CN101245111A

CN101245111A - 一种新型抗凝溶栓双功能融合蛋白的高效表达和复性

Info

Publication number: CN101245111A
Application number: CNA2008100450614A
Authority: CN
Inventors: 余蓉; 梁兰; 高玲; 李玲灵; 吴梧桐; 杨继虞
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2008-03-27
Filing date: 2008-03-27
Publication date: 2008-08-20

Abstract

本发明属于生物制药领域，具体涉及到一种新型抗凝溶栓双功能融合蛋白——水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白(HV12p－rPA)的高效表达和透析复性法。高效表达法通过优化表达HV12p－rPA蛋白的大肠杆菌的7个培养条件，证明摇床转速即通风量和微量元素对表达量提高有显著影响，使其提高到约29％。本方法简单、易行、高效，不提高成本，对实验室规模或商业化生产均有较好应用价值。透析复性法其特征在于：采用“洗涤”-“变性溶解”-“梯度透析”的过程。本法与通常的透析复性法相比，证明了用Gly－NaOH代替Tris－HCl作缓冲体系和用胱氨酸－半胱氨酸代替GSSG/GSH作为氧化还原体系，同样效果良好。该法效果稳定，蛋白浓度高，易操作，去除了会对临床使用有毒的物质，且成本低廉，产业化前景良好。

Description

一种新型抗凝溶栓双功能融合蛋白的高效表达和复性

技术领域

本发明涉及生物制药领域，具体地说是涉及新型抗凝溶栓双功能融合蛋白——水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白(HV12p-rPA)的高效表达和透析复性方法。

背景技术

本发明中的复性对象水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白(HV12p-rPA)，是通过一个(Gly)₃柔性肽基团首次将重组水蛭素HV3的C末端12肽与rPA基因融合而成的全新蛋白。

溶栓药物瑞替普酶(reteplase，r-PA)是人组织纤溶酶原激活剂(t-PA)的缺失变异体，它是在t-PA分子原结构的基础上，删除了其中的kringle I、Finger、EGF 3个结构域的单链非糖基化蛋白，分子量为39kDa，含有9对二硫键，为第三代溶栓药物。r-PA起效快，药效强，出血等副作用小。水蛭素是迄今作用最强的特异性凝血酶抑制剂，具有很强的抗凝、抗栓活性，其抗血栓性能优于肝素，对多种血栓疾病具有预防和治疗效果。目前研究已确认，水蛭素从10肽开始具有抗凝活性，以12肽为具有最大活性的最小肽段。水蛭素12肽其较小的分子量相对于水蛭素全长蛋白来说更有利于减小抗原性的副作用和影响。

由这两者融合而成的新型抗凝溶栓双功能蛋白，具有更长的作用半衰期，方便患者使用，且能有更高选择性地作用于血栓部位、和全身出血性副作用小等特点，作用更为肯定可靠，而其较小的分子量更有利于减小抗原性的副作用和影响。它可以在大肠杆菌中进行表达.但在本发明的优化之前，该融合蛋白在大肠杆菌中表达水平很低，约占全菌总蛋白的12％。经过本发明的优化后，其表达量提高到约29％。本发明的关键是在培养基中添加了钙、镁两种微量元素并且通过摇床转速来控制通风量。事实证明，这两个因素对提高表达量具有显著的影响。大肠杆菌表达体系高效、经济，可用高密度发酵工艺进行大规模培养，因而降低了成本.但是由于融合蛋白的r-PA分子中18个Cys要形成9对二硫键，所以大肠杆菌表达r-PA时，因发生二硫键的错配而形成致密的包涵体，溶解变性后要使其重写正确折叠和复性成活性状态非常困难，这是由于组成九对二硫键的18个Cys在复性时错误配对造成的。

蛋白质复性技术是基因工程蛋白产生的重大共性关键技术，直接关系到生产成本和技术能否产业化，所以，研究基因工程蛋白的复性技术不但在理论上有重大意义而且也有重大的应用价值。蛋白的体外复性被认为是一项异常艰巨的任务，目前已存在的复性方法是很多的，较常见的除了稀释复性以外，还有透析复性、柱上复性……但普遍复性率不高，只有20％左右的目的蛋白分子(汪家政等，蛋白质技术手册，科学出版社，2001年，p31)得到正确的空间构型，获得生物学活性。并且，变性蛋白的体外复性受外部环境的影响较大，不同蛋白的复性过程不同，特异的复性环境，包括缓冲液的组成、蛋白浓度、温度、pH等应根据蛋白的不同而异。没有哪种复性方法可以通用于所有的蛋白。近来，有人转向于体内蛋白质折叠的模拟，产生了一些新的方法，例如将小分子伴侣固定化后，相当于亲和层析的原理，复性蛋白质的同时使其浓缩和纯化。有很大的应用前景，但是，由于这些分子伴侣均需要特别制备技术，对于大规模多种蛋白质制备，仍属昂贵试剂。所以，要将实验室的研究成果产业化，获取实际的生产成果，就不得不考虑生产成本以及操作难易程度这两个问题。因此，制约基因药物生产的一个关键性难题就是复性效率、复性成本以及生产操作难易的问题。

水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白(HV12p-rPA)含有九对二硫键，无疑为其复性增加了更大的难度，其复性问题是下游工作的一个很大的考验。目前，对于这种含有多对二硫键的蛋白的复性率普遍不高。例如：同样含有九对二硫键的瑞替普酶(r-PA)，Kohnert(KohnertU，Rudolph R，Verheijen J H，et al.Biochemical properties of the kringle 2 andprotease domains are maintained in the refolding t-PA deletion variant BM 06.022.Protein Engineering，1992，5(1)：93～100)等用稀释复性法复性r-PA，具体步骤是将变性蛋白加入到缓冲液(0.05mol/L Tris-HCl，pH 9.3；6mol/L盐酸胍，0.1mol/L GSSG)中，25℃，3.5h，用氧化型谷胱甘肽使r-PA的巯基衍生化(derivatized)以对巯基进行保护。再用10L蛋白质复性(折叠)缓冲液[refolding buffer：0.7mol/L精氨酸-盐酸，pH8.6；2mmol/L GSH；1mmol/L EDTA]，添加300ml二硫化物混合液，分成3部分，放置24h进行复性，其复性率不超过5％。孙石静(孙石静等.瑞替普酶融合蛋白在大肠杆菌中表达条件的优化及其复性.中国药科大学学报，2005，36(4)：363-367)等运用金属螯合柱一步复性，融合蛋白复性率也仅达10％。赵友春(赵友春等.提高溶栓新药瑞替普酶生产得率的中试研究.化工科技，2003，11(1)：15～17)等改进了Kohnert的方法，在谷胱甘肽还原体系中，用重组人二硫键异构酶(PDI)辅助瑞替普酶复性，其复性率达到14％以上。但是PDI价格昂贵，用于工业化无疑大大提高了成本。在本专利中，采用了透析复性方法对水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白进行复性，本发明中的透析复性法，与常用方法相比，其改进在于首先采用了Gly-NaOH代替常用的Tris-HCl作为缓冲体系，Gly价格更低廉，且被动物耐受，使该蛋白在复性后可以直接用于药效学评价以及临床研究及应用，Tris则必须除去后才能用于动物和人体，而Tris的去除又是一个有待研究的课题。二是采用胱氨酸-半胱氨酸代替了GSSG/GSH作为氧化还原体系，二者相比，后者价格昂贵，只能用于实验室研究而不能用于产业化。做出这两个改进后，复性后溶栓活性可达6209IU/mg，抗凝活性为709ATU/mg。且透析复性后蛋白浓度较高，加入蔗糖或海藻糖等保护剂后可冻干保存，其稳定性较好。

发明内容

本发明针对的对象是一种全新的抗凝溶栓双功能融合蛋白——瑞替普酶-水蛭素12肽融合蛋白(HV12p-rPA)，在大肠杆菌中表达的该融合蛋白，其表达水平的高低直接影响后续的研究及其产业化的进展，且它以不溶性的包涵体形式存在，含有九对二硫键，疏水性也较强，极易造成二硫键错配和聚集体形成，复性非常困难，且复性后必须保证其具有双功能活性。本专利针对这些问题，公开了一种高效表达该融合蛋白的方法和梯度透析复性法。

高效表达方法如下：

以1％的接种量，将甘油(15％)管保存的菌种接种至新鲜含Am(100ug/ml)的LB液体培养基中37℃培养12h，使菌种得到活化。再将此活化的菌液转接至蒸馏水配制的LB培养基(含Amp浓度为100ug/ml)中，按照5％的接种量加入菌种，37℃，200r/min恒温培养3h后，加入诱导剂IPTG使终浓度为1mmol/L，再以200r/min，39℃恒温诱导4h，结束后，收菌，即4℃下以8000r/min离心3min，所得菌体沉淀以PBS(pH7.4)吹匀洗涤一次后，同条件离心得菌体，可获得高效表达的水蛭素12肽与r-PA融合蛋白，表达量约占总蛋白29％。

其中优化方案如下：

采用正交法，选取摇瓶培养条件中七个主要因素进行两水平正交优化实验。该七个因素为：培养基的配制、接种量、诱导时间、转速、诱导温度、补料方式、微量元素。借助SDS-PAGE和Bandscan凝胶分析软件，获得该融合蛋白在菌体总蛋白中的表达量百分数，作为考察条件优化的目标量。选用L₈(2⁷)安排，进行八次实验，对实验结果进行分析，通过极差分析，显示出微量元素钙、镁的添加以及摇床转速(即通风量)对表达量结果影响最大。其他因素则是综合发酵工艺的简便以及节约资源的角度来选取。

本发明是通过控制通风量和添加微量元素来提高水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白的表达水平，使其表达量提高到约29％。该方法的优点在于：方法简便、易行，提高产量，但不提高成本。大大节省了时间、人力、物力和财力。无论对于实验室规模或商业化生产均有较好的应用价值。

附图说明：

图中1为中分子量marker(6-10分别表示97.4KD、66.2KD、42.7KD、31.0KD、14.4KD)；2-4分别为三次平行实验包涵体表达量；11代表融合蛋白。

最佳实施例：

1.方法：

①保种：取牛奶冻干管中的HrP/BL21表达工程菌，以LB液体培养基配成溶液后，在LB固体培养基(含100ug/mL Amp)平板上涂布，37℃培养过夜，挑取平板上菌落接种至LB液体培养基(含100ug/mL Amp)，37℃，200r/min振摇过夜。以15％的甘油保存于-20℃冰箱中备用。

②摇瓶发酵：以1％的接种量，将甘油(15％)管保存的菌种接种至新鲜含Amp(100ug/ml)的LB液体培养基中37℃培养12h，使菌种得到活化。再将此活化的菌液按5％的接种量转接至摇瓶中，摇瓶内为蒸馏水配制的LB培养基，其中含Amp100ug/ml，Ca²⁺1mmol/L、Mg²⁺20mmol/L继续培养3h后，加IPTG(1mmol/L)作为诱导剂，39℃下，200r/min诱导4h。

③收菌：诱导结束后，收菌，即4℃下以8 000r/min离心3min，所得菌体沉淀以PBS(pH7.4)吹匀洗涤一次后，同条件离心得菌体。

④菌体的破碎：以Tris-Cl(pH 8.0)重悬菌体，250W，5s×10s，冰浴超声累计5min，12 000r/min，4℃离心20min得包涵体，-20℃保存。

2.结果鉴定：吸取超声裂解后的溶液(未离心)100ul到EP管中，加入100ul 1×SDS的上样缓冲液。煮沸3-5分钟后，每个电泳样品各加20ul做SDS-PAGE，以考马斯亮蓝G-25染色6h，脱色后进行扫描，再以bandscan 3.0软件计算目的蛋白在菌体总蛋白中的表达量。

采用该条件做三次平行试验，结果表达量分别为28.3％、26.5％、31.1％平均表达量为28.6％，其SDS-PAGE结果如附图。

梯度透析复性技术方案：用工程菌表达融合蛋白——超声破碎菌体——离心分离得包涵体沉淀——Triton洗涤包涵体——离心，保留包涵体沉淀——用加入精氨酸及氯化钠的脲或盐酸胍溶液变性溶解包涵体——将澄清的包涵体溶液装入透析袋，袋外用含梯度浓度尿素的缓冲液于4℃进行梯度透析，每6-8h换液一次——透析结束后，测定袋内溶液的溶栓活性和抗凝活性——冷冻干燥，干燥器内保存。

最佳实施例：

1.包涵体的洗涤：

称取超声破菌后的200mg包涵体，按1∶10(w/v)比例用Triton溶液(50mmol/L Gly-NaOHbuffer(pH8.6)，10mmol/L EDTA，0.5％Triton X-100，100mmol/L NaCl)吹匀，搅拌2h，在4℃下，以12 000r/min离心，收集沉淀。

2.包涵体的溶解：

按照1∶30(w/v)的比例用8mol/L的尿素缓冲液(8mol/L尿素，0.7mol/L L-Arg，50mmol/L DTT，100mmol/L NaCl，50mmol/L Gly-NaOH buffer，pH8.6)溶解洗涤后的包涵体，搅拌溶解4h-6h，在4℃下，以12 000r/min离心，收集上清液，弃去不溶沉淀物。

3.变性蛋白溶液浓度测定：以考马斯亮兰法测定蛋白质浓度，约为427μg/ml。

4.将上步中所述上清液装进透析袋(规格：10000道尔顿)中，依次用含6、4、2、1、0.5、0mol/L尿素的基础透析缓冲液(袋内袋外溶液体积比为1∶50)于4℃进行透析，每8h换液一次。其中，基础透析缓冲液为：20mmol/L Gly-NaOH(pH9.2)，0.5mol/L L-Arg，1mmol/L半胱氨酸，1mmol/L胱氨酸。

5.透析结束后，采用考马斯亮兰法测定透析袋内蛋白液的浓度，约为225.6ug/ml

6.生物活性的测定：

(1)抗凝活性的测定：于酶标板小孔中加200μl 4mg/ml的人纤维蛋白原(0.05mol/L Tris-HCl，0.15mol/L NaCl缓冲液(pH7.4)配制)，再加入50μl复性的蛋白溶液，充分混匀。用微量进样器吸取标准的凝血酶溶液(400NIH单位)，时间间隔为1min，若在1min内纤维蛋白原发生凝固，即说明已达滴定终点。由凝血酶的消耗量换算出水蛭素的单位数。由于水蛭素与凝血酶是1∶1结合，故每消耗一个凝血酶单位(NIH)相当于一个抗凝血酶单位(ATU)。

(2)纤溶活性测定：

纤维蛋白-琼脂糖平板测定法：配制平板用溶液均为0.05mol/L Tris-HCl，0.15mol/L NaCl缓冲液(pH7.4)。将50μl凝血酶(400NIH单位)加到25ml人纤维蛋白原溶液(4mg/ml)中，迅速混匀，倾入完全融化且降温至50℃左右的25ml琼脂糖溶液(1％)，混匀，倒入直径为15cm的平板中，室温放置0.5以上，凝固后打孔使用。孔中滴加不同比活性(10-20000单位/ml)的尿激酶标准品30μl。平皿加盖，37℃温育15h。测量溶栓圈相互垂直的两直径，以直径积的对数1g中将1BP单位/mL的凝血酶溶液贴壁加入10mL血纤蛋白原(5mg/mL)溶液中，快速混匀，倾入至完全融化且已降至45℃的10mL琼脂糖溶液(1.0％)中，混匀，倒入直径90mm的平皿中，凝固后打孔使用。

用微量移液器分别吸取不同比活性的尿激酶标准品30μl，滴于孔中，平皿加盖后，于37℃温育36h。用游标卡尺测量溶圈相互垂直的两直径，以两直径乘积的对数(1gφ₁φ₂)为纵坐标，以对照品尿激酶单位活性的对数(1gIU/mL)为横坐标，作标准曲线。同样，取待测定的蛋白样品依上述方法检测，将测得数据代入标准曲线方程，求出相应的单位活性(IU/mL)，再根据样品的蛋白含量，进而求得比活性(IU/mg)。

利用滴定法测定复性后蛋白液的抗凝活性为：709ATU/mg；利用平板法测定复性后蛋白液的溶栓活性为：6209IU/mg。

7.将透析后的蛋白液加入1％的蔗糖作为保护剂进行冷冻干燥后保存。

透析亦为一种常见的复性方法，因此它具有操作简单方便的优点。本法的优点在于：(1)方法简单易操作，能够同时将融合蛋白的两种功能较好地恢复；(2)所用试剂均为普通实际，成本低廉；(3)提高了复性后蛋白的浓度，实现了高浓度蛋白质的复性，为后续处理比如冻干保存等步骤减少了麻烦，降低了生产成本，实现了工业化的可能。

Claims

1.一种高效表达水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白(HV12p-rPA)的方法，其特征在于：优化表达该融合蛋白的大肠杆菌的培养条件(培养基组成、接种量、诱导时间、摇床转速即通风量、诱导温度和微量元素)，建立了一套使表达量提到高30％的培养条件，即：在蒸馏水配制的LB培养基(含Amp浓度为100ug/ml)中，按照5％的接种量加入菌种，37℃，200r/min恒温培养3h后，加入诱导剂IPTG使终浓度为1mmol/L，再以200r/min，39℃恒温诱导4h，可获得表达量约为29％的水蛭素12肽与r-PA融合蛋白。水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白(HV12p-rPA)的透析复性方法，其特征在于：采用“Triton洗涤”—“变性溶解”—“梯度透析”的复性过程，复性后溶栓活性达到6209IU/mg，抗凝活性达到709ATU/mg。

2.按照权利要求1所述新型双功能HV12p-rPA融合蛋白高效表达方法，其特征在于：表达对象为全新的水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白(HV12p-rPA)，其表达形式为包涵体蛋白。

3.按照权利要求1所述新型双功能融合蛋白(HV12p-rPA)高效表达方法，其特征在于：培养基组成为LB培养基，其中添加了微量元素Ca²⁺、Mg²⁺浓度分别为1mmol/L和20mmol/L。

4.按照权利要求1所述新型双功能融合蛋白(HV12p-rPA)高效表达方法，其特征在于：接种量为5％，诱导时间为4h，摇床转速为200r/min，诱导温度为39℃，诱导剂为IPTG，其浓度为1mmol/L。

5.按照权利要求1所述新型双功能融合蛋白(HV12p-rPA)的透析复性方法，其特征在于：以全新的水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白的包涵体为原料，具体操作过程如下：

(1)在室温下，收集超声破菌后的包涵体，加入到含有10-20mmol/L金属螯合剂EDTA，50-100mmol/L NaCl的Triton洗涤液中，吹匀后磁力搅拌2-3小时，冷冻离心得沉淀；

(2)在室温下，将洗涤后的包涵体，使用6-8mol/L的尿素或3-7mol/L胍缓冲液，使包涵体变性溶解，其中缓冲液含有还原剂DTT(0.5-1mmol/L)或β-巯基乙醇(10-20mmol/L)，含分子伴侣L-精氨酸0.6-0.7mol/L。搅拌溶解4h以上，12000r/min，15min，除去不溶物，收集上清液。

(3)将(2)中上清液装进透析袋(规格：10000道尔顿)中，依次用分别加入6、4、2、1、0.5、0mol/L尿素的基础透析缓冲液(含0.5-0.6mol/L L-Arg，1mmol/L半胱氨酸，1mmol/L胱氨酸，20mmol/L Gly-NaOH，pH9.2)，袋内袋外溶液体积比≥1∶50，于4℃进行梯度透析，每6-8h换液一次，使其逐渐折叠恢复活性。

(4)将透析后的蛋白液加入1％的蔗糖作为保护剂进行冷冻干燥保存。

6.按照权利要求1所述新型双功能融合蛋白(HV12p-rPA)透析复性法，其特征在于：复性对象为全新的水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白(HV12p-rPA)，其复性成功后应具有抗凝溶栓的双功能。

7.按照权利要求1所述新型双功能融合蛋白(HV12p-rPA)透析复性方法，其特征在于：洗涤包涵体的Triton溶液组成为：10-20mmol/L EDTA，0.5％Triton X-100，50-100mmol/LNaCl，50mmol/L Tris-Cl pH8.5。

8.按照权利要求1所述新型双功能融合蛋白(HV12p-rPA)透析复性方法，其特征在于：变性溶解包涵体的溶液组成为：6-8mol/L脲或3-7mol/L胍中含0.5-1mmol/L DTT或10-20mmol/Lβ-巯基乙醇，0.6-0.7mol/L L-精氨酸，100-150mmol/L NaCl，50mmol/L Tris-Cl或Gly-NaOH pH8.6。

9.按照权利要求1所述新型双功能融合蛋白(HV12p-rPA)透析复性方法，其特征在于：所述基础透析缓冲液组成为：0.5-0.6mol/L L-Arg，1mmol/L半胱氨酸，1mmol/L胱氨酸，20mmol/L Tri-HCl或Gly-NaOH，pH9.0-9.3

10.按照权利要求1所述新型双功能融合蛋白(HV12p-rPA)透析复性方法，其特征在于：所述梯度透析缓冲液为：在基础透析缓冲液中分别加入6、4、2、1、0.5、0mol/L尿素。

11.按照权利要求1所述新型双功能融合蛋白(HV12p-rPA)透析复性方法，其特征在于：分子伴侣为L-Arg。

12.按照权利要求1所述新型双功能融合蛋白(HV12p-rPA)透析复性方法，其特征在于：所述氧化还原系统是指GSSG/GSH，半胱氨酸/胱氨酸。