JPS62129298A - 新規ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規なポリペプチド、特に主としてヒ１〜顆粒
球系細胞のコロニー形成をさせるために必要な、特異的
な刺激因子、すなわちコロニー刺激的因子（以下ｒＣ８
ＦＪと略記する）活性を有するポリペプチドに関し、且
つ該ポリペプチドをコードする遺伝子を組み込んだ組換
えベクター並びに、これを含む形質転換体、及びそれか
ら産生されるＣ３Ｆ組成物に関する。

（従来の技術〕 ２層軟寒天培養法で、上層に標的細胞として骨髄細胞を
、下層に腎細胞や胎児細胞を入れて培養すると、上層の
細胞の一部が増殖分化し、好中球系顆粒球（以下「顆粒
球（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ）　ｊと称す。）や単球マ
イクロファージからなるコロニーか形成されることから
、生体内にコロニー形成を促進する因子が存在すること
が知られていた（ＰＩＬＩＺｎｉｋと５ａｃｈ；　Ｊ、
　Ｃｅ１１．Ｃｏｍｐ、Ｐｈｙｓｉｏｌ　、。

四巻３１９頁（１９６５）、　Ｂｒａｄｌｅｙと）ｆｅ
ｔｃａｌｆ　　：Ａ（ＪＳｔ。

Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｂｉｏｌ、　Ｍｅｄ、Ｓｃｉ、、　４
４巻２８７頁（１９６６））。

Ｃ３Ｆと総称されるこの因子は、正常に広く生体内分布
する細胞、たとえば、Ｔ細胞、単球マクロファージ、繊
維芽細胞、内皮細胞などより産生されることが知られて
いる。Ｃ３Ｆには顆粒球・単球マクロファージの９？細
胞に作用して、その増殖を刺激し分化を誘導して、軟寒
天中で顆粒球や単球マクロファージから成るコロニーを
形成ざぼる作用をもつ顆粒球−単球マクロファージＣ３
Ｆ（ＧＭ−Ｃ３Ｆと略記する。）、主として単球マクロ
ファージのコロニーを形成させる作用をもつ単球マクロ
ファージＣ３Ｆ　（Ｍ−Ｃ３Ｆと略記する。）、より未
分化な多能性幹細胞に作用する多能性Ｃ３Ｆ　（ｍｕ　
ｌ　ｔ　１−Ｃ３Ｆと略記する。）、あるいは本発明の
如き、主として顆粒球系コロニーを形成させる作用をも
つ顆粒球Ｃ３Ｆ　（Ｇ−Ｃ３Ｆと略記する。）などの１
ナブクラスが存在し、それぞれのサブクラスによって標
的細胞の分化段階も異なることが考えられる様になって
きた［八５ａｎＯ：代謝−Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　ａｎ
ｄ　Ｄｉｓｅａｓｅ、　２２ｉ２４９頁（１９８５）　
、　Ｙｕｎｉｓ等：　”ＧｒｏＷｔｈ　ａｎｄＨａｔｕ
ｒａｔｉｏｎ　Ｆａｃｔｏｒｓ”、　ｅｄｉｔｅｄ　ｂ
ｙ　Ｇｕｒｏｆｆ。

Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆５ｏｎｓ、　ＮＹ、　　１巻
、２０９頁（１９８３）　］。

従って個々のサブクラスを精製し、その化学的性状や生
物学的性状をより詳細に調べることは造血機構や種々の
血液学的疾患の病態の解析にぎわめて重要なことである
。中でもＧ−Ｃ３Ｆの生物学的作用として、骨髄性白血
病細胞の分化誘導と成熟顆粒球のは能六進が注目されて
おり、特に白血病の治療と予防へのＧ−Ｃ８Ｆの臨床的
有用性が大いに期待されている。

（発明が解決しようとする問題点） Ｇ−Ｃ３Ｆの単離精製のために従来行われてきた試みは
、細胞培養法を用いて、その培養上清からＧ−Ｃ３Ｆを
単離する方法でおるが、Ｇ−Ｃ３Ｆが低温度しか産生さ
れないこと、大量の培養液から微量のＧ−Ｃ３Ｆを得る
には複？■な精製過程を必要とするなどの難点をかかえ
未だ大量の均一なＧ−Ｃ３Ｆを１ｑるには至っていない
。従って、組換えＤＮＡ技術を用いてＧ−Ｃ３Ｆを大量
に製造することが渇望されていた。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は特許請求の範囲第１項に記載したアミノ酸配列
で表わされるヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有する
ポリペブチ下を提供するものである。又該ポリペプチド
を産生ずるために用いられる組換えベクター、及びこれ
で宿主を形質転換体して得た形質転換体とそれから産生
されるＧ−Ｃ３Ｆ組成物も同時に提供するものである。

なお、本発明にとり特に重要な構成要件はヒトＧ−Ｃ３
Ｆ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であっ
て、詳しくはショ糖密度勾配遠心法により１５〜１７Ｓ
画分としてｊｑられる、ヒトＧ−Ｃ３Ｆ活性を有するポ
リペプチドをコードするメツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲ
ＮＡ）に相補的な開＾（ｃＤＮＡ）であり、より詳しく
は図４（８）のポリペプチド■又は■をコードづる遺伝
子あるいはその一部を有するものであり、ざらに詳細に
は図４（八）の塩基配列の５′−末端から３１〜３３ヌ
クレオチド位のＡＴＧから６４０〜６４２ヌクレオチド
位のＣＣＣまでの配列、１２１〜１２３位のＡＣＣから
６４０〜６４２位のＣＣＣまでの配列または図４（Ａ）
に記載された配列あるいはその一部を有するものである
。

本発明の遺伝子は例えばＧ−Ｃ３Ｆ活性を有するポリペ
プチドを産生ずる能力を有する吐乳動物細胞等からＧ−
Ｃ３’ＦをコードするｍＲＮＡを調製した後、既知の方
法により２本鎖ＣＤＮＡに変換することによって得られ
る。

前記、ｍＲＮＡの供給源となる吐乳動物細胞は本発明に
おいては、ヒドロ腔底癌由来の細胞株ＣＩＩＵ−２（Ｃ
ｏｌ　Ｉｅｃｔｉｏｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌｅ　［）ｅ　
Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　Ｄｅ　Ｈｉｃｒｏ。

ｒｇａｎｉｓｍｅｓ　　（Ｃ，Ｎ、　Ｃ，Ｍ）寄託番号
■−４８３）であるが、腫瘍細胞株にかぎらず、哺乳動
物から分離できる細胞、あるいは樹立した他の細胞株で
もよい。又、ｒｒ＋ＲＮＡの調製はすでに池のいくつか
の生理活性タンパクの遺伝子をクローン化する際、用い
られた方法、例えば、バナジウム復合体等のりボヌクレ
アービインヒビター存在下に界面活性剤処理、フェノー
ル処理を行う（Ｂｅｒ（ｌｅｒと８ｉｒｋｅｎｍｅｉｅ
ｒ　；　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１８ｉ５１４３頁（
１９７９）を参照）か、グアニジンヂオシアナート処理
後、Ｃ５Ｃ１密度勾配遠心を行う（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ等
：　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−ｔａ巻５２９４頁（１
９７９）を参照）ことによって、全ＲＮＡを得た後、オ
′リゴ（ｄＴ）−セルロースやセファロース２Ｂを担体
とするポリＵ−セファロース等を用いたアフィニティー
カラム法あるいはバッチ法によりポリ（Ａ　　）ＲＮＡ
　（ｍＲＮＡ＞を１７にとができる。またショ糖密度勾
配遠心法等によりポリ（Ａ　　）ＲＮＡを更に分画する
こともできる。

上記の如くして得られたｒＴＩ　ＲＮ　Ａが、Ｇ−Ｃ３
Ｆ活性をもつポリペプチドをコードするものであること
を確＝Ｗ”ｆるためには、ｍＲＮＡをタンパク貿に１１
１訳ざＵ、生理活性を調べるか、抗Ｇ−Ｃ３Ｆ抗体を用
いてそのタンパクを同定する等の方法を行えばよい。例
えば、アフリカッメガエル（Ｘ（！ｎｏｐｔＪｓ　Ｉａ
ｅｖｉｓ）の卵母細胞にｍＲＮＡを注入して翻訳させた
り（Ｇｕｒｄｏｎ等；　Ｎａｔｕｒｅ、　　２３３巻１
７７頁（１９７２）を参照）、あるいは１戸ナギ網状赤
血球（Ｒｅｔ　ｉｃｕ　Ｉｏｃｙｔｅ　）系や小麦胚芽
（し出ｅａｔ　ｇｅｒｍ）系を利用した翻訳反応が行わ
れている（ＳｃｈｌｃｉｆとＷｅｎＳｉｎｋ　　；　“
Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ”　、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−
Ｖｅｒｌａｇ、　ＮＹ、　（１９８１））。

Ｇ−Ｃ３Ｆ活性の検定は骨髄細胞を用いた軟寒天培養法
を適用して実施できる。それらの手法については総説が
ある（）ｌｅｔｃａｌｆ　；　”Ｈｅｍｏｐｏｉｅｔｉ
ｃＣｏｌｏｎｉｅｓ”　、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒ
ｌａｇ、　Ｂｅｒｌｉｎ、　１ｌｅｉｄｅｌｂｅｒ（１
，Ｎ　Ｙ　（１９７７）　）。

前述の如き方法で１ｑたｍＲＮＡを鋳型にして１本鎖Ｃ
ＤＮＡを合成した後、この１重鎖ｃＤＮ肋＼ら２本鎖Ｃ
ＤＮＡを合成し、適当なベクターＤＮＡとの組換えプラ
スミドを作成する。これを大腸菌（ＥＳＣｈｅｒｉＣｈ
ｉａ　ｃｏｌ　ｉ　）などを形質転換して、形質転換株
のＤＮＡＢＹ（以下、ＣＤＮＡライブラリーと称する。

）を得る。

ｒｎ　ＲＮ　Ａから２本鎖ＣＤＮＡを得るには、例えば
ｍＲＮＡの３′−末端にあるポリへ−鎖に相補的なオリ
ゴ（ｄＴ、）をプライマーとして逆転写酵素で処理する
か、またはＧ−Ｃ３Ｆタンパクのアミノ酸配列の一部に
相応するオリゴヌクレオチドを合成し、これをプライマ
ーとして逆転写酵素で処理してｍＲＮＡに相補的なＣＤ
ＮＡを合成する１２木鎖ｃＤＮＡは、アルカリ処理でｍ
ＲＮＡを分解・除去した後、１ｑられた１本鎖ＣＤＮＡ
を逆転写酵素又はＤＮＡポリメラーピ（例えばにＩｅｎ
ｏｗ断片等）処理後Ｓ１ヌクレアーＬ等で処理して得る
か、あるいは、直接ＲＮａｓｅ’　ＨおよびＤＮＡポリ
メラービ（例えば、大腸菌のＤＮＡポリメラーゼ■等）
等で処理することによっても得ることができる（例えば
、）ｌａｎｉａｔｉｓ等：　）ｌｏｌｅｃＬＩＩａｒ　
ｃｌｏｎｉｎｇ　、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１Ｉａ
ｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２）およびＧｕ
ｂｌｅｒ’とｌｌｏｆｆｍａｎ　；Ｇｅｎｅ２５巻２６
３頁（１９８３）を参照。）。

このようにして得られた２重鎖ｃＤＮＡを適当なベクタ
ー、例えば、ｐＳＣＩＯＩ　、　ｐＤＦ４１゜Ｃｏ　Ｉ
　Ｅｌ、ｐＭＢ９．ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２７。

ｐＡＣＹＣｌなどに代表されるＥＫ型プラスミドベクタ
ーや、λｇｔ、λＣ２λｇｔｉｏ、λｑｔＷＥｓなどに
代表されるファージベクターなどに組み込んだ後、大腸
菌（Ｘ１？７６：ト１８１（ＩＩ：ＯＨＩ、Ｃ６００株
など）等を形質転換してＣＤＮＡライブラリーを得るこ
とができる（例えば、前出“’ＨＯＩｅＣＩＪｆａｒ　
ｃｌｏｎｉｎｇ”を参照）。

２重鎖ｃＤＮＡをベクターと連結させるには、ＤＮＡ末
端に連結可能な末端をつ【ノるべく、適当な化学合成り
ＮＡ断片を追加し、予め制限酵素を用いて開裂さＵたベ
クターＤＮＡとＡＴＰ存在下にＴ４ファージＤＮＡリガ
ーゼで処理することに・より行うことができる。あるい
は、予め制限酵素を用いて開裂させたベクターＤＮＡと
２本１ｃＯＮＡのそれぞれにｄＧ、ｄＣ−鎖（あるいは
ｄＡ、ｄＴ−鎖）を付加した後、例えば両ＤＮＡを含む
溶液を徐冷することによっても行うことかできる（前記
Ｈｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇを参照）。

こうして得られた組換えＤＮＡ体による宿主細胞の形質
転換は、例えば宿主細胞が大腸菌の場合１１ａｎａｈａ
ｎが詳細に記述している如き方法　（Ｊ。

）ｌｏｔ　、　Ｂｉｏｌ、　　；　　１６６巻５５７頁
（１９８３））　、すなわら、ＣａＣＩ　　やＭＯＣＩ
２又はＲｂＣ１を共存させて調製したコンピテント細胞
に該組換えＤＮＡ体を加えることにより実施することが
できる。

目的とする遺伝子を保有する細胞を検索するには、イン
ターフェロンＣＤＮＡのクローン化で用いられたプラス
−マイナス法（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ等；Ｐｒｏｃ、　Ｊ
ｐｎ　、　Ａｃａｄ、　５５巻Ｓｅｒ　、　３．　４６
４頁（１９７９）　’）や、ハイブリダイゼーション−
トランスレーションアッセイ法（Ｎａｑａｔａ等；　Ｎ
ａｔｕｒｅ　２８４巻３１６頁（１９８０）　）など、
又は該タンパク貿のアミノ酸配列をもとにして化学合成
したオリゴヌクレオチドプローブを用いたコロニーある
いはプラークハイブリダイゼーション法（Ｗａｌｌａｃ
ｅ等：　Ｎｕｃｌｅｉｃ＾ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　、、　９
Ｗ　８７９頁（１９８１））などを用いればよい。

このようにしてクローン化されたヒトＧ　−Ｃ３Ｆ活性
を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含む断片は
適当なベクターＤＮＡに再び組み込むことにより、他の
原核生物または真核生物の宿主　　　　□細胞を形質転
換させることができる。更にこれらのベクターに適当な
プロモーター及び形質発現に係る配列を導入することに
より、それぞれの宿主細胞に於いて遺伝子を発現さＵる
ことか可能である。

原核生物宿主細胞としては、例えばＥＳＣｈｅｒｉＣｈ
ｉａｃｏｌｉ、　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ
　、　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉＩｕｓ等
が挙げられる。目的の遺伝子をこれ等の宿主細胞内で形
質発現させるには、宿主と適合し得る種由来のレプリコ
ン、すなわち複製起源および調節配列を含んでいるプラ
スミドベクターで宿主細胞を形質転換させればよい。ま
たベクターは形質転換細胞に表現形質（表現型）の選択
性を付与することができる配列をもつものが望ましい。

例えば、Ｅ、Ｃ０１ｉは、それを宿主とするベクターで
あるｐＢ　Ｒ３２２を用いて形質転換することができる
（Ｂｏｌｉｖｅｒ等：ＧＱｎｅ２巻９５頁（１９７５）
を参照）。

ｐＢ　Ｒ３２２はアンピシリンおよびテトラサイクリン
耐性の遺伝子を含んでおり、どららかの耐性を利用する
ことによって形質転換細胞を同定することができる。原
核生物宿主の遺伝子発現に必要なプロモーターとしては
、β−ラクタマーゼ遺伝子のプロモーター（ｃｈａｎｇ
等；　Ｎａｔｕｒｅ　２７５巻６１５頁（１９７８））
　、やラクトースプロモーター（Ｇｏｃｄｄｅｌ等；　
Ｎａｔｕｒｅ　２８１巻５４４頁（１９７９）を参照。

）およびトリプトファンプロモーター（ＧＯｅｄｄｅｌ
等；ＮｕＣＩｅｉＣＡｃ１ｄ　Ｒｅｓ、）旦巻４０５７
頁（１９８０）を参照）等があげられ、どのプロモータ
ーも本発明のヒトＧ−Ｃ３Ｆ活性をもつポリペプチドの
産生に使用することができる。

以上の如き宿主−ベクター系を用いてヒトＧ−Ｃ３Ｆ活
性を有するポリペプチドを得るには、上記ベクターの適
当な部位に該遺伝子を組み込んだ組換えＤＮＡ体により
宿主細胞を形質転換させた後、得られた形質転換体を培
養すればよい。ざらに細胞内または培養液から該ポリペ
プチドを分離・精製するには、公知の手段を用いて行う
ことができる。

一般に真核生物の遺伝子はヒトインターフェロン遺伝子
等で知られているように、多形現象（ｐｏｌｙｍ、ｏｒ
ｐｈｙｓｍ　）を示すと考えられ（例えばＮ１５ｈｉ等
：　Ｊ　、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　、　９７巻１５３頁（１
９８５）を参照）、この多形現象によって１個またはそ
れ以上のアミノ酸が置換される場合もあれば、塩基配列
の変化はあってもアミノ酸は全く変わらない場合もある
。

また図４（８）アミノ酸配列の中の１個またはそれ以上
のアミノ酸を欠くか又は付加されたポリペプチド、ある
いは１個またはそれ以上のアミノ酸が１個またはそれ以
上のアミノ酸で置換されたポリペプチドでもＧ−Ｃ３Ｆ
活性を有することがある。例えば、ヒ１〜インターロイ
キン２（ＩＬ−２＞遺伝子のシスティンに相当する塩基
配列をセリンに相当する塩基配列に変換して得られたポ
リペプチドがインターロイキン２活性を保持することも
すでに公知となっている（Ｗａｎ（１等；　５ｃｉｅｎ
ｃｅ　。

」堕巻１４３１頁（１９８４））。それゆえ、それ等天
然に存在するかあるいは人工合成されたポリペプチドが
ヒトＧ−Ｃ３Ｆ活性を有する限りそれ等のポリペプチド
をコードする遺伝子は全て本発明に含まれる。

本発明のヒトーＧ−Ｃ５Ｆ活性をもつポリペプチド、及
びこれをコードづる遺伝子を有する組換えベクター及び
これを有する形質転換体、ざらにはその発現ヒト−Ｇ−
Ｃ３Ｆ組成物を（７る方法について筒中に説明すると以
下の通りである。

（１）プローブの調製 ｆｆ’！瘍細胞株ＣＨＵ　−２の培養上清から精製して
１ｑられた均一ヒトＣ３Ｆ・タンパクについてＮ末端よ
りアミノ酸配列を決定し、さらにブロムシアン分解、ト
リプシン処理などにより断片化した後その断片について
もアミノ酸配列を決定した。

［実施例３　（ｉ）、　（ｉｉ）、　（ｉｉｉ）　］そ
のアミノ酸配列中から図１に示される配列に対応する３
種類のヌクレオチドプローブ（Ａ）、プローブ（ＬＣ）
およびプローブ（ＩＷＱ）を合成した。（実施例４）プ
ローブ（＾）は連続した１４個のヌクレオチドからなる
混合型プローブである。

プローブ（ＩＷＱ　）は、ヒトコレシストキニン遺伝子
のクローン化で用いられた如ぎ（ｒａｋａｈａｓｈｉ等
；Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ　、　、
　ＵＳ＾、翌春１９３１頁（１９８５）　）デオキシイ
ノシンを使用した３０個の連続したヌクレオチドである
。プローブ（ＬＧ＞は実施例３（ｉ）に示したアミノ酸
配列のＮ末端から３２〜３９番に相当する部分を、図３
に示した塩基配列を基にして合成した２４個のヌクレオ
チドからなるプローブである。

ヌクレオチドの化学合成は改良型ホスホトリエステル法
を同相法に適用して行うことができ、Ｎａｒａｎ！Ｊの
総説に記述されている（丁ｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　３９
巻３−２２頁（１９８３））が市販の自動合成装置（例
えばＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）を用い
ても行うことができる。

使用するプローブは、本発明で用いたプローブ以外の位
置のアミノ酸配列に基づくものであってもよい。

（２）ＣＤＮＡライブイリーの構築 ＣＨＵ−２細胞にグアニジンチオシアナート溶液を加え
てホモジナイズし、ＣｓＣｌ密度勾配遠心法により全Ｒ
ＮＡを１ｑる。

この全ＲＮＡからオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムによ
りポリ（Ａ）ＲＮＡを選別した後、逆転写酵素により１
本鎖ＣＤＮＡを合成し、ＲＮａｓｅＨおよびＥ、ｃｏｌ
ｉＤＮＡポリメラーゼエを加えて、２木鎖ＣＤＮＡを得
た。得られた２本鎖ＣＤＮＡにｄＣ鎖を付加し、Ｐｓｔ
　■切断部位にｄＧ鎖を付加したｐＢ　Ｒ３２２ベクタ
ーとつなぎ合せて、大腸菌Ｘ１７７６株を形質転換させ
、ｐ　Ｂ　Ｒ３２２系ｃＤＮＡライブラリーを構築した
。（実施例５，６）同様に、［：Ｃ０ＲＩリンカ−を用
いて、２本鎖ＣＤＮＡをλｑｔｉｏベクターと連結し、
λフアージ系ＣＤＮＡライブラリーを構築した。（実施
例（３）スクリーニング ｐＢＲ３２２系ＣＤＮＡライブラリー由来のＩ？え体を
ワットマン５４１瀘紙に固定し、３２ｐで放射標識した
プローブ（ＩＷＱ＞を用いて、コロニーハイブリダイゼ
ーションを行った結果、１個のクローンが選別できた。

このクローンを、υす゛ンブロツティング法（Ｓｏｕｔ
ｈｅｒｎ：　Ｊ、　）ｌｏｔ　、　Ｒｉｏｔ、９８巻５
０３頁（１９７５））を用いて更に詳細に検討したとこ
ろ、プローブ（Ａ）ともハイブリダイズした。

このクローンの塩基配列をジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ
；５ｃｉｅｎｃｅ　　２旦巻１２０５頁（１９８１））
によって決定した。

得られたＣＤＮＡインサートの塩基配列を図２に示す。

図２に示される如く、このＣＤＮＡインサートはプロー
ブ（ＩＷＱ）およびプローブ（Ａ）を含む３０８塩基対
からなり、実施例３（ｉｉｉ）に示したアミノ酸配列を
含む８３個のアミノ酸をコードするオープンリーディン
グフレームを有していることがわかった。

この３０８塩基対を含むｐＢ　Ｒ３２２由来のプラスミ
ドを以下ＤＨＣ３−１と略記する。（実施例８）ｐＨＣ
３−１から得られる３０８塩基対を含むＤＮＡ断片をニ
ックトランスレーション法（前出、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
　Ｃｌｏｎｉｎｇを参照）にてｆｉＩｉ射標識し、これ
をプローブとしてλ０ｔｌｏ由来のＣＤＮＡライブラリ
ーをプラークハイブリダイゼーション（Ｂ（３ｎｔＯｎ
とＤａｖｉｓ　　；５ｃｉｅｎｃｅ　　１９６巻１８０
頁（１９７７）によりスクリーニングして５個のクロー
ンを得、ＣＤＮＡを含むと思われるクローンについてそ
の塩基配列を前）ホと同様の方法で決定した。（図３）
図３に示される如く、このＣＤＮＡインナートは一つの
大ぎなオープンリーディングフレームを有する。

このＣＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列は図３
に示された如く演えきできる。

ＥＣ０ＲＩ切断部位にこのＣＤＮＡを挿入した、ｐＢ　
Ｒ３２２を保持するエシェリヒア・コリ（Ｅ。

ｃｏｌｉ）　Ｘ１７７６株は、工業技術員微生物工業技
術研究所に寄託されている（ＦＥＲＭ寄託番寄託−ＰＰ
５２）　。また、このＣＤＮＡをｐＢ　Ｒ３２７［５Ｏ
ｂｅｒＯｎ等；　Ｇｅｎｅ９　巻２８７頁（１９８０）
　］とＥｃｏＲＩ部位で結合したプラスミドをｐＢＲＧ
４と称する。

このようにして得られたＩ）ＢＲＧ４を、制限酵素ＥＣ
０ＲＩで処理して得られる約１５００塩基対のＣＤＮＡ
を含むＤＮＡ断片をニックトランスレーション法（前出
の）ｆｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇを参照）にて
放射標識し、これをプローブとして、再びλｇｔ１０由
来のＣＤＮＡライブラリーをプラークハイブリダイゼー
ション（前出８ｅｎｔｏｎとＤａｖ　ｉ　ｓの文献参照
）によりスクリーニングした。この際、同時にλフアー
ジＤＮＡを固定したニトロセルロース濾紙を２枚作成し
ておき、先に述べたプローブ（ＬＣ）にて同様のプラー
クハイブリダイゼーションを行い、両プローブでポジテ
ィブとなるファージを選別した。完全長と思われるクロ
ーンを選別し、ジデオキシ法を用いてｃＤＮＡインサー
トの塩基配列を決定したところ図４（Ａ）に示される如
くであった。

このｃＤＮＡは一つの大きなオープンリーディングフレ
ームを有し、コードされるアミノ酸配列は図４（Ａ）に
示された如く演えきできる。

実施例３（ｉ）に示されているＧ−Ｃ３ＦタンパクのＮ
末端アミノ酸配列との比較により、本ｃＤＮＡは５′−
末端から３１〜３３ヌクレオチド位のＡＴＧ配列から始
まり、１１８〜１２０位のＣＣＣ配列で終わる９０塩基
対によってコードされるシグナルペプチドｄ３よび１２
１〜１２３位のＡＣＣ配列から始まり６４０〜６４２位
のＣＣＣ配列で終る５２２塩基対によってコードされる
成熟Ｇ−Ｃ３Ｆポリペプチドに相当する塩基配列を含ん
でいることがわかった。

従って図４（Ｂ）に示されたアミノ酸配列工のポリペプ
チドは２０４個のアミノ酸からなり、その分子量は２１
９７７、３５ダルトンと計算された。同様にアミノ酸配
列■のポリペプチドは１７４個のアミノ酸からなり、そ
の分子量は１８６７１．４２ダルトンであった。（実施
例ｉｏ） 但しタンパク質の開始部位に関しては、３１〜３３位以
外に５８〜６０位あるいは６７〜６９位のＡＴＧも同様
に考え得る。

ＥＣ０ＲＩ切断部位に木ＣＤＮＡを挿入したｐＢＲ３２
７を保持するエシェリヒア・コリ（Ｅ。

ｃｏｌｉ）　Ｘ１７７６株は工業技術院微生物工業技術
研究所に寄託されている（ＦＥＲＭ奇託番ｑＰ−８４５
３）。

図５には、得られた遺伝子の制限酵素切断部位を示した
。

（４）組換えベクターの構築 かくして得られたｐＢＲＶ２プラスミド（実施例１０）
からＧ−Ｃ３ＦポリペプチドのＣＤＮＡ断片を制限酵素
により切り出して来て、これと■　ｔａｃプロモーター
を含有するｐＫＫ２２３−３（ファルマシア社製）から
調製した断片と７ニーリングした合成リンカ−を連結（
ライゲーション）し組換えベクターを構築するか〈実施
例１１）■　Ｐ、プロモーターを含むｐＰ　Ｌ　−ｌａ
ｍｂｄａ（ファルマシア社製）から調製した３種の断片
とアニーリングした合成リンカ−を連結し、再調整して
絹換えベクターを構築するか（実施例１２）■　あるい
はｔｒｐプロモーター含有ｐＯＹＩプラスミドからＷＷ
した断片とアニーリングした合成リンカ−を連結して組
換えベクターを構築する。

（実施例１３） （５）形質転換体の調製と培養、発現 次に上記３種の粗換えベクターを用いて前出の）１ｏ１
ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇに記載されている塩化カ
ルシウム法又は塩化ルビジウム法で、夫々Ｅ、ｃｏｌｉ
Ｄ　Ｉ−１１株、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｎ４８３０株、あるい
はＥ、ｃｏｌｉＪＭ１０５株を形質転換した。（実施例
１１．１２．１３＞得られた形質転換株をアンピシリン
含有ルリア（Ｌｕｒｉａ　）培地でまず培養し次いで必
要に応じて、適宜誘導をかけ、培養を行い形質発現Ｕ瞥
めた。

（実施例１４） （６）大腸菌からのＧ−Ｃ３Ｆポリペプチドの回収）！
’ｉ！ｉ製とアミノ酸分析 形質転換株の培養液を遠心にかけ集菌した後リゾデーム
処理をし、凍結−融解をくりかえし溶菌させる。次いで
塩酸グアニジン処理後遠心で上澄液を得る。

これをυ１ｔｒｏａｅｌ　ＡＣＡ５４カラム（ＬＫＢ社
製）でゲル濾過し、活性画分を限外濾過器で濃縮した。

次に、ｎプロパツールを含むトリフルオロ酢酸水溶液を
添加し、氷中放置、遠心分離し、逆相Ｃ１８カラムに吸
着、溶出操作を施す。溶出俊各両分の活性を調べ、活性
ピークを集め凍結乾燥した。

この凍結乾燥粉末を溶解し高速液体クロマトグラフィに
かけ、再度上記と同様の精製操作を行い取１ｑシたポリ
ペプチドを５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
かけ目的とするＧ−Ｃ３Ｆポリペプチドを示す単一のバ
ンドを確認した。（実施例１５） このようにして得られたポリペプチドはヒトＧ−Ｃ３Ｆ
活性を示した。（実施例１６）更に、得られた精１−Ｃ
３Ｆポリペプチドのアミノ酸分析はアミノ酸組成をＥｌ
立８３５アミノ酸自動分析装置（日立製作断裂）を使用
し、特殊アミノ酸分析法によって分析した。又、Ｎ末端
アミノ酸分析は気相式シークエンサーを用いてエドマン
分解し、高速液体クロマトグラフィー及び、Ｕｌ　ｔｒ
ａｓｐｈｃｒｅ　−Ｑ　［）　Ｓカラムを用いて行った
。

（実施例１７） 〔実施例〕 以下実施例をあげて本発明の詳細な説明するが、その前
にＣ３Ｆ活性の測定法について参考例で説明しておく。

く参考例＞Ｃ３Ｆ活性の測定方法 本発明において用いられたＣ３Ｆ活性（以下Ｃ３Ａと略
す）の測定方法は次のとおりである。

ｒｃｓＡの測定方法」 （ａ）ヒト骨髄細胞を用いる場合： Ｂｒａｄｌｅｙ　Ｔ、　Ｒ，、）ｌｅｔｃａｌｆ　Ｄ、
等の方法（八ｕｓｔ、　　Ｊ、　　ｅｘｐ　　、　　８
ｉｏ１．　　ｍｅｄ　　、　　Ｓｃｉ　　、　　４４巻
　２８７〜３００頁、　１９６６年）に準じて単層軟寒
天培養法により行った。すなわらウシ胎児血清０．２ｍ
ｌ、被検検体０．１ｄ、ヒト骨髄非付着性細胞浮遊液ｏ
、　ｉ、ｇ（１〜２Ｘ１０有核細胞）、改変）１ｃｃｏ
ｙ’　ｓ　５ＡＩ８養液０．２７２．寒天を０．７５％
含む改変ＨｃＣｏｙ’　ｓ５Ａ培養液０．４〃認を混合
して直径３５ＩｎＩｎの組織培養プラスティックディツ
シュに入れて固まらせたのら、３７℃、５％炭酸ガス／
９５％空気、１００％湿度の条件で培養を行い、１０日
後に形成されたコロニー数（５０個以上の細胞からなる
集落を１コロニーとする）を数え、１個のコロニーを形
成する活性を１単位（Ｕｎｉｔ）としてＣ３Ａを求めた
。

（ｂ）マウス骨ｆｌｉｆｉ細胞を用いる場合：ウマ血清
０．ｈｆ、被検検体０．Ｗ、　Ｃ３Ｈ／１ｌｃ（メス）
マウスの前部細胞浮遊液０．１ｍ！！（０，５〜１ｘｉ
ｏ”有核細胞）、寒天を０，７５％含む改変ＨｃＣｏｙ
’　ｓ　５Ａ培養液０．４７を混合し直径３５ｍの組織
培養用プラスティックディツシュに入れて固まらせたの
ち、３７℃、５％炭酸ガス／９５％空気、１００％湿度
の条件下にて５日間ｉ８養し、形成されたコロニー数（
５０個以上の細胞からなる集落を１コロニーとする）を
数え、１個のコロニーを形成する活性を１単位（Ｕｎｉ
ｔ）としてＣ３Ａを求めた。

尚、上記（ａ）　、　（ｂ）の方法において用いた「改
変ｔｔｃｃｏｙ’　Ｓ　５Ａ培養液および（ａ）で用い
たヒト骨髄非付着性細胞浮遊液は次の如くして作成した
。

「改変ＨｃＣｏｙ’　ｓ　５Ａ培養液（２倍濃度）」Ｈ
ｃＣｏｙ’　ｓ　５Ａ培養液（ＧＩＢＣＯ社製）１２り
。

ＭＥＭアミノ酸ビタミン培地（日永製薬社製）２．５５
　ｇ重炭酸ナトリウム２．１８ｇ、ペニシリンＧカリウ
ム５ｏｏｏｏ単位を２回蒸溜水５００ｍ１に溶解後、０
．２２μｍのミリポアフィルタ−にて濾過滅菌を行った
。

「ヒト骨髄非付着性細胞浮遊液」 叶常人胸骨けん刺により得た骨髄液をＲＰＭ１１６４０
培養液にて５倍に希釈し、Ｆｉｃｏｌ　−Ｐａｑｕｅ液
（ファルマシア社製）に重層し、４００ｘｇ、３０分。

２５°Ｃにて遠心を行い、界面の細胞層（比重く１．０
７７）を回収する。この細胞を洗浄後、２０％ウシ胎児
血清を含むＲＰＭ　Ｉ　１６４０培養液にて５×１０”
　Ｃｅ１ｌ／ｍｌの濃１食に調整し、２５ｃｄの組織培
養用プラスチックフラスコに入れ、炭酸ガス培養器にて
３０分間インキュベートしたのち、上清の非付着性細胞
を回収し、再度２５ＣＩｉｔプラスチツクフラスコに入
れ、２時間３０分インキュベートしたのち、上清の非付
着性細胞を集めて用いた。

実施例１．ｒｃＨｔＪ−２Ｊの樹立 著明な好中球の増多が認められた口腔底癌患者の腫瘍を
ｎ　ｕ／ｎ　ＬＪマウスに移植した。この腫瘍は移植約
１０日後に著明な腫瘍の増大と好中球の増多が認められ
た。このｆｉ！！瘍を移４ＩＩ１１２日復に無菌的に摘
出し、１〜２＃３角に細切し、これを以下の如く培養し
た。

上記細切した腫瘍塊１０〜１５片を５０ＩｎＩｌのプラ
スチック遠心管に入れ、５７！のトリプシン溶液（トリ
プシン０．２５％、ＥＤＴＡ　Ｏ，０２％○む）を加え
、３７°Ｃの温浴中で１０分間振とうしたのら上清を捨
て、再度、同トリプシン溶液５ｄを加え、３７°Ｃで１
５分間攪拌しながらトリプシン消化を行った。上清の細
胞浮遊液を回収し、ウシ胎児血清を１ｄ加えてトリプシ
ンの作用を止めたのち水中に保存した。

以上の操作を再度行い細胞浮遊液を回収し、前回の分と
合わせて１　、５０Ｏｒ、　ｐ、　ｍ、　１０分間の遠
心により細胞ペレットを得た。この細胞ペレツＩ・をウ
シ胎児血清を１０％含むＦ−１０にて２回洗浄したのち
、２５ｃｒｉのプラスチック培養フラスコに細胞温度５
×１０”個／フラスコになるようにして植え込んだ。

ウシ胎児血清を１０％含有するＦ−１０培養液を用い、
炭酸ガスインキュベーター（炭酸ガス濃度５％。

湿度１００％）中にて一部インキユベートしたのら、上
清を非付着細胞と共に除去し、新しい培養液を加えて培
養を継続した。培養開始後６日目に細胞がいっばいに増
殖したので、この時点で培養液を新しいものに替えた。

翌日、この培養液を捨て、ＲＰＭ　Ｉ　１６４０で５倍
希釈した抗マウス赤血球抗体（Ｃａｐｐｅ　Ｉ社製）２
ｍｉと同じ＜　ＲＰＭ　Ｉ　１６４０で２．５倍希釈し
たモルーＥット補体（極東製薬社製）２ｄを加え３７°
Ｃ，２０分間インキュベートした。インキュベーション
終了後ウシ胎児血清を１０％含むＦ−１０にて２回洗浄
しｎｕ／ｎｕマウス由来のフィブロブラストを除去し、
引き続きウシ胎児血清を１０％含むＦ−１０培養液を加
えて、ざらに２日問培養を行った後細胞の一部を取り出
し、限界希釈法によりクローニングを行った。

得られた１１コのクローンについてＣ３Ｆ活性を調べた
ところ、他の・乙のよりも約１０倍高い活性を示すクロ
ーン（ＣＩ−ＩＵ−２＞が得られた。

実施例２．０ＳＦの単離 上述の如り′シて樹立された細胞が完全に密に増殖した
１５０ｃｄの培養フラスコ２本より細胞を回収し、これ
をウシ胎児血清を１０％含有するＦ−１０培養液５００
ｍ１に浮遊したのら、１５８０ｃｍのガラス製ローラー
ボトル（３ｅ　ｌ　ｃｏ社製）に移し、０．５ｒ、　ｐ
、　ｍ、の速度で回転培養を行った。細胞がローラーボ
トルの内壁に完全に密に増Ｊｆｉ　Ｌ、た時点で培養液
を血清を含まないＲＰＭ　Ｉ　１６４０に交換し、４日
間培養したのち培養上清を回収し、ウシ胎児血清を１０
％含有するＦ−１０を加えて培養を続行する。

３日間培養したのち再び血清を含まないＲＰＭ１１６４
０に波音を行い、４日後に培養上清を回収した。

以下同様の操作をくり返すことにより、毎週１ボトルよ
り５００１１！１２ずつの血清を含まない培養上清が得
られ、しかもこの方法によりかなり長期間にわたって細
胞を維持し、培養上清を回収することが可能であった。

１ｑられた培養上清５１を１バツチとし、これに０．０
１％ツイーン２０を添ＩＪＯｉｌ　ｌｌ０ＩＩＯＷ　Ｆ
ｉｂｅｒ　ＤＣ−４およびＡｍ１ｃｏｎ　ＰＭ−１０（
アコン社製）を用いた限外濾過法により約１ｏｏｏ倍に
濃縮したのら、これを以下の順序で精製した。

（ｉ）　　直径４．８ｅｍ、長さ９０ｃｍの旧ｔｒｏ（
ｌｅｌ　ＡＣＡ５４Ｃ１８カラム社製）を用い、０．１
５　Ｍ　ＮａＣｌおよび０．０１％ツイーン２０（半封
化学社！りを含む０．０１Ｍトリス塩酸緩衝液（Ｆ）ｌ
−１７，４）を用いて前記濃縮した培養上清５Ｉｎ１を
流速約５０ｄ／時間でゲル濾過した。尚カラムはあらか
じめウシ血清アルブミン（分子ｆｆ１６７．０００）　
、　７１ボアルブミン（分子量４５，０００）　、チト
クロームＣ（分子量１２．４００）にてキヤリプレーシ
ョンシを行った。ゲル濾過終了後置フラクションより０
．１ｄずつを採取し、１０倍に希釈した後、前述したｒ
Ｃ３Ａの測定方法（ｂ）」により活性を示ず画分を調べ
た。この結果、先ず■ｅ＝４００〜７００ｄの両分がマ
クロ７Ｆ−ジ優位（７）Ｃ８Ａを示し、Ｖｅ＝　８００
〜１２００ｄの両分が顆粒球優位のＣ３Ａを示すことが
わかったので、１多者の両分を集めＰＭ−１０（アミコ
ン社製）を用いる限外濾過器によって約５ｍｌに）層線
した。

（ｉｉ）　　上記濃縮画分にｎ−プロパツール（東京化
成社製、アミノ酸配列決定用）を３０％含む０．１％ト
リフルオロ酢酸水溶液を添加し、水中に１５分程度放置
したのち、１５．００Ｏｒ、　ｐ、　ｍ、　１０分の遠
心ににり沈澱を除去した。次いで先のｎ−プロパツール
およびトリフルオロ酢酸を含む水溶液で平衡化した１ｔ
　Ｂｏｎｄａｐａｋ　Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ礼製
、セミ分取用、８ＩｒｕｎＸ３０ＣｎＬ）に吸着後、３
０〜６０％の直線温度勾配のｎ−プロパツールを含む０
．１％トリフルオロ酢酸水溶液で順次溶出した。高速液
体クロマト装置は日立６８５−５０型を、検出は日立６
３８−４１型検出器くいずれも１三１立製作所製）を用
い、２２０ｎｍと２８０ｎｍの吸収を同時に測定した。

溶出後、各両分より１０μｍを分取ｔｏｏ　（３ｆｉ釈
したのら、前述の「Ｃ３Ａの測定法（ｂ）」により活性
を示す両分を調べた。この結果、ｎ−プロパツール４０
％にて溶出されるピークに活性が認められたので、この
ピークを集め再度同じ条件で再クロマトを行い上記と同
様にして　Ｃ３Ａを調べたところ、やはりｎ−プロパツ
ール４０％の位置のピークに活性が認められたので、こ
のピークを集め（４フラクシヨン＝４ｄ）凍結乾燥した
。

（ｉｉｉ）上記凍結乾燥粉末をｎ−プロパツールを４０
％含む０．１％トリフルオロ酢酸水溶液２００μｍに溶
解し、ＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷカラム（東洋曹達社製、
　　７．５ｒＩｕｒＩＸ　６０ｃｍ　）を用いた高速液
体りＣｌ？トグラフィ（ＨＰＬＣ）にかけた。溶出は同
水溶液により０．４ｄ／分の流速で行い、フラクション
コレクターＦＲＡＣ−１００（フフＩルマシア社製）に
にす０．４ｒｒｄｌずつ分取した。分取した各両分につ
いてＣ３Ａを前記と同様にして調べた結果、保持時間が
３７〜３８分の画分（分子量約２万に相当）に活性が認
められたので、この両分を回収し、更に分析用μＢｏｎ
ｄａｐａｋ　ｃｔｓカラム（４，６ｍＸ３０ｃｍ）によ
る精製を施したのら、メインピークを回収し凍結乾燥し
た。ｊＷられた標品について前述の「Ｃ８△の測定方法
（ａ）」によって検定したところヒトＧ−Ｃ３Ｆ活性を
有することを認めた。

実施例３．アミノ酸配列の決定 （ｉ）　　Ｎ末端アミノ酸配列の決定 試お１を気相式シークエン１ノー（アプライドバイオシ
ステム社製）を用いてエドマン（［：ｄｍａｎ）分解し
、ｊｑられたＰＴＨアミノ酸を高速液体クロマトグラフ
ィー装置（ベックマン・インストルメンツ社製）および
引ｔｒｏｐｈｅｒｅ　−ＯＤ　Ｓカラム（ベックマン・
インストルメンツ社製）を用いて常法により分析した。

カラム（５μｍ、直径４．６ｍ。

艮ざ２５０．）を開始緩衝液（１５ｍＭ酢酸ナトリウム
緩衝液ｐＨ４，５，４０％アヒトニ１−リルを含む水溶
液）にて平衡化したのら、検体（２０μｍの開始緩衝液
にて溶Ｖ１．）を注入して開始緩衝液によるイソクラテ
ィック溶出により分離を行った。流速は１．４威／分、
カラム湿度は４０℃に保持した。ＰＴＩＩアミノ酸の検
出は２６９ｎｍと３２０ｎｍの紫外部吸収を利用した。

あらかじめ標準ＰＴＨアミノｒｆｔ（シグマ社製）各２
０ｍｏｌを同一の系で分離して保持時間を決定し、被検
検体の保持時間から同定を行った。この結果、Ｎ末端か
ら４０′Ｉｌｊ、Ｗ目までのアミノ酸配列は次の如く決
定された。

１−１２　Ｎ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌ　ｙ−（
ｉｉ）　　ブロムシアン分解 試料を７０％ギ酸に溶かし、昇華精製したブロムシアン
２００当量を加えて、３７°Ｃで一夜反応させた。

次に反応物を凍結乾燥後、ＴＳＫ　　Ｇ３００Ｏ３Ｗカ
ラム（東洋曹達社製）を用いたＨ　Ｐ　Ｌ　Ｃで両分し
４つのピークを得た。ピークを分子量の大きい順にＣＮ
−１，ＣＮ−２，ＣＮ−３，０Ｎ−４と命名し、収率の
よいＣＮ−１，ＣＮ−２についてアミノ酸配列を自動気
相式シークエンサーくアプライドバイオシステム社製）
を用いて（ｉ）と同様の条件で分析した。

その結果、ＣＮ−１はＧ−Ｃ３ＦタンパクのＮ末端から
のペプチドであることがわかった。ざらにＣＮ−２は以
下のアミノ酸配列を有していた。

ｐｒｏ−ＡＩ　ａ−ｐｈｅ−Ａｌ　ａ−３ｅ　ｒ　−Ａ
　Ｉ　ａ−Ｐｈｅ−ＧＩ　ｎ−Ａｒ（Ｊ−Ａｒｇ−Ａ　
Ｉ　ａ−Ｇ　Ｉ　Ｖ−Ｇ　Ｉ　’ｙ−Ｖａ　Ｉ　−Ｌｅ
ｕ　−Ｖａ　　ｌ　　−Ａ　　ｌ　　ａ−３ｅ　　ｒ−
Ｈｉ　　５−Ｌｅｕ　−１ｎ− （ｉｉｉ）　トリプシン分解 試料を８Ｍ尿素を含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐｌ
−１７，４）に溶かし、０．１％２−メルカプトエタノ
ールを含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，４＞を
加えて最終的に２Ｍの尿素となるように調整した。次い
で試料と酵素が５０：１となるようにＴＰＣＫ処理トリ
プシン（シグマ社製商品名）を加え、２５°Ｃで４時間
反応させた後、さらに同量のＴＰＣＫ処理トリプシンを
加えて、再度２５°Ｃで１６時間反応さけた。反応後、
反応物をＣ８カラム（山村化学社製）を用いた高速逆相
カラムクロマトグラフィーに付した。溶出は０．１％Ｔ
ＦＡを含むｎ−プロパツールを用い、ｎ−プロパツール
濃度を５％〜６０％に直線的に上げて行った。２８０ｎ
ｍの紫外部吸収を測定して得られたピークのうち、メイ
ンピークについて（１）と同条件下に自動気相式シーク
工、ンサー（アプライドバイオシステム社製）を用いて
アミノ酸配列を分析した。その結果、メインピークは（
ｉｉ）のＣＮ−２断片の一部を含む以下の配列を有する
ペプチドでおることがわかった。

ＧＩ　ｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａ　１−Ａｌ　ａ−Ａｓ
　ｐ−Ｐｈｅ−Ａ　Ｉ　ａ−Ｔｈ　ｒ、−Ｔｈ　ｒ　−
Ｉ　Ｉ　ｅ−Ｔ　ｒ　ｐ−Ｇ　ｌ　ｎ−Ｇ　Ｉ　ｎ−Ｍ
ｅ　ｔ　−Ｇｌ　ｕ−Ｇｌ　ｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌ　ｙ−Ｍ
ｅｔ−Ａ　Ｉ　ａ−Ｐｒｏ　−Ａ　Ｉ　ａ−Ｌ　ｅｕ−
Ｇ　Ｉ　ｎ　−Ｐｒｏ−Ｔｈ　ｒ−Ｇ　ｌ　ｎ−（３１
Ｖ−Ａ　Ｉ　ａ　−Ｍｅ　１−Ｐｒｏ−Ａ　Ｉ　ａ−Ｐ
ｈｅ−Ａ　ｌ　ａ　−ｅｒ− 実ｔｒ％例／１．ＤＮＡプローブの作成（ｉ）プローブ
（ＩＷＱ）の合成 実施例３．（ｉｉｉ）で得られたアミノ酸配列の中から
Ｉ　ｌ　ｅ−Ｔｒｌ）−Ｇｌ　ｎ−Ｇ　ｌ　ｎ−Ｍｅｔ
　−ＧＩ　ｕ−Ｇｌ　ｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌ　ｙ−Ｍｅｔで
示される１０個のアミノ酸の配列に基づいて、３０個の
連続するヌクレオチドを得たく図１）。図１の配列に於
いて、例えば５′−末端から９位のヌクレオチドはｄＡ
およびｄＧを等吊金む混合物であることを示す。原料の
ヌクレオチドは主にダイマーを使用し、必要に応じて随
時モノヌクレオチド″ｂ使用した。グラスフィルター付
きカラムに出発原料のヌクレオチド樹脂Ａｐ−ｄ　（Ｇ
）（ヤマリー醤油社Ｍ）２０ｍｇを入れ塩化メチレンに
て洗浄を繰り返した後、３％トリクロロＩＭを含む塩化
メチレン溶液にて、４，４′−ジメトキシトリチル基を
脱離ｕしめ、次いで１ｍｌの塩化メチレンでカラムを数
回洗浄した。無水ピリジンで洗浄して溶媒を置換したの
ちヌクレオチドダイマー（ＤＭＴｒ）ＡｐＴｐ（ＮＨＲ
＞（日本Ｌオン社製：　　ＮｌｌＲ３はトリエチルアン
モニウム、ＤＭＴｒはジメトキシトリチルを示す）　２
０ｍｇと０．２ｒｄ、のピリジンを加えて真空ポンプに
てカラム内を真空乾燥した。次いで、２，４．６−トリ
メチルベンビンスルホニルー３−ニトロトリアゾリド（
ＭＳＮＴ、和光紬薬社製）　２ｏｍｇと無水ピリジン０
．２ｒｔｔｌを加えた後、カラム内を窒素ガスで置換し
て、室温下に４５分間時々娠とうさせることによってヌ
クレオチド樹脂とダイマーを縮合させた。反応終了後、
ピリジンにてカラムを洗浄し、次いで未反応のｏｔ−ｔ
ｍを過剰の無水酢酸−４−ジメチルアミノピリジンにて
アレデル化した後、再びカラムをピリジンで洗浄した。

以下同様に、（ＤＭＴｒ）Ｉｐ（ＮｔｌＲ３）　、　（
ＤＨＴｒ）ＧｐＧｐ（ＮｔｌＲ３）　　、　　（ＤＨＴ
ｒ）Ｉｐ（ＮｔｌＲ３）　　、　　（ＤＨＴｒ）Ｃｐ丁
ｐ（ＮｔｌＲ３）と（ＤＨＴｒ）ＴｐＴｐ（ＮｌｌＲ３
）の等量混合物。

（ＤＭＴｒ）八ｐＡｐ（ＮｔｌＲ）と（ＤＨＴｒ）ＡＤ
ＧＤ（ＮｔｌＲ３）の等量混合物、　（ＤＨＴｒ）ＡＩ
）ＧＯ（ＮＨＲ３）とＣＤ）ｔＴｒ）ＧＯＧｔ）（Ｎｔ
ｌＲ３）の等量混合物、　（ＤＭＴｒ）ＧＤＡＩ）（Ｎ
ｔｌＲ３）　、　（ＤＨＴｒ）ＴｐＧＩ）（ＮｔｌＲ３
）　　、　　（ＤＭＴｒ）八Ｆ）Ａｐ（Ｎｌｌｆ（３）
　　と（ＤＨＴｒ）ＧｐＡｐ（ＤＨＴｒ）ＡＩ）Ａｔ）
（１４１１Ｒ）と（Ｄ）ｌＴｒ）ＡｐＧｌ）（Ｎｌｌｆ
ｉｌ　３）との等量）捏合物、　　（ＤＨＴｒ）ＣＤＣ
Ｉ）（ＮｔｌＲ３）　　、　　（ＤＨＴｒ）丁ｐＧｐ（
ＮｔｌＲ３）　、　（開「ｒ）■１）（Ｎ１１Ｒ３）、
（Ｄ１４Ｔｒ）＾ＤＴＤ（ＮｔｌＲ３）［（Ｄｔ４Ｔｒ
）　Ｉｐ（間Ｒ３）はヤマ＋Ｊ鵠油社製、ぞの他は全て
日本ピオン社製］の順で、前述の操作を繰り返すことに
よって縮合ざＵた。最終段階の反応終了後、アセデル化
することなしに、ピリジン、塩化メチレン、エーテルの
順で樹脂を洗浄した後、乾燥させた。乾燥させた樹脂を
１Ｍテトラメヂルグアニジンおよび１Ｍα−ピコリンア
ルドキシムを含むジオキサンＩｄ、ピリジン０．５ｍｌ
、水０．２ｍｌの混合液１．７ｍに懸濁した後、−夜室
温にて放置した後、１００〜２００　　μｍまで減圧′
ａ縮した。

この濃縮液に少量（２〜３滴）のピリジンを加えた後、
）農アンモニア水２〜３威を加え５５℃で６時間加温し
た。次いで酢酸エチルを加えて抽出分離し、得られた水
層を減圧濃縮した後、５０ｍＭトリエチルアンモニウム
酢酸溶液（ｐＨ７，０）に溶解Ｌシ？ｌ）テＣ−１８カ
ラム（１，Ｏｘ１５ｃｍ、　Ｗａ　ｔ　ｅ　ｒＳ社製）
を用いたカラムクロマトグラフィーにイ」した。溶出は
、５０ｍＭ１−リエチルアンモニウム酢酸溶液（１）Ｈ
７，０）　ＦＦｌｌ０％〜３０％の直線濃度勾配のアセ
トコ１ヘリルて行い、アセトニトリル濃度が２５％（Ｊ
近の位置で溶出されるピーク画分を減圧濃縮した。

このｉ層線液に８０％酢酸を加えて室温下に３０分間放
置した後、酢酸エチルを加えて抽出・分離し得られた水
層を減圧下に濃縮した。得られた濃縮液は、Ｃ１８カラ
ム（センシュー科学社製、５ＳＣ−ＯＤＳ−２７２，６
φＸ　２００ｍ）を用いた高速液体クロマトグラフィー
に付して、ざらに精製した。

溶出は５０ｍＭトリエチルアンモニウム酢酸溶液（ｌｌ
　７．０）中１０％〜２０％の直線濃度勾配のアセトニ
トリルを用いて行い、ＩＯＡ　２６０ＬＩｎｌｔＳ以上
の収量で合成りＮＡが１ｑられた。

得られたオリゴヌクレオチドはＨａｘａｍ−Ｇｉ　１ｂ
ｅｒｔ法（）ｆｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍ　、　６５Ｗ　４
９９頁（１９８０）により塩基配列を調べた結果、図１
に示された配列を有していることが確認された。

（ｉｉ）プローブ（Ａ）の合成 実施例３．　（ｉｉｉ）で得られたアミノ閑配列の中か
らＭｅ’ｊ−Ｐｒｏ−Ａ　ｌ　ａ−ｐｈｅ−Ａ　Ｉ　ａ
て示される５個のアミノ酸の配列に基づいて１４個の連
続するヌクレオチドを得た。（図１）合成は、プローブ
（、ＩＷＱ＞と同様な方法で行いヌクレオチド樹脂ＡＰ
−ｄ　（Ｔ）（ヤマサ鵠油礼製）に（ＤＭＴｒ）ＣＤＡ
Ｄ（ｌｌ！１ｌＲ３）　　；　（Ｄ）ｆＴｒ）ＧｐＧｔ
）（ＮｌｌＲ３）；　　（Ｄ）ｌＴｒ）Ｃ１）Ａｔ）（
ＮｌｌＲ３）　　、　　（Ｄ）ｌＴｒ）Ｃ１）ＴＩ）（
ＮＨＲ３）　　。

（ＤＨＴｒ）ＣｐＧｐ（ＮｌｌＲ３）および（ＤＨＴｒ
）ＣｐＣＩ）（ＮｌｌＲ３）の等１合物　；　　（Ｄ）
ｆＴｒ）ＡＩ）ＧＤ（ＮｌｌＲ３）　　、　　（ＤＨＴ
ｒ）丁ｐＧｐ（ＮｌｌＲ３）　、　（ＤＭＴｒ）ＧＤＧ
Ｄ（ＮｌｌＲ３）および（［１ＨＴｒ）ＣＤＧＩ）（Ｎ
ＨＲ３）の等量混合物：　（ＤＨＴｒ）ＡｐＡｐ（間も
）；（ＤＨ’ｒｒ）ＣｐＡｐ（ＮｌｌＲ３）と（ＤＨＴ
ｒ）ＣｐＧｌ）（ＮｌｌＲ３）の等量混合物（ＤＨＴｒ
）Ｇｏ（ＮｌｌＲ３）　　（いずれも日本ゼオン社製）
の順に縮合ざＵて約１０Ａ　２６ｏｕｎｉｔｓの合成り
ＮＡを得た。得られたオリゴヌクレオチドの塩基配列を
Ｈａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法により調べたところ図１
に示された塩基配列を有していることが確認された。

（ｉｉｉ）プローブ（ＬＣ）の合成 アプライドバイオシステム社のＤＮＡ合成機３８ＯＡに
より、自動合成を行った。この方法はｃａｒｕｔｈｅｒ
ｓ等の記載した原理（Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ。

Ｓｏｃ、、１競巻３１８５頁（１９８１））に基づいて
おり、ホスホアミダイト法と称されている。

５′のジメトキシトリチルＩ（ＤＭＴｒ）を脱保護した
ｄＧ−３（Ｓは支持体）にテトラゾールで予め活性化し
た（ＤＭＴｒ＞−ｄＴのホスホアミダイト体を縮合させ
た後、未反応の水酸基をアセチル化し、次いで水存在下
でヨウ素酸化を行ってリン酸体に導いた。ＤＨＴｒ基を
脱保護し、以後同様に縮合を繰り返して図１に示される
如き配列の２４個のヌクレオチドを合成した。得られた
ヌクレオチドを支持体から開裂けしめ脱保護した後、０
１８カラム（センシュー科学社製５ｓｃ−ｏｏｓ−２７
２）を用いた逆相系高速液体クロマトグラフィーにて精
製した。

実施例５．　Ｃ間−２細胞の培養とｍＲＮＡの精製１）
ＣＩ−ＩＵ−２細胞の培養と細胞の回収樹立されたＣ　
ＨＵ　−２細胞を１５０ｃｎｉの培養フラスコ２本に完
全に密に増殖させた後、これをウシ胎児血清を１０％含
有するＲ　ＰＭ　Ｉ　１６４０培養液５００ｄに浮遊さ
せたのち、１５８０ｃｉｙｆのガラス製ローラーボ１−
ル（３ｅＩｃｏ社製）に移し、ｏ、　５ｒ、　Ｉ）、　
ｍ、の速度で４日間回転培養を行った。細胞がローラー
ボトルの内壁に完全に密に増殖した時点で、ローラーボ
トルから培養液を除き、あらかじめ３７°Ｃに加温した
ＥＤＴＡ＠０．０２％含む生理食塩水１００ｍ１を加え
、３７°Ｃで２分間加温後、ピペット操作にて細胞をは
く離ｕしめた。得られた細胞懸濁液を１５０Ｏｒ、　ｐ
、　ｍ、　１０分間の遠心にて細胞ペレットを１７る。

細胞をＥＤＴＡを含まない生理食塩水５ＩｎＩｌに再び
懸濁し、１５００ｒ、　ｐ、　ｍ、　１０分間遠心にて
細胞ペレットを得た（湿重担約０．８ｇ）　、このよう
にして（Ｇられた細胞はＲＮＡ仙出操出操作うまで一８
０’Ｃにて凍結保存する。

２）ｍＲＮＡの精製 上記の如くして１ワられたＣＨＵ−２細胞からのｍＲＮ
Ａの単離は本質的に’Ｈｏｔ（ＩＣＵＩａｒ　ｃｌｏｎ
ｉｎｇ　”［Ｈａｎｉａｔｉｓ等、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ
ｉｎｇ　ｌ１ａｒｂｏｒ、　　ｔ９６頁（１９８２）］
に記載されているようにして実施した。

凍結保存されていたＣＨＵ−２細胞（湿重量３．８ｇ）
に２０ｍ１．の６Ｍグアニジン溶液（６Ｍグアニジンチ
Ａシアナート、５’ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＩ−１
７，０＞　、　　０．１Ｍ／β−メルカプトエタノール
、０．５％ザルコシル硫酸すトリウム）に懸濁し、ｖｏ
ｒｔｅｘミキサーにて２〜３分よく混合した俊、１８Ｇ
の注射ε］を装てんした２０ｄ容の注射器を用いて１０
回吸入排出を繰り返した。ベックマン社ＩｕＳＷ４０Ｔ
　ｉローターに合うポリアロマ−製の遠心チュされるよ
うに上述の細胞が壊れて粘稠になったグアニジン溶液的
６Ｉｎｌを重層した。このようにして調製された遠心デ
ユープ４本を３０．００Ｏｒ、　ｐ、　ｍ、、２０°Ｃ
で１５時間遠心した後、得られたペレットを少量の７０
％エタノールを用いて３回洗浄した。

各々のチューブから得られたペレットを合して５５０μ
ｍの水に溶解せしめＮａＣｌ濃度が０．２Ｍとなるよう
に調整したのら、フェノール−クロロボルム（１：１）
処理、クロロホルム処理後、２．５倍容吊のエタノール
を加えてエタノール沈澱を行い全ＲＮＡを１ワた。（湿
細胞３．８ｇより仝ＲＮＡ約１０．１ｍｇを１９だ。）
　全ＲＮＡからポリ（Ａ　　＞−ＲＮＡの精製は以下の
如く行った。この方法はｍＲＮＡが３′末端にポリＡ鎖
を付加していることを利用したアフィニティークロマト
グラフィーである。オリゴ（ｄＴ）−セル［１−ス（Ｐ
−１Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ礼製、ＴＶｐ（！７）を
用い、吸着は全ＲＮＡを吸着緩衝液（１０ｍＭトリス−
塩酸（ｐＨ７，５＞　　、　　　０．５Ｍ　　　ＮａＣ
ｌ、　　１ｍＭ　　　ＥＤ−ｒＡ。

０．１％ＳＤＳ溶液を含む。）に溶解し、６５°Ｃで５
分間加熱した後、同溶液にて充てんされたオリゴ（ｄ［
）−セルロースカラムに通過させて行い、溶出はＴＥ溶
液（１０ｒｒ１Ｍトリスー塩Ｍ　（ｐｔ−Ｉ　７．５）
、１ｍＭ　　ＥＤＴＡを含む。）で行った。未吸着通過
液は再び同カラムに通して同様に溶出操作を行い、１回
目の溶出液と混合した。このような操作を用いて、ポリ
（Ａｈ　　ＲＮＡ４００μｇを１７だ。このようにして
調整したｒＴＩ　ＲＮ　Ａを５ｃｈｌｅｉｆとＷｃｎ５
　ｉ　ｎｋの実験技術書（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ　ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｂｉｏｌｏｇｙ
、　　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、　　Ｎｅｗ　
Ｙ。

ｒｋ、　ｌｌｅｉｄｅｒｂｅｒｇ、　Ｂｅｒｌｉｎ、　
（１９８１））中に記載されている方法と同様の操作で
、ショ糖密度勾配遠心法によりサイズ画分した。

すなわら、５Ｗ４０Ｔｉローター（Ｂｅｃｋｍａｎ社製
）用チューブに５％〜２５％のショ糖密度勾配を作る。

ショ糖溶液は０．１Ｍ　　ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス−
塩！　　　（ｐＨ７，５＞、　　１ｍＭ　　　ＥＤＴＡ
、　　　０．５％ＳＤＳの溶液にそれぞれ５％、２５％
の割合いでＲＮａＳｅフリーのショ糖（Ｓｃｈｗａｒｚ
　／）ｌａｎｎ社製）を含／υでいる。

上記でｊホべた如き方法で調製したｍＲＮＡ　（ポリ（
Ａ”　）−ＲＮＡ＞　８００μｑを２００μｍ〜５００
μｍのＴＥ溶液に溶ＶＲ，Ｉ！シめ、６５°Ｃで５分間
加熱後急冷した後、ショ糖密度勾配液の上にのせる。

３０００Ｏｒ、　Ｄ、　ｍ、にて２０時間遠心後０．５
ｄずつの分画を集め２６０ｎｍの吸光度を測り、同様に
行った標準ＲＮＡ　（２８Ｓ、１８Ｓ、５３のリポソー
ムＲＮＡ）ら分画されたＲＮＡのりイズを決めると同時
に各−分画のＧ−Ｃ３Ｆ活性をアフリカッメガエル（Ｘ
ｅｎＯｐＬＩＳ　Ｉａｅｖｉｓ）の卵母細胞系を用イテ
調べた。

すなわら各分画のｍＲＮＡを１μｇ／μｍの’ｈｔ　ｌ
ｘの水溶液に調製し、ツメガエル（生後約１年）から取
り出した卵母細胞１個に５０ｎｇのｍＲＮＡの割合いで
注入した後、９６穴のマイクロタイタープレートの１穴
に卵母細胞を１０個ずつ入れ、それぞれ１００μ＋のパ
ース培地（８８ｍＭ　　ＮａＣｌ、１ｍＨＫＣＩ、２．
４ｍＭ　　ＮａＨＣＯ３，０，８２ｍＭＭＱＳＯ４、０
，３３ｒｎＭ　　Ｃａ　（ＮＯ３）２　。

０．４１ｍＭ　　ＣａＣｌ２，７．５ｍＭ１’リス−塩
酸（ＤＨ７，６）　、ペニシリン１０ｍｙ／　ｌ　、ス
トレプトマイシン硫酸１０ｍｙ／　ｌ　）中で４８時間
室湿で培養した後上清を回収し、）量線）精製してＧ−
Ｃ３Ｆ活性を測定する。

この結果、１５〜１７８両分にＧ−Ｃ３Ｆ活性が認めら
れた。

実施例６．０ＤＮＡの合成（ＰＢＲ系ｃＤＮＡライブラ
リーの構築） 前述の方法で得られたポリ（Ａ”　）−ＲＮＡからＩ　
ａｎｄ等の方法［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ
　、　９ｉ２２５１頁（１９８１）］に塁づぎ、Ｇｕｂ
ｌｅｒとＩＪＯｆｆｍａｎの方法［Ｇｅｎｅ、２５巻２
６３頁（１９８３）　］を加味してＣＤＮＡを１７だ。

１）１本鎖ＣＤＮＡの合成 エツペンドルフ社製１．５７容デユープに以下の如くの
順序で試薬を入れる。８０μｍの反応緩衝液（５００ｍ
Ｍ　　ＫＣＩ　、　５０ｍＭ　　ＭＱＣ１２、２５０ｍ
Ｍ＋−リス−塩Ｍ、　ｐＨ８，３＞　、　２０μ＋の２
００　ｍ）ｌジヂオスレイトール、３２μ＋の１２．５
ｍＭ　　ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄ
ＴＴＰを各々１２．５ｍ１ｖｌ含む）、１０μ＋のα−
３２Ｐ−ｄＣＴＰ（アマジャム製、　ＰＢ　１０２０５
）　、　３２μｍのオリゴ（ｄ７）　　　　　（ｐ−Ｌ
　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ礼製。

５００／ｌ　／ｆｒ１ｆり　、　２０μｍのポリ（Ａ　
　ＩＲＮＡ（２，１μｇ／μｍ）、蒸溜水２０６μｍの
計　４００μｍの反応液を６５℃で５分間加熱後、４２
℃で５分間加温する。この反応液に逆転写１ｖｙ素（宝
酒造製）１２０単位を加え、さらに４２°Ｃ１２時間反
応させた接、ＲＮ　ａ　ｓ　ｅインヒビター（Ｂｅｔｈ
ｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂＯｒａｔＯｒ　ｉ　
ｅＳ礼製＞　２μｌ　、２０μｌのＴＥ温溶液１６μｍ
のＴｏｏ　ｍＭピロリン酸ナトリウム、４８単位（４μ
ｍ）の逆転写酵素を追加して、今度は４６°Ｃ２時間反
応じしめた。０．５Ｍ　　ＥＤ−ｒＡ　　ａｕｌ　。

１０％ＳＤＳ　　８μｍを加えて反応を停止させた後、
フェノール−クロロホルム処理、エタノール沈澱（２回
）を行い一本鎖ｃＤＮＡを１９だ。

２）１本鎖ＣＤＮＡへのｄＣ−鎖付加 上記で１昇られた一本鎖ｃＤＮＡを６０μｍの蒸溜水に
溶解後、６０μｍのｄＣ−鎖付加緩衝液（４００ｍＭカ
コジル酸カリウム；５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ６，９
）：４ｍＭジヂオスレイトール：１＋ｕＨＣｏＣＩ２　
：　１ｍＭ　　ｄＣＴＰに加え、３７℃で５分間加温し
た。この反応液にターミナルトランスフェラーゼ（２７
ｕｎｉｔ／μｌ　、　Ｐ−Ｌ　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌｓ社製）３μｍを加えて３７°Ｃで２．５分間反応し
た後、フェノール−クロロホルム処理（１回）、及びエ
タノール沈ｖｉ（２回）行い、１００ｍＭ　　ＮａＣｌ
を含むＴＥ溶液４０μｍに溶解せしめた。

３）２末鎖ｃＤＮＡの合成 上記４０μｍのＤＮＡ溶液に４μＩのオリゴＧ）　　　
　　　　（２００μｇ　／ｍ１．Ｐ−Ｌ　　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌｓ？ｆ’Ｍ）を加え６５℃５分間、続いて
４２℃で３０分間ＦＪＱ湿した後、反応液を０℃に保っ
た。この反応液に緩衝液８０μＩ　　（ｔｏＯｍＭ　１
〜リス−塩酸、ｐＨ７，５，２０ｍＭ　　ＭＱＣ＋　２
　、５０ｍＭ　（ＮＨ４）　２　ＳＯ４。

５００ｍＭ　　ＫＣＩ　＞　、　４μｌの４ｍＭ　　ｄ
ＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰを各
々４ｍＭ含む）、６０μｍの１ｍＭβ−ＮＡＤ、及び２
１０μｍの蒸溜水、２０μｍのＥ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡポ
リメラ−Ｕｌ（宝酒造社製）、１５μ；のＥ。

ｃｏｌｉ　ＤＮＡリガ−ピ（宝酒造社）、１５μｍのＥ
。

ｃｏｌｉ　ＲＮａｓｅ　Ｈ（宝酒ｊａ社）をＩＪ［１え
１２℃にて１　ｆＩＩ間反応させた後、さらに４μｍの
４ｍＭｄＮＴＰを’＞Ｑ加し、２５℃で１時間反応して
、フェノール−クロロボルム処理、エタノール沈澱（１
回）を行って、約８μｑの２末鎖ｃＤＮＡを（ワた。こ
の２木鎖ＣＤＮＡをＴＥ温溶液溶解せしめ１．２％アカ
ロースグル電気泳動を行い、約５６０塩基対（ｂｐ）〜
２キロ塩基対（ＫＭ））の大ぎざに相当する部分をワッ
トマンＤＥ８１（ワットマン社製）に吸着させ溶出回収
したところ、約０．２μりが回収された。

４）２末鎖ｃＤＮＡへのｄＣ−鎖付加 上記の如＜’＋”Ｉられた２本鎖ＣＤＮＡを４０μｍの
Ｔ　Ｅ溶液に溶解し、２）の項で述べたｄＣ−鎖イ」加
緩衝１μｍを加え３７℃で２分間加温した後、１μｍの
ターミナルトランスフェラーゼ（２７ｔＪｎｉｔ／μＩ
）を加えて３７℃で３分間反応せしめた。反応液を直ち
にＯ′Ｃに冷却し０．５Ｍ　　ＥＤＴＡＩμｍを加えて
反応を停止した後、フェノール−クロロホルム処■！、
エタノール沈澱を行い、１■られた沈澱をＴＥ溶液１０
μｍに懸濁した。

５）　　ｐＢＲ系ＣＤＮＡライブラリーの構築市販のオ
リゴ（ｄＧ）鎖付加ｐＢＲ３２２ベクターくベセスダリ
サーチラボラトリーズ社製、１０μｇ／μ（）４μｍと
上記ｄＣ−鎖付加２本鎖ｃＤＮ八２へｍを７５μｍの領
ＩＭ　　ＮａＣ１を含むＴＥ溶）１にの中でアニールさ
せた。アニールは６５°Ｃ１５分加温した後４０°Ｃに
て２時間加温、その後、室温になるまで放置して行った
。

一方、ＨａｎｉａｔｉＳらの実験ｉ［Ｈｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒ、　　２４９
頁（１９８２）］に記載されている方法等を用いて大腸
菌Ｘ１７７６株からコンピテント細胞を調製し、上記ア
ニールされたプラスミドにより形質転換を行い、トラン
スフォーマント（形質転換体）／Ｊｌ？？られた。

実施例７．ｃＤＮＡ合成（λフアージ系ライブラリーの
構築） １）１本鎖ＣＤＮＡの合成 実施例５で述べた方法に従って３．８ｇの凍結保存Ｃｌ
−Ｉ　Ｕ　−２細胞から２回Ａリゴ（４丁）セルロース
カラムによる精製を経て４００μりのポリ（Ａ＋）−Ｒ
ＮＡを１７だ。

このポリ（Ａ　　）−ＲＮＡ１２μｑを溶解したＴ［溶
液１０μｍを１０μＱのアクチノマイシンＤ（シグマ社
製）を含む反応チューブに入れた後、以下の順序で試薬
類を加えた７２０μｍの逆転写緩衝液（２５０ｍＭ　ト
リス−塩酸（１１８，３＞　、　４０ｍＭＭＣＪ　Ｃ１
２’　、２５０　ｍＭ　　ＫＣＩ　＞　２０．ｃｚｌの
５ｍＭｄＮＴＰ　（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＧＴＰ、　
ｄＴ’ｒＰを各々５ｍＭ含む）、２０μｌのオリゴ（”
［）１２−１３　　（０，２μ（］　　／ｄ　　　Ｐ−
Ｌ　　ＢｉＯＣｈｅｍｉＣａｌＳ社製）、１μｍの１Ｍ
ジチオスレイトール、２　μｍの３０ｕｎｉｔ／μｍの
ＲＮａｓｅ　（プロメガバイオチク社）。

１０μｍの逆転写酵＄　（１０ｕｎｉｔ／μｍ生化学工
業社製）、１μｍのα−［３２ｐ］　ｄＡＴＰ　（１０
μＣｉアマシ（／ム礼Ｍ）、１６μｍの水で訂　ｉｏｏ
μｊの液量の反応液になる。反応液を４２°Ｃで２時間
保った後、５μｍの０．５Ｍ　　ＥＤＴＡ及び１μｍの
２０％ＳＤＳを加えて反応を停止した。フェノール−ク
ロロホルム（１００μｍ）処理、エタノール沈澱（２回
）を行って約４μＱの１本鎖　ＣＤＮＡを得た。

２）２本鎖ＣＤＮＡの合成 上記の如く得られたＣＤＮＡを２９μｍのＴＥ溶液に溶
解し以下の順序で試薬類を加えて反応液とした；２５μ
ｍのポリメラーゼ緩衝液（４００ｒＴＩＭｔｌｅｐｅｓ
　（ｐＨ７，６）　：１６ｍＭ　ＭｇｃＩ２：６３ｎｔ
Ｈのβ−メルカプ１へエタノール：　　２７０ｍＭ　　
ＫＣＩ　）　　；１０μｍの５ｍＭ　　ｄＮＴＰ：　　
１．Ｏμｌの１５ｍＭβ−ＮＡＤ：　１．０μｍのα−
［３２１）］　ｄＡＴＰ　（１０μＣｉ／μｌ　）　：
　　０．２μＩ　Ｅ、　　ｃｏｌｉ　ＤＮＡリガーゼ（
６０ｕｎｉ　ｔ／　！ｌ　ｌ宝酒造社製）：　５．０μ
＋のＥ。

ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼＩ　（Ｎｅｗ　Ｅｎａｌ
ａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社、　１０ｕｎｉｔ／μｌ　）
　；　０．１μｌのＲＮａ　Ｓ　ｅ　Ｈ（６０ｕｎ　ｉ
　ｔ／μｍ宝酒造社製）；２８．７　　μｍの蒸溜水。

反応液を１４°Ｃで１時間インキュベートした後、室温
にもどして、さらに１時間インキニーベートした。次い
で５μｍの０．５Ｍ　　ＥＤＴＡと１μｍの２０％ＳＤ
Ｓを加えて反応を停止さけ、フェノール−クロロホルム
処理、エタノール沈澱を行った。

ｊｑられたＤＮＡを０．５ｍＭ　　ＥＤＴＡ２０μｌに
溶解せしめ、３μｍのに１ｅｎＯＷ緩衝液（５００ｍＭ
トリス−塩酸（Ｉ）ｌ−１８，０）　、　５０ｍＭ　　
ＭＣ！　ＣＩ　２　）　。

３μｍの５ｍＭ　　ｄＮＴＰ、及び水４μｍを加えて反
応液を調製した後、１μｍのＤＮＡポリメラーピ（ＫＩ
　ｅｎｏｗ断片）（宝酒迄社製）を加えて３０°Ｃ１５
分インキュベートした。

この反応液に７０μｍのＴ「溶液を加えて希釈し、さら
に５μｍの０．５Ｍ　　ＥＤＴＡ、１μｍの２０％ＳＤ
Ｓを加えて反応を停止した。反応液をフェノール−クロ
ロホルム処理し、エタノール沈澱を行って約８μｑの２
本鎖ＣＤＮＡを１７だ。

３）２本鎖ＣＤＮＡのメチル化 ２）の項で合成した２本鎖ＣＤＮＡの水溶液３０μｍ、
メチル化緩衝液（５００ｍＭトリス−塩酸（ｐ＋−１ａ
、ｏ＞　　、　　５０ｍＭ　　　ＥＤＴＡ）４０μｔ　
　、　　ＳＡＨ溶液＜　ａＯＯμＭＳ−アデノシル−し
−メチルメチオニン（ＳＡＭ）、５０ｍＭ　　β−メル
カプトエタノール）２０μｍ、水１００μｍを加えた混
合液に［ｃｏＲＩメヂラー１２；　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ
ａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社。

２０ｕｎｉｔ／μｍ）１５μｍを加えて全反応液を２０
０μｍとし、３７°Ｃ２時間インキュベートした。フェ
ノール処理、エーテル処理を行った後、エタノール沈澱
を行ってＤＮＡを回収した。

４）　　ＬｃｏＲＩリンカ−のイ」加 上記メチル化された２本鎖ＤＮＡ約１．２μｑにリカー
ｔｌ；緩ｎｉ液（２５０ｍＭ　Ｉ”リス−塩ｍ　　（ｐ
Ｈ７，５）　、　　ｔｏｏｍＭ　　ＭＱｃ　１２．　　
＞　　１．５μｌ　、あらかじめリン酸酸化されたＥＣ
０ＲＩリンカ−０，５，ｃｚｌ　　（１０ｍｅｒ、宝酒
造社製）、１．５μｍの１０ｍＭＡＴＰ、　　１００ｍ
Ｍジチオスレイトール１．５μ＋　。

２μｍの）−１２０を加え、反応液を１５μｍとしてＴ
４ＤＮＡリガーゼ（３，４ｕ／μｌ　、宝酒造社）０．
７μｍ加えて４°Ｃで一晩反応させた後、６５°Ｃにて
１０分間加熱しりガーゼを失活さけた。この反応液をさ
らに１００ｍＭトリス−塩酸（１）Ｈ７，５）　。

５ｆ丁ＩＭ　　Ｍ　ｇＣＩ　２　　、　５０ｍＭ　　Ｎ
　ａＣＩ　、　　１００μｇ／威のピラチンの濃度で全
液量が５０μｍになるように調製した後、ＥｃｏＲＩ　
（１０ｕｎｉｔ／μｌ　）３．５μｍ加え、３７℃、２
時間反応させた。次いで０．５ＭのＥＤＴＡ２ｔ５μｍ
、２０％ＳＤＳ　Ｏ，５μｍを加えた後フェノール−ク
ロロホルム処理を行いエタノール沈澱によりＤＮＡを回
収した。この後Ｕｌｔｒｏｇｃｌ　ＡｃＡ３４　（Ｌ　
Ｋ　Ｂ社製）のゲル濾過法ｄ５ルいはアガロースゲル電
気泳動法にて未反応のＥＣ０ＲＩリンカ−を除去し、リ
ンカ−付加２重鎖ＣＤＮＡ約０．５〜０．７μｇを回収
した。

５）２本鎖ＣＤＮＡとλ（ＪｔｌＯベクターの結合上記
のリンカ−付加２＊鎖ｃＤＮ△を２．４μｇの予じめＥ
ｃｏＲＩ［理したλｇｔｌＯベクター（ベクタークロー
ニングシステム社）、リガービ緩衝液（２５０ｍＭ　１
〜リスＪ’ＡＭ、　１００　ｍＭ　　ＨｇＣｌ２　）１
．４μｍ、蒸溜水６．５μｍを加えて、４２°Ｃ１１５
分間処理した後１０ｍＭ　　ＡＴＰＩμｌ　、０．１Ｍ
ジー７’−オスレイトール１μｌ　、Ｔ４ＤＮＡリガー
ビ０．５μｍをｈ［Ｉえ仝量を１５μｍとした後、１２
℃で一晩反応させた。

６）インビトロパッケージング 上記５）で１ｑられた組換え体ＤＮＡの約１７３をイン
ビ］〜ロバッケージングキット（プロメガ　バイオチク
社）を用いてパッケージングし、ファージプラークを１
９だ。

実施例８．１０−ブ（ＩＷＱ）によるｐＢＲ系ライブリ
ーのスクリーニング コロニーの成育した寒天培地上にワットマン５４１′ａ
紙をのケ３７℃で２時間放置した。以下、ｒａｕｂとＴ
ｈｏｍｐｓｏｎの方法［Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　
、　　１２６巻２２２頁（１９８２）］に準じて濾紙を
処理した。

すなわら、５４１濾紙にコロニーを移した後、クロラム
フェニコール（２５０μｇ／μｍ）を含んだ寒天培地に
移し、さらに３７℃で一晩放置した。

５４１濾紙を取り出した後、室温下で０．５　Ｎ　　Ｎ
ａ０１１溶液を浸した濾紙上に３分間放置し、これを２
回くり返した。以下同様な操作を０．５Ｍトリス塩酸（
ｐＨ８＞溶液を用いて３分間、２回行ない、ざらに４°
Ｃ下に０．０５Ｍトリス塩酸（ｐ）−１８＞溶液で３分
、１．５ｍｇ／ｍのリゾチーム液（０，０５Ｍトリス塩
１（ＤＨ８）、２５％ショ糖を含む）で１０分間、次い
で３７℃下に１　ｘＳＳＣ（０，１５Ｍ　　ＮａＣｌお
よび０．０１５クエン酸すトリウム））合液で２分間、
２００μｇ／ｍ１プロテアーゼｋを含む’１ＸＳＳＣ溶
液で３０分、再び室温下に１ＸＳＳＣ溶液で２分間、９
５％エタノール溶液で２分間、２回行った後、５月濾紙
を乾燥させた。１７られた乾燥　５４１濾紙を室温下に
フェノール：クロロホルム：インアミルアルコール（２
５：　２４　：　１　、　１００ｍＭ　トリス塩酸（ｐ
ｉｔ　８．５＞、ＩＱＱｍＭ　　ＮａＣ１，ＩＱｒｎＭ
ＥＤＴＡで平衡化したもの）溶液に３０分間浸した。

以下同様の操作を５ＸＳＳＣ溶液で３分間、３回次いで
９５％エタノール溶液で３分間、２回行った後、濾紙を
乾燥させた。

プローブ（ＩＷＱ）を常法（）ｌｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃ
ｌｏｎｉｎｇを参照）に従って３２ｐを用いて改削標識
した後、ＷａｌｌａＣ（！等の方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　
Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　９巻８７９頁（１９８１））に
従ってコロニーハイブリダイピージョンを行った。６Ｘ
ＮＥＴ　［０，９Ｍ　　ＮａＣｌ。

０．０９Ｍトリス塩酸（ＤＨ７，５）　、　６ｍＭ　　
ＥＤＴ八］へ５　Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、０．１％
ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍ１変性ＤＮＡ　（仔牛胸腺ＤＮ
Ａ）を含むハイブリダイビージョン緩衝液中で６５°Ｃ
１４時間、プレハイブリダイゼーションを行った後、放
射標識化したプローブ（ＩＷＱ）　１　ｘｌＯ”　　ｃ
ｐｍ／ＩｎＩ２を含む前記ハイブリダイゼーション緩Ｄ
ｉ液を用いて５６°Ｃで一夜ハイブリダイゼーションを
行った。反応終了後５４１′ａ紙を室ｔ−下に０．１％
ＳＤＳを含ムロ　ｘ　ＳＳＣ溶液で３０分、２回および
５６℃、１，５分間洗滌した後、オートラジオグラフィ
ーを行った。

シグナルの出たクローンよりプラスミドを分離した後、
プローブ（ＩＷＱ）を用いて１ノ舎アンブロツテイング
を行った。ハイブリダイピージョンおよびオートラジオ
グラフィーは前述と同一の条件で行なった。

同様にプローブ（Ａ）を用いてサザン　ブロッティング
を行った。ハイブリダイゼーションは前述のハイブリダ
イゼーション４１８７液を用い、４９°Ｃで１時間行い
、３９℃まで徐冷後さらに３９°Ｃで１時間行なった。

反応終了後、ニトロセルロースフィルターを０．１％Ｓ
ＤＳを含む６ＸＳＳＣで室温下に３０分で２回洗滌し、
次いで３９℃で３分間洗滌した後、オートラジオグラフ
ィーを行なった。

この結果、１個のクローンがポジティブなものとして１
ｑられ、ジデオキシ法により塩基配列を決定したところ
図２に示した如く、プローブ（ＩＷＱ）及びプローブ（
八）部分を含む３０８塩基対よりなるＤＮＡであること
が判明し、このインサートを含むｐ　［３Ｒ３２２由来
プラスミドをｐＨｃｓ−１と命名した。

実施例９．　ｐＨＣ３−１由来ＤＮＡプローブによるλ
フアージ系ライブラリーのス クリーニング ＢｅｎｔＯｎとＩ）ａｖ　ｉ　ｓの方法［５ｃｉｃｎｃ
ｅ　　１９６ｉ、　　１８０頁、　（１９７７）］に〆
（（じてプラークハイブリダイピージョンを行った。実
施例８で１７られたｐｌ−Ｉ　ＣＳ　−１を５ａｕ３Ａ
およびＥＣ０ＲＩで処理して約６００塩基対のＤＮＡ断
片を得、このＤＮＡ断片を常法に従いニックトランスレ
ーションにより敢ｑ］標識した。ファージプラークの生
じた寒天培地上にニトロセルロース濾紙（Ｓ＆Ｓ社）を
のせてファージを移し、０．５Ｍ’ＮａＯＨにてＤＮＡ
を変性させ、以下の順序で濾紙を処理した。０．１ＭＮ
ａＯＨ，１，５Ｍ　　ＮａＣｌで２０秒統御て０．５Ｍ
トリス塩１（ｐＨ７，５＞、　　１．５Ｍ　　ＮａＣｌ
で２０秒２回、Ｒ後に１２０ｍＭ　　ＮａＣｌ、１５ｍ
Ｍクエン酸ソーダ、１３ｍＭ　　ＫＨ２ＰＯ４，１ｍＭ
ＥＤＴＡ、　ｐ）＋　７．２で２０秒処理した。

次いで濾紙を乾燥し、８０℃で２時間加熱してＤＮＡを
固定した。５ＸＳＳＣ，５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ溶液、５
０ｍＭリンＭ緩衝液、５０％ホルムアミド。

０．２５　ｍＦＩ／ｍｌの変性ＤＮＡ　（鮭精巣ＤＮＡ
）、及び０．１％ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション
緩衝液中で４２°Ｃにて一部プレハイブリダイゼーショ
ンを行い、ニックトランスレーションにより放射標識化
したｐＨＣ８−１１０−ブ４Ｘ１０”　　Ｃｐｍ／威を
含むハイブリダイピージョン緩衝液（５×３３　Ｃ、５
Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６，０＞　、　５ｏ％ホルムアミド、０．１％ＳＤＳ
。

１０％デキストラン硫酸、　　０．１ｍｙ／ｍｌｌの変
性ＤＮＡ（鮭精巣ＤＮＡ）の混合液）で４２℃にて２０
時間ハイブリダイＬピーョンを行った。

ニトロセルロース濾紙を室温下に０．１％ＳＤＳを含む
２ＸＳＳＣで２０分間洗滌し、次いで４４℃で、ｏ、ｉ
％ＳＤＳを含む０．ｌＸ５ＳＣで３０分間、さらに室温
下でｏ、１ｘｓｓｃで１０分間洗滌した後、オートラジ
オグライーで検出した。

その結果、５個のポジティブなりローン（Ｇ１〜５）が
得られた。そこで、ｊｑられだクローンのうら完全長Ｃ
ＤＮＡを含むと思われるクローンのＤＮＡ塩基配列をジ
デオキシ法にて調べたところ図３に示される如き塩基配
列が得られた。そこでこのｃＤＮＡをλｇｔｌＯベクタ
ーより切りだし、ｐ　［３Ｒ３２７［５ｏｂｅｒｏｎ等
：　Ｇｅｎｅ９巻２８７頁　（１９８０）］とＥＣ０Ｒ
Ｉ部位で結合させ、プラスミドとして大損調製した。こ
のプラスミドをｐＢＲＧ４と称する。

実施例１０．１）ＢＲＧ４由来ＤＮＡプローブおよびプ
ローブ（ＬＣ）によるλフアー ジ系ライブラリーのスクリーニング 実施例って用いたＢｅｎｔＯｎとＤａｖ　ｉ　ｓの方法
（前出の文献を参照）に準じてプラハークハイプリダイ
ビーションを行った。ファージプラークの生じた寒天培
地上にニトロセルロース濾紙（Ｓ＆Ｓ礼製）をのけてフ
ァージを移し、０．５Ｍ　　Ｎａ０１−１にてＤＮＡを
変性させ、以下の順序で濾紙を処理した。

０．１Ｍ　　ＮａＯＨ１１，５Ｍ　　ＮａＣ１で２０秒
、続いて０．５Ｍトリス−塩Ｍ　（ｐＨ７，５）、１．
５ＭＮａＣｌで２０秒２回、最後に１２０ｍＭ　Ｎ　ａ
　ＣＩ、１５ｍＭクエン酸ソーダ、１３ｍＭＫＨ２ＰＯ
４，１ｍＭ　　ＥＤＴＡ、（ｐＨ７，２）　１２０秒処
理シタ。

次いで濾紙を乾燥し、８０′Ｃで２時間加熱してＤＮＡ
を固定した。このようにして同一の濾紙を２枚作製し、
ｐＢＲＧ４由来ＤＮＡプローブとプローブ（ＬＣ）によ
るスクリーニングにそれぞれ供した。

ｐＢＲＧ４由来ＤＮＡプローブによる場合は、ｐＢＲＧ
４をＥＣ０ＲＩで処理して約１５００塩基対のＤＮＡ断
片を得、このＤＮＡ断片を常法に従ってニックトランス
レーションにより放射標識した。

上記濾紙を５ＸＳＳＣ１５Ｘ　０ｅｒｌｈａｒｄｔ溶液
、５０ｍＭリン酸緩衝液、５０％ホルムアミド、０．２
５　ｍｇ／ｒｎｌｌの変性ＤＮＡ　（鮭精巣ＤＮＡ）　
、及び０．１％ＳＤＳを含むハイブリダイピーシフン緩
衝液中出４２°Ｃにて一晩、プレハイブリダイゼーショ
ンを行い、上記の放射標識した約１５００塩基対のＤＮ
Ａプローブ（約１×１０６Ｃｐ１１１／ｒｄ、）を含む
プレハイブリダイピージョン緩衝液［５ＸＳＳＣ１５ｘ
　０ｅｎｈａｒｄｔ溶液、２０ｍＭリン酸緩衝液（１）
Ｈ６，０）　、５０％ホルムアミド、０．１％ＳＯ３，
１０％デキストラン硫酸、０．１ｍＦｉ／ｍｉの変性Ｄ
ＮＡ　（鮭精巣ＤＮＡ）の混合液］で４２℃にて２０時
間ハイブリダイゼーションを行った。ニトロレルロース
濾紙を室温下に、０．１％ＳＤＳを含む２ＸＳＳＣで２
０分間洗滌し、次いで４４°Ｃで、０．１％ＳＯ８を含
む０．ｌＸ５ＳＣで３０分間、さらに室温下で０．１％
ＳＳＣで１０分間洗滌した後、オートラジオグライーで
検出した。

プローブ（ＩＣ）の場合は、濾紙を０．１％ＳＯ３を含
む３ＸＳＳＣで、６５°Ｃにて２時間前処理した後、６
ＸＮＥＴ、１ｘＤｅｎｈａｒｄｔ溶液、１００μｇ／威
の変性ＤＮＡ　（鮭情栄ＤＮＡ＞を含む溶液中、６５℃
で２時間、プレハイブリダイピージョンを行った。

放射標識したプローブ（ＬＧ＞　　（２ｘ１０６ｃｐｍ
／ｍｌ）を含むプレハイブリダイゼーション緩衝液［６
×ＮＥＴ、１　Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１００μ（
］　／ｎｄｌ変性ＤＮ″Ａ（鮭精巣ＤＮＡ）］で６３°
Ｃにて一晩ハイブリダイゼーションを行った後、二１〜
ロセルロース瀘紙を室温下に、０．１％ＳＤＳを含む６
ＸＳＳＣで２０分間洗滌し、この洗滌を３回行った後、
０．１％ＳＤＳを含む６ＸＳＳＣにて、６３°Ｃで２分
間洗滌した。

濾紙を乾燥した後オートラジオグラフィーで検出した。

このようにして行ったスクリーニングに於いて、２つの
プローブの両方にポジティブなりローンを選別し、その
うら完全長のＣＤＮＡを含むと思われるクローンの塩基
配列をジデオキシ法にて調べたところ、図４（Ａ）に示
される如き塩基配列が得られれた。そこでこのＣＤＮＡ
をλｇｔ１０ベクターより切りだし、ｐＢＲ３２７とＥ
ＣｏＲｌ部位で結合させ、プラスミドｐＢＲＶ２を得た
。

実施例月、［ｔａｃプロモーター含有ベクターを用いた
例］ １）組換えベクターの構築 ■　ベクターの調製 しａＣプロ’Ｅ−ター含有ベクターｐＫＫ　２２３−３
（ファルマシア礼製）５μｑを３０μＩの反応液（５０
ｍＭ　　　王ｒｉＳ−１−１ｃＩ　、　７　ｒｎＭ　　
ＨｇＣｌ　２．１ｏｏｒｎＭ　Ｎａｃ＋、７ｍＭ　２−
メルカプトドエタノール）中、ＥＣ０ＲＩ　（宝酒造社
製）８単位で３７°Ｃ１２時間速即した。

次いで、アルカリホスファターゼ（宝酒造社製）３μｍ
を加え６０°Ｃ，３０分間処理し、常法に従いフェノー
ル処理３回、エーテル処理及びエタノール沈澱を行って
ＤＮＡ断片を回収した。

このＤＮＡを５０ｍＭＴｒ　ｉ　５−ＨＣＩ、５ｍＭＭ
ｇＣ１２，１０ｍＭ　　ＤＴＴ、１ｍＭのｄ　Ａ　Ｔ　
Ｐ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ＴＴＰからなる５０μＩのｉ
捏合液に溶解し、大腸菌ＤＮＡポリメラーピＩ−Ｋｌｅ
ｎｏｗ断片（宝酒造社製）３μｍを加えて１４℃、２時
間反応じしめ、末端をブランｉ・エンド（ｂｌｕｎｔｅ
ｎｄ　）にした。

■　合成リンカ−の調製 合成リンカ−１ＣＧＡＡＴＧＡＣＣＣＣＣＣＴＧＧＧＣ
Ｃ及σＣＡＧＧＧＧＧＧＴＣＡＴＴＣＧの配列を有する
オリゴヌクレチオド３μｇを５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ
、１０ｍＭ　ＭＱＣ１２，１０ｍＭ２−メルカプトドエ
タノール らなる反応液４０μｍ中でＴ４ボリヌクレチオドキナー
ゼ４単位存在下、３７°Ｃ、６０分間反応せしめ、リン
酸化した。

次いで該リン酸化オリゴヌクレチオドを夫々０．２μｃ
＋を１００ｍＭ　　ＮａＣｌを含むＴＥ　（１０ｍＭＴ
ｒｉｓ−ｆ−ＩＣＩ　　、　ｐｌ−１８，０、１ｍＭ　
　　ＥＤＴＡ）２０μｍに溶解し、６５°Ｃ１１０分間
処理した後、室温まで徐冷することによりアニーリング
を行った。

■　Ｇ−Ｃ３ＦのｃＤＮＡ断片の調製 実施例１０で得た図４（Ａ）で示すｃＤＮＡを含有する
ｐＢＲＶ２６０　ｕａを６ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、
６ｍＭ　　ＭｇｃＩ２．６ｍＭ　　２−メルカトブトエ
タノール 限酵ｍＡ　ｐ　ａ　Ｉ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂ
ｉｏｌａｂｓ社製）１００単位、ＤｒａＩ　（宝酒造社
９４）５０単位で３７°Ｃ、３時間処理し、１．２％ア
ガロースゲル電気泳動にて約５９０ｂｐのＡｐａｌ−Ｄ
ｒａＩ断片約２／ｌを回収した。

■　上記各断片の連結 ■，■，■各断片を夫々的０．１μｑとり、２０μｍの
連結反応液（６６ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ、６、６ｍ
Ｍ　ＭｑＣＩ２、１０ｍＭ　　ＤＴＴ、１ｍＭＡ　Ｔ　
Ｐ　）に溶解しＴ４　ＤＮＡリガーゼ１７５単位を加え
て４°Ｃで一部反応し組換えベクターを（■だ。

２）形質転換 上記■で得られた組換えベクターを含む反応液２０μｍ
を用いて塩化ルビジウム法（前出Ｔ。

Ｈａｎｉａｔｉｓ等ｒＨＯｌｅｃｔｌｌａｒ　　ＣＩＯ
ｎｉｎ（ＩＪ　　Ｐ２Ｓ５（１９８２）参照）によりＥ
．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０５株を形質変換した。

１７られた形質転換株はアンピシリン耐性のコロニー培
養液にリプラスミドを分離し、制限酵素Ｂａｍｌ−Ｉ　
ｌ　、ＡｃｃＩＩ、ＡｐａＩで処理したところ目的の形
質転換株であることが確認できた。　　゛実施例１２．
　　［Ｐ，プロモーター含有ベクターを使用した例］ １）組換えベクター構築 ■　ベクターの調製 ＰＬ７０モーターを含むベクターｐＰＬ−ｌａｍｂｄａ
（ファルマシア社製）　　１００μｇを制限酵素３ａｒ
Ｔ１１−ＩＩ５０単位で反応液（１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ
−）−ＩＣＩ、ｐｌ＋７．６、７ｍＭ　　ｖｑｃｌ　　
、　　１００ｍＭ　　ＮａＣＩ　、１０ｍＭ　　ＤＴＴ
）１００μｌ中、３７℃、−晩処理した。

これから、１％アガロースゲル電気泳動にて、約４Ｋｂ
ｐの断片約４９μｑと約１．２Ｋ　ｂ　ｐの断片約１１
μｑを回収した。

上記の断片のうち、まず約４ＫｂＤの方を前記のＴＥ緩
衝液１００μｍに溶解し、アルカリボスフ７ターピ（宝
酒造社製）５μｍと６０°Ｃ、６０分間反応せしめ脱リ
ン酸化した。

残りの約１．２Ｋ　ｂ　ｐの断片の方は緩衝液（１０ｍ
ＨＴｒ　ｉ　Ｓ−ｔｉｃ　Ｉ　、１０ｍＭ　　ｆＶｔｇ
ｃ　１２　、６ｒＴＩＭＫＣＩ、’１ｍＭ　　ＤＴＴ）
２０μｌ　Ｇ．：溶解し、制限酵素Ｍｂｏ　ＩＩ　（Ｎ
ｅｗ　Ｅｎｑｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）２０単位
で３７°Ｃ、−晩処理した。

次いで、４％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により約
２００ｂｐのＢａｍｌ−ＩＩ−ＭｂｏｌＩ断片約０、９
μｑと約３１０ｂｌ）のＭｂｏＩＩ−ＢａｍＨＩ断片約
１，９μ９を回収した。

■　合成リンカ−の調製 合成リンカ−ＴＡＡＧＧＡＧＡＡＴＴＣＡＴＣＧＡＴお
よびＴＣＧＡＴＧＡＡＴＴＣＴＣＣＴＴＡＧを実施例１
１の■と同様にしてリン酸化しアニーリングし、合成Ｓ
／Ｄリンカ−を得た。

■　発現用ベクターの調製 上記■で調製した約４ＫｂＤ断片０．１μｑ及び０、Ｐ
，領域を有するＢａｍｔ−ＩＴ−ＭｂＯＩＩ断片、ｔＬ
１領域を右するＭｂｏＩＩ−Ｂａｍｔ−ｉ１断片夫々０
．　０５μｑとアニールした合成Ｓ／Ｄリンカ−０、　
１μ（］を４０μ＋の反応液（６６ｒｎＭ　　Ｔｒ　ｉ
　ｓ　−１−ＩＣ１．　６．６ｍＭ　　ＭｇＣＩ２、１
０ｍＭ　　ＤＴＴ、１ｍＭＡＴＰ）中、Ｔ４ＤＮＡリガ
ービ（宝酒造社製）１７５単位存在下１２°Ｃ、−晩反
応Ｖしめた。

この反応液２０μｍを用い、Ｅ，　ｃｏｌｉＮ９９ｃ　
ｌ＋株（ファルマシア社製）をＣａＣＩ２法（前出の”
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　ｃｌｏｎｉｎｇ”参照）にて形
質転換した。

該形質転換株を培養し、そのアビシリン耐性のコロニー
の培養液よりプラスミドを分離して、制限酵素ＥＣＯＲ
　Ｉ　、Ｂａｍｌ−１１　３ｍａ　Ｉで処理したところ
目的のプラスミドであることがＩａＺされた。

次に、このプラスミドを２μｑとり、２０μｍの緩衝液
（１０ｍＭ　　Ｔｒ　ｉ　ｓ−１−１ｃ１６ｍＭＨＣＩ
、６ｍＭ　　ＭｇＣｌ２．５０ｍＭ　　ＮａＣ１）中、
制限酵素　Ｃｌ　ａ　Ｉ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　
Ｂｉｏｌａｂｓ礼製）５単位を３７°Ｃ１２時間反応さ
せた後６５℃１０分間で失活させた。

更にその反応液１μｍを２０μｍの前記連結反応液及び
Ｔ４ＤＮＡリガービ（宝酒造社製）１７５単位を用いて
１２℃、−晩反応した後、上記と同様にしてＥ、　　ｃ
ｏｌｉ　Ｎ９９ｃ　Ｉ　　株（ファルマシア社製）を再
び形質転換した。アンピシリン耐性コロニー培養液から
プラスミドを分離しＥＣ０ＲＩ、Ｂａｍ１−ＩＩで処理
し、目的のプラスミドを確認した。

■　Ｇ−Ｃ３Ｆ発現用組換えベクター及び形質転換体の
調製 ■で得られた発現用プラスミドを制限酵素Ｃ１ａｌで処
理し、末端をプラントエンドにした後実施例１１と同様
にしてＧ−Ｃ５ＦのｃＤＮＡ断片を組み込み組換えベク
ターを得た。これを用い、前出の）ｉｏｌｅｃｕｌａｒ
　Ｃｌｏｎｉｎｇに記載されているＣａＣｌ２法にてＥ
、ｃｏｌｉ　Ｎ４８３０株（ファルマシア社製）を形質
転換した。なお、目的の形質転換体の確認も実施例１１
と同様に行った。

実施例１３．　　［ｔ　ｒ　ｐプロー［−夕含有ベクタ
ーを用いた例］ １）組換えベクターの構築 ■　ベクターの調製 ｐＢＲ３２２のＣ１ａ）部位にトリプトファンプロＥ−
ターを含む約３３０　ｂｐのＨｐａＩＩ−Ｔａｑ１断片
を挿入し作製したｐＯＹ１プラスミド１０μｇを１０ｍ
ＭＴｒ　ｉ　５−ＨＣＩ　、６ｍＭ　　ｆＶＩｇｃ１２
．５０ｍＭＮａＣｌの反応液３０μｍ中、制限酵素Ｃ１
ａ１７単位、ＰＶｕＩＩ８単位で３７°Ｃ１３時間処理
した。　次いで、アルカリホスファターゼ（宝酒造社ｙ
Ａ）２μｍを加え６０℃、１時間反応せしめた。

これから１％アガロースゲル電気泳動により約２．６Ｋ
ｂ″ｐの断片を約２．５Ｆ９回収した。

■　合成リンカ−の調製 合成リンカ−ＣＧＣＧＡＡＴＧＡＣＣＣＣＣＣＴＧＧＧ
ＣＣ及びＣＡＧＧＧＧＧＧＴＣＡＴＴＣＧを実施例１１
の■と同様にしてリン酸化し、アニーリングした。

■　組換えベクターの調製 上記■で調製ベクターの断片的１μｇ、及び■の合成リ
ンカ−約１μｇと、実施例１１の■で調製し一１ｃＧ−
Ｃ８ＦのｃＤＮＡ断片約１μｑを前記の連結反応液２０
μｍ中、Ｔ４ＤＮＡリガーピ（宝酒ｊ聞社ｕ）　　１７
５単位と１２°Ｃで一晩反応せしめ組換えベクターを得
た。

２）形質転換 上記■の反応液２０μｍを前出（ｌｆｏｌｅｃｕｌａｒ
　　ｃｌ。

ｎ　ｉ　ｎ（Ｉ　Ｊの塩化ルビジウム法でＥ、　ｃｏ　
ｌ　ｉ　ＤＩ−１１株に形質転換した。

実施例１１と同様にしてアンピシリン耐性のコロニーか
らプラスミドをとり、制限酵素ＡｐａＩ、Ｄｒａ　Ｉ、
Ｎｒｕ　Ｌ　Ｐｓｔ　Ｉで目的とする形質転換体が１９
られていることを確認した。

実施例１４．：形質転換株の培養 １）実施例１ｌ−ｃ−ｙｉた形質転換株（Ｔａｃ含有）
のＪ８養 アンピシリン２５μｇ／戒または５０μｇ／ｎｉを含む
ルリア（Ｌｕｒｉａ）　ＪＦｔ地１００ｕｆに、３７°
Ｃ１−晩培養した該形質転換株の培養液１ｄを加え３７
℃で２〜３時間培養する。次いで、イソプロピル−β−
Ｄ−チオガラクトシド２ｍＭにして３７°Ｃ１２〜４時
間培養した。

２）実施例１２で１７だ形質転換株（Ｐ、含有）の培養 アンピシリン２５μ０　／ｄまたは５０μＣＩ　／ｄを
含むルリア培地１００ＩＩｄ；！に２８°Ｃ−晩培養し
た該形質転換株の培養液１威を加え２８℃で約４時間培
養した。

その後、これを４２℃にし２〜４時間培養を行った。

３）実施例１３で１７だ形質転換株（ｔｒｐ含右）の培
養 ０．５％グルコース、０．５％カザミノ酸（ｏｉｒｃｏ
社製）、アンピシリン２５μ０　／ｄ又は５０μｔＪ／
ｍｌを含むＭ９培地１００ｄに３７℃−晩培養した該形
質転換株の培養液１ｍｌを加えて３７℃で４・−６時間
培養する。

次いで、３−β−インドールアクリルＭ（ＩＡＡ）５０
μｇ／ｍｌを加えて３７°Ｃで４〜８時間培養した。

施例１５．二大腸菌からのＧ−Ｃ３Ｆポリペプチドの回
収・精製 １）回収 実施例１４で培養した形質転換株、夫々について以下の
回収操作を行った。

培養液１００７を遠心分離にかけて菌体を集め、２０ｍ
Ｍ　　　Ｔｒｉｓ　−トＩＣＩ　　　（ｐｌ−１７，５
）　　、　３０ｍＭＮａＣｌ混合液５ｄに懸濁させた。

次いで、各々１ｍＭ、１０ｒｒ１Ｍ、０．２μｇ／ｄに
なるように０．２Ｍフェニルメチルスルホニルフルオラ
イド、０．２Ｍ　　ＥＤＴＡ、リゾデームを加え、０℃
で３０分間放置した。

次に凍結−融解を３回くりかえし溶菌させた。

続いて８Ｍ塩酸グアニジンを用いて、最終的に６Ｍ塩酸
グアニジンにした後、３０．０ＯＯｒ、　ｐ、　ｍ、、
５時間の遠心分離を行い、その上澄液を取得した。

２）精製 ｍ　　１）で得た上澄液を直径４．６Ｃｍ、長さ９０ｃ
ｍの旧ｔｒｏｇｅｌ　　ＡＣＡ５４Ｃ１８カラム社製）
にて、０．１５Ｍ　　ＮａＣｌおよび０．０１％ツイー
ン２０（半井化学社製）を含む０．０１Ｍトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ７，４）を用いて流速約５０威／時間でゲル
濾過した。次いて、前）ホしたｒｃｓＡの測定方法（ｂ
）」により活性を示す両分をとりｐＭ−１０（アミコン
社′ＩＡ）を用いる限外濾過器によって約５１ｄに）閃
絡した。

（ｉｉ）　　上記濃縮画分にｎ−プロパツール（東京化
成社製、アミノ酸配列決定用）を３０％含む０．１％ト
リフルオロ酢酸水溶液を添加し、水中に１５分程度放置
したのち、１５．００Ｏｒ、　ｐ、　ｍ、　１０分の遠
心により沈澱を除去した。次いで先のｎ−プロパツール
およびトリフルオロ酢酸を含む水溶液で平衡化したμＢ
ｏｎｄａｐａｋ　Ｃ１８カラム（ＷａｔｅｒＳ社製、セ
ミ分収用、８簡ｘ３０ｃｍ）に吸着後、３０〜６０％の
直線濃度勾配のｎ−プロパツールを含む０．１％トリフ
ルイロ酢酸水溶液で順次溶出した。高速液体クロマト装
置は日立６８５−５０型を、検出は日立６３８−４１型
検出器（いずれも日立製作新製）を用い、２２０ｎｍと
２８０ｎｍの吸収を同時に測定した。溶出後、各画分よ
り１０μｍを分取１００倍希釈したのら、前述のｒｃｓ
Ａの測定方法（ｂ）」により活性を示す両分を調べた。

この結果、ｎ−プロパツール４０％にて溶出されるピー
クに活性が認められたので、このピークを集め再度同じ
条件で再クロマトを行い上記と同様にしてＣ３Ａを調べ
たところ、やはりｎ−プロパツール４０％の位置のピー
クに活性が認められたので、このピークを集め（４フラ
クシヨン＝４７２＞凍結乾燥した。

（ｉｉｉ）上記凍結乾燥粉末をｎ−プロパツールを４０
％含む０．１％トリフルオロ酢酸水溶液２００μｍに溶
解し、ＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷカラム（東洋曹達社製、
　　７．５１ｎＩｎｘ６０ｃｍ＞を用いた高速液体クロ
マＩ〜グラフィ（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）にかけた。溶出は同水
溶液により０．４戒／分の流速で行い、フラクシコンコ
レクターＦＲＡＣ−１００（ファルマシア社製）により
０．４ｎｄｌずつ分取した。分取した各両分についてＣ
３Ａを前記と同様にして調べ活性画分を回収し、更に分
析用ｕ　Ｂｏｎｄａｐａｋ　Ｃ１８カラム（４，ｈ１７
１１ｘ３０ｃｍ＞による精製を施したのら、メインピー
クを回収し凍結乾燥した。

得られたタンパク質を２−メルカプトエタノールで処理
して５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（１５，０％）電
気泳動（１５ｍＭ、６時間）にかけ、クマシーブルーで
染色したところ目的とするＧ−Ｇ３「ポリペプチドが単
一のバンドとして確認できた。

実施例１６二発現物質のＧ−Ｃ３Ｆ活性の検定実施例１
５で得たＣ３Ｆ試料を前述のく参考例〉Ｃ３Ｆ活性の測
定方法（ａ）に従って検定した。

この結果を表−１に示す。

表−１ 実施例１７：アミノ酸分析 １）アミノ酸組成の分析 実施例１５で精製したＣ３Ｆ試料を常法により加水分解
し、そのタンパク部分のアミノ酸組成を日立８３５アミ
ノ酸自動分析装置（日立製作所社製）を用いて特殊アミ
ノ酸分析法により分析した。この結果を表−２に示した
。尚、加水分解条件は次の如くである。

■　６Ｎ　　１−ＩＣＩ、　　１１０℃、２４時間、真
空中■　４Ｎ　メタンスルホンｆｊ十０．２％３−（２
−アミノエヂル〉インドール、１１０℃、２４時間。

４８時間、７２時間、真空中試料は４０％ｎ−プロパツ
ールと０．１％ｌ−リフルオロ酢酸を含む溶液（１，５
ｄ）に溶かした後、各々０．１７をとり、乾燥窒素ガス
により乾燥させた後、■又は■の試薬を加えて真空封管
し、加水分解に供した。表中、実測値は■の２４時間値
と■の２４．４８．７２時間値の合計４回の平均値でお
る。但し、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、１／２ＣＶＳ、Ｍｅｔ、Ｖ
ａｌ、Ｉ　Ｉｅおよび−ｒ　ｒ　ｐは以下の方法で算出
した。（生化学実験講座、タンパク質化学■（東京化学
同人出版）を参照）Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、１／２Ｃｙｓ、Ｍ
ｅｔは■の２４゜４８、７２時間値の経時変化をとり、
零時間に補外。

Ｖａｌ、ｌｌｅは■の７２時間値。Ｔｒｐは■の２４４
８、７２１１．’ｊ間舶の平均値。

２）　　Ｎ末端アミノ酸分析 試料を気相式シークエンサー（アプライドバイオシステ
ム礼装）を用いてエドマン（Ｅｄｍａｎ）分解し、得ら
れたＰＴＨアミノ酸を高速液体クロマトグラフィー装置
（ベックマン・インストルメンツ社製）およびＵｌｔｒ
ａｓｐｈｅｒｅ　−０ＤＳカラム（ベックマン・インス
トルメンツ社製）を用いて常法により分析した。カラム
（５μｍ、直径４．６簡、長さ２５０．）を開始緩衝液
（１５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐｉ−１４，５，４０
％アセトニトリルを含む水溶液）にて平衡化したのら、
検体（２０μｍの開始緩衝液にて溶解）を注入して開始
緩衝液によるイソクラディック溶出により分離を行った
。流速は１．４ｎｆ／分、カラム温度は４０’Ｃに保持
した。

Ｐ［１１アミノ酸の検出は２６９ｎｍと３２０ｎｍの紫
外部吸収を利用した。あらかじめ標準Ｐ　Ｔ　）−１ア
ミノ酸（シグマ社製）各２ｎｍｏ＋を同一の系で分離し
て保持時間を決定し、被検検体の保持時間から同定を行
った。

イの結果、Ｐ　Ｔ　１１−メブＡニンおＪ、びＰ　Ｔ　
ｌ−１−スレオニンが検出された。

く実験例〉ヒ１−Ｇ−Ｃ３Ｆの感染防御効果１、シュー
ドモナス　アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　
ａｅｒｕｇｉｒｔＯ３ａ）感染に対する防御効果８〜９
週令（体重３５．３±１．３８ｇ）のＩＣＲ系マウス（
雄）にエンードキリン（ジオツギ社製、商品名）　　２
００ｍｆｆ／　Ｋ’ｊを腹腔的投与した後３群に分け、
その２群にヒトＧ−Ｃ８Ｆ　（２５０００ｕ／マウス又
は５００００　ｕ／マウス）を含む溶媒（１％プロパツ
ール、５％（Ｗ／Ｖ）マウス血清アルブミン）を、そし
て別の１ｆｌ￥には溶媒のみを、それぞれ２４時間毎に
０．１ｙｆずつ４回皮下投与した。

４回目の投与後３時間して各々の群にシュードモナス　
アエルギノー’ｆ　（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒ
ｕｇｉｎｏｓａ）ＧＮＢ−１３９（３，９Ｘ１０’　Ｃ
ＦＵ／マウス）を皮下投与して感染さけた。感染後２１
１；５間してさらにもう一度ヒトＧ−Ｃ３Ｆ　（２５０
００ｕ／？ウス又は５００００　ｕ／マ「ノス）を含む
溶媒又は溶媒のみをそれぞれ対応する群に皮下投与した
。

感染後１０日目までの生存マウス数により感染防御効果
を調べた。（表−３） （菌液の調′ＪＡ） バー１−インフュージョン寒天平板（［）ｉｆｃ。

礼装、商品名）を用いて３７°Ｃで一夜シュート七ナス
　アエルキノーザＧ　Ｎ　Ｂ−１３９を振どう培養する
。焙る液を生理食塩水に懸濁さＵて調製した。

表−３シュートモナス　アエルギノーザに対する効果 表−３に示される如く本発明のヒ＋＝ａ−ｃｓＦは顕著
な感染防御効果を有することが認められた。

〔発明の効果〕

以上、本発明によれば、従前入手が極めて困難でおった
ヒ１〜Ｇ−Ｃ８Ｆを絹換えベクター技術を用いて大量に
、しかも高品質で提供することが可能となり、これまで
Ｃ３Ｆにかけられていた数々の期待、例えば造血機構や
種々の血液学的疾患の病態の解析に多大の貢献をする他
、骨髄性白血病細胞の分化誘導と成熟顆粒球の機能几進
というＧ−Ｃ３Ｆ本来の生化学的作用を利用覆る治療、
及び予防に使用しうるのである。

したがって放射線照射や抗癌剤投与により骨髄組織の機
能が低下したり白血球が減少して、抵抗力を失った悪性
１ｈｉ瘍患者や、抗生物質で治療できない重症感染症患
者等に対してもこれを投与することが大いに期待されて
いるのである。

【図面の簡単な説明】

図１はプローブ（ＩＷＱ＞、プローブ（八）およびプロ
ーブ（ＬＣ）の配列を示す。 図２はＩ）ＨＯ２−１インナートの塩基配列を示す。 図３はｐＢＲＧ４のｃＤＮＡインサートの塩基配列を示
Ｊ０ 図４（Ａ）　はｐＢＲＶ２（７）ｃＤＮＡ−ｉ’ンサ−
ト（Ｄ塩基配列を示す。 図４（ＢＨＩ）はｐＢＲＶ２ｃＤＮＡから演えきしたじ
トＧ−Ｃ３Ｆ前駆体のアミノ酸配列を示す。 図４（Ｂ）（ｎ）はｐＢＲＶ２ｃＤＮ八から演えきした
ヒト成熟Ｇ−Ｃ３Ｆのアミノ酸配列を示す。 図５はｐＢＲＶ２のＣＤＮＡ−インサートの制限Ｍ素切
断部位を示す。 図６はｔａｃプロモーター含有ベクターの調製プロレス
を示す。 図７はＰ、プロモーター含有ベクターの調１畳プロセス
を示す。 図８はｔｒｐプロモーター含有ベクターの調製プロセス
を示す。 持直出願人　中外製薬株式会社

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　下記のアミノ酸配列で表わされるポリペプチド 【アミノ酸配列があります】 （但しｎは０又は１を示す） ２　ポリペプチドがヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を
   有することを特徴とする特許請求の範囲第１項記載のポ
   リペプチド。 ３　ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプ
   チドをコードする遺伝子を含む組換えベクター。 ４　遺伝子がショ糖密度勾配遠心法により１５〜１７Ｓ
   画分として得られる、ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性
   を有するポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮ
   Ａに相補的なＤＮＡであることを特徴とする特許請求の
   範囲第３項記載の組換えベクター ５　ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプ
   チドをコードする遺伝子が以下に示されるポリペプチド
   配列またはその一部をコードするものである特許請求の
   範囲第３項記載の組換えベクター。 【アミノ酸配列があります】 ６　ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプ
   チドをコードする遺伝子が以下に示されるポリペプチド
   配列またはその一部をコードするものである特許請求の
   範囲第３項記載の組換えベクター。 【アミノ酸配列があります】 ７　ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプ
   チドをコードする遺伝子が以下に示される塩基配列また
   はその一部を有するものである特許請求の範囲第３項記
   載の組換えベクター。 【アミノ酸配列があります】 ８　ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプ
   チドをコードする遺伝子が以下に示される塩基配列また
   はその一部を有するものである特許請求の範囲第３項記
   載の組換えベクター。 【アミノ酸配列があります】 ９　ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプ
   チドをコードする遺伝子が図４（Ａ）に示される塩基配
   列またはその一部を有するものである特許請求の範囲第
   ３項記載の組換えベクター。 １０　ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペ
   プチドをコードする遺伝子を含む組換えベクターを含有
   する形質転換体。 １１　ショ糖密度勾配遠心法により１５〜１７Ｓ画分と
   して得られる、ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有す
   るポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡに相
   補的なＤＮＡであることを特徴とする特許請求の範囲第
   １０項記載の形質転換体。 １２　ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペ
   プチドをコードする遺伝子が以下に示されるポリペプチ
   ド配列またはその一部をコードするものである特許請求
   の範囲第１０項記載の形質転換体。 【アミノ酸配列があります】 １３　ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペ
   プチドをコードする遺伝子が以下に示されるポリペプチ
   ド配列またはその一部をコードするものである特許請求
   の範囲第１０項記載の形質転換体。 【アミノ酸配列があります】 １４　ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペ
   プチドをコードする遺伝子が以下に示される塩基配列ま
   たはその一部を有するものである特許請求の範囲第１０
   項記載の形質転換体。 【アミノ酸配列があります】 １５　ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペ
   プチドをコードする遺伝子が以下に示される塩基配列ま
   たはその一部を有するものである特許請求の範囲第１０
   項記載の形質転換体。 【アミノ酸配列があります】 １６　ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペ
   プチドをコードする遺伝子が図４（Ａ）に示される塩基
   配列またはその一部を有するものである特許請求の範囲
   第１０項記載の形質転換体。 １７　ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペ
   プチドをコードする遺伝子を含む組換えベクターを含有
   する形質転換体から産生されたヒト顆粒球コロニー刺激
   因子活性を有するポリペプチド組成物。 １８　図４（Ｂ）（II）に示されるアミノ酸配列の一部
   で表わされるヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有する
   ポリペプチド。