JP3665071B2 - 新規なリセプター型チロシンキナーゼ - Google Patents
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Description
発明の背景
技術分野
本発明は新規なリセプター型チロシンキナーゼ、及び該リセプター型チロシンキナーゼに対し反応性を有する抗体に関する。更に詳細には、本発明は、血液未分化細胞においては発現するが、血液未分化細胞の分化に伴い発現レベルが低下する、新規なリセプター型チロシンキナーゼ、及び該リセプター型チロシンキナーゼに対し反応性を有する抗体に関する。本発明のリセプター型チロシンキナーゼに対し反応性を有する抗体を用いることにより、生物学的サンプルに含まれ、該リセプター型チロシンキナーゼを表面に有している血液未分化細胞を該生物学的サンプルから単離することができ、又生物学的サンプルに含まれる上記の血液未分化細胞を特異的に検出することができる。更に本発明は、少なくともそのリセプター型チロシンキナーゼ活性を阻害又は賦活化するか、或いはその発現を抑制する化学物質のスクリーニング方法にも関する。更に本発明は、上記のリセプター型チロシンキナーゼをコードするＤＮＡ；複製可能な発現ベクターに上記のリセプター型チロシンキナーゼをコードするＤＮＡが発現可能に組み入れられてなる、複製可能な組換えＤＮＡ；およびその組換えＤＮＡにより形質転換された微生物又は真核細胞；上記のリセプター型チロシンキナーゼをコードするｃＤＮＡを利用して作製したセンスＤＮＡ断片及びアンチセンスＤＮＡ断片並びにそれらの誘導体；及びセンスＲＮＡ断片及びアンチセンスＲＮＡ断片並びにそれらの誘導体に関する。
従来技術
ヒトの血液中には多種類の細胞があり、それぞれが重要な役割を担っている。例えば、赤血球は体内での酸素運搬を、血小板は止血作用を、白血球は免疫系を構成して感染を防御している。これらの多様な細胞は骨髄中の造血幹細胞に由来する。造血幹細胞は体内の種々の造血因子や環境要因により影響を受け、各種血液細胞、破骨細胞、肥満細胞などに分化することが近年明らかにされてきた。この造血因子として、赤血球への分化についてはエリスロポエチン（ＥＰＯ）が、白血球への分化については顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）が発見され、現在すでに臨床応用がなされている。しかし造血幹細胞を含む骨髄細胞、末梢血細胞、臍帯血細胞等の血液未分化細胞の、血液細胞への分化及び増殖のメカニズムについては、未だ不明な点が多い。又、この細胞群を分化及び増殖させる因子はその存在が指摘されているにも関わらず発見されていないものがあり、又そのような因子を発見するための有効な手法も見い出されていない。
近年の研究からチロシンキナーゼが動物、昆虫の発生や分化に大きく関わっていることが明らかになっており、血液未分化細胞の分化においてもチロシンキナーゼが大きく関与していると考えられる。
タンパク質中に存在するアミノ酸であるチロシンを特異的にりん酸化する酵素であるチロシンキナーゼは、細胞外から細胞内へのシグナル伝達、さらに細胞核内における遺伝子の転写調節を司る重要な物質である。また、これらのチロシンキナーゼをコードする遺伝子の転座、点変異により細胞が癌化したりする異常が起こることが知られている。さらに、これらをコードする遺伝子に類似した遺伝子を持つウイルスに感染することにより、細胞が癌化したり、生物個体に癌が生じることが知られている。したがって、チロシンキナーゼを理解し、その遺伝子構造、タンパク質構造を知ることは癌などに代表される細胞の異常増殖状態に起因する病気の診断・治療にとって極めて重要である。たとえば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）などの遺伝子増幅法を利用したり、ＤＮＡ、ＲＮＡプローブを用いたり、制限酵素を用いたりして、チロシンキナーゼの遺伝子の一部もしくは全部を検出することにより、生体中の点変異や遺伝子組換え、発現量の有無を調べ、血液疾患などの病気の診断に利用しうる。
チロシンキナーゼは、タンパク質のチロシン残基をりん酸化する酵素であり、その生理活性部位は約２５０個のアミノ酸残基から構成さている。また、チロシンキナーゼ群のアミノ酸配列の中には、きわめてよく保存された配列があり（Hanks et al. Science 241:42,1988）、保存されたアミノ酸配列に対応するＤＮＡ配列を設計し、ＲＴ（Reverse Transcription）−ＰＣＲ法のプライマーとして利用すれば、新たにチロシンキナーゼ遺伝子断片を得ることができる（Wilks. Methods in Enzymology 200:533,1991）。
リセプター型チロシンキナーゼの一種であるｃ−ｋｉｔは血液未分化細胞の表面に発現しており、ｃ−ｋｉｔに対するモノクローナル抗体は血液未分化細胞の単離の研究、増殖に関する研究に利用され、さらに、血液中のｃ−ｋｉｔ量が特定の白血病の病態と相関していることが指摘され、モノクローナル抗体を利用したｃ−ｋｉｔの血液中の濃度測定が診断薬として開発されようとしている。また、ｃ−ｋｉｔは、肥満細胞増殖因子でなおかつ血液未分化細胞の増殖因子の１つであるステムセルファクター（ＳＣＦ）のリセプターであることがわかっており（Witte. Cell 63: 5,1992）、このリセプター型チロシンキナーゼを介して細胞の分化が制御されている。この様なリセプター型チロシンキナーゼの細胞外部分に特異的に結合するリガンドは、一般に結合にともない細胞内の酵素活性を上昇させ、細胞内に情報を伝達し、その結果、生理活性を発生させる。
発明の概要
血液細胞の分化過程を研究するにあたり、有効な手段はその目的に見合った細胞株、もしくは細胞を利用することにあるが、ヒト巨核芽球白血病細胞株ＵＴ−７（日本国、自治医科大学血液科、小松則夫講師より入手可能）は顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ），インターロイキン３（ＩＬ−３）などの造血因子に依存して増殖する細胞株であり、ＧＭ−ＣＳＦ存在下でＰＭＡ（Ｐｈｏｒｂｏｌ １２−Ｍｙｒｉｓｔａｔｅ １３−Ａｃｅｔａｔｅ）にて刺激すると巨核球に分化し、また、エリスロポエチン存在下で酪酸にて刺激すると赤芽球に分化する多分化能を持った細胞である（Komatsu et al.Cancer Res. 51:341,1991）。したがって、ＵＴ−細胞の利用は血液未分化細胞の分化のメカニズムの研究に有効であると考えられる。
本発明者らは、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて、ヒト巨核芽球白血病細胞株ＵＴ−７から血液未分化細胞の分化に関与するチロシンキナーゼ遺伝子のクローニングを行った。その結果、ＵＴ−７細胞が未分化な状態ではｍＲＮＡ発現が強く認められるが、巨核球への分化に伴い発現が認められなくなる新規なリセプター型チロシンキナーゼを見い出した。この遺伝子断片をプローブとして用い、ヒト胎盤及びヒト胎児肝臓のｃＤＮＡライブラリーから、全長をコードするｃＤＮＡを得、その全塩基配列を決定し、新規なリセプター型チロシンキナーゼポリペプチドを発現する細胞を作製し、さらにこのポリペプチドを単離した。更に、該ポリペプチドに対し反応性を有する抗体を作製し、この抗体を用いて血液未分化細胞を検出、又は単離する方法を確立した。また更に、上記のポリペプチドを用いた新規な化学物質のスクリーニング方法を確立した。
従って、本発明の一つの目的は、血液未分化細胞に特異的に発現する新規なリセプター型チロシンキナーゼ及びそれをコードするＤＮＡを提供することにある。
更に本発明の他の一つの目的は、血液未分化細胞の分化及び増殖のメカニズムの解明に用いることのできる、上記のリセプター型チロシンキナーゼポリペプチドに対し反応性を有する抗体、及び該抗体を用いて該リセプター型チロシンキナーゼポリペプチドを発現している血液未分化細胞を単離又は検出する方法を提供することにある。
更に本発明の他の一つの目的は、リセプター型チロシンキナーゼ活性の阻害又は賦活化能、或いは上記のリセプター型チロシンキナーゼの発現抑制能を指標にして、本発明のリセプター型チロシンキナーゼのシグナル伝達を調節することができる血液未分化細胞分化増殖因子等の化学物質のスクリーニング方法を提供することにある。
更に本発明の他の一つの目的は、本発明のリセプター型チロシンキナーゼ遺伝子発現の確認や、細胞内における遺伝子発現の調整に有利に用いることのできる、センスＤＮＡ断片及びアンチセンスＤＮＡ断片並びにそれらの誘導体、又、センスＲＮＡ断片及びアンチセンスＲＮＡ断片並びにそれらの誘導体を提供することにある。
本発明の上記及びその他の諸目的、該特徴ならびに諸利益は、添付の配列表を参照しながら述べる次の詳細な説明及び請求の範囲の記載から明らかになる。
配列表の簡単な説明
配列表において：
配列番号１のアミノ酸配列は、本発明のリセプター型チロシンキナーゼの、シグナルペプチドを除いた細胞外ドメインの配列であり、配列番号４に示した本発明のリセプター型チロシンキナーゼ全アミノ酸配列のアミノ酸番号第１〜５２２番に相当しており；
配列番号２のアミノ酸配列は、本発明のリセプター型チロシンキナーゼの、細胞内ドメイン内に含まれるリセプター型チロシンキナーゼ酵素活性部分の配列であり、配列番号４に示した本発明のリセプター型チロシンキナーゼ全アミノ酸配列のアミノ酸番号第６００〜８５９番に相当しており；
配列番号３のアミノ酸配列は、本発明のリセプター型チロシンキナーゼの、シグナルペプチドを除いた、細胞外ドメイン、膜透過ドメイン及び細胞内ドメインの全ドメインの配列であり、配列番号４に示した本発明のリセプター型チロシンキナーゼ全アミノ酸配列のアミノ酸番号第１〜９７２番に相当しており；
配列番号４は、本発明のリセプター型チロシンキナーゼの全アミノ酸配列、及び該リセプター型チロシンキナーゼの全ｃＤＮＡ配列であり；
配列番号５は、後述の実施例２で使用するセンスプライマーの塩基配列であり；
配列番号６は、後述の実施例２で使用するアンチセンスプライマーの塩基配列であり；そして
配列番号７は、後述の実施例８で使用する塩基配列及びそれがコードするオリゴペプチドである。
なお、配列番号１〜４及び７に表わされた各アミノ酸配列の左端及び右端はそれぞれＮ末端及びＣ末端であり、又、配列番号４〜７に表わされた塩基配列の左端及び右端はそれぞれ５’末端及び３’末端である。
発明の詳細な説明
即ち、本発明の一つの態様によれば、リセプター型チロシンキナーゼ活性を有し、配列表の配列番号１、２及び３からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含有する単離されたポリペプチド、又は該ポリペプチドの、リセプター型チロシンキナーゼ活性を有する相同変異体が提供される。
又、本発明の他の態様によれば、上記のポリペプチド又は相同変異体をコードする単離されたＤＮＡ，上記のＤＮＡが、複製可能な発現ベクターに発現可能に組み入られてなる複製可能な組換えＤＮＡ，該複製可能な組換えＤＮＡにより形質転換された微生物または真核細胞が提供される。
本発明において、“リセプター型チロシンキナーゼ活性"とは、チロシンキナーゼが本来有している、チロシン残基をりん酸化する酵素活性、リセプター型チロシンキナーゼにおいてその細胞外ドメインがリガンドを認識して結合する機能、及びリセプター型チロシンキナーゼにおいてその細胞内ドメイン中のアミノ酸残基（主にチロシン残基）をりん酸化して、りん酸化した部位において他の細胞内タンパク質と結合して、その細胞内タンパク質を結合部位においてりん酸化する機能のうち少なくとも１つを含むものとする。
本発明のリセプター型チロシンキナーゼは配列表の配列番号１、２及び３からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含有するが、自然界で生じることが知られている種内変異、アレル変異等の突然変異及び人為的に作製可能な点変異による変異によって生じる、リセプター型チロシンキナーゼ活性を有する相同変異体も、本発明のリセプター型チロシンキナーゼに含まれる。
また、アミノ酸レベルの変異がなくとも、自然界から分離した染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡにおいて、遺伝コードの縮重により、そのＤＮＡがコードするアミノ酸配列を変化させることなくＤＮＡの塩基配列が変異した例はしばしば認められる。また５’非翻訳領域及び３’非翻訳領域はポリペプチドのアミノ酸配列の規定に関与しないので、それらの領域のＤＮＡ配列は変異しやすい。このような遺伝コードの縮重によって得られる塩基配列も本発明のＤＮＡに含まれる。
更に、上記したリセプター型チロシンキナーゼ活性を有し配列番号１、２及び３からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含有するポリペプチドの、リセプター型チロシンキナーゼ活性を有する相同変異体をコードするＤＮＡも、本発明のＤＮＡに含まれる。
本発明において、遺伝子操作に必要なｃＤＮＡの作製、ノーザンブロットによる発現の検討、ハイブリダイゼーションによるスクリーニング、組換えＤＮＡの作製、ＤＮＡの塩基配列の決定、ｃＤＮＡライブラリーの作製等の一連の分子生物学的な実験は通常の実験書に記載の方法によって行うことができる。前記の通常の実験書としては、たとえば、Maniatisらの編集したMolecular Cloning, A laborartorymanual, 1989, Eds., Sambrook,J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., Cold Spring Harbor Loboratory Pressを挙げることができる。
本発明のリセプター型チロシンキナーゼのｃＤＮＡを得る工程は、後述する実施例１〜６に記載した通りである。即ち、まず、公知のチロシンキナーゼ遺伝子に特徴的なアミノ酸配列に対応したプライマーを用いて、ＰＣＲを行う。ＰＣＲ用プライマーの作製並びにＰＣＲはＷｉｌｋｓの方法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1603, 1989）で行うことができる。すなわち、市販のＤＮＡ合成機で適当なオリゴヌクレオチドを作成し、精製してＰＣＲ用プライマーを得る。次いでＰＣＲ用プライマーを、上記したヒト巨核芽球白血病細胞株ＵＴ−７のｃＤＮＡ溶液に加えＰＣＲを行い、得られるＰＣＲ産物をクローニングし遺伝子配列を決定したところ、配列表の配列番号４の塩基配列の第２６４２番から第２８１２番に相当していた。この配列はチロシンキナーゼ酵素活性部位の中央部分をコードしており、細胞内シグナル伝達に重要な役割を果たすアミノ酸配列をコードする。
本発明のリセプター型チロシンキナーゼｃＤＮＡ全配列のクローニングには、前記の方法にてクローニングしたｃＤＮＡ断片をアイソトープ標識、又は非アイソトープ標識し、ＵＴ−７細胞株のｃＤＮＡライブラリーをハイブリダイゼーションなどの方法にてスクリーニングすることによって得ることができる。アイソトープの標識法としては、たとえば［32Ｐ］γ−ＡＴＰとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて末端をラベルする方法や、他のニックトランスレーション法またはプライマー伸長法などによる標識法が利用できる。
こうして得られた本発明のリセプター型チロシンキナーゼのｃＤＮＡ塩基配列を、配列表に配列番号４としてそれがコードするアミノ酸配列と共に示した。塩基配列は４０９塩基よりなる５’非翻訳領域、それに続く２９６１塩基よりなる本発明のリセプター型チロシンキナーゼをコードする領域、及びさらにそれに続く９１９塩基よりなる３’非翻訳領域からなる。また、本発明のリセプター型チロシンキナーゼのアミノ酸配列は、配列表の配列番号４のアミノ酸配列の−１５番から−１番にあたる１５アミノ酸から構成されるシグナルペプチド、配列表の配列番号４のアミノ酸配列の１番から５２２番にあたる５２２アミノ酸で構成される細胞外部分、配列表の配列番号４のアミノ酸配列の５２３番から５４８番にあたる２６アミノ酸から構成される細胞膜貫通部分、配列表の配列番号４のアミノ酸配列の５４９番から９７２番にあたる４２４アミノ酸から構成される細胞内部分、より構成される。さらに、細胞内部分においては配列表の配列番号４のアミノ酸配列の６００番から８５９番にあたる２６０アミノ酸はチロシンキナーゼ酵素活性部分である。尚、本発明のリセプター型チロシンキナーゼｃＤＮＡの全塩基配列を含むベクターｐＢＳＲＴＫＦＵＬＬを大腸菌ＪＭ１０９（日本国、東洋紡社製）に遺伝子導入した形質転換細胞は、日本国通産省工業技術院生命工学工業技術研究所において寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４８８３として１９９４年１１月１１日に寄託されている。
尚、本発明のリセプター型チロシンキナーゼのｃＤＮＡは、ＵＴ−７以外にも、血液細胞株であるヒト慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２（日本国理化学研究所、細胞開発銀行より入手可能、Ｎｏ．ＲＣＢ００２７）及びヒト急性巨核芽球性白血病細胞株ＣＭＫ（Blood 74:42,1989）等から、又非血液細胞株では肝細胞ガン細胞株Ｈｅｐ３Ｂ［アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（以下ＡＴＣＣと示す）より入手可能、ＨＢ８０６４］及びヒト胎児肺繊維芽細胞株ＭＲＣ−５（日本国理化学研究所、細胞開発銀行より入手可能、Ｎｏ．ＲＣＢ０２１１）等から、後述する実施例１〜６と実質的に同様の操作で得ることができる。
配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは本発明のリセプター型チロシンキナーゼの細胞外部分のシグナルペプチドを除いた部分のアミノ酸配列を有するポリペプチドに相当し、配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは本発明のリセプター型チロシンキナーゼの細胞内チロシンキナーゼ酵素活性部分のアミノ酸配列を有するポリペプチドに相当する。また、配列表の配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは本発明のリセプター型チロシンキナーゼのシグナルペプチドを除いた部分のアミノ酸配列を有するポリペプチドに相当する。
本発明のリセプター型チロシンキナーゼペプチドは、すでにクローニングされているリセプター型チロシンキナーゼであるヒトＥＰＨ（Hirai et al., Science, 238, 1717-1720, 1987）、ヒトＥＣＫ（Lindberg and Hunter, Mol. Cell. Biol., 10, 6316-6324, 1990）、ラットＥＬＫ（Lhotak et al., Mol. Cell. Biol., 11, 2496-2502, 1991）、ヒトＨＥＫ（Wicks et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA., 89, 1611-1615, 1992）、マウスＳＥＫ（Gilardi-Hebenstreit et al., Oncogene, 7, 2499-2506, 1992）、チキンＣｅｋ−５（Pasquale, Cell Regulation, 2, 523-534, 1991）と類似した構造を持つが、そのアミノ酸配列のホモロジーは最も高い場合のＥＬＫで５６．３％であり、これらの遺伝子とは全く異なった新規なアミノ酸配列を有する。
本発明のリセプター型チロシンキナーゼは、公知の遺伝子工学的手法により、リセプター型チロシンキナーゼ活性を有し、且つ配列表の配列番号１、２及び３からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡか、又は該ポリペプチドの、リセプター型チロシンキナーゼ活性を有する相同変異体をコードするＤＮＡを、複製可能な発現ベクターに発現可能に組み込み、微生物または真核細胞（たとえば昆虫細胞や動物細胞）を宿主とする形質転換体を得て、その形質転換体から得ることができる。本発明のリセプター型チロシンキナーゼをより安定な条件で産生させたい場合には真核細胞、特に動物培養細胞を宿主として用いるのが好ましい。
本発明のリセプター型チロシンキナーゼ、それをコードするＤＮＡ及び該リセプター型チロシンキナーゼを産生する形質転換体は、リセプター型チロシンキナーゼの基礎的な解析研究から、リセプター型チロシンキナーゼを介したシグナル伝達系を特異的に制御する抗癌剤を初めとする医薬品などの医療分野に関わる化学品の開発、ドラッグデザインの研究に使用することができる。
上記したように、本発明のリセプター型チロシンキナーゼ遺伝子のｍＲＮＡの発現は、上記したヒト巨核芽球白血病細胞株ＵＴ−７が未分化な条件ではｍＲＮＡの発現が見られるが、巨核球へと分化するにともないｍＲＮＡの発現が見られなくなり、他の巨核芽球細胞株においても同様な現象が確認できる。
本発明のリセプター型チロシンキナーゼの血液未分化細胞における発現を検出する方法としては、配列表の配列番号４の遺伝子配列の一部もしくは全配列を鋳型として設計した合成オリゴヌクレオチドを用いたノーザンブロットでも可能であるが、より簡便に検出するには本発明のリセプター型チロシンキナーゼに対し反応性を有する抗体を用いた方法がよい。モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の作製は配列表の配列番号３に示したアミノ酸配列の一部もしくは全部を免疫原として常法にて作成可能であり、特に細胞外部分（配列番号１）に対する抗体は細胞を生きた状態で検出可能であり、より有効な手段である。また更に、後述するように、本発明のリセプター型チロシンキナーゼに対し反応性を有する抗体を用いて、本リセプター型チロシンキナーゼを発現している血液未分化細胞を効率的に単離することもできる。
即ち、本発明の更に他の一つの態様によれば、リセプター型チロシンキナーゼ活性を有し、配列表の配列番号１、２及び３からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含有するポリペプチドか、又は該ポリペプチドの、リセプター型チロシンキナーゼ活性を有する相同変異体に対し、反応性を有する抗体が提供される。
本発明のリセプター型チロシンキナーゼに特異的な抗体を作製する方法の一例を、後述する実施例８に示す。この様にして作製したモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの３株３８−１Ｅ、６６−３Ａおよび６８−３Ａは、日本国通産省工業技術院生命工学工業技術研究所において、それぞれ、寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４８８４、ＦＥＲＭ ＢＰ−４８８５、ＦＥＲＭ ＢＰ−４８８６として１９９４年１１月１１日に各々寄託されている。
本発明のリセプター型チロシンキナーゼの細胞外ドメインに対し反応性を有する抗体の作製は、上記のようにして得られたポリペプチドを免疫原として、常法により本発明のリセプター型チロシンキナーゼを特異的に認識するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作成できる。
このモノクローナル抗体から、モノクローナル抗体のアミノ酸配列をコードする遺伝子、特に抗体遺伝子の可変領域をＰＣＲ法などの遺伝子工学的な方法で分離して、マウス、ヒト、ラット等の抗体をコードする遺伝子に遺伝子工学的な手法によってつなぎ、本発明のリセプター型チロシンキナーゼを認識するキメラ抗体をコードする遺伝子を得て、これを発現ベクターにつなぎ、動物細胞などの真核細胞、バクテリアなどの原核細胞に遺伝子導入して、本発明のリセプター型チロシンキナーゼを認識するキメラ抗体を産生させることができる。さらに、抗体の形状としては抗体全体でもかまわないが、抗体の可変領域のみを発現させる形にしたＦａｂ型、ファージなどを利用した一本鎖ペプチド型などの形で発現させることが可能である。本発明の抗体には、上記したキメラ抗体やＦａｂ型、一本鎖ペプチド型等のリコンビナント抗体及びそれらのアナログも含まれる。
本発明の抗体は、所望ならば、シャーレや磁気ビーズ等の固体支持体に固定した形で使用してもよい。
このようにして作製した抗体、特に細胞外部分を抗原として認識するモノクローナル抗体は、末梢血、骨髄液、臍帯血等に浮遊する血液細胞中に少量存在する血液未分化細胞を識別できるため、血液未分化細胞の単離や検出に有利に利用できる。
即ち、本発明の更に他の態様によれば、リセプター型チロシンキナーゼ活性を有するポリペプチドを含む体細胞を単離する方法にして、
（１）リセプター型チロシンキナーゼ活性を有し、配列表の配列番号１及び３からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含有するポリペプチド、又は該ポリペプチドの、チロシンキナーゼ活性を有する相同変異体を抗原として表面に有する体細胞を含む生物学的サンプルに、上記した本発明の抗体を、該抗原と該抗体とが抗原抗体複合体を形成する条件下で接触させ、それによって抗原抗体反応混合物を得；そして
（２）該ポリペプチド又は該相同変異体を抗原抗体複合体の形で含む上記の体細胞を、抗原抗体反応混合物から単離する、
ことを包含する方法が提供される。
上記の生物学的サンプルの例としては、血液未分化細胞を含有する水性懸濁液や血液未分化細胞を含有する体液よりなるサンプル等が挙げられる。
また、上記工程（２）の後、抗体を抗原抗体複合体から分離して、抗体と複合していない形の本発明のリセプター型チロシンキナーゼを含む体細胞を得ることもできる。
抗体を抗原抗体複合体から分離する方法としては、例えば、たたくなどの物理的な刺激、パパイン、キモパパイン、トリプシン等のプロテアーゼなどの酵素処理、溶液のＰＨや、塩濃度の変化などにより抗体を抗原抗体複合体から外す方法がある。また、抗原又は抗体を酵素により消化して本発明のリセプター型チロシンキナーゼを発現している細胞を分離することもできる。
血液未分化細胞の単離の方法としては、細胞を該モノクローナル抗体で染色してフローサイトメーターにより単離する方法があるが、より大量且つ簡便に行うためには、抗体をシャーレ等の基材表面の上に固定したものを用いるパンニング法、磁気ビーズなどを用いるカラム法等による方法が望ましいが、これらの方法に限定されるものではない。
上記の方法は、血液未分化細胞の分化・増殖のメカニズムの解明に有用であるのみならず、本発明のリセプター型チロシンキナーゼを発現している造血幹細胞を含む、上記のようにして得られる単離された血液未分化細胞は、後述する実施例９に示すように、抗ＣＤ３４抗体を用いて単離された血液未分化細胞と同等またはより高いコロニー形成能を有しており、現在行なわれている骨髄移植、末梢血幹細胞移植、臍帯血幹細胞移植等に応用可能である。
また、本発明の更に他の態様によれば、リセプター型チロシンキナーゼ活性を有するポリペプチドを検出する方法にして、
（１）リセプター型チロシンキナーゼ活性を有し、配列表の配列番号１、２及び３からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含有するポリペプチド、又は該ポリペプチドの、チロシンキナーゼ活性を有する相同変異体を抗原として含む生物学的サンプルに、上記した本発明の抗体を、該抗原と該抗体とが抗原抗体複合体を形成する条件下で接触させ、それによって抗原抗体反応混合物を得；そして
（２）該ポリペプチド又は該相同変異体を抗原抗体複合体の形で検出する、
ことを包含する方法が提供される。
上記の生物学的サンプルの例としては、体細胞の単離方法と同様、血液未分化細胞を含有する水性懸濁液や血液未分化細胞を含有する体液よりなるサンプル等がある。
上記の検出方法としてはフローサイトメーターによる方法が一般的であるが、他の公知の抗原抗体反応を利用する検出法も利用できる。また、血清、血漿中に存在する本発明のリセプター型チロシンキナーゼの検出は、リセプター型チロシンキナーゼであるｃ−ｅｒｂＢ２やｃ−ｋｉｔが腫瘍マーカーとして有効であるとの報告から、同様に腫瘍マーカーの検出に利用できる可能性がある。その場合には、本発明のリセプター型チロシンキナーゼに対する抗原認識部位の異なる２種の抗体を用いたサンドイッチ型酵素抗体法が望ましいと考えられる。
また、本発明の更に他の態様によれば、リセプター型チロシンキナーゼ活性を阻害又は賦活化することができるか、或いは、リセプター型チロシンキナーゼ活性を有するポリペプチドの発現を抑制する化学物質をスクリーニングする方法にして、
（１）サンプル材料を、リセプター型チロシンキナーゼ活性を有し、配列番号１、２及び３からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含有する単離されたポリペプチド、又は該ポリペプチドの、リセプター型チロシンキナーゼ活性を有する相同変異体に接触させ、該ポリペプチド又は該相同変異体が有するリセプター型チロシンキナーゼ活性に対する阻害能又は賦活化能、或いは該ポリペプチド又は該相同変異体の発現抑制能を指標にして、少なくとも該ポリペプチド又は該相同変異体の有するリセプター型チロシンキナーゼ活性を阻害又は賦活化させるか、或いは該ポリペプチド又は該相同変異体の発現を抑制する化学物質を検出し；そして
（２）検出した化学物質をサンプル材料から単離する、
ことを包含する方法が提供される。
この方法によって、本発明のリセプター型チロシンキナーゼに結合して、該リセプター型チロシンキナーゼの自己りん酸化（autophosphorylation）を抑制するか又は促進することによりリセプター型チロシンキナーゼ活性を阻害又は賦活化することができるか、或いは、本発明のリセプター型チロシンキナーゼの発現を抑制する化学物質、例えば後述の実施例１０に示すような巨核球分化因子であるインターロイキン１α（ＩＬ−１α）等のスクリーニングが可能である。また、本発明のリセプター型チロシンキナーゼのシグナル伝達を調節することができるために医薬品としての有用性が期待される未知の血液未分化細胞分化増殖因子等の新規な化学物質をスクリーニングできる可能性もある。
配列表の配列番号４の配列で表される塩基配列の一部と対をなす単離されたアンチセンスＤＮＡ断片及びアンチセンスＲＮＡ断片並びにそれらがメチル化、メチルフォスフェート化、脱アミノ化、又はチオフォスフェイト化された誘導体は、血液未分化細胞の分化の研究や血液未分化細胞の分化制御剤などの医薬品に利用可能である。又、配列表の配列番号４の塩基配列の一部を有する単離されたセンスＤＮＡ断片及びアンチセンスＤＮＡ断片あるいはそれらの誘導体、又それに対応する配列を有する単離されたセンスＲＮＡ断片及びアンチセンスＲＮＡ断片あるいはそれらの誘導体、により細胞内の発現を調節する事も可能である。さらに、これらのＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片及びそれらの誘導体を用いて、後述する実施例７に示したように本発明のリセプター型チロシンキナーゼのｍＲＮＡの発現を確認する事ができる。本発明の単離されたセンスＤＮＡ断片、アンチセンスＤＮＡ断片、センスＲＮＡ断片、及びアンチセンスＲＮＡ断片並びにそれらの誘導体は１２ｍｅｒ以上であればよいが、１４ｍｅｒから１６ｍｅｒ以上がより望ましい。
発明を実施するための最良の形態
以下実施例によって、本発明をより具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例になんら限定されるものではない。
実施例１ ヒト巨核芽球白血病細胞株ＵＴ−７のＰｏｌｙ（Ａ） + ＲＮＡの調製
ＵＴ−７細胞（日本国、熊本大学医学部遺伝発生医学研究施設分化制御部門須田年生教授もしくは日本国、自治医科大学血液科小松則夫講師より入手可能）の培養、継代は、培地として牛胎児血清（ＦＣＳ、以下本実施例で使用したＦＣＳは全てオーストラリア国、フィルトロン社製）を１０％含むイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）を用い、ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ｈＧＭ−ＣＳＦ）を２ｎｇ／ｍｌとなるように加え、ＣＯ2インキュベーターにて３７℃の条件で行った。未刺激細胞は、同じ条件で培養した細胞を用いた。巨核球に分化させる際には、細胞濃度２×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌに希釈し、ヒト顆粒球単球コロニー形成因子（ｈＧＭ−ＣＳＦ）を２ｎｇ／ｍｌとなるように加え、さらにフォルボール １２−ミリステート １３−アセテート（ＰＭＡ）（米国、シグマ社製）を１０ｎｇ／ｍｌとなるように加え、３日間培養後細胞を回収した。これらの各条件で培養した細胞を各々細胞数１×１０8個回収し、カルシウム、マグネシウムを含まないダルベッコ改変リン酸バッファー（ＰＢＳ（−）、日本国、ニッスイ社製）にて３回洗浄し、ＲＮＡの抽出に用いた。
回収した細胞から塩化リチウム／尿素法（Ｌｉｔｈｉｕｍ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ／Ｕｒｅａ法：Eur.J.Biochem.107:303(1980)）にて全ＲＮＡを抽出した。次に、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ ３０（日本国、宝酒造社製）にて、Ｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡを分離・精製した。
実施例２ チロシンキナーゼに特異的なプライマーの作成
Ｗｉｌｋｓの方法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1603,1989）に従い、公知のチロシンキナーゼに比較的共通するアミノ酸配列を有するチロシンキナーゼのサブドメイン７と９に対応し、かつ制限酵素の認識部位を連結した混合プライマー、すなわちセンスプライマーＰＴＫＩ：5'-TTGTCGACAC(AC)G(AG)GA(CT)(CT)T(CG)GC(ACGT)GC(ACGT)(AC)G-3'、（２７ｍｅｒ：制限酵素の認識部位としてＳａｌＩ部位が付加されている、配列表の配列番号５に記載）およびアンチセンスプライマーＰＴＫＩＩ：3'-CT(AG)CA(CG)ACC(AT)(CG)(AG)A(AT)ACCTTAAGGT-5'（２４ｍｅｒ：制限酵素の認識部位としてＥｃｏＲＩ部位が付加されている、配列表の配列番号６に記載）を用い以下のＰＣＲを行った。
合成オリゴヌクレオチドは固相法を原理とする全自動ＤＮＡ合成機を使用して作成した。全自動ＤＮＡ合成機としては米国のアプライドバイオシステム社３９１ＰＣＲ−ＭＡＴＥを使用した。ヌクレオチド、３'-ヌクレオチドを固定した担体、溶液、および試薬は同社の指示に従って使用した。所定のカップリング反応を終了し、トリクロロ酢酸で５’末端の保護基を除去したオリゴヌクレオチド担体を濃アンモニア中にて室温で１時間放置することにより担体からオリゴヌクレオチドを遊離させた。次に、核酸及びリン酸の保護基を遊離させるために、核酸を含む反応液を、封をしたバイアル内において濃アンモニウム溶液中で５５℃にて１４時間以上放置した。担体及び保護基を遊離した各々のオリゴヌクレオチドの精製を米国のアプライドバイオシステム社のＯＰＣカートリッジを使用して行い、２％トリフロオロ酢酸で脱トリチル化した。精製後のプライマーは最終濃度が１μｇ／μｌとなるように脱イオン水に溶解してＰＣＲに使用した。
実施例３ ｃＤＮＡの合成
実施例１により得られたＰｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡを用いてｃＤＮＡの合成を行った。すなわち、Ｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡの２μｇを脱イオン水１２．３μｌに溶解し、１０×緩衝液（５００ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１５ｍＭ ＭｇＣｌ2０．０１％ ゼラチン）２μｌ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（日本国、宝酒造社製）４μｌ、前述のチロシンキナーゼに特異的なアンチセンスプライマーＰＴＫＩＩ（１μｇ／μｌ、配列表の配列番号６に記載）１μｌ、アビアンミエロブラストシスウイルス逆転写酵素（ａｖｉａｎ ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ：Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ 社：３２Ｕ／μｌ）０．２μｌ、及びＲＮａｓｅインヒビター（独国、ベーリンガー社製：４０Ｕ／μｌ）０．５μｌ加えて３７℃で７５分間放置後、６５℃で１０分間放置した。
実施例４ チロシンキナーゼに特異的なプライマーによるＰＣＲ
ＰＣＲによる増幅は以下のように行った。実施例３で得られたｃＤＮＡ溶液２０μｌを使用し、１０×緩衝液（５００ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．０１％ ゼラチン）８μｌ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（日本国、宝酒造社製）６．４μｌ、前述のチロシンキナーゼに特異的なセンスプライマーＰＴＫＩ（１μｇ／μｌ、配列表の配列番号５に記載）１．５μｌ、及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ、米国、パーキンエルマー社製：５Ｕ／μｌ）０．２μｌを加え、最後に脱イオン水を加えて全量を１００μｌとして、９４℃で１分間、３７℃で２分間、７２℃を３分間からなる工程を１サイクルとして、この工程を４０サイクル行い、最後に７２℃にて７分間放置してＰＣＲを行った。このＰＣＲ産物の一部を２％アガロースゲル電気泳動を行い、エチジュウムブロマイドにて染色後、紫外線下で観察し、約２１０ｂｐのｃＤＮＡが増幅されていることを確認した。
実施例５ ＰＣＲ産物のクローニング及び塩基配列の決定
ＰＣＲ産物の全量を低融点アガロースにて作成した２％アガロースゲルにて電気泳動し、エチジュウムブロマイドにて染色後、紫外線照射下にて約２１０ｂｐのバンドを切り出し、ゲルと同体積の蒸留水を加え、６５℃にて１０分間加熱し、ゲルを完全に溶かした後、等量のＴＥ飽和フェノール（日本国、日本ジーン社製）を加えて、１５０００ｒｐｍ５分間遠心分離後上層を分取し、更にＴＥ飽和フェノール：クロロフォルム（１：１）溶液、次にクロロフォルムにて同様な分離操作を行った。最終的に得られた溶液からｃＤＮＡをエタノール沈澱して回収した。回収したｃＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ（日本国、宝酒造社製）及びＳａｌＩ（日本国、宝酒造社製）にて消化したのち、ベクターへの組み込みに用いた。
ベクターとしてはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（米国、ストラタジーン社製、以下ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔと示す）を用い、先のｃＤＮＡを組み込む前に、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩにて消化した。これらの処理を行ったベクターと先のｃＤＮＡのモル比が１：５となるように混ぜ合わせて、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（米国、ニューイングランドバイオラボ社製）にてベクターにｃＤＮＡを組み込んだ。ｃＤＮＡが組み込まれたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔを大腸菌ＪＭ１０９に遺伝子導入し、アンピシリンを５０μｇ／ｍｌ含むＬ−Ｂｒｏｔｈ半固型培地のプレートに蒔き、１２時間程度３７℃に放置し、現れてきたコロニーをランダムに選択し、ｃＤＮＡが組み込まれていることを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩにて消化して、２１０ｂｐのｃＤＮＡが切れ出されてくることをにより確認し、確認されたクローンについて、組み込まれているｃＤＮＡの塩基配列を米国、アプライドバイオシステム社の螢光シークエンサー モデル３７３Ａにて決定した。その結果、未刺激のＵＴ−７細胞からはクローニングされたが、巨核球に分化された場合にはクローニングされなかったチロシンキナーゼ遺伝子断片を得た。この遺伝子断片は配列表の配列番号４の２６４２番目から２８１２番目であった。
実施例６ ｃＤＮＡライブラリーの作成及び新規チロシンキナーゼ遺伝子の全長クローニング及びその解析
前述の方法にて分離精製された未刺激状態のＵＴ−７細胞のＰｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡを用いてｃＤＮＡライブラリーを作成した。ＵＴ−７ｃＤＮＡライブラリーの作成にはｐＣＤＭ８ベクターｃＤＮＡライブラリー作成キット（オランダ国、インビトロゲン社製）を用い、添付の作成方法に従って作成した。さらに、前述の方法に従ってヒト胎盤よりＰｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡを精製し、ｃＤＮＡライブラリーを作成した。ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーの作成にはλＺＡＰＩＩｃＤＮＡライブラリー作成キット（米国、ストラタジーン社製）を用い、添付の作成方法に従って作成した。
次に、これらのｃＤＮＡライブラリーからコロニーハイブリダイゼーションもしくはプラークハイブリダイゼーションにて全長ｃＤＮＡを持ったクローンの検索を５×１０5相当のコロニーもしくはプラークから行った。出現したコロニーもしくはプラークをナイロンフィルター（Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋：英国、アマシャム社製）に転写し、転写したナイロンフィルターをアルカリ処理（１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ ＮａＯＨを染み込ませたろ紙上に７分間放置）し、次いで中和処理（１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、１ｍＭ ＥＤＴＡを染み込ませたろ紙上に３分間放置）を２回行い、次にＳＳＰＥ溶液（０．３６Ｍ ＮａＣｌ、０．０２Ｍ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．７）、２ｍＭ ＥＤＴＡ）の２倍溶液中で５分間振とう後洗浄し、風乾した。その後、０．４Ｍ ＮａＯＨを染み込ませたろ紙上に２０分間放置し、５倍濃度のＳＳＰＥ溶液で５分間振とう後洗浄し、再度風乾した。このフィルターを用いて放射性同位元素32Ｐにて標識されたｃＤＮＡプローブにてスクリーニングを行った。
放射性同位元素32Ｐにて標識されたｃＤＮＡプローブは以下のように作成した。すなわち、本発明のリセプター型チロシンキナーゼの部分ｃＤＮＡが組み込まれたｐＢｌｕｅ−ｓｃｒｉｐｔより、ＳａｌＩとＥｃｏＲＩにてベクターより切り出し、低融点アガロースゲルからＤＮＡ断片を精製回収した。得られたｃＤＮＡ断片をＤＮＡラベリングキット（Ｍｅｇａｐｒｉｍｅ ＤＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ：英国、アマシャム社製）を用いて標識した。すなわち、ＤＮＡ２５ｎｇにプライマー液５μｌ及び脱イオン水を加えて全量を３３μｌとして沸騰水浴を５分間行い、その後、ｄＮＴＰを含む反応緩衝液１０μｌ、α−32Ｐ−ｄＣＴＰ５μｌ、及びＴ４ＤＮＡポリヌクレオチドキナーゼ溶液２μｌを加えて、３７℃で１０分間水浴し、更にその後、セファデックスカラム（Ｑｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０：独国、ベーリンガーマンハイム社製）で精製し、５分間沸騰水浴をしたのち、２分間氷冷後使用した。
前述の方法にて作成したフィルターを、各々の成分の最終濃度が５倍濃度のＳＳＰＥ溶液、５倍濃度のデンハルト液、０．５％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、及び１０ｍｇ／ｍｌの沸騰水浴により変性したサケ精子ＤＮＡであるプレハイブリダイゼーション液中に浸し、６５℃にて２時間振とうしたのち、前述の方法で32標識されたプローブを含むプレハイブリダイゼーション液と同一組成のハイブリダイゼーション液に浸し、６５℃にて１６時間振とうし、ハイブリダイゼーションを行った。
次に、フィルターを０．１％ＳＤＳを含むＳＳＰＥ溶液に浸し、６５℃にて振とうし２回洗浄後、さらに０．１％ＳＤＳを含む１０倍希釈したＳＳＰＥ溶液に浸し、６５℃にて４回洗浄した。洗浄を終了したフィルターを増感スクリーンを使用して、オートラジオグラフィーを行った。その結果、強く露光された部分のクローンを拾い、再度コロニー及びプラークを蒔き直し前述の方法にてスクリーニングを行い、完全に単独のクローンを分離した。
ＵＴ−７のライブラリーから分離されたクローンのうちインサートサイズの大きい２クローンを前掲のＭａｎｉａｔｉｓらの実験書に掲載の方法に従いプラスミドを精製し、制限酵素ＸｈｏＩにて消化し、低融点アガロース電気泳動にてｃＤＮＡを精製し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに組み込んだ。組み込まれたｃＤＮＡのサイズはおよそ３．０ｋｂｐ及び１．６ｋｂｐであった。また、ヒト胎盤ライブラリーから分離されたクローンのうちインサートサイズの大きい２クローンをＭａｎｉａｔｉｓらの実験書に掲載の方法に従いファージＤＮＡを精製し、制限酵素ＥｃｏＲＩにて消化し、同様にｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに組み込んだ。組み込まれたｃＤＮＡのサイズはおよそ３．８ｋｂｐ（ｃｌｏｎｅ２）及び３．５ｋｂｐ（ｃｌｏｎｅ９）であった。
これらのクローンのｃＤＮＡの両端の遺伝子配列をスウェーデン国、ファルマシア社ＡＬＦＤＮＡシークエンサーおよびスウェーデン国、ファルマシア社ＡＬＦシークエンサー用ラベリングキットを用い、添付の使用説明書に従い決定した。さらに全長の塩基配列決定を行うため日本国、宝酒造株式会社キロシークエンス用デリーションミュータント・キットを用い、添付の使用説明書に従い、デリーションミュタントを作成し、ｃＤＮＡの両方向についての塩基配列を決定した。
その結果、全長のｃＤＮＡがクローニングされていないことが判明したため、さらにｃｌｏｎｅ２の制限酵素ＸｈｏＩサイトから５’部分の約２００ｂｐ（配列表の配列番号３の４８４番から６９６番に当たる）を用いて、市販のヒト胎児肝臓ｃＤＮＡライブラリーλｇｔ１１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を同様な方法にてスクリーニングした結果、ＸｈｏＩサイトより５’方向のｃＤＮＡを含むクローン（ｃｌｏｎｅ Ｍ１、配列表の配列番号３の１番から１２１４番目に当たる）がクローニングでき、遺伝子配列をシークエンスして、本発明の全長ｃＤＮＡ遺伝子の塩基配列が決定された。
全長の遺伝子配列を持ったＤＮＡの作製は配列表の配列番号３に記載のＤＮＡのＸｈｏＩサイトを用いて上記のｃｌｏｎｅ２とｃｌｏｎｅＭ１のつなぎ、ライブラリーのリンカーのＥｃｏＲＩサイトを用いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＥｃｏＲＩサイトにサブクローニングして作製し、最終的に配列表の配列番号４に記載した本発明のリセプター型チロシンキナーゼの全ｃＤＮＡの塩基配列を有するＤＮＡ断片を含むベクターｐＢＳＲＴＫＦＵＬＬが完成した。尚、この遺伝子を含むベクターｐＢＳＲＴＫＦＵＬＬを大腸菌ＪＭ１０９（日本国、東洋紡社製）に遺伝子導入した形質転換細胞は、日本国通産省工業技術院生命工学工業技術研究所において寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４８８３として１９９４年１１月１１日に寄託した。
実施例７ ノーザンブロッティングによるｍＲＮＡの発現の確認
本新規リセプター型チロシンキナーゼのｍＲＮＡの発現を調べるため、あらかじめｍＲＮＡが転写されているフィルターである。米国、クローンテック社 Ｈｕｍａｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔ、Ｈｕｍａｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔ ＩＩ、Ｈｕｍａｎ Ｆｅｔａｌ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔ並びに実施例１に示した方法にて回収されたｍＲＮＡをアガロースゲル電気泳動し、Ｚｅｔａ−Ｐｒｏｂ（米国、バイオラッド社製）にトランスファーして作成したフィルターを用い、ｐＢＳＲＴＫＦＵＬＬを制限酵素ＳｍａＩにて消化して、１％のアガロースゲルで電気泳動を行い、７４６ｂｐの断片（配列表の配列番号４の６１０番目から１３５５番目）を切り出し、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ ＩＩ（米国、ＢＩＯ１０１社製）を用いて精製した遺伝子断片を前掲のＤＮＡラベリングキット（ＭｅｇａＰｒｉｍｅ ＤＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ：英国、アマシャム社製）にて前述の方法で32Ｐ標識し発現を調べた。
その結果、ヒト成人組織のうち心臓、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、すい臓、脾臓、前立腺、卵巣で発現が認められた。しかしながら、脳、胸腺、精巣、小腸、大腸、末梢血リンパ球においては発現が認められなかった。また、ヒト胎児組織では心臓、肺、肝臓、腎臓において発現が認められたが、脳においては発現が認められなかった。
また、血液細胞株では、前述の骨髄巨核芽球性白血病細胞株ＵＴ−７、ヒト慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２（日本国、理化学研究所、細胞開発銀行より入手可能、Ｎｏ．ＲＣＢ００２７）及びヒト急性巨核芽球性白血病細胞株ＣＭＫ（Blood 74:42,1989）に発現されており、非血液細胞株では肝細胞ガン細胞株Ｈｅｐ３Ｂ［アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（以下ＡＴＣＣと示す）より入手可能、ＨＢ８０６４］及びヒト胎児肺繊維芽細胞株ＭＲＣ−５（日本国、理化学研究所、細胞開発銀行より入手可能、Ｎｏ．ＲＣＢ０２１１）に発現が認められた。さらに、ＵＴ−７、Ｋ５６２、ＣＭＫに於いてはＰＭＡによる細胞分化を起こさせるとその発現がほぼ完全に認められなくなることが確認された。しかしながら、ヒトさい帯血から樹立された細胞株ＫＭＴ−２（日本国、理化学研究所、細胞開発銀行より入手可能、Ｎｏ．ＲＣＢ０７１２），ヒト慢性骨髄性白血病細胞株ＫＧ１ａ（ＡＴＣＣより入手可能、ＣＣＬ２４６．１）、急性リンパ球性白血病細胞株ＭＯＬＴ−４（ＡＴＣＣより入手可能、ＣＣＬ１５８２）に於いては発現が認められなかった。
以上のことから、この遺伝子は血液細胞が未分化の状態において発現されており、血液細胞が分化することにともない、その発現が消失することが推察された。したがって、本発明のリセプター型チロシンキナーゼは血液幹細胞の維持、巨核球分化に関連すると考えられた。
実施例８ 本発明のリセプター型チロシンキナーゼ発現細胞株の作成及び本発明のリセプター型チロシンキナーゼを認識する抗体の作成
得られた配列表の配列番号１のアミノ酸配列を持つポリペプチドをコードするＤＮＡ、配列表の配列番号２のアミノ酸配列を持つポリペプチドをコードするＤＮＡ、及び配列表の配列番号３のアミノ酸配列を持つポリペプチドをコードするＤＮＡの上流にＳＶ４０ウィルスの初期プロモーター及び下流にＳＶ４０ウィルスのPoly(A)+シグナル、さらにジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子をつないだ発現プラスミドを構築した。このプラスミドを精製し、その２０μｇをグルコース液に懸濁したＣＨＯ／ｄｈＦｒ-細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ９０９６）に導入した。導入には米国、バイオラド社のジーンパルサーを用い、６００Ｖの電圧をかけることで、遺伝子導入を行った。細胞は２日間、１０％牛胎児血清を含む培地で培養後、メトトキセート（ＭＴＸ）剤を含む培地（ダルベッコＭＥＭ，１０％透析牛胎児血清）で培養し、遺伝子導入による形質転換細胞を選択した。この細胞からｍＲＮＡを抽出し、オリゴｄＴゲルカラムによりＰｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡを得て、電気泳動後、フィルターに電気的に移し、固定後常法により、本発明のリセプター型チロシンキナーゼ遺伝子でハイブダイズしたところ、ｍＲＮＡが発現していることを確認した。これにより、本発明のリセプター型チロシンキナーゼの細胞外部分、酵素活性部分、及び全長を発現している形質転換細胞を得たことを確認した。
また、これらのタンパクの発現を確認するため、配列表の配列番号１、配列番号２、及び配列番号３のアミノ酸配列のＣ末端部から２０アミノ酸部分のアミノ酸配列を持ったポリペプチドを常法に従いペプチド合成機により作成し、かぶとがに由来ヘモシアニン（ＫＬＨ）とカップルさせ免疫源を作成し、これを兎に免疫し、それぞれのポリペプチドに対する抗血清を取得した。
上記形質転換細胞の細胞破砕産物及び細胞培養上清をポリアクリルアミドゲル電気泳動し、それをニトロセルロースメンブランに写し、作成された抗血清を用いてウエスタンブロットを行った。その結果、本発明のリセプター型チロシンキナーゼの細胞外部分を発現している形質転換細胞は細胞培養上清中に約８０キロダルトンのタンパクのバンドが確認され、本発明のリセプター型チロシンキナーゼの酵素活性部分及び全長を発現している形質転換細胞株は細胞破砕産物中に各々３０キロダルトン及び１３０キロダルトンのタンパクのバンドが確認され、これらの形質転換細胞株が各々に対応したポリペプチドを産生していることを確認した。細胞外部分及び全長のポリペプチドはアミノ酸組成から予想される分子量よりともにおよそ２０キロダルトン大きく、糖鎖付加されていると予想される。
また、本発明のリセプター型チロシンキナーゼ細胞外部分を特異的に認識するモノクローナル抗体を作成するために、米国、コダック社製ＩＢＩ ＦＬＡＧシステムを用いて、（詳細はＩＢＩ ＦＬＡＧ Ｅｐｉｔｏｐｅ．１、１、１９９２年 コダック社を参照のこと）配列表の配列番号１のアミノ酸配列を持つポリペプチドのＣ末端に８アミノ酸、すなわち配列表の配列番号７に示したアミノ酸配列であるAsp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lysを持つポリペプチドを付加したポリペプチドをコードする遺伝子を含む発現ベクターを上記の方法と同様に作成し、同様に形質転換細胞株を得た。この細胞培養上清から米国、コダック社製Ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ Ｍ２ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌを用いたアフィニティーカラム法にて本発明のリセプター型チロシンキナーゼの細胞外部分とＦＬＡＧとの融合タンパクを精製した。
上記のように精製された本発明のリセプター型チロシンキナーゼの細胞外部分とＦＬＡＧの融合タンパクをＢａｌｂ／ｃマウス（日本国、日本エスエルシー社製）に１匹あたり１０μｇを皮下・皮内に免疫した。２回の免疫後、眼底採血を行い血清中の抗体価の上昇を認めた後、３回目の免疫を行ってからマウスの脾臓細胞を取り出し、マウスミエローマ細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８（ＡＴＣＣ ＴＩＢ９）とポリエチレングリコール法にて細胞融合を行った。ＨＡＴ培地（日本国、日本免疫生物研究所製）にてハイブリドーマを選択し、酵素抗体法にて本発明のリセプター型チロシンキナーゼの細胞外部分を認識する抗体を培地中に産生しているハイブリドーマ株を３株分離した。これらのハイブリドーマを３８−１Ｅ、６６−３Ａ及び６８−３Ａと名付けた。これらのハイブリドーマ３株３８−１Ｅ、６６−３Ａおよび６８−３Ａは、日本国通産省工業技術院生命工学工業技術研究所において、それぞれ、寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４８８４、ＦＥＲＭ ＢＰ−４８８５、ＦＥＲＭ ＢＰ−４８８６として１９９４年１１月１１日に各々寄託した。
これらの細胞培養上清中からスウェーデン国、ファルマシア社製抗体精製キットＭａｂｔｒａｐＧを用いて、添付の取扱い説明書に従いモノクローナル抗体を精製した。このようにして作成された３種のモノクローナル抗体を用いて、本発明のリセプター型チロシンキナーゼの全長を発現する遺伝子導入細胞株及びＵＴ−７の細胞破砕物のウエスタンブロットを行ったところ、１３０キロダルトンのバンドを特異的に認識することが確認でき、本発明のリセプター型チロシンキナーゼを認識するモノクローナル抗体を樹立した。
実施例９ 本発明のリセプター型チロシンキナーゼを認識する抗体を用いた細胞の単離
本発明の抗リセプター型チロシンキナーゼ抗体が造血未分化細胞を検出しうる抗体であることを示すため、造血未分化細胞を検出しうる抗ＣＤ３４抗体との類似性を検討した。臍帯血８０ｍｌにシリカ懸濁液（日本国、免疫生物研究所）３ｍｌを添加し３７度の温度で１時間インキュベートした。その後１５ｍｌのハンクス生理食塩水（米国、ギブコ社）を添加し、フィコールパック液（スウェーデン国、ファルマシア社）に重層し、８００回転２０分の遠心操作により形成した単核細胞層を回収し、ハンクス生理食塩水により２回洗浄し単核の細胞を得た。この細胞の５×１０5細胞を含む懸濁液に抗新規リセプター型チロシンキナーゼ抗体１００μｇ／ｍｌを氷上で反応させ、フィコエリスリン標識した抗ＩｇＧ抗体（米国、ベクトンデッキンソン社製）で染色及び洗浄後、ＩｇＧ抗体（米国、ベクトンデッキンソン社製）存在下でインキュベートし、ＦＩＴＣ標識した抗ＣＤ３４抗体（米国、ベクトンデッキンソン社製）を反応させた。これらの細胞を英国、コールター社のフローサイトメーターＥＰＩＣＳ ＥＬＩＴＥで測定した。フローサイトメーターの測定法は、付属のマニュアルに従った。その結果、３８−１Ｅ抗体、６６−３Ａ抗体、６８−３Ａ抗体、抗ＣＤ３４抗体に対する陽性細胞は、それぞれ２．８％、０．５％、３．９％、４．０％であった。また、各本発明の抗リセプター型チロシンキナーゼ抗体陽性細胞中のＣＤ３４陽性細胞率は、３８−１Ｅ抗体、６６−３Ａ抗体、６８−３Ａ抗体のそれぞれ５２％、６７％、５６％であり、本発明の抗リセプター型チロシンキナーゼ抗体により染色された多くの細胞が血液未分化細胞を検出していることが示された。
またさらに、本発明の抗リセプター型チロシンキナーゼ抗体で血液未分化細胞を単離しうることを確認した。臍帯血３５ｍｌにシリカ懸濁液（日本国、免疫生物研究所）３．５ｍｌを添加し、３７度の温度で１時間インキュベートした。その後１０ｍｌのハンクス生理食塩水（米国、ギブコ社）を添加し、その細胞懸濁液をフィコールパック液（スウェーデン国、ファルマシア社）に重層し、８００回転２０分の遠心操作により形成した単核細胞層を回収し、ハンクス生理食塩水で２回洗浄し単核の細胞を得た。この細胞の一部４×１０4個を含む細胞懸濁液に本発明の抗リセプター型チロシンキナーゼ抗体３８−１Ｅまたは６８−３Ａを１００μｇ／ｍｌになるように加え、氷上で反応させ、洗浄後、米国、アプライドイムノサイエンス（ＡＩＳ）社のマイクロセレクター（抗マウスＩｇＧ抗体コーティング）を用いて、本発明の抗リセプター型チロシンキナーゼ抗体が反応した細胞をパンニング法にて分離した。マイクロセレクターは、日本国、旭メディカル社より購入し、その使用方法は付属のマニュアルに従った。コントロールとして単核の細胞を抗ＣＤ３４抗体（米国、ベクトンデッキンソン社製、抗ＨＰＣＡ−１抗体）で同様の方法で分離した。得られた細胞を使用し、半固形培地によるコロニー形成能を測定した。半固形培地は、カナダ国、テリーフォックス社の培地を使用し、その使用方法はテリーフォックス社の発行したマニュアルに従った。つまり、細胞は、半固形培地に懸濁後、４枚の３５ミリのディッシュ（米国、ファルコン社）に１ｍｌずつ添加し、５％炭酸ガス、９５％空気、３７度の温度、高湿度条件下で１４日培養した。形成したコロニー数は、顕微鏡下で計測した。以上の操作により３８−１Ｅ抗体、６８−３Ａ抗体、抗ＣＤ３４抗体のコロニー数はそれぞれ１５７個、１８２個、１１３個であった。即ち、本発明の抗リセプター型チロシンキナーゼ抗体である３８−１Ｅ、６８−３Ａは、抗ＣＤ３４抗体で単離した血液未分化細胞に較べ、より高いコロニー形成能を有する血液未分化細胞を単離していた。
実施例１０ 本発明のリセプター型チロシンキナーゼを用いた巨核球分化因子のスクリーニング
ヒト胎児繊維芽細胞株ＭＲＣ−５（日本国、理化学研究所、細胞開発銀行より入手可能、Ｎｏ．ＲＣＢ０２１１）のｍＲＮＡから作成したｃＤＮＡライブラリーの一部のＤＮＡを導入した細胞の培養上清から巨核球白血病細胞株ＵＴ−７における本発明のリセプター型チロシンキナーゼの発現を低下させる物質のスクリーニングを行った。
発現ライブラリーの作成は東洋紡社のＯｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ ｃＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ を用い行った。また、ＵＴ−７上における本発明のリセプター型チロシンキナーゼの発現の有無は実施例８で樹立されたモノクローナル抗体を用いたフローサイトメーター（ＥＰＩＣＳ Ｅｌｉｔｅ、米国、コールター社）にて行った。
実施例１に記載した条件で培養したＵＴ−７を最終細胞数が２×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように調整し、これに対し上記の方法で作成した発現ライブラリーをＣＯＳ細胞に遺伝子移入して作成した形質転換細胞の培養上清を加え、２日間培養後細胞を回収し、ＵＴ−７上の本発明のリセプター型チロシンキナーゼの発現を低下させる培養上清のライブラリーのクローニングを行った。その結果、ＵＴ−７上の本発明のリセプター型チロシンキナーゼの発現の低下がみられる培養上清を産生するＣＯＳ細胞クローンが得られ、そのクローンよりプラスミドを回収し、インサートの遺伝子配列を調べたところ、既に既知の遺伝子であるヒトインターロイキン１α（ＩＬ−１α）と同一であった。過去の研究によるとＩＬ−１αは巨核球系細胞のコロニー形成に関与することが知られている（Briddell et al.,Blood 79:332,1992;Takahashi et al.,Br. J Haematol. 78:480,1991）。これらの結果から、本発明のリセプター型チロシンキナーゼを用いることにより巨核球細胞に作用し、血小板の増加に関与する生理活性物質を探し出すことが可能であることが示された。
産業上の利用可能性
本発明のリセプター型チロシンキナーゼは、血液未分化細胞においては発現するが、血液未分化細胞の分化に伴い発現レベルが低下する。従って、本発明のリセプター型チロシンキナーゼに対し反応性を有する抗体を用いることにより、生物学的サンプルに含まれる、該リセプター型チロシンキナーゼが細胞表面に結合している血液未分化細胞をサンプルから単離することができ、又生物学的サンプルに含まれる上記のような血液未分化細胞を特異的に検出することができる。上記の方法は、血液未分化細胞の分化・増殖のメカニズムの解明に有用であるのみならず、本発明のリセプター型チロシンキナーゼを発現している造血幹細胞を含む、単離された血液未分化細胞は、現在行なわれている骨髄移植、末梢血幹細胞移植、臍帯血幹細胞移植等に応用可能である。更に本発明のリセプター型チロシンキナーゼを用いて、少なくともそのリセプター型チロシンキナーゼ活性を阻害又は賦活化するか、或いはその発現を抑制することのできる、血液未分化細胞分化増殖因子等の化学物質をスクリーニングすることもできる。
配列表
配列番号１
配列の長さ：５２２
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
起源
生物名：ヒト
配列
配列番号２
配列の長さ：２６０
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
起源
生物名：ヒト
配列
配列番号３
配列の長さ：９７２
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：アミノ酸
起源
生物名：ヒト
配列
配列番号４
配列の長さ：４２９０及び９８７
配列の型：核酸及びアミノ酸
鎖の数：二本鎖及び一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ to ｍＲＮＡ、及びアミノ酸
起源
生物名：ヒト
ただし遺伝子配列のＸは遺伝子配列が未決定。
配列
配列番号５
配列の長さ：２７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
起源：化学合成法による
配列：
配列番号６
配列の長さ：２４
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
起源：化学合成法による
配列：
配列番号７
配列の長さ：２７及び８
配列の型：核酸及びアミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ及びアミノ酸
起源：化学合成法による
配列：
技術分野
本発明は新規なリセプター型チロシンキナーゼ、及び該リセプター型チロシンキナーゼに対し反応性を有する抗体に関する。更に詳細には、本発明は、血液未分化細胞においては発現するが、血液未分化細胞の分化に伴い発現レベルが低下する、新規なリセプター型チロシンキナーゼ、及び該リセプター型チロシンキナーゼに対し反応性を有する抗体に関する。本発明のリセプター型チロシンキナーゼに対し反応性を有する抗体を用いることにより、生物学的サンプルに含まれ、該リセプター型チロシンキナーゼを表面に有している血液未分化細胞を該生物学的サンプルから単離することができ、又生物学的サンプルに含まれる上記の血液未分化細胞を特異的に検出することができる。更に本発明は、少なくともそのリセプター型チロシンキナーゼ活性を阻害又は賦活化するか、或いはその発現を抑制する化学物質のスクリーニング方法にも関する。更に本発明は、上記のリセプター型チロシンキナーゼをコードするＤＮＡ；複製可能な発現ベクターに上記のリセプター型チロシンキナーゼをコードするＤＮＡが発現可能に組み入れられてなる、複製可能な組換えＤＮＡ；およびその組換えＤＮＡにより形質転換された微生物又は真核細胞；上記のリセプター型チロシンキナーゼをコードするｃＤＮＡを利用して作製したセンスＤＮＡ断片及びアンチセンスＤＮＡ断片並びにそれらの誘導体；及びセンスＲＮＡ断片及びアンチセンスＲＮＡ断片並びにそれらの誘導体に関する。
従来技術
ヒトの血液中には多種類の細胞があり、それぞれが重要な役割を担っている。例えば、赤血球は体内での酸素運搬を、血小板は止血作用を、白血球は免疫系を構成して感染を防御している。これらの多様な細胞は骨髄中の造血幹細胞に由来する。造血幹細胞は体内の種々の造血因子や環境要因により影響を受け、各種血液細胞、破骨細胞、肥満細胞などに分化することが近年明らかにされてきた。この造血因子として、赤血球への分化についてはエリスロポエチン（ＥＰＯ）が、白血球への分化については顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）が発見され、現在すでに臨床応用がなされている。しかし造血幹細胞を含む骨髄細胞、末梢血細胞、臍帯血細胞等の血液未分化細胞の、血液細胞への分化及び増殖のメカニズムについては、未だ不明な点が多い。又、この細胞群を分化及び増殖させる因子はその存在が指摘されているにも関わらず発見されていないものがあり、又そのような因子を発見するための有効な手法も見い出されていない。
近年の研究からチロシンキナーゼが動物、昆虫の発生や分化に大きく関わっていることが明らかになっており、血液未分化細胞の分化においてもチロシンキナーゼが大きく関与していると考えられる。
タンパク質中に存在するアミノ酸であるチロシンを特異的にりん酸化する酵素であるチロシンキナーゼは、細胞外から細胞内へのシグナル伝達、さらに細胞核内における遺伝子の転写調節を司る重要な物質である。また、これらのチロシンキナーゼをコードする遺伝子の転座、点変異により細胞が癌化したりする異常が起こることが知られている。さらに、これらをコードする遺伝子に類似した遺伝子を持つウイルスに感染することにより、細胞が癌化したり、生物個体に癌が生じることが知られている。したがって、チロシンキナーゼを理解し、その遺伝子構造、タンパク質構造を知ることは癌などに代表される細胞の異常増殖状態に起因する病気の診断・治療にとって極めて重要である。たとえば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）などの遺伝子増幅法を利用したり、ＤＮＡ、ＲＮＡプローブを用いたり、制限酵素を用いたりして、チロシンキナーゼの遺伝子の一部もしくは全部を検出することにより、生体中の点変異や遺伝子組換え、発現量の有無を調べ、血液疾患などの病気の診断に利用しうる。
チロシンキナーゼは、タンパク質のチロシン残基をりん酸化する酵素であり、その生理活性部位は約２５０個のアミノ酸残基から構成さている。また、チロシンキナーゼ群のアミノ酸配列の中には、きわめてよく保存された配列があり（Hanks et al. Science 241:42,1988）、保存されたアミノ酸配列に対応するＤＮＡ配列を設計し、ＲＴ（Reverse Transcription）−ＰＣＲ法のプライマーとして利用すれば、新たにチロシンキナーゼ遺伝子断片を得ることができる（Wilks. Methods in Enzymology 200:533,1991）。
リセプター型チロシンキナーゼの一種であるｃ−ｋｉｔは血液未分化細胞の表面に発現しており、ｃ−ｋｉｔに対するモノクローナル抗体は血液未分化細胞の単離の研究、増殖に関する研究に利用され、さらに、血液中のｃ−ｋｉｔ量が特定の白血病の病態と相関していることが指摘され、モノクローナル抗体を利用したｃ−ｋｉｔの血液中の濃度測定が診断薬として開発されようとしている。また、ｃ−ｋｉｔは、肥満細胞増殖因子でなおかつ血液未分化細胞の増殖因子の１つであるステムセルファクター（ＳＣＦ）のリセプターであることがわかっており（Witte. Cell 63: 5,1992）、このリセプター型チロシンキナーゼを介して細胞の分化が制御されている。この様なリセプター型チロシンキナーゼの細胞外部分に特異的に結合するリガンドは、一般に結合にともない細胞内の酵素活性を上昇させ、細胞内に情報を伝達し、その結果、生理活性を発生させる。
発明の概要
血液細胞の分化過程を研究するにあたり、有効な手段はその目的に見合った細胞株、もしくは細胞を利用することにあるが、ヒト巨核芽球白血病細胞株ＵＴ−７（日本国、自治医科大学血液科、小松則夫講師より入手可能）は顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ），インターロイキン３（ＩＬ−３）などの造血因子に依存して増殖する細胞株であり、ＧＭ−ＣＳＦ存在下でＰＭＡ（Ｐｈｏｒｂｏｌ １２−Ｍｙｒｉｓｔａｔｅ １３−Ａｃｅｔａｔｅ）にて刺激すると巨核球に分化し、また、エリスロポエチン存在下で酪酸にて刺激すると赤芽球に分化する多分化能を持った細胞である（Komatsu et al.Cancer Res. 51:341,1991）。したがって、ＵＴ−細胞の利用は血液未分化細胞の分化のメカニズムの研究に有効であると考えられる。
本発明者らは、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて、ヒト巨核芽球白血病細胞株ＵＴ−７から血液未分化細胞の分化に関与するチロシンキナーゼ遺伝子のクローニングを行った。その結果、ＵＴ−７細胞が未分化な状態ではｍＲＮＡ発現が強く認められるが、巨核球への分化に伴い発現が認められなくなる新規なリセプター型チロシンキナーゼを見い出した。この遺伝子断片をプローブとして用い、ヒト胎盤及びヒト胎児肝臓のｃＤＮＡライブラリーから、全長をコードするｃＤＮＡを得、その全塩基配列を決定し、新規なリセプター型チロシンキナーゼポリペプチドを発現する細胞を作製し、さらにこのポリペプチドを単離した。更に、該ポリペプチドに対し反応性を有する抗体を作製し、この抗体を用いて血液未分化細胞を検出、又は単離する方法を確立した。また更に、上記のポリペプチドを用いた新規な化学物質のスクリーニング方法を確立した。
従って、本発明の一つの目的は、血液未分化細胞に特異的に発現する新規なリセプター型チロシンキナーゼ及びそれをコードするＤＮＡを提供することにある。
更に本発明の他の一つの目的は、血液未分化細胞の分化及び増殖のメカニズムの解明に用いることのできる、上記のリセプター型チロシンキナーゼポリペプチドに対し反応性を有する抗体、及び該抗体を用いて該リセプター型チロシンキナーゼポリペプチドを発現している血液未分化細胞を単離又は検出する方法を提供することにある。
更に本発明の他の一つの目的は、リセプター型チロシンキナーゼ活性の阻害又は賦活化能、或いは上記のリセプター型チロシンキナーゼの発現抑制能を指標にして、本発明のリセプター型チロシンキナーゼのシグナル伝達を調節することができる血液未分化細胞分化増殖因子等の化学物質のスクリーニング方法を提供することにある。
更に本発明の他の一つの目的は、本発明のリセプター型チロシンキナーゼ遺伝子発現の確認や、細胞内における遺伝子発現の調整に有利に用いることのできる、センスＤＮＡ断片及びアンチセンスＤＮＡ断片並びにそれらの誘導体、又、センスＲＮＡ断片及びアンチセンスＲＮＡ断片並びにそれらの誘導体を提供することにある。
本発明の上記及びその他の諸目的、該特徴ならびに諸利益は、添付の配列表を参照しながら述べる次の詳細な説明及び請求の範囲の記載から明らかになる。
配列表の簡単な説明
配列表において：
配列番号１のアミノ酸配列は、本発明のリセプター型チロシンキナーゼの、シグナルペプチドを除いた細胞外ドメインの配列であり、配列番号４に示した本発明のリセプター型チロシンキナーゼ全アミノ酸配列のアミノ酸番号第１〜５２２番に相当しており；
配列番号２のアミノ酸配列は、本発明のリセプター型チロシンキナーゼの、細胞内ドメイン内に含まれるリセプター型チロシンキナーゼ酵素活性部分の配列であり、配列番号４に示した本発明のリセプター型チロシンキナーゼ全アミノ酸配列のアミノ酸番号第６００〜８５９番に相当しており；
配列番号３のアミノ酸配列は、本発明のリセプター型チロシンキナーゼの、シグナルペプチドを除いた、細胞外ドメイン、膜透過ドメイン及び細胞内ドメインの全ドメインの配列であり、配列番号４に示した本発明のリセプター型チロシンキナーゼ全アミノ酸配列のアミノ酸番号第１〜９７２番に相当しており；
配列番号４は、本発明のリセプター型チロシンキナーゼの全アミノ酸配列、及び該リセプター型チロシンキナーゼの全ｃＤＮＡ配列であり；
配列番号５は、後述の実施例２で使用するセンスプライマーの塩基配列であり；
配列番号６は、後述の実施例２で使用するアンチセンスプライマーの塩基配列であり；そして
配列番号７は、後述の実施例８で使用する塩基配列及びそれがコードするオリゴペプチドである。
なお、配列番号１〜４及び７に表わされた各アミノ酸配列の左端及び右端はそれぞれＮ末端及びＣ末端であり、又、配列番号４〜７に表わされた塩基配列の左端及び右端はそれぞれ５’末端及び３’末端である。
発明の詳細な説明
即ち、本発明の一つの態様によれば、リセプター型チロシンキナーゼ活性を有し、配列表の配列番号１、２及び３からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含有する単離されたポリペプチド、又は該ポリペプチドの、リセプター型チロシンキナーゼ活性を有する相同変異体が提供される。
又、本発明の他の態様によれば、上記のポリペプチド又は相同変異体をコードする単離されたＤＮＡ，上記のＤＮＡが、複製可能な発現ベクターに発現可能に組み入られてなる複製可能な組換えＤＮＡ，該複製可能な組換えＤＮＡにより形質転換された微生物または真核細胞が提供される。
本発明において、“リセプター型チロシンキナーゼ活性"とは、チロシンキナーゼが本来有している、チロシン残基をりん酸化する酵素活性、リセプター型チロシンキナーゼにおいてその細胞外ドメインがリガンドを認識して結合する機能、及びリセプター型チロシンキナーゼにおいてその細胞内ドメイン中のアミノ酸残基（主にチロシン残基）をりん酸化して、りん酸化した部位において他の細胞内タンパク質と結合して、その細胞内タンパク質を結合部位においてりん酸化する機能のうち少なくとも１つを含むものとする。
本発明のリセプター型チロシンキナーゼは配列表の配列番号１、２及び３からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含有するが、自然界で生じることが知られている種内変異、アレル変異等の突然変異及び人為的に作製可能な点変異による変異によって生じる、リセプター型チロシンキナーゼ活性を有する相同変異体も、本発明のリセプター型チロシンキナーゼに含まれる。
また、アミノ酸レベルの変異がなくとも、自然界から分離した染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡにおいて、遺伝コードの縮重により、そのＤＮＡがコードするアミノ酸配列を変化させることなくＤＮＡの塩基配列が変異した例はしばしば認められる。また５’非翻訳領域及び３’非翻訳領域はポリペプチドのアミノ酸配列の規定に関与しないので、それらの領域のＤＮＡ配列は変異しやすい。このような遺伝コードの縮重によって得られる塩基配列も本発明のＤＮＡに含まれる。
更に、上記したリセプター型チロシンキナーゼ活性を有し配列番号１、２及び３からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含有するポリペプチドの、リセプター型チロシンキナーゼ活性を有する相同変異体をコードするＤＮＡも、本発明のＤＮＡに含まれる。
本発明において、遺伝子操作に必要なｃＤＮＡの作製、ノーザンブロットによる発現の検討、ハイブリダイゼーションによるスクリーニング、組換えＤＮＡの作製、ＤＮＡの塩基配列の決定、ｃＤＮＡライブラリーの作製等の一連の分子生物学的な実験は通常の実験書に記載の方法によって行うことができる。前記の通常の実験書としては、たとえば、Maniatisらの編集したMolecular Cloning, A laborartorymanual, 1989, Eds., Sambrook,J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., Cold Spring Harbor Loboratory Pressを挙げることができる。
本発明のリセプター型チロシンキナーゼのｃＤＮＡを得る工程は、後述する実施例１〜６に記載した通りである。即ち、まず、公知のチロシンキナーゼ遺伝子に特徴的なアミノ酸配列に対応したプライマーを用いて、ＰＣＲを行う。ＰＣＲ用プライマーの作製並びにＰＣＲはＷｉｌｋｓの方法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1603, 1989）で行うことができる。すなわち、市販のＤＮＡ合成機で適当なオリゴヌクレオチドを作成し、精製してＰＣＲ用プライマーを得る。次いでＰＣＲ用プライマーを、上記したヒト巨核芽球白血病細胞株ＵＴ−７のｃＤＮＡ溶液に加えＰＣＲを行い、得られるＰＣＲ産物をクローニングし遺伝子配列を決定したところ、配列表の配列番号４の塩基配列の第２６４２番から第２８１２番に相当していた。この配列はチロシンキナーゼ酵素活性部位の中央部分をコードしており、細胞内シグナル伝達に重要な役割を果たすアミノ酸配列をコードする。
本発明のリセプター型チロシンキナーゼｃＤＮＡ全配列のクローニングには、前記の方法にてクローニングしたｃＤＮＡ断片をアイソトープ標識、又は非アイソトープ標識し、ＵＴ−７細胞株のｃＤＮＡライブラリーをハイブリダイゼーションなどの方法にてスクリーニングすることによって得ることができる。アイソトープの標識法としては、たとえば［32Ｐ］γ−ＡＴＰとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて末端をラベルする方法や、他のニックトランスレーション法またはプライマー伸長法などによる標識法が利用できる。
こうして得られた本発明のリセプター型チロシンキナーゼのｃＤＮＡ塩基配列を、配列表に配列番号４としてそれがコードするアミノ酸配列と共に示した。塩基配列は４０９塩基よりなる５’非翻訳領域、それに続く２９６１塩基よりなる本発明のリセプター型チロシンキナーゼをコードする領域、及びさらにそれに続く９１９塩基よりなる３’非翻訳領域からなる。また、本発明のリセプター型チロシンキナーゼのアミノ酸配列は、配列表の配列番号４のアミノ酸配列の−１５番から−１番にあたる１５アミノ酸から構成されるシグナルペプチド、配列表の配列番号４のアミノ酸配列の１番から５２２番にあたる５２２アミノ酸で構成される細胞外部分、配列表の配列番号４のアミノ酸配列の５２３番から５４８番にあたる２６アミノ酸から構成される細胞膜貫通部分、配列表の配列番号４のアミノ酸配列の５４９番から９７２番にあたる４２４アミノ酸から構成される細胞内部分、より構成される。さらに、細胞内部分においては配列表の配列番号４のアミノ酸配列の６００番から８５９番にあたる２６０アミノ酸はチロシンキナーゼ酵素活性部分である。尚、本発明のリセプター型チロシンキナーゼｃＤＮＡの全塩基配列を含むベクターｐＢＳＲＴＫＦＵＬＬを大腸菌ＪＭ１０９（日本国、東洋紡社製）に遺伝子導入した形質転換細胞は、日本国通産省工業技術院生命工学工業技術研究所において寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４８８３として１９９４年１１月１１日に寄託されている。
尚、本発明のリセプター型チロシンキナーゼのｃＤＮＡは、ＵＴ−７以外にも、血液細胞株であるヒト慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２（日本国理化学研究所、細胞開発銀行より入手可能、Ｎｏ．ＲＣＢ００２７）及びヒト急性巨核芽球性白血病細胞株ＣＭＫ（Blood 74:42,1989）等から、又非血液細胞株では肝細胞ガン細胞株Ｈｅｐ３Ｂ［アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（以下ＡＴＣＣと示す）より入手可能、ＨＢ８０６４］及びヒト胎児肺繊維芽細胞株ＭＲＣ−５（日本国理化学研究所、細胞開発銀行より入手可能、Ｎｏ．ＲＣＢ０２１１）等から、後述する実施例１〜６と実質的に同様の操作で得ることができる。
配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは本発明のリセプター型チロシンキナーゼの細胞外部分のシグナルペプチドを除いた部分のアミノ酸配列を有するポリペプチドに相当し、配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは本発明のリセプター型チロシンキナーゼの細胞内チロシンキナーゼ酵素活性部分のアミノ酸配列を有するポリペプチドに相当する。また、配列表の配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは本発明のリセプター型チロシンキナーゼのシグナルペプチドを除いた部分のアミノ酸配列を有するポリペプチドに相当する。
本発明のリセプター型チロシンキナーゼペプチドは、すでにクローニングされているリセプター型チロシンキナーゼであるヒトＥＰＨ（Hirai et al., Science, 238, 1717-1720, 1987）、ヒトＥＣＫ（Lindberg and Hunter, Mol. Cell. Biol., 10, 6316-6324, 1990）、ラットＥＬＫ（Lhotak et al., Mol. Cell. Biol., 11, 2496-2502, 1991）、ヒトＨＥＫ（Wicks et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA., 89, 1611-1615, 1992）、マウスＳＥＫ（Gilardi-Hebenstreit et al., Oncogene, 7, 2499-2506, 1992）、チキンＣｅｋ−５（Pasquale, Cell Regulation, 2, 523-534, 1991）と類似した構造を持つが、そのアミノ酸配列のホモロジーは最も高い場合のＥＬＫで５６．３％であり、これらの遺伝子とは全く異なった新規なアミノ酸配列を有する。
本発明のリセプター型チロシンキナーゼは、公知の遺伝子工学的手法により、リセプター型チロシンキナーゼ活性を有し、且つ配列表の配列番号１、２及び３からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡか、又は該ポリペプチドの、リセプター型チロシンキナーゼ活性を有する相同変異体をコードするＤＮＡを、複製可能な発現ベクターに発現可能に組み込み、微生物または真核細胞（たとえば昆虫細胞や動物細胞）を宿主とする形質転換体を得て、その形質転換体から得ることができる。本発明のリセプター型チロシンキナーゼをより安定な条件で産生させたい場合には真核細胞、特に動物培養細胞を宿主として用いるのが好ましい。
本発明のリセプター型チロシンキナーゼ、それをコードするＤＮＡ及び該リセプター型チロシンキナーゼを産生する形質転換体は、リセプター型チロシンキナーゼの基礎的な解析研究から、リセプター型チロシンキナーゼを介したシグナル伝達系を特異的に制御する抗癌剤を初めとする医薬品などの医療分野に関わる化学品の開発、ドラッグデザインの研究に使用することができる。
上記したように、本発明のリセプター型チロシンキナーゼ遺伝子のｍＲＮＡの発現は、上記したヒト巨核芽球白血病細胞株ＵＴ−７が未分化な条件ではｍＲＮＡの発現が見られるが、巨核球へと分化するにともないｍＲＮＡの発現が見られなくなり、他の巨核芽球細胞株においても同様な現象が確認できる。
本発明のリセプター型チロシンキナーゼの血液未分化細胞における発現を検出する方法としては、配列表の配列番号４の遺伝子配列の一部もしくは全配列を鋳型として設計した合成オリゴヌクレオチドを用いたノーザンブロットでも可能であるが、より簡便に検出するには本発明のリセプター型チロシンキナーゼに対し反応性を有する抗体を用いた方法がよい。モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の作製は配列表の配列番号３に示したアミノ酸配列の一部もしくは全部を免疫原として常法にて作成可能であり、特に細胞外部分（配列番号１）に対する抗体は細胞を生きた状態で検出可能であり、より有効な手段である。また更に、後述するように、本発明のリセプター型チロシンキナーゼに対し反応性を有する抗体を用いて、本リセプター型チロシンキナーゼを発現している血液未分化細胞を効率的に単離することもできる。
即ち、本発明の更に他の一つの態様によれば、リセプター型チロシンキナーゼ活性を有し、配列表の配列番号１、２及び３からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含有するポリペプチドか、又は該ポリペプチドの、リセプター型チロシンキナーゼ活性を有する相同変異体に対し、反応性を有する抗体が提供される。
本発明のリセプター型チロシンキナーゼに特異的な抗体を作製する方法の一例を、後述する実施例８に示す。この様にして作製したモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの３株３８−１Ｅ、６６−３Ａおよび６８−３Ａは、日本国通産省工業技術院生命工学工業技術研究所において、それぞれ、寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４８８４、ＦＥＲＭ ＢＰ−４８８５、ＦＥＲＭ ＢＰ−４８８６として１９９４年１１月１１日に各々寄託されている。
本発明のリセプター型チロシンキナーゼの細胞外ドメインに対し反応性を有する抗体の作製は、上記のようにして得られたポリペプチドを免疫原として、常法により本発明のリセプター型チロシンキナーゼを特異的に認識するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作成できる。
このモノクローナル抗体から、モノクローナル抗体のアミノ酸配列をコードする遺伝子、特に抗体遺伝子の可変領域をＰＣＲ法などの遺伝子工学的な方法で分離して、マウス、ヒト、ラット等の抗体をコードする遺伝子に遺伝子工学的な手法によってつなぎ、本発明のリセプター型チロシンキナーゼを認識するキメラ抗体をコードする遺伝子を得て、これを発現ベクターにつなぎ、動物細胞などの真核細胞、バクテリアなどの原核細胞に遺伝子導入して、本発明のリセプター型チロシンキナーゼを認識するキメラ抗体を産生させることができる。さらに、抗体の形状としては抗体全体でもかまわないが、抗体の可変領域のみを発現させる形にしたＦａｂ型、ファージなどを利用した一本鎖ペプチド型などの形で発現させることが可能である。本発明の抗体には、上記したキメラ抗体やＦａｂ型、一本鎖ペプチド型等のリコンビナント抗体及びそれらのアナログも含まれる。
本発明の抗体は、所望ならば、シャーレや磁気ビーズ等の固体支持体に固定した形で使用してもよい。
このようにして作製した抗体、特に細胞外部分を抗原として認識するモノクローナル抗体は、末梢血、骨髄液、臍帯血等に浮遊する血液細胞中に少量存在する血液未分化細胞を識別できるため、血液未分化細胞の単離や検出に有利に利用できる。
即ち、本発明の更に他の態様によれば、リセプター型チロシンキナーゼ活性を有するポリペプチドを含む体細胞を単離する方法にして、
（１）リセプター型チロシンキナーゼ活性を有し、配列表の配列番号１及び３からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含有するポリペプチド、又は該ポリペプチドの、チロシンキナーゼ活性を有する相同変異体を抗原として表面に有する体細胞を含む生物学的サンプルに、上記した本発明の抗体を、該抗原と該抗体とが抗原抗体複合体を形成する条件下で接触させ、それによって抗原抗体反応混合物を得；そして
（２）該ポリペプチド又は該相同変異体を抗原抗体複合体の形で含む上記の体細胞を、抗原抗体反応混合物から単離する、
ことを包含する方法が提供される。
上記の生物学的サンプルの例としては、血液未分化細胞を含有する水性懸濁液や血液未分化細胞を含有する体液よりなるサンプル等が挙げられる。
また、上記工程（２）の後、抗体を抗原抗体複合体から分離して、抗体と複合していない形の本発明のリセプター型チロシンキナーゼを含む体細胞を得ることもできる。
抗体を抗原抗体複合体から分離する方法としては、例えば、たたくなどの物理的な刺激、パパイン、キモパパイン、トリプシン等のプロテアーゼなどの酵素処理、溶液のＰＨや、塩濃度の変化などにより抗体を抗原抗体複合体から外す方法がある。また、抗原又は抗体を酵素により消化して本発明のリセプター型チロシンキナーゼを発現している細胞を分離することもできる。
血液未分化細胞の単離の方法としては、細胞を該モノクローナル抗体で染色してフローサイトメーターにより単離する方法があるが、より大量且つ簡便に行うためには、抗体をシャーレ等の基材表面の上に固定したものを用いるパンニング法、磁気ビーズなどを用いるカラム法等による方法が望ましいが、これらの方法に限定されるものではない。
上記の方法は、血液未分化細胞の分化・増殖のメカニズムの解明に有用であるのみならず、本発明のリセプター型チロシンキナーゼを発現している造血幹細胞を含む、上記のようにして得られる単離された血液未分化細胞は、後述する実施例９に示すように、抗ＣＤ３４抗体を用いて単離された血液未分化細胞と同等またはより高いコロニー形成能を有しており、現在行なわれている骨髄移植、末梢血幹細胞移植、臍帯血幹細胞移植等に応用可能である。
また、本発明の更に他の態様によれば、リセプター型チロシンキナーゼ活性を有するポリペプチドを検出する方法にして、
（１）リセプター型チロシンキナーゼ活性を有し、配列表の配列番号１、２及び３からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含有するポリペプチド、又は該ポリペプチドの、チロシンキナーゼ活性を有する相同変異体を抗原として含む生物学的サンプルに、上記した本発明の抗体を、該抗原と該抗体とが抗原抗体複合体を形成する条件下で接触させ、それによって抗原抗体反応混合物を得；そして
（２）該ポリペプチド又は該相同変異体を抗原抗体複合体の形で検出する、
ことを包含する方法が提供される。
上記の生物学的サンプルの例としては、体細胞の単離方法と同様、血液未分化細胞を含有する水性懸濁液や血液未分化細胞を含有する体液よりなるサンプル等がある。
上記の検出方法としてはフローサイトメーターによる方法が一般的であるが、他の公知の抗原抗体反応を利用する検出法も利用できる。また、血清、血漿中に存在する本発明のリセプター型チロシンキナーゼの検出は、リセプター型チロシンキナーゼであるｃ−ｅｒｂＢ２やｃ−ｋｉｔが腫瘍マーカーとして有効であるとの報告から、同様に腫瘍マーカーの検出に利用できる可能性がある。その場合には、本発明のリセプター型チロシンキナーゼに対する抗原認識部位の異なる２種の抗体を用いたサンドイッチ型酵素抗体法が望ましいと考えられる。
また、本発明の更に他の態様によれば、リセプター型チロシンキナーゼ活性を阻害又は賦活化することができるか、或いは、リセプター型チロシンキナーゼ活性を有するポリペプチドの発現を抑制する化学物質をスクリーニングする方法にして、
（１）サンプル材料を、リセプター型チロシンキナーゼ活性を有し、配列番号１、２及び３からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含有する単離されたポリペプチド、又は該ポリペプチドの、リセプター型チロシンキナーゼ活性を有する相同変異体に接触させ、該ポリペプチド又は該相同変異体が有するリセプター型チロシンキナーゼ活性に対する阻害能又は賦活化能、或いは該ポリペプチド又は該相同変異体の発現抑制能を指標にして、少なくとも該ポリペプチド又は該相同変異体の有するリセプター型チロシンキナーゼ活性を阻害又は賦活化させるか、或いは該ポリペプチド又は該相同変異体の発現を抑制する化学物質を検出し；そして
（２）検出した化学物質をサンプル材料から単離する、
ことを包含する方法が提供される。
この方法によって、本発明のリセプター型チロシンキナーゼに結合して、該リセプター型チロシンキナーゼの自己りん酸化（autophosphorylation）を抑制するか又は促進することによりリセプター型チロシンキナーゼ活性を阻害又は賦活化することができるか、或いは、本発明のリセプター型チロシンキナーゼの発現を抑制する化学物質、例えば後述の実施例１０に示すような巨核球分化因子であるインターロイキン１α（ＩＬ−１α）等のスクリーニングが可能である。また、本発明のリセプター型チロシンキナーゼのシグナル伝達を調節することができるために医薬品としての有用性が期待される未知の血液未分化細胞分化増殖因子等の新規な化学物質をスクリーニングできる可能性もある。
配列表の配列番号４の配列で表される塩基配列の一部と対をなす単離されたアンチセンスＤＮＡ断片及びアンチセンスＲＮＡ断片並びにそれらがメチル化、メチルフォスフェート化、脱アミノ化、又はチオフォスフェイト化された誘導体は、血液未分化細胞の分化の研究や血液未分化細胞の分化制御剤などの医薬品に利用可能である。又、配列表の配列番号４の塩基配列の一部を有する単離されたセンスＤＮＡ断片及びアンチセンスＤＮＡ断片あるいはそれらの誘導体、又それに対応する配列を有する単離されたセンスＲＮＡ断片及びアンチセンスＲＮＡ断片あるいはそれらの誘導体、により細胞内の発現を調節する事も可能である。さらに、これらのＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片及びそれらの誘導体を用いて、後述する実施例７に示したように本発明のリセプター型チロシンキナーゼのｍＲＮＡの発現を確認する事ができる。本発明の単離されたセンスＤＮＡ断片、アンチセンスＤＮＡ断片、センスＲＮＡ断片、及びアンチセンスＲＮＡ断片並びにそれらの誘導体は１２ｍｅｒ以上であればよいが、１４ｍｅｒから１６ｍｅｒ以上がより望ましい。
発明を実施するための最良の形態
以下実施例によって、本発明をより具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例になんら限定されるものではない。
実施例１ ヒト巨核芽球白血病細胞株ＵＴ−７のＰｏｌｙ（Ａ） + ＲＮＡの調製
ＵＴ−７細胞（日本国、熊本大学医学部遺伝発生医学研究施設分化制御部門須田年生教授もしくは日本国、自治医科大学血液科小松則夫講師より入手可能）の培養、継代は、培地として牛胎児血清（ＦＣＳ、以下本実施例で使用したＦＣＳは全てオーストラリア国、フィルトロン社製）を１０％含むイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）を用い、ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ｈＧＭ−ＣＳＦ）を２ｎｇ／ｍｌとなるように加え、ＣＯ2インキュベーターにて３７℃の条件で行った。未刺激細胞は、同じ条件で培養した細胞を用いた。巨核球に分化させる際には、細胞濃度２×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌに希釈し、ヒト顆粒球単球コロニー形成因子（ｈＧＭ−ＣＳＦ）を２ｎｇ／ｍｌとなるように加え、さらにフォルボール １２−ミリステート １３−アセテート（ＰＭＡ）（米国、シグマ社製）を１０ｎｇ／ｍｌとなるように加え、３日間培養後細胞を回収した。これらの各条件で培養した細胞を各々細胞数１×１０8個回収し、カルシウム、マグネシウムを含まないダルベッコ改変リン酸バッファー（ＰＢＳ（−）、日本国、ニッスイ社製）にて３回洗浄し、ＲＮＡの抽出に用いた。
回収した細胞から塩化リチウム／尿素法（Ｌｉｔｈｉｕｍ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ／Ｕｒｅａ法：Eur.J.Biochem.107:303(1980)）にて全ＲＮＡを抽出した。次に、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ ３０（日本国、宝酒造社製）にて、Ｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡを分離・精製した。
実施例２ チロシンキナーゼに特異的なプライマーの作成
Ｗｉｌｋｓの方法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1603,1989）に従い、公知のチロシンキナーゼに比較的共通するアミノ酸配列を有するチロシンキナーゼのサブドメイン７と９に対応し、かつ制限酵素の認識部位を連結した混合プライマー、すなわちセンスプライマーＰＴＫＩ：5'-TTGTCGACAC(AC)G(AG)GA(CT)(CT)T(CG)GC(ACGT)GC(ACGT)(AC)G-3'、（２７ｍｅｒ：制限酵素の認識部位としてＳａｌＩ部位が付加されている、配列表の配列番号５に記載）およびアンチセンスプライマーＰＴＫＩＩ：3'-CT(AG)CA(CG)ACC(AT)(CG)(AG)A(AT)ACCTTAAGGT-5'（２４ｍｅｒ：制限酵素の認識部位としてＥｃｏＲＩ部位が付加されている、配列表の配列番号６に記載）を用い以下のＰＣＲを行った。
合成オリゴヌクレオチドは固相法を原理とする全自動ＤＮＡ合成機を使用して作成した。全自動ＤＮＡ合成機としては米国のアプライドバイオシステム社３９１ＰＣＲ−ＭＡＴＥを使用した。ヌクレオチド、３'-ヌクレオチドを固定した担体、溶液、および試薬は同社の指示に従って使用した。所定のカップリング反応を終了し、トリクロロ酢酸で５’末端の保護基を除去したオリゴヌクレオチド担体を濃アンモニア中にて室温で１時間放置することにより担体からオリゴヌクレオチドを遊離させた。次に、核酸及びリン酸の保護基を遊離させるために、核酸を含む反応液を、封をしたバイアル内において濃アンモニウム溶液中で５５℃にて１４時間以上放置した。担体及び保護基を遊離した各々のオリゴヌクレオチドの精製を米国のアプライドバイオシステム社のＯＰＣカートリッジを使用して行い、２％トリフロオロ酢酸で脱トリチル化した。精製後のプライマーは最終濃度が１μｇ／μｌとなるように脱イオン水に溶解してＰＣＲに使用した。
実施例３ ｃＤＮＡの合成
実施例１により得られたＰｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡを用いてｃＤＮＡの合成を行った。すなわち、Ｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡの２μｇを脱イオン水１２．３μｌに溶解し、１０×緩衝液（５００ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１５ｍＭ ＭｇＣｌ2０．０１％ ゼラチン）２μｌ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（日本国、宝酒造社製）４μｌ、前述のチロシンキナーゼに特異的なアンチセンスプライマーＰＴＫＩＩ（１μｇ／μｌ、配列表の配列番号６に記載）１μｌ、アビアンミエロブラストシスウイルス逆転写酵素（ａｖｉａｎ ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ：Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ 社：３２Ｕ／μｌ）０．２μｌ、及びＲＮａｓｅインヒビター（独国、ベーリンガー社製：４０Ｕ／μｌ）０．５μｌ加えて３７℃で７５分間放置後、６５℃で１０分間放置した。
実施例４ チロシンキナーゼに特異的なプライマーによるＰＣＲ
ＰＣＲによる増幅は以下のように行った。実施例３で得られたｃＤＮＡ溶液２０μｌを使用し、１０×緩衝液（５００ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．０１％ ゼラチン）８μｌ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（日本国、宝酒造社製）６．４μｌ、前述のチロシンキナーゼに特異的なセンスプライマーＰＴＫＩ（１μｇ／μｌ、配列表の配列番号５に記載）１．５μｌ、及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ、米国、パーキンエルマー社製：５Ｕ／μｌ）０．２μｌを加え、最後に脱イオン水を加えて全量を１００μｌとして、９４℃で１分間、３７℃で２分間、７２℃を３分間からなる工程を１サイクルとして、この工程を４０サイクル行い、最後に７２℃にて７分間放置してＰＣＲを行った。このＰＣＲ産物の一部を２％アガロースゲル電気泳動を行い、エチジュウムブロマイドにて染色後、紫外線下で観察し、約２１０ｂｐのｃＤＮＡが増幅されていることを確認した。
実施例５ ＰＣＲ産物のクローニング及び塩基配列の決定
ＰＣＲ産物の全量を低融点アガロースにて作成した２％アガロースゲルにて電気泳動し、エチジュウムブロマイドにて染色後、紫外線照射下にて約２１０ｂｐのバンドを切り出し、ゲルと同体積の蒸留水を加え、６５℃にて１０分間加熱し、ゲルを完全に溶かした後、等量のＴＥ飽和フェノール（日本国、日本ジーン社製）を加えて、１５０００ｒｐｍ５分間遠心分離後上層を分取し、更にＴＥ飽和フェノール：クロロフォルム（１：１）溶液、次にクロロフォルムにて同様な分離操作を行った。最終的に得られた溶液からｃＤＮＡをエタノール沈澱して回収した。回収したｃＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ（日本国、宝酒造社製）及びＳａｌＩ（日本国、宝酒造社製）にて消化したのち、ベクターへの組み込みに用いた。
ベクターとしてはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（米国、ストラタジーン社製、以下ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔと示す）を用い、先のｃＤＮＡを組み込む前に、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩにて消化した。これらの処理を行ったベクターと先のｃＤＮＡのモル比が１：５となるように混ぜ合わせて、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（米国、ニューイングランドバイオラボ社製）にてベクターにｃＤＮＡを組み込んだ。ｃＤＮＡが組み込まれたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔを大腸菌ＪＭ１０９に遺伝子導入し、アンピシリンを５０μｇ／ｍｌ含むＬ−Ｂｒｏｔｈ半固型培地のプレートに蒔き、１２時間程度３７℃に放置し、現れてきたコロニーをランダムに選択し、ｃＤＮＡが組み込まれていることを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩにて消化して、２１０ｂｐのｃＤＮＡが切れ出されてくることをにより確認し、確認されたクローンについて、組み込まれているｃＤＮＡの塩基配列を米国、アプライドバイオシステム社の螢光シークエンサー モデル３７３Ａにて決定した。その結果、未刺激のＵＴ−７細胞からはクローニングされたが、巨核球に分化された場合にはクローニングされなかったチロシンキナーゼ遺伝子断片を得た。この遺伝子断片は配列表の配列番号４の２６４２番目から２８１２番目であった。
実施例６ ｃＤＮＡライブラリーの作成及び新規チロシンキナーゼ遺伝子の全長クローニング及びその解析
前述の方法にて分離精製された未刺激状態のＵＴ−７細胞のＰｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡを用いてｃＤＮＡライブラリーを作成した。ＵＴ−７ｃＤＮＡライブラリーの作成にはｐＣＤＭ８ベクターｃＤＮＡライブラリー作成キット（オランダ国、インビトロゲン社製）を用い、添付の作成方法に従って作成した。さらに、前述の方法に従ってヒト胎盤よりＰｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡを精製し、ｃＤＮＡライブラリーを作成した。ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーの作成にはλＺＡＰＩＩｃＤＮＡライブラリー作成キット（米国、ストラタジーン社製）を用い、添付の作成方法に従って作成した。
次に、これらのｃＤＮＡライブラリーからコロニーハイブリダイゼーションもしくはプラークハイブリダイゼーションにて全長ｃＤＮＡを持ったクローンの検索を５×１０5相当のコロニーもしくはプラークから行った。出現したコロニーもしくはプラークをナイロンフィルター（Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋：英国、アマシャム社製）に転写し、転写したナイロンフィルターをアルカリ処理（１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ ＮａＯＨを染み込ませたろ紙上に７分間放置）し、次いで中和処理（１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、１ｍＭ ＥＤＴＡを染み込ませたろ紙上に３分間放置）を２回行い、次にＳＳＰＥ溶液（０．３６Ｍ ＮａＣｌ、０．０２Ｍ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．７）、２ｍＭ ＥＤＴＡ）の２倍溶液中で５分間振とう後洗浄し、風乾した。その後、０．４Ｍ ＮａＯＨを染み込ませたろ紙上に２０分間放置し、５倍濃度のＳＳＰＥ溶液で５分間振とう後洗浄し、再度風乾した。このフィルターを用いて放射性同位元素32Ｐにて標識されたｃＤＮＡプローブにてスクリーニングを行った。
放射性同位元素32Ｐにて標識されたｃＤＮＡプローブは以下のように作成した。すなわち、本発明のリセプター型チロシンキナーゼの部分ｃＤＮＡが組み込まれたｐＢｌｕｅ−ｓｃｒｉｐｔより、ＳａｌＩとＥｃｏＲＩにてベクターより切り出し、低融点アガロースゲルからＤＮＡ断片を精製回収した。得られたｃＤＮＡ断片をＤＮＡラベリングキット（Ｍｅｇａｐｒｉｍｅ ＤＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ：英国、アマシャム社製）を用いて標識した。すなわち、ＤＮＡ２５ｎｇにプライマー液５μｌ及び脱イオン水を加えて全量を３３μｌとして沸騰水浴を５分間行い、その後、ｄＮＴＰを含む反応緩衝液１０μｌ、α−32Ｐ−ｄＣＴＰ５μｌ、及びＴ４ＤＮＡポリヌクレオチドキナーゼ溶液２μｌを加えて、３７℃で１０分間水浴し、更にその後、セファデックスカラム（Ｑｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０：独国、ベーリンガーマンハイム社製）で精製し、５分間沸騰水浴をしたのち、２分間氷冷後使用した。
前述の方法にて作成したフィルターを、各々の成分の最終濃度が５倍濃度のＳＳＰＥ溶液、５倍濃度のデンハルト液、０．５％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、及び１０ｍｇ／ｍｌの沸騰水浴により変性したサケ精子ＤＮＡであるプレハイブリダイゼーション液中に浸し、６５℃にて２時間振とうしたのち、前述の方法で32標識されたプローブを含むプレハイブリダイゼーション液と同一組成のハイブリダイゼーション液に浸し、６５℃にて１６時間振とうし、ハイブリダイゼーションを行った。
次に、フィルターを０．１％ＳＤＳを含むＳＳＰＥ溶液に浸し、６５℃にて振とうし２回洗浄後、さらに０．１％ＳＤＳを含む１０倍希釈したＳＳＰＥ溶液に浸し、６５℃にて４回洗浄した。洗浄を終了したフィルターを増感スクリーンを使用して、オートラジオグラフィーを行った。その結果、強く露光された部分のクローンを拾い、再度コロニー及びプラークを蒔き直し前述の方法にてスクリーニングを行い、完全に単独のクローンを分離した。
ＵＴ−７のライブラリーから分離されたクローンのうちインサートサイズの大きい２クローンを前掲のＭａｎｉａｔｉｓらの実験書に掲載の方法に従いプラスミドを精製し、制限酵素ＸｈｏＩにて消化し、低融点アガロース電気泳動にてｃＤＮＡを精製し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに組み込んだ。組み込まれたｃＤＮＡのサイズはおよそ３．０ｋｂｐ及び１．６ｋｂｐであった。また、ヒト胎盤ライブラリーから分離されたクローンのうちインサートサイズの大きい２クローンをＭａｎｉａｔｉｓらの実験書に掲載の方法に従いファージＤＮＡを精製し、制限酵素ＥｃｏＲＩにて消化し、同様にｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに組み込んだ。組み込まれたｃＤＮＡのサイズはおよそ３．８ｋｂｐ（ｃｌｏｎｅ２）及び３．５ｋｂｐ（ｃｌｏｎｅ９）であった。
これらのクローンのｃＤＮＡの両端の遺伝子配列をスウェーデン国、ファルマシア社ＡＬＦＤＮＡシークエンサーおよびスウェーデン国、ファルマシア社ＡＬＦシークエンサー用ラベリングキットを用い、添付の使用説明書に従い決定した。さらに全長の塩基配列決定を行うため日本国、宝酒造株式会社キロシークエンス用デリーションミュータント・キットを用い、添付の使用説明書に従い、デリーションミュタントを作成し、ｃＤＮＡの両方向についての塩基配列を決定した。
その結果、全長のｃＤＮＡがクローニングされていないことが判明したため、さらにｃｌｏｎｅ２の制限酵素ＸｈｏＩサイトから５’部分の約２００ｂｐ（配列表の配列番号３の４８４番から６９６番に当たる）を用いて、市販のヒト胎児肝臓ｃＤＮＡライブラリーλｇｔ１１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を同様な方法にてスクリーニングした結果、ＸｈｏＩサイトより５’方向のｃＤＮＡを含むクローン（ｃｌｏｎｅ Ｍ１、配列表の配列番号３の１番から１２１４番目に当たる）がクローニングでき、遺伝子配列をシークエンスして、本発明の全長ｃＤＮＡ遺伝子の塩基配列が決定された。
全長の遺伝子配列を持ったＤＮＡの作製は配列表の配列番号３に記載のＤＮＡのＸｈｏＩサイトを用いて上記のｃｌｏｎｅ２とｃｌｏｎｅＭ１のつなぎ、ライブラリーのリンカーのＥｃｏＲＩサイトを用いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＥｃｏＲＩサイトにサブクローニングして作製し、最終的に配列表の配列番号４に記載した本発明のリセプター型チロシンキナーゼの全ｃＤＮＡの塩基配列を有するＤＮＡ断片を含むベクターｐＢＳＲＴＫＦＵＬＬが完成した。尚、この遺伝子を含むベクターｐＢＳＲＴＫＦＵＬＬを大腸菌ＪＭ１０９（日本国、東洋紡社製）に遺伝子導入した形質転換細胞は、日本国通産省工業技術院生命工学工業技術研究所において寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４８８３として１９９４年１１月１１日に寄託した。
実施例７ ノーザンブロッティングによるｍＲＮＡの発現の確認
本新規リセプター型チロシンキナーゼのｍＲＮＡの発現を調べるため、あらかじめｍＲＮＡが転写されているフィルターである。米国、クローンテック社 Ｈｕｍａｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔ、Ｈｕｍａｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔ ＩＩ、Ｈｕｍａｎ Ｆｅｔａｌ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔ並びに実施例１に示した方法にて回収されたｍＲＮＡをアガロースゲル電気泳動し、Ｚｅｔａ−Ｐｒｏｂ（米国、バイオラッド社製）にトランスファーして作成したフィルターを用い、ｐＢＳＲＴＫＦＵＬＬを制限酵素ＳｍａＩにて消化して、１％のアガロースゲルで電気泳動を行い、７４６ｂｐの断片（配列表の配列番号４の６１０番目から１３５５番目）を切り出し、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ ＩＩ（米国、ＢＩＯ１０１社製）を用いて精製した遺伝子断片を前掲のＤＮＡラベリングキット（ＭｅｇａＰｒｉｍｅ ＤＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ：英国、アマシャム社製）にて前述の方法で32Ｐ標識し発現を調べた。
その結果、ヒト成人組織のうち心臓、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、すい臓、脾臓、前立腺、卵巣で発現が認められた。しかしながら、脳、胸腺、精巣、小腸、大腸、末梢血リンパ球においては発現が認められなかった。また、ヒト胎児組織では心臓、肺、肝臓、腎臓において発現が認められたが、脳においては発現が認められなかった。
また、血液細胞株では、前述の骨髄巨核芽球性白血病細胞株ＵＴ−７、ヒト慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２（日本国、理化学研究所、細胞開発銀行より入手可能、Ｎｏ．ＲＣＢ００２７）及びヒト急性巨核芽球性白血病細胞株ＣＭＫ（Blood 74:42,1989）に発現されており、非血液細胞株では肝細胞ガン細胞株Ｈｅｐ３Ｂ［アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（以下ＡＴＣＣと示す）より入手可能、ＨＢ８０６４］及びヒト胎児肺繊維芽細胞株ＭＲＣ−５（日本国、理化学研究所、細胞開発銀行より入手可能、Ｎｏ．ＲＣＢ０２１１）に発現が認められた。さらに、ＵＴ−７、Ｋ５６２、ＣＭＫに於いてはＰＭＡによる細胞分化を起こさせるとその発現がほぼ完全に認められなくなることが確認された。しかしながら、ヒトさい帯血から樹立された細胞株ＫＭＴ−２（日本国、理化学研究所、細胞開発銀行より入手可能、Ｎｏ．ＲＣＢ０７１２），ヒト慢性骨髄性白血病細胞株ＫＧ１ａ（ＡＴＣＣより入手可能、ＣＣＬ２４６．１）、急性リンパ球性白血病細胞株ＭＯＬＴ−４（ＡＴＣＣより入手可能、ＣＣＬ１５８２）に於いては発現が認められなかった。
以上のことから、この遺伝子は血液細胞が未分化の状態において発現されており、血液細胞が分化することにともない、その発現が消失することが推察された。したがって、本発明のリセプター型チロシンキナーゼは血液幹細胞の維持、巨核球分化に関連すると考えられた。
実施例８ 本発明のリセプター型チロシンキナーゼ発現細胞株の作成及び本発明のリセプター型チロシンキナーゼを認識する抗体の作成
得られた配列表の配列番号１のアミノ酸配列を持つポリペプチドをコードするＤＮＡ、配列表の配列番号２のアミノ酸配列を持つポリペプチドをコードするＤＮＡ、及び配列表の配列番号３のアミノ酸配列を持つポリペプチドをコードするＤＮＡの上流にＳＶ４０ウィルスの初期プロモーター及び下流にＳＶ４０ウィルスのPoly(A)+シグナル、さらにジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子をつないだ発現プラスミドを構築した。このプラスミドを精製し、その２０μｇをグルコース液に懸濁したＣＨＯ／ｄｈＦｒ-細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ９０９６）に導入した。導入には米国、バイオラド社のジーンパルサーを用い、６００Ｖの電圧をかけることで、遺伝子導入を行った。細胞は２日間、１０％牛胎児血清を含む培地で培養後、メトトキセート（ＭＴＸ）剤を含む培地（ダルベッコＭＥＭ，１０％透析牛胎児血清）で培養し、遺伝子導入による形質転換細胞を選択した。この細胞からｍＲＮＡを抽出し、オリゴｄＴゲルカラムによりＰｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡを得て、電気泳動後、フィルターに電気的に移し、固定後常法により、本発明のリセプター型チロシンキナーゼ遺伝子でハイブダイズしたところ、ｍＲＮＡが発現していることを確認した。これにより、本発明のリセプター型チロシンキナーゼの細胞外部分、酵素活性部分、及び全長を発現している形質転換細胞を得たことを確認した。
また、これらのタンパクの発現を確認するため、配列表の配列番号１、配列番号２、及び配列番号３のアミノ酸配列のＣ末端部から２０アミノ酸部分のアミノ酸配列を持ったポリペプチドを常法に従いペプチド合成機により作成し、かぶとがに由来ヘモシアニン（ＫＬＨ）とカップルさせ免疫源を作成し、これを兎に免疫し、それぞれのポリペプチドに対する抗血清を取得した。
上記形質転換細胞の細胞破砕産物及び細胞培養上清をポリアクリルアミドゲル電気泳動し、それをニトロセルロースメンブランに写し、作成された抗血清を用いてウエスタンブロットを行った。その結果、本発明のリセプター型チロシンキナーゼの細胞外部分を発現している形質転換細胞は細胞培養上清中に約８０キロダルトンのタンパクのバンドが確認され、本発明のリセプター型チロシンキナーゼの酵素活性部分及び全長を発現している形質転換細胞株は細胞破砕産物中に各々３０キロダルトン及び１３０キロダルトンのタンパクのバンドが確認され、これらの形質転換細胞株が各々に対応したポリペプチドを産生していることを確認した。細胞外部分及び全長のポリペプチドはアミノ酸組成から予想される分子量よりともにおよそ２０キロダルトン大きく、糖鎖付加されていると予想される。
また、本発明のリセプター型チロシンキナーゼ細胞外部分を特異的に認識するモノクローナル抗体を作成するために、米国、コダック社製ＩＢＩ ＦＬＡＧシステムを用いて、（詳細はＩＢＩ ＦＬＡＧ Ｅｐｉｔｏｐｅ．１、１、１９９２年 コダック社を参照のこと）配列表の配列番号１のアミノ酸配列を持つポリペプチドのＣ末端に８アミノ酸、すなわち配列表の配列番号７に示したアミノ酸配列であるAsp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lysを持つポリペプチドを付加したポリペプチドをコードする遺伝子を含む発現ベクターを上記の方法と同様に作成し、同様に形質転換細胞株を得た。この細胞培養上清から米国、コダック社製Ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ Ｍ２ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌを用いたアフィニティーカラム法にて本発明のリセプター型チロシンキナーゼの細胞外部分とＦＬＡＧとの融合タンパクを精製した。
上記のように精製された本発明のリセプター型チロシンキナーゼの細胞外部分とＦＬＡＧの融合タンパクをＢａｌｂ／ｃマウス（日本国、日本エスエルシー社製）に１匹あたり１０μｇを皮下・皮内に免疫した。２回の免疫後、眼底採血を行い血清中の抗体価の上昇を認めた後、３回目の免疫を行ってからマウスの脾臓細胞を取り出し、マウスミエローマ細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８（ＡＴＣＣ ＴＩＢ９）とポリエチレングリコール法にて細胞融合を行った。ＨＡＴ培地（日本国、日本免疫生物研究所製）にてハイブリドーマを選択し、酵素抗体法にて本発明のリセプター型チロシンキナーゼの細胞外部分を認識する抗体を培地中に産生しているハイブリドーマ株を３株分離した。これらのハイブリドーマを３８−１Ｅ、６６−３Ａ及び６８−３Ａと名付けた。これらのハイブリドーマ３株３８−１Ｅ、６６−３Ａおよび６８−３Ａは、日本国通産省工業技術院生命工学工業技術研究所において、それぞれ、寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４８８４、ＦＥＲＭ ＢＰ−４８８５、ＦＥＲＭ ＢＰ−４８８６として１９９４年１１月１１日に各々寄託した。
これらの細胞培養上清中からスウェーデン国、ファルマシア社製抗体精製キットＭａｂｔｒａｐＧを用いて、添付の取扱い説明書に従いモノクローナル抗体を精製した。このようにして作成された３種のモノクローナル抗体を用いて、本発明のリセプター型チロシンキナーゼの全長を発現する遺伝子導入細胞株及びＵＴ−７の細胞破砕物のウエスタンブロットを行ったところ、１３０キロダルトンのバンドを特異的に認識することが確認でき、本発明のリセプター型チロシンキナーゼを認識するモノクローナル抗体を樹立した。
実施例９ 本発明のリセプター型チロシンキナーゼを認識する抗体を用いた細胞の単離
本発明の抗リセプター型チロシンキナーゼ抗体が造血未分化細胞を検出しうる抗体であることを示すため、造血未分化細胞を検出しうる抗ＣＤ３４抗体との類似性を検討した。臍帯血８０ｍｌにシリカ懸濁液（日本国、免疫生物研究所）３ｍｌを添加し３７度の温度で１時間インキュベートした。その後１５ｍｌのハンクス生理食塩水（米国、ギブコ社）を添加し、フィコールパック液（スウェーデン国、ファルマシア社）に重層し、８００回転２０分の遠心操作により形成した単核細胞層を回収し、ハンクス生理食塩水により２回洗浄し単核の細胞を得た。この細胞の５×１０5細胞を含む懸濁液に抗新規リセプター型チロシンキナーゼ抗体１００μｇ／ｍｌを氷上で反応させ、フィコエリスリン標識した抗ＩｇＧ抗体（米国、ベクトンデッキンソン社製）で染色及び洗浄後、ＩｇＧ抗体（米国、ベクトンデッキンソン社製）存在下でインキュベートし、ＦＩＴＣ標識した抗ＣＤ３４抗体（米国、ベクトンデッキンソン社製）を反応させた。これらの細胞を英国、コールター社のフローサイトメーターＥＰＩＣＳ ＥＬＩＴＥで測定した。フローサイトメーターの測定法は、付属のマニュアルに従った。その結果、３８−１Ｅ抗体、６６−３Ａ抗体、６８−３Ａ抗体、抗ＣＤ３４抗体に対する陽性細胞は、それぞれ２．８％、０．５％、３．９％、４．０％であった。また、各本発明の抗リセプター型チロシンキナーゼ抗体陽性細胞中のＣＤ３４陽性細胞率は、３８−１Ｅ抗体、６６−３Ａ抗体、６８−３Ａ抗体のそれぞれ５２％、６７％、５６％であり、本発明の抗リセプター型チロシンキナーゼ抗体により染色された多くの細胞が血液未分化細胞を検出していることが示された。
またさらに、本発明の抗リセプター型チロシンキナーゼ抗体で血液未分化細胞を単離しうることを確認した。臍帯血３５ｍｌにシリカ懸濁液（日本国、免疫生物研究所）３．５ｍｌを添加し、３７度の温度で１時間インキュベートした。その後１０ｍｌのハンクス生理食塩水（米国、ギブコ社）を添加し、その細胞懸濁液をフィコールパック液（スウェーデン国、ファルマシア社）に重層し、８００回転２０分の遠心操作により形成した単核細胞層を回収し、ハンクス生理食塩水で２回洗浄し単核の細胞を得た。この細胞の一部４×１０4個を含む細胞懸濁液に本発明の抗リセプター型チロシンキナーゼ抗体３８−１Ｅまたは６８−３Ａを１００μｇ／ｍｌになるように加え、氷上で反応させ、洗浄後、米国、アプライドイムノサイエンス（ＡＩＳ）社のマイクロセレクター（抗マウスＩｇＧ抗体コーティング）を用いて、本発明の抗リセプター型チロシンキナーゼ抗体が反応した細胞をパンニング法にて分離した。マイクロセレクターは、日本国、旭メディカル社より購入し、その使用方法は付属のマニュアルに従った。コントロールとして単核の細胞を抗ＣＤ３４抗体（米国、ベクトンデッキンソン社製、抗ＨＰＣＡ−１抗体）で同様の方法で分離した。得られた細胞を使用し、半固形培地によるコロニー形成能を測定した。半固形培地は、カナダ国、テリーフォックス社の培地を使用し、その使用方法はテリーフォックス社の発行したマニュアルに従った。つまり、細胞は、半固形培地に懸濁後、４枚の３５ミリのディッシュ（米国、ファルコン社）に１ｍｌずつ添加し、５％炭酸ガス、９５％空気、３７度の温度、高湿度条件下で１４日培養した。形成したコロニー数は、顕微鏡下で計測した。以上の操作により３８−１Ｅ抗体、６８−３Ａ抗体、抗ＣＤ３４抗体のコロニー数はそれぞれ１５７個、１８２個、１１３個であった。即ち、本発明の抗リセプター型チロシンキナーゼ抗体である３８−１Ｅ、６８−３Ａは、抗ＣＤ３４抗体で単離した血液未分化細胞に較べ、より高いコロニー形成能を有する血液未分化細胞を単離していた。
実施例１０ 本発明のリセプター型チロシンキナーゼを用いた巨核球分化因子のスクリーニング
ヒト胎児繊維芽細胞株ＭＲＣ−５（日本国、理化学研究所、細胞開発銀行より入手可能、Ｎｏ．ＲＣＢ０２１１）のｍＲＮＡから作成したｃＤＮＡライブラリーの一部のＤＮＡを導入した細胞の培養上清から巨核球白血病細胞株ＵＴ−７における本発明のリセプター型チロシンキナーゼの発現を低下させる物質のスクリーニングを行った。
発現ライブラリーの作成は東洋紡社のＯｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ ｃＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ を用い行った。また、ＵＴ−７上における本発明のリセプター型チロシンキナーゼの発現の有無は実施例８で樹立されたモノクローナル抗体を用いたフローサイトメーター（ＥＰＩＣＳ Ｅｌｉｔｅ、米国、コールター社）にて行った。
実施例１に記載した条件で培養したＵＴ−７を最終細胞数が２×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように調整し、これに対し上記の方法で作成した発現ライブラリーをＣＯＳ細胞に遺伝子移入して作成した形質転換細胞の培養上清を加え、２日間培養後細胞を回収し、ＵＴ−７上の本発明のリセプター型チロシンキナーゼの発現を低下させる培養上清のライブラリーのクローニングを行った。その結果、ＵＴ−７上の本発明のリセプター型チロシンキナーゼの発現の低下がみられる培養上清を産生するＣＯＳ細胞クローンが得られ、そのクローンよりプラスミドを回収し、インサートの遺伝子配列を調べたところ、既に既知の遺伝子であるヒトインターロイキン１α（ＩＬ−１α）と同一であった。過去の研究によるとＩＬ−１αは巨核球系細胞のコロニー形成に関与することが知られている（Briddell et al.,Blood 79:332,1992;Takahashi et al.,Br. J Haematol. 78:480,1991）。これらの結果から、本発明のリセプター型チロシンキナーゼを用いることにより巨核球細胞に作用し、血小板の増加に関与する生理活性物質を探し出すことが可能であることが示された。
産業上の利用可能性
本発明のリセプター型チロシンキナーゼは、血液未分化細胞においては発現するが、血液未分化細胞の分化に伴い発現レベルが低下する。従って、本発明のリセプター型チロシンキナーゼに対し反応性を有する抗体を用いることにより、生物学的サンプルに含まれる、該リセプター型チロシンキナーゼが細胞表面に結合している血液未分化細胞をサンプルから単離することができ、又生物学的サンプルに含まれる上記のような血液未分化細胞を特異的に検出することができる。上記の方法は、血液未分化細胞の分化・増殖のメカニズムの解明に有用であるのみならず、本発明のリセプター型チロシンキナーゼを発現している造血幹細胞を含む、単離された血液未分化細胞は、現在行なわれている骨髄移植、末梢血幹細胞移植、臍帯血幹細胞移植等に応用可能である。更に本発明のリセプター型チロシンキナーゼを用いて、少なくともそのリセプター型チロシンキナーゼ活性を阻害又は賦活化するか、或いはその発現を抑制することのできる、血液未分化細胞分化増殖因子等の化学物質をスクリーニングすることもできる。
配列表
配列番号１
配列の長さ：５２２
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
起源
生物名：ヒト
配列
配列の長さ：２６０
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
起源
生物名：ヒト
配列
配列の長さ：９７２
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：アミノ酸
起源
生物名：ヒト
配列
配列の長さ：４２９０及び９８７
配列の型：核酸及びアミノ酸
鎖の数：二本鎖及び一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ to ｍＲＮＡ、及びアミノ酸
起源
生物名：ヒト
ただし遺伝子配列のＸは遺伝子配列が未決定。
配列
配列の長さ：２７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
起源：化学合成法による
配列：
配列の長さ：２４
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
起源：化学合成法による
配列：
配列の長さ：２７及び８
配列の型：核酸及びアミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ及びアミノ酸
起源：化学合成法による
配列：
Claims (3)
- 血液未分化細胞を単離または検出する方法であって、リセプター型チロシンキナーゼ活性を有し、配列表の配列番号１のアミノ酸配列を含有するポリペプチドに対する抗体を用いることを特徴とする血液未分化細胞を単離または検出する方法。
- 抗体がＦＥＲＭ ＢＰ−４８８４、ＢＰ−４８８５及びＢＰ−４８８６からなる群より選ばれる受託番号であるハイブリドーマにより産生される抗体である請求項１に記載の血液未分化細胞を単離または検出する方法。
- 血液未分化細胞が半固形培地中でコロニー形成する血液未分化細胞である請求項１あるいは２に記載の血液未分化細胞を単離または検出する方法。
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