CN108998458B - 重组人胰岛素的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种重组人胰岛素的制备方法：以pET‑SUMO为载体，将SEQ ID No.2所示的核苷酸序列插入pET‑SUMO载体的EcoRI和HindIII酶位点之间，得到重组质粒；将重组质粒转入宿主菌中，在18‑37℃下在培养基中生长至OD₆₀₀＝0.5‑0.7，诱导表达后，分离出Sumo‑胰岛素原融合蛋白包涵体；用含有尿素的缓冲液洗涤Sumo‑胰岛素原融合蛋白包涵体，离心后取沉淀，变性、梯度复性后，得到复性Sumo‑胰岛素原融合蛋白；利用Sumo蛋白酶、胰蛋白酶和羧肽酶B在pH＝6.0‑8.0条件下一步酶切复性Sumo‑胰岛素原融合蛋白，酶切温度为16‑37℃，酶切时间为3‑6小时，得到重组人胰岛素。

Description

重组人胰岛素的制备方法

技术领域

本发明涉及重组蛋白生产技术领域，尤其涉及一种重组人胰岛素的制备方法。

背景技术

胰岛素是由人体胰岛β细胞产生的，用于调节机体碳水化合物和脂肪代谢平衡的重要激素。作为首个被美国食品药品监督管理局(FDA)批准的基因工程蛋白药物，重组人胰岛素在糖尿病临床治疗上具有重要用途且应用前景广泛。据世界卫生组织数据显示，全球目前共有糖尿病患者4亿2千万，另外还有1.6亿人处于糖尿病前期。在未来的20年，全球所需要的胰岛素消费将从目前的120亿美元增加至540亿美元。

胰岛素属于短肽分子，由51个氨基酸组成，相对分子质量仅为5808道尔顿。然而，由于胰岛素分子结构复杂(由A、B两链经复杂的二硫键连接而成)，体外通过基因工程生产胰岛素的难度大、技术壁垒高、生产效率低。目前的胰岛素生产方式远不能满足临床上对胰岛素日益增长的需要，造成胰岛素价格昂贵，糖尿病的治疗成本高。因此，学术和工业界一直在探求更为简便和高效的重组人胰岛素的生产技术和工艺。

重组人胰岛素可以通过三种基因工程表达系统来生产，即(1)动物或昆虫细胞表达系统；(2)大肠杆菌表达系统和(3)酵母表达系统。动物或昆虫细胞及酵母是真核细胞，虽然具有与蛋白折叠形成二琉键的能力，但该两种表达系统蛋白产量相对较低，操作难度较大、成本较高。而大肠杆菌则具有生长快速，生长周期短；易在分子水平上进行改造和修饰；培养基便宜；产量高。因此，在胰岛素生产工业上，大肠杆菌是目前应用最为广泛的表达系统。

大肠杆菌表达系统虽然广泛应用于胰岛素生产工业上，但存在着严重的技术瓶颈问题。(1)大肠杆菌缺少真核细胞具有的蛋白翻译后的修饰能力，因此表达出来的目标蛋白通常会以不可溶的、无活性的包涵体形式存在。要使目标蛋白变为有活性，需要对来自包涵体的不溶蛋白在细胞外进行复杂的变性和复性的操作。(2)大肠杆菌细胞内存在大量的蛋白水解酶，使得表达的目标蛋白容易被降解，特别是胰岛素这样的小分子蛋白，其稳定性更差。

为了解决胰岛素生产中的这两大关键问题，工业界一直不断地在探索胰岛素基因工程生产的新技术。其中，融合蛋白技术是探讨最多、目前应用最广的一种提高胰岛素生产效率的技术。其核心是指将目标蛋白(即胰岛素)与某一种高稳定性蛋白标签进行融合表达。目前，常用的融合蛋白标签包括：His，泛素，MBP(麦芽糖结合蛋白)，GST(谷胱苷肽S-转移酶)，硫氧还蛋白和Nusa标签等(见表1)。这些融合蛋白标签的应用可方便目标蛋白的分离纯化，并在一定程度上提高了胰岛素原蛋白在大肠杆菌内的稳定性，从而改善了重组胰岛素的生产效率。

表1基因工程上常用的融合蛋白标签

融合蛋白标签	氨基酸数	分子量(KDa)
			His	6	0.84
泛素	76	8
			麦芽糖结合蛋白	396	40
谷胱苷肽S-转移酶	211	26
			硫氧还蛋白	109	12
Nusa标签	495	55

然而，目前使用的融合蛋白技术并未能解决胰岛素生产中以下三个突出性技术难题：(1)不能显著提高胰岛素原蛋白在细胞外的变性复性效率；(2)需要在标签蛋白和胰岛素原(目的蛋白)之间设计特定的酶切位点(长度约10到20个氨基酸、具有特定序列的短肽)，以便在后续过程中通过蛋白酶切(如凝血酶、肠激酶)来释放目的蛋白。然而，这些酶切割以后通常会导致部分酶切位点氨基酸的残留，影响目的蛋白的生物功能；并且，切除这些融合标签所用的酶普遍存在着特异性差、切割效率低的问题；(3)经变性复性处理后的胰岛素原仍然需要经过三步酶切反应(即融合标签切割酶、胰蛋白酶和羧肽酶)才能获得有活性的胰岛素。因此，工业化生产胰岛素的过程仍然十分繁锁，生产效率很低，生产成本一直居高不下。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种重组人胰岛素的制备方法，构建了一种新的融合蛋白，该融合蛋白在宿主菌中具有高效的表达效率以及细胞外的高效变性复性效率，同时利用能特异性、并干净切除融合蛋白标签的“三合一”酶切反应体系，将胰岛素原转变为活性胰岛素，为胰岛素的高效、低成本工业化生产提供一种新的、更为简化的工艺流程。

在一方面，本发明要求保护一种Sumo-胰岛素原融合基因，包括SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

本发明的Sumo-胰岛素原融合基因，同时含有T7启动子、乳糖操纵子(Lac控制子)、胰岛素原基因和Sumo基因编码区，其中T7启动子为一大肠杆菌特异性的、具有高活性的转录启动元件；乳糖操纵子则为一条件性(诱导性)基因表过控制元件。当无诱导物存在时，阻遏物与操纵子(operator)结合使得结构基因不能正常转录，当诱导物(乳糖或IPTG)存在时，诱导物与阻遏物结合，使阻遏物从操纵基因上下来，使得基因转录正常进行。

小分子类泛素修饰蛋白(Sumo)是一种顺序高度保守的真核生物蛋白，由100个氨基酸组成。Sumo在真核细胞中的主要功能是通过共价的方式与目的蛋白结合，从而影响它们的结构和活性。据文献报道，当作为蛋白标签融合到某些目标蛋白的N末端时，Sumo起到了促进原核生物中蛋白表达、增加重组蛋白可溶性和稳定性的作用。Sumo蛋白酶是一种能识别Sumo空间结构(而非特异的氨基酸序列)并对其进行正确切割的一种蛋白酶。将Sumo作为融合标签用于胰岛生产，至少有三方面的优势：(1)可使表达后的胰岛原蛋白较为稳定；(2)在变性复性过程中，可帮助胰岛原蛋白正确折叠，提高复性效率；(3)由于Sumo蛋白酶识别的是Sumo空间结构，而非特异的氨基酸序列，所以酶切去除Sumo后不会导致个别氨基酸在目标原蛋白胰岛原中的残留。

在另一方面，本发明还要求保护一种Sumo-胰岛素原融合蛋白，其由上述Sumo-胰岛素原融合基因所编码。

在又一方面，本发明还要求保护一种表达Sumo-胰岛素原融合蛋白的重组质粒，包括Sumo-胰岛素原融合基因，Sumo-胰岛素原融合基因包括SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

本发明还要求保护一种重组人胰岛素的制备方法，包括以下步骤：

(1)以pET-SUMO为载体，利用T4 DNA连接酶将SEQ ID No.2所示的核苷酸序列插入pET-SUMO载体的EcoRI和HindIII酶位点之间，得到重组质粒；

(2)将步骤(1)得到的测序正确的重组质粒转入宿主菌中，在18-37℃(优选为35-37℃)下在培养基中生长至OD₆₀₀＝0.5-0.7(优选为OD₆₀₀＝0.5)，然后加入0.5-2mM(优选为1mM)的IPTG诱导表达，诱导结束后，将菌液离心取沉淀物，分离出Sumo-胰岛素原融合蛋白包涵体；

(3)用含有尿素的缓冲液洗涤所述Sumo-胰岛素原融合蛋白包涵体，离心后取沉淀，将沉淀用浓度为4-8M(优选为6-8M)的尿素变性液进行变性，离心后去上清液，使用浓度为6M-0.5M的包涵体复性液对上清液进行梯度复性，然后用PBS缓冲液重悬，得到复性Sumo-胰岛素原融合蛋白；

(4)同时利用Sumo蛋白酶、胰蛋白酶和羧肽酶B在pH＝6.0-8.0(优选为7.5)条件下一步酶切复性Sumo-胰岛素原融合蛋白，酶切温度为16-37℃(优选为25℃-30℃)，酶切时间为3-6小时，得到重组人胰岛素。

进一步地，在步骤(2)中，宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

进一步地，在步骤(2)中，诱导表达时间为6小时。

进一步地，在步骤(3)中，在尿素的缓冲液洗涤之前，还包括利用PBS缓冲液洗涤的步骤。

进一步地，在步骤(3)中，含有尿素的缓冲液中尿素的浓度为2-8M，缓冲液的pH值为6.2-8.5。

进一步地，在步骤(3)中，尿素变性液的pH值为6.5-9.5。

进一步地，在步骤(3)中，依次使用含有尿素的浓度为6M、4M、2M、1M以及含有0.5MPBS的包涵体复性液进行梯度复性。

进一步地，在步骤(3)中，包涵体复性液的pH值为7.5-9.5。进一步地，在步骤(4)中，酶切体系中Sumo蛋白酶、胰蛋白酶和羧肽酶B与复性Sumo-胰岛素原融合蛋白的浓度比为1:10:10:1。

进一步地，在步骤(4)中，酶切体系中Sumo蛋白酶与目的蛋白的质量比例为1:50–1:500；胰蛋白酶与目的蛋白的质量比例为1:50–1:1000；羧肽酶B与目的蛋白的质量比例为1:50–1:1000。

传统的重组胰岛素生产工艺过程中，带有融合标签的胰岛素原蛋白需经过三步酶切反应：依次使用Sumo蛋白酶(ΜLp1)、胰蛋白酶(Trypsin)和羧肽酶B(CarboxypeptidaseB)进行酶切，才能得到有活性的胰岛素。采用此种分步酶切的方式，既费时又易造成目标蛋白的大量损失，不利于提高重组胰岛素的生产效率。而本发明步骤(4)中，利用三种酶共同作用(即三合一)的酶切反应体系，使得去标签和胰岛素原向胰岛素的转换过程更为简单便捷，大大简化胰岛素生产流程，节省生产成本。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

(1)本发明构建了一种新的融合蛋白，以Sumo作为融合标签用于胰岛生产，促进了胰岛素原蛋白在大肠杆菌中的高效表达及在细胞外的变性复性效率。

(2)本发明在重组人胰岛素的制备过程中提供了一种能特异性、并干净切除融合蛋白标签的蛋白酶系统；利用优化的、且“三合一”的酶切反应体系，使得去标签和胰岛素原向胰岛素的转换过程更为简单便捷，将胰岛素原转变为活性胰岛素。

(3)本发明提供了一种重组人胰岛素的制备方法，大大简化胰岛素生产流程，节省生产成本，为胰岛素的高效、低成本工业化生产提供一种新的、更为简化的工艺流程。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1是本发明实施例1中所构建的不同载体的示意图；

图2是本发明实施例2中Sumo融合标签对胰岛素原蛋白在大肠杆菌中表达的影响测试结果；

图3是本发明实施例3中Sumo-胰岛素原的可溶性分析结果；

图4是本发明实施例3中包涵体的变性复性的测试结果；

图5是本发明实施例4中Sumo-胰岛素原的酶切测试结果；

图6是本发明实施例4中I型糖尿病小鼠腹腔分别注射不同液体后3小时内血糖随着时间的变化曲线。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1 Sumo-胰岛素原融合基因的设计

以pET-SUMO为基础载体，设计并构建带有Sumo标签的pET-SUMO-Proinsulin胰岛素原重组质粒(图1a)，该质粒中包括T7启动子、Lac控制子、胰岛素原基因和Sumo基因编码区(SEQ ID No.1)。

为了检验Sumo融合标签对胰岛素原在大肠杆菌中表达的影响，另外构建不带Sumo标签的pET-Proinsulin(胰岛素原)质粒(图1b)，该质粒中包括T7启动子、Lac控制子、胰岛素原基因编码区(SEQ ID No.3)。具体方法如下：

通过化学合成方法得到一段全长为357个碱基的DNA片段(SEQ ID No.2)。这个片段分别在5’和3’端带有EcoRI和HindIII两个内切酶位点，中间序列包含有编译Sumo C-端28个氨基酸及人胰岛原全长(A链+B链+C肽)的DNA序列。合成以后，该片段通过T4 DNA连接酶的作用，直接被插入到pET-Sumo载体的EcoRI和HindIII酶位点之间，即得到pET-Sumo-Proinsulin重组质粒。为了构建pET-Proinsulin质粒，将化学合成得到的、5’和3’分别带有NdeI和HindIII酶切位点的人胰岛胰岛素原DNA片段，经T4 DNA连接酶反应，插入到pET-Sumo载体的NdeI和HindIII酶位点之间。

实施例2重组Sumo-胰岛素原蛋白的诱导表达

将构建好的、并经DNA测序确认后的pET-Proinsulin和pET-SUMO-Proinsulin重组质粒，经传统的热休克法转入BL21(DE3)细胞，挑选单克隆，37℃在LB培养基中生长至OD₆₀₀＝0.5，后加1mM IPTG诱导表达6小时。

为了比较Sumo融合标签对胰岛素原蛋白在大肠杆菌中表达的影响，诱导结束后，将菌液离心并将所得大肠裂解，然后进行凝胶电泳分析，结果见图2。图2中，泳道M表示标记物；泳道1代表Pet-Sumo(阳性对照)，相对分子质量为17kDa；泳道2代表Pet-Insulin(C肽)，理论上相对分子质量为9kDa，箭头所示是理想情况下目的蛋白的位置；泳道3代表Pet-Sumo-Insulin(C肽)，相对分子质量为25kDa。比较pET-Proinsulin和pET-Sumo-Proinsulin在同一诱导条件下的表达情况，可以看到不加Sumo融合标签的情况下，无或只有极少量胰岛素原重组蛋白表达，而在加Sumo融合标签的情况下，可以在25kDa处看到有大量重组蛋白的表达。这说明Sumo标签蛋白的加入能够显著地改善胰岛素原蛋白的稳定性，提高其产量。

实施例3重组Sumo-胰岛素原蛋白的变性复性

在实施例2诱导结束后，将表达重组Sumo-胰岛素原蛋白的大肠杆菌裂解后，收集沉淀，即得到不溶的包涵体。同时对上清和沉淀进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，结果如图3所示。图3中，泳道M表示标记物；泳道1表示转入质粒后未经诱导的大肠杆菌裂解液；泳道2表示采用1×PBS第一次洗涤后上清液；泳道3表示采用1×PBS第一次洗涤后沉淀；泳道4表示采用1×PBS第二次洗涤后上清；泳道5表示采用1×PBS第二次洗涤后沉淀；泳道6表示洗涤液洗涤后上清；泳道7表示洗涤液洗涤后沉淀。图3的结果显示，重组的Sumo-胰岛素原蛋白主要以沉淀(即不溶的包涵体)形式存在于大肠杆菌中。包涵体的好处是易于分离得到，因此可以大大简化目标蛋白的初级分离。然而，包涵体中存在许多非目标蛋白。这些蛋白仅小部分可通过PBS反复洗涤的方式进行去除，但大部分仍然残留于目标蛋白中，只能在后续的纯化过程中，通过亲和层析或离子交换的方式加以去除。

对以上分离出的包涵体进行洗涤和变性复性处理，使不溶的Sumo-胰岛素原蛋白变成可溶的Sumo-胰岛素原蛋白。具体步骤如下：

1、利用1×PBS缓冲液将包涵体洗涤二至三次，然后用100mL洗涤缓冲液(Tris0.62g；NaCl 0.292g；Triston×100 1％；EDTA 0.0292g；尿素12g；pH＝8.5)洗涤1h后，4℃、12000g离心20min，弃上清保留沉淀。

2、将步骤1得到的沉淀用100mL浓度为8M的尿素变性液(Tris 0.6057g；NaCl0.292g；EDTA 0.292g；尿素48g；pH＝9.5)进行重悬，4℃冰箱中变性过夜。次日4℃、12000g离心20min，保留上清。

3、将步骤2得到的上清依次用含6M、4M、2M、1M尿素和0.5M PBS的包涵体复性液1-5进行梯度复性，每次至少6h。包涵体复性液1-5包含成分即pH值依次如下：

复性液1(6M尿素，50mMTris-HCl，50mM NaCl，1mM EDTA，1.0mM GSH，0.1mM GSSG，pH9.5)，复性液2(4M尿素，50mMTris-HCl，50mM NaCl，1mM EDTA，1.0mM GSH，0.1mM GSSG，pH9)，复性液3(2M尿素，50mMTris-HCl，50mM NaCl，1mM EDTA，1.0mM GSH，0.1mM GSSG，pH8.5)，复性液4(1M尿素，50mMTris-HCl，50mM NaCl，1mM EDTA，1.0mM GSH，0.1mM GSSG，pH8.0)，复性液5(0.5M PBS，pH7.5)

4、用1×PBS缓冲液重悬，4℃、12000g离心20min进行离心，弃沉淀，保留上清，得到变性复性后的Sumo-胰岛素原融合蛋白。

为了测试Sumo-胰岛素原蛋白变性复性的效果，收集每次离心后的上清和沉淀，进行SDS-PAGE电泳分析，结果如图4。图4中，泳道M表示标记物；泳道1表示转入质粒后未经诱导的大肠杆菌裂解液；泳道2表示实施例2中方法诱导得到的大肠杆菌裂解液；泳道3表示包涵体变性后上清；泳道4表示包涵体变性后沉淀；泳道5表示包涵体复性后上清；泳道6表示包涵体复性后沉淀。图4结果显示，经8M尿素变性液变性过夜后，所有Sumo-胰岛素原蛋白均存在于上清中，说明变性十分完全。即便依次经过6M、4M、2M、1M、0.5M复性液和1×PBS进行梯度复性后，重组Sumo-胰岛素原蛋白仍主要存在于上清中，说明Sumo-胰岛素原蛋白复性非常成功。Image J灰度计算显示，采用本发明的方法，Sumo-胰岛素原融合蛋白的复性效率达到或超过90％，显著高于目前文献中报道的胰岛素原与其它标签融合蛋白的30-50％的复性效率。说明Sumo标签能帮助提高胰岛素原的变性复性效率，Sumo有可能起到一种分子伴侣的作用，从而影响了与其融合的胰岛素原复性效率。

实施例4胰岛素原向胰岛素转化的酶切反应

对实施例3中得到的Sumo-胰岛素原融合蛋白进行酶切反应，使其转化为人胰岛素，所使用的酶切反应体系如表2所示：

表2酶切反应体系

反应物质/体系	用量/体积
		Sumo-胰岛素原融合蛋白	190μL(0.05mg)
20-50mM Tris-HCl(pH＝7.5)	234μL
		Sumo蛋白酶(0.1mg/mL)	64μL
胰蛋白酶(1mg/mL)	6μL
		羧肽酶B(1mg/mL)	6μL
总量	500μL

上述酶切体系的最佳反应条件是25℃，反应3-6小时。按照以上反应条件进行酶切反应，得到人胰岛素。

为了研究本发明的酶切反应体系的酶切效率，同时做了几组对照实验，分别利用Sumo蛋白酶(Ulp1)、胰蛋白酶(trypsin)和羧肽酶B(Carbo×B)中的一种或两种在同样的条件下进行酶切，测试其酶切效率。将单酶、双酶和三酶切以后的Sumo-胰岛素原进行了电泳分析，结果如图5所示。图5中，泳道M表示标记物；泳道1表示0.05mg重组蛋白；泳道2表示0.05mg重组蛋白+trypsin+Carbo×B+Ulp1；泳道3表示0.05mg重组蛋白+trypsin+Carbo×B；泳道4表示0.05mg重组蛋白+trypsin；泳道5表示0.05mg重组蛋白+Carbo×B；泳道6表示0.05mg牛胰岛素。图5结果显示，与第1组(泳道1，不加酶的对照组)比较，第2-4组(泳道2-4)重组蛋白被切成了17kDa的Sumo融合蛋白部分和7kDa的目的蛋白部分，且第二组(泳道2)的酶切效率>第三组(泳道3)的酶切效率>第四组(泳道4)的酶切效率。说明Sumo蛋白酶和胰蛋白酶均有切割去除Sumo标签的能力。而第5组(泳道5)中重组蛋白没有发生电泳带形的变化，说明羧肽酶B不具备切割然去除Sumo标签的能力。

为了检测经上述酶切反应所得胰岛素的活性，建立一批I型糖尿病小鼠模型。造模的具体步骤如下：随机选择10只8周龄C57BL/6J雄鼠进行链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)的注射。根据小鼠的体重计算STZ的用量(80mg/kg)，并与已提前配好的柠檬酸溶液混匀。然后隔1天腹腔注射一次，共注射3次，一周之后进行血糖的测定。当血糖≥16.7mmol/L时即造模成功。

造模成功后，通过腹腔注射：将六组不同酶处理得到的产物注入血糖≥16.7mmol/L的I型糖尿病小鼠(四只，即1、5、6和7号小鼠)，用血糖仪测量其血糖值，每20min测量一次血糖，持续观察3小时，得出血糖变化趋势。其中，六组分别如下：

第1组：0.05mg重组蛋白(20mmol/L Tris-HCl，pH＝7.5)；第2组：0.05mg重组蛋白+1.2μL trypsin+1.2μL Carbo×B+50％甘油保存的ulp1(20mmol/L Tris-HCl，pH＝7.5)；第3组：0.05mg重组蛋白+1.2μL trypsin+1.2μL Carbo×B(20mmol/L Tris-HCl，pH＝7.5)；第4组：0.05mg重组蛋白+1.2μL trypsin(20mmol/L Tris-HCl，pH＝7.5)；第5组：0.05mg重组蛋白+1.2μL Carbo×B(20mmol/L Tris-HCl，pH＝7.5)；第6组：0.05mg牛胰岛素重悬于20mmol/L Tris-HCl(pH＝7.5)。结果如图6所示，图6a-f分别代表I型糖尿病小鼠腹腔分别注射第1、2、3、4、5、6组的不同液体后3小时内血糖随着时间的变化曲线。图6的结果显示：Ulp1、胰蛋白酶和羧肽酶B三种酶共同处理的产物(第2组)的降糖效果显著优于其它各组(第1组，第3组，第4组，第5组，第6组)，不仅血糖值降到最低，而且维持时间最长。说明，经Ulp1、胰蛋白酶和羧肽酶B三种酶切反应后，Sumo-胰岛素原被有效地转换成了有活性的胰岛素。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 苏州大学

<120> 重组人胰岛素的制备方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 709

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 1

taatacgact cactataggg gaattgtgag cggataacaa ttcccctcta gaaataattt 60

tgtttaactt taagaaggag atatacatat gggcagcagc catcatcatc atcatcacgg 120

cagcggcctg gtgccgcgcg gcagcgctag catgtcggac tcagaagtca atcaagaagc 180

taagccagag gtcaagccag aagtcaagcc tgagactcac atcaatttaa aggtgtccga 240

tggatcttca gagatcttct tcaagatcaa aaagaccact cctttaagaa ggctgatgga 300

agcgttcgct aaaagacagg gtaaggaaat ggactcctta agattcttgt acgacggtat 360

tagaattcaa gctgatcaga cccctgaaga tttggacatg gaggataacg atattattga 420

ggctcacaga gaacagattg gtggtcgctt tgtgaaccaa cacctgtgcg gctcacacct 480

ggtggaagct ctctacctag tgtgcgggga acgaggcttc ttctacacac ccaagacccg 540

ccgggaggca gaggacctgc aggtggggca ggtggagctg ggcgggggcc ctggtgcagg 600

cagcctgcag cccttggccc tggaggggtc cctgcagaag cgtggcattg tggaacaatg 660

ctgtaccagc atctgctccc tctaccagct ggagaactac tgcaactag 709

<210> 2

<211> 357

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 2

gaattcaagc tgatcagacc cctgaagatt tggacatgga ggataacgat attattgagg 60

ctcacagaga acagattggt ggtcgctttg tgaaccaaca cctgtgcggc tcacacctgg 120

tggaagctct ctacctagtg tgcggggaac gaggcttctt ctacacaccc aagacccgcc 180

gggaggcaga ggacctgcag gtggggcagg tggagctggg cgggggccct ggtgcaggca 240

gcctgcagcc cttggccctg gaggggtccc tgcagaagcg tggcattgtg gaacaatgct 300

gtaccagcat ctgctccctc taccagctgg agaactactg caactagaga caagctt 357

<210> 3

<211> 352

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 3

taatacgact cactataggg gaattgtgag cggataacaa ttcccctcta gaaataattt 60

tgtttaactt taagaaggag atatacatat gtttgtgaac caacacctgt gcggctcaca 120

cctggtggaa gctctctacc tagtgtgcgg ggaacgaggc ttcttctaca cacccaagac 180

ccgccgggag gcagaggacc tgcaggtggg gcaggtggag ctgggcgggg gccctggtgc 240

aggcagcctg cagcccttgg ccctggaggg gtccctgcag aagcgtggca ttgtggaaca 300

atgctgtacc agcatctgct ccctctacca gctggagaac tactgcaact ag 352

Claims (10)

1.一种Sumo-胰岛素原融合基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种Sumo-胰岛素原融合蛋白，其特征在于：其由权利要求1所述的Sumo-胰岛素原融合基因所编码。

3.一种表达Sumo-胰岛素原融合蛋白的重组质粒，其特征在于：包括Sumo-胰岛素原融合基因，所述Sumo-胰岛素原融合基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

4.一种重组人胰岛素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）以pET-SUMO为载体，利用T4 DNA连接酶将SEQ ID No.2所示的核苷酸序列插入pET-SUMO载体的EcoRI和HindIII酶位点之间，得到重组质粒；

（2）将步骤（1）得到的测序正确的重组质粒转入宿主菌中，在18-37℃下培养生长至OD₆₀₀=0.5-0.7，然后加入0.5-2 mM的IPTG诱导表达，诱导结束后，将菌液离心取沉淀物，分离出Sumo-胰岛素原融合蛋白包涵体；

（3）用含有尿素的缓冲液洗涤所述Sumo-胰岛素原融合蛋白包涵体，离心后取沉淀，将沉淀用浓度为4-8M的尿素变性液进行变性，离心后去上清液，使用浓度为0.5M-6M的包涵体复性液对上清液进行梯度复性，然后用PBS缓冲液重悬，得到复性Sumo-胰岛素原融合蛋白；

（4）利用Sumo蛋白酶、胰蛋白酶和羧肽酶B在pH=6.0-8.0条件下，一步酶切所述复性Sumo-胰岛素原融合蛋白，酶切温度为16-37℃，酶切时间为3-6小时，得到所述重组人胰岛素。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：在步骤（2）中，所述宿主菌为大肠杆菌。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：在步骤（3）中，在尿素的缓冲液洗涤之前，还包括利用PBS缓冲液洗涤的步骤。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：在步骤（3）中，所述含有尿素的缓冲液中尿素的浓度为2-8M，缓冲液的pH值为6.2-8.5。

8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：在步骤（3）中，所述尿素变性液的pH值为6.5-9.5。

9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：在步骤（3）中，依次使用含有尿素的浓度为6M、4M、2M、1M以及含有0.5M PBS的包涵体复性液进行梯度复性。

10.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：在步骤（4）中，酶切体系中所述Sumo蛋白酶、胰蛋白酶和羧肽酶B与复性Sumo-胰岛素原融合蛋白的浓度比为1:10:10:1。

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