CN1654643A - 用辅助复性的方法制备重组瑞替普酶 - Google Patents
用辅助复性的方法制备重组瑞替普酶 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用二硫键异构酶PDI辅助变性的组织型纤溶酶原激活剂39KD重组异构体瑞替普酶(r-PA)正确折叠并提高其复性率的新型方法。在优化的r-PA复性体系中加入一定比例的PDI,可以使r-PA中错误配对的二硫键打开并形成正确的二硫键,从而提高复性率,降低异构体比例,简化后续纯化工艺,提高r-PA产率。
Description
本发明属医药领域中的重组蛋白质药物制备技术。
组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)的39KD重组异构体瑞替普酶(简称r-PA)是t-PA的一种分子改造衍生物。它包含有野生型t-PA的Kringle2结构域和蛋白酶结构域,不含糖基化位点。r-PA具有t-PA的溶血栓活性,但半衰期延长,并且出血副作用小,比t-PA具有使用方便安全经济的优势,是取代t-PA的理想溶血栓药物。
因为r-PA不含糖基化位点,可以用大肠杆菌来表达。我们构建了高效表达r-PA的工程菌以表达r-PA。由于r-PA含有十对二硫键,用细菌表达的r-PA形成包含体形式,溶解变性后用常规方法复性很难正确折叠和复性成活性形式。这是由于组成十对二硫键的20个半胱氨酸在复性错误配对造成的。为了提高变性r-PA的复性率,我们发明了用二硫键异构酶(PDI)促进复性的生产工艺,我们在r-PA的复性体系中加入重组人二硫键异构酶(rhPDI),使错误的二硫键打开重新形成正确的二硫键,从而提高复性率,最终提高r-PA的产率,降低成本,并可应用于工业化生产。
本发明原理是:二硫键异构酶PDI可以特异性地作用于蛋白分子中错配的二硫键,打开该错配的二硫键,并促进其形成正确配对的二硫键,完成分子结构重排,形成正确活性形式,达到复性的目的。
本发明的目的:使用二硫键异构酶催化变性的r-PA形成正确配对的二硫键,从而复性成正确的有活性的分子构型。这样可提高r-PA的复性率,降低异构体比例,简化后续纯化步骤,由此提高r-PA的产率,降低生产成本。
技术方案:r-PA的工程菌菌种活化→高效表达r-PA→菌体离心收获→菌体破碎→包含体离心分离→高浓度盐酸胍按一定比例变性溶解→在复性体系中按一定比例加入重组人PDI以催化r-PA的复性→Sephardex G-25脱盐→Lys-Sepharose 4B亲和层析→CM-Sepharose阳离子交换层析→Sephadex G-25脱盐。经上述步骤即可制备得到纯度大于95%,比活性高于6×105IU/mg的r-PA。
最佳实施例:
r-PA复性体系如下:50mM Tris,pH7~10,氧化型谷胱甘肽10~1mM,还原型谷胱甘肽1~0.1mM,r-PA蛋白浓度0.01~1mg/ml。在此复性体系中加入重组人二硫键异构酶PDI,使r-PA与PDI的摩尔比为100∶1~10∶1。在加入PDI的复性体系中进行复性,r-PA的复性率比不加PDI时有显著提高,二硫键错配造成的异构体比例大大降低,r-PA的终产率也相应提高。
r-PA的制备方法如下:r-PA工程菌37℃活化12~16h,接于大肠杆菌发酵培养基中,37℃,150rpm振荡培养12~16h,菌体密度O.D600达0.5~1.0。按0.5~1.0%比例将细菌转接于新鲜培养液中,恒温37℃培养80~90分钟,当菌体密度至OD600≈0.5~0.8时,加入0.5~1mMol/l的IPTG诱导表达r-PA,诱导时间3~6h。将诱导后的发酵液在4℃条件下,5000~8000×g离心10~15min,弃上清,沉淀即为表达后的r-PA工程菌菌体。将菌体按1∶10~1∶20的比例充分悬浮于50mM Tris,pH8.0的缓冲液中,在400w的功率下超声200~300秒,菌体破碎。超声后于4℃,10000~12000×g的条件下离心30min,所得沉淀即为r-PA包含体。包含体用6~8M盐酸胍,50mMTris,100~150mM DTT变性液,经过充分匀质后,搅拌30~60分钟。于室温18~25℃条件下充分溶解4~8h。10000~12000×g,15℃条件下离心30分钟,取上清,即为变性的r-PA。
将变性的r-PA缓慢滴加到不断搅拌的复性体系中,使得r-PA终浓度0.1mg/ml,室温18-25℃过夜(12~14h)。将上述复性液用5KD膜超滤浓缩换盐后,用Lys-Sepharose亲和层析柱纯化(以50mMPB,pH8.0的缓冲液为平衡缓冲液,用含0.2M赖氨酸,0.5~1.0MNacl的平衡缓冲液为洗脱液),收集紫外A280吸收峰。用Sephadex G-25脱盐后,再经过CM-Sepharose柱层析(平衡缓冲:20mMPB,pH6.0,0~1.0M Nacl线性梯度洗脱),最佳洗脱浓度是0.2~0.3M NaCl,收集紫外A280吸收峰。用Sephadex G-25脱盐后,得到纯度>95%,比活性>6×105IU/mg的r-PA。
本发明的优点:本发明提供了一种用PDI辅助变性r-PA折叠复性以制备r-PA的新型工艺方法。它与国外传统的生产工艺相比具有以下特点:①复性率高。②复性体系中r-PA蛋白浓度提高,复性体积减少,操作方便,节省试剂。③异构体比例低,简化了后续纯化步骤。④提高r-PA产率,降低生产成本。上述优势使本发明具有明显的技术创新性与工艺先进性,成本降低,更适合于工业化生产r-PA。
Claims (5)
1、用辅助复性方法制备组织型纤溶酶原激活剂39KD重组异构体瑞替普酶(r-PA)。其特征在于在变性r-PA的复性体系中加入二硫键异构酶,以提高r-PA的复性率。
2、组织型纤溶酶原激活剂39KD重组异构体瑞替普酶(r-PA)的制备工艺,其特征在于经过工程菌表达→菌体破碎→包含体分离→变性→PDI催化复性→脱盐→亲和层析→阳离子交换层析等步骤完成。
3、如权利要求2所述的瑞替普酶(r-PA)的变性,其特征在于用盐酸胍作为变性剂,变性体系含6M盐酸胍,20~100mM Tris,10~100mMDTT,PH7~10。
4、如权利要求2所述的PDI催化的瑞替普酶(r-PA)的复性,其特征在于复性体系采用50mM Tris,pH7~10,氧化型谷胱甘肽10~1mM,还原型谷胱甘肽1~0.1mM,r-PA蛋白浓度0.01~1mg/ml,加入的PDI为重组人PDI或其它来源的PDI,r-PA与PDI的摩尔比为100∶1~10∶1。
5、如权利要求2所述的阳离子交换层析,其特征在于采用CM-Sepharose阳离子交换柱,洗脱条件是0~1M NaCl,PH7~10,最佳洗脱浓度是0.2~0.3M NaCl。
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Cited By (3)
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CN100336824C (zh) * | 2005-12-19 | 2007-09-12 | 百奥泰生物科技(广州)有限公司 | 一种重组蛋白的高效变复性的方法 |
CN103509772A (zh) * | 2012-06-18 | 2014-01-15 | 王革 | 组织型纤溶酶原激活剂的新型组合突变体 |
CN110387365A (zh) * | 2018-04-19 | 2019-10-29 | 山东博创生物科技有限公司 | 基因工程组织型纤溶酶原激活剂重组异构体(nt-PA)包涵体的复性方法 |
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2004
- 2004-02-11 CN CNA2004100234706A patent/CN1654643A/zh active Pending
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