JPH01500483A

JPH01500483A - Ｇ‐ｃｓｆ及びそのミューテインの発現

Info

Publication number: JPH01500483A
Application number: JP62504837A
Authority: JP
Inventors: デブリン，ジェイムズ　ジェイ．; デブリン，パトリシア　イー．; カワサキ，アーニスト　エス．; ウォーレン，メリー　キム
Original assignee: シタス　コーポレイション
Priority date: 1986-08-11
Filing date: 1987-08-11
Publication date: 1989-02-23
Also published as: AU7675487A; WO1988001297A1; EP0256843A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】Ｇ　−ＣＳＦ及びそのミューティンの発現この発明は組換ＤＮＡの分野に関する。特に、この発明は顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）をコードする核酸の単ぞ及び種々の宿主細菌中でのその発現に関する。この発明は、Ｅ、コリ（Ｅ、　ｃｏｊｉ−）中て作用可箭なプロモーターの制御のもとに効果的に発現される、Ｇ　−ＣＳＦ及びそのミューティンをコードする変更されたＤ　Ｎ　Ａ配列、Ｅ、コリでの及びＥ、コリと遺伝子材料を交換することが知られているグラム陰性宿主でのＧ　−ＣＳＦの効率的発現のための変更されたＤＮＡ配列を用いる発現ベクター、該発現ベクターにより形質転換された微生物を包含する宿主生物、並びにそれにより生産されるＧ−ＣＳＦに関する。

骨髄前駆体からの顆粒球及びマクロファージの増殖及び分化における関心が、これらの過程を制御するコロニー刺激因子（Ｃ３Ｆ）の研究を鼓舞している。この課題は最近り、　Ｎｅｔｃａｌｆ、ＢＩＯ（坦、肛：　２５７（１９８６）により総説されている。顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）と称されるこれらの因子の１つは骨髄Ｒ，Ｊ胞からの顆粒球を主とするコロニーの生体外増殖を刺激する。ＣＳＦを生産するセルラインの入手可能性はＣ−ＣＳＦの特徴付けにおいて助けとなっているが、しかしながらこの研究の適切な説明にはこれらの細胞により放出されるＣ　Ｓ　Ｆの正確な同定が必要である。ヒトＪＪａ癌に由来するこのようなセルラインの１つＭｌ＾ＰａＣａ　−２はマクロファージ特異的Ｃ５Ｆ−１及び７日間の骨髄細胞培養物での一次顆粒球コロニーの形成を誘導することができるＣ３Ｆの両者を生産すると言われている。−Ｕ。

Ｍ、　Ｃ，、ム」１国、　Ｉｎμ：ｓｔ、、　、６７　：　１５８８（１９８１）。最近、Ｃ５Ｉ−１ｃＤＮ＾クローンがこのセルラインから単離された。Ｋａｗａｓａｋｉ等、む−←Ｍ嘔、翻仝・２９１　（１９８５）。彼らはまた、アフリカッメガエル（ｋ剪肌≦ｌａｅリジ）の卵母細胞での蔗糖密度分画ｍ　ＲＮ　Ａの翻訳により、１８ｓマーカーより遅く沈降する転写物がネズミ骨髄細胞の増殖を誘導するＣ３Ｆをコー　ドしているが、しかし該Ｃ３Ｆｉクローンは１８ｓマーカーより速く沈降する画分中のｍＲＮＡに最も強くハイブリダイズすることを示した。

ヒ）−Ｇ−ＣＳＦは、骨髄前駆細胞からの顆粒球及び単球の分化を惹起する。これはまた、ある白血病細胞の一層成熟した細胞タイプへの分化を誘導する。従って、ヒトｃ　−ＣＳＦは免疫的に傷つけられた患者及び貧血性疾患又は感染を有する患者における重要な細滴集団の再生のために有用なようである。Ｇ−Ｃ８Ｆはまた、白血病細胞の非分裂状態への分化を惹起し、これによってこれらの細胞タイプの制御されない増殖を阻止することにより、白血病の抑制のために有用であろう。骨髄性白血病細胞は（ニーＣＳＦのための受容体を有することが知られている。例えば、５ｃｉｅｎｃｅ、　３ｊ３　：　’７（１９８６）。

５ｏｕｚａ等は、にＭ−ＣＳＦと有意な相同性を有しないＣ−Ｃ５Ｆをコードする遺伝子を単離し、クローン化し、そしてλファージＰ、プロモーター及び開始コドンを含有する合成りＮＡｌ！７ｉ片並びにこれに続く成熟形の変化していない（ニーＣＳＦをコードずる配列を有する、修飾された温度怒受性のランアウェイ（ｒｕｎａｗａｙ）プラスミドを用いてＥ、コリの未同定の株において発現せしめた。しかしながら、発現レベルのデーターは記載されていない、　５ｏｕｚａ等、５ｃｉｅｎｃｅ、２３ス：　６ｌ−６５（１９８６）。

さらに、Ｎａ６ａｔａ等のヨーロッパ特許出願嵐０１６９，５６６に開示されているように、５ｏｕｚａ等のそれと同一のＮ−末端の２０個のアミノ酸を有するコロニー刺激因子が培養されたしトロ癌から単離された。ＣＨＵ−２と称されるこのクローンは、後に記載するように、ＭＩＡ　ＰａＣａ−２からクローン化されたＤＮＡ配列によりコードされた蛋白質のｃｙｓ３６残基のすぐ前にＶａｌ− Ｓｅｒ−Ｇｌｕをコードする追加の配列を有する。上記の開示のいずれにも、組換宿主、特にＥ、コリにおける発現レベルについての情報はなんら記載されていない。その７ｉＮａＢａｔａ等は、前記の追加のトリペプチド配列をコードする配列を欠くｃＤＮＡ配列を報告した。Ｎａ６ａｔａ等、叶遅し歩琲刈１し］。

５７５−５８１　（１９８６）。

これらの組換生産された（ニーＣＳＦはいずれも組換細菌宿主Ｅ　コリでの発現の結果としてＮｉ２−末端メチオニンを有すると言われている。蛋白質が非経口的に哺乳類宿主に投与される場合、この様なＮｉ２−末端メチオニンは免疫原作であることが一般に知られている。

組換宿主中で蛋白質の最大発現を得るために多くの因子が関与する。これらの因子として、宿主が増殖する培地の変化による宿主細胞の増殖のための生理的条件の最適化が挙げられる。使用されるべき発現ベクター中で作用可能な強力なプロモーター及びリボゾーム結合部位（ＲＢＳ）の選択及び使用も重要である。トリプトファンオペロンのごとき制御されるプロモーターの領域にアテヌエーター領域が存在する場合、それを除去することも望ましい。

組換宿主中で蛋白質の発現を最大にするための一層微妙な因子はコドンの利用に関する。要約すれば、コドンの利用は、特定のアミノ酸をコードする幾つかのコドンを同じアミノ酸をコードする他の異るコドンよりも速く且つ正確に翻訳する特定の組換宿主生物の能力として記載される１、すなわち、特定のアミノ酸を特定するトリヌクレオチドコードは縮重的（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）であるが、すなわち］１個の特定のアミノ酸を１個より多くのトリヌクレオチド配列がコードすることができるが、特定のアミノ酸をコードするすべてのコドンが宿主により同一の効率で使用されるわけではない。組換宿主中の遺伝子のヌクレオチド配列を該宿主により好まれるコドンに変えることにより、該配列によりコードされる蛋白質のアミノ酸配列を変えることなく、増強された発現を得ることができる。

さらに、Ｎｉ２−末端のアミノ酸配列の変化が、前記のＮｉ２−末端メチオニンのプロセシングを行うことができる。

組換宿主中の発現ベクターでの遺伝子発現の増強における他の微妙な点は、発現されるべきｍＲＮＡ配列における二次構造の形成に関する。例えば、遺伝子の３ ′末端の近位に存在するある種の′″ステムアンド・ループ°゛二次構造がｍ　ＲＮ　Ａ転写物の増加した安定性及びそれによってコードされた蛋白１月−品壓し得９ｊ、、（ＵＳΔ）、賂：　１０．３２−３３（１９８６））。しかしながら、ｍＲＮＡ転写物の５′末端における安定な二次構造の形成がその効率的な翻訳をブロックし、その遺伝子によりコードされた蛋白質の収量を減少せしめることが示唆されている。翻訳に対するｒ　ＲＮ　Ａ二次構造の影響はｌ５ｅｒｅｎｔａｎｔ　＆Ｆｉｅｒｓ、　（：ｅｎｅ、　９−：　１−１２（１９８０）及びＢｕｅ　ｌ　１等、―ｅ　ｉ−ｃ　Ａ　ｃ　ｉ　ｄＲｅｓｅａｒｃ−ｈ、　！３　：　１９２３−１９３８（１９８５）に記載されている。ＤｅＬａ＋ｎａｒｔｅｒ、　Ｊ、　Ｆ、等邸近−ｂトμ吐、　（」Ａ：　２５７５−２５８１（１９８５）の報告によれば、成熟（：Ｎ　−ＣＳＦをコードするＤＮＡの５′のコドンの最初の１０個において第三位のデオキシリボシトシンをデオキシリボアデニンに変えることにより、Ｇ：Ｍ−ＣＳＦの収量がＥ、コリにおいて増加し、蛋白質合成の増加がｍ　ＲＮ　Ａ転写物の変化した５′末端に帰せられる。

大量のＧ　−ＣＳＦを得ることが、このコロニー刺激因子の顆粒球刺激特性及び顆粒球−マクロフ７・−ジ刺激特性を利用する療法を開発するために望ましいであろう。さらに、組換宿主、そして特にＥ、コリ中で発現された場合にＮｉ２− 末端メチオニンを欠く形のＧ　−ＣＳＦを得ることが望ましいであろう。

本発明は、Ｇ−ＣＳＦを多数の宿主中で高レベルで生産することにより、大量のＧ　−ＣＳＦを得ることを可能にする。

本発明は、高い骨髄増殖活性を有するＨＩＡ　ＰａＣａ−２細胞からすでに単離されたｍＲ，ＮＡ画分がＧ−ＣＳＦをコードすることを開示する。本発明は（：　ＣＳＦ　ｍＲＮΔを包含する。さらに、本発明はＧ−ＣＳＦ３ｆｆ伝子をコードするこの＋ｎＲＮＡ画分がら作られるｃＤＮＡ配列を包含する。

この発明はまた、成熟Ｇ−ＣＳＦをコードするＤＮＡ配列を包含し、これらのＤＮＡ配列は組換宿主におけるＧ−ＣＳＦの発現を促進するように変更されている。さらに、成熟（ニー　ＣＳＦ、又は組換宿主中で発現された場合にＮｉ２−末端メチオニンを欠くミューティンをコードするＤＮＡ配列が開示される。

現在、研究音速は、成熟Ｇ−ＣＳＦの変更された核酸配列を用いる場合にＰＬプロモーター遺伝子Ｎ−ＲＢＳ制御又は１〜リプトフアン（Ｔ　ｒｐ）プロモーター制御の下でＥ、コリ宿主中で成熟（ニー　ＣＳＦの有意な発現を得ることについて大きな困難に遭遇している。本発明者等は、Ｅ、コリにおけるＰ、遺伝子Ｎ −ＲＢＳ制御のちとにある場き、（ニー　Ｃ３Ｆをコードするｍ　ＲＮ　Ａの定常状態レベルはこの明細書で詳細に記載するようにＮｏｒｔｈｅｒｎ分析により検出可能であることを決定した。Ｔｒｐプロモーターの制御のもとでは、同じ方法によりＥ、コリにおいて定常状態のＧ−ＣＳＦは見出されない。

Ｇｔ４−ＣＳＦ　ｍ伝子の５′末端の変更がＧＨ−ＣＳＦ　ｍＲＮＡ配列の二次構造及びその翻訳に悪影響を与えることを示唆するＤｅｌｅ−ｍａｒＬｅｒ等の研究に照らして驚くべきことに、本発明者等が見出したところによれば、Ｃ−Ｃ３Ｆ遺伝子の５′領域の変更が、Ｅ、コリ中のＰ、遺伝子Ｎ−ＲＢＳで制御された発現ベクター及びＴ’ｒｐて制御された発現ベクターにおけるに−ＣＳＦ蛋白質の増加した発現を導くのみならず、Ｅ、コリ中のＴｒｐにより制御された発現ベクターにおいてｍＲ，ＮＡの定常状態の転写物のレベルの上昇を導く。

第１図Ａは、分画されたＭＩＡＰａＣａ　−２＋ｎＲＮ＾から調製されたアフリカッメガエルの卵母細胞上清について得られた骨髄増殖活性のプロットである。

第１図Ｂは、Ｃ５Ｆ−１−特異的プローブを用いるＨＩＡＰａＣａ　−２ＮＲＮへのド・ントブロ・ントである。

第２図は、ＭＩＡ　ＰａＣａ−２細胞（レーン１）、ＬＤ−１細胞（レーン２）及び５６３７細胞（レーン３）から得られたＦ？、　Ｎ　Ａの、２つの異る２４ −１ｉｔｅｒプローブによりプローブされたナサンブロッ１へである。２Ａにおいてはプローブは５′−＾ＴＧＣＣＴＧＧＡＣＣＴＧＣＣ八ＣＣＣＡＣＡＧＣ− ３′でへり、これは３種類すべてのレーンのＤＮＡにハイブリダイズした。２Ｂにおいてオリゴマープローブは５′−ΔＣ＾＾ＧＣＴＧ虹いｙあ穎ＴＧＴ（：ＣＣ＾−３′であった。アンダーラインを付した９個のヌクレオチドはＧ　−ＣＳＦであることを意味するＣＨＵ−２配列中にのみ存在する（１’ｌａｇａｔａ等、前掲）。このプローブは、ストリンジェント条件下で試験されたセルラインのいずれともハイブリダイズしなかった。

第３図Ａは、プールされた１八ＰａＣａ−２ＲＮＡ画分の注射のｆ＆４０時間のアフリカッメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　Ｉａｅｖｉｓ）の卵母細胞から集められた上清の骨髄増殖活性のプロブ１〜である。下記の例に記載したネズミ骨髄細胞増殖アッセイにより活性を測定した。

第３図Ｂは、Ｇ　−ＣＳＦ特異的なγ３２ｐ−ラベル化オリゴデオキシリボヌクレオチドプローブを使用しての、プールされた旧＾ＰａＣａ−２＋ｎＲＮΔ画分のナサンプロットである。

第４図は、プラスミドｐＰ］、２のＢａｎ）Ｉ　ｌ消化物の配列決定から得られたＧ　−ＣＳＦの完全配列、及びそれによってコードされている推定アミノ酸配列を示す。矢印は、Ｎａεａｔａ等のクローンの９個のヌクレオチドの配列ＧＴＧＡＴＧＧＡＧの位置を示す。

第５図は、プラスミドｐＰＤ１の調製並びにＧ　−ＣＳＦ配列中の第６図は、プラスミドｐＰＤ２の調製の模式的表示てあり、このプラスミドにおいてはＧ　− ＣＳＦ遺伝子の３′非翻訳領域が切除され、そして転写の停止及びｍＲＮＡの安定性がポジティブ・レトロレギュラトリー・エレメント（ｐｏｖｉｔｉｖｃ　ｒｅｔｒｏ−ｒｅＨｕｌａｔｏｒｙ　ｅ！ｅｍｅｎｔ）の制御のもとに置かれている。

第７図は、プラスミドｐＪＤ１の調製の模式的表示であり、このプラスミドにおいてはＧ　−ＣＳＦの発現がＰＬプロモーター及び遺伝子Ｎ−リボゾーム結合部位の制御のもとにある。

第８図は、ｐＪＤ４　、　ＩＪＤ４＾及びｐ　Ｊ　Ｄ　４　Ｂの調製の模式的表示である。

第９図は、ｐＰＤ５の調製の模式的表示である。

第１０図は、Ｇ−Ｃ５Ｆ特異的オリゴヌクｌ／オチドブローブによりプローブされた、ｐＪＤｌ及びｌ）Ｐ　Ｄ　２からのナサンプロットである。

第１１図は、もとの（、−ＣＳＦ　、　ｐＪＤ４Ｂ　、　１）ＰＯ２、及びｐ、Ｊ　Ｄ　４　ＡによりコードされたＮ−末端アミノ酸配列及びＤＮＡ配列を示す。

ＭｅｔをコードするＡＴＧコドンがもとのＧ−Ｃ３Ｆに付加されたが、これはＭＩＡ　ＰａＣａ−２転写物から得られたｃＤＮＡ配列中には存在しない。

第１２図は、ｐＪＤ４＾及びｐＪＤ４Ｂを担持する誘導された及び誘導されていないＥ、コリ宿主でのＧ　−ＣＳＦの発現を示すＳＤＳゲルである。

第１３図は、ｐＰＤ５を担持する誘導された及び誘導されていないＥ、コリ宿主でのＧ　−ＣＳＦの発現を示ずＳＤＳゲルである。

第１４図は、プラスミドｐＰＤ６の調製の模式的表示であり、このプラスミドにおいては、−ＣＳＦの発現がＰＬプロモーター及び遺伝子Ｎ−リボゾーム結き部位の制御のもとにある。

第１５図は、託−ＣＳＦ及び、−角Ｇ　−ＣＳＦの発現を示すＳＤＳゲルである。１−蛸Ｇ　−ＣＳＦの移動度は、Ｎｉ２−末端Ｍｅ＋及びＴｈｒの欠失に対応するわずかに小さいサイズを反映している。

Ａ、　、　ＧＸＣＳＦ　＠λ−シニ式４Ａ反だ１洲一本発明の承継人に承継されそ１２て１９８６年８月１４日公開されたＰＣＴ公開Ｉｔ　ＷＯ３６１０４６０７中に記載されているようにして、本発明の（ニー　ＣＳＦは誘導されたＨＩＡ　ＰａＣａ−２細胞の蔗糖密度勾配遠心により得られた精製されたｍＲＮＡ画分中に検出された。

前記勾配から得られたｍＲＮＡ画分をアフリカッメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　！ａｅｖ−１ジ）の卵母細胞に注射し、該卵ｎ細胞をインキュベートし、そして上清を、ネズミ骨髄増殖〈ｂ町））を刺激する能力について試験した。Ｃ５Ｆ−１に特異的なプローブへのハイブリダイゼーションのピークは１．ｓｓ　ｍＲＮＡ画分により得られたが、ｂｍｐ活性のピークは１４　、１５及び１６Ｓ　８１＾ＰａＣａ−２ｍＲＮＡ画分が注入された卵ｆ３：８胞からの上清中に見出された。この現象は第１図Ａに示されており、この図はｍ　Ｒ，Ｎ　Ａ画分当りのＣ３Ｆハイブリダイゼ一シヨン強度及びｂｍｐ活性のプロットを示す。

さらに、本発明者等による研究は、より遅く沈降するＲＮＡ画分と関連するｂｍｐ活性のピークは、第３図Ａ及び第３図Ｂに示される様にＧ−ＣＳＦの活性に基くことを決定し／、二。これらの図は、Ｇ−ＣＳＦに特異的なプローブとＩＳＳより遅く沈降するＭＩＡＰａＣａ−２１ＬＩＲＮＡ画分とのハイブリダイゼーションピークを示す。従って、この発明は宿主細胞において（、−ＣＳＦを生産することができるヒト細胞の１ＩＩＲＮＡ画分を包含する。。

この明細書において使用する場合”Ｃ，−Ｃ３Ｆ”は、適切な種の骨髄細胞前駆体を用いるコロニー形成アッセイにおいて一次顆粒球コロニー又は顆粒球−マクロフ７・−ジコロニーの生成を刺激する効果を有する蛋白質を意味する。この活性を有する蛋白質は第４図に示される推定アミノ酸配列を有し、そして本発明の範囲内にあるものと考えられる。

この発明のに−ＣＳＦはＭＩＡ　ＰａＣａ−２セルラインから単離することができる。さらに、第２図に示すように、Ｇ　−ＣＳＦ特異的ＲＮＡ配列はＬＤ−１細胞及び５６３Ｂｇ胞のｍ　ＲＮ’　Ａにおいて明瞭に検出可能である。従って、これらのセルライン及びＧ　−ＣＳＦプローブ陽性である任意の他のセルラインからのクローニングにより得られる（、−ＣＳＦはこの発明の範囲内にあるものと涛えられる。ＬＤ−１セルラインにより生産される成熟に−ＣＳＦは単離されそしてアミノ酸配列が決定されている。ＬＤ−１により生産された蛋白質の６５％がＮ１１．−末端にＴｔｈ残基を有し、そして３５％がＮ１１２−末端にＰｒｏ残基を有する。

あらゆる蛋白質がそうであるように、（、−ＣＳＦの正確な化学構造は多数の因子に依存する。イオン化可能なアミン基及びカルボキシル基が分子中に存在する場合、特定の蛋白質は酸性塩又は塩基性塩として、あるいは中性の形で得ることができる。適当な環境条件に置かれた場合にそれらの活性を維持するこの様なすべての調製物はこの発明に含まれる。さらに、−次アミノ酸配列は、糖成分を用いる誘導体化（グリコジル化）により、又は他の補充的分子、例えば脂質、リン酸塩、アセチル基等により、最も一般的にはサツカライドとの接き”　により増加され得る。−次アミノ酸構造はまた集合して複合体を形成することもできる。

この様な増加の幾つかの観点は生産宿主の翻訳後プロセシング系により達成され、他のこの様な変更はインビトロで導入される。いずれにしても、この様な変更は、上に定義した蛋白質の活性が破壊されない限り、定義内に含まれる。言うまでもなく、この様な変更は、種々のアッセイにおける蛋白質の活性を増強するか又は低下せしめることにより該活性に量的又は質的に影響を与えることが予想される。

さらに、鎖中の個々のアミノ酸残基を酸化、還元又は他の誘導体化によって変えることができ、また、蛋白質を開裂せしめることにより活性を維持している断片を得ることができる。活性を破壊しないこの様な変更は蛋白質配列を定義から排除するものではない。

翻訳中に配列に導入されるアミノ酸の欠失、付加又は変更による一次構造自体の変形を、蛋白質の活性の破壊を伴わないで行うことができる。この様な置換又は他の変更は、“Ｃ−Ｃ５Ｆのそれと実質的に均等なアミノ酸配列を有する“蛋白質の定義に属するアミノ酸配列を有する蛋白質をもたらす。

便宜上、ここに示されるｃＤＮＡクローンから推定される第４図に示されるアミノ酸配列の成熟Ｇ　−ＣＳＦ蛋白質をｍＧ−ＣＳＦ（成熟Ｃ−Ｃ５Ｆ）と称し、これは＋１と称するアミノ酸配列スレオニンから始まる。第４図は３０残基の仮定のシグナル配列の存在を示し、この配列はおそらく哺乳類細胞からの分泌の際開裂される。ｍＧ　−ＣＳＦはこの図に示されるアミノ酸１〜１７４により示される。特に、ｍＧ−ＣＳＦからのそれらの相違によりそのモノマー又は存在するとすればダイマーが（ニー　ＣＳＦ及びＣ−Ｃ５Ｆの関連形と称されるミュテインもヒトＧ　−ＣＳＦの定義に含まれる。他の種に由来するＧ−ＣＳＦは、ヒト基質に関して前記した活性の必要なパターンを示すことにより“ヒト”Ｇ−ＣＳＦの定義に適合することができる。

やはり便宜上、Ｇ−Ｃ５Ｆのアミノ酸配列を参照として使用し、そしてＩｃ５Ｆ活性の観点からこれと実質的に均等である他の配列は第４図に示される配列に言及することによって帰属されるであろう。特定のアミノ酸の置換は、置換されるアミノ酸残基の番号に言及することにより示されるであろう。すなわち、例えば５ｅｒｓ　ｏＧ　−ＣＳＦは、６０位のアミノ酸がプロリンではなくセリンである点を除き第４図に示される配列を有する蛋白質を意味する。欠失は、及びこれに続く、Ｎ−末端配列から除去されるアミノ酸の数で示され、あるいは番号の後にマイナス記号がある場合、残基がＣ−末端配列から除去される場合に残るアミノ酸の数により示される。すなわち、、　−Ｇ　−ＣＳＦはＮ−末端から最初の４個のアミノ酸が除去されている第４図のＧ　−ＣＳＦを意味し、１３０−はアミノ酸１３０の後の最後の４４個のアミノ酸が除去されているＧ　−ＣＳＦを意味する。

゛作用可能に連結されなパスは“作用可能な連結における“とけ、成分の正常な機能が発揮され得る並置を意味する。すなわち、制御配列に“作用可能に連結された°゛コード配列、これらの配列の制御のもとに該コード配列が発現され得る配置を意味する。

゛制御配列”は、特定の宿主生物での作用可能に連結されたコード配列の発現のために必要なりＮＡ配列を意味する。原核生物のために適当な制御配列には、プロモーター、場合によってはオペレーター配列、ＲＢＳ、及びおそらく今までよく理解されていない他のものが含まれる。真核細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサ−を用いることが知られている。

゛″発現系゛°とは、作用可能に連結された所望のコード配列及び制御配列を含有する配列であって、これらの配列により形質転換された宿主がコードされた蛋白質を生産することができるものを意味する。形質転換を行うために発現系はベクター上に含まれるが、しかしながら関連するＤＮＡは次に宿主の染色体に組み込まれることができる。

この明細書において使用される場合、“細胞”、°“セルライン′”、及び゛細胞培養物”は相互に交換可能であり、そしてその様なすべての表示は子孫を包含する。従って、“形質転換体”又は“形質転換された細胞”は−次対象細胞、及び継代数には関係なくそれに由来する培養物を包含する。さらに、意図的な又は意図的でない変異のため、すべての子孫がＤＮＡ含有において正確に同一ではないと理解される。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされたのと同じ機能を有する変異体子孫が含まれる。異る表示が意図される場き、それは文脈から明らかであろう。

訓惺況刀汲で方慮Ｊン１１芝原核生物は最もしばしば、Ｅ、コリの種々の株により代表される。しかしながら、他の微生物株、例えばバシルス、例えばバジルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）　、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の種々の種、又は他の細菌株も使用することができる。この様な原核生物系においては、宿主と適合性の種に由来する制御配列及び複製部位を含有するプラスミドベクターが使用される９例えば、Ｅ、コリは典型的には、Ｂｏｌｉｖａｒ等、噛２　：　９５（１９７７）によりＥ、コリの種から誘導されたプラスミドであるｐＢＲ３２２の誘導体を用いて形質転換される。ｐＢＲ３２２はアンピシリン及びテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含有し、そしてそれ故に、目的のベクターを作製する際に維持されるか又は破壊される追加のマーカーを提供する。ＲＢＳ配列と共に、場合によってはオペレーターを伴う、転写開始のためのプロモーターを含むものとしてこの発明において定義される、−ｉに使用される原核性制御配列には、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）及びラクトース（Ｉａｃ）プロモーター系（Ｃｈａｎｇ等、Ｎａｔｕｒｅ（１９７７）１９８　：　１０５６）及びトリプトファン（Ｔｒｐ）プロモーター系（（：ｏｅｄｄｅ　Ｉ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ　ＡｃａｄｓＲｅｓ、　（１９８０）８　：　４０５７）　、及びλ 由来Ｐ１−プロモーター及びＮ−遺伝子リボゾーム結合部位〔Ｓｈｉｍａｔ、ａｋｅ等、Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９ス：　１２８）（１９８５年８月１５日に公開されたＰＣＴ公開ｍ　ＷＯ３５，１０３５２２に記載されているようにポータプル制御カセットとして有用にされている）のごとき一般に使用されるプロモーターが含まれる。しかしながら、原核生物に適合性の任意の入手可能なプロモーター系を使用することができる。

あとで詳細に記載するように、もとのＧ−ＣＳＦ配列はこの様な原核性微生物宿主において高レベルでＧ−ＣＳＦを生産するなめには効果的でないことが証明された。この発明においては、ｍＧ−ＣＳＦコード配列の５′末端に変更が行われた。ｍＧ−ＣＳＦをコードするＤＮＡ配列の５′末端にＡＴＧ開始コドンを置いたのに加えて、それによりコードされたｌｌＩＣ−Ｃ３Ｆのアミノ酸配列を変化せしめることなくそのヌクレオチド配列に多くの変更が行われた。

これらのヌクレオチド変化はＩ＾（、−ＣＳＦの最初の１０個のアミノ酸を一次的にコードするコドンを含む。こ）ｔらのコドンの少なくとも１個の第三位置の少なくとも１−個ヌクレオチドがデオキシリボグアニジン又はデオキシリボシトシンからデオキシリボアデニンに変えられた。これらの変化はそのコドンによりコードされたアミノ酸残基を変えることなく行われ、そしてさらに、生ずる変化したコドンは、少なくとも宿主細胞がＥ、コリである場合には、必ずしも宿主に好まれるものではない。さらに好ましくは、コドンの第三位の変化は献−ＣＳＦの最初の１０個又は１１個のコドンの内の少なくとも１個において行われ、ここでｍＧ　−ＣＳＦの５′アミノ酸配列は、ＴｈｒＰｒｏＬｅｕＧＩｙＰｒｏΔＩａＳｅｒＳｅｒＬｅｕＰｒｏ、又はＮ−末端Ｍｅｔをコードする追加のコドンが含まれる場合ＭｅｔＴｈｒＰｒｏＬｅｕＣＩｙＰｒｏ＾１ａＳｅｒＳｅｒＬｅｕＰｒｏを維持する。

最も好ましくは、前記のＧから八へ、又はＣからＡへのコドンの変化はｍＧ−ＣＳＦの最初の４個又は５個のコドンの内の少なくとも１個において行われ、ここてｍＧ　ＣＳＦの５′アミノ酸配列は、ＴｈｒＰｒｏＬｅｕＧＩｙ、又はＮ−末端メチオニンをコードする追加のコドンが含まれる場合ＭｅｔＴｈｒＰｒｏＬｅｕＧｌｙを維持する。

さらに好ましい態様においては、＋ｎＧ　−ＣＳＦの５′末端をコードするコドンの第三位のヌクレオチドへの前記の変化は、アミノ酸配列ＴｈｒＰｒｏＬｅｕＧｌｙＰｒｏ＾ＩａＳｅｒＳｅｒＬｅｕＰｒｏをコードするＤＮＡ配列の１０個のコドンの内の少なくとも３個において行われる。

さらに好ましい態様においては、ｍＧ　−Ｃ３Ｆの５′末端をコードするコドンの第三位のヌクレオチドへの前記の変化は、アミノ酸配列ＴｈｒＰｒｏＬｅｕＧ　ｌ　ｙをコードするＤＮＡ配列の４個のコドンの内の少なくとも３個において行われる。

前記の変化が、Ｅ、コリに適合性の発現ベクターにおいてＴｒｐプロモーターと作用可能に連結されているｍＧ−ＣＳＦをコードするＤＮＡ配列の５′末端において行われる場合、ｍＧ　−ＣＳＦをコードする定常状態の＋ＰＩＲＮ　Ａ転写物及びｍＧ−ＣＳＦ活性を有する蛋白質画分の両者は、それぞれナサンブロツティング及びアフリカッメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　１ａｅｖｉｓ）卵母細胞アッセイ、骨髄増殖又は顆粒球コロニー刺激アッセイにより容易に検出可能である。

これに対して、Ｔｒｐプロモーターと作用可能に連結されたちどのｍＧ−ＣＳＦＤＮΔ配列はナサンプロットにより検出可能な…ＲＮＡ転写物をもたらさないのみならず、上記のアッセイにおいてＧ　−ＣＳＦ活性を有する蛋白質画分ももたらさない。

発現ベクター中でＰＬプロモーター遺伝子Ｎ　−ＲＢＳと作用可能に連結されたもとのＣ−Ｃ５Ｆ　Ｉ）ＨＡ配列はＧ　−ＣＳＦをコードする検出可能な定常状態のｍＰｊＮＡ転写物をもならすがｍＧ　−ＣＳＦ活性を有する蛋白質画分をもたらさない。しかしながら、この発明の変更されたｍＧ　−、ＣＳＦ　ＤＮＡ配列が同じベクター中同じプロモーターＲＢＳ制御のもとに置かれた場合、Ｉｌｌに−ＣＳＦ活性を有する蛋白質画分が生産される。

この発明はまた、（、−ＣＳＦが組換宿主から生産される場合にＮ−末端メチオニンが存在しないＧ　−Ｃ３Ｆのミューティンに関する。Ｅ、コリのごとき原核性組換宿主においては翻訳開始コドンＡＴＧはアミノ酸メチオニンをコードする。その結果、これらの組換宿主において生産された組換真核性蛋白質のアミノ又はＮ１１２−末端はメチオニン残基を有し、このメチオニン残基は一般に、ＤＮＡを最初にそこから得た真核細胞中で生産される場合にはその蛋白質中に見出されないものである。

しかしながら、この余分なＷＯ２−末端メチオニンはある種のエキソペプチダーゼ酵素、最も特定すればメチオニンアミノペプチダーゼ又はｍｅｔアミノペプチダーゼによりプロセシングされ、そして除去され得る。この酵素はＮ１（２−末端アミノ酸残基を除去することができるが、具体的には、すべての蛋白質から同じ効率でＷＯ２−末端メチオニンを除去するわけではない。特に、酵素の効率はＷＯ２−末端メチオニンに隣接するアミノ酸残基が何であるかに依存して異る。

これに関する酵素の正確な特異性は無限に近い数の基質を試験しなければ決定することができないが、しかしながら５ｈｅｒ＋ｎａｎ　、　Ｆ　、等ＢｉｏΔ５ｓａｙｓ　３　：　２７−３１（１９８５）により有用な親指の法則（ｒｕｌｅ　ｏｆ　ｔｈｕｍｂ）が記載されている。Ｓｈｅｒｍａｎ等は、酵母からのイソ −１−チトクローム−〇の変異体の観察された形態及び８２の成熟細胞内蛋白質の公表された一次配列に対するＭｅｔ−アミノ−ペプチダーゼの特異性についての彼らの考察を基礎にした。彼らの結論によれば、メチオニンは通常、１．２９Ａ以下の旋回の半径を有する側鎖分有する残基から切離されるが、しかし一般には１．４３Ａより大きい側鎖を有する残基からは切離されない。このことは次の観察と適合する。

ずなわち、原核系及び真核系からの他の蛋白質の他の公表された配列と共に考慮された突然変異的に変更されたイソ−１−チトクローム−Ｃが示すところによれば、Ｎ−末端メチオニンは、それがアラニン、システィン、グリシン、プロリン、セリン、スレオニン又はバリンの残基に先行する場合には切離されるが、しかしそれがアルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、イソロイシン、口イシン、リジン又はメチオニンの残基に先行する場合には切離されない。これらの結果は一般に、後に記載するものと一致する。しかしながら、第二アミノ酸の旋回半径が１．２９Ａより大であり、そして二次構造及び三次構造又は他の条件が特に好都合である場合、幾つかの例外が存在する。従って、この酵素の特異性についてのこの観点は一般的ガイドラインとして意図されるものであり、そして特定のアミノベブチダーでの可能性ある三次構造は試験されていないことを心に留めるべきである。従って、“Ｍｅｔ−アミノペプチダーゼ′”の定義に属するなめには、その酵素に必要なことは、内部メチオニン残基の切離を伴わず且つメチオニン以外のＮ−末端残基の任意のペプチドからの切離を伴わないでＮ−末端メチオニンを特異的に切離するという要件に適合することのみである。

アミン末端メチオニンペプチダーゼによりプロセシングされ得るＮＯ３−末端アミノ酸配列には、メチオニンにａｌａ　、　ｇｌｙ又はｐｒｏが続く配列が含まれる。さらに、ＮＯ３−末端メチオニンにａｌａ−ｍｅｔ　、　ｇａｙ−ｍｅｔ　、　ａｌａ−ｓｅｒ　、　ｇｌｙ−ｇｌｙ　、　ａｌａ−ｐｒｏ。

又はｐｒｏ−ｔｈｒが続く場合もプロセシングされると予想される。

従って、上記の配列がアミノ酸のＮ−末端部分を構成しているＧ−ＣＳＦのあらゆる形態又はＧ　−ＣＳＦのミューティンが、Ｇ−ＣＳＦの生物学的活性が維持されている限り、この発明のＧ−ＣＳＦの定義に属する。特に、ＮＯ３−末端メチオニンに続くスレオリン残基が欠失していて、−Ｇ−ＣＳＦをもたらすＧ−ＣＳＦの欠失変異を後で幾分詳細に説明する。特に、ｔｈｒ、残基がａｌａ　。

ｇｌｙ　、　ａｌａ　ｓｅｒ、又はＢＩＹ−ｇｌＹにより置き換えられているか、あるいはｐｒｏとｔｒｅの順序が逆転しているＧ　−ＣＳＦの変異形もこの発明の範囲に属するであろう。Ｇ　−ＣＳＦの上記のミューティンをコードするＤＮＡ種は既知の技法を用いて、天然Ｇ−ＣＳＦをコードするｃＤＮＡの部位特異的変異誘発により調製することができる９これらのミューティンをコードするオリゴヌクレオチドはまた、特異的に消化されたＧ−ＣＳＦ　ＤＮＡ配列に変更された配列をコードするオリゴデオキシリボヌクレオチドを連結することにより、天然Ｇ　−ＣＳＦアミノ末端アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列と置き換えることができる。

Ｂ、　明を　するための一般・方法肚Ｉ勲且使用される宿主細胞に依存して、形質転換はその様な細胞に対して適当な標準的技法を用いて行われる。Ｃｏｈｅｍ、　Ｓ、　Ｎ、。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ＞（１９７２）６９　：　２１１０により記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム法、又はＭａｎｉａｔｉｓ等、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：八Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａ［１９８２）コールド・スプリング・ハーバ−・プレス２５４頁に記載されているＲｂＣ１２法を原核細胞及び実質的な細胞壁障壁を含有する他の細胞のために用いた。この様な細胞壁を持たない哺乳類細胞のためには、Ｇｒａｈａｍ及びｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、　（副腫江（１９７８）５２　：　５４６のリン酸カルシウム沈澱法、又は−ａｎｇ等、５ｃｉｅｎｃｅ、　２２８　：　１４９（１９８５）の方法を使用することができる。酵母への形質転換は、Ｖａｎ　Ｓｏｌｉｎｇｅｎ、　Ｐ、等、Ｊ、　Ｂａｃｔ、　（１９７７）１３味９４６、及びＨｓｉａ。

Ｃ，Ｌ、等、Ｐｒｏ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）（１９７９＞７６　：　３８２９の方法に従って行われる。

ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングｃＤＮＡライブラリーをコロニーハイブリダイゼーション法によりスクリーニングするコロニーの取り上げはニトロセルロース濾紙（Ｓ＆ＳタイプＢ＾−８５〉上に行う。５分間０　、５　ＭＮａＯＨｌｌ、５Ｍ　ＮａＣ１で処理することによりコロニーを溶解しそしてＤＮＡをフィルターに固定し、そして次に５分間ずつ１．０Ｍ　Ｔｒｉｓ（ｐ）１８）、３ＭＮａＣ／により２回洗浄する。フィルターを空気乾燥し、そして８０℃にて２時間燥熱する。２枚のフィルターを５ＸＳＳＣ１１０×デンハート溶液（０，２％ポリビニルピロリドン、０．２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．２％ＢＳ八）、０．１％ＳＯＳ、５０ＴＩＩＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７，０）及び１００μｇ／　ｍｆ！　ｔＲＮＡ中で１暗闇４５〜５０℃にてプレハイブリダイズせしめる。

フィルターのハイブリダイゼーションは、フレハイブリダイゼーションについて上記したものと類似しているが、しかしさらにＩ　Ｘ　１０’　ＣＰＭ／　ｍｌのキナーゼ処理されたプローブと共に１０％硫酸デキストランを含有する溶液中で、望ましいストリンジエンシーに依存する条件下で行われる。典型的な中間的ストリンジェントな条件は、１〜５　ｍｔ’／フィルターのプローブ含有ＤＮＡハイブリダイゼーション緩衝液と共に、１６〜２０時間にわたる４５〜５０℃の温度を用いる。より高いストリンジエンシーのためにはより高い温度が用いられる。フィルターを１５分間ずつ３回、適切な温度にて、３ｘｓｓｃ、０．１％ＳＤＳを用いて洗浄し、空気乾燥し、そして−７０℃にて２〜・３日間オートラジオグラフ処理する。

へえノ：ゼυ１１所望のコード配列及び制御配列を含有する適当なベクターの作製には、当業界においてよく理解されている標準的連結及び制限技法を用いる。単離されたプラスミド、ＤＮ’Ａ配列、又は合成されたオリゴヌクレオチドが開裂され、整えられ、そして所望の形に再連結される。

部位特異的ＤＮＡ開裂は、当業界において一般に理解されている条件下で適切な制限酵素により処理することにより行われ、その詳細はこれらの市販の制限酵素の製造者により限定されている。例えば、二ニー・イングランド・バイオラプスの製品カタログを参照のこと。一般に、約１μｇのプラスミド又はＤＮＡ配列が１ユニツトの酵素により約２０μｌの緩衝液中で行われる。この発明の例においては、ＤＮＡ基質の完全消化を保証するため３〜１０倍過剰の制限酵素が使用される。３７℃又は他の適当な温度において約１〜２時間のインキュベーションが有効であるが、変更を行うこともできる。各インキュベーションの後フェノール／クロロホルムによる抽出によって蛋白質を除去し、次にエーテル抽出を行い、そしてエタノールによる沈澱によって水性画分から核酸を回収し、次にセファデックスＧ−５０スピンカラ１８に通す。所望により、標準的技法を用いてポリアクリルアミドゲル又はアガロースゲル電気泳動により、開裂された画分のサイズ分間を行う。サイズ分離の一般的記載はＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８０）６５　：　４９９−５６０、又はＭａｎｉａｔｉｓ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＣＩｏｎｉＢ　：　Ａ−イかと１旦膝」１凹１−、コールド・スプリング・ハーバ−・うボラトリー、コールド・スプリング・ハーバ−１Ｎ　Ｙ　（１９８２＞に見られる。

制限開裂された断片は、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７，６）、５０＋ｎＭ　ＮａＣ１，６ｍＭ　ＨｇｆＪ２．６ｍＭ　ＤＴＴ及び５〜１０μＭｄＸＴＰ中２０〜２５℃にて約１５〜２０分間のインキュベーション時間を用いて、４種類のデオキシヌクレオチドトリホスフェ−１〜（ｃｌＸＴＰ＞の存在下でＥ、コリＤＮＡポリメラーゼ■の大断片（Ｋｌｅｎｏｗ）で処理することにより平滑末端化することができる。Ｋｌｅｎｏｕ＋断片は５′突出部をフィルインするが、４種類のｄＸＴＰが存在する場合でさえ突出した３′単鎖をチューバックする。所望により、接着末端の性質により指定される制限内で１種類の又は選択されたｄＸＴＰを供給することにより選択的修復を行うことができる。

Ｋｌｅｎｏｗによる処理の後、混合物をフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノール沈澱せしめ、そしてセファデックスＧ−５０スピンカラｌ＼に通す。適当な条件下でのＳｌヌクレアーゼによる処理が単鎖部分の加水分解をもたらす。

合成オリゴヌクレオチドは、ＭａｔＬｅｕｃｃｉ等〔Ｊ、＾ｒ１１．　Ｃｈｅｍ。

Ｓｏｃ、　（１９８１）１０３　：　３１８５）のトリエステル法により、又は市販の自動オリゴヌクレオチド合成機により調製される。アニーリング又はラベル化に先立つ単鎖のキナーゼ処理は、過剰の、すなわち０．１ｎ　ｍｏｌｅの基質に対して約１０ユニツ１〜のポリヌクｌ／オチドキナーゼを用いて、５０＋ｎＭ　Ｔｒｉｓ　（ｐＨ７，６）、１０ｍＭＭＨＣｆ２．５＋ｎＭジチオスｌ／イトール、１〜２ｍＭ　ＡＴＰ、１．７ｐ　ｍｏｌｅγ３２ｐ−ＡＴＰ（２，９ｍＣ１／ｍ　ｍｏｌｅ）、０．１ｍＭスペルミジン、０．１ｍＭ　ＥＤＴ＾の存在下で行われる。

連結（Ｉｉεａｔｉｏｎ）は１５〜３０μ！の容量中で次の標準的条件及び温度において行われる。２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｃ１（ｐＨ７，５）、１０ｍＨＨｇｆｊ’２．１０ｍＭ　ＤＴＴ、３３ｔ、ｔ、　ｇ／　ｍｆ　ＢＳΔ、１０＋ｎｆ４ −５０ｍｔ’ｌ　ＮａＣＺ　；　並びに４０μ８＾ＴＰ、　０．０１〜０．０２（Ｗｅｉｓｓ）Ｌ二・ｙ　１４４　ＤＮＡリガーゼ、０℃（“接着末端゛連結のなめ）、又はｂｎＭΔＴＰ、０．３〜０．６（Ｗｅｉｓｓ）ユニットＴ４　ＤＮＡリガーゼ、１４℃〈パ平滑末端パ連結のなめ）のいずれか。分子間゛′接着末端パ連結は通常、３３〜１００μｇ／ｎｌの全ＤＮＡ濃度（５〜１００ｍＭの合計末端濃度）において行われる。

分子間“平滑末端゛連結は（通常、１０〜３０倍分子過剰のリンカ−を用いて）１μＨの合計末端濃度において行われる。

パベクター断片”を用いるベクターの作製において、このベクター断片は、５′ リン酸を除去しそしてベクターの再連結を防止するために、細菌アルカリホスファーターゼ（ＢＡＰ）により処理される。ＢＡＰ消化はｐＨ８にて、約１５０１１ＩＮのＴｒｉｓ中で、Ｎａ＋及びＭｇ”２の存在下で、ベクターμｇ当り約１ユニツトのＢ　Ａ　Ｐを用いて６０℃にて約１時間行われる。この処理にかけられるベクター断片は、この明細書において゛′バップド（ｂａｐｐｅｄｌ’と称される。核酸断片を回収するため、調製物はフェノール／クロロホルムで抽出され、エタノール沈澱され、そしてセファデックスＧ−５０スピンカラムへの適用によって脱塩される。あるいは、不所望の断片の追加の制限酵素消化によって二重消化されたベクターにおいて再連結を防止することができる。

配列の変更が必要なｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ又はゲノ１．　Ｄ　Ｎ　Ａ由来のベクターの部分のため、部位特異的プライマー指令変異誘発が行われる。これは、所望の変異を代表する限定されたミスマツチのほか変異誘発されるべき単鎖ファージＤ　Ｎ　Ａに相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマー分用いて行われる。要約すれば、ファージに相補的な鎖の合成を指令するプライマーが使用され、そして生ずる二本鎖ＤＮＡがファージ担持性宿主細菌に形質転換される。形質転換された細菌の培養物を上層寒天中にプレートし、ファージを担持する単一細胞からプラークを形成せしめる。

理論的には、新たなプラークの５０％が変異した形態のファージを単鎖として含有し、５０％はもとの配列を有するであろう。生ずるプラークを、キナーゼ処理された合成プライマーと、正確にマットする場合にハイブリダイゼーションを許容するがしかしもとの鎖を有するミスマツチの場合にハイブリダイゼーションを回避するのに十分である温度においてハイブリダイズせしめる。次に、プローブとハイブリダイズするプラークを拾い上げ、培養し、そしてＤＮＡを回収する。

部位特異的変異誘発法の詳細は具体的な例において後記する。

４炙へ１４後に記載する作製法において、プラスミドの作製のための正しい連結の確認を行うにはまず、Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｈＣｅｎｔ、ｅｒ、　ＣＧ５Ｃ６１３５から得られるＥ、　ｃｏｌユ８Ｍ２９４株、又は他の適当な宿主を連結混合物により形質転換する。好結果の形質転換体をアンピシリン、テトラサイクリン又は他の抗生物質に対する耐性により、あるいはプラスミドの作製法に依存して他のマーカーを用いて、当業界において理解されている様にして行われる。次に、形質転換体からプラスミドを、Ｃｌｅ−ｗｅｌｌ、　Ｄ、　Ｂ、等、Ｐｒｏ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）（１９６８）６２　：１１５９の方法に従って調製し、場合によってはそれに先立ってタロラムフェニコール増幅（Ｃｌｅｗｅｌｌ、　Ｄ、　Ｂ、、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。

（１９７２）１１０　＋　６６７）ｌを行う。単離されたＤＮＡは制限酵素地図の作製により分析し、そして／又は５ａｎｅｅｒ、　Ｆ、等、Ｐｒｏｃ　。

Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）（１９７７）７４　：　５４６３により記載され、Ｍｅｒｒｉｎｇ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、（１９８１）９　：　３０９により、又はＭａｘａｍ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏ８ｙ（１９８０）６５　：　４９９によりさらに記載されたジデオキシ法により配列決定する。

１五Δ匠沢この発明においてクローニング及び発現のために使用される宿主株は次の通りである。

クローニング及び配列決定のため、並びにほとんどの細菌プロモーターの制御のもとての構成物の発現のなめ、Ｅ、　ｃｏｌｉ聞２９４株（前掲）、Ｔａｔｎ＋ａｄｇｅ、　Ｋ、等、Ｇｅｎｅ（１９８０）１２　：　２３５　；　Ｈｅ−５ｓｅｌｓｏｎ、　Ｍ、等、Ｎａｔｕｒｅ（１９６８）２１７　：　１ｆｌＯを宿主として使用した。Ｐ、　Ｎ−ＲＢＳプロモーターの制御下での発現のため、Ｅ。

ニアｊＪＫ１２株ＭＣ１０００λ溶原株、Ｎ７Ｎｓ：＋ｃ１８５７ＳｕｓＰ、。

、　ＡＴＣＣ３９５３１（以後、時トしテＭｃ１０００−３９５１３，１Ｇ９５又１．ｔＤＧ９５　トｉｔすル）ヲ用いる。

Ｍ１８ファージ組換体のため、ファージ８染に感受性のＥ、コリ株、例えばＥ、コリに１２株を使用する。ＤＣ：９８株は１９８４年７月１３日に＾ＴＣＣＧ′ ニー寄託されており、そして寄託番号１９６５を有する。

細菌に加えて、真核性微生物、例えば酵母を使用することもできる。パン酵母サツカロミセス・セレビシェ−（Ｓａｃｃｈａ−ｒｏ＋ａｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の実験質株が最も使用されるが、他の多くの株も一般に入手可能である。２ミクロン複製開始点を用いるベクターが例示される（Ｂｒｏａｃｈ、　Ｊ、　Ｒ，、Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚ。

（１９８３）剋Ｌ：　３０７）が、酵母での発現のなめに適当な他のプラスミドが知られている〔例えば、Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ等、Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２８２　＋　３９　；　Ｔｓｃｈｅｐｅ等、Ｇｅｎｅ（１９８０）１０　：　１５７　；及びＣ１ａｒｂｅ、　Ｌ。

等、Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚ、　（１９８３）１０１　：　３００を参照のこと〕。

酵母用べ°　フタ−のための制御配列には糖酵素の合成のためのプロモーター［Ｈｅ５ｓ等、Ｊ、　Ａｄｖ、　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｒｅ　、　（１９６８）１　：　１４９　；　Ｈｏ１ｌａｎｄ等、Ｂｉｏｃ冒ｉ賎匡（１９７８）１７　：　４９００１）が包含される。当業界において知られている追加のプロモーターには３ −ホスホグリセレート・キナーゼのプロモーター（Ｈｉｔｚｍａｍ等、Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

ｑμｎ、　（１９８０）翻５　：　２０７３）　、並びに他の解糖系酵素、例えばグリセルアルデヒド−３−ホスフェ−１〜・デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベート・デカルボキシラーゼ、ホスホフラクトキナーゼ、グルコース− ６−ホスフェート・イソメラーゼ、３−ホスホグリセレート・ムターゼ、ピルベート・キナーゼ、トリホスフェート・イソメラーゼ、ホスホグルコース・イソメラーゼ及びグルコキナーゼのためのプロモーターが含まれる。転写が増殖条件によって制御されるという追加の利点を有する他のプロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクローム−Ｃ，酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、並びにマルトース及びガラクトースの資化のための酵素（Ｈｏｌｌａｎｄ、前掲）のためのプロモーター領域である。Ｔｒｐプロモーター及びＰＬプロモーターと共に有効であることが示されるそれらに類似する１ＩＩＧ− Ｃ３ＦＤＮ＾配列の５′末端の変更も、この様な真核性プロモーターと共に使用するために行われ得る。

コード配列の３′−末端にターミネータ−配列が望ましいことも信じられる。この様なターミネータ−は、酵母由来遺伝子中のコード配列に続く３′−非翻訳領域中に見出される。

例示されるベクターの多くが、エノラーゼ遺伝子含有プラス８：１２１）から得られるＬＥ０２由来の制御配列を含有するが、酵母適合性プロモーター、複製開始点及び他の制御配列を含有するすべてのベクターが適当である。

言うまでもなく、後でさらに記載するように、多細胞生物に由来する真核性宿主細胞培養物中でポリペプチドをコードする遺伝子を発現せしめることも可能である。例えば一般に、Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ、アカデミツクプレス、Ｃｒｕｚ及びＰａｔｔｅｒｓｏｎ編集（１９７３）を参照のこと。有用な宿主セルラインにはネズミ骨髄腫Ｎ５１．　ＶＥＲＯ及びＬｅＬａ細胞、ＣＯ３−７細胞、並びにチャイニズ・ハムスター・卵巣（ＣＨＯ）Ｍ胞が含まれる。これらの細胞のための発現ベクターは一般に、哺乳類細胞に適合性のプロモーター及び制御配列、例えばシミアンウィルス４０（ＳＶ４０）からの一般に使用される初期及び後期プロモーター［Ｆｉｅｒｓ等、Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）２７３　：　１１３）、又は他のウィルスプロモーター、例えばポリオーマウィルス、アデノウィルス２、ウシ乳頭腫ウィルス又はトリ肉腫ウィルス由来のプロモーター、又は免疫グロブリンプロモーター及びヒートショックプロモーターを包含する。哺乳類細胞宿主系形質転換の一般的観点は１９８３年８月１６日発効の＾ｘｅｌの米国特許隘４，３９９，２１６に記載されている。今やさらに、発現の最適化に°″ エンハンサー領域が重要であり、これらは一般にプロモーター領域の上流に見出される配列である。必要であれば、複製開始点をウィルス原から得ることができる。しかしながら、染色体への絹込みが真核細胞でのＤＮＡの複製のための一般的機構である。今や植物細胞も宿主として使用することができ、そして植物細胞に適合性の制御配列、例えばツバリン合成酵素プロモーター及びポリアデニル化シグナル配列（Ｄｅｐｉｃｋｅｒ　、＾。

等、しＪ吐工静１ユ販ｎ、　（１９８２）１　：　５６１）が使用可能である。

次に、本発明を例によりさらに具体的に説明するが、これにより発明の範囲を限定するものではない。

例−」− ヒトＧ　−ＣＳＦをコード　るｃＤＮＡの単離及びｌ。

ヒト顆粒球刺激因子をコードするｃＤＮＡをＭＩＡＰａＣａ　−２セルラインから単離し、そして組換ベクターを用いてＣＯ５−７２セルラインは、Δｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　１２３０１Ｐａｒｋｌａｔｕｎ　Ａｖｅｎｕｅ、　Ｂｅｔｈｅｓｄａ、、　ＭＤ　２０８９５のＣｅ１ｌ　ＲｅｐｏｓｉｔｏｒｙＬｉｎｅｓ（ＣＲＬ）からΔＴＣＣＣＲＬ　１４２０の番号のもとに一般に入手可能な樹立されたセルラインである。ｃＤＮＡクローンを配列決定し、そして対応するアミノ酸配列を推定した。

Ａ、高Ｂ　Ｍ　Ｐ活性を有　るがしかしＣ５Ｆ−１１０−ブに対する−いハイブリダイゼーションを　る　１４１＾ＰａＣａ　−２細月からの…ＲＮＡの最　の　吐ヒト由来膵臓癌セルラインＭＩＡ　ＰａＣａ−２を、Ｃ５Ｆ−１特異的プローブを確認するための及びイントロン不含形のヒトＣＳＦ　−１コ一ド配列を含有するｃ　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリーの形成のためのｍ　ＲＮ　Ａ源として使用した。

ＭＩＡＰａＣａ−２セルラインは、ネズミＬ−９２９細胞のそれよりも約１０倍低いレベルでＣ５Ｆ−１を生産する。

無血清培地中に維持されなＭＩＡ　ＰａＣａ−２細胞がら、ずなわち５ＳＦＩを生産しない条件下で、負対照ｍＲＮＡを調製した。

血清を除去しな後Ｃ５Ｆ−１の生産を再誘導することによりＣＳＦ　−１生産細胞を得た。

１０％のウシ胎児血清を含有するダルベコ改変イーグル培地（ＤＭＥＨ）を用いてローラービン中でコンフルエンスに、そして２０００〜６０００ユニット／ｍｌのＣ５Ｆ−１を生産するように細胞を増殖せしめた。細胞培養物を洗浄し、そして無血清条件下で再度インキュベートしてＣ５Ｆ−１の生成を抑制した。負対照については、血清を伴わない１〜２日のインキュベーションの後検出可能なＣ３Ｆ−１は生産されなかった。ホルボールミリスティックアセテート（ｐｈｏｒｂｏｌ　ｍｙｒｉｓｔｉｃ　ａｃｅｔａｔｅ）（１００ｎＨ／ｍ／）の添加により再誘導された細胞を得、数日後に１ｏｏｏ〜２０００ユニット／社の生産を得な。

リボヌクレオチド・バナジルコンプレックス（Ｂｅｒｇｅｒ　、　Ｓ　。

Ｌ２等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７９）１８　：　５１４３）の存在下０．５％ＮＰ−４０を含有する等張緩衝液中での細胞の溶解、並びにこれに続くフェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈澱、及びオリゴｄＴクロマトグラフィーによりＭＩＡＰａＣａ−２ｍＲＮＡを得、そして濃縮されたｍＲＮＡ調製物を得た。

さらに具体的には、細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝化塩溶液）中で２回洗浄し、そしてバナジルアデノシンコンプレックス（Ｂｅｒｇｅｒ、　Ｓ、　Ｌ、等、前掲）を含有するＩ　ＨＢ　＜１４０ｍＭ　Ｎａ、ＣＩ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、１．５ｍＨＨｇＣｌ２、ｐＨ８＞中に再懸濁する。

エチレンオキシドポリマー型の非イオン性洗剤（ＮＰｉＯ）を０．５％に添加することにより核膜を溶解しないで細胞膜を溶解する。１．ＯＯＯｘｇにて１０分間の遠心分離により核を除去し、そして核を除去した後の上清を２容量のフェノール／クロロホルム（１：１）飽和Ｔ　Ｅ　（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴΔ）、ｐＨ７，５〕に加え、そして０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及び１０ｍＭ　ＥＤＴ八に調整する。上清を４回再抽出し、各回に２．ＯＯＯＸｇにて１０分間の遠心分離により相分離を行う。サンプルを０．２５Ｍ　ＮａＣｆに調整し、２容量の１００％エタノールを添加しそして一２０℃にて貯蔵することによりＲＮＡを沈澱せしめる。ＲＮＡを５，０００％ｇにて３０分間ベレット化し、７０％及び１００％のエタノールで洗浄し、そして次に乾燥する。全細胞ＲＮＡからオリゴｄＴセルロース上でのクロマトグラフィーによりポリアデニル化（ｐｏｌｙ　Ａ”）メツセンジャーＲＮ＾（ｍＲＮＡ）を得る〔＾ｖｉｖ、　Ｊ、等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、（１９７２）６９：　１４０８　１４１２）　。ＲＮＡをＥ　Ｔ　Ｓ　（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、１ｍＨＥＤＴＥ、０．５％ＳＤＳ、ｐｌ！７．５）中に２　ｐｇｌ−の濃度に溶解する。この溶液を６５℃に５分間加熱し、次に迅速に４℃に冷却する。ＲＮＡ溶液を室温にした後、それを０．４Ｍ　ＮａＣｔ’に調整し、そして結合緩衝液（５００ｍＭ　ＮａＣ：ｆｆｉ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、１ｍｔ４　ＥＤＴ＾、ｐＨ７，５，０，５％５ＤＳ）によりあらかじめ平衡化したオリゴｄＴセルロースカラムにゆっくりと通ず。流通液をさらに２回カラムに通す。次に、カラムを１０容量の結合緩衝液で洗浄する。小分けしたＥＴＳによりポリ＾”ｍＲＮＡを溶出し、ＴＥ−飽和フェノール／クロロホルムで２回抽出し、そして０，２ＭへのＮａＣｆｆ１及び２容量の１００％エタノールの添加により沈澱せしめる。ＲＮＡを２回再沈澱せしめ、７０％エタノール中で１回及び次に１００％エタノール中で洗浄した後、乾燥する。

全ｍ　ＲＮ　Ａを、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！（ｐＨ７，４）、１ｍＨＥＤＴΔ及び０．５％Ｓ　Ｉ）　Ｓ中で、ベックマン５Ｗ４０ローターを用いて、２０℃及び２７，０００ｒｐｍにて１７時間、５〜２０重量％シュークロース勾配遠心にかけた６次に、１ｌｌＲＮＡ画分をエタノール沈澱により勾配画分から沈澱せしめ、そして標準的翻訳アッセイにおいてアフリカッメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　Ｉａｅｖｉｓ）卵母細胞に注入した。ＲＮＡ画分の卵母細胞生成物をＭｏｏｒｅ、　Ｒ，Ｎ、等、Ｌ−Ｉｍｍｕｎｏｔ、（１９８３）１３１　：　２３７４の、及びＰｒｙｓｔｏａ＋ｓｋｙ、　Ｈ，Ｂ、等、Ａｍ。

Ｊ、　Ｐａｔｈｏｌ、（１９８４０１４：　１４９の骨髄増殖アッセイにおいてアッセイし、そして両分自体をケッム配列の第二エクソン中のＤＮＡに対応する３２−ｍａｒプローブ（エクソン■プローブ）へのドットブロッ１〜ハイブリダイゼーションによりアッセイした。これらの結果を第１図Ａ及び第１図Ｂに要約する。

第１図Ａ中の破線はアフリカッメガエル卵ａ細胞からの上清の骨髄増殖アッセイにおける応答を示し、第１図Ｂはドツトプロットの結果を示す。最も強くハイブリダイズする画分１１は１８Ｓより大きい両分に相当し、そして最も活性な画分８及び９は１４〜１６Ｓに相当する。

ｍＲ，ＮＡをさらに変性ホルムアルデヒドゲル上で分画し、ニトロセルロースに移し、そしてエクソン■プローブによりプローブした。１．５ｋｂ〜４．５ｋｂのサイズの別個の種がストリンジエン１−ハイブリダイゼーション条件下でさえ見出された。

Ｂ、８１人ＰａＣａ−２、かｔのＧ−ＣＳＦ　＋ｎＲＮへの゛−コンフルエントのＭＩＡ　ＰａＣａ−２ＭＢ胞を、無血清ダルベコ最少必須培地（ＤＨＥＭ）中で４日間、ホルボール・ミリステート・アセテート（ｐｈｏｒｂｏｌ　＋＊ｙｒｉｓｔａｔｅ　ａｃｅｔａｔｅ）（５０ｎＨ／ｍ６）及びレチノイン酸（ｒｅｔｉｎｏｉｎ　ａｃｉｄ）（１０ＭＭ）により刺激した。Ｃｈｉｒｇｕｉｎ等により記載されているようにしてＲＮＡを調製した。要約すれば、お胞を５Ｍグアニジンイソチオシアネート中で溶解し、次に５．７Ｍ塩化セシウム（ＣｓＣｆ）クッションを通して遠心し、Ｍａｎｉａｔｉｓ等、前掲、に記載されているようにしてオリゴ（ｄＴ）セルロース上での１回の選択サイクルにより、前記細胞溶解物からポリ＾”　ＲＮＡを調製した。

さらに詳細には、５Ｍグアニジンイソチオシアネート、０．０２５Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ７）、０．５％サルコシン及び８％β−メルカプトエタノールを含有する溶液中で細胞を溶解した。分子生物学グレードのＣｓＣ１を５．７Ｍ又は４０％（Ｗ／■）にし、そして０．０２Ｍ　Ｔｒｉｓ（ｐｔｔ７．５＞及び０．００２Ｍ　Ｎａ−ＥＤＴΔにより緩衝化した。すべての溶液はＲＮａｓｅ不存在条件下で調製し、そして使用前に０．４５μミリポアフィルタ−を通した。

次に溶解した細胞を、１０社の５．７Ｍ　Ｃ３ＣＩ及び６社の４０％ＣｓＣＩ２の層を収容する５−２８超遠心管上に層形成した。

２６．０００ｒｐ＋口にて１８時間遠心した後、ＲＮＡぺ１ノツトを蒸留水に溶解し、そして２回エタノール沈澱せしめた。Ｍａｎｉａｔｉｓ等、前掲、（１９７頁）に記載されているようにしてオリゴ（ｄＴ）セルロース上での全ＲＮＡのクロマ１−グラフィーによりポリアデニル化（ポリＡ”）メツセンジャーＲＮ＾（ｍＲＮＡ）を得な。

ＲＮＡを無菌水に溶解し、そして６５℃に５分間加熱した。

０．０４０Ｍ　Ｔｒｉｓ−Ｃ／！（ｐＨ７，６）、１．０Ｍ　ＮａＣ１，０，００２Ｍ　ＥＤＴ＾及び０．２％ＳＯＳを含有する溶液等容量を迅速に添加し、そしてサンプルを室温に冷却する。次にサンプルを、０．０２Ｍ　Ｔｒｉｓ　（ｐＨ７゜６）、０．５Ｍ　ＮａＣＮ、Ｏ，ＯＯＩＭ　ＥＤＴ＾及び０．１％ＳＤＳを含有する緩衝液により平衡化されたオリゴ（ｄＴ）カラムに負荷する。流過液を集め、６５℃に加熱し、室温に冷却し、そして再度カラムに通す。次に、カラムを１０容量の洗浄緩衝液（０，０２Ｔｒｉｓ、０．１Ｍ　Ｎａ（Ｊ、Ｏ，ＯＯＩＭ　ＥＤＴ＾、０．１％５ＤＳ）で洗浄する。

ポリ八＋ｍＲＮＡをノド分けした０、ＯＩＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７，５）、Ｏ，ＯＯＩＭ　ＥＤＴΔ。

により溶出し、そしてエタノール沈澱を２回行う。

３３４μｇのＭＩ八へａＣａ−２ポリ＾”　ｍＲＮＡを、２０ｎ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ −）１ｆＪ（ｐＨ１７，５）　、１ｍＨＥＤＴΔ及び０．５％サルコシン中でベックマン蛋４０ローターを用いて２０℃及び２７，８００ｒｐｍにて１６時間、５〜２５重量％シュークロース勾配遠心により分画した。ｍＲ，ＮＡ画分を４００μｌの両分として集め、そしてエタノール沈澱を２回行った。両分をプールし、そして１５μｌの水に再懸濁した。

レーン当り５μ８のポリ＾＋ＲＮ＾又は１μ！の各プールされたＲＮＡ画分を０．５Ｍホルムアルデヒドを含有する１％アガロースゲルを通して電気泳動し、次にニトロセルロースフィルターにプロットすることによりナサンプロットを調製した。

フィルターを８０℃にて１．５時間乾熱した後、これらを５５°Ｃにて１時間プレハイブリダイズせしめた〔５ｘｓｓｃ、１０×デンハート溶＞Ｗ　（０，２％ポリビニルピロリドン、０．２％フィコール、０．２％ＢＳ＾）、０．１％ＳＤＳ、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７，０）、及び１００μｇ／社しＲＮ＾〕。プロットを５５℃にて１６時間、１０％ＫＢデキストラン、及びγ３２ｐ−＾ＴＰとポリヌクレオチドキナーゼとでラベルされたオリゴヌクレオチド１、０　 ’　ｃｐｍ／　ｍｅをさらに含有する同様の溶液中でハイブリダイズせしめた。

第３図Ｂに示されるプロットを３ｘＳＳＣ１０，１％ＳＤＳ中で５５°Ｃにて洗浄した。このオリゴヌクレオチドプローブは配列５　’−ＧＴＡＧＧＴＧＧＣΔ ＣＡＣＡ（：ＣＴＴＣＴＣＣＴＧ　−３’を有し、そしてＮａｇａｔａ等、Ｎａｔｕｒｅ、　３１旦：　４］、５−４１８（１９８６）により記載されなＣ）ＩＵ−２ｃＤＮΔクローンの配列に基いて設計されている。

前記のアッセイにおいて記載されたＲ、　Ｎ　Ａプールを、Ｇｕｒｄｏｎ等、Ｎａｔｕｒｅ、　２３３　：　１７７−１８０（１，９７１＞に記載されているようにして各卵母細胞に５０ｎｌのＲ，Ｎ　Ａを注入することにより、アフリカッメガエル卵母細胞アッセイにおいて翻訳した。４０時間後に卵母細胞当り１０μ りの上清を集め、そしてＣ３Ｆ活性についてアッセイした。

各ハイブリダイゼーション画分からの卵母細胞上清を、Ｍｏｏｒｅ等、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１３１　：　２３７４−２３７８（１９８３）に記載されているようなネズミ骨髄細胞増殖アッセイにおいてＣＳＦ活性についてアッセイした。要約すれば、このアッセイにおいて、５Ｘ１０’個／ウェルのネズミ骨髄細胞を９６−ウェルプレート（１２Ｘ８）中で、ハイブリダイズ陽性ｍ　ＲＮ　Ａ画分から調製された逐次稀釈されたアフリカッメガエル卵母細胞上清と共にインキュベートした。３日間の後、３Ｈチミジン（０，５μＣｉ／ウエル）を加え、そして６時間後細胞を集め、そして液体シンチレーションカウンター中で計数した。

第３図に示す上記オリゴヌクレオチドプローブとのナサンプロットにおいて最も強く陽性であったｍ　ＲＮ　Ａ画分から調製されたアフリカッメガエル卵母細胞上清中に骨髄増殖のピークが見出された。

Ｃ、ＭＩＡ　ＰａＣａ−２ｃ（２ＮＡう／じρ札史＝沖のＧ−Ｃ８些ツ七１ｂケ証だＫａｗａｓａｋ　ｉ等、５ｃｉｅｎｃｅ、　、３０　：　２９１−２９６（１９８５）に記載されている様にして、濃縮されたＭＩＡ　ＰａＣａ−２ＩＩＩＲＮ＾からｃＤＮＡライブラリーを調製した。要約すれば、この方法においては、Ｏｋａｙａｍａ、　）１．等、Ｍｏｌ　、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、３　：　２８０−２８９（１９８３）の方法を用いるポリＡ＋テイルのオリゴ（ｄＴ　）プライミング及びＡＭＶ逆転写酵素を用いた。この方法は、ポリ（ｃｌＧ）ティリングに比べて高い比率で十分長いクローンをもたらし、そして宿主ベクターどして、そこに記載されておりそして著者から入手可能な２つのベクターｐｃＤＶ　１及びｐＬｌの部分を使用する。得られるベクターはベクター断片間に近似ＢａｍＨＩ及びＸｈｏｌ制限部位を含有する。このベクターはｐＢＲ３２２の複製開広、並びにｃｏｓ　−７：ｓ胞中で挿入された配列の発現を行うベクターの能力をもたらすＳＶ４０制限要素、及びアンピシリン耐性遺伝子を含有する。

次に、オカヤマ及びベルブの方法により前記の濃縮された８■＾ＰａＣａ−２ｍＲＮ八から得られなＥ、コリ中１．２Ｘ１０６個のクローンのライブラリーを、最も活性の強いプールされたＭＩＡＰａＣａ−２ｍＲＮΔ画分において陽性シグナルをもたらした同じオリゴヌクレオチドプローブを用いてプローブした。ライブラリーをプローブするなめ、オカヤマ〜ベルグベクターを含有するＥ、コリを栄養培地上で増殖せしめた。コロニーをニトロセルロース濾紙上に濾過し、そして溶解した。０．５ｎ＋ｔ４　Ｎａ０）ｌ、１．５Ｍ　ＮａＣ１により５分間処理することによりＤＮＡをフィルターに固定した。次に、フィルターを２回５分間ずつ、１．５Ｍ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、３Ｍ　Ｎａ（Ｊで洗浄し、そして空気乾燥し、そして８０℃にて２時間乾燥した。

スクリーニングのためフィルターをこの例のセクションＢに記載したようにしてプレハイブリダイズせしめ、そしてγ３２ｐラベル化プローブにハイブリダイズせしめた。しかし、プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの両者を５０℃にて行った。プラスミドｐＰ１２及びｐＰ２８がプローブ陽性であることが決定され、そしてさらに特徴付けられた。

Ｄ、Ｇ−ＣＳＦＭＩ＾ＰａＣａ−２プラスＥｌ’ｃＤＮＡの配列決定クローニングし、そしてジデオキシ・チェイン−ターミネーション法を用いて配列決定した。

ｐＰ１２のＤＮＡ配列及び予想される蛋白質配列を第４図に示す。ｐ　Ｐ　１２中のｃＤＮＡ挿入部はポリ（ｄＧ）及びポリ（ｄＡ）テイルを除き１５１０塩基対の長さであり、これはＣＨＵ−２Ｃ−Ｃ５Ｆクローンより１１塩基対多い５′ 非翻訳配列を含有する。

ＨＩＡ　ＰａＣａ−２に由来するこのクローンとＮａｇａｔａ等のＣＨＵ　−２ｃＤＮＡクローンとの間の主たる差異は、第４図中に矢印により示されるＭ１八ＰａＣａ−２Ｇ−ＣＳＦ中のｃｙｓ−３５の直前にアミノ酸残基Ｖａｌ　−５ｅｒ−ＧｌｕをコードするであろうＣＩ（Ｕ−２クローン中の９塩基対挿入（ＧＴＣＡＴＧ（：ＡＣ）である。２つの他の差異が存在し、ＭＩＡ　ＰａＣａ　２クローン中の５８８位のＡ（ＣＩＩＵ−２クローンにおいてはＧ）はサイレントな第三塩基の変化であり、そしてＭＩＡ　ＰａＣａ−２クローン中の１２３７位のＴ（ＣＨｔｌ−２クローン中のＣ）は３′非翻訳領域にある。

Ｅ、ＣＯ５−７細Ｈ中で生産された。ＰＩ３及びｐ、Ｐ２８蛋白質の活性プラスミドｐＰ１２及びｐＰ２８をＣ５Ｃｊ！グラジエントを用いて精製し、そしてり〜ン酸カルシウム沈澱法の変法（Ｗａｎｇ、へ０Ｍ１等、５ｃｉｅｎｃｅ、　２２８　：　１４９（１９８５））を用いてＣＯＳ　−７ａｌ胞をトランスフェクトした。３日間のインキュベーションの後、上清を集めそして（、−ＣＳＦの生産を、前記の様に、コロニー形成ア・ンセイ及び骨髄増殖アッセイにおいてアツセイした。

ＣＳＦ活性をネズミ骨髄細胞増殖アッセイ及びコロニー形成アッセイの両方で測定した。コロニーアッセイのため、Ｂａ１ｂ／ｃマウスからの単核骨髄細胞１× １０５個を、５％の細胞上清、１５％のウシ胎児血清及び０．３％の寒天を含有するＲＰＭＩ　１６４０培地合計ＩＩＩＮ中で使用しな。４０個より多くの細胞のコロニーを７日後に計数し、そして個々のコロニーを細胞遠心分離（ｃｙｔｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｉｎｇ）　Ｌ、そして改変ライト（１’ｌｒｉεｈｔ）染色で染色することにより細胞タイプを決定した。

各ユニットのＣ３Ｆは１個のコロニーの形成を刺激する。対照のため、トランスフェクション段階を通して細胞をプラスミドに暴露しないことにより、同じ条件下でｃｏｓ−７，ｉ胞を偽（ｍｏｃｋ）　−トランスフェクトした。アッセイの結果を次の第１表に記載する。

トランスフェクトされたＣＯ５−７細　によるＣＳＦ活性の生産トランスフェクション　増殖（ｃｐ−）　コニッ）ｎ＋ｊ！　％にｌａｌ　％Ｃ１ｑ（ｂｌｐＰ１２　４５９５　＞２８０　５８　４２ｐＰ２８　６５９４　＞２８０　８３　１７Ｍｏｃｋ　６３３　０　０　０（、）−顆粒球のみを含有するコロニー。

（ｂ）−顆粒球及び単球の両者を含有するコロニー。

倒二二り旦ユ旦丈でｐ澄ＩＱためのＧａ５ＦのクローニンｊＡ、Ｇ−ＣＳＦ　１（７）ｍｌ：５’Ｈｉｎｄｌｌｌ　ＵＡＴＧ’：１−ドンノ挿入クローニングベクター及び発現ベクター中での（、−ＣＳＦ　ＤＮＡの操作を容易にするため、ｍＧ−ＣＳＦ中のアラニン（−１）をコードするＧＣＣコドンの３′側にＨｉｎｄ１１部位及びＡＴＧコドンを挿入することによりＧ−ＣＳＦ配列を変更した。

プラスミドｐＰ１．２をＢａｎＨＩエンドヌクレアーゼで消化し、そして消化物をＴｒｉｓ−アセテート中、０．５％低融点アガロースゲルで電気泳動した。Ｇ −ＣＳＦ　ＤＮＡ配列を担持する小断片バンドを、接着末端条件下でＴ４　ＤＮ＾リガーゼを用いてＢａｍＨＩ−消化Ｍ１３ｍｐ１９に連結した。連結の後、この混合物を用いてＥ。

コリＤＧ９８株、＾ＴＣＣｆｆｉ　３９，７６８を形質転換した。形質転換された細胞を０．３−イソプロビルチオガラクシド（ＩＰＴＣ）　（シグマ・ケミカルス；セントルイス、ＭＯから入手）及び０．３ｓＨＸ−ｇａｆの存在下ＤＧ９８のローン（ｌｏｗｎ）上にプレートし、そして３７℃にて増殖せしめた。α相補的白色プラークは液体培地中に増殖せず、そして培養物のサンプルを用いて複製形（ＲＥ）ＤＮＡを精製しな。ＢａｍＨＩ消化及び０．７％アガロースゲル上での断片のサイズ分離により挿入部の存在を確認した。予想される挿入部を有するファージをｐ＾３と命名しな。

次の配列：５’−にＴに　ＣＡＧ　ＧＡＡ　ＧＣＣＡＡＧ　ＣＴＴ　ＡＴＧ　ＡＣＣＣＣＣＣＴＧ　ＧＧＣ−３’を有する化合的に合成され精製されな３３−ｍｅｒオリゴデオキシリボヌクレオチドを用いる部位特定変異誘発により、１鵡−ＣＳＦ配列のＮ−末端スレオニンをコードするコドンに隣接して且つそれとフレームを合わせて、（ニー　ＣＳＦ配列中に旧ｎｄｌＪ部位及びＡＴＧ開始コドンを置いた。

ＡＴＧコドンのすぐ上流のＨｉｎｄ１１部位は、その後の操作におけるｔｍＧ− ＣＳＦ−コードＤＮＡ配列の便利なりローニングを可能にする。８５℃にて５分間、次に４５℃にて２０分間加熱することにより、約１３μりの１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７，４）、９０ｍＭＮａｃｅ、１０ｍＭ　ＨｇＣｌ２中で１０ｐｍｏｌｅ（ｐＨ）の３３−ｍｅｒをｐ＾３がらの約１ｐＮの単鎖ＤＮＡにハイブリダイズせしめた。アニールした混合物を氷上で冷却し、そして１０ｍＭへのジチオスレイトール、０．５１１ＩＭへの各ｄＸＴＰ及び５ユニツトのＤＮＡポリメラーゼＩ　Ｋｌｅｎｏｗ断片を添加することにより１８μｌに調整した。反応混合物を氷上で２０分間インキュベートし、次に室温で１時間インキュベートした。

次に、この修復反応混合物を用いて上記のＥ、コリＤＧ９８を形質転換し、寒天プレート上にプレートし、そして−夜インキユベートしてファージプラークを得た。

プラークをニトロセルロース円形Ｐ紙を用いてプロットし、そしてフィルターを前記のように処理して細胞を溶解し、ＤＮＡを変性し、中和し、すすぎ、ＤＮＡをフィルターに固定し、そしてプレハイブリダイゼーションＷ衝液中でインキュベートする。３３−ｍｅｒオリゴヌクレオチドを、ポリヌクレオチドキナーゼを用いてγｊ２ｐによりラベルし、そして４５℃にて一夜、フィルターにハイブリダイズせしめる。フィルターを洗浄し、そしてオートラジオグラフィーにかける。プローブ陽性のクローンを液体培地中で増殖せしめ、そしてＢａｍＨＩ　、旧ｎｄＩ［［消化及びアガロースゲルサイズ決定により特徴付け、予想される断片の存在を確認する。望ましい挿入部を有する１つのクローンをｐＡｐｏｏＬと命名した。ｐＡｐｏｏＬをＢ　ａ　ｍ　ｔｌＩ及びＨｉｎｄＩＩ［により消化した。約１５００塩基対のＢａｍＨＩ　Ｈｉｎｄ■断片を単離し、精製し、そして所望のプロモーター及びターミネータ−配列を有するプラスミドへの連結のために保持した。

Ｂ、工ｒ制御ｌ＼のＧ　−ＣＳＦコード　列の設置−に　−ＣＳＦコード配列をＴｒｐ制御のもと及びＢＴポジティブ・レトロレキュレトリー・エレメント（ＰＲＥ）のちとに置くため、Ｇ−ＣＳＦコード配列をプラスミドｐＡＷ７０３にクローン化した。

ｐＡＷ７０３は、ヒト腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）をコードする遺伝子を含有する旧旦ｄ■−ＢａｍＨ１断片作用可能に連結されたＴｒｐプロモーター及びＰＲＥを有するプロモーターである。

断片をＴＮＦＵｒ片の代りに連結する。

次に、ｐｌＶ７０３の作製、及びこのプラスミドへのＧ　−ＣＳＦのクローニングによるｐＰＤｌの作製を記載する。ｐＴｒｐ３を用いる他の作製も記載する。

Ｂ、１．妨肛吋＠傷にプラスミドｐＡＷ７０３を、プラスミドｌ）Ａ冒７０１及びＩ）八Ｗ７１１から次の様にして作製した。ＰＲＥをコードする４００ｂｐＢａｍＨｒ一旦１」断片を含有するプラスミドｐＡＷ７１１をエンドヌクレアーゼ影桂■及びｂ＾ＩＩＩにより供給者により示唆された条件下で消化してＰＲＥを含有する約４００ｂｐの断片を得た。消化物を１％アガロース調製用ゲルに負荷し、そしてＰＲＥを含有すプラスミドｐＡ１４７０１を使用して、遺伝子の発現を制御するためのＴｒｐ制御配列を得た。

ｐＴｒｐ３をＢａｍＨｌ及びＨｉｎｄｌｌｌエンドヌクレアーゼで消化し、そして大ＨｉｒＨｄＩ［Ｉ　−Ｂａｍｌｌ　ｌ断片をＴＮＦ遺伝子を担持する旧ｎｄｍ−ＢａＪＩ断片と連結することにより、プラスミドｐＴｒｐ３の誘導体であるｐＡＷ７０１を調製しな。ｐＡＷ７０３０作製においては、ｐＡＷ７０１をＢａｍＨＩ及び５ａｉｌエンドヌクレアーゼにより消化した。Ｔｒｐプロモーター旧旦ｄ１部位及びＴＮＦ配列を含有するｐｌＶ７０１の大ＢａｍＨｌ−Σ１１断片を分取用アガロースゲルから電気溶出により単離し、そして接着末端条件下でＴ４　ＤＮ＾リガーゼを用いて小ＢａｍＨｉ　５ａｉｌ断片に連結してｐへＷ７０３を作製した。

−ＢａｍＨＩ断片をゲル単離し、そしてＴ４　ＤＮＮツリガーゼ用いてｐ静７０３消化物と連結した。

連結混合物を用いてコンピテントＥ、コリＭＭ　２９４株を形質転換した。形質転換体をアンピシリン耐性についてスクリーニングした。多数のアンピシリン耐性コロニーからプラスミズ標準と共に１．５％アガロースゲル上を泳動せしめた。予想通りのサイズの断片を有する１つのクローンをｐＰＤｌと命名した。

Ｂ、２．　エユ１Ｊじ優−行。

ｐＴｒｐ３はＨｉｎｄ　ＩＩＩのすぐ５′側にＴｒｐプロモーター及びＲＢＳを含有する宿主発現ベクターであり、従って開始コドンのすぐ５′側に旧旦ｄＩ１１部位を有するコード配列をＴｒｐプロモーターの制御のもとに挿入することを可能にする。ｐＴｒｐの骨格ベクターはｐＢＲ３２２である。ｐＴｒｐ３は１９８４年１２月１８日に、＾ｍｅ−ｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、１２３０１．　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ。

Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＨＤに、寄託番号３９，９４６として寄託されている。

Ｂ　、　２　、Ａ、　、　ｐＴｒｐ３の１ｌＨｉｎｄ１１部位の後にＴｒｐ制御配列を含有する宿主ベクターを作製するため、スタッフォード大学Ｃ，Ｙａｎｏｆｓｋｙから得たｐＶＨ１５３からアテヌエーターを欠（Ｔｒｐプロモーター／オペレーター／リボゾーム結合部位配列を得た。Ｔｒｐ配列は当業界において知られている種々のこの様なプラスミドにおいて入手可能である。ｐ　Ｖ　Ｈ］、、　５３をＨｈａｌ（これは、Ｔｒｐプロモーターのちょうど５′側の露出された３′接着末端を残して切断する）で処理し、Ｋｌｅｎｏｗにより平滑末端化し、そしてｎｌにより部分消化する。ＴｒｐリーダーのＡＴＧ開始コドンに先行する６ヌクレオチドであるＴａｑ１部位における制限に対応する９９ｂｐ断片を単薙し、そして次にむ旦Ｒ１（修復）／Ｃ１ａＩ消化されたｐＢＲ３２２に連結してｐＴｒｐ３を得る。

改良された形のｐＴｒｐ３はさらに、後に記載する発現されるべきコード配列の下流のベクター中の位置にポジティブ・レトロレギラトリー配列を含む。

ｐＡＷ７０３と同じ制御配列を有する（ニー　ＣＳＦのための発現ベクターを、ｐＴｒｐ３（ΔＴＣＣ３９，９４０）及びｐＡＷ７１１（＾ＴＣＣ３９，９１８）及びｐＰ１２から直接次の様にして作ることができる。

ｐＴｒｐ３を旧旦ｃｌｌｌ及び心±１により消化する。大旧旦ｄｌ−ＳａｌＩ断片を分収用ゲルからの電気溶出により単離する。

ＰＲＥを含有する小ｈΔ（Ｉ−８ａ、ＩＩｌ断片前記の様にしてｐＡ１１Ｉ７１１から単離し、そして接着末端条件下でＴ４　ＤＮΔリガーゼを用いてｐＴｒｐ３の大胆ｎｄ［［−３ａｌ　ｌ断片に連結する。ｐＰＤｌはまた、ｐＰ１２のＢａｍＨ１−ｔｌｉｎｄＩＩＩ断片をｐＴｒｐ３及びｐＡＷ７１１からの前記断片と混合し、そして接着末端条件下でＴ４　ＤＮΔリガーゼを用いて連結する。

Ｃ，Ｇ−Ｃ３ＦＩ晴’Ｐ、＋ｈＭ皿灼工捉さＣ’）Ｂａす」亙里厘亘凶設賀−ｐへ３中のＧ−ＣＳＦをコードするＤＮＡ配列はＧ　−ＣＳＦ配列中の翻訳終止コードＴＧＡの３′側の転写はされるがしかし翻訳されない領域に約９３０ヌクレオチドを含有していた。これらの非翻訳コドンを除去し、そして転写停止及びｍＲＮＡの安定性をポジティブ・レトロレギュラトリー要素の影響下におくため、部位特定変異誘発により１３ａｍＨ１部位をＧ−ＣＳＦ翻訳終止シグナルのすぐ３′側に設置した。

次の配列：ＣＣＣＡＣＣＣＣＴ　ＧＡＧ　ＧＡＴ　ＣＣΔ　ＡＣＣＣＣＴ　ＣＣＣを有する２７−ｍｅｒデオキシリボヌクレオチドを市販のＤＮＡ合成機を用いて化学合成し、そして精製した。

約１０ｐＨの２７−　ｍｅｒをｐｐ＾３からの約１ｐＨの単鎖ＤＮＡに、約１３ μ！の１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐｉ１７．４＞、９０ｍＭ　ＨｇＣｌ２．１０ｍＭ　ＨｇＣｌ２中で、８５℃にて５分間、次に４５℃にて２０分間加熱することによりハイブリダイズせしめた。アニールした混合物を氷上で冷却し、そして１０ｍＭへのジチオスレイトール、０．５ｍＭへの各ｄＸＴＰ、及び５ユニツトのＤＮＡポリメラーゼＴ　Ｋｌｅｎｏｔｍ断片の添加により１８μｌに調整した。反応混合物を氷上で２０分間インキュベートし、次に室温にて約１時間インキュベートした。

次に、この反応混合物を用いてＥ、コリＤＧ９８株を形質転換し、寒天プレート上にプレートし、そして−夜インキユベートしてファージプラークを得た。円形ニトロセルロースフィルターを用いてプラークをプロットし、そしてフィルターを前記の様にして処理して細胞を溶解し、ＤＮＡを変性し、中和し、すすぎ、ＤＮＡをフィルターに固定し、そしてプレハイブリダイゼーション緩衝液中でインキュベートした。２７−Ｎｅｒオリゴヌクレオチドを、ポリヌタレオチドを用いて３２γ−リン酸により末端ラベルし、そして４５℃にて一夜フイルターにハイブリダイズせしめた。フィルターを洗浄し、そしてオートラジオグラフィーにかけた。プローブ陽性プラークの１つをｐＢｐｏｏｌと命名した。

ｐＢｐｏｏｌを液体培養で増殖せしめ、そしてｍＩ及びＢａＪ　！エンドヌクレアーゼにより、製造者により特定された条件下で消化した。Ｇ　−ＣＳＦのコード配列は内部ｍＩ部位を有する。

この消化は、ｍｌ；　−ＣＳＦ遺伝子の翻訳終止コドンのすぐ３′側の新たに転換された石ＨＩ末端を有する約５４０塩基対のＮ四Ｉ−石ＩＩＩ断片を生じさせる。

プラスミドｐＰＤ１をまた供給者により示唆された条件下でＡ、ｐａｌ及びＢａｍＨＩにより消化しな。この消化は、Ａｐａ’１部位が前記のものと同じでありそしてｈ見８１部位がＧ　−ＣＳＦ遺伝子の非翻訳領域の３′にあるＮ肚１−　ＢａｍＨＩ断片を生じさせた。

２つの消化物を、消化されたｐＢｐｏｏｌ対ｐＰＤ］のモル過剰において混合し、そして接着末端条件下でＴ４　ＤＮ＾リガーゼを用いて連結した。連結混合物をＥ、コリＭ８２９４株に形質転換した。

形質転換体をアンピシリン耐性についてスクリーニングした。

幾つかのコロニーを単離し、そしてＨｉｎｄｌｌ及びＢａｍ）Ｉ　Ｉにより消化した。正しい長さのＨｉｎｄｌＩＩ　ＢａｍＨＩ挿入部を有するコロニーをｐＰＤ２と命名した。

Ｄ、ＰＩＩ　へのｍＧ　−ＣＳＦの装置プラスミドｐＬＡＰＨβは＾ｐｈβ遺伝子の発現を制御するＰＬプロモーター及び遺伝子Ｎ−ＲＢＳを有するプラスミドである。

このプラスミドはさらに＾ｐｈβ遺伝子への３′側にポジティブ・レギュラトリー・エレメントを含有し、このＰＲＥのすぐ５′側にＢａｍＨｌを有する。プラスミドｐＬ＾ｐｈβはプラスミドｐＦＣ５４，Ｔ（＾ＴＣＣ寛３９，７３９＞から作られた。プラスミドｐＬＡＰ）１３次の点を除きｐＦＣ５４，７と正確に同一である。すなわち、後者はＡｐｈβコード断片の代りにｄｅｓ−ａｌａｎｙｌ −ＩＬ−２をコードする旧ｎｄ　ｍ　−Ｂａｗｌ　Ｉ断片を有する。従って、Ｇ　−ＣＳＦの発現を温度感受性ＰＬプロモーターー遺伝子Ｎ−ＲＢＳ及びＰＲＥの制御のもとに置くためにｐＦＣ５４，７を用いて次の段階を行うことができる。ＡＴＧ開女台コドンを有するｐＰＤ２の辻ｉｎｄ　Ｉ［［−Ｂａｍ１ｔ　Ｉ断片を次のようにしてＰＬプロモーターの制御下及びＰＲＥの影響下においた。

プラスミドｐＬＡＰＨβ　をＨｉｎｄｌｌ及びＢａｍＨｆにより供給者により示唆された条件下で消化した。プラスミドｐＰＤ２を同じエンドヌクレアーゼにより消化した。ｐＰＤ２消化物：　ｐＬＡＰＨβ消化物が１０：１のモル比になるように消化物を混合しそしてＴ４１）Ｎへリガーゼにより連結した。

連結の後、連結混合物を用いてコンピテントＥ、コリ宿主株λＮＤに　９５を形質転換した。アンピシリン耐性コロニーを選択し、そしてそれらからプラスミドを単離し、匹見）ＩＩ及びＨｉｎｄｌ［で消化し、そして約５４０ｂｐの予想通りの挿入部を有する形質転換体をｐＪＤｌと命名した。

匠−１ＰＯ２びＪＤＩ中のｍＧ　−ＣＳＦのＡ、形　転換されなＥ、コリ８８２９４株中のｐＰＤ２　び多　転れたＥ、コ１ λＨＤ（：９５　ＪＤＩの　び；２種類の異る発現ベクターを使用してｍＧ−ＣＳＦを生産する最初の試みは不成功であった。第一のベクターｐＪＤ１　（第５図）は、バクテリオファージλＰＬプロモーター及びλ遺伝子Ｎ−ＲＢＳの制御下にある成熟ｍＧ　−ＣＳＦ蛋白質をコードするＤＮＡから成っている。バシルス・チューリンジエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓ）ポジティブ・レトロレギュレート・ニレメン）　（ＰＲＥ）が１ｌｌＧ−ＣＳＦコード領域のすぐ下流にある。さらに、Ｃａｌ　Ｅｌ由来の複製開始点は温度感受性Ｃｏｐ−表現型を付与する変異を含有していた。ｐ、ＴＤｌを担持するＥ、コリＤに９５λ株（λＮ７Ｎｚ：＋Ｃ１８３７ｓｕｓＰ８０＞細胞を３０℃にて、６００μｍで０．３の光学濃度に増殖せしめた０次に、温度を３時間にわたって４２℃に変えることによりＰＬプロモーター及びプラスミドの複製を誘導しな。

第二のベクターｐＰＤ２はＥ３コリＴｒｐプロモーターの制御のもとにｍＧ−ＣＳＦ蛋白質をコードするＤＮＡから成っている。

バシルス・チューリンジエンシスのポジティブ・レトロレギュレート・エレメントはｍＧ−ＣＳＦコード領域のすぐ下流にある。Ｅ、コリ８８２９４株の細胞を、１００μｇ／ｍｆのＴｒｐ及び５０μ８／ｌ１１ｅのアンピシリンを加えたＭ９培地中で一夜増加せしめた。朝に、細胞をＭ９培地で２回洗浄し、次に培養物を、Ｔｒｐを含有しないＭ９培地中に６００μｍにおいて０，０５の光学濃度となるように調整することによりＴｒｐプロモーターを誘導した。細胞を、３７℃ において、６００ｒ＋ｍで０．８の光学濃度に増殖せしめた。

ｐＪＤｌ及びｐＰＤ２の誘導の後、誘導された細胞及び未誘導細胞の抽出物を次の様にして調製した。すなわち、細胞を、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ＞及び２−メルカプトエタノール＜２ＭＥ）を含有するｌａｅｍｍ　ｌ　ｉローディング緩衝液（Ｌａｅｍｍ　ｌ　ｉ　。

Ｎａｔｕｒｅ、　２２７　：　６８０−６８５（１９７０））中で５分間煮沸した。ＳＤＳ及び２ＭＥを含有する１２．５％ポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）による電気泳動、及びクマッシー・ブリリアント・ブルーによる染色の後、ｍＧ　−ＣＳＦに対応する分子量の誘導された蛋白質のバンドを検出することができなかった。

Ｂ、ｐＪＤｌ　びＰＯ２を担持する細　の誘導ｔの、字状１ｍＧ−Ｃ９ＦｐＪＤ１及びｐＰＤ２を担持する細胞中のＣ，−ＣＳＦ転写物の定常レベルを決定するため、次の様にしてＲＮＡを調製した。２０社の誘導された細胞、及び誘導されていない細胞を２０ｍ１の水冷リン酸緩衝化塩溶液と混合した。４℃での遠心により細胞をベレット化し、そして３＋ｏＮの０．１５Ｍシュークロース−２０ｍＭ酢酸ナトリウム中に再懸濁した。０．３ｍｌの２０Ｂ／ｖａｌのリゾチーム溶液を加え、そして混ｉｔｂを氷上でインキュベートした。０．１５ｍｆ’の２０％ＳＤＳを添加し、そして混合物を等容旦のフェノール／クロロホルム＜１：１）により、界面がきれいになるまで（約４回）抽出した。２回のエタノール沈澱の後、核酸混合物を１００ｕ　１の２０ｍｔ４　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７，５）　１０ｍＭ　Ｍｇｃ１２中に再懸濁した。ＲＮａｓｅ不含有ＲＮａｓｅ　Ｉの１ｎ＋Ｂ／ｍｌ溶液２）、ｔｅを添加し、そして混合物を３７℃にて１０分間インキュベートした。５μりの２０％ＳＤＳを添加し、そして次にサンプルをフェノール／クロロホルム（１：　１）により２回抽出し、そしてエタノール沈澱を２回行った。

報告されている方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ等、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ！ｏｎｉｎ　：　Ａ−ｉあ江１旦ｙ　Ｍａｎｕａｌ、コールド・スプリング・ハーバ−１Ｎ、　Ｙ、（１９８２））の変法を用いて記載するようにしてナサンブロッティング分析を行った。要約すれば、０．５Ｍホルムアルデヒドを含有する１％アガロールゲルによるＲＮＡの電気泳動及びそれに続くニトロセルロースフィルターへのプロッティングによりササンプロットを調製した。８０℃にて１．５時間フィルターを乾熱した後、これらを４５℃にて１時間、５×５ＳＣ１０，２％ポリビニルピロリドン、０．２％フィコール、０．２％ウシ血清アルブミン、０．１％ＳＤＳ、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７，０）及び１００μｇｌｎｎｔＲＮＡ中でプレハイブリダイズせしめた。ブロッ１〜を４５℃にて１６時間、さらに硫酸デキス１〜ラン（１０％）及び１０６ｃｐｎ／ｍ１のｍｃ−ＣＳＦ特異的オリゴヌクレオチド５　’−ＣＧＣＴＧＣＧＣＣＡＴＣＧＣＣＣＴＧ（１，ＡＴＣＴＴ　−３’（γ３２Ｐ−ΔＴＰ及びポリヌクレオチドキナーゼによりラベルされているもの）を含有する同様の溶液中でハイブリダイズせしめた。

第１０図は、ｐＪＤｌを担持する誘導された細胞が予想通りのサイズのｍＧ−ＣＳＦ及びより小さいｍＧ−ＣＳＦ関連ｍ　ＲＮ　Ａを含有しており、他方ｐＰＤ２を担持する細胞は検出可能なｍＧ−ＣＳＦｍＲＮ＾を含有していないことを示す。

次の配列：＾＝５′−八ＧＣＴへΔＴ　Ｇ　Ａ　ＣＡ　ＣＣへＴＴＡＧＧΔＣ−３′Ｂ＝５ ’−ＴへへＴにＧＴＧＴＣＡＴ＾−３′を有する２種類のオリゴデオキシヌクレオチドを化学合成し、そして精製した。

ｐＪＤＩのＤＮＡを制限酵素ヒエｄｌｌ及びＡｐａｉで消化し、そして電気泳動の後、大断片をＴｒｉｓ−アセテ−１−１０，５％低融点アガロースゲル（Ｃｒｅａｓｅ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　１０し７８（１９８３）　）から単離した。この断片を２Ｑｐｍｏｌｅの上記２種類のオリゴヌクレオチ１ごと混合した。この混合物をＴ４　ＤＮ＾リガーゼを用いて連結＋、、そしてＥ、コリＤＧ９５株のコンピテント細胞を形質転換するｆニゲ）に用いた。アンピシリンを含有する寒天プレート上に細胞をプレートし、そして組換プラスミド（ｐＪＤ４＾及びｐＪＤ４Ｂ＞を含有するコロニーを、γ”Ｐ−ＡＴＰ及びポリヌクレオチドキナーゼによりラベルされたオリゴヌクレオチドＡを用いるコロニーハイブリダイゼーション（Ｍａｎｉａｔｉｓ等、前掲）により同定した。第１１１１］に示すように、ｐＪＤ４＾及びｐＪＤ４ＢはいずれもｐＪＤｌと同じ蛋白質をコードするが、ｐＪＤ４＾及びｐＪＤ４Ｂのコドン２，３及び４はｐＪＤｌに使用されているそれと異る。さらに、ｐＪＤ４Ｂ中のコドン５はｐＪＤＩと異る。　ｐＪＤ４＾とｐＪＤ４Ｂとの間のこの相違は、Ａμｍ部位に連結されたオリゴマーデュプレックスの末端が酵素Ａｗｌにより生ずる単鎖末端に対して１個のミスマツチを含有していたことによる。

このタイプのミスマツチは連結を妨害しないであろうが（Ｈｕｎｇ及びＷｅｎｓｉｎｋ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　１２　：　１８６３−１８７４（１９８４））　、Ｌかしながら、このミスマツチの修復に依存して、得られるクローンの幾つかはＡｐａＪを再生しそしてｐＪＤｌ一様第五コトンを有し、そして幾つかはｐＪＤ４Ｂ一様第五コトンを有するてあろう。ｐＪ　Ｄ　４＾及びｐＪＤ４Ｂの構成はＤＮＡ配列分析により確認された。

Ｂ、ｐＪＤ４人文囚閥Ｄ　４　Ｂによる＋ｎＧ−ＣＳＦ蛋白−の　−ｐＪＤ４＾又はｐＪＤ４Ｂのいずれかを担持するＥ、コリを例■においてｐＪＤｌについて記載したようにして誘導し、そしてＳＯＳ　−ＰＡＧＥにより分析した。第１２図は、ｍＧ　−ＣＳＦの分子量に相当する分子量を有する誘導性蛋白質が、ｐＪＤ４＾又はｐＪＤ４Ｂを担持するＥ、コリ細胞中に存在することを示している。

Ｃ，アミノメチオニ４さブチダーゼでびヤシ４グ濠れ得句ＨＧ　−ＣＳＦのアミノ末端をコードする取り替えられたコドＺ玉〕「たゑｔ上ご￥２−ターの作」（次の配列：Ｃ：　５′＾ＧＣＴＴＡＴＧＣＣＡＴＴＡＧＧＡＣ３′Ｄ：　３′　＾ＴＡＣＧＧＴ八八Ｔ　へへ５”を有する２種類のオリゴヌクレオチドを化学合成しそして精製した。

プラスミドｐＪＤ１のＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄｌＩ［及びΔμ弓で消化し、そしてＩＶ、＾、において前記したようにして大断片を単離した。２０μＨずつのオリゴヌクレオチドＣ及びＤを該大断片と混合し、接着末端条件下でＴ４　ＤＮ＾リガーゼにより連結し、そして連結混合物を使用してコンピテントＥ、コリＤ（：９５株を形質転換する。アンピシリンを含有する寒天上に細胞をプレートし、そしてポリヌクレオチドキナーゼを用いてγ３２Ｐ−＾ＴＰでラベルされたオリゴヌクレオチドＣとのハイブリダイゼーションにより、組換プラスミドを含有するＡｍｐ耐性コロニーを同定した。プローブ陽性コロニーから得られたプラスミドなｐ　Ｊ　Ｄ　６と命名した。これはｔｈｒ＋が除去されたＣ、ＣＳＦ種、すなわち、　−ｍＧ−Ｃ３Ｆを含有していた。ジデオキシ配列決定により正しい配列を確認した。

Ｄ４ＰＤ６によるｍ（ニーＣＳＦ蛋白質の例■、においてｐＪＤｌについて記載したようにしてｐＰＤ６を担持するＥ、コリＤＧ９５を誘導し、そして分析しな。

第１５図は、ｐＰＤ６及びｐＪＤ５を有するＥ、コリにより生産された蛋白質の５ＤＳ−ＰＡ（：Ｅゲルの写真である。細胞が明瞭に示すところによれば、ｐＪＤ５により生産される１４Ｇ　−ＣＳＦよりもわずかに小さい分子量の誘導性蛋白質をｐＰＤ６が生産する。

ｐＰＤ６の大規模誘導からｐＰＤ６により生産された蛋白質バンドを単離しそして精製した。精製された蛋白質を自動アミノ酸シーケンサ−を用いて配列決定し、これはこの蛋白質のＮ１１２−末端がｍｅｔ又はｔ　ｈ　ｒではな（ｐｒｏであることを示した。

久二α色艷ｐＪＤ４＾からのＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎｄ■及びＢａｍＨＩにより消化した。

ｍＧ−ＣＳＦのコード領域を含有する小断片をＴｒｉｓ−アセテート、０．５％低融点アガロースゲルから単離した。　ｐＰＤＺからのＤＮＡを制限酵素上ｎｄＩＩＩ及び陰二）Ｉ！で消化し、そしてＴｒｉｓ−アセテート、０．５％低融点アガロースゲルから大断片を単離した。これら２つの断片をＴ４　ＤＮ＾リガーゼを用いて一緒に連結し、そしてコンピテントＥ、コリ聞２９４株を形質転換するために使用した。組換体を含有するアンピシリン耐性コロニーを拾い、そして構成物をＤＮＡ配列分析により確認した。得られるプラスミドをｐＰＤ５と命名した。

１３、ｐＰＤ５における一〇−ＣＳＦの発現先行例においてｐＰＤＺについて記載した様にして、ｐＰＤ５を担持するＥ、コリを誘導しそして５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。

第１３図は、ｐＰＤ５を担持するＥ、コリ細胞中にｍＧ−ＣＳＦの分子量に相当する分子量の誘導性蛋白質が存在することを示し峡臥例淀這゛１、レベルのｐＰＤ２又はｐＰＤ５のいずれかを有する誘導された細胞中のｍＧ　−ＣＳＦ　ｍＲＮ＾の定常状態レベルを前記のようにしてナサン分析により比較しな。第１４図は、ｐＰｌ）５を有する誘導された細胞は予想されるサイズのｍＧ−ＣＳＦ転写物を含有するが、ｐＰＤ２を有する誘導された細胞においてはｍＧ−ＣＳＦ転写物゛が検出されなかったことを示している。

下記のプラスミドがΔｍｅｒｉｃａ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ。

Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＨＤ、米国、に寄託されている。

Ａプヌま」−一旦」１−　ｉ比１ｉｐ、ＪＤ４＾　Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　ＤＧ９５λ　８／１２／８６　６７．１８１ｐＪＤ４Ｂ　Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　ＤＧ９５λ　８／１２／８６　６７．１８３ｐＰＤ５＾　Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　Ｎ８２９４　８／１２／８６　６７．１８２ｐＡＪＩ　Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　ＤＧ９５λ　１１／８／８４　３９．９１８ｐＴｒｐ３　Ｅ、ｃｏｌｉ　ＭＣ１００Ｏ１２／　１８／８４　３９．９４６ｐＦＣ５４，ｔ　Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｄ（：９５λ　８／７／８４　３９．７８９これらの寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約及びその規則（ブダペスト条約）の規定のもとに行われた。これは寄託の日から３０年間にわたる生存培養物の維持を保証する。寄託物はブダペスト条約の規定のもとで、及び関連する米国特許の発効の後の永久且つ無制限の入手可能性を保証する出願人と＾ＴＣＣとの間の契約に従って＾ＴＣＣにより入手可能にされるであろう。承継人はここに、適当な条件下で培養された場合に寄託中の培養物が死滅し、失われ又は破壊された場合に、通知の俊速やかにそれが同一培養物の生存標品と置き換えられることを承認する。寄託物の入手可能性は、いずれかの国の権威のもとにその特許法に従って認められた権利に反して発明を実施することの許諾として理解されるべきではない。

この発明の範囲は、この明細書に記載された例示的態様により限定されるものと解されるべきではなく、添付された請求の範囲に従って決定されるべきである。

本発明者はＧ−ＣＳＦ及びその効率的発現のための手段を開示した。請求の範囲に記載された発明の本質から逸脱することなく、当業者は本発明の範囲内において変更を行うことができよう。

ＣＰＭＸ　１０−３ Φ　虐 −口＞　ｃｐｍ　ｘ　１０−３ＭＥＴ　Ｔ）３Ｐ、ＰＲＯＬＥＤ　ＧＬＹＧ−Ｃ５Ｆ　ＡＴＧ　ＡＣＣＣＣＣＣＴＧ　ＧＧＣＦＩＧ、Ｉｆ非誘誘ＤＧ９５　ＰＪＤ４Ａ　ＰＪＤ４ＢＦＩＧ、Ｉ２国際調査報告ＩＭＩＩ−＋８１１６ＭＩ　ＡＤＩＭｌｌＩ＋　ＮＩ　ＰＣＴ／ＩＪｓ　８７／Ｑ１ｇ９９Ａ−’ＪＮＥＸ　Ｔｏ　ＴＨＥ　工ＮτＥＲＮＡ丁１ＯＮＡＬ　ＳＥＡ、ＲＣＨＲ三ＰＯＲＴ　ＯＮ第１１頁の続き ■Ｉｎｔ、ＣＩ、’　識別記号　庁内整理番号優先権主張　■１９８岬１１月１８日［相］米国（ＵＳ）［有］９３２，０３７０発　明　者　カワサキ、アーニスト　ニス、　アメ１マテン０発　明　者　ウオーレン、メリー　キム　アメ１ジヨーツカ合衆国、カリフォルニア　９４８０４．　リッチモンド、サンｒ　ストリート　２６０ツカ合衆国、カリフォルニア　９４５７７、サン　リーンドロー。

／フィン　アベニュ　４８６

Claims

【特許請求の範囲】

１．Ｇ−ＣＳＦをコードする変更されたＤＮＡ配列であって、該Ｇ−ＣＳＦは適切な種の骨髄細胞前駆体を用いるコロニー形成アッセイにおいて一次顆粒球又は顆粒球−マクロファージコロニーの生成を促進する効果を有し、前記ＤＮＡ配列においてその５′領域が少なくとも１個のコドンの第三位のデオキシリボグアニン又はデオキシリボシトシンに代ってデオキシリボアデニンを含有し、この変化がＧ−ＣＳＦのアミノ酸配列を変化せしめない、前記変更されたＤＮＡ配列。
２．前記５′領域がアミノ酸配列Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ又はＴｈｒＰｒｏ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　ＰｒｏをコードするＤＮＡ配列を含んで成る、請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ配列。
３．少なくとも３個のコドンが前記置換を有する、請求の範囲第２項に記載のＤＮＡ配列。
４．さらに、少なくとも１個のコドンの第１位のデオキシリボシトシンの代りにデオキシリボチミジンを含んで成る請求項１，２又は３に記載の方法。
５．成熟Ｇ−ＣＳＦをコードする変更されたＤＮＡ配列であって、その５′領域が、ＡＣＡ　ＣＣＡ　ＴＴＡ　ＣＣＡ　ＡＣＡ　ＣＣＡ　ＴＴＡ　ＡＴＣＡＣＡ　ＣＣＡ　ＴＴＡ　ＣＣＡ、及びＡＴＣ　ＡＣＡ　ＣＣＡ　ＴＴＡから成る群から選択されたコドンを含んで成る、前記変更されたＤＮＡ配列。
６．Ｇ−ＣＳＦのミューテインをコードする変更されたＤＮＡ配列であって、該Ｇ−ＣＳＦのミューテインは適切な種の骨髄細胞前駆体を用いるコロニー形成アッセイにおいて一次顆粒球又は顆粒球−マクロファージコロニーの生成を促進する効果を有し、そして該ミューテインは組換宿主から生産される場合ＮＨ２−末端メチオニンを有しない、前記変更されたＤＮＡ配列。
７．前記ミューテインのＨＨ２−末端がｍｅｔアミノペプチダーゼによりプロセシングされる配列をコードする、請求の範囲６に記載のＧ−ＣＳＦのミューテインをコードする変更されたＤＮＡ配列。
８．前記ＤＮＡ配列がｍｅｔ−ａｌａ、ｍｅｔ−ｇｌｙ、ｍｅｔ−ｐｒｏ、ｍｅｔ−ａｌａ−ｍｅｔ、ｍｅｔ−ｇｌｙ−ｍｅｔ、ｍｅｔ−ａｌａ−ｓｅｒ、ｍｅｔ−ａｌａ−ｐｒｏ、ｍｅｔ−ｐｒｏ−ｔｈｒ、及びｍｅｔ−ｐｒｏ−ｌｅｕから成る群から選択されたアミノ末端をコードする、請求の範囲第７項に記載のＧ −ＣＳＦのミューテインをコードする変更されたＤＮＡ配列。
９．プロモーター及びリボゾーム結合部位と作用可能に連結されている請求の範囲第１項〜第８項のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列を含んで成る発現ベクター。
１０．ＰＬプロモーター及びこれと作用可能に連結されたリボゾーム結合部位、並びにＴｒｐプロモーター−リボゾーム結合部位から成る群から選択されたプロモーター−リボゾーム結合部位と作用可能に連結されている請求の範囲第９項に記載の発現ベクター。
１１．請求の範囲第９項に記載の発現ベクターにより形質転換されたＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）。
１２．全細胞蛋白質の少なくとも約３％〜約１０％のＧ−ＣＳＦ含量を有する、請求の範囲第１０項に記載の発現ベクターにより形質転換されたＥ．コリの培養物。
１３．ヒト組換Ｇ−ＣＳＦ。
１４．ヒトＧ−ＣＳＦをコードする、ヒト細胞から単離されたｍＲＮＡ画分。
１５．ｐＪＤ４又はｐＬＤ５を含んで成る請求の範囲第１０項に記載の発現ベクター。
１６．対応する種の骨髄細胞前駆体を用いるコロニー形成アッセイにおいて一次顆粒球又は顆粒球−マクロファージコロニーの生成を促進する効果を有し、ＮＨ２−末端メチオニンを有しないＧ−ＣＳＦミューテイン。
１７．前記ミューテインのＮＨ２−末端が組換宿主においてｍｅｔアミノペプチダーゼによりプロセシングされるアミノ酸配列を有する、請求の範囲第１６項に記載のミューテイン。
１８．前記アミノ末端が【配列があります】及びｍｅｔ−ｐｒｏ−ｌｅｕから成る群から選択されたものである、請求の範囲第１７項に記載のＧ−ＣＳＦのミューテイン。
１９．組換宿主において発現された場合にに１−ｍＧ−ＣＳＦをもたらす、請求の範囲第１８項に記載のＧ−ＣＳＦのミューテイン。
２０．ａｌａ１−ｍＧ−ＣＳＦ、ｇｌｙ１−ｍＧ−ＣＳＦ、ｐｒｏ１−ｍＧ−ＣＳＦ、ｐｒｏ１−ｔｈｒ２−ｍＧ−ＣＳＦ、ａｌａ１−ｍｅｔ２−ｍＧ−ＣＳＦ、ｇｌｙ１−ｍｅｔ２−ｍＧ−ＣＳＦ，ａｌａ１−ｓｅｒ２−ｍＧ−ＣＳＦ，ａｌａ１−ｐｒｏ２−ｍＧ−ＣＳＦ，ｐｒｏ１−ｌｅｕ２−ｍＧ−ＣＳＦ，及び１ −ｍＧ−ＣＳＦから成る群から選択されたｍＧ−ＣＳＦ。
２１．１−ｍＧ−ＣＳＦ。