JPS62269693A - 新規ｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は遺伝子に関し、さらに詳しくは、主として顆粒
球系細胞のコロニー形成をさせるために必要な、特異的
な刺激因子、すなわちコロニー刺激因子（以下ｒｃｓＦ
Ｊと略記する）活性を有するポリペプチドをコードする
遺伝子に関する。

（従来の技術） ２層軟寒天培益法で、上層に標的細胞として骨髄細胞を
、下層に腎細胞や胎児細胞を入れて培養すると、上層の
細胞の一部が増殖分化し、好中球系顆粒球（以下［顆粒
球（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ）　Ｊと称す）や単球マイ
クロファージからなるコロニーが形成されることから、
生体内にコロニー形成を促進する因子が存在することが
知られていた（ＰＩｕＺｎｉｋと５ａｃｈ　：　Ｊ、　
Ｃｅ１１．Ｃｏｍｐ、Ｐｈｙｓｉｏｌ　、　、　６８巻
３１９頁（１９６５）、　ＢｒａｄｌｅｙとＨｅｔｃａ
ｌｆ　　：八ｕｓｔ、Ｊ、　　ＥＸｐ、Ｂ１１１．Ｒｅ
ｄ、ＳＣｉ、　、　４４巻２８７頁（１９６６））。

Ｃ３Ｆと総称されるこの因子は、正常にひろく生体内に
分布する細胞、たとえば、Ｔ細胞、単球マクロファージ
、繊維芽細胞、内皮細胞などより産生されることが知ら
れている。Ｃ３Ｆには顆粒球・単球マクロファージの幹
細胞に作用して、その増殖を刺激し分化を誘導して、軟
寒天中で顆粒球や単球マクロファージから成るコロニー
を形成させる作用をもつ顆粒球−単球マクロフ７．−ジ
Ｃ３Ｆ　（ＧＭ−Ｃ３Ｆと略記する）、主として単球マ
クロファージのコロニーを形成させる作用をもつ単球マ
クロファージＣ８Ｆ　（Ｍ−Ｃ３Ｆと略記する）、より
未分化な多能性ｑ♀細胞に作用する多能性Ｃ３Ｆ　（ｍ
ｕ　Ｉ　ｔ　１−Ｃ３Ｆと略記する）、あるいは本発明
の如き、主として顆粒球系コロニーを形成させる作用を
もつ顆粒球Ｃ５Ｆ　（Ｇ−Ｃ３Ｆと略記する）などのサ
ブクラスが存在し、それぞれのサブクラスによって標的
細胞の分化段階も異なることが考えられる様になってき
た［ＡＳａｎＯ：代’ｄ４４　　Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ
　ａｎｄ　Ｄ！５ｅｉｌＳｅ、　２２巻２４９頁（１９
８５）　、　Ｙｕｎｉｓ等；　”Ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ
　Ｈａｔｕｒａｔｉｏｎ　Ｆａｃｔｏｒｓ　”　、　ｅ
ｃｌｉｔｅｄ　ｂｙ　Ｇｕｒｏｆｆ、　　Ｊｏｈｎ　Ｗ
ｉｌｅｙ　＆５ｏｎｓ、　ＮＹ、正巻。２０９頁（１９
８３）　］。

従って個々のサブクラスを精製し、その化学的性状や生
物学的性状をより詳細に調べることは造血機構や種々の
血液学的疾患の病態の解析にきわめて重要なことである
。中でもＧ−Ｃ３Ｆの生物学的作用として、骨髄性白血
病細胞の分化誘導と成熟顆粒球の機能六進が注目されて
おり、特に白血病の治療と予防へのＧ−Ｃ３Ｆの臨床的
有用斗が大いに期待されている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

Ｇ−Ｃ３Ｆの単離精製のために従来行われてきた試みは
、細胞培養法を用いて、その培養上清からＧ−Ｃ３Ｆを
単離する方法であるが、Ｇ　−Ｃ３Ｆが低濃度しか産生
されないこと、大量の培養液から微量のＧ−Ｃ３Ｆを得
るには複雑な精製過程を必要とするなどの難点をかかえ
未だ大量の均一なＧ−Ｃ３Ｆ＠得るには至っていない。

従って、組換えＤＮＡ技術を用いてＧ−Ｃ３Ｆを大量に
製造することが渇望されていた。

かかる状況に於いて本発明者等は、マウス腫瘍細胞株よ
りＧ−Ｃ３Ｆ活性を有するポリペプチドをコードする遺
伝子を単離し、当該遺伝子を宿主細胞内で発現すること
に成功した。

本発明のマウスＧ−Ｃ３ＦｃＤＮＡと、これを発現して
得られるマウスＧ−Ｃ３Ｆは、研究用試薬としてまた臨
床検査用試薬として有用なものである。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明はマウスＧ−Ｃ３Ｆ活性を右するポリペプチドを
コードする遺伝子を提供するものである。

すなわち、本発明はマウスＧ−Ｃ３Ｆ活性を有するポリ
ペプチドをコードする遺伝子であり、詳しくはショ糖密
度勾配遠心法により１４〜１７３両分として得られる、
マウスＧ−Ｃ３Ｆ活性を有するポリペプチドをコードす
るメツセンジ１１−　ＲＮ　Ａ（ｍＲＮＡ＞に相補的な
ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）であり、より詳しくは図１（Ｂ）
のポリペプチド■又は■をコートする遺伝子あるいはそ
の一部を右するものであり、ざらに詳細には図１（Ａ）
の塩基配列の５′−末端から６８〜７０ヌクレオチド位
のＡＴＧから６８９〜６９１ヌクレオチド位のＧＣＣま
での配列、１５８〜１６０位のＧＴＴから６８９〜６９
０位のＧＧＣまでの配列または図１（Ａ）に記載された
配列あるいはその一部を有するもので必る。

本発明の遺伝子は例えばＧ−Ｃ３Ｆ活性を有するポリペ
プチドを産生ずる能力を有する咄乳動物細胞等からＧ−
Ｃ３ＦをコードするｍＲＮＡを調製した後、既知の方法
により２重鎖ＣＤ　Ｎ　Ａに変換することによって１ｑ
られる。

首記、ｍＲＮＡの供給源となる動物細胞は本発明におい
ては、マウスフイブロリ゛ルコーマＮ）ＴＳＡｆｔ　ｆ
Ｇａｎｎ　７５　Ｗ、　　３５５頁〜３６１頁（１９８
４）、　］である。

ｍＲＮＡ株の分画精製は”ＭＯＩｅＣＬＩＩａＰ　Ｃｌ
０ｎｉｎ（Ｊ　”Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂ
ｅｒ刊（１９８２）に２戎された方法に準じて行い、全
ＲＮＡを得た後、オリゴ（ｄＴ）−セルロースやセファ
ロース２Ｂを担体とするポリＵ−セファ０−ス等を用い
たアフィニティーカラム法あるいはバッチ法によりポリ
（Ａ）ＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）を得ることができる。また
ショ糖密度勾配遠心法等によりポリ（Ａ　　）ＲＮＡを
更に分画することもできる。

上記の如くして得られたｍＲＮＡが、Ｇ−Ｃ５Ｆ活性を
もつポリペプチドをコードするものであることを確認す
るためには、ｍＲＮＡをタンパク質に翻訳させ、生理活
性を調べるか、抗ａ−ＣＳＦ抗体を用いてそのタンパク
を同定する等の方法を行えばよい。例えば、アフリカッ
メガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　Ｉａｅｖｉｓ）の卵母細胞
にｍＲＮＡを注入して翻訳させたり（Ｇｔｊｒ（ｆｏｎ
等：　Ｎａｔｕｒｅ、　　２３３巻１７７頁（１９７２
）を参照）、あるいはウサギ網状赤血球（Ｒｅｔｉｃｕ
ｌｏｃｖｔｅ）系や小麦胚芽（Ｗｈｅａｔ　（ｌｅｒｍ
）系を利用した翻訳反応が行われている（ＳＣｈｌｅｉ
ｆとＷｅｒｌＳ！ｎｋ　：　”ＰｒａＣｊｌＣａｌ　）
ｌｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＢＩＯＩ
Ｏｇｙ”　、　Ｓｏｒｉｎｇｅｒ−ＶｅｒｌａＯ，ＮＹ
、　（１９８１））。

Ｇ−Ｃ３Ｆ活性の検定は骨髄細胞を用いた軟寒天培養法
を適用して実施できる。それらの手法については総説が
ある（）ｉｅｔｃａｌｆ　；　”ｌｌｅｍｏｐｏｉｅｔ
ｉｃＣｏｌｏｎｉｅｓ”　、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅ
ｒｌａｇ、　Ｂｅｒｌｉｎ、　Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、
　Ｎ　Ｙ　（１９７７）　）。

前述の如き方法で１ｑたｍＲＮＡを鋳型にして１末鎖ｃ
ＤＮＡを合成した後、この１末鎖ｃＤＮＡから２本鎖Ｃ
ＤＮＡを合成し、適当なベクターＤＮＡとの組換えプラ
スミドを作成する。これを大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ　ｃｏｔ　ｉ　）などを形質転換して、形質転換株
のＤＮＡ群（以下、ＣＤＮＡライブラリーと称する。）
を得る。

ｍＲＮＡから２本鎖ＣＤＮＡを得るには、例えばｍＲＮ
Ａの３′−末端にあるポリへ−鎖に相補的なオリゴ（ｄ
Ｔ）をプライマーとして逆転写酵素で処理するか、また
はＧ−Ｃ３Ｆタンパクのアミノ酸配列の一部に相応する
オリゴヌクレオチドを合成し、これをプライマーとして
逆転写酵素で処理してｍＲＮＡに相補的なＣＤＮＡを合
成する。

２末鎖ｃＤＮＡは、アルカリ処理でｍＲＮＡを分解・除
去した後、得られた１本鎖ＣＤＮＡを逆転写酵素又はＤ
ＮＡポリメラーゼ（例えばＫ　Ｉ　ｅｎＯＷ断片等）処
理後Ｓ１ヌクレアーゼ等で処理して得るか、あるいは、
直接ＲＮａＳｅ　　トｌおよびＤＮＡポリメラーゼ（例
えば、大腸菌のＤＮＡポリメラーゼ■等）等で処理する
ことによっても得ることができる（例えば、Ｍａｎｉａ
ｔｉｓ等；　）ｌｏｌｅｃｕｔａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　
、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒＬａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ（１９８２）およびＧＬｌｂｌｅｒとｌｌ
ｏｆｆｍａｎ　：Ｇｅｎｅ２５巻２６３頁（１９８３）
を参照。）。

このようにして胃られた２本鎖ＣＤＮＡを適当なベクタ
ー、例えば、ｐｓｃｉｏｉ　、ｐｏＦａｉ。

Ｃｏ　Ｉ　Ｅｌ、　ｐＭＢ９．　ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ
３２７。

ｐＡＣＹＣｌなどに代表されるＥＫ型プラスミドベクタ
ーや、λｇｔ、λＣ１λｇｔ１ｏ、λｇｔＷＥｓなどに
代表されるファージベクターなどに組み込んだ後、大腸
菌（Ｘ１７７６：トＩＢ　１０１：ＤＩ−（１，Ｃ６０
０株など）等を形質転換してＣＤＮＡライブラリーを得
ることができる（例えば、前出“ＭＯＩｅＣＬＩｆａｒ
　ｃｌｏｎｉｎｇ　”を参照）。

こうして１ｑられた組換えＤＮＡ体による宿主細胞の形
質転換は、例えば宿主細胞が大腸菌の場合＋１ａｎａｈ
ａｎが詳細に記述している如き方法（Ｊ　、）ｌｏｔ。

Ｂ１１１、；」巻５５７頁（１９８３））　、すなわち
、ＣａＣｌ２やＭｃｘＣ１２又はＲｂＣ＋を共存させて
調製したコンピテント細胞に該組換えＤＮＡ体を加える
ことにより実施することができる。また宿主細胞が動物
細胞の場合は、リン酸カルシウム法（Ｗｉ（ｌｌｅｒ等
；Ｃｅ１１１４巻　７２５頁（１９７８）やＤＥＴＥデ
キストラン：クロロキン法（例えばＧＯｒｄＯｎ等；５
ｃｉｎｅｎｃｅ　２Ｂ８巻８１０頁（１９８５）を参照
）等によって行うことができる。

目的とする遺伝子を保有する細胞を検索するには、イン
ターフェロンＣＤＮＡのクローン化で用いられたプラス
−マイナス法（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ等；Ｐｒｏｃ、　Ｊ
ｐｎ　、　Ａｃａｄ、　５５巻Ｓｅｒ　、　　８．４６
４頁（１９７９）　）や、ハイブリダイビーションート
ランスレーションアツセイ法（Ｎａｇａｔａ等：　Ｎａ
ｔｕｒｅ　２Ｂ４巻３１６頁（１９８０）　）など、又
は該タンパク貿のアミノ酸配列をもとにして化学合成し
たオリゴヌクレオヂドプローブを用いたコロニーあるい
はプラークハイブリダイゼーション法（ＷａｌｌａＣｅ
等；　ＮｕｃｌｅｉＣＡＣｉｄｓ　Ｒｅｓ、、　９巻８
７９頁（１９８１））などを用いればよいが、本発明で
はヒＩ”Ｇ−Ｃ３ＦｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片をプロー
ブとして用いる。ヒトＧ−Ｃ３ＦＣＤＮＡを含むＤＮＡ
断片はエシェリヒア・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）χ１７７６
Ｒ−１（ＦＥＲＭＢＰ−９５４＞から常法にしたがって
プラスミドを回収し、制限酵素処理して得ることができ
る。

このようにしてクローン化されたマウスＧ−Ｃ３Ｆ活性
を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含む断片は
適当なベクターＤＮＡに再び組み込むことにより、他の
原核生物または真核生物の宿主細胞を形質転換させるこ
とができる。更にこれらのベクターに適当なプロモータ
ー及び形質発現に係る配列を導入することにより、それ
ぞれの宿主細胞に於いて遺伝子を発現させることが可能
である。

原核生物宿主細胞としては、例えばエシェリヒア・コリ
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　、バチルス・
スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）　
、バチルス・サーモフィルス（ＢａＣｉ　ｌ　Ｉｕｓ　
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉ　Ｉｕｓ）等が挙げられる。

目的の遺伝子をこれ等の宿主細胞内で形質発現させるに
は、宿主と適合し得る種由来のレプリコン、すなわら複
製起源および調節配列を含んでいるプラスミドベクター
で宿主細胞を形質転換させればよい。またベクターは形
質転換細胞に表現形質（表現型）の選択性を付与するこ
とができる配列をもつものが望ましい。

真核微生物の宿主細胞としては、例えばナツ力ロミセス
Φセレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ）などが挙げられ、プラスミドＹＲｐ７　
（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ等：　Ｎａｔｕｒｅ　２８２巻
３９頁（１９７９）などを参照）等によって形質転換す
ることができ、遺伝子発現に利用可能なプロモーターと
しては、酸性ホスフ７タービ遺伝子プロモーター（Ｈｉ
ｙａｎＯｈａｒａ等；Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、
ｓｃｉ、ＵＳＡ　８０巻１頁（１９８３）　）ヤアルコ
ールデヒドロゲナーゼ道信子プロモーター（Ｖａ　Ｉ　
ｅｎｚｕｅ　Ｉ　ａ等：　ＮａｔＬｌｒｅ　２９８巻３
４７頁（１９８２）　’）などが挙げられる。

哺乳動物由来の宿主細胞としては、ｃｏｓＩｌＩｌ胞、
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｃ−１２
７細胞、ト１ｅＬａ細胞などが挙げられ、これ等の細胞
を形質転換さけるベクターとしては、ｐＳＶ２−ｑｐｔ
　（Ｈｕｌｌｉｃ＋ａｎとａｅｒｇ　：　Ｐｒ０Ｃ，Ｎ
ａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃ　ｉ、　ＵＳＡ　；　７８巻２０７２
頁（１９８１）を参照）等がある。これ等のベクターは
複製起源、選択マーカー、発現させようとする遺伝子の
前に位置するプロモーター、ＲＮＡスプライス部位、ポ
リアデニル化シグナルなどを含んでいる。

哺乳動物細胞における遺伝子発現のプロモーターとして
はレトロウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウィル
ス、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）などのプロモー
ターを用いればよい。例えば５ｖ４０のプロモーターを
使用する場合は、）ＩＩＩ　Ｉ　１（Ｊａｎ等の方法（
Ｎａｔｕｒｅ　２７７巻１０８頁（１９７９）に従えば
容易に実施することができる。

複製起源としては、ＳＶ４０、ポリオーマウィルス、ア
デノウィルス、牛パピローマウィルス（ＢＰＶ）等の由
来のものを用いることができ、選択マーカーとしては、
ホスホトランスフエラーｔ’ＡＰＨ（３°）■或いはＩ
　（ｎｅｏ）ｉ信子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）ｉ信子
、大腸菌キナンチンーグアニンホスホリボシルトランス
フエラーゼ（ＥｃｏＱｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元
酵素（ＤＨＦＲ＞ｉ信子を用いることができる。

以上の如き宿主−ベクター系を用いてマウスＧ−Ｃ３Ｆ
活性を有するポリペプチドを１ｑるには、上記ベクター
の適当な部位に該遺伝子を組み込んだ組換えＤＮＡ体に
より宿主細胞を形質転換させた後、１９られた形質転換
体を培養すればよい。ざらに細胞内または培養液から該
ポリペプチドを分離・精製するには、公知の手段を用い
て行うことができる。

一般に真核生物の遺伝子はマウスインターフェロン遺伝
子等で知られているように、多形現象（ｐｏｌｙｍｏｒ
ｐｈｙｓｍ　）を示すと考えられ（例えばＮ　ｉ　ｓｈ
　ｉ等；　Ｊ　、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　、　９７巻１５３
頁（１９８５）を参照）、この多形現象によって１個ま
たはそれ以上のアミノ酸が置換される場合もあれば、塩
基配列の変化はあってもアミノ酸は全く変わらない場合
もある。

また図１（Ｂ）アミノ酸配列の中の１個またはそれ以上
のアミノ酸を欠くか又は付加されたポリペプチド、ある
いは１個またはそれ以上のアミノ酸が１個またはそれ以
上のアミノ酸で置換されたポリペプチドでもＧ−Ｃ３Ｆ
活性を有することがある。それゆえ、それ等天然に存在
するかあるいは人工合成されたポリペプチドがマウスＧ
−Ｃ３Ｆ活性を有する限りそれ等のポリペプチドをコー
ドする遺伝子は全て本発明に含まれる。

本発明のマウス−Ｇ−Ｃ３Ｆ活性をもつポリペプチド、
及びこれをコードする遺伝子を有する組換えベクター及
びこれを有する形質転換体、ざらにはその発現マウス−
Ｇ−Ｃ３Ｆ組成物を得る方法について簡単に説明すると
以下の通りである。

（１）ｃＤＮＡライブイリーの構築 マウスフイブロリ“ルコーマＮＦＳＡ細胞にグアニジン
チオシアナート溶液を加えてホモジナイズし、ＣｓＣｌ
密度勾配遠心法により全ＲＮＡを１ｑる。

この全ＲＮＡからオリゴ（ｄＴ＞セルロースカラムによ
りポリ（Ａ”）ＲＮＡを選別した後、逆転写酵素により
１本鎖ＣＤＮＡを合成し、ＲＮａｓｅＨおよ°びＥ、ｃ
ｏｌｉＤＮＡポリメラーゼ■を加えて、２重鎖ｃＤＮＡ
を得た。（ｑられた２本鎖ＣＤＮＡにＥＣ０ＲＩリンカ
−を付加して、２本鎖ＣＤＮＡをλｇｔｉｏベクターと
連結し、λフアージ系ＣＤＮＡライブラリーを構築した
。

（２）スクリーニング ＥＣ０Ｒ１切断部位にヒトＧ−Ｃ３ＦｃＤＮＡを挿入し
た、ｐＢＲ３２２を保持するエシェリヒア・コリ（Ｅ、
　ｃｏ　Ｉ　ｉ　）　Ｘ１７７６Ｒ−１株（ＦＥＲＭ　
　ＢＰ−９５４＞は、工業技術院微生物工業技術研究所
に寄託されている。

この菌から常法に従いヒトＧ−Ｃ３ＦｃＤＮＡを含むプ
ラスミドｐＢＲＧ４を回収し、制限酵素ＥＣ０ＲＩで消
化してヒトＧ−Ｃ３ＦｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を得て
これをプローブとした。このプローブを用いてλｇｔｌ
ｏｃ　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリーをプラークハイブリダイ
ゼーションによりスクリーニングした。

その結果、２４個のポジティブなファージを選別し完全
長と思われるクローンを１７で、ジデオキシ法を用いて
ｃＤＮＡインサートの塩基配列を決定したところ図１（
Ａ）に示される如くであった。

このｃＤＮＡは一つの大きなオープンリーディングフレ
ームを有し、コードされるアミノ酸配列は図１（Ａ）に
示された如く演えきできる。

ヒトＧ−Ｃ３Ｆタンパクのアミノ酸配列との比較により
、本ｃＤＮＡは５′−末端から６８〜７０ヌクレオチド
位のＡＴＧ配列から始まり、１５５〜１５７位のＧＣＣ
配列で終わる９０塩基対によってコードされるシグナル
ペプチド、および１５８〜１６０位のＧＴＴ配列から始
まり６８９〜６９１位のＧＣＣ配列で終る５３４塩基対
によってコードされる成熟Ｇ−Ｃ３Ｆポリペプチドに相
当する塩基配列を含んでいることがわかった。

従って図１（８）に示されたアミノ酸配列■のポリペプ
チドは１７８個のアミノ酸からなり、その分子量は１９
０６１ダルトンであった。

但しタンパク質の開始部位に関しては、６８〜７０位以
外に９５〜９７位あるいは１０４〜１０６位のＡＴＧも
同様に考え得る。

ＥｃｏＲＩ切断部位に本ＣＤＮＡを挿入したｐＢＲ３２
７を保持するエシェリヒア・コリ（Ｅ。

ｃｏｌｉ）　Ｘ１７７６Ｒ−４株（ＦＥＲＭＢＰ−１０
５５＞は工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されて
いる。　図２には、得られた遺伝子の制限酵素切断部位
を示した。

（３）ＣＯ３＄ＩＢ胞による形質発現 かくして得られた遺伝子は、サルのＣＶ−１細胞由来で
ＳＶ４０の複製起源（ｏｒｉｇｉｎ）欠損変異株で形質
転換されＳＶ４０の大型Ｔ抗原を表現しているＣＯ８細
胞（Ｇｌｕｚｍａｎ等；Ｃｅ１１２３巻１７５頁（１９
８１）を参照）を宿主細胞とし、ＳＶ４０の複製起源と
初期遺伝子のプロモーターを持つプラスミドＤｄＫＣＲ
（Ｆｕｋｕｎａｇａ等：Ｐｒ０Ｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８１巻５０８＆
頁（１９８４）　）をベクターとして形質発現させたと
ころマウスＧ−Ｃ３Ｆ−活性を示すことがわかった。

〔実施例〕

以下実施例をあげて本発明の詳細な説明するが、その前
にＣ８Ｆ活性の測定法について参考例で説明しておく。

く参考例＞Ｃ８Ｆ活性の測定方法 本発明において用いられたＣ３Ｆ活性（以下Ｃ３Ａと略
す）の測定方法は次のとおりである。

ｒＣ３Ａの測定方法、１ （ａ）マウス骨髄細胞を用いる方法： ウマ血清０．４ｎ／、被検検体０．１丁ｍ、　０３Ｈ／
１ｉｅ（メス）マウスの骨髄細胞浮遊液０．１ｄ（０，
５〜１Ｘ１０５有核細胞）、寒天を０．７５％含む改変
）ｆｃｃｏｙ’　ｓ　５Ａ＠養液０．／７８７８Ｑ直径
３５ＩｒＩ！ｎの組織培養用プラスティックディツシュ
に入れて固まらぜたのち、３７℃、５％炭酸ガス／９５
％空気、１００％湿度の条件下にて５日間培養し、形成
されたコロニー数（５０個以上の細胞からなる集落を１
コロニーとする）を数え、１個のコロニーを形成する活
性を１単位（Ｕｎｉｔ）としてＣ３Ａを求めた。

尚、上記の方法において用いた「改変Ｈｃｃｏｙ’　Ｓ
５Ａ＠養液は次の如くして作成した。

［改変ＨＣＣＯｙ’　Ｓ　５Ａ培養液（２倍濃度）」Ｈ
ｃＣｏｙ’　ｓ　５Ａ培養液（ＧＩＢＣＯ社製）１２ｇ
。

ＭＥＭアミノ酸ビタミン培地（白水製薬社製）２．５５
９重炭酸ナトリウム２．１８ｇ、ペニシリンＧカリウム
５００００単位を２回蒸溜水５００ｒｄに溶解後、０．
２２μｍのミリポアフィルタ−にて濾過滅菌を行った。

実施例１　マウスフィブロプルコーマ細胞ＮＦＳＡから
のｍＲＮＡの精製 １０％牛脂児血清を含むダルベツコ最小栄養培地（ＭＥ
Ｍ）中にマウスフィブロゾルコーマＮＦＳＡ（Ｇａｎｎ
　７５巻３５５頁〜３６１頁、　１９８４ンを増殖ざぜ
、約４Ｘ１０７個の細胞を回収する。

ｍＲＮＡの単離は本質的に’ＨＯＩｅＣｕｌａｒ　ｃｌ
ｏｎｉｎｇ　”［）ｆａｎｉａｔｉｓ等、　Ｃｏ１ｄ　
Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒ、　　１９６頁（１９８
２）］に記載されているようにして実施した。

上記細胞に２０ｄの６Ｍグアニジン溶液（６Ｍグアニジ
ンチオシアナート、５ｍＭクエン酸ナトリウム　（ｐＨ
７，０＞、　　０．ＩＭ　　β−メルカプトエタノール
、０．５％す“ルコシル硫酸ナトリウム）に懸濁し、ｖ
ｏｒｔｅｘミキサーにて２〜３分よく混合した後、１８
Ｑの注射針を装てんした２０ｍ１容の注射器を用いて１
０回吸入排出を繰り返した。ベックマン社製５Ｗ４０Ｔ
ｉローターに合うポリアロマ−製の遠心チューブに６ｒ
ＩＩｉの５．７ｊｖｌ　　ＣｓＣｌ　−０，ＩＭＥＤＴ
Ａ、　　（ｔ）８７．５＞を先に加えておき、デユープ
が満たされるように上述の細胞が壊れて粘稠になったグ
アニジン溶液的６ｄを重層した。このようにして調製さ
れた遠心チューブ４本を３０．０００ｒ、　ｐ、　ｍ、
、２０℃で１５時間遠心した後、得られたペレットを少
量の７０％エタノールを用いて３回洗浄した。

各々のチューブから得られたペレットを合して５５０μ
ｍの水に溶解せしめＮａＣＩＷ度が０．２Ｍとなるよう
に調整したのら、フェノール−クロロホルム（１：１）
処理、クロロホルム処理後、２．５倍容量のエタノール
を加えてエタノール沈澱を行い全ＲＮＡを１７だ。

全ＲＮＡからポリ（Ａ　　＞−ＲＮＡの精製は以下の如
く行った。この方法はｍＲＮＡが３′末端にポリＡ鎖を
付加していることを利用したアフィニティークロマトグ
ラフィーである。オリゴ（６丁）−ごルロース（Ｐ　−
Ｌ　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製、　Ｔｙｇｅ７）
を用い、吸着は全ＲＮＡを吸着緩衝液（１０ｍＭトリス
−塩Ｗｔ　（ＩＤＨ７，５）　、　　０．５Ｍ　　Ｎａ
Ｃｌ。

１ｍＭ　　ＥＤＴＡ、０．１％ＳＯＳ溶液を含む。）に
溶解し、６５℃で５分間加熱した後、同溶液にて充てん
されたオリゴ（ｄＴ）−セルロースカラムに通過させて
行い、溶出はＴＥ温溶液１０ｍＭトリス−塩Ｍ　（ＤＨ
７，５＞　、１ｍＭ　　ＥＤＴＡを含む。）で行った。

未吸着通過液は再び同カラムに通して同様に溶出操作を
行い、１回目の溶出液と混合した。このような操作を用
いて、ポリ（Ａ）−ＲＮＡを得た。

実施例２．０ＤＮＡ合成（λファージ系ライブラリ−の
構築） １）１本鎖ＣＤＮＡの合成 マウスフィブロザルコーマＮＦＳＡより実施例１で述べ
た如＜１７られたポリ（Ａ　　）−ＲＮＡ１２μｑを溶
解したＴ［溶液１０μｇを１０μｇのアクチノマイシン
Ｄ（シグマ社製）を含む反応チューブに入れた復、以下
の順序で試薬類を加えた；２０μｇの逆転写緩衝液（２
５０ｍＭトリス−塩Ｍ（ｐＨ８，３）　、　４０ｍＭ　
　ＭＣ７ＣＦ　２　、２５０　ｍＭ　　ＫＣＮ　＞２０
μＮの５ｍＭｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ。

ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰを各々５ｍＭ含む）、２０μ＋のオ
リゴ（ｄＴ＞　　　　　（０，２μｇ／ｗＩＩＰ−Ｌ　
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）、１μｍの１Ｍジチオ
スレイトール。

２　μｌの３０ｕｎｉｔ／μｌのＲＮａＳｅ（プロメガ
バイオチク社）、１０μＩの逆転写酵素（１０ｕｎｉｔ
／μｍ生化学工業社製）、１μ］のα−［３”ｐｌｄＡ
ＴＰ（１０μＣｉアマジャム社製）、１６μｍの水で計
１００μｍの液量の反応液になる。反応液を４２℃で２
時間保った後、５μｍの０．５Ｍ　　ＥＤＴＡ及び１μ
ｍの２０％ＳＤＳを加えて反応を停止した。フェノール
−クロロホルム（１００μｍ）処理、エタノール沈澱（
２回）を行って約４μｑの１末鎖ｃＤＮＡを１７た。

２）２本鎖ＣＤＮＡの合成 上記の如く得られたｃＤＮＡを２９μｍのＴＥ溶液に溶
解し以下の順序で試薬類を加えて反応液とした；２５μ
ｍのポリメラービ緩衝液（４００ｍＭＩＩｅＤｅｓ　（
１）Ｈ７，６）　：１６ｍＭ　　ＭＣＩＣＩ２　；６３
ｍ１’ｆのβ−メルカプトエタノール １０μ＋の５ｍＭ　　ｄＮＴＰ：　　１．０μ＋の１５
ｍＭβ−ＮＡＤ：　１．０μｍのα−［３２ｐ］　ｄＡ
ＴＰ　（１０μＣｉ／μＩ　）　　：　　０．２μｌ　
Ｅ．　　ｃｏｌｉ　ＤＮＡリガーゼ（６０ｕｎｉｔ／　
１１　１宝酒造社製）：　　５．０μｌのＥ。

ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼＩ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ
ａｎｄ　８ｉｏ１ａｂｓ社，　１０ｕｎｉｔ／μｌ　）
　；　０．１，ｃｚｌのＲＮａＳｅｌ−１（６０ｕｎｉ
　ｔ／　ｕ　ｌ宝酒造社製）　：２８．７　　μｌの蒸
溜水。

反応液を１４℃で１時間インキュベートした後、室温に
もどして、さらに１時間インキニーベートした。次いで
５μｍの０．５Ｍ　　ＥＤＴＡと１μｍの２０％ＳＯＳ
を加えて反応を停止させ、フェノール−クロロホルム処
理、エタノール沈澱を行った。

１７られたＤＮＡを０．５ｎ＋Ｈ　　ＥＤＴＡ２０μｍ
　ニ溶解せしめ、３μｍのＫＩｅｎＯＷ緩衝液（　５０
０ｍＭトリス−塩酸（ＤＨ　８．０）　、　５０ｍＭ　
　ＭｇＣ　Ｉ２　＞　。

３μｍの５ｍＭ　　ｄＮＴＰ，及び水４μｍを加えて反
応液を調製した後、１μｍのＤＮＡポリメラービ（ＫＩ
　ｅｎｏｗ断片）　（宝酒造社製）を加えて３０℃１５
分インキュベートした。

この反応液に７０μｌのＴＥ溶液を加えて希釈し、ざら
に５μｍの０．５Ｍ　　ＥＤＴＡ．１μｍの２０％ＳＤ
Ｓを加えて反応を停止した。反応液をフェノール−クロ
ロホルム処理し、エタノール沈澱を行って約８μ９の２
木鎖ＣＤＮＡ８得た。

３）　２本ｆａＣＤＮＡのメチル化 ２）の項で合成した２本！’！ｃＤＮＡの水溶液３０μ
！、メチル化緩衝液（５００ｍＭトリス−塩酸（　　ｐ
Ｈ　ａ．ｏ＞　　、　　５０ｍＭ　　　ＥＤＴＡ＞　　
４０μｍ　　、　　ＳＡ）！溶液（　８００μＭＳーア
デノシルーＬーメチルメチオニン（ＳＡＭ）、５０ｍＭ
　　β−メルカプトエタノール）２０μｍ，水１００μ
ｊを加えた混合液にＥＣＯＲＩメチラーピ（Ｎｅｗ　Ｅ
ｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社。

２０ｕｎｉｔ／μｌ　）　１５μｍを加えて全反応液を
２００μｍとし、３７°Ｃ２時間インキュベートした。

フェノール処理、エーテル処理を行った後、エタノール
沈澱を行ってＤＮＡを回収した。

４）　　ＥｃｏＲＩリンカ−の付加 上記メチル化された２本鎖ＤＮＡ約１．２μｑにリガー
ピ緩衝液（２５０ｍＭトリス−塩酸　（　ｐＨ７、５）
　、　　１００ｍＭ　　ＭＱＣ　１２　）　　１．５ｍ
　、あらかじめリン酸酸化されたＥＣＯＲＩＣＯＲ−０
．５μ＋　　（１０ｍｅｒ，宝酒造社製）、１．５μｍ
の１０ｍ〜ＩＡＴＰ，１００ｍＭジチオスレイトール１
．５μｍ　。

２μｍのＩ２０を加え、反応液を１５μｍとしてＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ（　３．４ｕ／μｌ　、宝酒造社）０、７
μｍ加えて４°Ｃで一晩反応させた後、６５℃にて１０
分間加熱しりガーゼを失活させた。この反応液をさらに
１００ｍＭトリス−塩酸（１１７．５）　。

５ｍ〜ｉ　　ＭＱＣＩ２，５０ｍＭ　　ＮａＣｌ，　　
１００μ（Ｊ　／ｄのゼラチンの濃度で仝液量が５０μ
！になるように調製した後、ＥｃｏＲＩ　（１０ｕｎｉ
ｔ／μｌ　）３．５μｍ加え、３７℃、２時間反応させ
た。次いで０．５ＭのＥＤＴＡ　２．５μｍ、２０％Ｓ
ＤＳ　Ｏ，５μＩを加えた後フェノール−クロロホルム
処理を行いエタノール沈澱によりＤＮＡを回収した。こ
の後Ｕｌｔｒｏｇｅｌ　ＡｃＡ３４　（ＬＫＢ社製）の
ゲル濾過法あるいはアガロースゲル電気泳動法にて未反
応のＥｃｏＲＩリンカ−を除去し、リンカ−付加２本ｍ
ｃＤＮＡ約０．５〜０．７μｇを回収した。

５）２末鎖ｃＤＮＡとλｇｔｔｏベクターの結合上記の
リンカ−付加２本鎖ＣＤＮＡを２．４μｇの予じめＥｃ
ｏＲＩ処理したλｇｔｉｏベクター（ベクタークローニ
ングシステム社）、リガーゼＩＩ　’ｆｌｓ液（２５０
ｍＭ　トリス塩Ｒ，１００ｍＭ　　Ｍ（］Ｃ１２）１．
４μｍ、蒸溜水６．５μｌを加えて、４２℃、１５分間
処理した後１０ｍＭ　　ＡＴＰＩμｌ　、０．１Ｍジチ
オスレイトール１μｌ　、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ０．５μ
ｍを加え全量を１５μｌとした後、１２℃で一晩反応さ
せた。

６）インビトロパッケージング 上記５）で得られた組換え体ＤＮＡの約１７３をインビ
トロパッケージングキット（プロメガ　バイオチク社）
を用いてパッケージジグし、ファージプラークを得た。

実施例３　　ｐＢＲＧ４由来ＤＮＡプローブによるλフ
アージ系ライブラリーのスク リーニング ＢｅｎｉｇｎとＤａｖｉｓの方法［５ｃｉｅｎｃｅ　１
９６巻、１８０頁（１９７７）　］に準じてプラハーク
ハイプリダイビーションを行った。ファージプラークの
生じた寒天培地上にニトロセルロース濾紙（Ｓ＆Ｓ社製
）をのせてファージを移し、０．５Ｍ　　Ｎａ０１−１
にてＤＮＡを変性させ、以下の順序で濾紙を処理した。

０、ＩＭ　　ＮａＯＨ，１，５Ｍ　　ＮａＣＩＴ−２０
秒、続いて０．５Ｍトリス−塩酸（ｐＨ７゜５）、１．
５ＭＮａＣ１で２０秒２回、最後に１２０ｍＭＮａＣ＋
、１５ｍＭクエンＨ’）−ダ、１３ｍＭＫＨ２ＰＯ４，
１ｍＭ　　ＥＤＴＡ、（ｐＨ７，２）テ２０秒９！１ｍ
した。

次いで濾紙を乾燥し、８０’Ｃで２時間加熱してＤＮＡ
を固定し、ｐＢＲＧ４由来ＤＮＡプローブによるスクリ
ーニングに供した。

ｐＢＲＧ４由来ＤＮＡプローブは、ｐＢＲＧ４をＥｃｏ
ＲＩで処理して約１５００塩基対のＤＮＡ断片を得、こ
のＤＮＡ断片を常法に従ってニックトランスレーション
により放射標識した。上記濾紙を５ＸＳＳＣ，５ｘＤｅ
ｎｈａｒｄｔ溶液、５０ｍＭリンｒ！ｉ緩衝液、５０％
ホルムアミド、０．２５　ｍｌ／ｍｌの変性ＤＮＡ（鮭
精巣ＤＮＡ）、及び０．１％ＳＤＳを含むハイブリダイ
ゼーション緩衝液中で４２℃にて一晩、プレハイブリダ
イゼーションを行い、上記の放射標識した約１５００塩
基対のＤＮＡプローブ（約１×１０６ＣｐｌＩｌ／ｍ１
）を含むプレハイブリダイゼーション緩衝液［５ＸＳＳ
Ｇ、５　ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、２０ｍＭリン酸緩
衝液（ｐ）（６，０）　、５０％ホルムアミド、ｏ、ｉ
％ＳＤＳ、１０％デキストラン硫酸、０．１１１１１１
／ｄの変性ＤＮＡ　（鮭精巣ＤＮＡ＞の混合液］で４２
℃にて２０時間パイプリダイゼーションを行った。

ニトロセルロース濾紙を室温下に、０．１％ＳＤＳを含
む２ｘＳＳＣで２０分間洗滌し、次いで４４℃で、ｏ、
ｉ％ＳＤＳを含む０．ｌＸ５ＳＣで３０分間、ざらに室
温下で０．１％ＳＳＣで１０分間洗滌した後、オートラ
ジオグライーで検出した。

このようにして行ったスクリーニングに於いて、ポジテ
ィブなりローンを選別し、そのうら完全長のｐＤＮＡを
含むと思われるクローンの塩基配列をジデオキシ法にて
調べたところ、図１（＾）に示される如き塩基配列が得
られれた。そこでこのＣＤＮＡをλｇｔｉｏベクターよ
り切りだし、ｐＢＲ３２７とＥＣｏＲＩ部位で結合させ
、プラスミドｐＢＲＭＧ２を得た。

実施例４　　ＣＯ３細胞用発現ベクターの構築実施例３
で得られた図１（Ａ）で示されるｃＤＮＡのＥＣ０ＲＩ
断片を制限酵素ＤｒａＩＧＣＴ３７℃で２時間処理した
後、ＯＮ△ポリメラーピ■のＫｌｅｎｏｗ断片（宝酒造
社製）で処理し、末端を平滑末端とした。１μ９のＢＣ
ＩＩＩＩリンカ−（８ｍｅｒ；宝酒造社製）をＡＴＰを
用いてリン酸化した後、上記で得られた１μ９のＤＮＡ
断片混合物と結合させた。次いて制限酵素［３Ｑ１ｍで
処理してアガロース電気泳動を行い、最も大ぎいＯＮＡ
断片だけを回収した。

このＤＮＡ断片は図２に示すようにマウスＧ−Ｃ８Ｆポ
リペプチドをコードする部分を含む約７７０塩基対に相
当していた。発現用ベクターｐｄＫＣＲ（Ｆｕｋｕｎａ
ｇａ等：ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　ＳＣｉ　
、ＵＳＡ　：８１巻５ｏ８６頁（１９８４））を制限酵
ｉＢａｍＨ工で処理した後、アルカリホスファターゼ（
宝酒造社製）で脱リン酸してｊｑられたベクターＤＮＡ
をＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を加えてｃＤＮＡ
断片と結合させ、ｐＭＧＤｌを得た（図３）。図３に示
される如くこのプラスミドは、ＳＶ４０初期遺伝子のプ
ロモーター、ＳＶ４０の複製開始領域、ウサギβ−グロ
ブリン遺伝子の一部、ｏＢＲ３２２の複製開始領域およ
びｐＢＲ３２２由来のβ−ラクタマーヒ遺伝子（Ａｍｐ
’　）を含むプラスミドで、ＳＶ４０初期遺伝子のプロ
モーター下流にマウスＧ−Ｃ３Ｆｉ伝子が接続されてい
る。

実施例５　　ＣＯ３細胞でのマウスＧ−Ｃ３Ｆｉｍ伝子
の発現 修生血清１０％を含むＤＭＥＭ　（日永製薬社製。

ダルベツコ変法イーグル培地「ニツスイ」）培地（１０
ｍ＞を用いて、直径９ｃｍのペトリ皿（ＮＬＩｎＣ社製
）中で約７０％密にまで増殖ざＵたＣＯ３−１細胞（氷
国、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｉｓｇ　Ｈａｒｂｏｒ研究所叶
、ＧＩＬＩＺｍａｎより譲受）をリン酸−カルシウム法
（Ｗｉ（ｌｌｅｌ’等；Ｃｅ１ｌ　１４巻７２５頁（１
９７８）　）およびＤＥＡＥ−デキストラン：りｎｏキ
ン法（例えば、ＧＯｌ’ｄＯｎ等；５ｃｉｅｎｃｅ　２
２８巻８１０頁（１９８５）を参照）によって形質転換
した。

リン酸−カルシウム法の場合は以下の如〈実施した。

実施例４で調整したプラスミドｐＭＧＤ１　１６０μ９
をＴＥ溶液３２０μＮに溶解ひしめ、３．２ｍｉの蒸溜
水を加えた後ざらに５０４μｇの２Ｍ　　ＣａＣρ２を
加えた。

この溶液に４１ｎｌの２ＸＨＢＳ　［５０ｍＭ　　Ｈｅ
ｐｅｓ、　　２８０ｍＭ　　ＮａＣ，Ｑ　、１．５　ｍ
ＭリンＭ　ＬＭ　！ｊ液、　　（ｐＨ７，１２）　］を
加えて２０〜３０分間氷冷した後、ＣＯ３−１細胞の増
殖したペトリ皿１枚につぎ１ｒ１１１ずつ滴下″した。

３７℃のＣＯ２インキュベーターにて４時間培養させた
後、無血清のＤＭＥＭ培地で細胞を洗浄し、次いで２０
％のグリセロールを含む［）ＭＥＭ培地培地５奢ｌえて
空温で約３分間放置し、再び無血清のＤＭＥＭ培地で洗
浄した。

無血清のＤＭＥＭ培地を除□いた後、修生血清１０％を
含むＤＭＥＭ培地１培地１金 キュベーター中で培養し、再□び同培地にて培地交換を
行ってざらに３日間培養した。

ＤＥＡＥ−デキストラン：りＤｏキン法を用いた場合は
以下の如くである。

リン酸カルシウム法と同様にＣＯ３−１細胞を７０％密
にまで培養し、無血清のＤＭＥＭ培地で細胞を２回洗浄
した。これに２５０μ９の／ｄのＤＥＡＥ−デキストラ
ンおよび実施例１２で調整した２μｇ／ｒｒ１Ｎのプラ
スミドｐＭＧＤ１を含む無血清ＤＭＥＭ培地を加え、３
７℃，１２時間培養した。次いで、細胞を無血清ＤＭＥ
Ｍ培地で２回洗浄し、１０％仔牛修生と１ｍＭクロロキ
ンを含むＤＭＥＭ培地にて、３７℃，２時間培養を続（
プだ。その後細胞を無血清ＤＭＥ〜１培地で２回洗浄し
た後、１０％仔牛修生を含むＤＭＥＭ培地を添加し、３
７℃にて３日間培養した。同様にマウスＧ−Ｃ３ＦのＣ
ＤＮＡを含まないｐｄＫＣＲでＣＯ３−１細胞を形質転
換した後、その培養上清をコントロールとして用いた。

得られた標品について参考例に記載された「マウスＧ−
Ｃ３Ｆの測定方法（ａ）」に塁づいた方法にてマウスＧ
−Ｃ３Ｆ活性を検定した。結果は下表の通りであった。

表 〔発明の効果〕 本発明のマウスＧ−Ｃ３ＦｃＤＮＡとこれを発現して得
られるマウスＧ−Ｃ３Ｆは、研究用試薬としてまた臨床
検査用試薬として有用なものである。

【図面の簡単な説明】

図１（Ａ）はｐＢＲＭＧ２のＣＤＮＡインサートの塩基
配列を示す。 図１（Ｂ）（ｉ）はｐＢＲＭＧ２のＣＤＮＡから演えき
したマウス−Ｇ−Ｃ８Ｆ前駆体のアミノ酸配列を示す。 図ＨＢ）（旧はｐＢＲＭＧ２のＣＤＮＡから演えきした
マウス−成熟Ｇ−Ｃ５Ｆのアミノ酸配列を示す。 図２はＤＢＲＭＧ２のｃＤＮＡインサートの制　□限ｉ
ｙ素切断部位を示す。 図３はプラスミドｐＭＧＤ１を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　マウス顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペ
   プチドをコードする遺伝子。 ２　遺伝子がショ糖密度勾配遠心法により１４〜１７Ｓ
   画分として得られる、マウス顆粒球コロニー刺激因子活
   性を有するポリペプチドをコードするメッセンジャーＲ
   ＮＡに相補的なＤＮＡであることを特徴とする特許請求
   の範囲第１項記載の遺伝子。 ３　マウス顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペ
   プチドをコードする遺伝子が以下に示されるポリペプチ
   ド配列またはその一部をコードするものである特許請求
   の範囲第１項記載の遺伝子。 【遺伝子配列があります】 ４　マウス顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペ
   プチドをコードする遺伝子が以下に示されるポリペプチ
   ド配列またはその一部をコードするものである特許請求
   の範囲第１項記載の遺伝子。 【遺伝子配列があります】 ５　マウス顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペ
   プチドをコードする遺伝子が以下に示される塩基配列ま
   たはその一部を有するものである特許請求の範囲第１項
   記載の遺伝子。 【遺伝子配列があります】 ６　マウス顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペ
   プチドをコードする遺伝子が以下に示される塩基配列ま
   たはその一部を有するものである特許請求の範囲第１項
   記載の遺伝子。 【遺伝子配列があります】 ７　マウス顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペ
   プチドをコードする遺伝子が図１（Ａ）に示される塩基
   配列またはその一部を有するものである特許請求の範囲
   第１項記載の遺伝子。 ８　マウス顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペ
   プチドをコードする遺伝子が微生物又はウィルス由来の
   レプリコンに接続されたものである特許請求の範囲第１
   項〜第７項のいずれかに記載の遺伝子。