CN103981102A - Dse菌株24l-4及其在铁皮石斛生产上的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了DSE菌株24L-4，属于生物技术领域，具体涉及能明显促进铁皮石斛生长的DSE菌株及其在铁皮石斛生产上的应用。该真菌株能显著促进铁皮石斛的生长，利用该菌接种铁皮石斛组培苗45d后生物量比对照增加了19.4%，接种铁皮石斛盆栽苗180d后植株生物量比空白对照增加了18.5%，株高增加了15.3%，茎径增加了6.8%，芽数增加了22.1%。本发明的有益效果是：该菌株可应用于铁皮石斛专用微生物菌剂的生产和生物有机肥的开发，对铁皮石斛的规模化生产、保护生态环境具有重要意义，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及能促进铁皮石斛生长的DSE菌株24L-4及其在铁皮石斛生产上的应用。
背景技术
深色有隔内生真菌(Dark septate endophyte，DSE)是植物共生真菌的典型代表之一，其一般特征是菌丝颜色较深、具有明显横隔，广泛存在于健康植物根的表皮、表层甚至维管束组织的细胞内或细胞间隙，能够在植物细胞内或细胞间隙形成“微菌核”等结构特征。刘茂军等(深色有隔内生真菌(DSE)研究进展[J].菌物学报，2009，28(6)：888-894)研究报道DSE具有促进宿主矿质营养吸收、促进宿主对有机养分的吸收、提高宿主抗逆性、提高宿主的抗病能力等生态学功能，可望促进作物生长和提高抗逆能力，减少化学农药肥料的使用，修复和降低环境污染。
铁皮石斛是一种珍稀名贵的药用和观赏植物，由于铁皮石斛的生长除了对气候和上壤环境要求较高外，在自然界中其生长还需要共生真菌的参与，人工栽培往往成活率较低，生长缓慢。通过筛选能显著促进铁皮石斛生长的DSE真菌，建立“铁皮石斛-DSE”高效共生体系，提高铁皮石斛的成活率和产量，可用于铁皮石斛专用菌肥的开发利用。
发明内容
本发明提供一种DSE菌株24L-4及其在铁皮石斛生产上的应用，能促进铁皮石斛的生长。
本发明所述的DSE菌株24L-4为Devriesia sp.，该菌株已于2014年4月28日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，其地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其保藏编号为：CGMCC No.9098。
该菌株从茶花叶部组织分离获得，通过观察其在宿主植物的定殖特征确定其为DSE菌株，菌株命名为24L-4。经菌株形态学和18S rDNA序列分析，该菌株鉴定为德弗霉菌属Devriesia sp.真菌。
所述DSE真菌菌株24L-4的提纯步骤包括：
步骤A：取茶花叶片，清洗杀菌后吸干表面水分后置于玉米粉培养基培养至菌落长出；
步骤B：将叶部组织置于培养皿平板上，于生化培养箱中培养，直至叶片组织周围长出菌丝体，挑取菌丝置于CMMY培养基，得到纯化菌株。
优选的，所述玉米粉培养基包括：玉米粉6-10g/L，琼脂粉7-8g/L。
优选的，CMMY培养基包括：麦芽提取物8-12g/L，酵母浸膏1.5-3g/L，玉米粉琼脂7-9g/L，琼脂7-9g/L。
所述DSE真菌菌株在促进铁皮石斛组培苗生长上的应用，包括以下步骤：
步骤A′：将供试菌株活化后接种于燕麦培养基中，待菌落长大后备用；
步骤B′：选择长势一致的无菌铁皮石斛组培苗移栽至培养皿平板的菌落上，将培养皿放入培养瓶中培养，培养结束后将根部培养基洗净后干燥后称量干重。
优选的，所述步骤B′中，培养的条件为：温度为25℃，光照强度为160-200μmolm-2s-2，光照时间为15-18h，培养时间为40-50d。
优选的，所述燕麦培养基包括：燕麦粉10g/L，琼脂18g/L，MgSO4·7H2O1g/L，KH2PO41.5g/L，NaNO31g/L。
所述DSE菌株在促进铁皮石斛盆栽苗生长上的应用，包括以下步骤：
步骤A″：选取长势一致的铁皮石斛苗，移栽至培养杯中，移栽成活后待用；
步骤B″：在马铃薯葡萄糖液体培养基PDB中接入菌丝块，振荡培养结束后将培养物打碎配置成菌液，灌根铁皮石斛苗。
优选的，所述步骤A″中，所述培养基质为水草。
优选的，所述步骤B″中马铃薯葡萄糖液体培养基包括：马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000mL。
优选的，所述步骤B″中灌根条件为每杯铁皮石斛灌根25-35mL菌液，每隔10-15d灌根一次，共灌根2-3次。
本发明的有益效果是：该菌株可应用于铁皮石斛专用微生物菌剂和生物有机肥的开发，对促进铁皮石斛的规模化生产和保护生态环境具有重要意义，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是本发明中菌株24L-4的菌落形态。
图2是本发明中铁皮石斛组培苗接种菌株24L-4培育90天后长势对照。
图3是本发明中在铁皮石斛根部观察到菌株24L-4的DSE微菌核定殖特征。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明。
实施例1
本发明菌株的分离。
取茶花叶片，用自来水冲洗表面的灰层及附着物，凉干表面水份，将叶片剪成边长约为0.5-1.2cm的正方片，在超净工作台上先用70％酒精浸10-20s，再用1％次氯酸钠浸1-2min，无菌水洗3-5次，用灭菌滤纸吸干表面水分后置于玉米粉培养基(玉米粉6-10g/L，琼脂粉7-8g/L)上培养。90mm的培养皿接4-8片组织片，于22-28℃生化培养箱中培养，直至叶片组织周围长出菌丝体，挑取菌丝置于CMMY培养基(麦芽提取物8-12g/L，酵母浸膏1.5-3g/L，玉米粉琼脂7-9g/L，琼脂7-9g/L)上，获得纯化菌株。
实施例2
本发明菌株的形态学特征。
将菌株接种于CMMY培养基上，23℃培养3周后观察其形态学特征，结果见图1。
实施例3
本发明菌株的18S rDNA序列分析。
菌株培养用马铃薯葡萄糖液体培养基PDB，在28℃、120r/min的摇床上振荡培养10-15d后，过滤收集菌丝。菌丝体总DNA采用Saghai et al.的CTAB法提取。18S rDNA区域PCR扩增分别采用White et al.的通用引物NS1/NS4进行扩增。PCR反应体系为：TIANgel一管便捷式MasterMix(成分：10mM Tris-HCl pH8.3、50mM KCl、1.5mM MgCl2、250uM dNTPeach、0.05U Polymerase/μL、ddH2O)9μL，20umol/L正反引物各1μL，模板DNA1μL，用超纯水定容至25μL。PCR反应参数：94℃预变性5min，94℃变性1min，53℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸10min。PCR扩增产物测序由上海生工生物工程技术有限公司完成，测序结果在GenBank登录和比对分析。
菌株24L-4的18S rDNA部分区域的核苷酸序列：
CAGTTCTCGCCGTGAGGCGGACCGGCCAACCCGGCCCAAGGTTCAACTACGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTTAATATACGCTATTGGAGCTGGAATTACCGCGGCTGCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGATCCTCGTTAAGGGATTTAAATTGTACTCATTCCAATTACCAGACCCTAACGAGCCCTGTATTGTTATTTATTGTCACTACCTCCCCGTGTCAGGATTGGGTAATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAGTCGAACCCTAATTCCCCGTTACCCGTTGACACCATGGTAGGCCACTATCCTACCATCGAAAGTTGATAGGGCAGAAATTTGAATGATGCATCGCCGGCTCGAGGCCCTGCCATTCCTTCAATTATTATGATTCAATCAGGATCCCCGAGAGGACGCTGGTTTTTCTCTTTATATATACACTGCTTCCCAACCTCGGAAGTCTTTAGTATGTATTAGCTACTAGATCTACCACTACTGTCGATGTACTGAATATCTATCACATCAACCAAACCAGATCTGATTAACCGTTCCATTCTTCAGCTGTCAAAGTTGCTATTACTTAAACCTTGCATGGCGCATGCTTAAACAG。
结合菌株24L-4的形态学特征及18S rDNA序列分析结构，将本发明菌株鉴定为德弗霉菌属(Deriviesia sp.)真菌。
实施例4
本发明菌株对铁皮石斛组培苗的接种效应。
将供试菌株活化后接种于燕麦培养基(燕麦粉10g/L，琼脂18g/L，MgSO4·7H2O1g/L，KH2PO41.5g/L，NaNO31g/L)上，每培养皿接种3个菌块，培养10d待菌落长大后备用。选择长势一致的无菌铁皮石斛组培苗移栽至菌落上，在每培养皿的3个菌落上分别移栽2-4株组培苗，将培养皿放入组培瓶中，于23-28℃，光照强度为160-200μmol m-2s-2，光照时间为15-18h每天的培养箱中共培养40-50d后，将根部培养基洗净后在45-50℃烘箱中烘烤3d以上称量干重。以未接种菌株的处理为对照，结果如表1所示。
表1
| 处理 | 干重(mg) |
| 24L-4 | 205.3 |
| 24L-4 | 159.7 |
| 24L-4 | 145.0 |
| 对照 | 112.3 |
实施例5
本发明菌株对铁皮石斛盆栽苗的接种效应。
选取长势一致的铁皮石斛苗，移栽至培养杯中(直径4.5cm×高4.5cm)，每杯种植3株苗，培养基质为水草，移栽成活后浇菌液。
在马铃薯葡萄糖液体培养基PDB中接入菌丝块，于25℃转速为100-150rpm摇床中振荡培养10-15d后，用灭菌纱布过滤收集菌丝团，用灭菌水冲洗数次后，将菌丝团打碎配制成浓度为5×105cfu/mL的菌液。每杯铁皮石斛苗灌根25-35mL菌液，每隔10-15d灌根一次，总共灌根2-3次，灌根结束后6个月调查株高和干重等生长指标。以未浇菌液的处理为对照，结果见表2和图2，可见，铁皮石斛组培苗接种菌株24L-4(B)90天后长势明显好于对照(A)。
表2 菌株对铁皮石斛盆栽苗生长的影响
| 处理 | 株高(cm) | 茎径(cm) | 芽数(个) | 干重(mg) |
| 24L-4 | 8.7 | 7.0 | 10 | 395.1 |
| 24L-4 | 6.3 | 7.0 | 8 | 338.2 |
| 24L-4 | 7.1 | 6.6 | 9 | 505.0 |
| 24L-4 | 6.8 | 6.5 | 9 | 542.8 |
| 对照 | 4.9 | 5.4 | 5 | 228.2 |
实施例6
本发明菌株在铁皮石斛组培苗根部定殖特征观察。
将供试菌株活化后接种于燕麦培养基(燕麦粉10g/L，琼脂18g/L，MgSO4·7H2O1g/L，KH2PO41.5g/L，NaNO31g/L)上，每培养皿接种3个菌块，培养10d待菌落长大后备用。选择长势一致的无菌铁皮石斛组培苗移栽至菌落上，在每培养皿的3个菌落上分别移栽2-4株组培苗，将培养皿放入组培瓶中，于23-28℃，光照强度为160-200μmol m-2s-2，光照时间为15-18h/d的培养箱中培养，接种1个月后，进行根部石蜡切片和棉兰染色，在光学显微镜下观察菌株在根部分布、颜色和形态等定殖特征。观察结果表明，菌株24L-4在铁皮石斛组培苗根部可以观察到DSE的定殖特征微菌核，见图3。
该真菌株能显著促进铁皮石斛的生长。利用该菌接种铁皮石斛组培苗45d后生物量比对照增加了19.4％，接种盆栽铁皮石斛180d后植株生物量比空白对照增加了18.5％，株高增加了15.3％，茎径增加了6.8％，芽数增加了22.1％。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 广西壮族自治区农业科学院微生物研究所
<120> DSE菌株24L-4及其在铁皮石斛生产上的应用
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<170> PatentIn version 3.3
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<213> Devriesia sp.
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cctaacgagc cctgtattgt tatttattgt cactacctcc ccgtgtcagg attgggtaat 240
ttgcgcgcct gctgccttcc ttggatgtgg tagccgtttc tcaggctccc tctccggagt 300
cgaaccctaa ttccccgtta cccgttgaca ccatggtagg ccactatcct accatcgaaa 360
gttgataggg cagaaatttg aatgatgcat cgccggctcg aggccctgcc attccttcaa 420
ttattatgat tcaatcagga tccccgagag gacgctggtt tttctcttta tatatacact 480
gcttcccaac ctcggaagtc tttagtatgt attagctact agatctacca ctactgtcga 540
tgtactgaat atctatcaca tcaaccaaac cagatctgat taaccgttcc attcttcagc 600
tgtcaaagtt gctattactt aaaccttgca tggcgcatgc ttaaacag 648
Claims (10)
1.DSE菌株24L-4，其保藏编号为：CGMCC No.9098。
2.权利要求1所述DSE菌株在促进铁皮石斛组培苗生长上的应用。
3.权利要求1所述DSE菌株在促进铁皮石斛盆栽苗生长上的应用。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
步骤A′：将供试菌株活化后接种于燕麦培养基中，待菌落长大后备用；
步骤B′：选择长势一致的无菌铁皮石斛组培苗移栽至培养皿平板的菌落上，将培养皿放入培养瓶中培养，培养结束后将根部培养基洗净后干燥后称量干重。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤A′中燕麦培养基包括：燕麦粉10 g/L，琼脂18 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，KH2PO4 1.5 g/L，NaNO3 1 g/L。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤B′中培养条件为：温度为25℃，光照强度为160-200μmol m-2s-2，光照时间为15-18h/d，培养时间为40-50d。
7.如权利要求3所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
步骤A″：选取长势一致的铁皮石斛苗，移栽至培养杯中，移栽定殖后浇菌液；
步骤B″：在马铃薯葡萄糖液体培养基PDB中接入菌丝块，振荡培养结束后将培养物打碎配置成菌液，灌根铁皮石斛苗。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述步骤A″中，所述培养基质为水草。
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述步骤B″中，马铃薯葡萄糖液体培养基包括：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，水1000 mL。
10.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述步骤B″中灌根条件为每杯铁皮石斛灌根25-35mL菌液，每隔10-15d灌根一次，共灌根2-3次。
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