプトドエタノール、１ｍＭ　　ＡＴＰからなる反
応液４０μｍ中でＴ４ボリヌクレチオドキナーゼ４単位
存在下、３７℃、６０分間反応せしめ、リン酸化した。 次いで該リン酸化オリゴヌクレチオドを夫々０．２　μ
ｑを１００ｍＭ　　ＮａＣｌを含むＴＥ（１０ｍＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨａ、ｏ、１ｍＭ　　ＥＤＴＡ）２０
μｍに溶解し、６５°Ｃ１１０分間処理した後、室温ま
で徐冷することによりアニーリングを行った。 ■　Ｇ−Ｃ３ＦのＣＤＮＡ断片の調製 実施例９で得た図３（Ａ）で示すｃＤＮＡを含有するＤ
ＢＲＧ４６０　μ（ＩＩを６ｍＭ　　Ｔｒ　ｉ　Ｓ−１
（ＣＩ　、６ｍＭ　　ＭｑＣＩ２．６ｍＭ　　２−メル
カトブトエタノールからなる反応液２００μｍ中、制限
酵素Ａ　ｐａ　Ｉ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏ
ｌａｂｓ社製）１００単位、ＤｒａＩ　（宝酒造社製）
５０単位で３７℃、３時間処理し、１．２％アガロース
ゲル電気泳動にて約５９０ｂＤのＡｐａＩ−ＤｒａＩ断
片約２ｕａを回収した。 ■　上記各断片の連結 ■、■、■各断片を夫々的０．１μｑとり、２０μｍの
連結反応液（６８ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ｔ−１ｃＩ、６、
ｅｍＭ　　ＭｇＣｌ２．１０ｍＭ　　ＤＴＴ、１ｍＭＡ
ＴＰ＞に溶解し’ｒ４ＤＮＡリガーゼ１７５単位を加え
て４℃で一部反応し組換えベクターを得た。 ２）形質転換 上記■で得られた組換えベクターを含む反応液２０μｍ
を用いて塩化ルビジウム法（前出Ｔ、）ｌａｎｉａｔｉ
ｓ等団ｏ１ｅｃｕｌａｒ　　ｃｌｏｎｉｎｃ＋Ｊ　Ｐ２
Ｓ５（１９８２）参照）によりＥ、ｃｏｌｉ　ＪＨ１０
５株を形質変換した。得られた形質転換株はアンピシリ
ン耐性のコロニー培養液よりプラスミドを分離し、制限
酵素　　３ａｍ１−１ｔ、Ａｃｃ［、ＡｌｇａＩで処理
したところ目的の形質転換株であることが確認できた。 実施例１１．　　［ＰＬプロモーター含有ベクターを使
用した例］ １）組換えベクター構築 ■　ベクターの調製 ＰＬプロモーターを含むベクターｐｐＬ−１ａｍｂｄａ
（ファルマシア社製）１００μｑを制限酵素Ｂａｍｔｌ
■、５０単位で反応液（１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
、ｐｔ１７．６．７ｍＭ　　ｔＶＩＱ　ＣＩ　２．１０
０ｍＭ　　Ｎ　ａ　Ｃ１，１０ｍＭ　　ＤＴＴ＞１００
μｌ中、３７°Ｃ１−晩処理した。 これから、１％アガロースゲル電気泳動にて、約４Ｋｂ
ｐの断片的４９μｑと約１．２Ｋ　ｂ　ｐの断片的１１
μｇを回収した。 上記の断片のうち、まず約４Ｋｂｐの方を前記のＴＥ緩
衝液１００μｍに溶解し、アルカリホスファターゼ（宝
酒造社製）５μｍと６０’Ｃ１６０分間反応せしめ脱リ
ン酸化した。 残りの約１．２Ｋ　ｂ　ｐの断片の方は緩衝液（１０ｍ
ＨＴｒ　ｉ　５−ＨＣＩ　、１０ｍＭ　　ＭｑＣ１２，
６ｍＭＫＣｌ、１ｍＭ　　ＤＴＴ＞２０μｌに溶解し、
制限酵素Ｍ　ｂ　ＯＴｉ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　
Ｂｉｏｌａｂｓ社製）２０単位で３７℃、−晩処理した
。 次いで、４％ポリアクリルアミドゲル電電気泳動上ヨリ
約２００ｂｐ３ａｒｎｔ−１１−ＭｂｏＩＩ断片約０．
９μｇと約３１０ｂｌ）のＭｂｏＩＩ−Ｂａｍ！−１１
断片約１．９μｑを回収した。 ■　合成リンカ−の調製 合成リンカ−ＴＡＡＧＧＡＧＡＡＴＴＣＡＴＣＧＡＴお
よびＴＣＧＡＴＧＡＡＴＴＣＴＣＣＴＴＡＧを実施例１
０の■と同様にしてリン酸化しアニーリングし、合成Ｓ
／Ｄリンカ−を１７だ。 ■　発現用ベクターの調製 上記■で調製した約４Ｋｂｐ断片０．１μｇ及び０１Ｐ
［領域を有するＢａｍＨＩ−ＭｂｏＩＩ断片、ｔＬ１領
域を有するＭｂｏＩ［−ＢａｍＨ１断片夫々０．０５Ｐ
ｇとアニールした合成Ｓ／Ｄリンカ−ｏ、ｉμｇを４０
μｍの反応液（６６ｍＭＴ　ｒ　ｉ　ｓ　−トＩＣＩ　
　、　　６．６ｍＭ　　　Ｍ（ＪＣＩ　　２　、１０ｍ
Ｍ　　　ＤＴＴ。 １ｍＭＡＴＰ＞中、”ｒ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製
）１７５単位存在下１２℃、−晩反応せしめた。 この反応液２０μｍを用い、Ｅ、　ｃｏｌｉＮ９９ｃ　
Ｉ＋株（ファルマシア社製）をＣａＣｌ２法（前出の”
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　ｃｌｏｎｉｎｇ”参照）にて形
質転換した。 該形質転換株を培養し、そのアビシリン耐性のコロニー
の培養液よりプラスミドを分離して、制限酵素ＥｃｏＲ
Ｌ　Ｂａｍｔ−ＩＬ　ＳｍａＩで処理したところ目的の
プラスミドであることが確認された。 次に、このプラスミドを２μｑとり、２０μｍの緩衝液
（１０ｍＭ　　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣＩ　、６ｍＭＭｃｉ
ＣＩ２．５ｏｍＭ　　ＮａＣ１）中、制限酵素ＣＩ　ａ
　ｌ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製
）を３７°Ｃ１２時間反応させた後６５℃１０分間で失
活させた。 更にその反応液１μｍを２０μｍの前記連結反応液及び
Ｔ４　ＤＮＡ’）ｊｊ−ゼ（宝酒ｉＷ社ｒ！Ａ＞　　１
７５単位を用いて１２℃、−晩反応した１多、上記と同
様にしてＥ、　　ｃｏｌｉ　Ｎ９９ｃ　Ｉ　　株（ファ
ルマシア社製）を再び形質転換した。アンピシリン耐性
コロニー培養液からプラスミドを分離しＥ、ＣｏＲ１［
３ａｍＨＩで処理し、目的のプラスミドを確認した。 ■　Ｇ−Ｃ３Ｆ発現用組換えベクター及び形質転換体の
調製 ■で得られた発現用プラスミドを制限酵素Ｃ１ａｌで処
理し、末端をプラントエンドにした後実施例１０と同様
にしてＧ−Ｃ３ＦのＣＤＮＡ断片を組み込み組換えベク
ターを得た。これを用い、前出の）１ｏ１ｅｃｕｌａｒ
　Ｃｌ０ｎｉｎ（ｌに記載されているＣａＣｌ２法にて
Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｎ４８３０株（ファルマシア社製）を形
質転換した。なお、目的の形質転換体の確認も実施例１
０と同様に行った。 実施例１２．、　　［ｔ　ｒ　ｐプロモータ含有ベクタ
ーを用いた例］ １）組換えベクターの構築 ■　ベクターの調製 ＤＢＲ３２２のＣｌａＩ部位にトリプトファンフロモー
ターを含む約３３０ｂｐのＨｐａ　ＩＩ　−Ｔ　ａｑＩ
断片を挿入し作製したｐＯＹ１プラスミド１０μｇを１
０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ　１６ｍＭ　　ＭｇＣＩ　２．
５０ｍＭＮ　ａ　Ｃ＋の反応液３０μｍ中、制限酵素Ｃ
１ａ１７単位ＰＶｕｌＩ８単位で３７°Ｃ３時間処理し
た。 次いで、アルカリホスファターゼ（宝酒造社製）２μｍ
を加え６０℃、１時間反応せしめた。 これから１％アガロースゲル電気泳動により約２．６Ｋ
　ｂ　ｐの断片を約２．５μり回収した。 ■　合成リンカ−の調製 合成リンカ−ＣＧＣＧＡＡＴＧＡＣＣＣＣＣＣＴＧＧＧ
ＣＣ及びＣＡＧＧＧＧＧＧＴＣＡＴＴＣＧを実施例１０
の■と同様にしてリン酸化し、アニーリングした。 ■　組換えベクターの調製 上記■で調製ベクターの断片的１μｑ、及び■の合成リ
ンカ−約１μｇと、実施例１０の■で調製したＧ−Ｃ３
ＦのＣＤＮＡ断片約１μｇを前記の連結反応液２０μ（
中、Ｔ４ＤＮＡリガービ（宝酒造社製）１７５単位と１
２℃で一晩反応せしめ組換えベクターを得た。 ２）形質転換 上記■の反応液２０μｍを前出ｒＭｏｌｅｃｕｌａｒ　
　ｃｌ。 ｎｉｎｇＪの塩化ルビジウム法でＥ、ＣｏＩｉＤＨＩ株
に形質転換した。 実施例１０と同様にしてアンピシリン耐性のコロニーか
らプラスミドをとり、制限Ｍ素ＡｐａＩ、０ｒａｌ、　
Ｎｒｕ　Ｉ、　Ｐｓ　ｔ　Ｉで目的とする形質転換体が
得られていることを確ニーした。 実施例１３．：形質転換株の培養 １）実施例１０で得た形質転換株（Ｔａｃ含有）の培養 アンピシリン２５μｇ／７！又は５０Ｍｇ／ｄを含むル
リア（Ｌｕｒｉａ）培地１００ｄに、３７°Ｃ１−晩培
養した該形質転換株の培養液１ｄを加え３７℃で２〜３
時間培養する。 次いで、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド２ｍ
Ｍにして３７℃、２〜４時間培養した。 ２）実施例１１で１９だ形質転換株（ＰＬ金含有の培養 アンピシリン２５μｇ／ｄ又は５０μ０　／ｄを含むル
リア培地１０Ｍに２８℃−晩培養した該形質転換株の培
養液１ｄを加え２８℃で約４時間培養した。 その後、これを４２℃にし２−１１時間培養を行った。 ３）実施例１２で得た形質転換株（を叩含有）の培養０
．５％グルコース、０．５％カデミノ酸（［）ｉｆｃｏ
社製）、アンピシリン２５ｔｔｑ　／ｍｌ又は５０μ（
１／ｒ１１１を含むＭ９培地１００威に３７℃−晩培養
した該形質転換株の培養液１ｒｒ１１を加えて３７℃で
４〜６時間培養する。 次いで、３−β−インドールアクリル酸（ＩＡＡ）５０
μｇ／ｒｒｄｌを加えて３７℃で４〜８時間培養した。 実施例１４．二大腸菌からのＧ−Ｃ３Ｆポリペプチドの
回収・精製 １）回収 実施例１３で培養した形質転換株、夫々について以下の
回収操作を行った。 培養液１００ｄを遠心分離にか【ノて菌体を集め、２０
ｍＭＴｒｉＳ−トＩＣｌ　　（ｐｔ−＋　　７．５＞　
　、　３０ｍＭＮａＣｌ混合液５ｄに懸濁させた。 次イテ、各々１ｍＭ、１０ｍＭ、０．２μｇ／ｍａｌに
なるように０．２Ｍフェニルメチルスルホニルフルオラ
イド、０．２Ｍ　　ＥＤＴＡ、リゾチームを加え、Ｏ′
Ｃで３０分間放置した。 次に凍結−融解を３回くりかえし溶菌させた。 続いて８Ｍ塩酸グアニジンを用いて、最終的に６Ｍ塩酸
グアニジンにした後、３０．　ｏｏｏｒ、　ｐ、　ｍ、
、５時間の遠心分離を行い、その上澄液を取得した。 ２）精製 （ｉ）　　１）で得た上澄液を直径４．６Ｃｍ、長さ９
０ＣＭの旧ｔｒｏｇｅｌ　　ＡＣＡ５４カラム（ＬＫＢ
社製）にて、０．１５Ｍ　　ＮａＣｌおよび０．０１％
ツイーン２０（牛丼化学社製）を含む０．０１Ｍトリス
塩＠緩衝液（ｐＨ７，４）を用いて流速約５０ｄ／時間
でゲル濾過した。 次いで、前述したｒＣ３Ａの測定方法（ｂ）」により活
性を示す両分をとりｐＭ−１０（アミコン社製）を用い
る限外濾過器によって約５ｄに濃縮した。 （ｉｉ）　　上記濃縮画分にｎ−プロパツール（東京化
成社製、アミノ酸配列決定用）を３０％含む０．１％ト
リフルオロ酢酸水溶液を添加し、水中に１５分程度放置
したのち、１５．０００ｒ、　ｐ、　ｍ、　１０分の遠
心により沈澱を除去した。次いで先のｎ−プロパツール
およびトリフルオロ酢酸を含む水溶液で平衡化したｕ　
Ｂｏｎｄａｐａｋ　Ｃ１８カラム（ＷａｔｅｒＳ社製、
セミ分取用、８ｍＸ３０ｃｍ＞に吸着後、３０〜６０％
の直線濃度勾配のｎ−プロパツールを含む０．１％トリ
フルオロ酢酸水溶液で順次溶出した。高速液体クロマト
装置は日立６８５−５０型を、検出は日立６３８−４１
型検出器（いずれも日立製作新製）を用い、２２０ｎｍ
と２８０ｎｍの吸収を同時に測定した。溶出後、各画分
より１０μＩを分取１００倍希釈したのち、前述のｒＣ
３Ａの測定方法（ｂ）」により活性を示す両分を調べた
。この結果、ｎ−プロパツール４０％にて溶出されるピ
ークに活性が認められたので、このピークを集め再度同
じ条件で再クロマトを行い上記と同様にしてＣ３Ａを調
べたところ、やはりｎ−プロパツール４０％の位置のピ
ークに活性が認められたので、このピークを集め（４フ
ラクシヨン＝４ｄ）凍結乾燥した。 （ｉｉｉ）上記凍結乾燥粉末をｎ−プロパツールを４０
％含む０．１％トリフルオロ酢酸水溶液２００μｍに溶
解し、ＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷカラム（東洋曽達社製、
　　７．５＃Ｘ　６０ｃｍ　）を用いた高速液体クロマ
トグラフィ（ＩＩＰＬｃ）にかけた。溶出は同水溶液に
より０．４ｄ／分の流速で行い、フラクションコレクタ
ーＦＲＡＣ−１００（）１ルマシア社製）により０．４
ｍｌずつ分取した。分取した各両分についてＣ３Ａを前
記と同様にして調べ活性画分を回収し、更に分析用ｕ　
Ｂｏｎｄａｐａｋ　Ｃ１８カラム（４，６ｓ＋＋ｘ３０
ｃｍ＞による精製を施したのち、メインピークを回収し
凍結乾燥した。 得られたタンパク質を２−メルカプトエタノールで処理
して５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（１５，０％）電
気泳動（１５ｍＶ、６時間）にかけ、クマシーブルーで
染色したところ目的とするＱ　−Ｃ３Ｆポリペプチドが
単一のバンドとして確認できた。 実施例１５：発現物質のＧ−Ｃ３Ｆ活性の検定実施例１
４で得たＣ３Ｆ試料を前述のく参考例〉Ｃ３Ｆ活性の測
定方法（ａ）に従って検定した。 この結果を表−１に示す。 （以下余白） 表−１ 実施例１６：アミノ酸分析 １）アミノ酸組成の分析 実施例１４で精製したＣ３Ｆ試料を常法により加水分解
し、そのタンパク部分のアミノ酸組成を日立８３５アミ
ノ酸自動分析装置（日立製作所社製）を用いて特殊アミ
ノ酸分析法により分析した。この結果を表−２に示した
。尚、加水分解条件は次の如くである。 ■　６Ｎ　ＦＩＣＩ　、　　１１０’Ｃ，２４時間、真
空中■　４Ｎ　メタンスルホン酸＋０．２％３−（２−
アミノエチル）インドール、１１０℃、２４時間。 ４８時間、７２時間、真空中 試料は、４０％ｎ−プロパツールと０．１％トリフルオ
ロ酢酸を含む溶液（１，５ｒｄ）に溶かした後、各々０
．７をとり、乾燥窒素ガスにより乾燥させた後、■又は
■の試薬を加えて真空封管し、加水分解に供した。 表中、実測値は■の２４時間値と■の２４．４８．７２
時間値の合計４回の平均値である。但し、Ｔｈｒ。 Ｓｅｒ、１／２ＣＶＳ、Ｍｅｔ、Ｖａ　ｌ、Ｉ　Ｉ　ｅ
およびＴｒｐは以下の方法で篩用した。（生化学実験講
座、タンパク貿化学■（東京化学同人出版）を参照） −Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、１／２ＣＶＳ、Ｍｅ’１■の２４．
４８．７２時間値の経時変化をとり、零時間に補外。 −Ｖａｌ、Ｉｌｅは■の７２時間値。 ・　Ｔｒｐは■の２４．４８．７２時間値の平均値。 （以下余白） 表−２（アミノ酸分析表） ２）　　Ｎ末端アミノ酸分析 試料を気相式シークエンリ−（アプライドバイオシスデ
ム社製）を用いてエドマン（Ｅｄｍａｎ）分解し、ｊｑ
られたＰ　Ｔ　Ｈアミノ酸を高速液体クロマトグラフィ
ー装置（ベックマン・インストルメン”／社製）および
ＩＪＩｔｒａｓｐｈｅｒｅ　−００５カラム（ベックマ
ン・インストルメンツ社製）を用いて常法により分析し
た。カラム（５μｍ、直径４．６端、長さ２５０Ｍｒ１
）を開始緩衝液（１５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４
，５，４０％アセトニトリルを含む水溶液）にて平衡化
したのち、検体（２０μｍの開始緩衝液にて溶解）を注
入して開始緩衝液によるインクラティック溶出により分
離を行った。流速は１．４ｍ／分、カラム温度は４０℃
に保持した。 ＰＴＩ＋アミノ酸の検出は２６９ｎｍと３２０ｎｍの紫
外部吸収を利用した。あらかじめ標準ＰＴＨアミノ酸（
シグマ社製）各２ｎｍｏ＋を同一の系で分離して保持時
間を決定し、被検検体の保持時間から同定を行った。 その結果、ＰＴＨ−メチオニンおよびＰＴＨ−スレオニ
ンが検出された。 く実験例〉ヒトＧ−Ｃ３Ｆの感染防御効果１、シュード
モナス　アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａ
ｅｒｕｇｉｎｏｓａ）感染に対する防御効果８〜９週令
（体重３５．３±１．３８ｇ）のＩＣＲ系マウス（雄）
にエンドキリン（ジオツギ社製、商品名）　　２００ｍ
９７　Ｋｆｊを腹腔的投与した後３群に分け、その２群
にヒトＧ−Ｃ８Ｆ　（２５０００ＬＪ／マウス又は５０
０００　ｕ／マウス）を含む溶媒（１％プロパツール、
５％（Ｗ／Ｖ）マウス血清アルブミン）を、そして別の
１群には溶媒のみを、それぞれ２４時間毎に０．１ｒｒ
Ｉｉずつ４回皮下投与した。 ４回目の投与後３時間して各々の群にシュードモナス　
アエルギノーザ（Ｐｓｃｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇ
ｉｎｏｓａＧＮＢ−１３９（３，９ｘ１０４ＣＦＵ／マ
ウス）を皮下投与して感染させた。感染後２１時間して
さらにもう一度ヒトＧ−Ｃ８Ｆ　（２５０００Ｌｊ／？
ウス又ハ５００００　ｕ／マウス）を含む溶媒又は溶媒
のみをそれぞれ対応する群に皮下投与した。 感染後１００回目での生存マウス数により感染防御効果
を調べた。（表−３） （菌液の調製） ハートインフュージョン寒天平板（ＱｉｆＣＯ社製、商
品名）を用いて３７℃で一夜シュードモナス　アエルギ
ノーザＧＮＢ−１３９を娠どう培養する。培養液を生理
食塩水に懸濁さけて調製した。 表−３シュードモナス　アエルギノーザに表−３に示さ
れる如く本発明のヒトＧ−Ｃ５Ｆは顕著な感染防御効果
を有することが認められた。 〔発明の効果〕 以上、本発明によれば、従１１０人手が極めて困難であ
ったヒトＧ−Ｃ８Ｆを組換えベクター技術を用いて大量
に、しかも高品質で提供することが可能となり、これま
てＣ３Ｆにかけられていた数々の期待、例えば造血機構
や種々の血液学的疾患の病態の解析に多大の貢献をする
他、骨髄性白血病細胞の分化誘導と成熟顆粒球の機能六
進というＧ−Ｃ３Ｆ本来の生化学的作用を利用する治療
、及び予防に使用しうるのである。 したがって放射線照射や抗癌剤投与により骨髄組織の機
能が低下したり白血球が減少して、抵抗力を失った悪性
腫瘍患者や、抗生物質で治療できない重症感染症患者等
に対してもこれを投与することが大いに期待されている
のである。

【図面の簡単な説明】

図１はプローブ（ＩＷＱ＞、及びプローブ（Ａ）の配列
を示す。 図２はＤＨＣ３−１インサートの塩基配列を示す。 図３（Ａ〉はｐＢ　ＲＧ　４のｃＤＮＡインサートの塩
基配列を示す。 図３（Ｂ）（Ｉ）は１）ＢＲＧ４　ｃＤＮＡから演えき
したヒトＧ　　Ｃ３Ｆ前駆体のアミノ酸配列を示す。 図３（Ｂ）（ＩＩ）はｐＢＲＧ４　ｃＤＮＡから演えき
したヒト成熟Ｇ−Ｃ３Ｆのアミノ酸配列を示す。 図４はｐＢＲＧ４由来ヒトＧ−Ｃ３ＦｃＤ、ＮＡの制限
酵素切断部位を示す。 図５はｔａｃプロモーター含有ベクターの調製プロヒス
の一部を示す。 図６は合成ＰＬプロモーター含有ベクターの調製プロレ
スを示す。 図７はｔｒｐプロモーター含有ベクターの調製プロセス
を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　下記のアミノ酸配列で表わされるポリペプチド【ア
   ミノ酸配列があります】 （但しｎは０又は１を示す） ２　ポリペプチドがヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を
   有することを特徴とする特許請求の範囲第１項記載のポ
   リペプチド。 ３　ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプ
   チドをコードする遺伝子を含む組換えベクター。 ４　遺伝子がショ糖密度勾配遠心法により１５〜１７Ｓ
   画分として得られる、ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性
   を有するポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮ
   Ａに相補的なＤＮＡであることを特徴とする特許請求の
   範囲第３項記載の組換えベクター ５　ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプ
   チドをコードする遺伝子が以下に示されるポリペプチド
   配列またはその一部をコードするものである特許請求の
   範囲第３項記載の組換えベクター。 【アミノ酸配列があります】 ６　ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプ
   チドをコードする遺伝子が以下に示されるポリペプチド
   配列またはその一部をコードするものである特許請求の
   範囲第３項記載の組換えベクター。 【アミノ酸配列があります】 ７　ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプ
   チドをコードする遺伝子が以下に示される塩基配列また
   はその一部を有するものである特許請求の範囲第３項記
   載の組換えベクター。 【遺伝子配列があります】 ８　ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプ
   チドをコードする遺伝子が以下に示される塩基配列また
   はその一部を有するものである特許請求の範囲第３項記
   載の組換えベクター。 【遺伝子配列があります】 ９　ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプ
   チドをコードする遺伝子が図３（Ａ）に示される塩基配
   列またはその一部を有するものである特許請求の範囲第
   ３項記載の組換えベクター。 １０　ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペ
   プチドをコードする遺伝子を含む組換えベクターを含有
   する形質転換体。 １１　遺伝子がショ糖密度勾配遠心法により１５〜１７
   Ｓ画分として得られるヒト顆粒球コロニー刺激因子活性
   を有するポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮ
   Ａに相補的なＤＮＡであることを特徴とする特許請求の
   範囲第１０項記載の形質転換体。 １２　ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペ
   プチドをコードする遺伝子が以下に示されるポリペプチ
   ド配列またはその一部をコードするものである特許請求
   の範囲第１０項記載の形質転換体。 【アミノ酸配列があります】 １３　ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペ
   プチドをコードする遺伝子が以下に示されるポリペプチ
   ド配列またはその一部をコードするものである特許請求
   の範囲第１０項記載の形質転換体。 【アミノ酸配列があります】 １４　ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペ
   プチドをコードする遺伝子が以下に示される塩基配列ま
   たはその一部を有するものである特許請求の範囲第１０
   項記載の形質転換体。 【遺伝子配列があります】 １５　ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペ
   プチドをコードする遺伝子が以下に示される塩基配列ま
   たはその一部を有するものである特許請求の範囲第１０
   項記載の形質転換体。 【遺伝子配列があります】 １６　ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペ
   プチドをコードする遺伝子が図３（Ａ）に示される塩基
   配列またはその一部を有するものである特許請求の範囲
   第１０項記載の形質転換体。 １７　ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペ
   プチドをコードする遺伝子を含む組換えベクターを含有
   する形質転換体から産生されたヒト顆粒球コロニー刺激
   因子活性を有するポリペプチド組成物。 １８　図３（Ｂ）（II）に示されるアミノ酸配列の一部
   で表わされるヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有する
   ポリペプチド。