CN100336824C - 一种重组蛋白的高效变复性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种重组蛋白的高效变复性的方法，对重组表达而不具有生物活性的蛋白质进行了高效快速的变复性。通过采用含有尿素和一定浓度比例的氧化还原剂GSSH/GSH等组成的变性缓冲液对充分洗涤后的包涵体蛋白进行溶解，随后将变性蛋白稀释注入含有L-精氨酸和一定浓度比例的氧化还原剂GSSH/GSH等组成的复性缓冲液中进行复性，并在复性过程中逐步提高缓冲液中氧化还原剂GSSH/GSH的比例及调低pH，直至复性结束。经该方法复性的几种在大肠杆菌中表达并形成包涵体的蛋白质，其生物活性强且稳定，因此是工业化高效变复性的方法。

Description

一种重组蛋白的高效变复性的方法

技术领域

本发明涉及一种重组蛋白的高效变复性的方法，对重组表达而不具有生物活性的蛋白质进行高效稳定的变复性。整个蛋白质变复性时间短，经本发明复性后的蛋白性质稳定并具有生理活性。此外，经本发明复性的重组蛋白可直接进行下游的层析纯化而无须更换条件，并适合于工业化放大生产。

背景技术

原核表达系统作为一种成熟的蛋白表达系统，因表达量高，操作简便和成本较低一直以来都受到工业化生产的青睐。因此借助大肠杆菌系统进行基因工程重组表达具有成本低，大规模发酵容易等优点，但重组蛋白在大肠杆菌系统中基本以包涵体形式表达，表达产物不具有生物活性，往往需要进行烦琐的蛋白质变复性实验才能获得部分活性。

包涵体是蛋白质凝集形成的致密颗粒，主要是由于重组蛋白高水平表达所致。因为蛋白质合成速度过快，以至于在蛋白质折叠过程中，没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对；分子内部的疏水区间暴露于溶液中，使多肽的疏水区之间相互作用及碰撞，形成不正确的折叠而聚集。但对于生物制药工业来说，包涵体的形成也是有利的，不仅可获得高表达、高纯度的重组蛋白质，还可避免细胞水解酶对重组蛋白质的破坏，并且还便于进行下游分离和纯化。

该类含有二硫键的蛋白包括组织型纤溶酶原激活剂和人脑利钠肽。组织型纤溶酶原激活剂或者变体蛋白含有多对二硫键及不规则的疏水区域(重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体基因的克隆及工程菌的构建与鉴定，陈于红等人，2004)；人脑利钠肽为具有32个氨基酸的多肽，含有一对二硫键(N-末端原脑利钠肽对心血管疾病预测价值的研究进展，曹莉，2004)。两者经原核表达后形成的包涵体蛋白变复性过程复杂；复性后蛋白质不稳定且容易发生沉淀；整个复性周期较长而容易丧失活性。因此，本发明提供一种重组蛋白的高效变复性的方法，对于利用基因工程技术工业化生产高效稳定的基因药物，提高疗效、安全性以及降低生产成本均有重要意义。

技术内容

本发明所提供的一种重组蛋白的高效变复性的方法，其特征在于整个蛋白质复性阶段使用了含有不同pH值与不同浓度和比例的还原剂/氧化剂所组成的复合动态缓冲液。该法不仅适用于大肠杆菌表达形成的包涵体或其它异体蛋白，或者是非大肠杆菌表达而失去生物活性的，又或者与生物活性有差异的表达蛋白；还适用于含有二硫键的组织型纤溶酶原激活剂及其变体衍生物和人脑利钠肽及其变体衍生物。通过该法进行蛋白质变复性，复性后重组蛋白具有性质稳定且纯度高，得率较高以及明显的生理活性等特点，适合于工业化大规模高效生产的应用。

目前有的复性蛋白的专利主要采用了柱上复性的手段(CN 1410435A，CN1077715A，CN 1508150A)，由于局限于纯化填料空间大小以及洗脱条件等因素，必然对于蛋白充分复性的效果有所影响，因此对于其工业化的大规模应用是具有实际困难的。相对于专利(CN 1556206A)，我们所复性的蛋白为未经添加任何人工纯化位点的，因此无须使用额外的蛋白酶进行切割而影响成本，而且我们所复性后的蛋白能够直接进行亲和层析和凝胶过滤层析，直接达到生产的需要，因此具有更为明显的优势。

本发明首先将诱导表达的重组蛋白充分破壁并对包涵体蛋白进行清洗和分离，以除去脂类和膜蛋白，避免包涵体溶解和复性的过程中重组蛋白质的降解。然后将洗涤后的包涵体蛋白溶解于pH值为10.0以上的含有尿素、甘氨酸和一定浓度与比例的氧化/还原剂的变性缓冲液中，从而打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展；并使分离的包涵体中含有的一些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键全部打开。

将变性完全的重组蛋白稀释注入含有一定浓度与比例的L-Arg，表面活性剂Tween 80和氧化/还原剂GSSH/GSH的复性缓冲液中进行复性。复性过程中采用低温和磁力搅拌，分批加入变性蛋白，浓度控制在0.1~1mg/ml，使变性蛋白在复性液中始终处于低浓度状态，从而避免形成絮状沉淀。使用表面活性剂Tween 80可促进蛋白质复性并防止絮集；使用L-Arg可使不正确折叠的蛋白质结构以及不正确连接的二硫键变得不稳定，并促使折叠向正确方向进行，可大幅度地提高包涵体蛋白质的折叠效率；使用氧化/还原剂GSSH/GSH可促进不正确形成的二硫键快速交换反应，提高了正确配对的二硫键的产率。

开始复性时，加入复性缓冲液将pH值调至9.5左右，防止自由硫醇的质子化作用而影响正确配对的二硫键的形成。在复性过程中，将每一步的溶液的pH值都比上一步的溶液的pH值调低0.2~0.5；氧化剂浓度增加50~100％，还原剂浓度相应降低50％~100％，以致最终溶液的pH值接近中性或者该重组蛋白质的生理值，同时复性过程中逐步降低还原剂的浓度并提高氧化剂的浓度，以至于其还原剂的终浓度为0~10mM；氧化剂的终浓度为1~100mM。

采用以上方法进行复性后的组织型纤溶酶原激活剂变体蛋白未经Lysine Resin和Sephadex G-25纯化已具有90％的纯度；而纯化后可得到95％的纯度。进行纤溶平板活性测定，可知重组蛋白具有约1M IU/10mg的溶栓活性。复性后蛋白长期保存于4℃下依然具有明显的生理活性。综上所述，本发明所提供的一种重组蛋白的高效变复性的方法具有以下特点：变复性步骤简单且容易操作；复性蛋白的回收率高并且性质稳定；复性后可获得浓度与纯度较高的活性蛋白；复性过程周期短；复性方法适宜于工业化放大。

具体而言，本发明提供了一种重组蛋白的高效变复性的方法，其特征在于不同的蛋白质复性阶段使用了含有不同pH值与不同浓度和比例的氧化/还原剂剂所组成的复合动态缓冲液，这种方法的步骤包括：

(1)使用pH值为10.0以上的变性缓冲液溶解重组蛋白，且缓冲液中含有2.0mM以上的还原剂；优选该步骤使用pH值为10~11的变性缓冲液溶解重组蛋白，且缓冲液中含有2~22mM的还原剂，其中还原剂优选是DTT和/或GSH；

(2)加入复性缓冲液，使得到的溶液pH值比步骤(1)得到溶液的pH值降低了0.5~1.0，而且使氧化剂浓度比步骤(1)的氧化剂浓度增加100~300％，还原剂浓度比步骤(1)中的还原剂浓度降低50％~100％；

(3)然后调节复性缓冲液，使得到的溶液pH值比上一步骤得到溶液的pH值降低了0.2~0.5，而且使氧化剂浓度比上一步骤的氧化剂浓度增加10~100％，还原剂浓度比上一步骤中的还原剂浓度降低50％~100％；

(4)重复步骤(3)若干次，使每一步所得的溶液的pH值都比上一步的溶液的pH值降低0.2~0.5，而且使氧化剂浓度比上一步骤的氧化剂浓度增加50~100％，直至最终溶液的pH值接近中性或者该重组蛋白质的生理值并使氧化剂的终浓度为1~100mM。当达到最终溶液的pH值接近中性或者该重组蛋白质的生理值并使氧化剂的终浓度为1~100mM时，复性完成。优选复性停止时最终溶液的pH为7.3~7.6，氧化剂的终浓度为1~10mM。

在以上方法中，优选调节复性缓冲液的步骤中不加入还原剂，而仅仅通过依靠加入氧化剂的量来调节复性缓冲液中的氧化还原剂比例，而增加氧化剂的浓度并相应减少还原剂的浓度。

在以上方法中，优选重组蛋白在每一步的不同缓冲液中都能静止或者动态的放置60分钟以上，优选放置2~6小时。动态放置的方式有搅拌、震荡等。

在以上方法中，优选复性缓冲液的pH值与氧化还原剂的调节是可以在原有缓冲液中进行调节，也可以是使用重新配置的缓冲液。在原有缓冲液中进行调节即在上一步骤得到的溶液中加入额外的酸/碱和/或氧化还原剂来进行调解pH和氧化还原剂浓度。

在以上方法中，优选复性缓冲液中的还原剂可以是β巯基乙醇(β-mercaptoethanol)，二硫苏糖醇(DTT)，或还原型谷胱甘肽(GSH)；复性缓冲液中的氧化剂可以是氧化型谷胱甘肽(GSSH)，过氧化氢(H2O2)或者氧气O2。更优选的氧化剂是氧化型谷胱甘肽(GSSH)；更优选的还原剂是还原型谷胱甘肽(GSH)。复性缓冲液中可含有去污剂，尿素，SDS，Tris-Cl，甘氨酸，EDTA，L-精氨酸，和/或蛋白酶抑制剂。优选的复性缓冲液含Tris-Cl，L-精氨酸，EDTA，Tween 80，GSSH和GSH。

在以上方法中，优选复性缓冲液的pH值的动态变化与氧化还原剂的浓度的动态变化的速度是可调节的。动态变化的方式指复性缓冲液的pH值和氧化还原剂的浓度的调节时间是变化的，可以是2~6小时。

在以上方法中，优选复性缓冲液的pH值与氧化还原剂的浓度是同时发生变化的。例如，在调节复性缓冲液时加入含有酸碱和氧化还原剂的溶液来进行调节pH和氧化还原剂浓度，优选加入含有盐酸和GSSH的溶液。

在以上方法中，优选调节复性缓冲液的步骤之间，pH值和/或氧化还原剂的浓度的调整幅度是相同的。例如，每一步调节都降低pH值0.4，和/或增加GSSH浓度0.25mM。

在以上方法中，优选复性过程中复性缓冲液的氧化还原剂的浓度比例改变，而pH值可以不变。例如，每一步调节均增加GSSH浓度0.25mM，而pH值一次性降低到7.4。

在以上方法中，优选重组蛋白可以是大肠杆菌表达形成的包涵体或其它异体蛋白。其中，重组蛋白可以是形成二硫键的包涵体蛋白；重组蛋白也可以是非大肠杆菌表达而失去生物活性的，或者与生物活性有差异的表达蛋白。在一个具体的实施方式中，具有二硫键的重组蛋白可以是组织型纤溶酶原激活剂(Tissue Plasminogen Activator，TPA)及其变体衍生物，优选如陈于红等人(南京大学学报(自然科学版)，2004年01期)所述的重组组织型纤溶酶原激活剂变体蛋白。在一个具体的实施方式中，具有二硫键的重组蛋白可以为人脑利钠肽(Nesiritide，BNP)的多肽及其变体衍生物，优选如Rapid Transcritional Activation and Easy mRNA Turnoverof Brain Natriuretic Peptide in Cardiocyte Hypertrophy.OsamuNakagawa，Yoshihiro Ogawa，Hiroshi Itoh，etc.J.Clin.Invest，Volume96，September 1995，1280-1287。

附图说明

图1  重组组织型纤溶酶原激活剂变体蛋白表达的电泳结果

M.蛋白质分子量参照    1.不进行IPTG诱导的对照

2.诱导表达1小时后的重组蛋白的总菌

3.诱导表达2小时后的重组蛋白的总菌

4.诱导表达3小时后的重组蛋白的总菌

5.诱导表达4小时后的重组蛋白的总菌

图2  重组组织型纤溶酶原激活剂变体蛋白破碎、洗涤和变复性的电泳结果

M.蛋白质分子量参照      1.诱导表达重组蛋白的总菌

2.重组蛋白的裂解总菌    3.重组蛋白的裂解沉淀

4.重组蛋白经1号洗涤缓冲液清洗的上清

5.重组蛋白经2号洗涤缓冲液清洗的上清

6.重组蛋白经变性缓冲液溶解的上清

7.重组蛋白经复性缓冲液复性的上清

图3重组组织型纤溶酶原激活剂变体蛋白复性过程的电泳结果

M.蛋白质分子量参照             1.重组蛋白的复性上清(pH9.5)

2.重组蛋白的复性上清(pH9.0)    3.重组蛋白的复性上清(pH8.8)

4.重组蛋白的复性上清(pH8.6)    5.重组蛋白的复性上清(pH8.4)

6.重组蛋白的复性上清(pH8.0)    7.重组蛋白的复性上清(pH7.8)

8.重组蛋白的复性上清(pH7.6)    9.重组蛋白的复性上清(pH7.4)

图4重组组织型纤溶酶原激活剂变体蛋白纤溶平板的活性鉴定

1.100 IU标准品                2.200 IU标准品

3.300 IU标准品                4.500 IU标准品

5.1000 IU标准品               6.0.5ul重组蛋白

7.1ul重组蛋白                 8.2ul重组蛋白

9.3ul重组蛋白                 10.10ul PBS(空白对照)

具体实施方式

可以认为，不需进一步的解释，本领域的人员就可以根据前面的描述，充分利用本发明。下面结合实施例，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室指南(第三版)(科学出版社，北京，2002)等实验手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1  重组组织型纤溶酶原激活剂变体蛋白的表达

构建表达重组组织型纤溶酶原激活剂变体蛋白的菌株可以按照陈于红等人(南京大学学报(自然科学版)，2004年01期)所述的方式来进行。也可以参照分子克隆的实验方法进行重组克隆。挑取新鲜的重组克隆于10ml含有终浓度为2％的葡萄糖和0.5mg/ml的氨卞抗生素的LB培养基，并在37℃下以250rpm培养过夜。以1∶100的接种比例转移新鲜菌液于1L含有终浓度为2％的葡萄糖和0.5mg/ml的氨卞抗生素的LB培养基，并在37℃下以250rpm培养至OD_G600＝0.7~0.8，然后使用终浓度为0.1~0.3mM IPTG进行诱导表达，连续培养4小时后以8000rpm/10min离心收菌。分别制备诱导前后的重组工程菌样品进行SDS-PAGE电泳分析(图1)。

实施例2  重组组织型纤溶酶原激活剂变体蛋白的裂解与洗涤

将由实施例1获得的诱导表达的重组工程菌离心沉淀，并取该菌体重悬于13ml的溶解缓冲液[50mM Tris-Cl，25％蔗糖，1mM EDTA，10mM DTT，0.1％叠氮钠，pH8.0]中，然后转移到50ml离心管中。以上步骤都可以在冰上操作。然后加入l00ul溶菌酶，250ul DNase I，50ul MgCl₂(0.5M)，轻轻震荡均匀后在冰上放置30分钟。然后加入12.5ml的裂解缓冲液[50mMTris-Cl，100mM NaCl，10mM DTT，1％.脱氧胆酸钠，0.1％叠氮钠，pH8.0]，并仔细反复颠倒数次使液体混合均匀，室温放置30~60分钟。然后加入0.5MEDTA 350ul，仔细反复颠倒数次混合均匀后置于-80℃中10分钟，再取至37℃解冻。如以上步骤，在-80℃和37℃反复冻溶两次后，加人0.5M MgCl₂200ul使溶液旋浊度降低。静置30~60分钟，再加入0.5M EDTA 350ul并仔细的使用枪头反复吹匀沉淀。

将细胞裂解溶液在4℃下以11000g离心20分钟，小心的倒弃上清，然后将沉淀重悬于10ml的1号洗涤缓冲液[50mM Tris-Cl，0.5％TritonX-100，100mM Nacl，1mM EDTA，1mM DTT，0.1％叠氮钠，pH8.0]中。在-80℃和37℃方法反复冻溶一次，并将所有的沉淀仔细吹匀。接着在4℃下11000g离心20分钟，小心的倒弃上清，并将沉淀重悬于10ml的2号洗涤缓冲液[50mM Tris-Cl，100mM Nacl，1mm EDTA，1mm DTT，0.1％叠氮钠，pH8.0]中。在-80℃和37℃反复冻溶一次，并将所有的沉淀仔细吹匀，然后4℃下11000g离心20分钟，收集沉淀。图2显示了重组组织型纤溶酶原激活剂变体蛋白经过破碎、洗涤和变复性步骤后的效果。

实施例3  重组组织型纤溶酶原激活剂变体蛋白的变复性

将实施例2所获得的沉淀重悬于9ml pH值为10.5的变性缓冲液[8M尿素，0.1M Tris-Cl，1mM甘氨酸，1mM EDTA，10mM DTT，1mM GSH，0.1mM GSSH，10mM β-巯基乙醇]中，37℃下以250rpm震荡1小时，直到沉淀完全溶解。

将以上溶解后的变性蛋白质以1∶20~1∶50的稀释比例注入复性缓冲液[50mM Tris-Cl，15mM L-精氨酸，2mM EDTA，0.1％Tween 80，0.25mM GSSH，1mM GSH]中，使pH值为9.5，而且使得整体蛋白浓度不超过1mg/ml，并在4℃下磁力搅拌6~12小时。然后每隔2~6小时小心加入1M盐酸来降低整体缓冲液的pH值0.2～0.5，并通过添加125 mM GSSH来增加整体氧化剂GSSH浓度50~100％，并依次使整体还原剂GSH浓度降低50~100％，然后4℃下继续缓慢搅拌。将以上调整缓冲液pH值和氧化剂浓度的步骤重复若干次，直至最终缓冲液的pH值为7.3~7.6，而且整个复性过程中逐步降低还原剂的浓度并提高氧化剂的浓度，以至于其还原剂的终浓度为0~10mM；氧化剂的终浓度为1~100mM。至此，复性过程结束。在一个具体实施方式中，以上复性的具体步骤如下：

1)调整pH到9.5和氧化性GSSH至终浓度0.25mM，缓慢搅拌6-12小时。

2)调整pH到9.0和氧化性GSSH至终浓度0.5mM，缓慢搅拌2~6小时。

3)调整pH到8.8和氧化性GSSH至终浓度0.75mM，缓慢搅拌2~6小时。

4)调整pH到8.6和氧化性GSSH至终浓度1.0mM，缓慢搅拌2~6小时。

5)调整pH到8.4和氧化性GSSH至终浓度1.25mM，缓慢搅拌2~6小时。

6)调整pH到8.2和氧化性GSSH至终浓度1.5mM，缓慢搅拌2~6小时。

7)调整pH到8.0和氧化性GSSH至终浓度1.75mM，缓慢搅拌2~6小时。

8)调整pH到7.8和氧化性GSSH至终浓度2.0mM，缓慢搅拌2~6小时。

9)调整pH到7.6和氧化性GSSH至终浓度2.25mM，缓慢搅拌2~6小时。

10)调整pH到7.4和氧化性GSSH至终浓度2.5mM，缓慢搅拌2~6小时。

图3显示了以上主要复性步骤所得的中间产物的电泳结果。

实施例4  重组组织型纤溶酶原激活剂变体蛋白的纯化

使用柱缓冲液A[50mM Tris-Cl，2mM EDTA，0.1％Tween 80，pH7.4]将赖氨酸树脂亲和填料(购自Amersham Biosciences，USA)进行清洗和平衡，然后将复性蛋白上样到赖氨酸树脂柱中，并使用8倍柱床体积的柱缓冲液B[50mM Tris-Cl，2mM EDTA，0.1％Tween 80，0.1M NaCl，pH7.4]进行清洗。最后使用柱缓冲液C[50mM Tris-Cl，2mM EDTA，0.1％Tween 80，0.5M NaCl，0.2M赖氨酸，pH7.4]进行洗脱。

使用2倍柱床体积的0.01M PBS(pH7.4)平衡Sephadex G-25柱(购自Amersham Biosciences，USA)，然后将1/5的Sephadex G-25柱床体积的经赖氨酸树脂纯化后的重组蛋白上样到Sephadex G-25柱中，再使用1倍柱床体积的0.01M PBS(pH7.4)洗脱目的蛋白。

实施例5  重组组织型纤溶酶原激活剂变体蛋白的活性鉴定取20ml煮溶的缓冲液(0.1％琼脂糖，20mM Tris-Cl，100mM NaCl，0.01％Tween 80，pH7.5)与1ml 20mg/ml纤维蛋白原(溶于50mM Tris-Cl，100mM NaCl，0.01％Tween 80，pH7.5)混合，倒入预先加有20U的凝血酶100ul和4个酪蛋白单位的纤溶酶原100ul的平板上，快速混匀，凝固后用打孔器打孔若干个，孔径3mm，空间距1cm左右。分别往上述纤维平板孔里加入以上过程制备出的重组组织型纤溶酶原激活剂变体蛋白和纤溶酶原激活剂变体蛋白标准品(天普公司，广州)，进行纤溶活性的测定。测定样品溶圈的面积，与标准品的进行定量比较(图4)。图4的结果显示通过本发明的复性过程得到的重组组织型纤溶酶原激活剂变体蛋白已经达到了复性的要求，经过对比计算表现出了该蛋白具有1M IU/10mg的纤溶活性。因此本发明提供了一种重组蛋白的高效变复性的方法，可以高效稳定的获取活性蛋白。

Claims (8)

1.一种重组组织型纤溶酶原激活剂变体蛋白的高效变复性的方法，其特征在于蛋白质复性的不同阶段使用了含有不同pH值与不同浓度和比例的还原剂/氧化剂所组成的复合动态缓冲液，该方法的步骤如下：

(1)使用pH值为10~11的变性缓冲液溶解重组组织型纤溶酶原激活剂变体蛋白，且缓冲液组成为8M尿素、0.1M Tris-Cl、1mM的甘氨酸、1mMEDTA、10mM DTT、1mMGSH、0.1mM GSSH和10mM β-巯基乙醇；

(2)加入复性缓冲液，且该缓冲液组成为50mM Tris-Cl、15mM L-精氨酸，2mM EDTA、0.1％Tween 80、0.25mM的氧化剂GSSH，以及1mM的GSH，使得到的溶液pH值比步骤(1)所得到溶液的pH值降低了0.5~1.0，而且使氧化剂浓度比步骤(1)中的氧化剂浓度增加100~300％，还原剂浓度比步骤(1)中的还原剂浓度降低50％~100％；

(3)调节复性缓冲液，使得到的溶液pH值比上一步骤(2)得到溶液的pH值降低了0.2~0.5，而且使氧化剂浓度比上一步骤(2)的氧化剂浓度增加10~100％，还原剂浓度比上一步骤中的还原剂浓度降低50％~100％；

(4)重复步骤(3)若干次，使每一步所得的溶液的pH值都比上一步的溶液的pH值降低0.2~0.5，而且使氧化剂浓度比上一步骤的氧化剂浓度增加50~100％，直至最终溶液的pH值达到pH7.3~7.6，并使氧化剂的终浓度为1~10mM，还原剂的终浓度为0~10mM。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，调节复性缓冲液的步骤中不加入还原剂。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，重组蛋白在每一步的不同缓冲液中都能静止或者动态的放置60分钟以上。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，复性缓冲液的pH值与氧化还原剂的调节是在原有缓冲液中进行调节，或是使用重新配置的缓冲液。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，复性过程中，复性缓冲液的pH值的动态变化以及氧化还原剂的浓度的动态变化的速度是可调节的。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，复性缓冲液的pH值与氧化还原剂的浓度是同时发生变化的。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，调节复性缓冲液的步骤之间，pH值和/或氧化还原剂的浓度的调整幅度是相同的。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，复性过程中复性缓冲液的氧化还原剂的浓度比例改变，而pH值可以不变。

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