CN103849583A

CN103849583A - 短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LDS33及其应用

Info

Publication number: CN103849583A
Application number: CN201310752611.7A
Authority: CN
Inventors: 刘冰花; 罗亚雄; 陶雪梅; 蒲小龙; 袁管明; 梁炼国
Original assignee: Chengdu University
Current assignee: Chengdu University
Priority date: 2013-12-31
Filing date: 2013-12-31
Publication date: 2014-06-11
Anticipated expiration: 2033-12-31
Also published as: CN103849583B

Abstract

本发明公开了一种短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LDS33及其在制备抗凝溶栓双活性化合物中的应用，短小芽孢杆菌LDS33保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO：M2013179，GenBank登录号为KF515275。本发明的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LDS33菌株具有耐碱、耐盐、耐热、耐冷，易于培养、培养成本低、不受体系中有机物抑制等优点，其发酵液可用于提取具有抗凝、溶栓双活性作用的化合物，该化合物活性高、稳定性好，可用于抗血栓药物或保健品领域。

Description

短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)LDS33及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LDS33及其在制备抗凝溶栓双活性化合物中的应用。

背景技术

血栓栓塞性疾病是加速人体衰老、致残、甚至死亡的直接原因和罪魁祸首，全身哪里有血管，哪里就有可能发生血栓，因此，防治血栓已成为世界各国最关心的问题之一。

溶栓抗凝疗法是治疗血栓性疾病效果最好的疗法之一，抗血栓药物的发展对控制血栓病人的死亡率和致残率起到了十分重要的作用。目前，临床上治疗血栓病的药物大都作用单一，要么只有溶栓作用，要么只有抗凝作用，使用时抗凝、溶栓需要分别给药，这给临床应用带来了许多不便之处，所以寻找溶栓活性高、副作用小、且具有溶栓和抗凝双活性的药物已逐渐成为全世界医药行业的研究热点。

短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）属于芽孢杆菌属，产生活性物质的概率很高，不仅可以产生多种酶，如耐热木聚糖酶、耐热丝氨酸碱性蛋白酶、谷氨酰内肽酶、胆红素氧化酶、胶原蛋白酶、脂肪酶、耐热角蛋白酶、降解毒死蜱的酶、降解石油的酶、降解血红蛋白的酶等，还可以产生多种抗生素，特别是抗真菌的抗生素。所以寻找新的抗血栓药物，同时发掘短小芽孢杆菌的新用途，具有重要的科学研究和应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可产生抗凝溶栓双活性作用化合物的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LDS33。

本发明的另一目的在于提供上述短小芽孢杆菌LDS33在制备具有抗凝溶栓双活性作用化合物中的应用。

本发明提供的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LDS33已于2013年05月07日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心，保藏号为：CCTCC NO：M2013179，GenBank登录号为：KF515275。

本发明提供的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LDS33在VY/4平板上的菌落为淡黄色、较薄、表面黏湿，边缘不整齐，有很多树叶边缘状的突起。该菌株在VY/4平板上生长缓慢，可滑动。其菌体长约1.67μm-3.67μm，宽约0.5μm-0.67μm。

菌株Bacillus pumilus LDS33既可在VY/4培养基上生长，又可在LB培养基上生长，适宜的生长温度为15℃-50℃，最佳生长温度为30℃-35℃。另外，菌株Bacillus pumilus LDS33培养是在好氧条件下进行的，培养基的pH范围为pH4.0-pH12.0，说明该菌既可在酸性条件下生长繁殖，又可在碱性条件下生长繁殖，pH8.5-pH9.0是其最适的生长条件。

本发明提供的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LDS33可用于提取具有抗凝和溶栓双活性作用的化合物。

本发明的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LDS33菌株具有耐碱、耐盐、耐热、耐冷，易于培养、培养成本低、不受体系中有机物抑制等优点，其发酵液可用于提取具有抗凝溶栓双活性作用的化合物，该化合物活性高、稳定性好，可用于抗血栓药物或保健品领域。

附图说明

图1为抗凝溶栓双活性化合物在纤维蛋白平板上形成的透明圈。

图2为尿激酶标准曲线。

图3为菌株LDS33的基因同源性的系统发育树。

图4为菌株LDS33在不同pH值的LB培养基中的生长状况。

图5为Sephadex G-200层析图谱。

图1中：①30μL10U/mL尿激酶；②30μL100U/mL尿激酶；③30μL500U/mL尿激酶；④30μL1000U/mL尿激酶；⑤30μL2500U/mL尿激酶；⑥30μL5000U/mL尿激酶；⊙30μL菌株LDS33的胞外浓缩液。

图3中：圆括号内为GenBank中的登录号。每个分支点处的数字为Bootstrap（1000次重复抽样）的支持百分率。标尺代表1%的序列差异。

图5中：峰A为活性峰，其它峰为杂蛋白峰。

具体实施方式

实施例1

1.短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LDS33的筛选

（1）材料

a.样品：

采自成都市及周边洛带、龙泉驿、双流等地的兔粪、羊粪、泥土、水等共20个样品。样品采回后风干，马上使用(水样不用风干，采回后直接使用)。

b.培养基：

VY/4固体培养基：安琪酵母0.25％，CaCl₂·2H₂O0.1％，维生素B₁₂0.5μg/ml、琼脂粉1.60％，pH7.22。

酪蛋白培养基：酪蛋白0.25%，NaCl0.05%，无水CaCl₂0.01%，维生素B₁₂0.5μg/ml，琼脂粉1.6%，pH值7.22。

c.试剂及仪器：

试剂：安琪酵母（湖北安琪酵母股份有限公司），维生素Ｂ₁₂（BR）（成都市科龙化工试剂厂）等。

仪器：SW-CJ-1D洁净工作台（江苏苏洁净化设备厂），DH-400型电热恒温培养箱(北京中兴伟业仪器有限公司)，全温振荡培养箱（琅玕），奥林巴斯生物显微镜CX21BlM-SET6，PCR反应扩增仪（加拿大BBI公司），3730测序列分析仪(美国ABI公司)，YXJ-2离心机（湘仪离心机仪器有限公司），H6-1微型电泳槽（上海精益有机玻璃制品仪器厂），Sherolock全自动细菌鉴定系统（美国MIDI（Microbial Identification）公司），凝胶成像系统（Gene Genius公司），U-3010紫外-可见分光光度计(Hitachi公司)，移液器（范围100μl-1000μl，20μl-200μl，0.5μl-10μl）（加拿大BBI公司），等。

（2）菌株Bacillus pumilus LDS的筛选

a、样品的预处理：取样品适量，用30mg/L的多菌灵溶液浸泡(水样不用多菌灵处理)；

b、VY/4平板法：将用多菌灵处理过的兔粪、羊粪、泥土等样品及没有用多菌灵处理过的水样放入加有30mg/L多菌灵的VY/4平板上，置30℃恒温培养，及时挑取疑似短小芽孢杆菌的菌落，转接于VY/4平板上，继续置30℃恒温培养，反复转接于VY/4平板上，30℃恒温培养，直到目测单一菌落为止。

c、酪蛋白平板法：将疑似菌株接种在酪蛋白平板上，30℃恒温培养，观察是否有透明圈并测量透明圈直径大小，有透明圈者则证明该菌株可能产生纤溶酶，透明圈直径(D)与菌落直径(d)之比(D/d)越大，其酶活性越高。

选择透明圈直径(D)与菌落直径(d)之比(D/d)最大的菌株，最终从成都市洛带镇某鱼池水样中分离到短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LDS33菌株。

2.短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LDS33菌株的鉴定

（1）短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LDS33菌株的形态特征：

将目的菌株在VY/4固体培养基上进行稀释涂布，在30℃培养箱中恒温培养4d-5d，观察菌落形态，同时对菌株进行革兰氏染色，发现菌株Bacillus pumilus LDS33在VY/4平板上的菌落为淡黄色、较薄、表面黏湿，边缘不整齐，有很多树叶边缘状的突起。同时该菌株在VY/4平板上生长缓慢，可滑动。革兰氏阳性，其芽孢端生，杆状，两端钝圆，其菌体长约1.67μm-3.67μm，宽约0.5μm-0.67μm，菌体不具有荚膜，无鞭毛。

（2）短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LDS33菌株的理化性质检验：

菌株Bacillus pumilus LDS33的理化性质通过接触酶试验、葡萄糖氧化发酵实验、V-P测定、淀粉水解试验、明胶水解试验、马尿酸盐水解试验、硝酸盐还原试验、厌氧洋菜中是否生长等实验来验证，结果如表1所示。

表1.短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LDS33的理化性质

“+”表示阳性，“-”表示阴性。

（3）短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LDS33菌株的脂肪酸含量（由中国科学院微生物研究所测定：（2013）微检字第460号）

采用美国MIDI（Microbial Identification）公司Sherolock全自动细菌鉴定系统对菌株LDS33进行菌体脂肪酸成分分析，测得菌株LDS33的细胞脂肪酸含C14:0ISO1.61%，C15:0ISO59.4%，C15:0ANTEISO26.69%，C16:1W7C ALCOHOL1.33%，C16:0ISO2.02%，C16:01.32%，C17:1ISOW10C1.83%，C17:1ISO I/ANTEISO B1.31%，C17:0ISO1.83%，C17:0ANTEISO2.24%，其中芽孢杆菌的特征性脂肪酸C15:0ISO含量最高，C15:0ANTEISO含量次之，且C15:0ISO／C15:0ANTEISO的比值为2.23，符合短小芽孢杆菌的特征（刘国红等，芽胞杆菌种类脂肪酸鉴定与分子鉴定方法的比较[J]，福建农业学报，2012，27(2)：173-181.）。

（4）短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LDS33菌株的G+C mol/%含量（由中国科学院微生物研究所测定：（2013）微检字第461号）

采用溶解温度（Tm）法，以大肠埃希菌（E.coli K12，CGMCC1.365）为参比对照，测得菌株LDS33基因组DNA的G+C mol/%含量为38.82mol/%，符合短小芽孢杆菌的特征（Holt JG等，伯杰斯细菌鉴定手册第九版，2004:729–731.）。

（5）短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LDS33菌株的16S rRNA同源性

直接将菌株Bacillus pumilus LDS33送往上海生工对其16S rDNA序列测序，发现其16S rDNA共有1440bp（见序列表），将其16S rDNA序列输入NCBIGenBank中blast，发现其和菌株Bacillus pumilus SAFR-032的相似度为99%，和菌株Bacillus atrophaeus1942的相似度为98%，和菌株Bacillus amyloliquefaciens FZB42的相似度为97%，用MEGA5.2.1软件构建系统发育树，采用邻位相接法，1000次重复抽样，发现菌株LDS33与菌株Bacillus pumilus SAFR-032（AY167879.1）聚到了同一个分支，亲缘关系最近。

根据菌株的菌体及菌落形态、生理生化特性、脂肪酸含量、G+C mol/% 含量及16S rRNA基因序列的比对结果，确定细菌LDS33属于硬壁菌门芽孢杆菌目芽孢杆菌科芽孢杆菌属的短小芽孢杆菌，命名为Bacillus pumilus LDS33（图3）。该菌与文献已报道的短小芽孢杆菌菌种在某些特性方面存在明显的差异，是一株新型的短小芽孢杆菌菌种。

4.短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LDS33菌株培养条件的筛选

（1）菌株Bacillus pumilus LDS33生长所需pH值的测定

短小芽孢杆菌Bacillus pumilus LDS33菌株既可在VY/4培养基又可在LB培养基上生长，由于VY/4液体培养基本身是混浊的，无法用分光光度法准确测定细菌的生长情况，所以在进行细菌耐酸碱实验中用的是LB液体培养基。

分别配制pH4.0-pH12.0的LB液体培养基，过滤后分装于长试管中，每管5mL，用棉塞塞好，121℃消毒25分钟。保存菌株活化后，稀释涂平板(30℃、4d)，分别挑取单菌落于上述装有5mL LB液体培养基的试管中（每个pH平行做3管），置旋转式摇床30℃、150r/min培养36小时。以空白LB液体培养基作对照，在波长580nm处测不同试管中培养液的吸光度，以pH值为横坐标，以吸光值A为纵坐标，寻找短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)LDS33菌株生长的最佳pH范围，如图4所示。从图4可知短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)LDS33菌株可生长的pH范围为pH4.0-pH12.0，其最适pH范围为pH8.5-pH9.0，是一种嗜碱菌。

（2）菌株Bacillus pumilus LDS33生长所需温度的测定

保存菌株活化后，转接于VY/4斜面或LB斜面上，分别将斜面置于15℃、20℃、25℃、28℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃的培养箱中恒温培养，观察细菌的生长状况，发现菌株在15℃-50℃之间均能生长。通过细胞计数检测，发现在30℃-35℃时，细胞传代繁殖时间最短，是该菌的最佳生长温度。

（3）菌株Bacillus pumilus LDS33耐盐量的测定

保存菌株活化后，分别转接于NaCL浓度为1.0%-10%的LB斜面上，置30℃培养箱恒温培养，观察其是否生长。发现短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)LDS33菌株可以在NaCL浓度为1.0%-9%的LB斜面上生长，最高耐盐量为9%。

另外，短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)LDS33菌株培养是在好氧条件下进行。

实施例2短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LDS33菌株分泌的胞外物质抗血栓活性的检测

（1）材料

a.培养基：

种子培养基：安琪酵母0.25％、CaCl₂·2H₂O0.1％、维生素B₁₂0.5μg/ml，pH7.22；

发酵培养基：安琪酵母0.375%、CaCl₂·2H₂O0.1%、VitB₁₂0.5μg/ml。pH7.22。

（2）试剂及仪器：

试剂：安琪酵母（湖北安琪酵母股份有限公司），维生素Ｂ₁₂（BR）（成都市科龙化工试剂厂），尿激酶(注射用尿激酶，100000U/支，丽珠集团丽珠制药厂)，凝血酶(注射用凝血酶，500U/支，湖南一格制药有限公司)，纤维蛋白原1g／瓶(sigma公司)。

仪器：SW-CJ-1D洁净工作台（江苏苏洁净化设备厂），DH-400型电热恒温培养箱(北京中兴伟业仪器有限公司)，全温振荡培养箱（琅玕），YXJ-2离心机（湘仪离心机仪器有限公司），移液器（范围100μl-1000μl，20μl-200μl，0.5μl-10μl）（加拿大BBI公司）。

（3）菌株Bacillus pumilus LDS33分泌的胞外活性物质溶液的制备：

将保存的菌株活化后，稀释涂平板(30℃、4d)，挑取单菌落于100ml 种子培养基中，置旋转式摇床30℃、150r/min培养2d，再以5%的接种量转接入100ml发酵培养基中，置旋转式摇床30℃、100r/min培养7d，然后将发酵液离心(4000r/min，30min)，使上清液和菌体沉淀分离，弃沉淀。50℃旋转蒸发上清液至体积为2ml，此为胞外浓缩液。然后在胞外浓缩液中缓慢加入固体硫酸铵，使其中的蛋白质（多肽、寡肽）完全沉淀，离心，分离上清液和沉淀，沉淀用水或缓冲液溶解，得到菌株LDS33分泌的胞外蛋白质（多肽、寡肽）溶液。

（4）菌株Bacillus pumilus LDS33分泌的胞外活性物质溶栓活性的检测

a.纤维蛋白平板法：

称取0.225g琼脂糖加入长试管中，再加入10ml浓度为0.1mol/L的pH7.4的磷酸缓冲液，加热熔化后在60℃水浴中温育，得A液；称取10mg纤维蛋白原放入长试管中，加入5ml0.1mol/L的pH7.4的磷酸缓冲液溶解，于45℃孵箱温育，得B液；量取2ml20U/ml凝血酶溶液于直径9.0cm的培养皿中，再加入2ml0.1mol/L的pH7.4的磷酸缓冲液，混匀，于45℃孵箱温育，得C液。然后将A液倒入B液的试管中，混匀，再将A、B混合液倒入C液所在的平板中，混匀，在水平桌面上静置20min，待平板凝固后，打孔。

向纤维蛋白平板的孔中分别滴加30μl10U/ml、100U/ml、500U/ml、1000U/ml、2500U/ml、5000U/ml的尿激酶标准品和30μl菌株的胞外浓缩液，平皿加盖，35℃温育6h，观察目的菌株的胞外浓缩液是否像尿激酶一样会出现透明圈，如果出现透明圈就说明有溶栓活性，并计算出目的菌株胞外浓缩液纤溶酶的酶活力单位。在另一纤维蛋白平板的孔中分别滴加30μl5000U/ml尿激酶标准品、30μl目的菌株的胞外蛋白质（多肽、寡肽）溶液和30μl胞外浓缩液经硫酸铵沉淀后的上清液，平皿加盖，35℃温育6h，观察是否出现透明圈及透明圈大小。发现加有菌株LDS33胞外浓缩液的孔周围出现非常明显而且大的透明圈，说明菌株LDS33的胞外浓缩液具有非常强的溶栓活性，如图1所示。以透明圈的两个垂直直径的乘积的常用对数为横坐标，以尿激酶标准品的酶活力单位的常用对数为纵坐标，作图得出溶栓酶活性的标准曲线，如图2所示，根据标准曲线和LDS33的胞外浓缩液在纤维蛋白平板上的透明圈直径乘积的大小，计算出其酶活力单位高达18055U/mL。同时发现加有胞外蛋白质（多肽、寡肽）溶液的孔周围有明显的透明圈，而加有胞外浓缩液经硫酸铵沉淀后的上清液的孔周围没有出现透明圈，说明溶栓活性由菌株LDS33的胞外蛋白质（多肽、寡肽）溶液产生。

b.纤维蛋白试管法：

取两支短试管，分别向其中加入2.5mg/ml的纤维蛋白原溶液2ml，置37℃水浴中3min，然后向每支试管中一滴一滴加入20U/ml的凝血酶溶液，边加边摇，直到两支试管中的液体全部凝固为止，这时向两支试管中分别加入100μl菌株LDS33的胞外蛋白质（多肽、寡肽）溶液和100μl菌株LDS33的胞外浓缩液经硫酸铵沉淀后的上清液，然后将两支试管均置入37℃水浴中，10min后观察每支试管中的栓状物是否溶解。结果发现加入胞外蛋白质（多肽、寡肽）溶液的试管中的栓状物完全溶解，而加入上清液的试管中的栓状物完全没有变化。进一步说明溶栓活性由菌株LDS33的胞外蛋白质（多肽、寡肽）溶液产生。

（5）菌株Bacillus pumilus LDS33胞外活性物质溶液抗凝活性的检测：

在3支短试管中各加入1mg/ml的纤维蛋白原溶液2ml，置37℃水浴中3min，然后向第1支试管中逐滴加入20U/ml的凝血酶溶液，直至试管中的液体全部凝固，并记录所加的凝血酶溶液的体积；在另外2支试管中先分别加入30μl菌株LDS33的胞外蛋白质（多肽、寡肽）溶液和80μl菌株LDS33的胞外浓缩液经硫酸铵沉淀后的上清液，然后再加入和第1管相同体积的20U/ml的凝血酶溶液，置37℃水浴中2h，观察后边2支试管中是否出现栓状物。结果发现加入胞外蛋白质（多肽、寡肽）溶液的试管中没有出现栓状物，而加入上清液的试管中的液体全部变为栓状物。说明菌株LDS33产生的胞外蛋白质（多肽、寡肽）还具有抗凝的作用，是一种既溶栓又抗凝的双活性物质。

实施例3

从短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LDS33发酵液中提取具有抗凝和溶栓双活性作用的化合物，包括如下步骤：

（1）将短小芽孢杆菌株（Bacillus pumilus）LDS33活化后，稀释涂布于平板，在30℃培养，挑取单菌落于种子培养基中，然后置于旋转式摇床上，在温度为30℃、转速为150r/min的条件下培养2d，所述种子培养基为：安琪酵母0.25％+CaCl₂·2H₂O0.1％+维生素B₁₂0.5μg/ml，pH值7.22；

（2）将种子培养菌液以5%的接种量转接入发酵培养基中，然后置于旋转式摇床上，在温度为30℃、转速为150r/min的摇床上培养7d，所述发酵培养基为：安琪酵母0.375%+CaCl₂·2H₂O0.1%+维生素B₁₂0.5μg/ml，pH值7.22；

（3）将步骤（2）制得的发酵液置于离心机中4000r/min离心30min，使上清液和菌体沉淀分离，弃沉淀，将上清液旋转蒸发至2mL，得胞外浓缩液；

（4）将胞外浓缩液离心，收集上清液，将上清液用10%的饱和（NH₄） ₂SO₄沉淀，12000r/min离心20min，弃沉淀，收集上清液，将上清液用60%的饱和（NH₄）₂SO₄沉淀，弃上清液，沉淀用100%的饱和（NH₄）₂SO₄洗3次，每次洗后都离心20min，将沉淀用浓度为0.1mol/L、pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液溶解，得上样液；

（5）将上样液上样于葡聚糖凝胶（Sephadex）G-200凝胶层析柱上，用浓度为0.1mol/L、pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗柱子，收集洗脱液。Sephadex G-200凝胶层析柱层析图谱如图5所示，分别将各峰50℃旋蒸至0.5mL，用纤维蛋白平板检测其溶栓活性，发现只有峰A具有溶栓活性，且活性较高。

序列表

菌株LDS33的16S rDNA序列：共1440bp

TACATGCAAGTCGAGCGGACAGAAGGGAGCTTGCTCCCGGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAGTTCCTTGAACCGCATGGTTCAAGGATGAAAGACGGTTTCGGCTGTCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCAAGAGTAACTGCTTGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTTCCCTTCGGGGACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCTGCGAGACCGCAAGGTTTAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGCAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGGCAGATGAT

Claims

1.短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LDS33，保藏号为CCTCC NO：M2013179。

2.如权利要求1所述短小芽孢杆菌LDS33在制备具有抗凝溶栓双活性作用化合物中的应用。