CN1058292C - 一种制造重组人粒－巨噬细胞集落刺激因子的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种利用基因工程技术制造重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子方法，其目的在于提高粒-巨噬细胞集落刺激因子的表达水平，便于纯化制备。利用PCR技术改构其cDNA成熟肽编码区5′端，消除其强二级结构，将其插入高效表达载体，受热诱导后得到高效表达，分离包含体、溶解、复性、纯化后得到比活性＞1×107，纯度＞98%的重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子纯品，可以满足临床应用要求。

Description

一种制造重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子的方法
本发明涉及一种利用基因工程技术制造重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)的方法，它包括以下几个步骤：
1.利用PCR方法对GM-CSF cDNA进行改构；
2.在大肠杆菌中进行高效表达；
3.表达产物的复性；
4.复性后表达产物的纯化。
在以往的研究中(Greenberg R，Curr.Microbiol，1988；17：321)，天然的粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)在大肠杆菌中表达量很低，难以复性、纯化，不易达到临床应用的要求，成本昂贵，不利于大量生产应用。
本发明的目的在于避免上述现有技术不足，提高GM-CSF在大肠杆菌中的表达水平，降低成本利于大量生产而提供的改构cDNA和GM-CSF的复性、纯化的方法。
本发明的目的可以通过以下措施达到：
利用计算机模拟改造GM-CSF cDNA成熟编码区的5′端，使其形成的二级结构减弱，能量下降减少，有利于mRNA的解读、翻译，提高表达量。根据此设计合成引物，用PCR方法定向改造cDNA成熟编码区的5′端，尽量采用大肠杆菌偏性密码子，而不改变编码氨基酸排列的顺序。
改构后的cDNA插入到pBV220表达载体中，转化受体菌HB101，经热诱导后，高效表达rhGM-CSF。表达的rhGM-CSF工程菌用超声破碎，经4,000～12,000rpm离心15～25分钟后取包含体沉淀，用含有0～2M尿素、10～50mM Tris-HCl或磷酸盐缓冲液(pH8～9)洗涤；洗涤后包含体沉淀用8M尿素、10mM二硫苏糖醇(DTT)溶解，可溶部分用由二硫苏糖醇0.01～2mM、氧化型谷胱甘肽0.01～2mM组成的稀释复性液在2～10℃温度下复性。
复性后经Q-Sepharose FF层析柱纯化，洗脱液为含有0.3～1M NaCl的Tris-HCl或磷酸盐缓冲液(pH6.5～8.5)。收集蛋白峰过Sephacryl S-200柱除去多聚体，即得rhGM-CSF纯品。
另一纯化路线亦可得到相同结果：8M尿素可溶部分先过Sephacryl S-200层析柱，部分收集rhGM-CSF蛋白峰，在上述稀释复性液中复性，再过Q-Sepharose FF层析柱。
附图的图面说明如下：
图1.改构后的rhGM-CSF cDNA序列
图2.改构后的rhGM-CSF cDNA序列
图3.rhGM-CSF重组质粒构建图。其中：
1.pUC/GM-CSF
2.GM-CSF cDNA
3.pBV220
4.改构后的GM-CSF cDNA
5.重组质粒J1
本发明结合附图实施例作进一步详述：
实施例1：根据文献发表的cDNA核甘酸顺序，设计并合成引物。从中国人外周血有核细胞中提取总RNA，用逆转录-PCR扩增克隆了hGM-CSF之cDNA，用DNA序列分析验证。再根据大肠杆菌偏性密码及能量最低原理，设计合成一对引物，尽量避免cDNA成熟编码区5′端的二级结构，将终止密码子换成TAA。引物如下：
上游引物：5′CGGAATTCATGGCACCAGCACGTTCTCCATCTCCGTCTACTCAGCCCTGG3′；
下游引物：5′CTGGATCCTTACTCCTGGACTGGCTC3′。
用PCR方法改构cDNA(如图1)，以EcoR I和BamH I位点插入高效表达载体pBV220中(构建过程见图3)，转化受体菌HB101，筛选出重组质粒，命名为J1。
将工程菌J1/HB101接种于LB液体培养基中，30℃培养过夜，再以5％扩大培养至对数生长中期，立即转42℃继续培养4小时。4,500rpm离心25分钟收集菌体，以1/10悬浮于20mM磷酸盐缓冲液中，超声破碎，12,000rpm离心15分钟，收集包含体沉淀，用1M尿素洗涤沉淀两次，离心回收沉淀，用8M尿素10mM DTT溶解。可溶部分过凝胶过滤Sephacryl S-200层析柱，缓冲液为20mM Tris-HCl(pH8.0，含5M尿素)，分步收集rhGM-CSF峰，用含0.2mM DTT和0.1mM氧化型谷胱苷肽的缓冲液复性后过Q-Sepharose FF阴离子交换柱，用含1M NaCl的20mM Tris-HClpH8.0洗脱rhGM-CSF，其比活性＞1×107u/mg，纯度＞98％。
实施例2：将逆转录-PCR克隆的hGM-CSF之cDNA，根据能量最低原理并尽量采用大肠杆菌偏性密码，设计引物用PCR方法改造之。
上游引物：5′GAGAATTCATGGCACCGGCTCGTTCTCCATCTCCGTCTACTCAGCCCTGG3′；
下游引物：5′CTGGATCCTTACTCCTGGACTGGCTC3′构建重组质粒。
重组质粒转化大肠杆菌HB101，工程菌在LB培养基中30℃培养至对数生长中期，快速升温至42℃继续培养3～4小时，用SDS-PAGE测定表达产物rhGM-CSF占菌体总蛋白的40％。
收集菌体8,000rpm离心15分钟，经超声破碎后，离心8,000rpm 15分钟收沉淀，沉淀以20mM Tris-HCl，1mM EDTA缓冲液洗3次，用8M尿素10mM二硫苏糖醇溶解包含体沉淀。可溶部分稀释复性，4℃20小时后过Q-Sepharose FF，用含0.3MNaCl的Tris-HCl pH8.0洗脱rhGM-CSF，收集蛋白峰，再过Sephacryl S-200柱，分步收集rhGM-CSF单体峰，所得纯化的rhGM-CSF比活性＞1×107u/mg，纯度＞98％。
本发明相比现有技术具有如下优点：
1.用改构后的cDNA构建的工程菌表达rhGM-CSF的水平显著提高，达到全菌总蛋白的40％以上；
2.纯化简便，生产成本低，所得rhGM-CSF比活性高，＞1×107u/mg，纯度＞98％；
3.所得rhGM-CSF纯品可以满足临床应用要求。

Claims (5)

1、一种利用基因工程技术制造重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子的方法，其特征在于用PCR方法对人粒-巨噬细胞集落刺激因子cDNA的改构，获得的cDNA核苷酸序列为
ATGGCACCAG    CACGTTCTCC    ATCTCCGTCT
ACTCAGCCCT    GGGAGCATGT    GAATGCCATC
CAGGAGGCCC    GGCGTCTCCT    GAACCTGAGT
AGAGACACTG    CTGCTGAGAT    GAATGAAACA
GTAGAAGTCA    TCTCAGAAAT    GTTTGACCTC
CAGGAGCCGA    CCTGCCTACA    GACCCGCCTG
GAGCTGTACA    AGCAGGGCCT    GCGGGGCAGC
CTCACCAAGC    TCAAGGGCCC    CTTGACCATG
ATGGCCAGCC    ACTACAAGCA    GCACTGCCCT
CCAACCCCGG    AAACTTCCTG    TGCAACCCAG
ACTATCACCT    TTGAAAGTTT    CAAAGAGAAC
CTGAAGGACT    TTCTGCTTGT    CATCCCCTTT
GACTGCTGGG    AGCCAGTCCA    GGAGTAA
或者
ATGGCACCGG    CTCGTTCTCC    ATCTCCGTCT
ACTCAGCCCT    GGGAGCATGT    GAATGCCATC
CAGGAGGCCC    GGCGTCTCCT    GAACCTGAGT
AGAGACACTG    CTGCTGAGAT    GAATGAAACA
GTAGAAGTCA    TCTCAGAAAT    GTTTGACCTC
CAGGAGCCGA    CCTGCCTACA    GACCCGCCTG
GAGCTGTACA    AGCAGGGCCT    GCGGGGCAGC
CTCACCAAGC    TCAAGGGCCC    CTTGACCATG
ATGGCCAGCC    ACTACAAGCA    GCACTGCCCT
CCAACCCCGG    AAACTTCCTG    TGCAACCCAG
ACTATCACCT    TTGAAAGTTT    CAAAGAGAAC
CTGAAGGACT    TTCTGCTTGT    CATCCCCTTT
GACTGCTGGG    AGCCAGTCCA    GGAGTAA，
获得重组质粒以及对此工程菌进行表达，经离心、洗涤液洗涤、回收包含体、尿素溶解、稀释复性液中复性，经Q-Sepharose FF和Sephacryl S-200层析柱纯化，分步收集可得重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子纯品。
2.依据权利要求1所述之方法，其特征在于离心转速为4000～12,000rpm，时间为15～25分钟。
3.依据权利要求1所述之方法，其特征在于洗涤液中含有0～2M尿素、10～50mM Tris-HCl或磷酸盐缓冲液，PH值8～9。
4.依据权利要求1所述之方法，其特征在于稀释复性液中含有二硫苏糖醇和氧化性谷胱甘肽，其浓度分别为0.01～2mM和0.01～2mM。
5.依据权利要求1所述之方法，其特征在于Q-Sepharose FF层析柱纯化过程中洗脱重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子洗脱液为含有0.3～1M NaCl、pH6.5～8.5的Tris-HCl或磷酸盐缓冲液。
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