MX2010010313A - Analisis de factor de crecimiento pegilado similar a insulina. - Google Patents
Analisis de factor de crecimiento pegilado similar a insulina.Info
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Abstract
La presente invención reporta un inmunoanálisis para la determinación de factor de crecimiento pegilado similar a insulina utilizando un anticuerpo anti-(polietilenglicol) y un anticuerpo anti-digoxigenina para la detección de factor de crecimiento similar a insulina/complejo de factor de crecimiento similar a insulina con unión de proteína.
Description
ANALISIS DE FACTOR DE CRECIMIENTO PEGILADO SIMILAR A INSULINA
CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con el campo de inmunoanálisis , de manera más precisa se reporta un inmunoanálisis para la detección y cuantificación de factor de crecimiento pegilado similar a insulina mediante la formación y determinación de un complejo de factor de crecimiento pegilado similar a insulina y una proteína de unión a factor de crecimiento similar a insulina. ANTECEDENTES DE LA INVENCION Los factores de crecimiento I y II similares a insulina (IGF I e IGF II, por sus siglas en inglés) son miembros de la superfamilia insulina de hormonas, factores del crecimiento y neuropéptidos cuyas acciones biológicas se obtienen mediante la unión a receptores en superficie celular, por ejemplo el receptor de factor de crecimiento I similar a insulina o el receptor del factor de crecimiento II similar a insulina. El factor de crecimiento similar a la insulina y la hormona del crecimiento (GH, por sus siglas en inglés) tienen un papel importante en regular el crecimiento somático fetal e infantil. Varias décadas de investigación básica y clínica han demostrado que también es crítico para mantener el crecimiento neoplásico (Khandwala, H.M., et al.,. Endocr. Rev. 21 (2000) 215-244) . Las acciones del factor de REF.:213124
crecimiento similar a insulina son reguladas por proteínas de unión a factor de crecimiento similar a insulina (las IGFBP, por sus siglas en inglés) que actúan como transportadores de los factores de crecimiento similares a insulina protegiéndolos de la degradación, limitando o inhibiendo su unión a receptores y manteniendo un "depósito" de factor de crecimiento similar a insulina biológicamente inactivo (Martin, J.L., and Baxter, R.C., IGF binding proteins as modulators of IGF actions, in Rosenfield, R.G. , and Roberts, C.T. (eds.), The IGF system, Molecular Biology, Physiology, and Clinical Applications (1999) , Humana Press, Totowa, 227-255; Jones, J.L., and Clemmons, D.R., Endocr. Rev. 12 (1995) 10-21; Khandwala, H.M., et al., Endocr. Rev. 21 (2000) 215-244; Hwa, V., et al., The IGF binding protein superfamily, in Rosenfeld, R.G., and Roberts, C.T. (eds.), The IGF system, Molecular Biology, Physiology, and Clinical Applications (1999) , Humana Press, Totowa, p . 315-327) . Virtualmente , cada nivel del sistema de factor de crecimiento similar a insulina que media una respuesta sobre tejidos tumorales (los IGF, las IGFBP y los receptores de IGF) pueden ser el objetivo para soluciones terapéuticas (Khandwala, H.M., et al., Endocr. Rev. 21 (2000) 215-244; Fanayan, S., et al., J. Biol. Chem. 275 (2000) 39146-39151; Imai, Y., et al., J. Biol . Chem. 275 (2000) 18188-18194). También debe mencionarse aquí que la proteína 3 de unión a factor de crecimiento
similar a insulina tiene efectos antiproliferativos y proapoptósicos independientes de factor de crecimiento similar a insulina (Wetterau, L.A., et al., Mol. Gen. Metab. 68 (1999) 161-181; Butt, A.J., et al., J. Biol . Chem. 275 (2000) 39174-39181) . El factor de crecimiento I similar a insulina humano es una hormona circulante relacionada estructuralmente con insulina. El factor de crecimiento I similar a insulina tradicionalmente se considera como el mediador principal de las acciones de la hormona del crecimiento sobre tejidos periféricos. El factor de crecimiento I similar a insulina consiste de 70 aminoácidos y también se ha denominado somatomedina C y ha sido definido por SwissProt Número P01343. El uso, actividad y producción se mencionan, por ejemplo, en le Bouc, Y., et al., FEBS Lett . 196 (1986) 108-112; de Pagter-Holthuizen, P., et al., FEBS Lett. 195 (1986) 179-184; Sandberg Nordqvist, A.C., et al., Brain Res. Mol. Brain Res. 12 (1992) 275-277; Steenbergh, P.H., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 175 (1991) 507-514; Tanner, J.M., et al., Acta Endocrinol . (Copenhagen) 84 (1977) 681-696; Uthne, K. , et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 39 (1974) 548-554; EP 0 123 228; EP 0 128 733 ; documento de E.U.A. 5,861,373; documento de E.U.A. 5,714,460; EP 0 597 033; WO 02/32449; WO 93/02695. La regulación de la función del factor de
crecimiento I similar a insulina es muy compleja. En circulación, existe solo una concentración marginal de 0.2% a 1.0% de factor de crecimiento I similar a insulina en forma libre mientras que la mayor parte está unido a proteínas que unen factor de crecimiento similar a insulina, las cuales tienen afinidades muy altas por factores de crecimiento similares a insulina y modulan la función del factor de crecimiento I similar a insulina. El factor puede ser liberado localmente por mecanismos que liberan factor de crecimiento I similar a insulina tales como proteólisis de proteínas que unen a factor de crecimiento similar a insulina por proteasas . El factor de crecimiento I similar a insulina juega un papel paracrino en el desarrollo y maduración del cerebro (Werther, G.A. , et al., Mol. Endoc inol . 4 (1990) 773-778). Estudios in vitro indican que el factor de crecimiento I similar a insulina es un agente trópico no selectivo potente para varios tipos de neuronas en el SNC (Knusel, B., et al., J. Neurosci. 10(1990) 558-570; Svrzic, D., and Schubert, D., Biochem. Biophys . Res. Commun. 172 (1990) 54-60), que incluye neuronas dopaminérgicas (Knusel, B., et al., J. Neurosci. 10 (1990) 558-570) y oligodendrocitos (McMorris, F.A., and Dubois-Dalcq, M . , J. Neurosci. Res. 21 (1988) 199-209; McMorris, F.A., et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 83 (1986) 822-826; Mozell, R.L., and McMorris, F.A., J. Neurosci. Res.
30 (1991) 382-390)). El documento de E.U.A. 5,093,317 menciona que se incrementa la supervivencia de células neuronales colinérgicas por administración de factor de crecimiento II similar a insulina. Se sabe además que el factor de crecimiento I similar a insulina estimula la regeneración de nervios periféricos (Kanje, M. , et al., Brain Res. 486 (1986) 396-398) e incrementa la actividad de ornitina descarboxilasa (documento de E.U.A. 5,093,317). El documento de E.U.A. 5,861,373 y O 93/02695 mencionan un método para tratar daños o enfermedades del sistema nervioso central que afecta predominantemente a células de neuroglia y/o células neuronales no colinérgicas al aumentar una o varias concentraciones activas del factor de crecimiento I similar a insulina y/o análogos del mismo en el sistema nervioso central del paciente. El documento WO 02/32449 se relaciona con métodos para reducir o evitar daño isquémico en el sistema nervioso central de un mamífero al administrar a la cavidad nasal del mamífero una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de factor de crecimiento I similar a insulina o variantes biológicamente activas del mismo. El factor de crecimiento I similar a insulina se absorbe a través de la cavidad nasal y es transportado al interior del sistema nervioso central del mamífero en una cantidad eficaz para reducir o evitar daño isquémico asociado con un evento isquémico. En el documento
EP O 874 641 se reporta el uso de un factor de crecimiento I similar a insulina o un factor de crecimiento II similar a insulina para la elaboración de un medicamento para tratar o evitar daño neuronal en el sistema nervioso central. La reducción de las concentraciones en cerebro y suero del factor de crecimiento I similar a insulina libre se han relacionado con la patogénesis de formas esporádicas y familiares de enfermedad de Alzheimer. Además, el factor de crecimiento I similar a insulina protege a las neuronas contra neurotoxicidad inducida por ?ß (Niikura, T. , et al., J. Neurosci. 21(2001) 1902-1910; Dore, S., et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 94 (1997) 4772-4777; Dore, S., et al., Ann. NY Acad. Sci. 890 (1999) 356-364). Recientemente, se ha demostrado que el factor de crecimiento II similar a insulina, administrado periféricamente es capaz de reducir las concentraciones de ?ß cerebrales en ratas y ratones (Carro, E., et al., Nat. Med. 8 (2002) 1390-1397). Además, el estudio ha demostrado que en un modelo de ratón AD transgénico el tratamiento prolongado con factor de crecimiento I similar a insulina reduce de manera significativa la carga de placa amiloide cerebral. Estos datos constituyen un indicio fuerte para la idea de que el factor de crecimiento I similar a insulina es capaz de reducir las concentraciones de ?ß en cerebro y la demencia en cerebro asociado a producción de placas al depurar ?ß del cerebro.
El factor de crecimiento I similar a insulina y el factor de crecimiento II similar a insulina son polipéptidos de 70 y 67 aminoácidos de cadena sencilla idénticos en 67%, respectivamente, y comparten con la insulina aproximadamente 40% de identidad de secuencia y supuesta homología estructural. Los primeros 29 residuos de los factores de crecimiento similares a insulina son homólogos a la cadena B de insulina (región B, 1-29) seguido por 12 residuos que son análogos al péptido C de proinsulina (región C, 30-41) y una región de 21 residuos que es homologa a la cadena A de insulina (región A, 42-62). El octapéptido carboxi terminal (región D, 63-70) no tiene contraparte en insulina y proinsulina (Murray-Rust , J., et al., BioEssays 14 (1992) 325-331; Baxter, R.C., et al., J. Biol . Chem. 267 (1992) 60-65). Los factores de crecimiento similares a insulina son los únicos miembros de la superfamilia de insulina en los cuales la región C no ha sido separada proteolíticamente después de la traducción. Las proteínas de unión a factor de crecimiento similar a insulina (proteínas 1 a 6 de unión a factor de crecimiento similar a insulina) son proteínas de 216 a 289 residuos en donde la proteína 5 madura de unión a factor de crecimiento similar a insulina consiste de 252 residuos (Wetterau, L.A., et al., Mol. Gen. Metab. 68 (1999) 161-181; para una revisión véase, por ejemplo, Rajaram, S., et al.,
Endocr. Rev. 18 (1997) 801-831) . Todas las proteínas que se unen a factor de crecimiento similar a insulina comparten una organización de dominio común. La conservación más alta se encuentra en la parte N-terminal (residuos 1 a aproximadamente 100) y los dominios ricos en cisteína de la parte C-terminal (desde el residuo 170) . Se encuentran 12 cisteínas conservadas en el dominio N-terminal y seis en el dominio C-terminal. La parte débilmente conservada central (dominio L) contiene la mayor parte de los sitios de separación para proteasas específicas (Chernausek, S.D., et al., J. Biol. Chem. 270 (1995) 11377-11382). Hasta ahora se han descrito y caracterizado bioquímicamente varios fragmentos diferentes de proteínas de unión a factor de crecimiento similar a insulina (Mazerbourg, S., et al., Endocrinology 140 (1999) 4175-4184) . Los estudios de mutagénesis sugieren que el sitio de unión del factor de crecimiento similar a insulina de alta afinidad se localiza en el dominio N-terminal ( etterau, L.A., et al., Mol. Gen. Metab. 68 (1999) 161-181; Chernausek, S.D., et al., J. Biol. Chem. 270 (1995) 11377-11382) y que por lo menos la proteína 3 de unión a factor de crecimiento similar a insulina y la proteína 2 de unión a factor de crecimiento similar a insulina contienen dos determinantes de unión, uno en el dominio N-terminal y el otro en el dominio C-terminal ((Wetterau, L.A., et al., Mol. Gen. Metab. 68 (1999) 161-
181) . Recientemente se ha descrito un grupo de proteínas relacionadas con la proteína de unión a factor de crecimiento similar a insulina (las IGFBP-rP, por sus siglas en inglés) , las cuales unen factores de crecimiento similar a insulina con una afinidad menor que las proteínas de unión a factor de crecimiento similar a insulina (H a, V., et al., The IGF binding protein superfamily in Rosenfeld, R.G. , and Roberts, C. T. (eds.), The IGF system, Molecular Biology, Physiology, and Clinical Applications (1999) , Humana Press, Totowa, pp. 315-327) . Las proteínas de unión a factor de crecimiento similar a insulina y las IGFBP-rP comparten un dominio en la parte N-terminal altamente conservado y rico en cisteína el cual parece ser crucial para varias acciones biológicas que incluyen su unión a factores de crecimiento similares a insulina y una unión de alta afinidad a insulina (Hwa et al., 1999) . Los fragmentos de la parte N-terminal de la proteína 3 de unión a factor de crecimiento similar a insulina generados, por ejemplo por digestión con plasma también unen insulina y fisiológicamente por lo tanto son probablemente relevantes para la acción de insulina. Más allá del dominio N-terminal, existe una carencia de similitud de secuencia entre las proteínas de unión a factor de crecimiento similar a insulina y las IGFBP-rP. SUMARIO DE LA INVENCION El primer aspecto de la presente invención es un
inmunoanálisis para la detección de factor de crecimiento pegilado similar a insulina que comprende un anticuerpo de captación y un anticuerpo trazador en donde el anticuerpo de captación es un anticuerpo monoclonal anti- (polietilenglicol) , el anticuerpo trazador es un anticuerpo monoclonal anti -digoxigenina y el factor de crecimiento pegilado similar a insulina se detecta como un complejo con una proteína que une a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilada por lo que la etapa de incubación del factor de crecimiento pegilado similar a insulina y la proteína de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilada es durante 12 a 24 horas a temperatura ambiente con una concentración de la proteína de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilada de 5.0 yg/ml o menor. En una modalidad, el anticuerpo anti- (polietilenglicol) se conjuga a una fase sólida y el anticuerpo anti -digoxigenina se conjuga a una marca detectable . En otra modalidad, la conjugación es una conjugación química. En una modalidad adicional, la marca detectable se selecciona de enzimas, grupos fluorescentes, grupos quimioluminiscentes y complejos de quelato de metal. En una modalidad adicional, el factor de crecimiento pegilado similar a insulina es el factor de crecimiento I similar a insulina de la SEC ID NO: 1 o una variante pegilada del
mismo. En una modalidad adicional, el factor de crecimiento pegilado similar a insulina está monopegilado . En otra modalidad adicional, la proteína de unión a factor de crecimiento similar a insulina es la proteína 3 de unión a factor de crecimiento similar a insulina, la proteína 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina o la proteína 5 de unión a factor de crecimiento similar a insulina. En una modalidad adicional, el inmunoanálisis de acuerdo con la invención se caracteriza porque la etapa de incubación del factor de crecimiento pegilado similar a insulina y la proteína de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilada es desde 18 a 22 horas, preferiblemente 20 horas. En una modalidad adicional, el inmunoanálisis de acuerdo con la invención se caracteriza en que la etapa de incubación del factor de crecimiento pegilado similar a insulina y la proteína de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilada es con una concentración de proteína de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilada desde 0.1 hasta 5.0 pg/ml o desde 0.1 g/ml hasta 1.0 g/ml. El segundo aspecto de la presente invención es un método para la determinación de factor de crecimiento pegilado similar a insulina en una muestra, que comprende las siguientes etapas: a) proporcionar una muestra que se va a analizar,
b) incubar un anticuerpo anti- (polietilenglicol ) conjugado a una fase sólida con la muestra para formar un complejo anticuerpo anti- (polietilenglicol) /factor de crecimiento pegilado similar a insulina, c) incubar el complejo que se forma en el inciso b) con la proteína 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilada para formar un segundo complejo que comprende el complejo que se forma en el inciso b) a temperatura ambiente durante 12 a 24 horas con una concentración de proteína 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilada de 5.0 yg/ml o menor, d) incubar el complejo que se forma en c) con un anticuerpo anti -digoxigenina conjugado con peroxidasa de rábano para formar un tercer complejo que comprende el complejo formado en el inciso c) , e) determinar el factor de crecimiento pegilado similar a insulina al incubar el complejo formado en el inciso d) con ABTS y por detección de la formación del producto coloreado. En una modalidad del método se realiza una etapa de lavado después de las etapas b) y/o c) , y/o d) . En una modalidad, el factor de crecimiento pegilado similar a insulina es factor de crecimiento I similar a insulina pegilado o una variante pegilada del mismo. En otra modalidad, la etapa de incubación del factor de crecimiento
pegilado similar a insulina y la proteína 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilada es durante 18 a 22 horas. En una modalidad adicional, la etapa de incubación del factor de crecimiento pegilado similar a insulina y la proteína 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilada es con una concentración de proteína 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilada desde 0.1
hasta 5.0 pg/ml . Un tercer aspecto de la presente invención es un método para la determinación cuantitativa de la cantidad de factor de crecimiento pegilado similar a insulina o una variante pegilada del mismo en una muestra que comprende las siguientes etapas: a) proporcionar una muestra que se va a analizar, b) proporcionar por lo menos dos muestras de referencia, cada una contiene una cantidad definida pero diferente de factor de crecimiento I similar a insulina pegildado, c) incubar por separado un anticuerpo anti- (polietilenglicol ) conjugado a una fase sólida con la muestra y con por lo menos dos muestras de referencia que contienen cantidades diferentes de factor de crecimiento I similar a insulina pegilado para formar un complejo de anticuerpo anti- (polietilenglicol) /factor de crecimiento pegilado similar a insulina,
d) incubar por separado el complejo que se formó en el inciso c) en cada una de la muestra y las muestras de referencia con proteína 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilada para formar un segundo complejo que comprende el complejo que se forma en el inciso c) , por lo que la incubación con la proteína 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilada es durante 12 a 24 horas a temperatura ambiente con una concentración de la proteína 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilada de 5.0 pg/ml o menor, e) incubar por separado el complejo que se forma en el inciso d) en cada uno de la muestra y las muestras de referencia con anticuerpo anti-digoxigenina conjugado con peroxidasa de rábano para formar un tercer complejo que comprende el complejo formado en el inciso d) , f) incubar por separado el complejo que se forma en el inciso e) en cada uno de la muestra y las muestras de referencia con ABTS durante 5 a 15 minutos y determinar la cantidad de producto coloreado que se forme, g) determinar cuantitativamente la cantidad de factor de crecimiento I similar a insulina pegilado o de una variante pegilada del mismo en la muestra con una curva de calibración calculada en base en la cantidad de producto coloreado formado en las muestras de referencia.
Un cuarto aspecto de la presente invención es el uso de un método de acuerdo con la invención para el seguimiento de un paciente en quien se ha administrado factor de crecimiento pegilado similar a insulina o una variante pegilada del mismo. Una modalidad de los aspectos de la presente invención es que el anticuerpo de captación es una mezcla del anticuerpo anti- (polietilenglicol ) que comprende por lo menos dos de los anticuerpos anti- (polietilenglicol) que difieren en el sitio de anticuerpo en el cual se conjugan a la fase sólida, y el anticuerpo trazador es una mezcla de anticuerpo anti-digoxigenina que comprende por lo menos dos de los anticuerpos anti-digoxigenina que difieren en el sitio de anticuerpo en el cual se conjugan a la marca detectable . En una modalidad adicional, la conjugación del anticuerpo a su asociado de conjugación se realiza al unir químicamente, vía parte N-terminal y/o grupos e-amino (lisina) , grupos e-amino de diferentes lisinas, grupos funcionales carboxi, sulfhidrilo, hidroxilo y/o fenólico de la estructura principal de aminoácido del anticuerpo y/o los grupos de alcohol de azúcar de la estructura de carbohidratos del anticuerpo. En una modalidad de los aspectos de la invención, la mezcla de anticuerpo de captación o la mezcla de anticuerpo trazador comprende el anticuerpo respectivo conjugado vía un grupo amino y vía una estructura
carbohidrato a su asociado de conjugación. En una modalidad adicional, la conjugación del anticuerpo de captación a la fase sólida se realiza por adsorción pasiva o vía un par de unión específico. En una modalidad de la invención, el par de unión específico (primer componente/segundo componente) se selecciona de estreptavidina o avidina/biotina o anticuerpo/antígeno, o lectina/polisacárido o esteroide/proteína que une esteroide, u hormona/receptor de hormona, o enzima/sustrato, o IgG/proteína A y/o G. En otra modalidad, el anticuerpo de captación se conjuga a biotina y la conjugación a la fase sólida se realiza por medio de avidina o estreptavidina inmovilizadas. En otra modalidad, el anticuerpo de captación es un anticuerpo anti- (polietilenglicol ) de la clase IgM. En otra modalidad adicional de los aspectos de la invención es un anticuerpo trazador conjugado a la marca detectable vía un par de unión específico. Otra modalidad de los aspectos de la presente invención es que la relación de anticuerpo de captación respecto a anticuerpo trazador es 1:10 a 50:1 (relación significa relación de moléculas de anticuerpos sin importar el peso molecular de los conjugados, los cuales pueden ser diferentes) . Otro aspecto de la presente invención es un kit para la determinación de factor de crecimiento I similar a insulina pegilado o una variante pegilada del mismo en una
muestra, que comprende: a) una placa de microtitulación recubierta con estreptavidina , b) un anticuerpo anti (polietilenglicol ) conjugado a biotina, c) un anticuerpo anti-digoxigenina conjugado a peroxidasa de rábano, d) proteína 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilado, e) ABTS. En una modalidad, los anticuerpos en el inciso b) y c) son anticuerpos monoclonales . En otra modalidad, el anticuerpo en el inciso b) es un anticuerpo de la clase IgM y el anticuerpo en el inciso c) es un anticuerpo de la clase igG. BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La figura 1 es un esquema de un inmunoanálisis de acuerdo con la invención ejemplificado con el factor de crecimiento I similar a insulina y la proteína 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina; 1: placa de microtitulación recubierta con estreptavidina, 2: anticuerpo monoclonal anti - (polietilenglicol ) biotinado, 3: factor de crecimiento I similar a insulina pegilado, 4: proteína 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilada , 5: anticuerpo monoclonal anti-digoxigenina
conjugado a peroxidasa de rábano. La figura 2 muestra la curva estándar obtenida con las muestras de referencia (ejemplo 2); eje de las abscisas: concentración de factor de crecimiento pegilado similar a insulina, en ng/ml, eje de las ordenadas: media de señal de absorción. La figura 3 muestra curvas estándar obtenidas con muestras i) en las que se ha agregado una concentración conocida con cantidades de referencia de factor de crecimiento pegilado similar a insulina (rombos) , ii) con administración de concentración conocida de suero humano 5% (v/v) y cantidades de referencia de factor de crecimiento pegilado similar a insulina (triángulos) y iii) adición de una concentración conocida con 10 ng/ml de proteína 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina, 5% (v/v) el suero humano y cantidades de referencia de factor de crecimiento pegilado similar a insulina (cuadros); eje de las abscisas: concentración de factor de crecimiento pegilado similar a insulina, en ng/ml, eje de las ordenadas: media de Ia señal de absorción; condiciones de análisis: anticuerpo anti- (polietilenglicol) de clase Ig , proteína 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilado en una concentración de 0.1 yg/ml, conjugado de anticuerpo anti-digoxigenina-peroxidasa de rábano a 50 mU/ml , todos los tiempos de incubación: 1 hora, temperatura ambiente, el
factor de crecimiento pegilado similar a insulina es una mezcla de proteína pegilada en la parte N-terminal y pegilada en la posición 68. La figura 4 muestra curvas estándar obtenidas con las muestras i) adicionadas con concentración conocida con cantidades de referencia de factor de crecimiento pegilado similar a insulina (rombos) , ii) adicionadas con concentraciones conocidas de suero humano 5% (v/v) y cantidades de referencia de factor de crecimiento pegilado similar a insulina (triángulos) y iii) adicionadas con concentraciones conocidas de 10 ng/ml de proteína 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina, 5% (v/v) el suero humano y cantidades de referencia de factor de crecimiento pegilado similar a insulina (cuadros); eje de las abscisas: concentración de factor de crecimiento pegilado similar a insulina, en ng/ml, eje de las ordenadas: media de la señal de absorción; condiciones de análisis: anticuerpo anti- (polietilenglicol ) de clase IgM, proteína 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilado en una concentración de 0.1 yg/ml, conjugado de anticuerpo anti-digoxigenina-peroxidasa de rábano a 50 mU/ml, todos los tiempos de incubación: 1 hora excepto para la incubación con la proteína 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilada, el cual es de 20 horas, temperatura ambiente, el factor de crecimiento pegilado similar a
insulina es una mezcla de proteína pegilada en la parte N-terminal y pegilada en la posición 68. La figura 5 muestra curvas estándar obtenidas con las muestras i) a las que se les ha agregado una concentración conocida con cantidades de referencia de factor de crecimiento similar a insulina pegilada y una concentración de proteína 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilada de 0.1 g/ml (rombos) a las que se les ha adicionado una concentración conocida con cantidades de referencia de factor de crecimiento similar a insulina pegilada, 20 ng/ml de proteína 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina y una concentración de proteína 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilada de 0.1 g/ml (triángulos), iii) a las que se ha agregado una concentración conocida con cantidades de referencia de factor de crecimiento pegilado similar a insulina, 20 ng/ml de proteína 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina y una concentración de proteína 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilada de 0.5 µg/ml (cuadros); iv) adicionado con concentración conocida, con cantidades de referencia de factor de crecimiento similar a insulina, 20 ng/ml de proteína 4 de unión de factor de crecimiento similar a insulina y una concentración de proteína 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilada de
1.0 yg/ml (cuadros chicos); v) adicionado con concentración conocida con cantidades de referencia de factor de crecimiento similar a insulina pegilada, 20 ng/ml de proteína 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina y una concentración de proteína 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilada de 5.0 µg/ml (diagonales); vi) adicionado con concentración conocida, con cantidades de referencia de factor de crecimiento pegilado similar a insulina, 20 ng/ml de proteína 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina y una concentración de proteína 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilada de 10.0 pg/ml (triángulos pequeños); eje de las abscisas: concentración de factor de crecimiento pegilado similar a insulina, en ng/ml; eje de las ordenadas: media de la señal de absorción; condiciones de análisis: anticuerpo anti- (polietilenglicol) de clase IgM, conjugado de anticuerpo anti -digoxigenina-peroxidasa de rábano a 50 mU/ml, todos los tiempos de incubación: 1 hora excepto para la incubación con la proteína 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilada, el cual es de 20 horas, temperatura ambiente, el factor de crecimiento pegilado similar a insulina es una mezcla de proteína pegilada en la parte N-terminal y pegilada en la posición 68. La figura 6 muestra curvas estándar obtenidas con las muestras i) adicionadas con concentración conocida, con
cantidades de referencia de factor de crecimiento similar a insulina pegilada y una concentración de proteína 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilada de 0.1 pg/ml (rombos), ii) adicionadas con concentraciones conocidas, con cantidades de referencia de factor de crecimiento similar a insulina pegilada, 20 ng/ml de proteína 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina y una concentración de proteína 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilada de 0.1 pg/ml (triángulos); iii) adicionado con concentraciones conocidas, con cantidades de referencia de factor de crecimiento pegilado similar a insulina, 20 ng/ml de proteína 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina y una concentración de proteína 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilada de 0.5 pg/ml (cuadros); iv) adicionado con concentraciones conocidas, con cantidades de referencia de factor de crecimiento pegilado similar a insulina, 20 ng/ml de proteína 4 de unión de factor de crecimiento similar a insulina y una concentración de proteína 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilada de 1.0 pg/ml (cuadros chicos); v) adicionado con una concentración conocida de cantidades de referencia de factor de crecimiento similar a insulina pegilada, 20 ng/ml de proteína 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina y una concentración de
proteína 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilada de 5.0 pg/ml (diagonales); vi) adicionado con una concentración conocida, con cantidades de referencia de factor de crecimiento pegilado similar a insulina, 20 ng/ml de proteína 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina y una concentración de proteína 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilada de 10.0 pg/ml (triángulos pequeños); eje de las abscisas: concentración de factor de crecimiento pegilado similar a insulina, en ng/ml; eje de las ordenadas: media de la señal de absorción; condiciones de análisis: anticuerpo anti- (polietilenglicol) de clase IgM, conjugado de anticuerpo anti -digoxigenina-peroxidasa de rábano a 50 mU/ml , todos los tiempos de incubación: 1 hora excepto para la incubación con la proteína 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilada, el cual es de 20 horas, 4°C, el factor de crecimiento pegilado similar a insulina es una mezcla de proteína pegilada en la parte N-terminal y pegilada en la posición 68. La figura 7 muestra una comparación de curvas estándar obtenidas con muestras i) adicionadas con una concentración conocida, con cantidades de referencia de factor de crecimiento pegilado similar a insulina y suero humano 5% (v/v) (triángulos) , ii) adicionadas con una concentración con cantidades conocidas de referencia de
factor de crecimiento pegilado similar a insulina y suero de ratón 5% (v/v) (triángulos); eje de las abscisas: concentración de factor de crecimiento pegilado similar a insulina, en ng/ml; eje de las ordenadas: media de la señal de absorción; condiciones de análisis: anticuerpo anti-(polietilenglicol) de clase IgM, conjugado de anticuerpo anti-digoxigenina-peroxidasa de rábano a 25 mU/ml, todos los tiempos de incubación: 1 hora excepto para la incubación con la proteína 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilada, el cual es de 20 horas, temperatura ambiente, el factor de crecimiento pegilado similar a insulina es una mezcla de proteína pegilada en la parte N-terminal y pegilada en la posición 68. La figura 8 muestra una curva estándar obtenida con muestra de referencia adicionadas con concentraciones conocidas de cantidades de referencia de factor de crecimiento pegilado similar a insulina y plasma humano 5% (v/v) ; eje de las abscisas: concentración de factor de crecimiento pegilado similar a insulina, en ng/ml; eje de las ordenadas: media de señal de absorción. DESCRIPCION DE LAS SECUENCIAS SEC ID NO: 1 secuencia de aminoácidos del factor de crecimiento I similar a insulina humano (aminoácidos 49 a 118 de Swiss-Prot ID P01343) SEC ID NO: 2 secuencia de aminoácidos del factor de
crecimiento II similar a insulina humano (aminoácidos 25 a 91 de Swiss-Prot ID P01344) SEC ID NO: 3 secuencia de aminoácidos de proteína 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina humano (aminoácidos 22 a 258 de Swiss-Prot ID P22692) .
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con un inmunoanálisis para la determinación de factor de crecimiento pegilado similar a insulina o una variante pegilada del mismo mediante la utilización de un anticuerpo de captación y una anticuerpo trazador, en donde el anticuerpo de captación es un anticuerpo anti- (polietilenglicol ) y el anticuerpo trazador es un anticuerpo anti-digoxigenina, en donde el factor de crecimiento pegilado similar a insulina se determina como un complejo que se forma entre el factor de crecimiento pegilado similar a insulina y una proteína de unión a factor de crecimiento similar a insulina, por lo que la etapa de incubación del factor de crecimiento pegilado similar a insulina y la proteína de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilada es durante 12 a 24 horas a temperatura ambiente con una concentración de proteína de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilada de 5.0 µg/ml o menor. Los inmunoanálisis son bien conocidos por los
expertos en la técnica. Los métodos para llevar a cabo dichos análisis así como las aplicaciones prácticas y procedimientos se resumen en los libros de texto relacionados. Los ejemplos de libros de texto relacionados son Tijssen, P., Preparation of enzyme-antibody or other enzyme-macromolecule conjugates (in: "Practice and theory of enzyme immunoassays" (1990), 221-278, Eds. R. H. Burdon and v. P. H. Knippenberg, Elsevier, Amsterdam) y en diversos volúmenes de "Methods in Enzymology" (eds. S. P. Colowick, N. 0. Caplan, Academic Press) , que se relacionan con métodos de detección inmunológica , especialmente los volúmenes 70, 73, 74, 84, 92 y 121. Los anticuerpos contienen como proteínas numerosas porciones reactivas tales como, por ejemplo, grupos amino (lisinas, grupos a-amino) , grupos tiol (cistinas, cisteína y metionina) , grupos de ácido carboxílico (ácido aspártico, ácido glutámico) y grupos azúcar-alcohólicos. Estos se pueden utilizar para acoplamiento a un asociado de unión como una superficie, una proteína, un polímero (tal como, por ejemplo, PEG, celulosa o polistirol) , una enzima o un miembro de un par de unión (véase, por ejemplo, Aslam M. , y Dent . A., Bioconjugation MacMillan Ref. Ltd. (1999) 50-100). Uno de los grupos reactivos de proteínas más comunes es la e-amina alifática del aminoácido lisina. En general, casi todos los anticuerpos contienen lisina
abundante. Las aminas de lisina son nucleófilos razonablemente buenos por encima de pH 8.0 (pKa = 9.18) y por lo tanto reaccionan de manera fácil y limpia con una diversidad de reactivos para formar enlaces estables. Otro grupo reactivo común en anticuerpos es el residuo tiol del aminoácidos que contiene azufre cisteína y su producto de reduccción cisteína (o media cistina) . La cisteína contiene un grupo tiol libre el cual es mucho más nucleófilico que las aminas y generalmente es el grupo funcional más reactivo en un^ proteína. Los tioles generalmente son reactivos a pH neutro y por lo tanto se pueden acoplar a otras moléculas selectivamente en presencia de aminas. Dado que los grupos sulfhidrilo libres son relativamente reactivos, las proteínas con estos grupos con frecuencia existen con estos en su forma oxidada como grupos disulfuro o enlaces disulfuro. Además de cistina y cisteína, algunas proteínas también tienen el aminoácido metionina, el cual es el que contiene azufre en un enlace tioéter. La literatura informa el uso de varios reactivos reticulantes tiolantes tal como el reactivo de Traut's (2 - iminotiolano) , acetato de succinimidil (acetiltio) (SATA, por sus siglas en inglés) o 6- [3- (2-piridilditio) propionamido] hexanoato de sulfosuccinimidilo (Sulfo-LC-SPDP, por sus siglas en inglés) para proporcionar maneras eficientes para introducir grupos sulfhidrilo múltiples vía grupos amino reactivos. Esteres reactivos.
particularmente ásteres de N-hidroxisuccinimida (NHS, por sus siglas en inglés) están entre los reactivos utilizados más comúnmente para la modificación de grupos amina. El pH óptimo para reacción en un ambiente acuoso es pH 8.0 a 9.0. Los isotiocianatos son reactivos de modificación amina para formar enlaces tiourea con proteínas. Reaccionan con aminas proteínicas en solución acuosa (de manera óptima a pH 9.0 a 9.5) . Los aldehidos reaccionan bajo condiciones acuosas dirigidas con aminas alifáticas y aromáticas, hidrozinas e hidrazidas para formar un intermediario imina (base de Schiff) . Una base de Schiff se puede reducir selectivamente con agentes reductores ligeros o fuertes (tales como borohidruro de sodio o cianoborohidruro de sodio) para derivar un enlace alquilamina estable. Otros reactivos que han sido utilizados para modificar aminas son anhídridos ácidos. Por ejemplo, el anhídrido dietilenaminopentaacético (DTPA, por sus siglas en inglés) es un agente quelante bifuncional que contiene dos grupos anhídrido reactivos con amina. Puede reaccionar con grupos N-terminal y e-amina de proteínas para formar enlaces amida. El anillo anhídrido se abre para crear brazos quelantes de metal multivalentes capaces de unirse firmemente a metales en un complejo de coordinación . Otros grupo reactivo común en anticuerpo son los ácidos carboxílicos (ácido aspártico, ácido glutámico) . Las
proteínas contienen grupos de ácido carboxílico en la posición C-terrainal y dentro de las cadenas laterales de ácido aspártico y ácido glutámico. Para conjugación es el grupo de ácido carboxílico el que habitualmente se convierte al éster reactivo mediante el uso de carbodiimida hidrosoluble y que se hace reaccionar con un reactivo nucleófilico tal como una amina, hidrazida o hidrazina. El reactivo que contiene amina será débilmente básico con el fin de reaccionar selectivamente con el ácido carboxílico activado en presencia de otras aminas en la proteína. El reticulado de proteína se puede llevar a cabo cuando el pH se incrementa por encima de 8.0. Se puede utilizar peryodato de sodio para oxidar la parte alcohol de un azúcar dentro de una porción carbohidrato a un aldehido. Cada grupo aldehido se puede hacer reaccionar con una amina, hidrazida o hidrazina como se describe para ácidos carboxílieos . Puesto que la porción carbohidrato se encuentra predominantemente sobre la región del fragmento cristalizable (Fe) de un anticuerpo, la conjugación se puede llevar a cabo mediante modificación dirigida al sitio del carbohidrato alejada del sitio en donde se une a antígeno. Los reactivos que reaccionan con tiol son aquellos que se acoplarán a grupos tiol en las proteínas formando productos acoplados tioéter. Estos reactivos reaccionan con rapidez en un pH ligeramente ácido a neutro y por lo tanto se
pueden hacer reaccionar selectivamente en presencia de grupos amina. Los derivados de haloacetilo, por ejemplo yodoacetamidas , forman enlaces tioéter y son reactivos para modificación de tiol. En anticuerpos, la reacción se lleva a cabo en grupos cisteína que están presentes de manera intrínseca o que resultan de la reducción de disulfuro de cistina en diversas posiciones del anticuerpo. Los reactivos útiles adicionales son maleimidas. La reacción de maleimidas con reactivos que reaccionan con tiol es esencialmente la misma que con yodoacetamidas. Las maleimidas reacciona rápidamente a pH ligeramente ácido a neutro. Las aminas, hidrazidas e hidrazinas son reactivos que reaccionan con aldehido y ácido carboxílico (formación de amida, hidrazona o enlaces alquilamina) . Las aminas, hidrazidas e hidrazinas se pueden acoplar a ácidos carboxílicos de proteínas después de activación del grupo carboxilo mediante una carbodiimida hidrosoluble . El reactivo que contiene amina puede ser débilmente básico de manera que reaccione selectivamente con la proteína activada con carbodiimida en presencia de e-aminas más fuertemente básicas de lisina para formar un enlace amida estable. En la reacción con grupos aldehido, los cuales se puede generar sobre anticuerpos por oxidación de peryodato de los residuos carbohidrato en el anticuerpo, se forma un intermediario de base de Schiff, el cual se puede reducir a una alquilamina a
través de la reducción del intermediario con cianoborohidruro de sodio (ligera y selectiva) o borohidruro de sodio (fuerte) de agentes reductores hidrosolubles . El término "inmunoanálisis", como se utiliza en la presente invención indica un método de determinación inmunológica, es decir, un método in vitro. Con un inmunoanálisis una determinación directa ya sea de la presencia y/o la cantidad de factor de crecimiento pegilado similar a insulina o de una variante pegilada del mismo en una muestra es posible (véase, por ejemplo The Immunoassay Handbook, edited by David Wild, M Stockton Press, 1994) . En general comprende inmunoanálisis uno o más en una modalidad dos diferentes moléculas de unión unen específicamente a la molécula que se va a analizar en la muestra. En una modalidad, el inmunoanálisis de acuerdo con la invención comprende dos anticuerpos diferentes que se unen a epítopos diferentes no superpuestos sobre un factor de crecimiento pegilado similar a insulina. En otra modalidad, el inmunoanálisis de acuerdo con la invención comprende un anticuerpo que se une específicamente a factor de crecimiento pegilado similar a insulina o su variante pegilada y una molécula que se une a un epítopo que no se superpone de la molécula que se va a detectar. Para propósitos de detección, por lo menos una de las moléculas de unión está marcada con una marca detectable, por ejemplo que incluye radioisótopos.
enzimas o colorantes los cuales se pueden detectar por desintegraciones radioactivas, producción de color catalizada enzimáticamente , salida de fluorescencia o inhibición o una salida quimioluminiscente . Los métodos de determinación inmunológica incluyen métodos tales como radioinmunoanálisis (RIA) , análisis inmunosorbente unido a enzima (ELISA) , inmunoanálisis fluorescente (FIA) y análisis quimioluminiscentes (CLA) . El inmunoanálisis de acuerdo con la presente invención en una modalidad son inmunoanálisis heterogéneos. En el análisis es posible separar moléculas no unidas presentes en la muestra que se va a analizar de complejos que comprende el anticuerpo de captación y el analito, el cual se une a una fase sólida. La separación se puede llevar a cabo por centrifugación, filtración, separación magnética o aspiración del fluido de muestra de la fase sólida y en una modalidad seguido por lavado repetido del complejo que se une a fase sólida con un amortiguador. En una modalidad el inmunoanálisis es un inmunoanálisis tipo emparedado (véase, por ejemplo, Immunochemistry of Solid-Phase Immunoassay, John E. Butler, CRC Press, 1991) . En este inmunoanálisis, el factor de crecimiento pegilado similar a insulina se encuentra en una primera etapa unido a un anticuerpo inmovilizado en fase sólida que se une específicamente a un primer epítopo del factor de crecimiento pegilado similar a insulina. Después de formación del
complejo la muestra se separa y el complejo se lava repetidamente con un amortiguador. Posteriormente se agrega al complejo una molécula que se une a un epítopo del factor de crecimiento pegilado similar a insulina que es un epítopo que no se superpone al primer epítopo. Dicha molécula de detección generalmente se conjuga a una marca detectable, ya sea de manera directa (por ejemplo un grupo fluorescente, una radiomarca o un quelato de metal) o de modo indirecto (por ejemplo a un primer asociado de un par de unión) . El factor de crecimiento pegilado similar a insulina está "interpuesto" entre el anticuerpo y la molécula de detección. Se puede llevar a cabo una segunda etapa de lavado para separar molécula de detección no unida. Finalmente, la marca detectable se detecta con un agente de detección adecuado. En una modalidad del inmunoanálisis y método de acuerdo con la invención el anticuerpo se une a la parte de (polietilenglicol) y la molécula de detección se une a una parte de factor de crecimiento similar a insulina del factor de crecimiento pegilado similar a insulina o su variante pegilada. El término "muestra", como se utiliza en esta solicitud indica, pero no se limita a cualquier cantidad de una sustancia de un organismo vivo o un organismo anteriormente vivo. Los organismos vivos incluyen, pero no se limitan a humanos, ratones, monos, ratas, conejos u otros
animales. En una modalidad, la muestra en el inmunoanálisis o método de acuerdo con la invención se obtiene de un ratón, rata, perro, macaco o humano. En otra modalidad, la muestra en el inmunoanálisis o método de acuerdo con la invención es de un macaco o un humano. Las muestras incluyen, pero no se limitan a sangre completa, suero o plasma de un individuo las cuales son las fuentes utilizadas más ampliamente de muestra en rutina clínica. El término "fase sólida" como se utiliza dentro de esta solicitud indica una sustancia no fluida e incluye partículas (que incluye micropartículas y esferas) elaboradas de materiales tales como polímero, metal (partículas paramagnéticas , ferromagnéticas) , vidrio y cerámica; sustancias en gel tal como sílice, alúmina y geles poliméricos ; capilares, los cuales se pueden elaborar de polímero, metal, vidrio y/o cerámico; zeolitas y otras sustancias porosas; electrodos; placas de microtitulación; tiras sólidas y cubetas, tubos u otros recipientes de muestra para espectrómetro. Un componente en fase sólida de un análisis se diferencia de superficies sólidas inertes con las cuales el análisis puede estar en contacto en que esa "fase sólida" contiene por lo menos una porción en su superficie la cual está diseñada para interactuar con la molécula de captación utilizada en el análisis. Una fase sólida puede ser un componente estacionario tal como un tubo, tira, cubeta o
placa de microtitulación pueden ser componentes no estacionarios, tales como esferas y micropartículas . Las micropartículas también se pueden utilizar como una fase sólida para formatos de análisis homogéneos. Se pueden utilizar una diversidad de micropartículas que permiten la unión no covalente o covalente de proteínas y otras sustancias. Las partículas incluyen partículas poliméricas tales como poliestireno y poli (metacrilato de metilo) , partículas de oro tales como nanopartículas de oro y coloides de oro; y partículas cerámicas tales como sílice, vidrio y partículas de óxido de metal, véase, por ejemplo, Martin, C. R., et al., Analytical Chemistry News & Features (1998) 322A-327A. Los soportes sólidos para los inmunoanálisis de acuerdo con la invención se describen ampliamente en el estado de la técnica (véase, por ejemplo, Butler, J. E., Methods 22 (2000) 4-23) . Los cromógenos (grupos fluorescentes o luminiscentes y colorantes), enzimas, grupos activos para RM o partículas metálicas, haptenos, por ejemplo digoxigenina son ejemplos de "marcas detectables" . La marca detectable también puede ser un grupo reticulante fotoactivable , por ejemplo un grupo ácido o una azirina. Un quelato de metal el cual se puede detectar por electroquimioluminiscencia en una modalidad es una marca detectable con preferencia particular por quelatos de rutenio, por ejemplo un quelato de rutenio
(bispiridil ) 32+ ¦ Los grupos marcadores de rutenio adecuados se describen, por ejemplo, en los documentos EP 0 580 979, WO 90/005301, WO 90/11511 y WO 92/14138. Para detección directa del grupo de marcado se pueden seleccionar cualquier grupo detectable conocido tales como colorantes, grupos de marcado luminiscentes (tales como grupos quimioluminiscentes , por ejemplo ésteres de acridinio o dioxetanos) o colorantes fluorescentes (por ejemplo fluoresceina, coumarina, radamina, oxazina, resorrufina, cianina y derivados de los mismos) . Otros ejemplos de grupos de marcado son complejos de metal luminiscentes (tales como complejos de rutenio o europio), enzimas (por ejemplo las que se utilizan para ELISA o para CEDIA (siglas en inglés para inmunoanálisis donador de enzima clonado, por ejemplo EP-A-0 061 888)) y radioisótopos. Los sistemas de detección indirecta comprenden, por ejemplo, que el reactivo de detección se marque con un primer asociado de un par de unión por bioafinidad. Los ejemplos de pares de unión adecuados son hapteno o antígeno/anticuerpo, biotina o análogos de biotina tales como aminobiotina, iminobiotina o destiobiotina/avidina o estreptavidina, azúcar/lectina, ácido nucleico o análogos de ácido nucleico/ácido nucleico complementario y receptor/ligando, por ejemplo receptor de hormona esteroide/hormona esteroide . Los primeros miembros de par de unión preferidos comprenden
hapteno, antígeno y hormona. Se prefieren especialmente los haptenos como digoxina y biotina y análogos de los mismos. El segundo asociado de dicho par de unión son, por ejemplo, un anticuerpo, estreptavidina, etc habitualmente se marca para permitir la detección directa, por ejemplo, mediante las marcas como se menciona en lo anterior. En los métodos de detección inmunitarios de acuerdo con la presente invención se selecciona las condiciones de reactivo las cuales permitirán la unión de los reactivos utilizados, por ejemplo para unión de un anticuerpo a factor de crecimiento pegilado similar a insulina. Una persona experta en la técnica se refiere al resultado de dicho evento de unión mediante la utilización del término "complejo" . El complejo que se forma en un método de análisis de acuerdo con la presente invención se puede utilizar para determinar la presencia o se puede usar para determinar la concentración, es decir, para cuantificar la cantidad. El término "factor de crecimiento similar a insulina", como se utiliza en esta solicitud, indica una proteína de la SEC ID NO : 1 (factor de crecimiento I similar a insulina) o la SEC ID NO: 2 (factor de crecimiento II similar a insulina) o una variante de los mismos. En una modalidad, una variante de un factor de crecimiento similar a insulina es un factor de crecimiento similar a insulina de la SEC ID NO: 1 con la lisina en la posición 27 sustituido con
un aminoácido polar, y ya sea la lisina en la posición 65 o la lisina en la posición 68 sustituida con un aminoácido polar. El término "aminoácido polar" indica arginina, glutamina y asparagina, es decir, la lisina está sustituida con arginina, glutamina o asparagina. En una modalidad, el aminoácido polar es arginina. En otra modalidad, el factor de crecimiento pegilado similar a insulina es un factor de crecimiento similar a insulina monopegilado con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 1, en donde la lisina en la posición 27 y 65 están sustituidas con un mismo ácido polar y un residuo PEG está unido covalentemente en la posición de aminoácido 68. En una modalidad adicional, el factor de crecimiento pegilado similar a insulina es un factor de crecimiento similar a insulina monopegilado con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 1 con la lisina en la posición 27 y 68 sustituidos con un aminoácido polar y un residuo PEG unido covalentemente a la posición de aminoácidos 65. En una modalidad adicional, el factor de crecimiento pegilado similar a insulina es un factor de crecimiento similar a insulina monopegilado con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 1 con la lisina en la posición 27 o con la lisina en la posición 27 y 65 y/o 68 sustituido por un aminoácido polar y un residuo PEG unido covalentemente a la parte amino terminal del factor. El primer aspecto de la presente invención es un
inmunoanálisis para la detección de un factor de crecimiento pegilado similar a insulina que comprende un anticuerpo de captación, un complejo de factor de crecimiento similar a insulina/proteína de unión a factor de crecimiento similar a insulina y un anticuerpo trazador, en donde a) el anticuerpo de captación es un anticuerpo monoclonal anti- (polietilenglicol) , b) el factor de crecimiento pegilado similar a insulina se detecta como un complejo con una proteína de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilada , c) el anticuerpo trazador es un anticuerpo monoclonal anti -digoxigenina . El anticuerpo contra polietilenglicol (PEG) está biotinado y, en una modalidad, unido a una fase sólida, por ejemplo una placa de microtitulación recubierta con estreptavidina . El factor de crecimiento pegilado similar a insulina o su variante pegilada ya sea como estándar de referencia o a partir de las muestras de prueba se une a anticuerpo anti (polietilenglicol ) conjugado en fase sólida en una primera etapa de incubación. El término "factor de crecimiento pegilado similar a insulina", como se utiliza dentro de esta solicitud, indica un "factor de crecimiento similar a insulina" al cual se ha unido covalentemente un residuo (polietilenglicol) . Posteriormente, en una modalidad,
el reactivo de detección digoxigenilado , una proteína de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilada, la cual está presente en exceso, se une en una segunda etapa de incubación al complejo formado previamente. En una muestra derivada de mamífero, el factor de crecimiento similar a insulina generalmente formará complejo con proteína de unión a factor de crecimiento similar a insulina endógena. Para determinar el factor de crecimiento pegilado similar a insulina, la proteína de unión a factor de crecimiento similar a insulina endógena debe ser sustituida por la proteína de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilada del análisis, la cual por lo tanto se agrega en exceso. El anticuerpo anti-digoxigenina conjugado a peroxidasa de rábano y una solución de ABTS se utiliza como sistema de detección. En una modalidad, el anticuerpo de captación es un anticuerpo completo, es decir, comprende una cadena ligera y pesada por lo que la cadena ligera comprende un dominio variable y un dominio constante y por medio del cual la cadena pesada comprende un dominio variable, un dominio CHI , CH2 , CH3 y opcionalmente CH4 así como una región de bisagra. El anticuerpo de captación en una modalidad diferente se puede seleccionar de la cadena ligera, la región variable de la cadena pesada, un fragmento Fab, Fab' , F(ab)2 o F(ab' )2 del anticuerpo anti- (polietilenglicol) , es decir, ya sea la
cadena ligera, la región variable de la cadena pesada, el fragmento Fab o Fab' o F(ab)2 o F(ab' )2 del anticuerpo anti-(polietilenglicol) . Dependiendo de la secuencia de aminoácidos de la región constante de la cadena pesada a las inmunoglobulinas se les asignan clases diferentes: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Algunas de estas clases se dividen adicionalmente en subclases (isotipos) , es decir, IgG se divide en IgGl , IgG2 , IgG3 e IgG4, o IgA se divide en IgAl e IgA2. En una modalidad, el anticuerpo de captación es un anticuerpo multimérico, por ejemplo una IgM. La conjugación de un anticuerpo trazador y/o de captación a su asociado de conjugación se puede llevar a cabo por diferentes métodos tal como adsorción pasiva, unión química o unión vía un par de unión específico. El término "asociado de conjugación", como se utiliza en la presente indica, por ejemplo, una fase sólida, un polipéptido, una marca detectable o un miembro de par de unión específico. En una modalidad, la conjugación del anticuerpo de captación y/o trazador a su asociado de conjugación es independiente entre sí y se realiza por unión química vía un grupo N-terminal y/o e-amino (lisina) , grupos e-amino de lisinas diferentes, grupos funcionales carboxi, sulfhidrilo, hidroxilo y/o fenólico de la estructura principal de aminoácido del anticuerpo y/o grupos de alcohol de azúcar de la estructura
de carbohidrato del anticuerpo. En una modalidad, el anticuerpo de captación y/o trazador se conjugan a su asociado de conjugación por medio de un par de unión específico. En una modalidad, el anticuerpo de captación se conjuga a biotina y la inmovilización a un soporte sólido se realiza por medio de avidina o estreptavidina inmovilizadas en fase sólida. En una modalidad, el anticuerpo trazador se conjuga a peroxidasa de rábano y es un anticuerpo contra digoxigenina . El anticuerpo de captación en otra modalidad está conjugado a la fase sólida por adsorción pasiva. Un anticuerpo conjugado a la fase sólida por adsorción pasiva comprende una mezcla de anticuerpos a la fase sólida vía diferentes sitios de anticuerpo. De esta manera, el anticuerpo de captación conjugado a la fase sólida por adsorción pasiva es una mezcla de dos o más conjugados diferentes en donde los conjugado difieren en el sitio de anticuerpo, es decir, el residuo de aminoácido del anticuerpo con el cual se lleva a cabo la conjugación a la fase sólida. La adsorción pasiva se describe, por ejemplo, por Butler, J. ?·/ "Solid Phases in Immunoassay" , páginas 205-225 en Diamandis, E. P. y Christopoulos , T. K. (editores) : Immunoassay (1996), Academic Press, San Diego. En una modalidad de la invención, el anticuerpo de captación se inmoviliza vía un par de unión específico. Dicho par de unión (primer componente/segundo componente) es, por
ejemplo, estreptavidina o avidina/biotina , anticuerpo/antígeno (véase, por ejemplo, Hermanson, G.T., et al., Bioconjugate Techniques, Academic Press, 1996), lectina/polisacárido, esteroide/proteína de unión de esteroide, hormona/receptor de hormona, enzima/sustrato, IgG/proteína A y/o G y/o L, etc. En una modalidad, el anticuerpo de captación se conjuga a biotina y la inmovilización se lleva a cabo por medio de avidina o estreptavidina inmovilizadas. En otra modalidad, el anticuerpo trazador se conjuga a una marca electroquimioluminiscente como un complejo de bispiridil rutenio . El inmunoanálisis de acuerdo con la invención utiliza la interacción específica de factor de crecimiento similar a insulina con proteína de unión a factor de crecimiento similar a insulina. La proteína de unión a factor de crecimiento similar a insulina se une específicamente a factor de crecimiento similar a insulina y se detecta el complejo formado de factor de crecimiento similar a insulina/proteína de unión a factor de crecimiento similar a insulina. Este complejo no se puede detectar directamente y por lo tanto se requieren asociados de unión adicionales. Por lo tanto, el inmunoanálisis de acuerdo con la invención comprende como elementos de núcleo: a) un anticuerpo de captación que se une
específicamente a factor de crecimiento similar a insulina, b) un anticuerpo trazador que se une específicamente a proteína de unión a factor de crecimiento similar a insulina. De esta manera, el inmunoanálisis de acuerdo con la invención para la detección de un factor de crecimiento pegilado similar a insulina comprende los siguientes compuestos (véase también la figura 1) : una fase sólida, un anticuerpo de captación el cual se une específicamente a polietilenglicol y el cual se conjuga a la fase sólida, una proteína de unión a factor de crecimiento similar a insulina, la cual se conjuga ya sea directamente a una marca detectable o se conjuga a un primer asociado de un par de unión, opcionalmente , si la proteína de unión a factor de crecimiento similar a insulina se conjuga a un primer asociado de un par de unión, una molécula trazadora comprende el segundo asociado del par de unión. El anticuerpo anti- (polietilenglicol) conjugado a la fase sólida se une específicamente al residuo polietilenglicol de los compuestos pegilados. Si una muestra que contiene compuestos pegilados se pone en contacto con el anticuerpo anti- (polietilenglicol) conjugado a una fase
sólida, los compuestos pegilados se unirán por el anticuerpo anti- (polietilenglicol) y de esta manera se conjugarán a la fase sólida vía el anticuerpo anti- (polietilenglicol ) . En una modalidad, el anticuerpo anti- (polietilenglicol) es un anticuerpo monoclonal y puede ser de cualquier clase de inmunoglobulina . En otra modalidad, el anticuerpo anti- (polietilenglicol) es un anticuerpo monoclonal anti- (polietilenglicol ) de la clase IgM. Los anticuerpos anti- (polietilenglicol) ejemplares se reportan en los documentos de E.U.A. 7,320,791 o O 2002/094853. La conjugación del anticuerpo anti- (polietilenglicol) a la fase sólida puede ser covalentemente o por medio de un par de unión específico o mediante interacciones físicas. La fase sólida en una modalidad es un pozo de una placa de microtitulación . La conjugación del anti- (polietilenglicol) de captación a la fase sólida en una modalida es por medio de un par de unión específico, por ejemplo, por medio del par de unión específico estreptavidina/biotina, en donde el anticuerpo anti- (polietilenglicol ) está unido a biotina vía un enlace covalente y la fase sólida se une a estreptavidina vía un enlace covalente . El término "proteína de unión a factor de crecimiento similar a insulina" en la presente invención abarca las proteínas de unión a factor de crecimiento similar
a insulina, proteína 1 de unión a factor de crecimiento similar a insulina, proteína 2 de unión a factor de crecimiento similar a insulina, proteína 3 de unión a factor de crecimiento similar a insulina, proteína 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina, proteína 5 de unión a factor de crecimiento similar a insulina y proteína 6 de unión a factor de crecimiento similar a insulina. Las secuencias de las proteínas 1 a 6 de unión a factor de crecimiento similar a insulina se describen en detalle en la base de datos S issProt (http://www.expasy.ch) y se identifican con los siguientes números de acceso:
Nombre No. de Acceso proteína 1 de unión a factor de P 08833 crecimiento similar a insulina proteína 2 de unión a factor de P 18065 crecimiento similar a insulina proteína 3 de unión a factor de P 17936 crecimiento similar a insulina proteína 4 de unión a factor de P 22692 crecimiento similar a insulina proteína 5 de unión a factor de P 24593 crecimiento similar a insulina proteína 6 de unión a factor de P 24592 crecimiento similar a insulina
La proteína de unión a factor de crecimiento similar a insulina en el inmunoanálisis de acuerdo con la invención, en una modalidad es la proteína 3 de unión a factor de crecimiento similar a insulina o la proteína 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina o la proteína 5 de unión a factor de crecimiento similar a insulina . En muestras derivadas de mamífero, por ejemplo muestras humanas, el factor de crecimiento similar a insulina formará un complejo con una de las proteínas 1 a 6 de unión a factor de crecimiento similar a insulina endógenas mientras que la proteína 3 de factor de crecimiento similar a insulina es la más abundante (Rajaram S., et al., Endocr. Rev. 18 (1997) 801-831). En una modalidad, la proteína de unión a factor de crecimiento similar a insulina en el inmunoanálisis o método de acuerdo con la invención es la proteína 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina de la SEC ID NO: 3. La marca detectable la cual se conjuga a la proteína de unión a factor de crecimiento similar a insulina se conjuga vía un enlace covalente. En una modalidad, la marca detectable se selecciona de enzimas, antígenos, grupos fluorescentes, grupos quimioluminiscentes , complejos de quelato de metal y grupos electroquimioluminiscentes . En otra modalidad, la marca detectable se selecciona de digoxigenina Y complejos de rutenio bispiridilo.
El siguiente aspecto de la presente invención es un método para la determinación de factor de crecimiento pegilado similar a insulina en una muestra que comprende las siguientes etapas: a) proporcionar una muestra que se va a analizar, b) incubar un anticuerpo anti- (polietilenglicol ) conjugado a una fase sólida con la muestra para formar un complejo anticuerpo anti- (polietilenglicol) /factor de crecimiento pegilado similar a insulina, c) incubar el complejo que se forma en el inciso b) con la proteína 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilada para formar un complejo que comprende el complejo que se forma en el inciso b) , d) incubar el complejo que se formó en el inciso c) con anticuerpo anti -digoxigenina conjugado a peroxidasa de rábano para formar un complejo que comprende el complejo formado en el inciso c) , e) determinar el factor de crecimiento pegilado similar a insulina al incubar el complejo que se formó en el inciso d) con ABTS y por formación de un producto coloreado. En la determinación de factor de crecimiento pegilado similar a insulina con el método de acuerdo con la invención se llevan a cabo cuatro etapas. En la primera etapa se incuba un anticuerpo anti- (polietilenglicol) el cual está conjugado a una fase sólida, por ejemplo un medio par de
unión específico estreptavidina/biotina, con una muestra en cuestión sospechosa de contener polipéptidos pegilados, especialmente de contener factor de crecimiento pegilado similar a insulina. En una modalidad, la muestra es suero sanguíneo de ratón, rata, perro, macaco o humano. La primera etapa de incubación, en una modalidad es de 0.5 horas a 5 horas, por ejemplo, de aproximadamente 1 hora. El anticuerpo anti- (polietilenglicol ) se une específicamente a polipéptidos pegilados contenidos en la muestra y de esta manera se conjuga el polipéptido pegilado también a la fase sólida vía el anticuerpo anti- (polietilenglicol) . Después de la primera etapa de incubación la fase sólida opcionalmente se lava con una solución amortiguadora. En una segunda etapa de incubación, el complejo que consiste de la fase sólida conjugada con anticuerpo anti- (polietilenglicol ) y el polipéptido pegilado que se forma en la primera etapa de incubación se incuba con proteína 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilado . Un segundo complejo adicional se forma únicamente si el polipéptido pegilado contenido en el complejo obtenido en la primera etapa de incubación es un factor de crecimiento pegilado similar a insulina. Para la determinación del factor de crecimiento pegilado similar a insulina se agrega un exceso de proteína 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina con el fin de sustituir la
proteína de unión a factor de crecimiento similar a insulina endógena que forma complejo con el factor de crecimiento pegilado similar a insulina de la muestra. El segundo complejo consiste del anticuerpo anti- (polietilenglicol) conjugado en fase sólida, el factor de crecimiento pegilado similar a insulina unido al mismo y la proteína 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilada unida. La segunda etapa de incubación, en una modalidad, es de 12 a 24 horas, en otra modalidad es de 18 a 22 horas. Después de la segunda etapa de incubación, la fase sólida opcionalmente se lava con una solución amortiguada. En la tercera etapa de incubación, el complejo que consiste del anticuerpo anti- (polietilenglicol) conjugado en fase sólida, el factor de crecimiento pegilado similar a insulina y la proteína 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilada se incuban con un anticuerpo anti-digoxigenina, el cual se conjuga a peroxidasa de rábano y se forma un tercer complejo. El tercer complejo consiste del anticuerpo anti- (polietilenglicol) conjugado en fase sólida, el factor de crecimiento pegilado similar a insulina unido al mismo, la proteína 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilada unida al mismo y el anticuerpo anti-digoxigenina unido al mismo, conjugado a peroxidasa de rábano. En una modalidad, la tercera etapa de incubación es de 0.5 horas a 5 horas, por ejemplo, de
aproximadamente 1 hora. Después de la tercera etapa de incubación, la fase sólida opcionalmente se lava con una solución amortiguadora. En la cuarta etapa de incubación, el complejo que consiste del anticuerpo anti- (polietilenglicol) conjugado en fase sólida, el factor de crecimiento pegilado similar a insulina, la proteína 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilada y el anticuerpo anti-digoxigenina conjugado a peroxidasa de rábano se incuban con ácido 2, 2 ' -azino-bis-3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico (ABTS, por sus siglas en inglés) , un sustrato para la enzima peroxidasa de rábano, el cual se convierte por la enzima a un producto coloreado con un máximo de absorbancia 405 nm. La concentración del compuesto coloreado es proporcionar la cantidad de peroxidasa de rábano y por lo tanto la cantidad de factor de crecimiento pegilado similar a insulina en una muestra analizada. Por lo tanto, es posible una determinación cuantitativa si se analizan por lo menos dos muestras de referencia con una concentración conocida de factor de crecimiento pegilado similar a insulina, se puede determinar una función uniforme/curva de calibración y de esta manera se calcula la cantidad de factor del crecimiento similar a insulina pegilado. La cuarta etapa de incubación en una modalidad se detiene, cuando la densidad óptica (DO) de la solución a
405 nm reducida por la densidad óptica de la solución a 490 nm (longitud de onda de referencia, blanco) es de 1.9 a 2.1. En otra modalidad, la cuarta etapa de incubación es de 5 a 15 minutos y en una modalidad adicional es de 8 a 12 minutos. Se ha encontrado que algunos parámetros en el inmunoanálisis necesitan seleccionarse cuidadosamente. Uno de estos parámetros es el tiempo de incubación de la segunda etapa de incubación del complejo que consiste del anticuerpo anti- (polietilenglicol) conjugado en fase sólida y el factor de crecimiento pegilado similar a insulina con la proteína de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilada . Se ha encontrado que un tiempo de incubación más prolongado resulta en un análisis que tiene una susceptibilidad reducida, por ejemplo, por otros componentes del suero humano o por competir con proteínas que se unen a factor de crecimiento similar a insulina (figuras 3 y 4) . Por lo tanto, en una modalidad, es el tiempo de incubación en la segunda etapa de incubación del análisis de acuerdo con la invención, de 12 a 24 horas. Un parámetro adicional es la temperatura de incubación en la segunda etapa de incubación. Se ha encontrado que es benéfica una temperatura de incubación en la segunda etapa de incubación de 20 a 25 °C, es decir, temperatura ambiente (figura 5) cuando se compara con una temperatura baja, por ejemplo de 4°C (figura 6) . Un
parámetro adicional que debe de considerarse es la concentración de la proteína de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilada utilizada. Se ha encontrado que la concentración debe ser de 5.0 yg/ml o menor. En una modalidad, la concentración de la proteína de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilada es de 0.1 g/ml a 5.0 pg/ml , en una modalidad adicional es de 0.1 g/ml a 1.0 yg/ml . Debe resaltarse que si la muestra proporcionada no contiene factor de crecimiento pegilado similar a insulina no se forma complejo en la segunda etapa de incubación y por lo tanto no se forma producto coloreado en la cuarta etapa de incubación . El tercer aspecto de la presente invención es un método para la determinación cuantitativa de la cantidad de factor de crecimiento pegilado similar a insulina en una muestra, que comprende las siguientes etapas: a) proporcionar una muestra que se va a analizar, b) proporcionar muestras de referencia que contienen cantidades conocidas de factor de crecimiento pegilado similar a insulina, c) incubar por separado un anticuerpo anti- (polietilenglicol ) conjugado a una fase sólida con cada uno de la muestra y por lo menos dos muestras de referencia que contienen cantidades diferentes de factor de crecimiento
pegilado similar a insulina para formar un complejo de anticuerpo anti- (polietilenglicol) /factor de crecimiento pegilado similar a insuliod^....--. d) incubar el complejo que se formó en el inciso c) en cada una de la muestra y la muestra de referencia con la proteína 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilada para formar un segundo complejo que comprende el complejo formado en el inciso c) , por lo que la incubación con la proteína 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilada es de 12 a 20 horas, e) incubar el complejo formado en el inciso d) en cada una de la muestra y las muestras de referencia con un anticuerpo anti - digoxigenina conjugado con peroxidasa de rábano para formar un tercer complejo que comprende el complejo que se forma en el inciso d) , f) incubar el complejo que se forma en el inciso e) en cada una de la muestra y las muestras de referencia con ABTS durante 5 a 15 minutos y determina la cantidad del producto coloreado que se forme, g) determinar cuantitativamente la cantidad de factor de crecimiento pegilado similar a insulina en la muestra en base en una curva de calibración o una función de uniformidad calculada en base en la cantidad de producto coloreado que se forma en las muestras de
referencia . El cuarto aspecto de la presente invención es el uso de un método de acuerdo con la invención para el seguimiento de un paciente en quien se ha administrado factor de crecimiento pegilado similar a insulina. Otro aspecto de la presente invención es un kit para la determinación del factor de crecimiento pegilado similar a insulina en una muestra, que comprende: a) una placa de microtitulación recubierta con estreptavidina , b) un anticuerpo anti- (polietilenglicol) conjugado a biotina, c) un anticuerpo anti-digoxigenina conjugado a peroxidasa de rábano, d) proteína 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilada, e) ABTS. En una modalidad, los anticuerpos b) y c) son anticuerpos monoclonales. En otra modalidad, el anticuerpo anti - (poliet ilenglicol ) es un anticuerpo de la clase IgM y el anticuerpo anti-digoxigenina es un anticuerpo de la clase IgG. Los siguientes ejemplos, listados de secuencias y figuras se proporcionan para ayudar a la comprensión de la presente invención, el verdadero alcance de la cual se
establece en las reivindicaciones anexas. Se entiende que pueden realizarse modificaciones en los procedimientos que se establecen sin apartarse del espíritu de la invención. EJEMPLO 1; PREPARACION DE ANTICUERPO ANTI- (POLIETILENGLICOL) CONJUGADO A UNA PLACA DE MICROTITULACION Una solución de anticuerpo anti- (pol iet ilengl icol ) biotinado con una concentración final de anticuerpo de 2 g/ml se agrega a los pozos de una placa de microtitulación recubierta con estreptavidina de 96 pozos (MicroCoat) con 100 µ? a cada pozo. Posteriormente la solución se incuba a temperatura ambiente a 500 rpm durante 1 hora. Después la solución se desecha y los pozos se lavan tres veces, cada vez con 300 µ? de amortiguador de lavado (PBS lx (solución salina amortiguada con fosfato) suplementada con n-octilglucósido 0.05% (p/v) ) . EJEMPLO 2 PREPARACION DE MUESTRAS a) Muestra estándar Se prepara una solución concentrada de factor de crecimiento I similar a insulina pegilado (para preparación del factor de crecimiento I similar a insulina pegilado véase, por ejemplo O 2006/066891) con una concentración de 2 ng/ml en amortiguador PBS (solución
salina amortiguada con fosfato) suplementada con 0.5% (p/v) de albúmina de plasma bovino 1. La solución concentrada se diluye a las siguientes concentraciones:
2 00 ng/ml 1 00 ng/ml 0 50 ng/ml 0 25 ng/ml 0 13 ng/ml 0 06 ng/ml 0 03 ng/ml 0 00 ng/ml
b) Muestra de referencia con suero o plasma Se prepara una solución concentrada de factor de crecimiento I similar a insulina pegilado (para preparación del factor de crecimiento I similar a insulina pegilado véase, por ejemplo WO 2006/066891) con una concentración de 2 ng/ml en un suero de ratón blanco acumulado 5% o suero humano blanco acumulado 5% o plasma humano blanco acumulado 5% en suplemento de amortiguador PBS (solución salina amortiguada con fosfato) con albúmina de plasma bovino 1 0.5% (p/v) . La solución concentrada se diluye hasta las siguientes concentraciones :
2 00 ng/ml 1 00 ng/ml 0 50 ng/ml 0 25 ng/ml 0 13 ng/ml 0 06 ng/ml 0 03 ng/ml 0 00 ng/ml
c) Muestra de prueba La muestra de suero de prueba desconocida se diluye 1:20 con suero de ratón blanco acumulado 5% en solución salina amortiguada con fosfato suplementada con albúmina plasmática bovina 1 0.5% (p/v) . EJEMPLO 3 : INMUNOANALISIS A los pozos de una placa de microt itulación que se obtiene de acuerdo con el ejemplo 1 se agregan 100 µ? de cada una de la muestra de referencia y de prueba, por duplicado. Los pozos se incuban durante una hora con agitación a 500 rpm . Posteriormente, la solución de desecha y cada pozo se lava tres veces cada uno con 300 µ? de solución salina amortiguada con fosfato suplementada con n- oct i lglucós ido 0.05% (p/v) .
Posteriormente se agregan 100 µ? de una solución de proteína 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilada a 100 ng/ml a cada pozo y se incuba durante 12-24 horas, preferiblemente 20 horas, con agitación a 500 rpm . Posteriormente, la solución de desecha y cada pozo se lava tres veces cada vez con 300 µ? de solución salina amortiguada con fosfato suplementada con n-octilglucósido 0.05% (p/v) . Posteriormente se agregan a cada pozo 100 µ? de una solución de anticuerpo ant i -digoxigenina conjugado con peroxidasa de rábano, con una concentración final de 50 mU/ml y se incuba durante una hora con agitación a 500 rpm. Posteriormente, la solución en los pozos se desecha y cada pozo se lava tres veces, cada vez con 300 µ? de solución salina amortiguada con fosfato suplementada con n-octilglucósido 0.05% (p/v) . Posteriormente se agregan a cada pozo 100 µ? de una solución ABTS . La reacción se detiene cuando la solución estándar más alta de 2 ng/ml a alcanzado un valor DO de 1.9-2.0. Esto normalmente requiere entre 5 y 15 minutos . La DO de las muestras estándar y de prueba se mide a 405 nm y 490 nm . Una curva estándar de los estándares de referencia se obtiene utilizando el programa de ajuste de 4 parámetros. Con la curva estándar se calcula la cantidad de factor de crecimiento I similar a insulina pegilado
en las muestras de prueba. Se han calculado el límite inferior de detección y el límite inferior de cuant if icación, los cuales son de 20 pg/ml y 31 pg/ml, respectivamente. Todas las etapas se llevan a cabo a temperatura ambiente. TABLA 1: RESULTADOS TIPICOS DEL CONTROL POSITIVO
Muestra Muestra Muestra Concentración Media Desviación CV No. 1 No. 2 No. 3 de muestra estándar [%]
2.0350 2. 0550 2. 0020 2. 00 ng/ml 2 0307 0 0268 1.3%
1.6600 1. 6640 1. 7330 1. 00 ng/ml 1 6857 0 0410 2.4%
1.2090 1. 2520 1. 2240 0. 50 ng/ml 1 2283 0 0218 1.8%
0.7570 0. 7340 0. 7660 0. 25 ng/ml 0 7523 0 0165 2.2%
0.4390 0. 4280 0. 4360 0. 13 ng/ml 0 4343 0 0057 1.3%
0.2500 0. 2520 0. 2430 0. 06 ng/ml 0 2483 0 0047 1.9%
0.1410 0. 1590 0. 1490 0. 03 ng/ml 0 1497 0 0090 6.0%
0.0590 0. 0620 0. 0660 0. 00 ng/ml 0 .0623 0 0035 5.6%
EJEMPLO 4 BIOTINACION DE ANTICUERPO ANTI - (POLIETILENGLICOL) Un anticuerpo contra polietilenglicol se dializa contra amortiguador (amortiguador de fosfato de potasio 100 mM, pH 8.5). Posteriormente la solución se ajusta a una concentración de proteína de 10 mg/ml. Se disuelve éster de N-hidroxisuccinimida de ácido D-biotinoilaminocaproico en
DMSO y se agrega a la solución de anticuerpo en una relación molar de 1:5. Después de 60 minutos, la reacción se detiene al agregar L-lisina. El excedente de reactivo de marcado se retira por diálisis contra amortiguador de fosfato de potasio 25 mM suplementado con NaCl 150 mM, pH 7.5. EJEMPLO 5 DIGOXIGENILACION DE PROTEINA DE UNION A FACTOR DE CRECIMIENTO
SIMILAR A INSULINA La proteína de unión a factor de crecimiento similar a insulina se dializa contra amortiguador de digoxigenilación (amortiguador de fosfato de potasio 100 mM, pH 8.5). Posteriormente, la solución se ajusta a una concentración de proteína de 10 mg/ml . Se disuelve éster de N-hidroxisuccinimida de ácido 3 -O-metilcarbonil- e -aminocaproico en DMSO y se agrega a la solución de anticuerpo en una relación molar de 1:5. Después de 60 minutos la reacción se detiene al agregar L-lisina. El excedente de reactivo de marcado se elimina por diálisis contra amortiguador de fosfato de potasio 25 mM suplementado con NaCl 150 mM, pH 7.5. Se hace contar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.
Claims (20)
1. Un inmunoanálisis para la detección de factor de crecimiento pegilado similar a insulina, que comprende un anticuerpo de captación y un anticuerpo trazador, caracterizado porque: a) el anticuerpo de captación es un anticuerpo monoclonal anti- (polietilenglicol) , b) el factor de crecimiento pegilado similar a insulina se detecta como un complejo, con una proteína de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilada, c) el anticuerpo trazador es un anticuerpo monoclonal anti-digoxigenina, por lo que la incubación del factor de crecimiento pegilado similar a insulina y la proteína de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilada es durante 2 a 24 horas a temperatura ambiente con una concentración de la proteína de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilada de 5.0 «g/ml o menos.
2. El inmunoanálisis de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque: a) el anticuerpo anti- (polietilenglicol ) se conjuga a una fase sólida, y b) el anticuerpo anti-digoxigenina se conjuga a una marca detectable.
3. El inmunoanálisis de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la conjugación es una conjugación vía un enlace covalente.
4. El inmunoanálisis de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3, caracterizado porque la marca detectable se selecciona de enzimas, antígenos, grupos fluorescentes, grupos quimioluminiscentes , grupos electroluminiscentes y complejos de metal-quelato .
5. El inmunoanálisis de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el factor de crecimiento pegilado similar a insulina es un factor de crecimiento I similar a insulina pegilado o una variante pegilada del mismo.
6. El inmunoanálisis de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la proteína que se une a factor de crecimiento similar a insulina es proteína 4 que se une a factor de crecimiento similar a insulina.
7. El inmunoanálisis de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la incubación del factor de crecimiento pegilado similar a insulina y la proteína de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilada es durante 18 a 22 horas.
8. El inmunoanálisis de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la etapa de incubación del factor de crecimiento pegilado similar a insulina y la proteína de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilada es con una concentración de la proteína de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilada desde 0.1 hasta g/ml 5.0 pg/ml .
9. Un método para la determinación de factor de crecimiento pegilado similar a insulina en una muestra, caracterizado porque comprende las siguientes etapas: a) proporcionar una muestra que se va a analizar, b) incubar un anticuerpo anti- (polietilenglicol) conjugado a una fase sólida con la muestra para formar un complejo de anticuerpo anti- (polietilenglicol) /factor de crecimiento pegilado similar a insulina, c) incubar el complejo que se forma en el inciso b) con la proteína 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilada para formar un complejo que comprende el complejo que se forma en el inciso b) a temperatura ambiente durante 12 a 24 horas con una concentración de proteína 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilada de 5.0 g/ml o menor, d) incubar el complejo que se forma en el inciso c) con un anticuerpo anti-digoxigenina conjugado con peroxidasa de rábano para formar un tercer complejo que comprende el complejo formado en el inciso c) , e) determinar el factor de crecimiento pegilado similar a insulina al incubar el complejo formado en el inciso d) con ABTS y por la formación . de un producto coloreado.
10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque después de las etapas b) , c) , y/o d) , se lleva a cabo una etapa de lavado.
11. El método de conformidad con la reivindicación 9 ó 10, caracterizado porque el factor de crecimiento pegilado similar a insulina es factor de crecimiento I similar a insulina pegilado o una variante pegilada del mismo.
12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, caracterizado porque la incubación del factor de crecimiento pegilado similar a insulina y la proteína 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilada es durante 18 a 22 horas.
13. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, caracterizado porque la incubación del factor de crecimiento pegilado similar a insulina y la proteina 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina es con una concentración de la proteína 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilada desde 0.1 g/ml hasta 5.0 yg/ml .
14. El uso de un método de conformidad con la reivindicación 9 para el seguimiento de un paciente al que se le administra factor de crecimiento I similar a insulina pegilado o una variante pegilada del mismo.
15. Un kit para la determinación de factor de crecimiento pegilado similar a insulina en una muestra, caracterizado porque comprende: a) una placa de microtitulación recubierta con estreptavidina , b) un anticuerpo anti- (polietilenglicol) conjugado a biotina, c) un anticuerpo anti -digoxigenina conjugado a peroxidasa de rábano, d) proteína de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilada.
16. El kit de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque los anticuerpos en b) y c) son monoclonales .
17. El kit de conformidad con la reivindicación 15 ó 16, caracterizado porque el anticuerpo anti- (polietilenglicol) es de la clase IgM.
18. El kit de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, caracterizado porque la proteína de unión a factor de crecimiento similar a insulina es proteína 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina.
19. Un método para la determinación cuantitativa de la cantidad de factor de crecimiento pegilado similar a insulina en una muestra, caracterizado porque comprende las siguientes etapas: a) proporcionar una muestra que se va a analizar, b) proporcionar una muestra de referencia que contiene una cantidad definida de factor de crecimiento pegilado similar a insulina, c) incubar un anticuerpo anti- (polietilenglicol) conjugado a una fase sólida cada uno con una muestra y por lo menos dos muestras de referencia, que contienen cantidades diferentes de factor de crecimiento pegilado similar a insulina para formar un complejo de anticuerpo anti- (polietilenglicol ) /factor de crecimiento pegilado similar a insulina, d) incubar el complejo formado en el inciso c) en cada una de la muestra y las muestras de referencia con proteína 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilada para formar un segundo complejo que comprende el complejo que se forma en el inciso c) , por lo que la incubación con la proteína 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilada es durante 12 a 24 horas a temperatura ambiente con una concentración de la proteína 4 de unión a factor de crecimiento similar a insulina digoxigenilada de 5.0 pg/ml o menor, e) incubar el complejo que se forma en el inciso d) en cada uno de la muestra y las muestras de referencia con anticuerpo anti -digoxigenina conjugado con peroxidasa de rábano para formar un tercer complejo que comprende el complejo formado en el inciso d) , f) incubar el complejo que se forma en el inciso e) en cada uno de la muestra y las muestras de referencia con ABTS durante 5 a 15 minutos y determinar la cantidad de producto coloreado que se forme, g) determinar cuantitativamente la cantidad de factor de crecimiento pegilado similar a insulina en la muestra con base en una curva de calibración calculada en base en la cantidad de producto coloreado formado en las muestras de referencia.
20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque en la etapa d) la incubación es durante 18 a 22 horas.
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