JPH0789952B2 - ＩｇＡプロテアーゼによる組み換えタンパク質の酵素的切断法 - Google Patents

ＩｇＡプロテアーゼによる組み換えタンパク質の酵素的切断法

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JPH0789952B2
JPH0789952B2 JP3503102A JP50310291A JPH0789952B2 JP H0789952 B2 JPH0789952 B2 JP H0789952B2 JP 3503102 A JP3503102 A JP 3503102A JP 50310291 A JP50310291 A JP 50310291A JP H0789952 B2 JPH0789952 B2 JP H0789952B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、バイオテクノロジーにより得られたタンパク
質をIgAプロテアーゼ（Igaseとも言う）で配列特異的に
切断する方法に関し、特に原核生物内で組み換えタンパ
ク質またはペプチドを生産し、その後Ｎ−末端配列を除
去する方法に関する。
バイオテクノロジーによるタンパク質の生産は、好まし
くは培養が簡単で、生産されたタンパク質が単純な方法
で単離できる微生物を使って実施される。そのための適
当な微生物は、例えばグラム陰性菌の大腸菌（Escheric
hia coli）、グラム陽性菌のストレプトコッカス・カル
ノサス（Sterptococcus carnosus）およびパン酵母のサ
ッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisia
e）である。しかしながら、かかる微生物による外来遺
伝子の発現はしばしば不利なことがある。E.coliでは、
例えば翻訳の結果である天然タンパク質のアミノ末端メ
ニオニン残基が通常プロテアーゼによって効率よく切断
される。しかし、外来タンパク質の場合は、一般に最初
のメニオニン残基が部分的に切断されるだけである。従
って、定められたアミノ末端を有するタンパク質の適当
な生産方法は、初めに融合タンパク質の形でそれらを生
産し、その後配列特異的プロテアーゼを使って一定の方
法でそれらを切断することである。
真正なタンパク質と比べて、このような融合タンパク質
は微生物の細胞内で凝集して、他の細胞成分から簡単に
分離できる濃密な沈殿体（“inclusion bodies"）を形
成し、その結果目的タンパク質の単離・精製が容易にな
るという利点がある。一方、初めに遺伝子工学的手法で
実際の目的タンパク質に融合された担体タンパク質は、
融合相手に非特異的タンパク質加水分解に対する特別の
安定性を付与するものである；外来であると認識された
ポリペプチドの切断の問題は特にバイオテクノロジーに
よる小さいペプチドの生産に関係がある。さらに、他の
担体タンパク質は目的タンパク質を特定の細胞区画（そ
の区画からそれらを簡単に精製することができ、そこで
は特にそれらが安定しておりかつ／また試験のために接
近しやすい）に移動させることができる。最後に、担体
タンパク質は効率のよい精製（例えばアフィニティーク
ロマトグラフィー精製）を可能にする特別の性質をもつ
ものであり得る。大抵の場合、融合タンパク質はそのア
ミノ末端に担体タンパク質を、そのカルボキシル末端に
目的タンパク質を保有することが好適である。しかしな
がら、その逆の形態、あるいは目的タンパク質と２つの
融合相手とのカップリングも特殊な場合には望ましい。
さらに、１つの融合体内に目的タンパク質を反復させる
ことも有利であり得る。
このような融合体から遊離形の目的タンパク質を得るた
めに、共有結合で結合された融合相手を互いに切断する
ことが必要である。原理的に、これは化学的または生化
学的（酵素的）方法で達成できる。しかしながら、これ
までに利用された方法は特異性が十分でないために応用
範囲が狭く、目的タンパク質を得るためには、かかる切
断が融合相手間の切断配列（すなわち結合部）で起こ
り、いかなる状況下でも目的タンパク質それ自体の内部
で追加的に切断が起こらないことが重要である。かくし
て、融合相手の切断は高度に特異的に実施されねばなら
ない。
今までに融合タンパク質の配列特異的分離に使用されて
きた化学的方法には、例えばタンパク質中のアミノ酸メ
チオニンでの臭化シアンによる切断、およびギ酸を使用
した酸性媒体中でのアミノ酸Asp・！・Pro間の切断があ
る。これらの方法は目的タンパク質中の特異的切断部位
が結合相手への結合部以外に存在しないときだけ有効で
ある。一般的には、生化学的切断法の方が化学的方法よ
りも好ましい。なぜならば、前者の方法は通常目的タン
パク質を変性させない生理学的条件下で、すなわち少な
くとも温和な化学反応条件下で実施されるからである。
融合タンパク質の生化学的切断法は出来るだけ特異的な
プロテアーゼを使用することを土台としている。例え
ば、トリプシンはタンパク質中のアミノ酸アルギニンお
よびリシンの次に来るペプチド結合を切断する。この特
異性はアミノ酸Lysを予め化学的に修飾することによっ
て増加させることができ、これによりアミノ酸アルギニ
ンに対する特異的認識が制限される。バイオテクノロジ
ーの分野で使用される別のプロテアーゼはクロストリパ
インであり、この酵素はアミノ酸アルギニンとこれに続
くアミノ酸の間のペプチド結合を切断する。今までに使
用された融合タンパク質の酵素的切断法の研究はF.A.O.
Marston（［D.M..Glover,E.］:DNA cloning III,IRL Pr
ess Oxford and Washington DC,1987）によって論じら
れている。酵素的切断法も、切断部位に特異的なアミノ
酸が目的タンパク質それ自体中に同時に存在しうる点で
制限される。従って、タンパク質融合体の生化学的切断
においては、切断するために１個のアミノ酸を認識する
のではなく、アミノ酸の配列を認識する酵素が特に好適
である。と言うのは、特定のアミノ酸配列が融合相手間
の切断部位のほかに目的タンパク質中にもう一度存在す
る可能性は、切断配列の認識および切断に必要なアミノ
酸の数が多ければ多いほど、少なくなるからである。
特定のタンパク質を非常に特異的に切断するプロテアー
ゼは知られている。このような選択的プロテアーゼ（例
えばヒトの補体系や血液凝固系中に存在する）の大多数
は基質中の定められた部位を切断するが、対応する切断
部を他のタンパク質（例えば融合タンパク質）中に移し
変えても、一般にこの種のプロテアーゼはもうその部位
を切断することができない。その理由は数多くあり、例
えばプロテアーゼが基質の特定の二次または三次構造を
認識するからであり、またプロテアーゼが融合タンパク
質中の切断部位に接近できないからである。
融合タンパク質の切断に使用されたことのある配列特異
的プロテアーゼとしては、現在ファクターXaを筆頭に挙
げることができる。このプロテアーゼは切断配列Ile−G
lu−Gly−Arg・！・Ｘ（ここで・！・は切断部位を表
し、Ｘは任意のアミノ酸を示す）を特異的に切断する。
しかしながら、このプロテアーゼは対応する切断配列を
結合部に有する融合タンパク質の切断には一般に使用で
きないことが分かっている。かかる基質（すなわち担体
タンパク質に共有結合で結合された目的タンパク質を含
む融合タンパク質）は往々にして全く切断されないか、
不十分な程度にまたは可溶性形態で切断されるにすぎな
い。
融合タンパク質の効率のよい切断は原核生物での組み換
えタンパク質の生産において特に重要となってくる。こ
の場合、実際のDNA配列の出発前に開始コドンとしてAUG
を含むDNA配列をクローニングすることが必要である。
その結果、アミノ酸位置−１にメチオニン残基を含む組
み換えタンパク質がE.coliのような原核生物内で発現さ
れる。
しかし、多くの場合に、１位にメチオニンを含まない組
み換えタンパク質を生産する必要がある。かかるタンパ
ク質の原核生物からの単離は、例えばＮ−末端メチオニ
ンを切断するメチオニン特異的ペプチダーゼにより実施
することができる。この方法は、しかし、切断をタンパ
ク質の配列決定によって確認しなければならないので非
常に煩雑である。その上、−１位にメチオニンを含むタ
ンパク質とメチオニンを含まないタンパク質の分離は、
それらがほぼ等しい分子量を有するために極めて困難で
あり、従って部分的に達成されるにすぎない。
PCT出願W084/02351は融合タンパク質からのＮ−末端ア
ミノ酸の切断を開示している。この方法では、タンパク
質の数個のアミノ酸がエキソペプチダーゼ（好ましくは
ロイシンペプチダーゼ）による段階的切断でＮ−末端か
ら配列Ｘ−Proまで除去される。配列Ｘ−Proはポストプ
ロリン−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（EC3.4.1
4）を使う二段階または一段階反応でこの生産物から切
り離される。しかしながら、この方法には、タンパク質
のＮ−末端からのアミノ酸の段階的切断の結果として、
均一な生産物を形成することができず、代わりに不完全
な分解タンパク質や分解されすぎたタンパク質を目的産
物のほかに含む混合物が常に形成されるという欠点があ
る。
融合タンパク質の別の酵素的切断法は欧州特許第0 020
290号により知られている。この方法では、特定の認識
配列からタンパク質の融合成分を切断するために酵素コ
ラゲナーゼが使用される。その後、融合成分の更なるア
ミノ酸を更なる酵素処理によって除くことができる。し
かし、コラゲナーゼと他のエンドペプチダーゼ類は低い
特異性をもつにすぎないことが立証された（Biochim.Bi
ophys.Acta271（1972）133−144を参照されたい）。さ
らに、コラゲナーゼは特定の空間構造を有するタンパク
質に対してのみ活性を有する。
タンパク質のＮ−末端融合成分を切断するための上記フ
ァクターXaの使用はすでに知られている。しかし、先に
述べた切断効率の問題とは別に、この方法はタンパク質
の内部配列をも認識して切断するという更なる欠点をも
っている。その上、ファクターXaはウシ血清から単離し
なければならず、その結果治療用タンパク質の切断にそ
れを用いる場合、存在しうる病原性因子やウイルスを検
出するために十分な精製と分析がその後必要となる。
ヒト粘膜で生育する種々の病原菌種［例えば淋菌（Neis
seria gonorrhoea）や髄膜炎菌（Neisseria meningiti
s）のようなナイセリア属またはインフルエンザ菌（Hae
mophilus influenzae）やエジプトヘモフィルス（Haemo
philus aegypticus）のようなヘモフィルス属に含まれ
るもの］はプロテアーゼを分泌し、それらのプロテアー
ゼの配列は互いに密接に関係があり、ヒトIgA1に対して
特異的であるために、分かりやすくIgAプロテアーゼま
たはIgaseと呼ばれる。免疫グロブリンIgA1はこのよう
な病原微生物による感染から防御する分泌免疫応答の重
要な成分である（Kornfeld and Plaut,Rev.Infect.Dis.
3（1981）521−534）。さらに、IgAプロテアーゼはまた
自己タンパク質加水分解によりそれ自体の前駆体タンパ
ク質を切断する。真正細菌株やグラム陰性宿主細胞によ
る淋菌MS11由来のIgAプロテアーゼの生成がすでに詳細
に開示されている（DE 36 22 221.6）。
IgAプロテアーゼは、例えばPohlnerら（Nature 325（19
87）458−462）により記載されるように、次の認識配列
を切断する： 1.Pro−Ala−Pro・！・Ser−Pro 2.Pro−Pro・！・Ser−Pro 3.Pro−Pro・！・Ala−Pro 4.Pro−Pro・！・Thr−Pro ここで記号・！・はそれぞれの場合にIgAプロテアーゼ
の切断部位を表す。IgAプロテアーゼのクローニングは
例えばPohlnerら（1987）同上に記載されている。
従って、本発明の目的は融合タンパク質の改良された生
化学的（酵素的）切断法を提供することであり、これに
より融合相手とその結合部に特定の切断配列を含む遺伝
子工学的手法により生産された融合タンパク質を基質と
して使用して、出来るだけ高い収量および再現性で目的
タンパク質を単離することができる。
この目的は、融合タンパク質の結合部に認識部位または
切断配列Pro・！・Ｘ−Proを導入し、この切断配列を・
！・で示した切断部位でIgAプロテアーゼにより特異的
に切断することにより、遺伝子工学的手法を使って達成
された（ここでＸは好ましくはアミノ酸Ser、Thrおよび
Alaを表し、特に好ましくはSerまたはThrであるが、他
のアミノ酸を表すこともできる）。
かくして、本発明は、融合タンパク質を酵素的に切断
し、これらの融合タンパク質の目的成分を単離するため
の方法を提供し、その方法は （１）融合タンパク質の２つの成分が一緒に結合さえる
結合部を遺伝子工学的手法により修飾して、この結合部
にアミノ酸配列Ｙ−Pro・！・Ｘ−Pro（ここでＸはアミ
ノ酸であり、Ｙは１個または数個の任意のアミノ酸であ
る）を有するIgAプロテアーゼ認識部位を少なくとも１
つ形成し、 （２）段階（１）から得られた融合タンパク質を・！・
で示した認識部位中の位置でIgAプロテアーゼにより切
断し、そして （３）切断後、融合タンパク質の１つまたは数個の目的
成分を単離する ことを特徴としている。
本発明によると、用語“IgAプロテアーゼ”にはIgAを特
異的に切断するプロテアーゼが含まれ、例えばRev.Infe
kt.Dis.3（1981）521−534に記載されている。DE−A 36
22 221、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79（1982）7881−78
85、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80（1983）2681−2685、N
ature 325（1987）458−462およびEMBO Jour.3（1984）
1595−1601に記載されるような組み換えIgAプロテアー
ゼも同様に適している。
本発明の方法では、IgAプロテアーゼ認識部位またはそ
の一部をコードするヌクレオチド配列を融合タンパク質
の結合部に組み込み、それによりこれらのヌクレオチド
配列がタンパク質融合体の目的の部分をコードする１ま
たはそれ以上のDNAセクションの上流および／または下
流に組み込まれるような方法で、融合タンパク質の結合
部の修飾を実施することが好ましい。このために、好ま
しくは化学的に合成されたヌクレオチド配列が使用され
る。
驚いたことに、本発明の方法はさらに、もともと（すな
わち結合部の修飾前には）天然IgAプロテアーゼ認識部
位をもっていなかった融合タンパク質の切断に特に適し
ていることが判明した。
本発明方法のためのIgAプロテアーゼ認識部位はアミノ
酸の共通配列Ｙ−Pro・！・Ｘ−Proを有する。この場
合、Ｘはアミノ酸を表し、Ｙは１個または数個の任意の
アミノ酸を表す。Ｘは好ましくはセリン、トレオニンま
たはアラニンを表し、特に好ましくはセリンまたはトレ
オニンである。Ｙは好ましくは次の配列:Pro、Pro−Al
a、Arg−Pro、Pro−Arg−Pro、Ala−Pro−Arg−Proまた
はPro−Ala−Pro−Arg−Pro未満に有する数個のアミノ
酸を表す。
従って、本発明の方法は、IgAプロテアーゼで目的タン
パク質を切断し、単離するために使用できる少なくとも
共通の切断配列Pro・！・Ｘ−Proを有するIgAプロテア
ーゼ認識部位を、融合タンパク質の結合部（例えば担体
タンパク質と目的タンパク質の間）に組み込むことから
成っている。このために、切断配列Pro・！・Ｘ−Pro中
の位置Ｘにはアミノ酸Ser、AlaまたはThrを使用するこ
とが好ましい。この部位での切断をさらに最適化するた
めに、切断配列の前に特定のアミノ酸、特にProを挿入
することができる。
次のアミノ酸配列が特に好適である： ａ）Pro−Ala−Pro・！・Ser−Pro ｂ）Pro−Pro・！・Ser−Pro ｃ）Pro−Arg−Pro−Pro・！・Ala−Pro ｄ）Pro−Pro・！・Thr−Pro ｅ）Ala−Pro−Arg−Pro−Pro・！・Thr−Proまたは ｆ）Pro−Ala−Pro−Arg−Pro−Pro・！・Thr−Pro 目的タンパク質が担体タンパク質の下流にある融合タン
パク質の切断に本発明方法を適用する場合、IgAプロテ
アーゼによる切断後に、アミノ末端に配列Ｘ−Proを有
するタンパク質が形成される。この配列は目的タンパク
質の一部として有利であったり、不利であったり、ある
いは無意味であったりする。遺伝子工学的手法により得
られた目的タンパク質がそのアミノ末端に天然型として
対応する２つのアミノ酸Ｘ−Proを含む場合には、一般
にこの配列は有利である。バイオテクノロジーの分野で
重要な、アミノ末端がＸ−Proで特徴づけられるタンパ
ク質は自然界に存在する。
本発明方法は、融合タンパク質の他の全ての既知切断法
と比べて、驚いたことに結合部に上記切断配列を有する
融合タンパク質を普遍的に応用でき、さらに不溶性、可
溶性、膜に結合した、または細胞に結合したタンパク質
融合体にも同様に適用できるという利点がある。その
上、この方法は、微生物内で生じるような沈殿体（それ
自体を容易に濃縮できる）の形で融合タンパク質または
タンパク質融合体の切断が可能であるという特別の利点
を有する。この方法の更なる利点は、使用する切断酵素
Igeseが非病原菌の培地から簡単に単離できる点であ
る。
タンパク質融合体の結合部へのIgaseの切断配列の組み
込みは遺伝子工学的手法を使って行われる。従って、例
えば切断配列またはその一部をコードする一連のヌクレ
オチドすなわちヌクレオチド配列を化学的に合成して、
既知の遺伝子工学的手法を使って担体タンパク質と目的
タンパク質のDNAセクション間に組み込むことができ
る。適当な切断配列またはその一部をコードする天然の
ヌクレオチド配列も相応の方法で組み込むことができ
る。好ましくは、タンパク質融合体をコードする遺伝子
を適当な（有利には誘導可能な）発現シグナルの制御下
に置いて、融合タンパク質が必要条件に従って生産され
るようにする。タンパク質融合体の生産には、宿主細胞
として適当な原核または真核（植物および動物）細胞が
使用されるが、無細胞系も可能である。この方法で使用
する担体タンパク質は、それらがタンパク質融合体に付
与すべき性質に応じて、特定の輸送機能、タンパク質融
合体の精製またはその安定性を改善する機能などの機能
をもち得る。好適な担体タンパク質は以下に記載する。
本発明によるタンパク質融合体の切断は、過剰生産性の
非病原性細菌株により生産されかつ培養上清から単離・
精製しうるIgaseを用いて行うことが好適である（例え
ばDE−36 22 221を参照）。
本発明の方法は分析のためだけでなく生産のために使用
することができる。生産面では、本方法は医薬、研究、
環境保護、工業的方法または製品において使用される重
要なタンパク質の生命工学的製造に役立つ。分析面で
は、本方法は、例えば適当な発現系と組み合わせて、遺
伝子融合の日常的実験に使用される。
融合タンパク質の酵素的切断とこれらの融合タンパク質
の目的成分の単離から成る本発明方法の好適な実施態様
は、 （１）結合部に少なくとも１つのIgAプロテアーゼ認識
部位を含む融合タンパク質をコードする少なくとも１コ
ピーの遺伝子を保有する組み換えDNAまたは組み換えベ
クターで細胞を形質転換し、 （２）適当な培地で該形質転換細胞を培養し、 （３）該融合タンパク質をコードする遺伝子を該形質転
換細胞において発現させ、 （４）該融合タンパク質をIgAプロテアーゼで切断し、
そして （５）該融合タンパク質の１つまたはいくつかの目的成
分を単離する、 ことを特徴としている。
この方法では、IgAプロテアーゼによる融合タンパク質
の処理を、細胞溶解後および／または細胞タンパク質の
部分または完全分離後に、培地（培養ブロス）中で行う
ことができる。
融合タンパク質（好ましくは原核生物の発現産物）を処
理するために、例えばEP−B 0 141 223またはEP−B 0 1
41 224に記載されるような、当業界で知られた方法を使
ってIgAプロテアーゼを固定化することがさらに好まし
い。
本発明方法の特に好適な応用は、アミノ酸配列Met−Ｙ
−Pro・！・Ｘ−Pro−Ａを有する融合タンパク質または
ペピチドからＮ−末端メチオニン残基を含まない組み換
えタンパク質またはペプチドを生産することであり、こ
こでＸはアミノ酸、好ましくはTha、AlaまたはSerを表
し、ＹはＸがThrまたはAlaを表すとき好ましくはProで
終わる１個または数個の任意のアミノ酸を表すが、Ｘが
Serを表すときは好ましくは配列Pro−AlaまたはPro−Pr
oで終わる数個の任意のアミノ酸を表し、そしてＡは任
意のアミノ酸の配列を表す。この方法では、融合タンパ
ク質またはペプチドをIgAプロテアーゼで切断すると、
アミノ酸配列Ｘ−Pro−Ａを有する切断産物が得られ
る。例えば、Ｎ−末端メチオニン残基を含まない組み換
えタンパク質の原核細胞からの生産方法は、次の段階： （１）アミノ酸配列Met−Ｙ−Pro・！・Ｘ−Pro−Ａ
（ここでＸ、ＹおよびＡは上記の意味を有する）を有す
るタンパク質またはペプチドをコードする遺伝子で原核
細胞を形質転換し、 （２）該形質転換細胞を適当な培地で培養して、形質転
換遺伝子を発現させ、 （３）IgAプロテアーゼを使ってアミノ酸配列Met−Ｙ−
Pro・！・Ｘ−Pro−Ａを有する該形質転換細胞からの発
現産物を切断し、そして （４）Ｎ−末端メチオニン残基を含まないアミノ酸配列
Ｘ−Pro−Ａを有する切断産物を単離する、 から成っている。
本発明の方法を用いることにより、Ｎ−末端メチオニン
残基を含まずかつＮ−末端配列Ｘ−Pro（ここでＸは好
ましくはThr、AlaまたはSerを表す）を有するタンパク
質を驚くべく高収量でしかも良好な特異性で得ることが
一段階で可能である。
融合タンパク質の担体成分Ｙは、IgAプロテアーゼで認
識される切断配列を末端に有する少なくとも１個、好ま
しくは100個まで、特に１−50個のアミノ酸を有するア
ミノ酸配列を表す。Ｘがアミノ酸セリンを表とき、Ｙは
好ましくは配列Pro−AlaまたはProをその末端に有す
る。ＸがThrまたはAlaを表すときは、Ｙは好ましくはそ
の末端にProを、特にArg−Pro、Pro−Arg−ProまたはAl
a−Pro−Arg−Proを有する。
特に好適な実施態様において、Ｙはその末端に配列Pro
−Ala−Pro−Arg−Proを有する少なくとも５個のアミノ
酸を表す。しかし、IgAプロテアーゼで認識される切断
部位は本発明方法にとってどれも適している。
担体成分Ｙはさらに任意のアミノ酸、好ましくは100個
まで、特に好ましくは50個までのアミノ酸を含むことが
できる。しかし、DNAレベルでタンパク質Met−Ｙ−Pro
・！・Ｘ−Pro−Ａの発現を高めかつ／またアミノ酸レ
ベルで細胞からのその精製を容易にするアミノ酸配列を
このために使用することが好ましい。
タンパク質Met−Ｙ−Pro・！・Ｘ−Pro−Ａの発現は例
えばβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の断片との融合（すな
わち担体成分Ｙがβ−ガラクトシダーゼタンパク質の一
部を含む）によりDNAレベルで改善される。タンパク質M
et−Ｙ−Pro・！・Ｘ−Pro−Ａの発現を高めるための他
の方法も当業界で知られている。発現産物の分離・精製
は他のポリペプチド、特に高度に荷電されたポリペプチ
ドまたはタンパク質（例えばポリ（Lys,Arg））との融
合により、あるいは高い親和性で特定の物質に結合しう
るもの（例えばストレプトアビジン）との融合により容
易にすることができる（例えばEP−A 0 089 626、EP−A
0 306 610を参照）。
さらに、本発明は、いくつかのポリペプチド成分を含
み、かつ異なるポリペプチド成分間の少なくとも１つの
結合部にアミノ酸配列Pro・！・Ｘ−Pro（ここでＸはア
ミノ酸を表すが、好ましくはThr、AlaまたはSerを表
す）を有する１つまたはいくつかのIgAプロテアーゼ認
識部位が組み込まれた融合タンパク質を提供する。この
認識部位はアミノ酸配列（ａ）Pro−Ala−Pro・！・Ser
−Pro、（ｂ）Pro−Pro・！・Ser−Pro、（ｃ）Pro−Ar
g−Pro−Pro・！・Ala−Pro、（ｄ）Pro−Pro・！・Thr
−Pro、（ｅ）Ala−Pro−Arg−Pro−Pro・！・Thr−Pro
または（ｆ）Pro−Ala−Pro−Arg−Pro−Pro・！・Thr
−Pro（ここで・！・は切断部位を表す）を有すること
が特に好ましい。
本発明の融合タンパク質は、個々のポリペプチド成分間
の少なくとも１つの結合部に前記の認識部位のいずれか
が遺伝子工学的手法により導入されたものであり、天然
IgAプロテアーゼ認識部位（ａ）、（ｂ）および（ｃ）
とこれらの間に位置するアミノ酸配列を有する天然のIg
Aプロテアーゼ配列を含む融合タンパク質は除外される 本発明はまた、とりわけ、アミノ酸配列Met−Ｙ−Pro・
！・Ｘ−Pro−Ａを有するタンパク質またはペプチドを
包含し、ここでＸは好ましくはThr、AlaまたはSerを表
し、Ｙは１個または数個の任意のアミノ酸を表し、Ｘが
ThrまたはAlaを表すときは、Ｙは好ましくはその末端に
Proを有し、ＸがSerを表すときは、Ｙは好ましくはその
末端に配列Pro−AlaまたはProを有し、そしてＡは任意
のアミノ酸配列を表す。かかるタンパク質またはペプチ
ドは、本発明に従って前記タンパク質またはペプチドを
コードする少なくとも１コピーの遺伝子を含む組み換え
ベクターで原核細胞を形質転換することにより発現され
る。
配列Ａは任意のアミノ酸配列を表すことができる。この
アミノ酸配列には、IgAプロテアーゼの切断部位が存在
しないことが好ましい。
本発明はまた、融合タンパク質の少なくとも１つの結合
部に１つまたはいくつかのIgAプロテアーゼ認識部位ま
たは切断配列が組み込まれた本発明によるタンパク質ま
たはペプチドをコードする組み換えDNAを提供する。
本発明の組み換えDNAは分子生物学の分野で知られた方
法により得られる。この場合、アミノ酸配列Ａをコード
するDNA配列を含むベクターが通常その遺伝子の５′末
端の領域で制限エンドヌクレアーゼにより切断され、所
望の配列を含むオリゴヌクレオチドと再連結される。こ
の方法では、オリゴヌクレオチドはIgAプロテアーゼの
切断部位またはその一部をコードする配列を含まねばな
らない。
さらに、本発明は少なくとも１コピーの本発明による組
み換えDNAを含む組み換えベクターを提供する。原核生
物でのタンパク質発現の土台となる好適なベクターは当
業界で知られている。このベクターは好ましくは本発明
の組み換えDNAの高度発現を可能にするものである。ベ
クターに担持された組み換えDNAは誘導可能な発現シグ
ナル（例えばλ、tac、lacまたはtrpプロモーター）の
制御下に置くことが好ましい。
本発明によるベクターは染色体外に存在することも（例
えばプラスミド）、宿主生物のゲノムに組み込むことも
できる（例えばバクテリオファージラムダ）。本発明の
ベクターは好ましくはプラスミドである。特定の宿主生
物による遺伝子発現のそれぞれの場合に適しているベク
ターは分子生物学の分野で当業者によく知られている。
それは真核生物ベクターであってもよいが、原核生物ベ
クターの方が好ましい。本発明による原核生物でのDNA
発現に適するベクターの例は市販されているpUCおよびp
URベクターである。
本発明はまた、本発明の組み換えDNAおよび／または本
発明の組み換えベクターで形質転換された細胞、好まし
くは原核細胞、特にE.coli細胞を提供する。
本発明方法により一段階で得られるＮ−末端配列Ｘ−Pr
o（ここでＸはThr、AlaまたはSerを表す）を有するタン
パク質の例としては、ヒト・エリトロポエチン、ヒトＴ
細胞レセプターのβ鎖、特にヒト顆粒球コロニー刺激因
子（Ｇ−CSF）がある。
Ｇ−CSFは活性化された単球、マクロファージ、および
一連の他の細胞系によりリンフォカインとして合成され
る。リンフォカインは免疫または血液細胞系の細胞の成
熟化に関与する。それらは十分に分化した細胞への骨髄
幹細胞の成熟化を刺激する。かくして、Ｇ−CSFは例え
ば好中球や顆粒球の形成を誘導する。
Ｇ−CSFは短期間で好中球細胞の集団を顕著に増加させ
ることができるので、Ｇ−CSFの治療上の使用分野は相
当に広い。例えば、Ｇ−CSFは免疫系の細胞が破壊され
る癌の化学療法の後に使用することができる。さらに、
骨髄移植、重症の火傷、免疫不全症が原因の日和見感
染、および白血病にＧ−CSFを使用することができるだ
ろう。
Ｇ−CSFは分泌タンパク質分子である。従って、一次翻
訳産物は分泌されるときに切断されるＮ−末端シグナル
配列を含み、その結果成熟Ｇ−CSFの配列はアミノ酸Thr
（＋１）−Pro（＋２）（アミノ酸位置＋１および＋
２）から始まる。Ｇ−CSFを原核生物に生産させると、
このシグナルペプチドが少しきり切断されないか、また
は全く切断されないので、シグナル配列を含まない原核
生物からのＧ−CSFを調製するために、タンパク質レベ
ルでThr（＋１）−Pro（＋２）から始まる成熟Ｇ−CSF
をコードするDNA配列の出発前に開始コドンとしてAUG
（Met）をクローン化しなければならない。その結果と
して、E.coliのような原核生物ではアミノ酸位置−１に
メチオニンを含むＧ−CSFが発現される。
本発明方法を用いることにより、アミノ酸位置−１にメ
チオニンを含まないアミノ酸Thr（＋１）−Pro（＋２）
から始まるＧ−CSFを、原核生物から簡単な方法で生産
することができる。
これは、アミノ酸配列の位置＋１および＋２にアミノ酸
Thr（＋１）−Pro（＋２）を含み、その前に、すなわち
アミノ酸配列の位置−１から前方にIgAプロテアーゼで
認識されかつThr（＋１）−Pro（＋２）から始まるアミ
ノ酸配列Ｇ−CSFから切断され得るアミノ酸配列を含む
Ｇ−CSF誘導体を原核生物から単離することにより行わ
れる。
好適な実施態様において、この誘導体は位置−１と−２
にそれぞれProを、位置−３から−１にアミノ酸配列Arg
−Pro−Proを、位置−４から−１にアミノ酸配列Pro−A
rg−Pro−Proを、または位置−５から−１にアミノ酸配
列Ala−Pro−Arg−Pro−Proを含んでいる。
特に好適な実施態様では、この誘導体は位置−６から−
１にアミノ を含んでいる。本発明の意味において、Ｇ−CSFは天然
に存在するＧ−CSF（その配列は例えばScience 232（19
86）61に記載されている）とそれから誘導される顆粒球
コロニー刺激活性を有する誘導体（そのアミノ酸配列は
Ｘ（＋１）−Pro（＋２）から始まる）を含むことが理
解される。ＸはThr、AlaまたはSerを表し、好ましくはT
hrである。
本発明によるＧ−CSF誘導体は、原核生物での発現後
に、位置＋１と−１の間（Thr（＋１）とPro（−１）の
間）をIgAプロテアーゼで処理することにより切断する
ことができる。こうして、位置−１にメチオニンを含ま
ず、Ｎ−末端のアミノ酸配列が天然に存在するＧ−CSF
のアミノ酸Thr（＋１）−Pro（＋２）から始まるＧ−CS
Fが一回の加水分解工程で得られる。
Ｇ−CSFを原核生物に発現させると、不活性の難溶性凝
集体（屈曲性物体）が形成される。このタンパク質を例
えば治療のために使用する前に、それを活性型に変換し
なければならない。当業界でよく知られた方法（例えば
EP−A 0 219 874、EP−A 0 114 506、WO 84/03711）を
使って、初めに変性剤を添加して可溶化を行い、次に再
生を行い、初望によりさらに精製段階を行う。IgAプロ
テアーゼによる本発明タンパク質の処理は可溶化の前、
可溶化の後、まは再生の後に行うことができる。IgAプ
ロテアーゼによる処理を可溶化の後に直接実施する場合
には、IgAプロテアーゼの添加前に可溶化剤（例えばグ
アニジン塩酸塩または尿素）を透析によって除かなけれ
ばならない。しかし、IgAプロテアーゼによる処理は再
生後に行うことが好ましく、この場合はＧ−CSFの収量
が特に高い。
IgAプロテアーゼでＧ−CSFまたは他のタンパク質を切断
処理するのに必要な条件は特に決まっていない。しか
し、この方法では、Ｇ−CSF（または他のタンパク質）
対IgAプロテアーゼの重量比は1:1ないし100:1であるこ
とが好適である。この反応はpH6.5−8.5の緩衝化水溶液
中で行うのが好ましい。緩衝液の濃度は有利には50−30
0mmol/lの範囲であり、所望により20−100mmol/lの塩化
ナトリウムを添加する。切断は好ましくは室温で20−60
分間行う。
可溶化、再生およびIgAプロテアーゼによる切断後に得
られた切断産物は、イオン交換および大きさによる分画
化によって精製することが好ましい。このようにして得
られた位置−１にメチオニンを含まないＧ−CSFは、他
のタンパク質によって0.％未満、好ましくは10-3％未満
汚染されているにすぎない。
かくして、位置−１にメチオニンを含まないＧ−CSF
は、IgAプロテアーゼ切断によってメチオニンを含む融
合タンパク質からほぼ定量的に分離・精製され得る。
本発明方法を用いることにより、他のタンパク質によっ
て0.1％未満、好ましくは10-3％未満汚染されているに
すぎず、位置−１にメチオニンを含む原核生物由来のＧ
−CSFを含まない組み換えＧ−CSFが得られる。
本発明はまた、本発明方法により得られた活性物質とし
ての原核生物由来のＧ−CSF、および所望により慣用の
製剤学的担体、充填剤、補助剤を含有してなる医薬組成
物を提供する。かかる医薬組成物は特に顆粒球（とりわ
け好中球）の形成を刺激すべき治療に適している。
本発明による医薬組成物は注射液や注入液として適用す
ることが好ましい。これは本発明組成物を含むすでに注
射可能な溶液を用意することにより可能である。しか
し、本組成物を凍結乾燥品の形で供給することもでき
る。これらはその後注射目的に適した既知の溶剤または
溶液を用いて用時調製される。注射媒体として水が好適
に使用されるが、これは安定剤、可溶剤、緩衝剤、生理
学的NaCl濃度のような等張添加剤といった注射液用の慣
用添加剤を含む。この種の添加剤は例えばマンニトー
ル、酒石酸塩またはクエン酸塩緩衝液、エタノール、錯
化剤（例えばエチレンジアミン四酢酸とその無毒性
塩）、粘度調節用の高分子ポリマー（例えば液体ポリエ
チレンオキシド）などである。注射液用の液状担体は無
菌でなければならず、アンプルで分配することが好まし
い。
最後に、本発明はさらに、本発明の医薬組成物を調製す
るための、位置−１にメチオニンを含まない原核生物由
来のＧ−CSFの使用を意図している。
タンパク質Ｘ−Pro−Ａが本発明方法によって融合タン
パク質の切断産物として得られ（ここでＸはアミノ酸を
表し、Ａは任意のアミノ酸配列を表す）、そのタンパク
質がアミノ末端に望ましくないジペプチドＸ−Proをも
つ場合、この望ましくないジペプチドは本発明方法の一
部としてジペプチジルアミノペプチダーゼ（DPAP）で処
理することにより除去することができる。ジペプチジル
アミノペプチダーゼはこれまでに一連の微生物、昆虫、
両生類および異なるヒト組織において見つかっている。
それらは例えは前駆体タンパク質の段階的プロセッシン
グに役立ち、その一部はジペプチドＸ−Proのアミノ末
端分解に対し相当の特異性をもっている（Ｘ−Pro−DPA
Pase;G.Kreil,Trends in Biochemical Sciences 15,23
−26,1990）。かくして、本発明に従っIgaseとＸ−Pro
−DPAPとを組み合わせることによって、あらゆるアミノ
末端アミノ酸を有する目的タンパク質を生成することが
できる。
上記のIgaseとＸ−Pro−DPAPを組み合わせることによ
り、位置−１にメチオニンを含まない原核生物由来の別
のＮ−末端アミノ酸配列を有するタンパク質を生産する
ことが可能である。このために、最初に、アミノ酸配列
Met−Ｙ−Pro・！・Ｘ−Pro−Ａを有する融合タンパク
質が得られ、この場合は２個のＮ−末端アミノ酸Ｘ−Pr
oを含まないアミノ酸配列Ａが発現すべきタンパク質の
目的成分である。
アミノ酸配列Met−Ｙ−Pro・！・Ｘ−Pro−Ａを有する
原核細胞の発現産物は、最初に、アミノ酸配列Ｘ−Pro
−Ａを有する第一の切断産物が形成されるように、IgA
プロテアーゼで切断する。
このタンパク質はその後、配列Ｘ−Proを特異的に認識
してProの後を切断する上記のジペプチジルアミノペプ
チダーゼで処理する。このようにして、任意のアミノ酸
配列Ａを有する第二の切断産物が形成される。従って、
本発明方法はＮ−末端メチオニン残基を含まない様々な
タンパク質の生産に非常に有用であることが分かり、Ｎ
−末端配列Ｘ−Pro（ここでＸは好ましくはThr、Alaま
たはSerを表す）を有するタンパク質の生産に限定され
ない。
最後に、本発明はさらに、（上で定義したような）IgA
プロテアーゼ認識部位をコードする領域を含みかつ融合
タンパク質の結合部へ組み込むのに適している組み換え
DNAを意図している。これは好ましくは化学的に合成さ
れたDNA断片であり、その両末端に１つまたはいくつか
の適当な制限切断部位をもつことが好ましい。
用語の定義： 本発明方法は希望するタンパク質のバイオテクノロジー
による生産を意図している。これに関連して、「バイオ
テクノロジーによる生産」とは、遺伝子工学的手法およ
び他の生命工学的手法（例えば微生物の発酵）を使った
目的タンパク質またはその中間体産物の生産を意味す
る。
「目的のタンパク質」とは、例えば医薬の分野、研究、
環境保護、産業的方法または製品において使用される中
間産物または最終産物を意味する。
本発明方法は「融合タンパク質」（「タンパク質融合
体」とも言う）から目的タンパク質を形成することから
成り、ここで融合タンパク質またはタンパク質融合体は
互いに共有結合で結合されたいくつかの「融合相手」か
ら成っている。これに関連して、融合相手の少なくとも
１つは目的タンパク質を表す。ある融合タンパク質中の
融合相手の順序およびそれらの反復の程度は任意であ
る。しかし、それはアミノ末端の担体タンパク質とカル
ボキシ末端の目的タンパク質から成るのが好ましい。
「担体タンパク質」または「担体成分」はある種の性質
を備えた融合タンパク質の形で目的タンパク質を提供す
るように作用する。かかる性質は例えば特定の構造特性
に基づいた融合タンパク質の安定性の増加、それ故細胞
プロテアーゼに対する耐性の増加をもたらし、またそれ
らはタンパク質加水分解活性のより少ない環境へ融合タ
ンパク質を輸送することができる。さらに、担体タンパ
ク質は融合タンパク質の効率のよい精製を可能にする性
質を備えていてもよい。これらには例えばアフィニティ
ークロマトグラフィー法と関連した特定のリガンドの結
合、容易に単離できる沈殿体への融合タンパク質の沈
降、および接近しやすい部位へのタンパク質の輸送が含
まれる。
融合タンパク質の成分（担体タンパク質と目的タンパク
質）が結合した融合タンパク質内の領域は「結合部」と
呼ばれる。
それぞれの結合部は１つまたはいくつかの「アミノ酸配
列」により定義される。アミノ酸配列（およびアミノ酸
とタンパク質の他の全ての配列）はアミノ末端（左）か
らカルボキシ末端（右）の方向で示される。
本発明方法の範囲内で、IgAプロテアーゼにより切断可
能な結合部の全てのアミノ酸配列には本発明による「切
断配列」または認識配列が含まれる。
融合タンパク質またはタンパク質融合体の切断が起こる
アミノ酸配列の２個のアミノ酸間の部位は「切断部位」
と呼ばれる。
本発明方法は「IgAプロテアーゼ」による結合部での融
合タンパク質の酵素的切断を意図している。本発明方法
の範囲内で、「IgAプロテアーゼ」またはIgaseは、菌株
Neisseria gonorrhoeae MSllのIgAプロテアーゼと、ヌ
クレオチドレベルおよび生成法に関してこのプロテアー
ゼと関連した他のあらゆる酵素を包含する。また、これ
らは特にNeisseria属とHaemophilus属のIgAプロテアー
ゼを含む。
微生物E.coli ED 8654はゲッチンゲン3400、グリーセバ
ッハストローゼ８のジャーマン・コレクション・フォー
・マイクロオーガニズム（the German Collection for
Microorganisms）に受託番号DSM 2102として寄託され
た。
図面と合わせて以下の実施例により本発明をさらに詳し
く説明する。
図面は次の通りである： 図１は、担体タンパク質MS2ポリメラーゼ（99アミノ
酸）とN.gonorrhoeae MS11由来のIgAプロテアーゼ前駆
体のβ−ドメイン（アミノ酸位置1195−1505）の間のタ
ンパク質融合体の模式図を示す。これらの二成分間の結
合部は12のアミノ酸から成り、Igaseの切断配列−Pro−
Pro・！・Thr−Pro−を含む。切断部位の構築のため
に、制限切断部位EcoRIとHindIIIの間に４つのオリゴヌ
クレオチド（１）から（４）を組み込んだ。ポリペプチ
ドの生産および精製Igaseによる切断については実施例
５で詳述する。
図２は、担体タンパク質（MS2ポリメラーゼの99アミノ
酸およびプラスミドによりコードされる６アミノ酸）と
ヒトＴリンパ球からのCD8タンパク質の206アミノ酸から
成るタンパク質融合体を示す。Igaseにより切断される
天然の切断配列がCD8タンパク質のアミノ酸配列中に存
在する（実施例６参照）。
図３は、発現分泌系を用いてE.coli細胞により生産され
たタンパク質融合体B63＊を示す。これはアミノ末端の
コレラ毒素Ｂサブユニット（103アミノ酸）と、これに
続くIgase切断部位を含む結合部（11アミノ酸）と、カ
ルボキシル末端のIgAプロテアーゼ前駆体のβ−ドメイ
ンの一部（アミノ酸位置1097−1160）から成る。Igase
切断部位は２つのオリゴヌクレオチドTK006およびTK007
を用いて２つのタンパク質ドメインの間に組み込まれ
た。
図４は、タンパク質融合体B49およびB59の模式図を示
す。それらはコレラ毒素ＢサブユニットとIgAプロテア
ーゼ前駆体のβ−ドメインから成る。これらの成分間に
は２つの異なるIgase切断配列（−Pro−Pro−Ala−Pro
−および−Pro−Pro−Thr−Pro−）を有する２つの異な
る結合部が存在する。切断配列は合成オリゴヌクレオチ
ドを使って構築された（図３参照）。
実施例１ メチオニンを含まないＧ−CSFの発現用プラスミドの構
築 この構築は発現ベクターpPZ07−mgllac（WO 88/09373）
を使って行う。このために、発現ベクターpPZ07−mglla
cをNcoIで切断し、突出末端をヤエナリ（mung bean）ヌ
クレアーゼで除く。その後このベクターをBam HIで再び
切断する。次のオリゴヌクレオチドによりDNAレベルでI
gA認識配列を作製する。
オリゴヌクレオチドA: ５′AAT TCG GAG GAA AAA TTA ATG ACA CCA CTG CCA CC
T CCT ACA CCA CTG GGC CCT G 3′ オリゴヌクレオチドB: ５′GAT CC AGG GCC CAG TGG TGT AGG AGG TCG CAG TGG
TGT CAT TAA TTT TTC CTC CGA ATT 3′ 上記のように切断したベクターpPZ07−mgllacに、等モ
ル量の２つのオリゴヌクレオチドを加え、約100倍過剰
で挿入する。再連結後、常法でコンピテント細胞にした
E.coli K12の細胞を形質転換する。常法に従って細胞か
らDNAを単離し、ApaIとBam HIで切断する。制限エンド
ヌクレアーゼApaIとBam HIを使ってＧ−CSF配列から約5
20bp長のＧ−CSF断片を単離する（Science 232（198
6）,61−65）。この断片をApaIとBam HIで切断したベク
ターに連結する。
実施例２ IgA1認識配列のほかに、融合タンパク質は精製を容易に
するペプチドを含み得る。それはストレプトアビジンを
コードするDNAを含むことができる。このために、IgAプ
ロテアーゼ認識配列の前に正しい翻訳枠でストレプトア
ビジン遺伝子（WO 89/03422）をクローン化する。
実施例３ 実施例１に記載したプラスミドでE.coli K12細胞（ED 8
654、DSM 2102）を形質転換し、抗生物質マーカー（ア
ンピシリン）で選択し、そしてプラスミドを制限分析で
同定する。このようなクローンを培養およびＧ−CSFの
発現のために使用する。細胞を完全培地で増殖させる。
この培地はリットル当たり16gのバクトトリプトン（Dif
co）、10gの酵母エキス（Difco）、および5gの塩化ナト
リウムを含む。細胞をOD 546が2.0になるまで増殖さ
せ、その後10-3mol/lのIPTGで誘導する。さらに４時間
後、細胞を遠心により回収し、リゾチーム/EDTAで溶解
し、inclusion bodies（IB′ｓ、EP−A 0 219 874参
照）としてＧ−CSFを単離する。
単離した不溶性Ｇ−CSF融合体粒子の変性または再生
は、EP−A 0 219 874に記載されるように行う。変性は6
mol/lのグアニジン塩酸塩に対する透析により行う。こ
の時点でアリコートを取り、5mmol/lのリン酸カルシウ
ム緩衝液、pH7に対して透析後、これをIgAプロテアーゼ
て切断する（実施例４）。
別法として、グアニジン塩酸塩での変性後に、1mmol/l
GSHと3mmol/l GSSGを含む5mmol/lのリン酸カリウム緩衝
液、pH7に対して透析を行う。再生後、これを5mmol/lの
リン酸カリウム緩衝液、pH7に対して透析する。
実施例４ 位置−１にメチオニンを含まない天然Ｇ−CSFを製造す
るためのIgA1プロテアーゼによる融合タンパク質の切断 EMBO Jour.3（1984）,1595−1601に記載されるようにIg
A1プロテアーゼを単離する。実施例３に従って再生また
は変性したＧ−CSF 10μｇに２−５μｇのIgAプロテア
ーゼを加え、室温で30分間インキュベートする。メチオ
ニンを含まないＧ−CSFは、Mono−ＱやMono−Ｓのよう
なイオン交換カラムにかけて単離することができる。ア
ミノ末端のタンパク質の配列決定は、精製したＧ−CSF
が正しいアミノ酸配列Thr（＋）−Pro（＋２）から始ま
ることを示す。
実施例５ タンパク質融合体の生産およびIgase特異的切断部位で
の“inclusion bodies"からの不溶性タンパク質凝集体
の切断 原核生物発現ベクターpEX31C（K.Strebel,Journal of V
irology 57,983−991,1986）は、この系を使ってE.Coli
細胞で過剰生産されたタンパク質融合体がIgaseによっ
て担体タンパク質と目的タンパク質に切断されるような
方法で修飾した。
このために、合成オリゴヌクレオチドからアミノ酸配列
Thr−Pro−Ala−Pro−Arg−Pro−Pro・！・Thr−Proを
コードする二本鎖DNA断片を構築する。このDNA断片を遺
伝子工学的手法を使って発現ベクターpEX31CのEcoRI切
断部位に挿入する。さらに、これに直接隣接して、２つ
の合成DNA断片（一連の制限エンドヌクレアーゼのため
の適当な切断部位と遺伝子発現に関与する細菌酵素のた
めの終止シグナルを含んでいた）をHindIII切断部位に
挿入する。このようにして形成された発現プラスミドpE
V37に、SmaIとHindIIIの切断部位を使って、Neisseria
gonorrhoeae MS11由来のIgAプロテアーゼ前駆体タンパ
ク質のβ−ドメインをコードするDNA断片を挿入する。
これは、E.coliで発現させたとき融合タンパク質を形成
するハイブリッド遺伝子が構築されたことを意味する。
これはアミノ末端に担体タンパク質としてMS2ポリメラ
ーゼの99アミノ酸を、用いてIgase切断配列を有する12
アミノ酸の中央結合部を、そしてカルボキシル末端に目
的のβ−ドメインを含んでいた（図１参照）。精製した
Igaseを使って、タンパク質融合体のカルボキシル末端
のβ−ドメインを結合部内の切断部位Pro・！・Thrで切
断することができるだろう。
ハイブリッド遺伝子を含むプラスミドは、タンパク質融
合体の制御可能な過剰生産のためにバクテリオファージ
ラムダ由来の調節因子CI857を含むE.coli細胞に形質転
換することにより導入した（E.Remaut,Gene 22,103−11
3,1983）。CI857リプレッサー温度は28℃から42℃へ上
げて不活性化し、その結果組み換えE.coli細胞でのタン
パク質の生産が活性化された。このために、28℃で12時
間増殖させたE.coli培養物50mlを、予め45℃に加熱して
おいた培地200mlに移し、42℃でさらに２時間培養し
た。この段階で、タンパク質融合体が“inclusion bodi
es"の形で細菌の細胞質中に大量に蓄積する。その後細
胞を遠心により回収し、20mlの溶解緩衝液（10％サッカ
ロース、50mMトリス/HCl pH8.0、1mM EDTA）に懸濁し、
400μｌのリゾチーム溶液（5mg/ml）の添加後22℃で30
分間インキュベートする。洗剤トリトンＸ−100を加え
て0.1％の最終濃度となし、この溶液を再度30分間イン
キュベートした。細胞の溶解により放出されたDNAを超
音波処理で破壊し、沈殿体中に存在するタンパク質融合
体を含む不溶性成分を遠心し、その後5mlのU1NTE緩衝液
（1M尿素、50mM NaCl、50mMトリス/HCl pH8.0、1mM EDT
A）で洗った。再遠心後、沈殿物を5mlのPBS緩衝液（20m
Mリン酸カリウムpH7.5、140mM NaCl）中で音波処理を行
って懸濁し、洗浄した。残留尿素を完全に除くためにこ
の方法を数回繰り返した。最後に融合タンパク質を含む
不溶性画分は音波処理により5mlのPBS緩衝液に懸濁し
た。
SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（12.5％）とその
後のクーマシーブルーによる染色を用いて、懸濁したタ
ンパク質融合体の品質および量を測定した。切断のため
に、タンパク質懸濁体を酵素／基質比1/100（W/W）で37
℃で３時間インキュベートした。未精製の不溶性タンパ
ク質融合体から得られた切断を分析用SDSポリアクリル
アミドゲル電気泳動で調べ、これによりβ−タンパク質
の予期されたサイズを有するポリペプチドが形成された
ことが分かった。このタンパク質をニトロセルロース膜
に移し、自動配列解析にかけた。末端アミノ酸の配列に
より、それがIgase切断部位での正しい切断によりタン
パク質融合体から形成されたものであることを確認し
た。
しかし、この切断では、基質の全量の約50％までが変換
されたにすぎなかった。より多量のIgaseを加えても、
より長い時間反応させても増加が見られなかった。この
ことは、Igaseの切断部位が融合タンパク質の非切断部
分では接近しにくいことを示している。ハイブリッドタ
ンパク質および切断産物は、Igaseとのインキュベーシ
ョン後でさえ、また不溶性の凝集体の形をしており、そ
の結果懸濁体から遠心により沈殿した。
不純な“inclusion body画分”の代わりに、予め追加の
精製段階に付したタンパク質融合体を使用した場合は、
90％までの切断収率が達成された。このために、不溶性
沈殿物は、U1NTE緩衝液（上記）で洗った後、5mlのU7NT
E緩衝液（7M尿素、50mM NaCl、50mMトリス/HCl pH8.0、
1mM EDTA）に加えた。不溶性成分を遠心により除き、可
溶性画分を４℃で51のPBS緩衝液に対して透析した。透
析による尿素の除去中、融合タンパク質が不溶性凝集体
の形で溶液から沈殿した。沈殿した凝集体を超音波処理
で微細な懸濁体に変換し、Igaseで切断して、上記のよ
うに分析した。
実施例６ Igaseによる再生した可溶性タンパク質融合体の特異的
切断 pEX発現系を使って、MS2ポリメラーゼとヒト細胞障害性
Ｔリンパ球のCD8タンパク質の一部（図２参照）から成
るハイブリッドタンパク質を生産した（実施例１参
照）。初期の精製およびU7NTE緩衝液中での“inclusion
bodies"からのタンパク質の可溶化後に、更なる精製段
階として分離用12.5％SDSポリアクリルアミドゲルを使
用した。クーマシーブルー染色後にタンパク質融合体を
単一バンドとしてゲルから切りだし、Hunkapillerの方
法（Methods in Enzymology 91,227−235,1983）に従っ
てゲル材料から分離した。この方法では、0.1％SDS（ド
デシル硫酸ナトリウム）を加えたTAE緩衝液（40mMトリ
ス／酢酸塩pH7.9）中で電気溶出を行った。その後22℃
で51のTAE緩衝液に対して透析してSDSを除いた。タンパ
ク質は更なる透析で貯蔵緩衝液（20mMリン酸カリウムpH
7.5、140mM NaCl、50％グリセロール）に移した。この
ようにして得られた可溶性融合タンパク質を精製Igase
（実施例５参照）とインキュベートし、この方法で融合
タンパク質はCD8分子中に含まれる切断部位（−Pro−Pr
o・！・Thr−Pro−Ala、図２参照）で２つのポリペプチ
ド断片に完全に切断された。切断の特異性は、小さい方
の切断産物のアミノ末端のアミノ酸配列を分析して調べ
た。この試験の結果は、予期した通りに、Thr−Pro−Al
a−Pro−Thr−Ileであった。
実施例７ 培養上清から単離した可溶性融合タンパク質のIgaseに
よる特異的切断 コレラ毒素Ｂ−サブユニットとN.gonorrhoeae MS11由来
のIgaseプロテアーゼ前駆体のβ−ドメインの一部（Po
s.1097−1160;J.Pohlner,Nature 325,458−462,1987）
から成るタンパク質融合体を、組み換えE.coli細胞の培
養上清から可溶性形態で単離した。２つのタンパク質成
分を互いに分離するために、Igaseの人工的な切断配列
（Pro−Pro・！・Thr−Pro−）をコレラ毒素Ｂ−サブユ
ニットとβ−ドメイン間に遺伝子工学的手法を使って挿
入した。このために、オリゴヌクレオチドTK006およびT
K007を結合部の制限切断部位EcoRIおよびSacII間に挿入
した（図３参照）。37℃で12時間増殖させた細菌培養物
の上清21から融合タンパク質を硫安沈殿により濃縮し、
その後51のPBS緩衝液に対して透析した。切断のため
に、それを精製IgaseとPBS緩衝液中50μg/mlの濃度で酵
素／基質比1/50（w/w）で37℃、２時間インキュベート
した。イムノブロット分析により、完全な切断により生
じた大きい方の切断断片は、その分子量および抗血清と
の反応に関して、天然コレラ毒素Ｂ−サブユニットに一
致することが分かった。
実施例８ Igaseを用いたグラム陰性菌の表面上のタンパク質融合
体の特異的切断 発現分泌系を使って、コレラ毒素Ｂ−サブユニットとIg
Aプロテアーゼβ−ドメインから成るタンパク質融合体T
KB49およびTKB59を、組み換えサルモネラ菌の表面に露
出させた。TKB49をコードするハイブリッド遺伝子は、
毒素とβ−ドメイン間の結合部にIgaseのもとの切断配
列（ｃ）（−Pro−Pro・！・Ala−Pro−）を含んでい
た。これに対して、TKB59の遺伝子には制限切断部位Eco
RIとSacII間に、切断配列（−Pro−Pro・！・Thr−Pro
−）をコードするオリゴヌクレオチドTK006およびTK007
から成る合成DNA断片が挿入された（図３参照）。かか
るタンパク質融合体が表面に固着された細菌を精製Igas
eとインキュベートしたら、Igase切断部位で特異的に切
断が観察された。イムノブロット分析により、切断によ
り生じた小さい切断断片は、その分子量および抗血清と
の反応に関して、天然コレラ毒素Ｂ−サブユニットに一
致することが分かった。
実施例９ 組み換えE.coli細胞の培養上清からの活性Igaseの精製 修飾したIgAプロテアーゼ遺伝子を有するプラスミドpEX
1070（DE 36 22 221.6）を含む組み換えE.coli C600細
胞は培養上清に活性Igaseを分泌する。上清中にこの酵
素は膜濾過とこれに続く硫安（0.42g/ml）による溶液か
らの沈殿により濃縮した。遠心後、沈殿物をBiorex緩衝
液（50mMリン酸カリウムpH7.0、8.6％グリセロール）に
溶解し（11の培養上清当たり緩衝液1ml）、21の緩衝液
に対して透析し平衡化し、その後カチオン変換クロマト
グラフィー（Biorex 70）にかけた。結合したIgAプロテ
アーゼは溶離緩衝液（500mMリン酸カリウムpH7.0、8.6
％グリセロール）を使って一段階でカラムから溶離し、
分画化した。次いでIgAプロテアーゼ含有画分をSDSポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（12.5％）で分析した。精
製のこの時点で、平均純度＞90％が得られた。純粋なIg
aseの調製のために、Sephacryl HR300によるゲル濾過を
Biorex緩衝液で行い、続いて更なるカチオン交換クロマ
トグラフィー（上記参照）を行った。Igaseの活性は、I
gA1抗体とのインキュベーションおよび得られた切断産
物のSDSポリアクリルアミドゲルでの分離により調べ
た。
実施例10 メチオニン不含インターロイキン３の発現用プラスミド
の構築 この構築は発現ベクターpPZ07−mgllac（WO88/09373）
を使って行う。このために、発現ベクターpPZ07−mglla
cをNCOIで切断し、突出末端をヤエナリ（mung bean）の
ヌクレアーゼで除去する。次に、このベクターをBam HI
で再度切断する。融合タンパク質の最適化されたアミノ
末端領域は以下のオリゴヌクレオチドを使ってDNAレベ
ルで作製される： プライマー1A: ５′AATTCGGAGGAAAAATTAATGAAAGCCAAACGTTTTAAAAAACATG
TCGACCATGGAG3′ プライマー1B: ５′GGATCCTCCATGGTCGACATGTTTTTTAAAACGTTTGGCTTTCATT
AATTTTTCCTCCGAATT3′ 両方のオリゴヌクレオチドを等モル量で加え、上記のよ
うに切断したベクターpPZ07−mgllacに100倍過剰で挿入
する。連結後、常法でコンピテント細胞にしたE.coli K
12の細胞を形質転換する。既知の方法により細胞からDN
Aを単離し、Sa1I/Bam HIで切断し、そしてシグナル配列
を含まないインターロイキン３をコードする領域を含む
DNA断片と連結する（以下に記載する）。
IgAプロテアーゼの認識領域を含むインターロイキン３
をコードする領域は公知のPCR法を使ってDNAレベルで作
製され、PCR反応は鋳型としてのインターロイキン３のc
DNAおよび下記のプライマーを用いて行う： プライマー2A: ５′AAGCTTGTCGACCCACGTCCACCAGCTCCCATGACCCAGACAACGC
CC3′ プライマー2B: ５′TTCGTTGGATCCCTAAAAGATCGCGAGGTCAAAGT3′ 生成されたPCR断片は酵素SalIとBam HIで切断し、上記
のベクターDNAに直接挿入し、リガーゼで共有結合させ
る。
適当な宿主（例えばE.coli K12 C600）へのDNAの形質転
換後、Il3をE.coliにRb′ｓの形で合成させ、その後単
離する。タンパク質の変性および再生はＧ−CSFに関し
て記載したように行い、再生したタンパク質をIgAプロ
テアーゼで切断する。このようにして調製されたメチオ
ニン不含Il3は更なる精製段階後に治療のために使用す
ることができる。
実施例11 メチオニン不含インターロイキン２の発現用プラスミド
の構築 この構築は、実施例10に記載したように、プライマー1A
および1Bの挿入後にSalI/Bam HIで切断した発現ベクタ
ーpPZ07−mgllac（WO88/09373）を使って行うことがで
きる。IgAプロテアーゼ認識領域を有するインターロイ
キン２をコードする領域はPCR法を使ってDNAレベルで作
製され、PCR反応は鋳型としてのインターロイキン２のc
DNAおよびIgAプロテアーゼ認識領域をコードするプライ
マー3Aおよび3Bを用いて行う。
プライマー3A: ５′AAGCTTGTCGACCCACGTCCACCAGCACCTACTTCAAGTTCTACAA
AG3′ プライマー3B: ５′TTCGTTGGATCCTCAAGTTAGTGTTGAGATGATGCTTT3′ このようにして得られたPCR断片を酵素SalIとBam HIで
切断し、上記のベクターDNAに直接挿入する。Il3に関し
て述べたようにその後の手順を行う。
先の実施例では、アミノ酸配列Ala Proから始まるメニ
オニン不含治療用タンパク質がIgAプロテアーゼが認識
切断部位の使用と更なる方法によりどのようにして得ら
れるかについて記載した。上記実施例から類推して、す
なわちIgAプロテアーゼの認識領域および発表された配
列の５′または３′未満に相当する領域を含み、かくし
てPCR増幅により作製できるオリゴヌクレオチドを使う
ことにより、他のメチオニン不含タンパク質を生産する
ことができる。以下に、天然に存在する成熟体がAla−P
roで始まり、従って本発明方法と類似の方法で生産し得
る治療上関係のあるタンパク質を示してある： カテプシンＬ（EC 3.4.22.15）,Mason,R.W.et al.Bioch
em.J.240,373−377,1986. エリトロポエチン,Lai,P.H.et al.J.Biol.Chem.261,311
6−3121,1986. インターロイキン−1 ベータ,Zsebo,K.M.et al.Blood 7
1,962−968,1988. オステオネクチン,Fisher,L.W.et al.J.Biol.Chem.262,
9702−9708,1987. IV型コラゲナーゼ,Collier,I.E.et al.J.Biol.Chem.26
3,6579−6587,1988. さらに、成熟体がアミノ酸配列Ser,Proで始まるタンパ
ク質も生産できる。これらの例は次のものである： アルファ−1 アンチトリプシン,Hill,R.E.et al.,Natur
e 311,175−177,1984. 心房性ナトリウム利尿因子,Kambayashi,Y.et al.,FEBS
Lett.259,341−345,1990. 成熟体がThr Proで始まり、治療上関係のあるタンパク
質の他の例は次のものである： 補体因子B,Campell,R.D.et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.80,
4464−4468,1983. アポリポタンパク質A,Eaton,D.L.et al.,Proc.Nat.Aca
d.Sci.84,3224−3228,1987.
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｈ 9282−4Ｂ Ｋ 9282−4Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (31)優先権主張番号 Ｐ４０３９４１５．８ (32)優先日 1990年12月10日 (33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ） 微生物の受託番号 ＤＳＭ ２１０２ (72)発明者 シュマシェール，グーンター ドイツ連邦共和国 Ｄ―8131 ベルンリー ド，カペレンシュトラーセ 20 (72)発明者 ドニー，カロラ ドイツ連邦共和国 Ｄ―8131 スターンベ ルグ，ワルドシュミドシュトラーセ 15 (56)参考文献 特開 昭62−129298（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−164695（ＪＰ，Ａ) 特表 昭64−500164（ＪＰ，Ａ) 特表 昭64−500483（ＪＰ，Ａ)

Claims (33)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】融合タンパク質を酵素的に切断し、これら
    の融合タンパク質の目的成分を単離する方法であって、 （１）融合タンパク質の２つの成分が一緒に結合される
    結合部を遺伝子工学的手法により修飾して、この結合部
    にアミノ酸配列Ｙ−Pro・！・Ｘ−Pro（ここでＸはアミ
    ノ酸であり、Ｙは１個または数個の任意のアミノ酸であ
    る）を有するIgAプロテアーゼ認識部位を少なくとも１
    つ形成し、 （２）階段（１）から得られた融合タンパク質を・！・
    で示した認識部位中の位置でIgAプロテアーゼにより切
    断し、そして （３）切断後、融合タンパク質の１つまたはいくつかの
    目的成分を単離する ことを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】融合タンパク質の結合部をIgAプロテアー
    ゼ認識部位またはその一部をコードするヌクレオチド配
    列の組み込みにより修飾し、その際融合タンパク質の目
    的成分をコードする１つまたはいくつかのDNAセクショ
    ンの前および／または後に該ヌクレオチド配列を組み込
    む、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】もともと天然IgA認識部位をもっていない
    融合タンパク質を修飾する、請求項１または２記載の方
    法。
  4. 【請求項４】目的成分のほかに１つまたはいくつかの担
    体成分を含む融合タンパク質の結合部を修飾する、請求
    項１−３のいずれか１つに記載の方法。
  5. 【請求項５】融合タンパク質の担体成分はβ−ガラクト
    シダーゼの一部を含む、請求項４記載の方法。
  6. 【請求項６】融合タンパク質の担体成分はいくつかの荷
    電アミノ酸および／または特定の物質に高い親和性で結
    合するタンパク質またはポリペプチドを含む、請求項４
    記載の方法。
  7. 【請求項７】ＸはSer、ThrまたはAlaを表す、請求項１
    −６のいずれか１つに記載の方法。
  8. 【請求項８】ＸはSerまたはThrを表す、請求項７記載の
    方法。
  9. 【請求項９】Ｙは配列Pro、Pro−Ala、Arg−Pro、Pro−
    Arg−Pro、Ala−Pro−Arg−ProまたはPro−Ala−Pro−A
    rg−Proで終わる、請求項１−８のいずれか１つに記載
    の方法。
  10. 【請求項１０】IgAプロテアーゼ認識部位は次のアミノ
    酸配列： ａ）Pro−Ala−Pro・！・Ser−Pro ｂ）Pro−Pro・！・Ser−Pro ｃ）Pro−Arg−Pro−Pro・！・Ala−Pro ｄ）Pro−Pro・！・Thr−Pro ｅ）Ala−Pro−Arg−Pro−Pro・！・Thr−Proまたは ｆ）Pro−Ala−Pro−Arg−Pro−Pro・ｌ・Thr−Pro を有する、請求項９記載の方法。
  11. 【請求項１１】（１）結合部に少なくとも１つのIgAプ
    ロテアーゼ認識部位を含む融合タンパク質をコードする
    少なくとも１コピーの遺伝子を保有する組み換えDNAま
    たは組み換えベクターで細胞を形質転換し、 （２）適当な培地で該形質転換細胞を培養し、 （３）該形質転換細胞において融合タンパク質をコード
    する遺伝子を発現させ、 （４）該融合タンパク質をIgAプロテアーゼで切断し、
    そして （５）該融合タンパク質の１つまたはいくつかの目的成
    分を単離する、 ことから成る、請求項１−10のいずれか１つに記載の方
    法。
  12. 【請求項１２】融合タンパク質は細胞溶解後および／ま
    たは細胞タンパク質の除去後にIgAプロテアーゼを使っ
    て培地中で切断する、請求項11記載の方法。
  13. 【請求項１３】融合タンパク質の切断のために、ナイセ
    リア属、特に淋菌（Neisseria gonorrhoeae）および髄
    膜炎菌（Neisseria meningitidis）またはヘモフィルス
    属、特にインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）
    およびエジプトヘモフィルス（Haemophilus aegypticu
    s）の病原菌種から誘導されるIgAプロテアーゼ、あるい
    は該IgAプロテアーゼの修飾により誘導されかつIgAプロ
    テアーゼ活性を有するタンパク質を使用する、請求項１
    −12のいずれか１つに記載の方法。
  14. 【請求項１４】融合タンパク質の切断のために、過剰生
    産性の非病原菌株から得られるIgAプロテアーゼを使用
    する、請求項13記載の方法。
  15. 【請求項１５】融合タンパク質の切断のために、固定化
    されたIgAプロテアーゼを使用する、請求項13または14
    記載の方法。
  16. 【請求項１６】可溶性形態、不溶性形態、膜に結合した
    または細胞に結合した形態で存在する融合タンパク質を
    切断する、請求項11−15のいずれか１つに記載の方法。
  17. 【請求項１７】不溶性沈殿体として存在する融合タンパ
    ク質を切断する、請求項16記載の方法。
  18. 【請求項１８】Ｎ−末端メチオニン残基を含まない原核
    細胞由来の組み換えタンパク質の生産のために、配列Me
    t−Ｙ−Pro・！・Ｘ−Pro−Ａ（ここでＸはいずれかの
    アミノ酸を表し、Ｙは１個または数個の任意のアミノ酸
    を表し、そしてＡはアミノ酸配列を表す）を有する融合
    タンパク質をIgAプロテアーゼで切断し、これによりア
    ミノ酸配列Ｘ−Pro−Ａを有するタンパク質またはペプ
    チドを切断産物として得る、請求項１−17のいずれか１
    つに記載の方法。
  19. 【請求項１９】融合タンパク質の目的成分はアミノ酸配
    列Ｘ−Proで始まる、請求項18記載の方法。
  20. 【請求項２０】Ｘ−Pro−Ａはヒト顆粒球コロニー刺激
    因子（Ｇ−CSF）またはその誘導体を表す、請求項１−1
    9のいずれか１つに記載の方法。
  21. 【請求項２１】IgAプロテアーゼで切断した後、別の工
    程において融合タンパク質の目的成分をジペプチジルア
    ミノペプチダーゼで処理し、この方法によりＮ−末端配
    列Ｘ−Proを切断する、請求項18記載の方法。
  22. 【請求項２２】Ｘ−Pro−ジペプチジルアミノペプチダ
    ーゼを使ってＮ−末端配列Ｘ−Proを切断する、請求項2
    1記載の方法。
  23. 【請求項２３】それぞれのポリペプチド成分間の少なく
    とも１つの結合部に遺伝子工学的手法により導入され
    た、アミノ酸配列Ｙ−Pro・！・Ｘ−Pro（ここでＸはSe
    r、ThrまたはAlaを表し、ＹはProまたはPro、Pro−Al
    a、Pro−Arg−Pro、Ala−Pro−Arg−ProまたはPro−Ala
    −Pro−Arg−Proで終わるアミノ酸配列を表す）で表さ
    れる１つまたはいくつかのIgAプロテアーゼ認識部位を
    有する、いくつかのポリペプチド成分を含む融合タンパ
    ク質（ただし、該融合タンパク質には、IgAプロテアー
    ゼ前駆体遺伝子の遺伝子部分によりコードされる、天然
    IgAプロテアーゼ認識部位を含むポリペプチド部分が存
    在しない）。
  24. 【請求項２４】ＸはSerまたはThrを表す、請求項23記載
    の融合タンパク質。
  25. 【請求項２５】アミノ酸配列Met−Ｙ−Pro・！・Ｘ−Pr
    o−Ａ（ここでＸとＹは上記の意味を有し、Ａはアミノ
    酸配列を表す）を有する、請求項23記載の融合タンパク
    質。
  26. 【請求項２６】アミノ酸配列Ｘ−Pro−Ａは顆粒球コロ
    ニー刺激因子（Ｇ−CSF）またはその誘導体を表す、請
    求項23−25のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
  27. 【請求項２７】請求項23−26のいずれか１つに記載した
    融合タンパク質をコードする、組み換えDNA。
  28. 【請求項２８】請求項27に記載した組み換えDNAの１つ
    またはいくつかのコピーを含む、組み換えベクター。
  29. 【請求項２９】組み換えDNAは誘導可能な発現シグナル
    の制御下にある、請求項28記載の組み換えベクター。
  30. 【請求項３０】原核生物のベクターである、請求項28ま
    たは29記載の組み換えベクター。
  31. 【請求項３１】プラスミドである、請求項28−30のいず
    れか１つに記載の組み換えベクター。
  32. 【請求項３２】請求項27に記載したDNAまたは請求項28
    −31のいずれか１つに記載したベクターで形質転換され
    た細胞。
  33. 【請求項３３】原核生物の細胞である、請求項32記載の
    細胞。
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