CN105820958B - 一株庆大霉素降解真菌及其应用 - Google Patents

一株庆大霉素降解真菌及其应用 Download PDF

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Abstract

一株真菌(Aspergillus terreus FZC3)，其保藏号为CGMCC No.12072，可应用于降解庆大霉素，其方法是将所述真菌接种到含有庆大霉素的体系中培养，实现降解庆大霉素。通过培养本发明的真菌，去除环境中的庆大霉素，用于处理制药废弃物，减少庆大霉素对环境、人类及动物产生的危害。

Description

一株庆大霉素降解真菌及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一株用于降解庆大霉素的真菌及其应用。
背景技术
抗生素(antibiotics)是由微生物(包括细菌、真菌、放线菌属)产生的具有抗病原体或具其它活性的一类次级代谢产物，能干扰其他活细胞的发育功能。抗生素作为抑菌或杀菌类药物已被广泛应用于人类疾病治疗、畜禽及水产养殖等多个领域，主要包括四环素类，磺胺类，β-内酰胺类、氟喹诺酮类、氨基糖苷类和大环内酯类等。我国是抗生素生产和使用大国，每年抗生素生产量达21万吨，使用量达18.9万吨，其中兽用抗生素占到使用量的一半以上。研究发现，生物体摄入大量抗生素类药物后除部分被机体代谢外，约有40-90％以原药或初级代谢产物的形式随粪便和尿液排出体外，最终又通过施肥等方式进入土壤环境或者通过渗漏和污水排放进入水体环境。近年来，关于抗生素类污染物在水体、沉积物和土壤中被检出的国内外相关报道层出不穷，甚至在蔬菜、奶类和肉类等产品中也发现了抗生素残留。
研究发现，长期暴露在抗生素环境下，不仅人和动物的患病和发病率会升高，而且对植物的叶绿素合成、酶分泌和根系生长都有影响。此外，微生物也会逐渐适应抗生素环境，并产生抗生素耐药性和抗性基因(antibiotic resistance genes，ARGs)。同时，低浓度抗生素对生态环境中微生物种群也能够起到筛选作用，使具有抗生素耐药性的微生物种群得以保留并逐渐壮大，而对其敏感的种群不断死亡消失，直接后果就是使微生物种群结构失衡，对生态环境及人类健康造成极大的危害。据报道，2014年全 球有70万人因抗生素耐药性的产生而死亡，因此解决抗生素问题迫在眉睫。
为了解决抗生素污染问题，除了减少抗生素的滥用，如何去除环境体系中残留的抗生素已经成了近年来研究的热点。目前，对含有抗生素残留污水的理化处理方法进行了大量的研究和实践，包括高级氧化法、活性炭吸附法、低温等离子体技术和膜处理法等。但是这些理化法处理所需成本高，管理复杂，除了高级氧化法对抗生素的去除率可达95％外，其他方法的去除效率都较低，并且都对固态介质中抗生素残留处理存在局限性。因此有关抗生素的微生物降解研究逐渐成为热点并不断报道。但是经文献和专利检索，目前多是对四环素类、磺胺类、β-内酰胺类、氟喹诺酮类和大环内酯等抗生素降解菌的研究，尚未发现对氨基糖苷类抗生素降解菌的筛选。
因此，有必要筛选出可有效降解氨基糖苷类抗生素的微生物菌株。
发明内容
本发明的目的是提供一株可有效降解庆大霉素的菌株，以及应用该降解菌株去除庆大霉素的方法；有效防止大量的抗生素流入到自然环境中，减轻庆大霉素对自然环境、动植物及人类健康造成的严重影响。
本发明提供的真菌(Aspergillus terreus FZC3)，其保藏号为CGMCC No.12072，已于2016年1月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
上述真菌(Aspergillus terreus FZC3)可在如下1)-2)中任一方式中应用：
1)在降解氨基糖苷类抗生素中的应用；
2)在提高降解氨基糖苷类抗生素去除率中的应用。
其中，所述氨基糖苷类抗生素是指庆大霉素。
本发明的另一个目的是提供一种降解庆大霉素的方法。
本发明的方法，包括如下步骤：将所述真菌(Aspergillus terreus FZC3) 接种到含有庆大霉素的培养液中培养，实现对庆大霉素的降解。
上述方法中，所述含有庆大霉素的培养液为液体土豆培养基(LPD)培养液，优选的，培养液的浓度为1/1LPD培养液。
上述方法中，所述庆大霉素的初始含量为50mg/L-200mg/L。优选含量为50mg/L。
上述方法中，将已接种所述真菌的含有庆大霉素的培养液，置于转速为150rpm和210rpm的摇床中培养。
上述方法中，所述真菌FZC3的接种量为5×108cfu。优选的，培养时间为3-5天。
上述方法中，所述培养温度为30℃-35℃。
上述方法中，所述培养的pH为6-10。优选pH＝6。
本发明的一种降解庆大霉素的方法，是将所述的真菌(Aspergillus terreusFZC3)以5×108cfu的接种量接种到含有庆大霉素的1/1LPD培养液中，培养液pH＝6，庆大霉素的含量为50mg/L，在恒温30℃摇床中培养，摇床转速150rpm。
本发明的真菌Aspergillus terreus FZC3对庆大霉素去除率可达95％以上，因此可进行专门培养，以用来去除制药厂废渣或废水中残留的庆大霉素，减少对环境的不良影响。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1显示不同真菌对庆大霉素的去除效果柱状图。
图2为本发明的真菌Aspergillus terreus FZC3在显微镜下观察倍数 100x下观察到的形态。
图3是将测得的真菌FZC3序列与Genebank公开的相应菌株的ITS序列进行对比，挑选相似度相近的序列用MEGA 6.0按邻接法构建系统发育树。
图4显示真菌FZC3在不同浓度的培养液中对庆大霉素去除率的影响的实验结果图。
图5显示真菌FZC3在含有不同初始浓度庆大霉素的培养液中对庆大霉素去除率的影响的实验结果图。
图6显示真菌FZC3的不同接种量对庆大霉素去除率的影响的实验结果图。
图7显示真菌FZC3在不同pH的培养液中对庆大霉素去除率的影响的实验结果图。
图8显示真菌FZC3在不同温度的培养液中对庆大霉素去除率的影响的实验结果图。
图9显示真菌FZC3置于不同转速的摇床中混合对庆大霉素去除率的影响的实验结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例用的试剂和材料：
菌株的筛选材料：从山东省只楚药业(生产庆大霉素的药厂)获得的池中发酵罐污泥、厌氧罐污泥、好氧罐污泥和车间废渣。
生化试剂：庆大霉素标准品，1mol/L氢氧化钠，0.1mol/L盐酸，土 豆，蛋白胨，葡萄糖，氯化铵，氯化钾，硫酸镁，硫酸铁，磷酸二氢钾，磷酸氢二钾，溴甲酚紫，肌酸，硝酸钠，酵母粉，琼脂粉，甲醇(色谱纯)，三氟乙酸(色谱纯)，哇哈哈纯净水，蒸馏水，CTAB抽取液(2％(w/v)CTAB，100mmol/L Tris-HCL(pH 8.0)，20mmol/L EDTA(pH 8.0)，1.4mol/L NaCl)，TE缓冲液(pH 8.0，10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA)，无水乙醇，70％酒精，Tris饱和酚，酚∶氯仿∶异戊醇(26∶24∶1)。
培养基配方：
液体土豆培养基(LPD)：土豆去皮，切成块，称取200g加水，121℃灭菌煮沸30min(注意火力的控制，可适当补水)，用纱布过滤，滤液加葡萄糖20g，补足水至1L。
本申请文件中的1/1LPD培养液是液体土豆培养基(LPD)原液，1/6、1/10、1/16、1/20LPD是在原液的基础上被无机盐培养基呈6倍、10倍、16倍、20倍地稀释；分别对应简写为1/1LPD、1/6LPD、1/10LPD、1/16LPD、1/20LPD培养液。
无机盐培养基(MSM)：氯化铵1g，磷酸二氢钾0.6g，磷酸氢二钾1.6g，硫酸镁0.2g，氯化钠1g，蒸馏水1L，pH7。
马丁氏培养基(MB)：蛋白胨6g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.6g，琼脂18g，蒸馏水1L。以下分别灭菌后倒平板时加：3.3mL的0.1％孟加拉红水溶液(抑制细菌和放线菌)，20mL的2％去氧胆酸钠溶液(抑制革兰阳性菌)；每100mL培养基中再加0.3mL的1％链霉素溶液(过滤除菌，抑制细菌和放线菌)，葡萄糖20g。
改良马丁培养基(MMB)：蛋白胨6g，酵母浸出粉2g，葡萄糖20g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.6g，蒸馏水1L，pH 6.2-6.6。
酵母提取物培养基(CYA)：硝酸钠3g，磷酸氢二钾1g，氯化钾0.6g，硫酸镁0.6g，硫酸铁0.6g，酵母粉6g，蔗糖30g，琼脂20g，蒸馏水1L。
麦芽提取物培养基(MEA)：麦芽浸出粉10g，琼脂16g。
肌酸蔗糖培养基(CREA)：肌酸3g，蔗糖30g，氯化钾0.6g，硫酸镁 0.6g，硫酸铁0.01g，磷酸氢二钾1.3g，溴甲酚紫0.6g琼脂16g，蒸馏水1L，pH为8左右(高温灭菌后再调pH)。
实验例
一、目的菌的筛选
①涂布平板法从药渣中纯化出真菌：用挑针挑取适量的药渣点接在MB培养基上，在30℃的恒温培养箱中培养7天。
7天后挑取形态各异的真菌点接在MMB培养基上进行纯化，在30℃的恒温培养箱中培养7天后重复该过程，得到纯化的真菌后将其转接到斜面MMB培养基上在4℃的冰箱中保存。
②庆大霉素降解能力评估：将步骤①保存的真菌分别接种到含有100mL 1/10LPD、无机盐培养基MSM的250mL锥形瓶中，加入庆大霉素标准品，使其含量为100mg/L，在恒温摇床中培养(30℃，150rpm)作为实验组，同时以不接种真菌的培养基为空白对照(排除外部环境对庆大霉素浓度的影响)，每个处理设置3个平行。分别在7、14、21、28天提取培养液测定庆大霉素的含量以计算庆大霉素去除率。
去除率计算公式：
去除率(％)＝((Ctn-Ct0)-(Ckn-Ck0))*100/(Ct0-(Ckn-Ck0))
其中Ct0：实验组的庆大霉素初始浓度；Ctn：n天后实验组的庆大霉素浓度；Ck0：空白对照的庆大霉素初始浓度；Ckn：n天后空白对照的庆大霉素浓度。
在公式中：(Ctn-Ct0)＝实验组的庆大霉素经过n天后的浓度变化值(包含自然因素造成的浓度变化和真菌降解浓度变化)；(Ckn-Ck0)＝自然因素造成的浓度变化；((Ctn-Ct0)-(Ckn-Ck0))＝由真菌降解掉的庆大霉素的浓度；(Ct0-(Ckn-Ck0))＝实验组放置n天后庆大霉素的浓度。
去除率＝由真菌降解的浓度/实验组放置n天后庆大霉素的浓度*100％。
③筛选结果及实验记录，如图1所示：
从庆大霉素生产药渣中分理出8株真菌。这8株真菌对庆大霉素的去 除效果如图1所示。可知，FZC3对庆大霉素的去除率最高，28天后都能达到75％。所以把FZC3作为目的菌来进行后续研究，以期获得更好的庆大霉素去除效果。
二、真菌FZC3的鉴定
挑选具有较高庆大霉素去除能力的真菌(FZC3)进行鉴定，主要包括形态学鉴定和分子生物学鉴定。
1、FZC3的形态鉴定
将FZC3分别点接(3点)到CYA、MEA、和CREA平板上，分别在25℃和37℃条件下培养7天(避光)，分别对三种培养基上的FZC3进行菌落形态观察。然后从MEA培养基上挑取少许FZC3，放在载玻片上，用乳酸浸没，再滴加一滴酒精去除气泡和多余的孢子，然后盖上盖玻片在显微镜下对其进行微观形态学观察。
如图2所示，A-C为FZC3在25℃培养7天后的菌落形态(A，CREA；B，MEA；C，CYA)；D-F为FZC3在37℃培养7天后的菌落形态(D，CREA；E，MEA；F，CYA)；G-I为FZC3在37℃培养14天后的菌落形态(G，CREA；H，MEA；I，CYA)；J-L为FZC3在MEA培养基上，37℃条件下培养7天后的微观形态图。
FZC3在CREA培养基上25℃和37℃的条件下培养7天后菌落呈现白色毛绒状，直径分别为0.8-1.2cm和1.6-2.0cm。在MEA培养基上25℃的条件下培养7天后菌落呈现白色，直径分别为1.6-2.8cm；在37℃条件下菌落呈棕色层理状，直径为2.6-2.9。在CYA培养基上25℃和37℃的条件下培养7天后菌落呈扇形状，半径分别为2.8-3.1cm和4.0-4.2cm。FZC3在MEA上培养天后的围观形态观察显示，FZC3的分生孢子头为透明球形，直径为2.5-3μm；孢子梗无色，壁光滑，直径为2.5-4.5μm；囊泡直径为6.5-9μm。
根据菌种FZC3的形态观察结果，FZC3为曲霉属。
2、分子生物学鉴定
(1)DNA的提取方法：
①、在水浴锅中加适量的蒸馏水，使水面足够离心管温浴，打开水浴锅将温度设为65℃，将CTAB抽提液置于65℃水浴锅中；
②、在研钵(包括研锤)中加入一勺(适量)液氮使其预冷，刮取适量菌丝于研钵，迅速加入一勺液氮并迅速研磨成粉末状后，把粉末转入1.5mL或2mL离心管中。
③、1.5ml离心管中加入650μLCTAB抽提液(2mL离心管中可加入1mLCTAB抽提液，以下步骤可根据需要按比例加入各种试剂)，上下颠倒数次使之混合均匀，于65℃水浴保温0.5-1h；
④、加入等体积(650μL)的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，轻缓颠倒混匀10min；可以从4℃冰箱中加入325μLTris饱和酚，再加入325μL氯仿∶异戊醇(24∶1)。
⑤、11000rpm离心15min，用黄枪头将上清液轻缓转入另一离心管中，最多保留600μL上清液，弃沉淀。
⑥、在上清夜中加入等体积(650μL)氯仿∶异戊醇(24∶1)，轻缓颠倒混合均匀10-20min。
⑦、11000rpm离心15min，用黄枪头将上清液轻缓转入另一离心管中，最多保留500μL上清液，弃沉淀。在上清夜中加入等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)，轻缓颠倒混合均匀。
⑧、11000rpm离心15min，用黄枪头将上清液(约400μL)轻缓转入另一离心管中，加入1ml预冷的无水乙醇(4℃冰箱中20min)。
⑨、挑取絮状沉淀放入另一离心管，若无法挑取则采用12000rpm离心15min，去上清留沉淀DNA。
(2)凝胶电泳检测：
①、在DNA沉淀中加入等体积预冷的70％乙醇(4℃冰箱中)洗两次。
②、弃上清液，倒置干燥。
③、溶于适量的TE缓冲液(50μL-100μL)中4℃过夜，使其充分溶解。
④、3μL产物与溴酚蓝1μL混合，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测。
(3)PCR扩增：
将提取的基因组DNA进行ITS序列扩增，用于扩增的PCR反应引物：正向引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)；反向引物ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。PCR扩增体系如下：2.0μl浓度为50ng ul-1的模板DNA，5.0μl的10×Ex Taq缓冲液，4.0μl的2.5mM的dNTP Mix(混合核苷酸)，1.0μl浓度为10μM的正向引物，1.0μl浓度为10μM的反向引物，0.5μl的Ex Taq酶，加入无菌去离子水36.5μl，形成50μl的扩增体系。扩增条件：95℃预变性5min；之后95℃变性30S，55℃退火30S，72℃延伸1.5min，经30个循环；72℃延伸10min，产物4℃保存。
(4)将PCR扩增获得的片段进行ITS测序，其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。
菌株FZC3测序后ITS基因序列的Genebank登陆号为KU170490。将得到的序列与Genebank上的相关序列进行对比。与Genebank公开的相应菌株序列进行对比后，挑选相似度相近的序列用MEGA 6.0按邻接法构建系统发育树。构建得到的发育树如图3所示。
根据序列对比结果和系统发育树理论，目标菌株因为与土曲霉的相似度高达100％，因此FZC3被界定为土曲霉(Aspergillus terreus)。
三、用真菌FZC3降解庆大霉素的处理条件优化
将筛选得到的真菌FZC3以一定接种量接种到含有100mL LPD培养液的250mL锥形瓶中，调节pH值，向锥形瓶中加入庆大霉素标准品，在恒温摇床中培养(调节温度和转速)作为实验组，同时以不接种真菌的培养基为空白对照(排除外部环境对庆大霉素浓度的影响)。
按照去除率计算公式计算去除率：
去除率(％)＝((Ctn-Ct0)-(Ckn-Ck0))×100/(Ct0-(Ckn-Ck0))
其中Ct0：实验组的庆大霉素初始浓度；Ctn：n天后实验组的庆大霉素浓度； Ck0：空白对照的庆大霉素初始浓度；Ckn：n天后空白对照的庆大霉素浓度。
以下分别就培养液浓度、庆大霉素初始浓度、真菌接种量、培养pH、培养温度、摇床的转速对庆大霉素的去除率的影响进行探究。以下分别描述实验方法及结果：
1、培养液中LPD浓度对庆大霉素去除率的影响
培养条件是30℃、转速为150prm、庆大霉素100mg/L、pH为7、真菌FZC3的接种量为5×106cfu、装液量为100mL，培养液浓度梯度为全浓度、1/5、1/10、1/15、1/20LPD培养基和无机盐培养基，每个处理设置三个重复，同时每种培养基设置三个空白对照(control)。
由图4可知，随着培养液的浓度的升高，真菌FZC3对庆大霉素的去除效果越好，当浓度为1/1时，去除率能达到90％以上。因此，选择1/1的LPD培养液作为FZC3去除庆大霉素的优化培养。
2、培养液中庆大霉素初始浓度对庆大霉素去除率的影响
培养条件是：温度为30℃、转速为150prm、pH为7、真菌FZC3接种量为5×106cfu、装液量为100mL，培养液浓度为1/1LPD的培养液，庆大霉素梯度50mg/L、100mg/L、200mg/L和400mg/L，每个处理设置三个重复，同时每种庆大霉素浓度设置三个空白对照(control)。
图5所示为不同初始浓度庆大霉素对去除效率的影响。可以看出低浓度(50mg/L～200mg/L)的庆大霉素对去除率的影响不明显，几乎相当，但是当浓度高达到400mg/L时，去除率较低，甚至达不到50％。所以选择50mg/L～200mg/L作为优化的庆大霉素浓度。
3、真菌FZC3的接种量对庆大霉素去除率的影响
接种量的优化：培养条件是30℃、转速150prm、pH 7、装液量为100mL，培养液浓度为1/1LPD的培养液，庆大霉素含量为50mg/L，接种量梯度为5×102、5×104、5×106、5×108cfu，每个处理设置三个重复，同时设置空白对照(control)。
如图6所示，(a)(b)和(c)分别是第3、5和7天不同真菌FZC3的 接种量对庆大霉素去除效果的影响。由图6可知，开始时接种量对庆大霉素的去除影响较大，并且接种量越大，3天之内庆大霉素的去除效果越好。但是到了第5天以后庆大霉素的去除效果差异不大。因此，选择5×108cfu作为真菌FZC3去除庆大霉素的优化接种量，综合去除率和时间成本，培养时间为3-5天较佳。
4、不同的培养pH对庆大霉素去除率的影响
pH的优化：培养条件是转速为150prm，培养温度是30℃，培养液浓度为1/1LPD的培养液，庆大霉素含量为50mg/L，真菌FZC3接种量为5×108cfu，装液量为100mL。pH梯度为3、4、5、6、7、8、9、10，每个处理设置三个重复，同时每个pH设置三个空白对照(control)。
如图7所示，(a)(b)和(c)分别是第3、5和7天不同初始pH值对庆大霉素去除效果的影响。由图7可以看出，FZC3在培养pH为6-10时对庆大霉素的去除效果更好也更稳定。当pH为3-5时，随着pH值的降低，真菌FZC3对庆大霉素的去除效果也随之降低。优选的pH值为6-10，而考虑到LPD培养基的原始pH值为6左右，因此选择pH6为优化结果。
5、不同的培养温度对庆大霉素的去除率的影响
温度的优化：培养条件是转速为150prm，装液量为100mL，培养液浓度为1/1的LPD的培养液，庆大霉素含量为50mg/L，真菌FZC3接种量为5×108cfu，pH＝6，温度梯度为20℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、60℃。每个处理设置三个重复，同时每个温度设置三个空白对照(control)。
如图8所示，(a)(b)和(c)分别是第3、5和7天不同培养温度对庆大霉素去除效果的影响。由图可知，当在第3天时，FZC3在30℃时对庆大霉素的去除效果最好，达到62％。在第5天时，FZC3在30℃和35℃条件下对庆大霉素的去除率最高，达到90％以上。在第7天时，FZC3在30℃、35℃和40℃条件下对庆大霉素的去除率最高，达到95％。但是当温度大于45℃时，庆大霉素的去除率随着温度的升高而降低，并且在温度达到45℃以后，庆大霉素去除率显著降低。因此选择30℃～35℃，更优选30℃为优 化培养温度。
6、不同的摇床转速对庆大霉素的去除率的影响
转速的优化：培养液浓度为1/1的LPD的培养液，庆大霉素含量为50mg/L，真菌FZC3接种量为5×108cfu，pH＝6，培养温度是30℃，转速梯度为90prm、110prm、130prm、150prm、170prm、190rpm、210rpm。每个处理设置三个重复，同时每个转速设置三个空白对照(control)。
通过比较培养前后庆大霉素浓度的大小来比较不同条件下FZC3对庆大霉素的去除效果。
由图9可知，转速对庆大霉素去除效果影响较小。但相比之下，当转速为150rpm和210rpm时庆大霉素去除率达到95％以上。考虑到摇床高转速耗能高的限制，选择150rpm作为优化的转速。
综上，Aspergillus terreus FZC3对庆大霉素去除效果的优化条件是：1/1LPD，50mg/L庆大霉素，150rpm的转速，5×108的接种量，30℃，pH6。在优化条件下，Aspergillusterreus FZC3对庆大霉素去除率可达95％以上。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种降解庆大霉素的方法，包括：
将保藏号为CGMCC No.12072的Aspergillus terreus FZC3真菌接种到含有庆大霉素的培养液中培养，实现对庆大霉素的降解，其特征在于：
将Aspergillus terreus FZC3真菌按照5×108cfu的接种量接种到含50mg/L～200mg/L庆大霉素的液体土豆培养基原液中，置于转速为150rpm的摇床中培养，在保持培养基温度为30℃～35℃、pH为6～10的条件下培养3～5天。
2.根据权利要求1所述的降解庆大霉素的方法，其特征在于：将Aspergillus terreusFZC3真菌以5×108cfu的接种量接种到含有庆大霉素含量为50mg/L的液体土豆培养基原液中，培养液pH＝6，在恒温30℃摇床中培养，摇床转速为150rpm。
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