CN1142278C - 一类能被尿激酶或自身激活的尿激酶原变体及其编码基因、制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术制药工业中的基因工程生产蛋白药物的技术领域,其目的是利用定点突变,获得尿激酶原变体基因,实现在大肠杆菌中的高效表达,经分离纯化后,在尿激酶或自身及二价金属离子的作用下转变为双链尿激酶变体,以解决目前临床上使用的尿源性尿激酶来源困难,成本高及可能带有病毒污染的缺点,从而降低临床用尿激酶的成本及提高用药安全性。
Description
本发明涉及一种一类能被尿激酶或自身激活的尿激酶原变体及其编码基因、制备方法和用途
尿激酶是一种双链丝氨酸蛋白水解酶,作为体内一种重要的纤溶酶原激活因子,由肾脏细胞以其前体分子——单链尿激酶原的形式分泌。经纤溶酶激活,尿激酶原转变为高活性的双链尿激酶,活化的尿激酶则可激活纤溶酶原,产生纤溶酶,后者大量水解纤维蛋白,完成纤溶过程。在病理条件下,机体纤溶系统不足以消除栓塞血块,必须经静脉灌注或局部注射溶栓药物——纤溶酶原激活剂,才能有效地溶解血栓中的纤维蛋白,清除血栓。尿激酶是我国经营多年的一种传统溶栓药物,被广泛地运用于治疗急性心肌梗塞、脑血栓、肺静脉栓塞、下肢静脉栓塞等多种血管栓塞性疾病。
近20年来,国内尿激酶原料的市场一直稳定在2亿元人民币,美国约2.5亿美元,日、欧等其它市场在2至3亿美元以上,中国为欧美日尿激酶原料的主要提供国,尿激酶的出口曾为国家换回了大量外汇。目前临床上使用的尿激酶均是人源性的,近几年来其市场发生了很大的变化,由于病毒感染和病毒疾病的蔓延(如艾滋病毒、乙型肝炎病毒),人源性尿激酶原料受到很大程度的病毒污染,而其病毒灭活检测方法具有相当大的技术困难。因此,人源性尿激酶已被多个国家禁用,如在美国于1998年被FDA禁用,导致肾透析病人导管栓塞用药奇缺的危机现象,该治疗中每次使用尿激酶0.05mg的方法已为tPA 2mg(FDA待批)所取代,但后者的用量是前者的40倍,大大提高生产成本,并且疗效仍不如前者)。中国目前虽继续使用人源性尿激酶,但已引起了药品管理部门的高度重视。
基因工程生产尿激酶工艺中,由于尿激酶原转变为尿激酶时需要纤溶酶作为催化剂,该酶价格昂贵,且为血液制品,同样存在病源体污染的危险。纤溶酶对尿激酶存在两个以上的水解位点,因此,用野生型尿激酶原制备双链尿激时,条件不易控制,通常产生不同分子量大小的尿激酶的混合物,并难以进一步分离纯化,其生产成本高,纯度差,所以,国际上还未见有用该法工业化生产尿激酶的报导。
本发明的目的是利用尿激酶特异性强的特点,用寡聚核苷酸介导的定点突变方法,将尿激酶原中纤溶酶的识别位点Lys-Ile改造为尿激酶识别位点Arg-Val,同时对其相临序列作出不同改变,最终获得系列能被尿激酶或自身激活的尿激酶原变体基因,并实现在大肠杆菌中的高效表达,经分离纯化,其表达产物尿激酶原无需纤溶酶激活,在其内在酶活性的作用下直接变为尿激酶,不涉及任何人源性原材料,不存在任何病毒污染的隐患,该变体与天然尿激酶具有相当的酶活性。与目前市场上尿源性尿激酶相比,具有技术先进,工艺方便,纯度高,不含任何病毒污染源,产量高,成本低等优点。本发明的技术内容包括:
通过定点突变,构建系列能被尿激酶或自身激活的尿激酶原变体基因,即将尿激酶155位Pro至165位Thr之间序列突变为系列含有158Lys159Ile→158Arg159Val的尿激酶原变体基因。化学合成尿激酶原基因正链中含有突变氨基酸的寡聚核苷酸引物,并与Psat-prouk质粒单链DNA退火,用Promega公司Altered Sites in vitro MutagenesisSystem突变试剂盒获得尿激酶原变体基因,插入表达载体pET25b的NdeI,XhoI位点之间。转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,SDS-PAGE表明尿激酶原变体的表达量约占菌体总蛋白的20%,分子量为46KD,与理论值相符。
尿激酶原变体表达产物经离心收集菌体、超声破碎、包涵体制备、体外变复性、CM-纤维素离子交换层析及Superdex 75分子筛层析等步骤,获得尿激酶原变体蛋白,该变体在辅助因子存在条件下,自身(或少许外加尿激酶)催化转变为高活性的双链尿激酶变体,样品中少许单链分子用Benzamidine Sepharose 6B亲和层析去除。
本发明的优点是创造了自身催化活化效率高的尿激酶原变体,适于工业化生产用,生产成本低,避免了尿源性尿激酶可能带来的诸如肝炎、爱滋病等的致病因子,从而提高了尿激酶在临床上的安全性。用于治疗脑血栓、急性心梗、肺静脉栓塞、心肌缺血性坏死,下肢静脉栓塞等多种血管栓塞性疾病。
本发明的实施例:
实施例1可被尿激酶或自身活化的尿激酶原变体(以156RFKII161→GRVV为例)基因的获得:化学合成一段包含了突变氨基酸在内的寡核苷酸引物,其序列为5′-CTCTGAGGCCCGGTCGTGTTGTTGGGG G-3′,以Psat-prouk单链DNA为模板,选用Promega公司AlteredSites in vitro Mutagenesis System试剂盒,经退火、DNA合成、转入ES1301,质粒DNA纯化及转入JM109,DNA序列测定等步骤获得尿激酶原变体(156RFKII→GRVV)基因。
实施例2可被尿激酶或自身活化的尿激酶原变体基因的表达:将上述尿激酶原变体基因克隆至pET25b NdeI,XhoI位点之间,转入大肠杆菌JM109,筛选得阳性克隆,将pET25b-prouk质粒转入表达宿主菌BL21(DE3),挑取单克隆接种至10mlLB(含50ug/ml Amp)培养液中,37℃振荡培养过夜,按1%比例接入1000ml LB(含50ug/ml Amp)培养液中,37℃振荡培养至OD600约0.6,加入IPTG至终浓度0.5mM,37℃继续培养3.5小时。
实施例3可被尿激酶或自身活化的尿激酶原变体蛋白的纯化:将上述培养液离心,收集菌体,重悬于裂解缓冲液(0.1M NaCl,50mM Tris·HCl,5mM EDTA pH7.5)中,冰浴中超声破菌25分钟(超声5秒,停5秒),7500rpm离心30分钟,收集沉淀,用含有0.5%Triton,2M尿素的裂解缓冲液洗涤包涵体两次。洗涤后的包涵体用变性液(6M盐酸胍,50mM Tris.HCl,5mM EDTA,50mM DTT pH7.5)变性过夜,8000rpm离心15分钟,弃沉淀,将上清液缓慢加入复性缓冲液(2M尿素,1mMGSSG,0.2mM GSH,50mM Tris·HCl pH7.5)中,4℃复性24小时。
将上述复性液对50mM NaAc-HAc pH4.0缓冲液透析至pH4.0,离心,弃沉淀,将上清液上CM-离子交换层析柱,用含0.5M NaCl的NaAc-HAc缓冲液洗脱,洗脱峰经超滤浓缩后上Superdax75分子筛层析柱,用pH4.5醋酸缓冲液洗脱,根据SDS-PAGE收集尿激酶原变体洗脱峰。
实施例4双链尿激酶变体的制备:将上述经纯化的尿激酶原变体中加入ZnCl2至终浓度为1mM,37℃反应48小时,SDS-PAGE检测双链产生的效率,反应结束后将样品上Benzamidine Sepharose CL 6B亲和层析柱,收集穿过峰,对50mM HAc透析后冷冻干燥,即为双链尿激酶变体纯品,其比活大于120000Iu/mg。
Claims (8)
1.一种能被尿激酶或自身激活的尿激酶原变体,其特征在于它是一种通过寡核苷酸介导的定点突变,将人尿激酶原蛋白序列中158Lys159Ile变为158Arg159Val的尿激酶原变体。
2.一种权利要求1所述尿激酶原变体的编码基因。
3.一种权利要求1所述尿激酶原变体的制备方法,其特征在于通过基因重组技术在原核细胞、真核细胞或酵母细胞中表述所述尿激酶原变体的编码基因,获得所述尿激酶原变体。
4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于在所述原核细胞中表达获得的尿激酶原变体,经体外复性、CM-纤维素离子交换层析、分子筛层析方法纯化,获得高纯度的尿激酶原变体蛋白。
5.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于所述尿激酶原变体蛋白在其内在酶活性或少许外加尿激酶的催化及辅助因子作用下,转变为双链尿激酶变体,并经BenzamidineSepharose 6B去除单链分子。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于所述的辅助因子是Zn2+、Fe2+或Cu2+金属离子。
7.一种权利要求1所述的尿激酶原变体的用途,其特征在于所述尿激酶原变体用于制备治疗血管栓塞性疾病的药物组合物。
8.根据权利要求7的用途,其特征在于所述的血管栓塞性疾病是急性心肌梗塞、脑血栓、肺动脉栓塞、静脉血栓、心肌缺血性坏死。
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