FI109810B - Menetelmä rekombinanttiproteiinien entsymaattiseksi pilkkomiseksi käyttämällä IgA-proteaaseja - Google Patents
Menetelmä rekombinanttiproteiinien entsymaattiseksi pilkkomiseksi käyttämällä IgA-proteaaseja Download PDFInfo
- Publication number
- FI109810B FI109810B FI923463A FI923463A FI109810B FI 109810 B FI109810 B FI 109810B FI 923463 A FI923463 A FI 923463A FI 923463 A FI923463 A FI 923463A FI 109810 B FI109810 B FI 109810B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- pro
- protein
- amino acid
- proteins
- fused
- Prior art date
Links
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 title claims abstract description 85
- 230000007017 scission Effects 0.000 title claims abstract description 84
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 84
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 title claims description 10
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 title claims description 10
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 title abstract description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 209
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 188
- 108010002231 IgA-specific serine endopeptidase Proteins 0.000 claims abstract description 70
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 69
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 53
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims abstract description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 39
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 30
- 230000007704 transition Effects 0.000 claims description 29
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 28
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 25
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 23
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 23
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 22
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 22
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 22
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 20
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 19
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 17
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 16
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 15
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 claims description 13
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 12
- RWCOTTLHDJWHRS-YUMQZZPRSA-N Pro-Pro Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NCCC1 RWCOTTLHDJWHRS-YUMQZZPRSA-N 0.000 claims description 11
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 11
- 108010077112 prolyl-proline Proteins 0.000 claims description 11
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 10
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 9
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 8
- QOLYAJSZHIJCTO-VQVTYTSYSA-N Thr-Pro Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O QOLYAJSZHIJCTO-VQVTYTSYSA-N 0.000 claims description 8
- WBAXJMCUFIXCNI-WDSKDSINSA-N Ser-Pro Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O WBAXJMCUFIXCNI-WDSKDSINSA-N 0.000 claims description 7
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 108010026333 seryl-proline Proteins 0.000 claims description 7
- 101000930822 Giardia intestinalis Dipeptidyl-peptidase 4 Proteins 0.000 claims description 6
- FELJDCNGZFDUNR-WDSKDSINSA-N Pro-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FELJDCNGZFDUNR-WDSKDSINSA-N 0.000 claims description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 6
- LQJAALCCPOTJGB-YUMQZZPRSA-N Arg-Pro Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O LQJAALCCPOTJGB-YUMQZZPRSA-N 0.000 claims description 5
- 108010060035 arginylproline Proteins 0.000 claims description 5
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 5
- 241000606790 Haemophilus Species 0.000 claims description 4
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 claims description 4
- ICTZKEXYDDZZFP-SRVKXCTJSA-N Pro-Arg-Pro Chemical compound N([C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(O)=O)C(=O)[C@@H]1CCCN1 ICTZKEXYDDZZFP-SRVKXCTJSA-N 0.000 claims description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 4
- 125000000174 L-prolyl group Chemical group [H]N1C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@@]1([H])C(*)=O 0.000 claims description 3
- CGBYDGAJHSOGFQ-LPEHRKFASA-N Pro-Ala-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@@H]2CCCN2 CGBYDGAJHSOGFQ-LPEHRKFASA-N 0.000 claims description 3
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 claims description 3
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 claims description 3
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 claims description 2
- 241000588652 Neisseria gonorrhoeae Species 0.000 claims description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 claims description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 2
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 claims description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 2
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims 9
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 claims 9
- 101000746367 Homo sapiens Granulocyte colony-stimulating factor Proteins 0.000 claims 2
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 claims 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 152
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 59
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 28
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical group C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 21
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 21
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 17
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 16
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 16
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 15
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 15
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 11
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 11
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 10
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 10
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 10
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 10
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 9
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 8
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 8
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 7
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 7
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 7
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 6
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 6
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 6
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 6
- WPWUFUBLGADILS-WDSKDSINSA-N Ala-Pro Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O WPWUFUBLGADILS-WDSKDSINSA-N 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 5
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 5
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 4
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 4
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 description 4
- 108010087924 alanylproline Proteins 0.000 description 4
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 4
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 4
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 4
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 3
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010048188 MS2 polymerase Proteins 0.000 description 3
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 3
- 241001108452 Neisseria gonorrhoeae MS11 Species 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 3
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 108090000624 Cathepsin L Proteins 0.000 description 2
- 102000004172 Cathepsin L Human genes 0.000 description 2
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 2
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 2
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 2
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 102000000646 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 2
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 108010086093 Mung Bean Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 229940076264 interleukin-3 Drugs 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 2
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 2
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 2
- 238000000734 protein sequencing Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LOGFVTREOLYCPF-KXNHARMFSA-N (2s,3r)-2-[[(2r)-1-[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-hydroxybutanoic acid Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CCCCN LOGFVTREOLYCPF-KXNHARMFSA-N 0.000 description 1
- 230000006269 (delayed) early viral mRNA transcription Effects 0.000 description 1
- IXHADCPJRQNDGG-UHFFFAOYSA-N 3-[bis(2-chloroethyl)amino]-1-(4-phenylphenyl)propan-1-one Chemical compound C1=CC(C(=O)CCN(CCCl)CCCl)=CC=C1C1=CC=CC=C1 IXHADCPJRQNDGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000024188 Andala Species 0.000 description 1
- 102000007592 Apolipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010071619 Apolipoproteins Proteins 0.000 description 1
- YCYXHLZRUSJITQ-SRVKXCTJSA-N Arg-Pro-Pro Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 YCYXHLZRUSJITQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 101800001288 Atrial natriuretic factor Proteins 0.000 description 1
- 102400001282 Atrial natriuretic peptide Human genes 0.000 description 1
- 101800001890 Atrial natriuretic peptide Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 description 1
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 description 1
- 241001478240 Coccus Species 0.000 description 1
- 102000003712 Complement factor B Human genes 0.000 description 1
- 108090000056 Complement factor B Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 108010091443 Exopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000018389 Exopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 206010018612 Gonorrhoea Diseases 0.000 description 1
- 241001501603 Haemophilus aegyptius Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000987586 Homo sapiens Eosinophil peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 101000920686 Homo sapiens Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000003777 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000193 Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 102100026964 M1-specific T cell receptor beta chain Human genes 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 102000009890 Osteonectin Human genes 0.000 description 1
- 108010077077 Osteonectin Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- NHDVNAKDACFHPX-GUBZILKMSA-N Pro-Arg-Ala Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O NHDVNAKDACFHPX-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 108091058545 Secretory proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000040739 Secretory proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- MROIJTGJGIDEEJ-RCWTZXSCSA-N Thr-Pro-Pro Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 MROIJTGJGIDEEJ-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 102000015395 alpha 1-Antitrypsin Human genes 0.000 description 1
- 108010050122 alpha 1-Antitrypsin Proteins 0.000 description 1
- 229940024142 alpha 1-antitrypsin Drugs 0.000 description 1
- 108010087408 alpha-beta T-Cell Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 108010029539 arginyl-prolyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000010352 biotechnological method Methods 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- NSQLIUXCMFBZME-MPVJKSABSA-N carperitide Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=CC=C1 NSQLIUXCMFBZME-MPVJKSABSA-N 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 108090001092 clostripain Proteins 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000008139 complexing agent Substances 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 239000012059 conventional drug carrier Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 229960001484 edetic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 239000008393 encapsulating agent Substances 0.000 description 1
- 229940066758 endopeptidases Drugs 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 102000044890 human EPO Human genes 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 239000003978 infusion fluid Substances 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 208000016638 multiple benign circumferential skin creases on limbs Diseases 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005580 one pot reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- REQCZEXYDRLIBE-UHFFFAOYSA-N procainamide Chemical compound CCN(CC)CCNC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 REQCZEXYDRLIBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 230000007026 protein scission Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- -1 respectively Proteins 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012536 storage buffer Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 125000000446 sulfanediyl group Chemical group *S* 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940095064 tartrate Drugs 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 238000007039 two-step reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5403—IL-3
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/28—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Vibrionaceae (F)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
- C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5409—IL-5
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/55—IL-2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Description
109810
Menetelmä rekombinanttiproteiinien entsymaattiseksi pilkkomiseksi käyttämällä IgA-proteaaseja - Förfarande för enzy-matisk spaltning av rekombinanta proteiner med användning av IgA-proteiner 5
Keksintö kohdistuu menetelmään bioteknisesti saatujen proteiinien sekvenssispesifiseksi pilkkomiseksi käyttämällä IgA-proteaaseja (nimitetään myös igaaseiksi) ja erityisesti 10 menetelmään rekombinanttiproteiinien, vastaavasti -peptidien, valmistamiseksi prokaryooteissa ja sitä seuraavaan, N-terminaalisen sekvenssin poistamiseen.
Proteiinien biotekninen valmistaminen suoritetaan edulli-15 sesti käyttämällä mikro-organisneja, jotka ovat helposti viljeltäviä ja jotka mahdollistavat tuotetun proteiinin talteenottamisen yksinkertaisella tavalla. Tähän sopivia mikro-organismeja ovat esimerkiksi gram-negatiivinen bakteeri Escherichia coli, gram-positiivinen bakteeri Srepto-20 coccus carnosus sekä leipomohiiva Saccharomyces cerevisiae. Autenttisesti vieraiden geenien ilmentämisellä tällaisissa mikro-organismeissa on kuitenkin usein paljon haittoja. Esimerkiksi E. colissa pilkotaan luonnollisten proteiinien : translaation vaatima aminoterminaalinen metioniinitähde 25 usein tehokkaasti. Vieraissa proteiineissa tapahtuu tämä pilkkominen kuitenkin useimmiten vain osittain. Sen tähden on sopiva keino tällaisten proteiinien, joissa on määritet-ty aminopää, valmistamiseksi muodostaa ne ensin fuusioitu-j en proteiinien muotoon ja pilkkoa ne seuraavaksi sek-30 venssispesifisellä proteaasilla määritetysti.
!,.* Verrattuna autenttisiin proteiineihin voi tällaisilla fuu- ·. sioiduilla proteiineilla olla etuna se, että ne aggregoitu- t · j '· vat mikro-organismin soluun ja muodostavat tiheitä presipi- : 35 taatiokappaleita (inclusion bodies), jotka voidaan erottaa vähäisillä kustannuksilla muista solun osista, jolloin ha- ,, . lutun proteiinin eristäminen ja puhdistaminen helpottuu.
• » • * Toisaalta kantajaproteiinit, jotka fuusioidaan geenitekno logisella menetelmällä ensiksi varsinaisesti haluttuun pro- 2 109810 teiiniin, antavat fuusiopartnerille erityisen stabiiliuden ei-spesifistä proteolyyttistä hajoamista vastaan; vieraiksi tunnistettujen polypeptidien hajoamisongelma koskee erityisesti pienten peptidien bioteknistä valmistamista. Toisaal-5 ta muut kantajaproteiinit mahdollistavat haluttujen proteiinien ohjaamisen määrättyihin solun osastoihin, joista ne voidaan puhdistaa pois erittäin helposti ja joissa ne ovat erittäin stabiileja ja/tai joissa ne ovat helppopääsyisiä testaustarkoituksiin. Lisäksi kantajaproteiineilla voi olla 10 myös erityisiä ominaisuuksia, jotka mahdollistavat tehokkaan puhdistamisen esimerkiksi affiniteettikromatografiällä. Useimpiin käyttötarkoituksiin ovat edullisia fuusioidut proteiinit, joissa on kantajaproteiini aminopäässä ja haluttu proteiini karboksyylipäässä. Päinvastainen versio tai 15 halutun proteiinin kytkeminen kahteen fuusiopartneriin voi olla määrätyissä tapauksissa myös edullista. Lisäksi voi halutun proteiinin fuusiossa reiterointi olla edullista.
Halutun proteiinin valmistamiseksi tämänkaltaisesta fuusi-20 osta vapaassa muodossa on kovalenttisesti sitoutuneiden fuusiopartnereiden pilkkominen toisistaan välttämätöntä. Periaatteessa tämä voidaan suorittaa kemiallisella tai biokemiallisella (entsymaattisella) menetelmällä. Tällöin on : kuiten useimmiten rajoittavana nykyisin käytössä olevien : 25 menetelmien rajoittunut spesifisyys, sillä halutun proteii- ·· nin saamiseksi on tärkeää, että tälläinen pilkonta tapahtuu * · « · fuusiopartnereiden välissä olevassa pilkontasekvenssissä, • · ,·. : siis siirtymäalueella, eikä missään tapauksessa lisäksi ·;·_ itse halutun proteiinin sisällä.
30 , . Tähän mennessä käytetyt kemialliset menetelmät fuusioitujen # · » proteiinien sekvenssispesifiseksi erottamiseksi ovat esi-' merkiksi bromisyaanilla pilkkominen aminohapossa metioniini proteiinin sisällä ja pilkonta aminohappojen Asp·'«Pro vä-35 listä happamassa ympäristössä käyttämällä muurahaishappoa.
•. Nämä menetelmät ovat kuitenkin vain silloin sopivia, kun spesifinen pilkontakohta ei ole olemassa toista kertaa ha-• ·' lutussa proteiinissa katsottuna siirtymäalueelta fuusio- partneriin. Kuitenkin biokemialliset pilkontamenetelmät 109810 3 ovat ovat edullisempia kuin kemialliset menetelmät, sillä ensin mainitut voidaan suoritaa fysiologisissa tai ainakin kemiallisesti miedoissa reaktio-olosuhteissa, jotka eivät vahingoita haluttua proteiinia.
5
Biokemialliset menetelmät fuusioitujen proteiinien pilkkomiseksi perustuvat mahdollisimman spesifisten proteaasien käyttämiseen. Esimerkiksi trypsiini pilkkoo aminohappoa arginiini tai lysiini seuraavat peptidisidokset proteii-10 neissa. Spesifisyyden lisääminen voidaan saada aikaan modifioimalla kemiallisesti edeltä aminohappo Lys, jolloin aminohapon arginiini spesifinen tunnistaminen vähenee. Eräs toinen bioteknisesti käytetty proteaasi on klostripaiini, tämä entsyymi pilkkoo aminohapon arginiini ja minkä tahansa 15 sitä seuraavan aminohapon väliset peptidisidokset. Katsauksen tähän mennessä käytettyihin entsymaattisiin menetelmiin fuusioitujen proteiinien pilkkomiseksi on tehnyt F.A.O. Marston ([D.M. Glover, E.]: DNA cloning III, IRL PRESS Oxford ja Washington DC, 1987). Entsymaattiset pilkontamene-20 telmät ovat myös sillä tavalla rajoittuneita, että pilkon-takohdalle spesifinen (spesifiset) aminohappo (aminohapot) voi (voivat) esiintyä samalla myös itse halutussa proteiinissa. Fuusioitujen proteiinien biokemialliseen pilkontaan : sopivat siten erityisesti entsyymit, jotka eivät tunnista 25 pilkkomista varten vain yhden aminohapon vaan tällaisten aminohappojen järjestyksen, sillä todennäköisyys, että mää-rätty aminohappojärjestys esiintyy viekä fuusiopartnereiden :*·,· välisen pilkontakohdan ulkopuolella itse halutussa proteii- nissa on sitä vähäisempi, mitä suurempi on pilkontasekvens-30 sin tunnistamiseen ja lohkisemiseen tarvittavien aminohap-· poj en lukumäärä.
Proteaasit, jotka leikkaavat määrätyn proteiinin erittäin | ’·· spesifisesti, ovat tunnettuja. Lukuisat tällaiset selektii-: :35 viset proteaasit (esim. ne, jotka esiintyvät ihmisen komp- _ lementti- ja verenhyytymisjärjestelmässä) pilkkovat tosin ,, , substraatin määrätyssä kohdassa, siirrettäessä vastaava * 1 pilkonta-alue toiseen proteiiniin (esim. fuusioituun prote iiniin) eivät tällaiset proteaasit ole yleensä pilkontaan 4 109810 kykeneviä. Syyt tähän ovat monet ja ne ovat esimerkiksi siinä, kuinka proteaasi tunnistaa substraatissa olevan määrätyn sekundaari- tai tertiaarirakenteen tai fuusioidussa proteiineissa olevan pilkontakohdan luoksepääsemättömyydes-5 sä.
Sekvenssispesifisten proteaasien, joita on käytetty tähän mennesssä fuusioitujen proteiinien pilkkomiseen rajoitetusti, listaa esittää nykyisin faktori Xa. Tämä proteaasi 10 leikkaa spesifisesti pilkontasekvenssin Ile-Glu-Gly-Arg-i*X, jolloin ·;· on pilkontakohta ja X on mikä tahansa aminohappo. On kuitenkin osoittautunut, että tätä proteiinia ei voida käyttää yleisesti fuusioitujen proteiinien pilkontaan, joissa on vastaava pilkontasekvenssi siirtymä-15 pinnassaan ja usein tällaiset substraatit (so. fuusioidut proteiinit, jotka sitovat halutun proteiinin kovalenttises-ti kantajaproteiiniin) eivät pilkkoudu vähäisemmässäkään määrin tai vain liukenevassa muodossa.
20 Erityisen merkityksellistä on fuusioitujen proteiinien tehokas pilkonta valmistettaessa rekombinanttiproteiineja prokaryoottisissa organismeissa. Silloin tarvitaan nimittäin DNA-sekvenssin kloonaamista, joka sisältää AUG;n aloi- • · · • ·* tuskodonina ennen varsinaisen DNA-sekvenssin alkua. Tämän 25 seurauksena ilmentyy prokaryooteissa, kuten esimerkiksi E.
* colissa, rekombinanttiproteiini, joka sisältää amniohappo- i · · • asemassa -1 metioniinitähteen.
• · » · • · · • ·
Monissa tapauksissa tarvitaan kuitenkin asemassa 1 metio-30 niinittömän rekombinanttiproteiinin valmistamista. Tällais-.·. : ten proteiinin talteenotto prokaryooteista voidaan tehdä esimerkiksi metioniinispesifisen peptidaasin kautta, joka • · · pilkkoo pois N-terminaalisen metioniinin. Tämä menetelmä • ·· on kuitenkin hyvin kustannuksia vaativaa, sillä tämä pil- :<tt! 35 konta voidaan tutkia vain proteiinisekvennoinnilla. Lisäksi asemassa -1 olevan metioniinipitoisen ja metioniinivapaan .. .( proteiinin erottaminen on lähes identtisten molekyylipai- i · • * nojen perusteella hyvin vaikeaa ja se voidaan suorittaa sen tähden vain hyvin epätäydellisesti.
5 109810 PCT-hakemuksessa WO84/02351 selostetaan N-terminaalisten aminohappojen pilkkominen fuusioproteiinista. Tällöin voidaan poistaa proteiinin useita aminohappoja N-terminaalista vaiheittaisella pilkkomisella eksopeptidaasilla, edullises-5 ti leusiinipeptidaasilla, sekvenssiin X-Pro saakka. Sekvenssi X-Pro pilkotaan tästä tuotteesta joko kahdessa vaiheessa tai yksivaiheisessa reaktiossa käyttämällä postpro-liini-dipeptidyyli-aminopeptidaasia (EC 3.4.14.). Tämän menetelmän haittana on kuitenkin se, että vaiheittaisella 10 aminohappojen pilkkomisella proteiinin N-terminaalista ei synny mitään yhtenäistä tuotetta vaan aina tuoteseos, joka sisältää ei-toivotun tuotteen lisäksi myös epätäydellisiä sekä liian hajonneita tuotteita.
15 EP-patentista 0 020 290 tunnetaan toinen menetelmä fuusio-proteiinin entsymaattiseksi pilkkomiseksi. Tässä menetelmässä käytetään entsyymiä kollagenaasi proteiinin fuusio-osan pilkkomiseen määrätystä tunnistussekvenssistä. Sen jälkeen voidaan poistaa muita fuusio-osan aminohappoja kä- 20 sittelemällä edelleen entsymaattisesti. On kuitenkin todettu, että kollagenaasin sekä muiden endopeptidaasien spesifisyys on vähäinen (katso Biochim. Biophys. Acta 271 (1972), 133-144). Sitäpaitsi ovat kollagenaasit vain sel-: ·* laisten proteiinien yhteydessä aktiivisia, joilla on spesifi. ' 25 finen tilarakenne.
• Myös jo mainitun tekijän Xa käyttö proteiinien N-terminaa-lisen fuusio-osan pilkkomiseen on tunnettu. Kuitenkin tässä menetelmässä on jo mainittujen pilkkomistehokkuusongelmien 30 lisäksi muita etuja ja sillä alalla, että proteiinin sisäi- .·. : set sekvenssit tunnistetaan ja pilkotaan. Lisäksi tekijä » · ·
Xa täytyy eristää naudan seerumista, jolloin pilkottaessa terapeuttisesti käytettyjä proteiineja tarvitaan myös vält- • a : '·· tämättä puhdistusta ja analyysiä mahdollisesti esiintyvien • ta 35 patogeenisyystekijöiden, vastaavasti virusten, toteamiseen.
»III» t <
Erilaiset patogeeniset bakteerilaj it (esimerkiksi Neisse-ria-lajit, kuten Neisseria gonorrhoea ja Neisseria meningitis, tai Haemophilus-lajit, kuten Haemophilus influenzae 6 109810 ja Haemophilus aegypticus), jotka kasvavat ihmisen limakalvossa, erittävät sekvenssissään keskenään lähisukuisia pro-teaaseja, jotka ovat spesifisiä ihmisen IgG:lle ja joita nimitetäään sen takia IgA-proteaaseiksi tai igaaseiksi. 5 Immunoglubuliini IgAl on sekretorisen immuunivasteen tärkeä komponentti, joka suojaa tälläisten patogeenien aiheuttamaa infektiota vastaan (katsaus: Kornfeld ja Plaut, Rev. Infect. Dis. 3 (1981), 521-534). Lisäksi IgA-proteaasi pilkkoo oman edeltäjäproteiininsa autoproteolyysillä. IgA-pro-10 teaasin muodostaminen Neisseria gonorrhoeaesta MS11 autenttisessa bakteerikannassa sekä gram-negatiivisissa isäntä-soluissa on kuvattu yksityiskohtaisesti (DE 36 22 221.6).
IgA-proteaasi pilkkoo seuraavat tunnistussekvenssit, kuten 15 esimerkiksi Pohlner et ai. (Nature 325 (1 987), 458-462) kuvaavat: 1. Pro-Ala-Pro·:-Ser-Pro 2. Pro-Pro·!·Ser-Pro 20 3. Pro-Pro···Ala-Pro 4. Pro-Pro·'·Thr-Pro
Symboli tarkoittaa IgA-proteaasin leikkauskohtaa. IgA- : .· proteaasin kloonaaminen ovat kuvanneet esimerkiksi Pohlner '·,·/ 25 et ai. 1987, supra.
• · »
Siksi esillä olevan keksinnön kohteena on saada aikaan pa-rannettu menetelmä fuusioitujen proteiinien biokemiallisek-si (entsymaattiseksi) pilkkomiseksi, niin että geenitekni- » 30 sesti valmistettua fuusioitua proteiinia, joka koostuu mis- . . tä tahansa fuusiopartnerista ja siirtymäalueella olevasta » » » !..* spesifisestä pilkontasekvenssistä, voidaan käyttää sub straattina haluttujen proteiinien talteenottamiseen mahdol-lisimman suurena saantona ja toistettavasti.
0 :"'t: 35 ’ . Tämä tehtävä ratkaistiin geeniteknisesti viemällä tunnis- ··.·, tuspaikka, vastaavasti pilkontasekvenssi, Pro-*J*X-Pro fuu sioitujen proteiinien siirtymäalueelle ja pilkkomalla tämä pilkontasekvenssi IgA-proteaasilla *i*:lla merkityssä pii- 7 109810 kontakohdassa, jolloin X on edullisesti aminohappo Ser, Thr ja Ala ja erityisen edullisesti Ser tai Thr, mutta se voi tarkoittaa myös muuta aminohappoa.
5 Siten esillä olevan keksinnön kohteena on menetelmä fuusioitujen proteiinien entsymaattiseksi pilkkomiseksi ja näiden fuusioitujen proteeinien haluttujen osien talteenottamiseksi, jolle on tunnusomaista, että (1) modifioidaan geeniteknisillä keinoilla siirtymäalue, jos-10 sa fuusioidun proteiinin kaksi osaa ovat toisiinsa kytkeytyneenä siten, että tälle siirtymäalueelle syntyy vähintään yksi IgA-proteaasitunnistuskohta, jossa on aminohapposekvenssi Y-Pro'1 X-Pro, jossa X voi olla mikä tahansa aminohappo ja Y voi olla mikä tahansa yksi tai useampi aminohappo, 15 (2) vaiheesta (1) saatu fuusioitu proteiini pilkotaan IgA- proteaasilla ':11a merkityssä tunnistuskohdan asemassa, ja (3) pilkkomisen jälkeen otetaan talteen fuusioidun proteiinin yksi tai useampi haluttu osa.
20 Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa .
Esillä olevan keksinnön mukaiseen käsitteeseen "IgA-proteaa-si" kuuluvat proteaasit, jotka pilkkovat IgA:n spesifisesti, 25 esim. ne, jotka on kuvattu Rev. Infekt. Dis.3:ssa (1981) 521- , ,·. 534. Samaten ovat sopivia myös rekombinantti-IgA-proteaasit, • jotka on kuvattu esimerkiksi DE-A 36 22 221:ssä, Proc. Natl.
Acad. Sei. USA 80 (1983) 2681-2685, Nature 325 (1987) 458-462 ·* ja EMBO Jour. 3 (1984) 1595-1601.
V.J 30 V * Keksinnön mukaisessa menetelmässä tapahtuu fuusioitujen pro teiinien siirtymäalueen modifiointi edullisesti siten, että :/·· fuusioidun proteiinin siirtymäalueelle rakennetaan nukleoti- ‘ : disekvenssejä, jotka koodaavat IgA-proteaasitunnistuskohtaa « « » . 35 tai sen osaa, jolloin nämä nukleotidisekvenssit rakennetaan > » · yhden tai useamman, proteiinifuusion haluttua osaa koodaavan DNA-sekvenssin eteen ja/tai jälkeen. Tähän tarkoitukseen käy-:_:t: tetään edullisesti nukleotidijärjestyksiä, jotka voidaan syn- : tetoida kemiallisesti.
8 109810
Yllättäen todettiin, että keksinnön mukainen menetelmä sopii erityisesti myös fuusioitujen proteiinien pilkkomiseen, joissa ei ole alunperin (so. ennen siirtymäalueen modifiointia) mitään luonnollista IgA-proteaasitunnistuskohtaa.
5
Keksinnön mukaiseen menetelmään tarkoitetussa IgA-proteaa-situnnistuskohdassa on aminohappo-konsensussekvenssi Y-Pro*'*X-Pro. Tällöin X voi merkitä mitä tahansa aminohappoa ja Y mitä tahansa yhtä tai useampaa aminohappoa. X tarkoit-10 taa edullisesti seriiniä, treoniiniä tai alaniiniä, erityisen edullisesti seriiniä tai treoniiniä. Y tarkoittaa edullisesti useampia aminohappoja, jotka päättyvät sekvenssiin Pro, Pro-Ala, Arg-Pro, Pro-Arg-Pro, Ala-Pro-Arg-Pro tai Pro-Ala-Pro-Arg-Pro.
15
Keksinnön mukainen menetelmä käsittää täten sen, että IgA-proteaasitunnistuskohta, jossa on vähintään konsensuspil-kontasekvenssi Y-Pro·!-X-Pro, viedään halutun fuusioidun proteiinin siirtymäalueella, esimerkiksi kantajaproteiinin 20 ja halutun proteiinin väliin, ja sitä voidaan käyttää halutun proteiinin pilkkomiseen ja talteenottamiseen IgA-prote-aasin avulla. Tällöin sijoitetaan pilkontasekvenssiin Y-Pro··-X-Pro edullisesti aminohapot Ser, Ala tai Thr asemaan • » ’.· X. Pilkkomisen edelleen optimoimiseksi merkityssä kohdassa » 25 voidaan pilkontasekvenssiin esikytkeä muita erityisiä ami- /;· nohappoja, erityisesti aminohappo Pro.
» * · i » I 1 * * « .\j Erityisen edullisia ovat aminohapposekvenssit: * * , (a) Pro-Ala-Pro··*Ser-Pro » » * 30 (b) Pro-Pro···Ser-Pro . (c) Pro-Arg-Pro-Pro*·*Ala-Pro (d) Pro-Pro· '-Thr-Pro * i » ·' (e) Ala-Pro-Arg-Pro···Thr-Pro tai j (f) Pro-Ala-Pro-Arg-Pro-Pro···Thr-Pro 35 * i » Käytettäessä keksinnön mukaista menetelmää fuusioitujen » » ,, , proteiinien pilkkomiseen, joissa haluttu proteiini on kyt- t · > ·* ketty kantajaproteiinin perään, syntyy IgA-proteaasilla pilkkomisen jälkeen proteiini, jonka aminoterminaalille on 9 109810 tunnusomaista sekvenssi X-Pro. Tämä sekvenssi voi olla halutun proteiinin osana etuna, haitallinen tai merkityksetön. Tästä sekvenssistä on etua, kun geeniteknisesti valmistettu haluttu proteiini sisältää luonnollisessa muodos-5 saan aminoterminaalissaan vastaavat kummatkin aminohapot X-Pro. Bioteknisesti tärkeitä proteiineja, joille on tunnusomaista aminoterminaalinen X-Pro, esiintyy luonnossa.
Keksinnön mukaisessa menetelmässä on verrattaessa kaikkiin 10 muihin tunnettuihin menetelmiin proteiinifuusioiden pilkkomiseksi etuna se, että sitä voidaan käyttää yllättäen uni-versaalisesti fuusioituihin proteiineihin, joissa on siir-tymäalueella esitetty pilkontasekvenssi ja että sitä voidaan käyttää liukenemattomiin, liukeneviin, kalvoon assosi-15 oltuihin ja soluunsitoutuneisiin proteiinifuusioihin. Erityisenä etuna menetelmä tarjoaa mahdollisuuden pilkkoa fuusioidut proteiinit, vastaavasti proteiinituusiot, presipi-taatiokappaleiden muodossa siten kuin ne saadaan mikro-organismeissa ja joissa ne voidaan sellaisenaan helposti ri-20 kastaa. Menetelmän toisena etuna on se, että käytetty pil-kontaentsyymi, igaasi, voidaan ottaa talteen viljelyväli-aineista käyttämällä vähän ei-patogeenisia bakteereita.
• ·
Igaasille tarkoitetun pilkontasekvenssin vieminen siirtymä- • · · 25 alueelle tapahtuu geeniteknisin keinoin. Siten nukleotidien ·'·· järjestys, vastaavasti nukleotidisekvenssi, joka koodaa I I · ·' ·* pilkontasekvenssiä tai sen osaa, voidaan syntetoida kemial- • · lisesti ja viedä kantajaproteiinin ja halutun proteiinin « · « V * DNA-kappaleiden väliin tunnetuilla geeniteknisillä keinoil- 30 la. Vastaavasti voidaan rakentaa myös luonnollinen nukleo-tidien järjestys, joka koodaa sopivaa pilkontasekvenssiä tai sen osaa. Proteiinifuusiota koodaava geeni asetetaan sopivien (edullisesti indusoitavien) ilmentämissignaalien • · ohjauksen alaiseksi siten, että mahdollistetaan vaatimuksia *···’ 35 vastaava fuusioitujen proteiinien tuotanto. Proteiinifuusi- ·:··: oiden tuotannon isäntäsoluina voidaan käyttää sopivia pro- karyoottisia tai eukaryoottisia (kasvi- tai eläin-) soluja t · ja soluttomat järjestelmät ovat myös mahdollisia. Tällöin käytetyt kantajaproteiinit voivat sisältää mitä tahansa 10 109810 funktioita sen mukaan mitä ominaisuuksia niiden pitää luovuttaa proteiinifuusiolle kuten määrätyt siirtofunktiot, funktiot, jotka parantavat proteiinifuusion puhdistusta tai sen stabiiliutta ja monia muita. Edullisia kantajaproteii-5 neja selostetaan jäljempänä.
Keksinnön mukaista menetelmää vastaava proteiinifuusioiden pilkonta tapahtuu edullisesti igaasilla, jotka muodostetaan sivutuottavalla ei-patogeenisella bakteerikannalla ja ote-10 taan talteen puhdistamalla viljelysupernatantista (katso esimerkiksi DE-36 22 221).
Keksinnön mukaista menetelmää voidaan käyttää preparatiivi-siin sekä analyyttisiin tarkoituksiin. Preparatiivisessa 15 käytössä käytetään menetelmää tärkeiden proteiinien biotek-nisekseen talteenottamiseen, joita voidaan käyttää esimerkiksi lääketieteessä, tutkimuksessa, ympäristönsuojelussa tai teollisuusprosesseissa, vastaavasti tuotteissa. Analyyttisessä käytössä menetelmää käytetään esimerkiksi sopi-20 vien ilmentämis j ärjestelmien yhdteydessä geenifuusioiden rutiinitutkimiseen.
; .·. Keksinnön mukaisen menetelmän fuusioitujen proteiinien ent- symaattiseksi pilkkomiseksi ja näiden fuusioitujen proteii- ”! 25 nien haluttujen osien talteenottamiseksi eräälle suoritus- muodolle on tunnusomaista se, että \ '' (1 ) solu transformoidaan rekombinantti-DNA:11a tai rekom- « · · '· ’· binanttivektorilla, jolloin DNA, vastaavasti vektori, si- ♦ ♦ · *.* ‘ sältää geenin, joka koodaa fuusioitua proteiinia, vähintään 30 yhden kopion, joka proteiini sisältää vähintään yhden IgA-proteaasitunnistuskohdan siirtymäalueella, (2) transformoitu solu viljellään sopivassa väliaineessa, ./ (3) fuusioitua proteiinia koodaava geeni saatetaan ilmen- *... tymään transformoidussa solussa, 35 (4) fuusioitu proteiini pilkotaan IgA-proteaasilla ja (5) yksi tai useampi haluttu fuusioidun proteiinin osa eristetään.
,, 109810 Tällöin fuusioidun proteiinin käsittely IgA-proteaasilla väliaineessa (viljelyliemi) voi tapahtua soluliuotuksen ja/tai soluproteiinien osittaisen tai täydellisen erottamisen jälkeen.
5
Fuusioidun proteiinin, edullisesti prokaryoottisen ilmentä-mistuotteen, käsittelemiseksi on edelleen edullista immobi-lisoida IgA-proteaasi ammattimiehen sinänsä tuntemalla tavalla, esimerkiksi siten kuin EP-B 0 1 41 223 tai EP-B 0 141 10 224:ssä kuvataan.
Keksinnön mukaisen menetelmän erityisen edullinen käyttö on rekombinanttiproteiinien, vastaavasti -peptidien, joissa ei ole N-terminaalisia metioniinitähteitä, valmistaminen 15 fuusioiduista proteiineista, vastaavasti peptideistä, joissa on aminohapposekvenssi Met-Y-Pro*·-X-Pro-A, jossa X on mikä tahansa aminohappo, edullisesti Thr, Ala tai Ser, Y on mikä tahansa yksi tai useampi aminohappo, joka päättyy edullisesti, kun X on Thr tai Ala, Proihon, tai jos X on 20 Ser, se päättyy sekvenssiin Pro-Ala tai Pro-Pro, ja A tarkoittaa mitä tahansa aminohapposekvenssiä. Tällöin IgA-proteaasi pilkkoo fuusioidun proteiinin, vastaavasti peptidin, . . ja saadaan pilkontatuote, jossa on aminohapposekvenssi X- • ; Pro-A. Tämä menetelmä rekombinanttiproteiinien, joissa ei 25 ole N-terminaalista metioniinitähdettä, valmistamiseksi prokaryottisoluista sisältää seuraavat vaiheet: : (1 ) prokaryoottisen solun transformoimisen geenillä, joka koodaa proteiinia, vastaavasti peptidiä, joissa on amino-: happosekvenssi Met-Y-Pro· · -X-Pro-A, jossa X:n, Y:n ja A:n 30 merkitys on edellä annettu, (2) transformoidun solun viljelemisen sopivassa väliainees-sa ja transformoidun geenin ilmentämisen, (3) ilmentämistuotteen pilkkomisen transformoidusta solus- • ta, jossa on aminohapposekvenssi Met-Y-Pro··-X-Pro-A IgA-35 proteaasilla, ja ;··; (4) saadun pilkontatuotteen, jossa on aminohapposekvenssi X-Pro-A, jossa ei ole N-terminaalista metioniinitähdettä, eristämisen.
12 109810
Keksinnön mukaisella menetelmällä saadaan yhdessä vaiheessa proteiineja, joissa ei ole N-terminaalista metioniinitäh-dettä, yllättävän suurena saantona ja hyvällä spesifisyydellä, joissa proteiineissa on N-terminaalinen sekvenssi 5 X-Pro, jolloin X tarkoittaa edullisesti Thr, Ala tai Ser.
Fuusioidun proteiinin kantajaosa tarkoittaa aminohapposekvenssiä, jossa on vähintään 1, edullisesti 100 saakka, erityisen edullisesti 1-50, aminohappoa, joka päättyy yhteen 10 IgA-proteaasin tunnistamaan pilkontasekvenssiin. Jos X on aminohappo seriini, niin Y päättyy edullisesti sekvenssiin Pro-Ala tai Pro. Jos X on Thr tai Ala, niin T päättyy edullisesti Proshon, edullisemmin Arg-Pro:hon, Pro-Arg-Pro:hon tai Ala-Pro-Arg-Pro:hon.
15
Eräässä erityisen edullisessa suoritusmuodossa Y on vähintään 5 aminohappoa, jotka päättyvät sekvenssiin Pro-Ala-Pro-Arg-Pro. Keksinnön mukaiseen menetelmään sopivat kuitenkin sinänsä kaikki IgA-proteaasin tunnistamat pilkonta-20 kohdat.
Kantajaosa Y voi sisältää sen lisäksi vielä mitä tahansa : aminohappoja, edullisesti 100:aan saakka, erityisen edul lisesti 50 aminohappoon saakka. Tällöin käytetään kuitenkin ”! 25 edullisesti sellaisia aminohapposekvenssejä, jotka paran- tavat DNA-tasolla proteiinin Met-Y-Pro· J *X-Pro-A ilmenty-• mistä ja/tai helpottavat aminohappotasolla sen puhdistamis- ’· '· ta solusta.
30 Proteiinin Met-Y-Pro· ! ·X-Pro-A ilmentymistä DNA-tasolla voidaan parantaa esimerkiksi fuusioimalla β-galaktosidaasin fragmentteihin, so. kantajaosa Y käsittää β-galaktosidaasi-./ proteiinin osan. Muut mahdollisuudet proteiinin Met-Y-Pro- •••X-Pro-A ilmentymisen lisäämiseksi ovat ammattimiehen ;*’ 35 tuntemia. Fuusioimalla toisiin polypeptideihin, erityisesti korkeasti varautuneisiin (esim. poly(Lys, Arg)) tai määrä-tyissä substansseissa suurella affiniteetilla sitoutuviin (esim. streptavidiini) polypeptideihin tai proteiineihin 13 109810 voidaan helpottaa ilmentämistuotteen puhdistamista tai erottamista (katso esim. EP-A- 0 089 626, EP-A 0 306 610).
Lisäksi esillä olevan keksinnön kohteena on fuusioitu pro-5 teiini, joka sisältää useita polypeptidiosia ja joka sisältää rakennettuna vähintään yhdellä siirtymäalueella, joka on erilaisten polypeptidiosien välissä, yhden tai useamman IgA-proteaasitunnistuskohdan, jossa on aminohapposekvenssi Pro*'*X-Pro, jossa X tarkoittaa mitä tahansa aminohappoa, 10 edullisesti kuitenkin Ser:ä, Thr:a tai Ala:a. Erityisen edullisesti tunnistuskohdassa on aminohapposekvenssi (a) Pro-Ala-Pro·'*Ser-Pro, (b) Pro-Pro*·*Ser-Pro, (c) Pro-Arg-Pro-Pro-!·Ala-Pro, (d) Pro-Pro*·«Thr-Pro, (e) Ala-Pro-Arg-Pro· ·-Thr-Pro tai (f) Pro-Ala-Pro-Arg-Pro-Pro-·-Thr-Pro, 15 jossa ··· on tunnistuskohta.
Esillä oleva keksintö käsittää myös edullisesti proteiinin tai peptidin, jossa on aminohapposekvenssi Met-Y-Pro-·J-X-
Pro-A, jossa X tarkoittaa edullisesti Thr, Ala tai Ser, Y
20 tarkoittaa mitä tahansa, yhtä tai useampaa aminohappoa, ja edullisesti kun X on Thr tai Ala se päättyy Pro:hon, tai
jos X on Ser, se päättyy sekvenssiin Pro-Ala tai Pro, ja A
: tarkoitaa mitä tahansa aminohapposekvenssiä. Tämän kaltai- | · nen proteiini, vastaavasti peptidi, ilmennetään keksinnön 25 mukaisella menetelmällä transformoimalla prokaryoottisolu rekombinanttivektorilla, joka sisältää geenin vähintään ·’ ·’ yhden kopion, joka geeni koodaa tämän kaltaista proteiinia, '· " vastaavasti peptidiä.
• · · 30 Sekvenssi A voi olla mikä tahansa aminohapposekvenssi.
:Tässä aminohapposekvenssissä ei ole kuitenkaan edullisesti mitään muuta IgA-proteaasipilkontakohtaa.
*... Keksinnön muuna kohteena on rekombinantti-DNA, joka koodaa ’"· 35 keksinnön mukaista proteiinia, vastaavasti peptidiä, ja jossa fuusioidun proteiinin vähintään yhdelle siirtymäalu-eelle on rakennettu yksi tai useampi IgA__proteaasitunnistuskohta, vastaavasti pilkontasekvenssi.
1 4 109810
Keksinnön mukainen rekombinantti-DNA on alan ammattimiehen saatavissa molekyylibiologian alalla tunnetulla tavalla. Tavanomaisesti vektori, joka sisältää aminohapposekvenssiä A koodaavan DNA-sekvenssin, pilkotaan restriktioendonukle-5 aasilla (-seilla) tämän geenin 51-pään alueella, ja siihen uudelleenligatoidaan oligonukleotidit, jotka sisältävät halutun sekvenssin. Oligonukleotidin tulee sisältää tällöin sekvenssi, joka koodaa IgA-proteaasipilkontakohtaa tai sen osaa.
10
Keksinnön muuna kohteena on rekombinanttivektori, joka sisältää keksinnön mukaisen rekombinantti-DNA:n vähintään yhden kopion. Prokaryoottisissa organismeissa proteiinin ilmentämiseen sopivat perusvektorit ovat alan ammattimie-15 hen tuntemia. Tämä vektori on edullisesti sellainen, joka sallii keksinnön mukaisen DNA:n suuren ilmentäminenn. Yh-distelmä-DNA on edullisesti vektorissa indusoitavan ilmen-tämissignaalin (esim. lambda, tae, lac tai trp-promoottori) ohjauksen alaisena.
20
Keksinnön mukainen vektori voi olla ekstrakromosomaalinen (esim. plasmidi) tai isäntäorganismin genomissa integroi-: .·. tuna (esim bakteriofagi lambda). Keksinnön mukainen vektori ’ on edullisesti plasmidi. Vektorit, jotka sopivat geeni-il- 25 mentämiseen määrätyssä isäntäsolussa, ovat molekyylibiolo-gian alan ammattimiehelle tunnettuja. Kyseeseen voi tulla ; ·' eukaryootti-, edullisesti kuitenkin prokaryoottivektori.
*· Esimerkkejä keksinnön mukaisen DNA:n ilmentämiseen proka- : ryooteissa sopivista vektoreista ovat ainakin kaupallisesti 30 saatava pUC- ja pUR-vektorit.
• ·
Keksinnön muuna kohteena on solu, edullisesti prokaryoot-tisolu, erityisen edullisesti E. coli -solu, joka on trans-formoitu keksinnön mukaisella DNA:lla tai/ja keksinnön mu-·;·’ 35 kaisella rekombinanttivektorilla.
·*·*: Esimerkit proteiineista, joissa on N-terminaalinen sekvens si X-Pro, joissa X tarkoittaa Thr, Ala tai Ser ja jotka voidaan ottaa talteen keksinnön mukaisella menetelmällä 1S 109810 yhdessä vaiheessa, ovat ainakin ihmisen erytropoietiini, ihmisen T-solureseptorin β-ketju ja erityisesti ihmisen granulosyytteja stimuloiva tekijä (G-CSF).
5 G-CSF syntetoidaan lymfokiininä aktivoiduista monosyyteis-tä, makrofageista sekä joukosta muita solulinjoja. Lymfo-kiinit osallistuvat immuuni- vastaavasti verisolujärjestel-män kypsymiseen soluista. Ne stimuloivat luuydin-kantasolu-jen kypsymistä eriytyneiksi soluiksi. Siten G-CSF indusoi 10 esimerkiksi neutrofiilien ja granulosyyttien muodostumista.
Koska G-CSF kykenee lisäämään lyhyessä ajassa huomattavasti neutrofiilisten solujen populaatiota, G-CFS:lle on huomattavat terapeuttiset käyttöalueet. Niinpä G-CSF:ää voidaan 15 käyttää esimerkiksi syövän kemoterapian jälkeen, jossa immuunijärjestelmän solut tuhoutuvat. Lisäksi G-CSF:ää voidaan käyttää luuydinsiirroissa, vaikeissa palohaavoissa, immuuniheikkoudesta johtuvissa infektioissa ja leukemiassa.
20 G-CSF on sekretorinen proteiinimolekyyli. Primäärinen translaatiotuote sisältää N-terminaalisen signaalisekvens- sin, joka pilkkoutuu pois sekreetiossa siten, että kypsän : G-CSF:n sekvenssi alkaa aminohapoilla Thr(+1 )-Pro(+2) (ami- , .·, nohappoasemat +1 ja +2). Tuotettaessa G-CSF:ää prokaryoo- 25 teissä pilkotaan tämä signaalipeptidi heikosti tai ei ol- !!*! lenkaan siten, että G-CSF:n, jossa ei ole signaalisekvens- » * siä, valmistamiseksi prokaryooteista täytyy kloonata • · · ; / AUG(Met) aloituskodonina ennen kypsää G-CSF:ää koodaavan *·’ * sekvenssin alkua, joka alkaa proteiinitasolla Thr(+1)- 30 Pro(+2). Tämän seurauksena ilmennetään prokaryooteissa, kuten E. colissa, G-CSF, joka sisältäää metioniinin amino-v : happoasemassa -1.
i · ·
Keksinnön mukaisella menetelmällä voidaan prokaryooteista 35 valmistaa yksinkertaisella tavalla aminohappoasemassa -1 metioniinitön G-CSF, joka alkaa aminohapoilla Thr(+1)- Pro( +2 ).
16 109810 Tämä tapahtuu siten, että prokaryooteista otetaan talteen G-CSF:n johdannainen, joka sisältää aminohapposekvenssin asemassa +1 ja +2 aminohapot Thr(+1 )-Pro(+2) ja aminohapposekvenssin asemassa -1 aminohapposekvenssin, joka tunnis-5 taa IgA-proteaasin ja joka voidaan pilkkoa G-CSF:n aminohapposekvenssistä, joka alkaa Thr(+1)-Pro(2+).
Eräässä edullisessa suoritusmuodossa johdannainen sisältää asemassa -1 ja -2 Pro:n, asemasta -3 asemaan -1 aminohap-10 posekvenssin Arg-Pro-Pro, asemassa -4 asemaan -1 aminohapposekvenssin Pro-Arg-Pro-Pro tai asemasta -5 asemaan -1 aminohapposekvenssin Ala-Pro-Arg-Pro-Pro.
Eräässä erityisen edullisessa suoritusmuodossa johdannainen 15 sisältää asemasta -6 asemaan -1 aminohapposekvenssin -6 -5 -4 -3 -2 -1
Pro-Ala-Pro-Arg-Pro-Pro 20 Keksinnön hengessä ymmärretään G-CSF:llä luonnollisena esiintyvää G-CSF:ää, jonka sekvenssi on esitetty esimerkiksi Science 232:ssa (1986) 61 sekä siitä johdettuja johdan-; .·. naisia, joissa on granulosyyttejä stimuloivaa toimintaa ja * ! joiden aminohapposekvenssit alkavat X(+1 )-Pro(+2 ). X on • · · "I 25 Thr, Ser tai Ala, erityisen edullisesti Thr.
« i · * •*t ' Keksinnön mukainen G-CSF-johdannainen voidaan pilkkoa pro- * " karyooteisssa ekspressoimisen jälkeen käsittelemällä IgA- « I · V ; proteaaseilla asemien +1 ja -1 välissä (Thr(+1) ja Pro(-1) 30 välissä). Tällöin saadaan yhdessä ainoassa hydrolyysivai-: heessa asemassa -1 metioniinitön G-CSF, jonka aminohappo- sekvenssi alkaa N-terminaalissa luonnossa esiintyvän σι.· CSF:n aminohapoilla Thr (+1 )-Pro(+2 ).
• i · 35 Ilmennettäessä G-CSF:ää prokaryooteissa muodostuu huonosti liukenevia aggregaatteja (retractile bodies), jotka ovat inaktiivisia. Ennen kuin proteiinia voidaan käyttää esimerkiksi terapeuttisiin tarkoituksiin, se täytyy muuttaa aktiiviseksi muodokseen. Alan ammattimiehen tuntemissa mene- 17 109810 telmissä (vrt. esim. EP-A O 21 9 874, EP-A O 1 1 4 506, WO 84/03711) suoritetaan ensin liukoisaksi tekeminen lisäämällä denaturointiaineita, mitä seuraa renaturointi ja mahdollisesti lisäpuhdistusvaiheita. Keksinnön mukaisen proteii-5 nin käsitteleminen IgA-proteaasilla voi tapahtua ennen liukoisaksi tekemistä, liukoisaksi tekemisen jälkeen tai vasta renaturoinnin jälkeen. Jos liuokoisaksi tekemisen jälkeen suoritetaan suoraan IgA-proteaasilla käsittely, täytyy liukoisaksi tekevä aine (esimerkiksi guanidiinihydrokloridi 10 tai urea) erottaa dialysoimalla ennen IgA-proteaasin lisäämistä. IgA-proteaasilla käsittely suoritetaan kuitenkin renaturoinnin jälkeen, koska tässä tapauksessa G-CSF-saan-not ovat erittäin suuret.
15 G-CSF:n vastaavasti muun IgA-proteaaseilla pilkottavan proteiinin käsittelyolosuhteet eivät sinänsä ole kriittisiä. On kuitenkin edullista käyttää G-CSF:ää (vastaavasti muuta proteiinia) suhteessa IgA-proteaasiin painosuhteessa 1:1— 100:1. Muuttaminen tapahtuu edullisesti puskuroidussa vesi-20 liuoksessa pH:ssa 6,5-8,5. Puskurikonsentraatio on edullisesti alueella 50-300 mml/1, mahdollisesti lisättäessä 20-100 mmol/1 natriumkloridia. Pilkkominen tapahtuu edullises-: .·. ti huoneenlämpötilassa 20-60 min aikana.
"I 25 Liukoisaksi tekemisen, renaturoinnin ja IgA-proteaasilla pilkkomisen jälkeen saatu pilkontatuote puhdistetaan edul- ;t lisesti ioninvaihtimessa ja kokofraktonoinnilla. Tällä ta- • · · valla valmistetun ja asemassa -1 metioniinittomän G-CSF:n V * muiden proteiinien aiheuttama epäpuhtaus on alle 0,1 %, 30 edullisesti alle 10-3 %.
: Asemassa -1 metioniinitön G-CCSF voidaan erottaa, vastaa- vasti puhdistaa, pilkkomalla IgA-proteaasilla myös käytän-nöllisesti kvantitatiivisesti metioniinia sisältävästä fuu- < » ·;* 35 sioproteiinista.
Keksinnön mukaisella menetelmällä voidaan prokaryooteista » * saada rekombinantti-G-CSF, joka on alle 0,1 %, edullisesti alle 10”3 %, muiden proteiinien likaama ja joka on kvanti 1β 109810 tatiivisesti vapaa prokaryooteista peräisin olevasta G-CSF:stä, joka sisältää asemassa -1 metioniinin.
Keksinnön kohteena on myös lääkeaine, joka perustuu keksin-5 nön mukaisella menetelmällä talteenotettuun prokaryooteista peräisin olevaan G-CSF:ään vaikuttavana aineena, mahdollisesti yhdessä tavanomaisten farmaseuttisten kanto-, täyte-ja apuaineiden kanssa. Tällainen lääkeaine sopii erityisesti terapeuttisiin käsittelyihin, joissa täytyy kiihottaa 10 granulosyyttien, erityisesti neutrofiilien muodostumista.
Keksinnön mukaiset farmaseuttiset valmisteet käytetään edullisesti injektio- ja infuusioliuoksina. Tämä voi tapahtua siten, että käytetään jo ruiskutusvalmista liuosta, 15 jonka koostumus on keksinnön mukainen. On kuitenkin mahdollista käyttää farmaseuttisia valmisteita lyofilisaattien muodossa. Ne rekonstruoidaan sitten itsessään tunnetuilla injektiotarkoituksiin sopivilla aineilla tai liuoksilla. Inj ektointiväliaineena käytetään edullisesti vettä, joka 20 sisältää injektioliuoksissa tavanomaisia lisäaineita, kuten stabilointiainetta, liuotevälittäjäainetta, puskuria ja isotonisia lisäaineita, esimerkiksi fysiologista NaCl-kon-: .·. sentraatiota. Tällaisia lisäaineita ovat esimerkiksi man- niitti, tartraatti- tai sitraattipuskuri, etanoli, komplek-25 sinmuodostaj at, kuten esimerkiksi etyleenidiamiinitetra- * etikkahappo ja niiden ei-toksiset suolat, sekä korkeamole-*, \ kyyliset polymeerit, kuten juokseva polyetyleenioksidi, i » * viskositeetin säätämistä varten. Injektioliuoksiin tarkoi-V ‘ tettuijen juoksevien kantoaineiden täytyy olla steriileitä 30 ja ne täytetään edullisesti ampulleihin.
« > ♦ · · * · :T: Lisäksi keksintö kohdistuu prokaryooteista peräisin olevan :·' asemassa -1 metioniinittömän G-CSF:n käyttöön keksinnön
• « I
mukaisten valmisteiden valmistamiseen.
» » *:*' 35
Siinä tapauksessa, että pilkkomalla mikä tahansa fuusioitu ; proteiini keksinnön mukaisella menetelmällä saatu tuote sisältää proteiinin X-Pro-A (jossa X tarkoittaa mitä tahansa aminohappoa ja A aminohappojen mitä tahansa sekvenssi), 1 9 109810 joka sisältää aminoterminaalissaan kuitenkin vain ei-toivo-tun dipeptidin X-Pro, voidaan tämä ei-toivottu dipeptidi erottaa keksinnön mukaisen menetelmän osana käsittelemällä lisäksi dipeptidyyliaminopeptidaaseilla (DPAP). Dipeptidyy-5 liaminopeptidaasej a on tähän mennessä löydetty joukosta mikro-organismeja, hyönteisiä, sammakkoeläimiä ja erilaisista ihmiskudoksista. Ne käsittelevät esimerkiksi vaiheittain edeltäjäproteiineja, ne ovat osaksi spesifisiä dipeptidin X-Pro aminoterminaaliselle rakenteelle (X-Pro-DPDPa-10 se; G.Kreil, Trends in Biochemical Sciences 15, 23-26, 1990). Yhdistämällä keksinnön mukaisesti igaasi ja X-Pro-DPAP voidaan valmistaa haluttuja proteiineja, joissa on mitkä tahansa aminoterminaaliset aminohapot.
15 Edellä kuvatulla igaasin ja X-Pro-DPAP:n kombinoinnilla on mahdollista valmistaa prokaryooteista myös proteiineja, joissa on toinen N-terminaalinen aminohapposekvenssi asemassa -1 metioniinittömänä. Tällöin saadaan ensiksi fuusio-proteiini, jossa on aminohapposekvenssi Met-Y-Pro*·*X-Pro-20 A, jolloin tässä tapauksessa aminohapposekvenssissä A ei ole ilmennettävän proteiinin halutun osan kumpaakaan N-ter-minaalista aminohappoa X-Pro.
* ► « • * ! Prokaryoottisen solun ilmentämistuote, jossa on aminohap- 25 posekvenssi Met-Y-Pro*·-X-Pro-A, pilkotaan ensin IgA-prote- * · ♦ • * * | aasilla siten, että syntyy ensimmäinen pilkontatuote, jossa • * * • ·' on aminohapposekvenssi X-Pro-A.
• « * » · • * · V * Tämä proteiini voidaan, kuten edellä kuvataan, käsitellä 30 dipeptidyyliaminopeptidaasilla, joka tunnistaa spesifises-: ti sekvenssin X-Pro ja pilkkoo Pro:n takana. Näin syntyy toinen pilkontatuote, jossa on mikä tahansa aminohapposekvenssi A. Keksinnön mukainen menetelmä on siten erittäin hyödyllinen erilaisten proteiinien, joissa ei ole N-termi- » « 35 naalista metioniinitähdettä, valmistamisessa, eikä se ra-·:*; joitu proteiinien, joissa on N-terminaalinen sekvenssi X-Pro, valmistamiseen, joissa X on edullisesti Ser, Thr tai Ala.
20 109810
Keksintö koskee myös yhdistelmä-DNA:ta, joka sisältää (edellä määritellyn) IgA-proteaasia koodaavan alueen ja joka sopii fuusioitujen proteiinien siirtymäalueelle rakennettavaksi. Kyseessä on edullisesti kemiallisesti syntetoi-5 tu DNA-fragmentti, jonka päissä on edullisesti yksi tai useampia sopivia restriktiokohtia.
Käsitteiden määrittelyt:
Keksinnön mukainen menetelmä käsittää haluttujen proteii-10 nien bioteknisen talteenottamisen. Bioteknisellä ymmärretään tässä yhteydessä sitä, että haluttu proteiini tai sen välituote tulee esiin käyttämällä geeniteknisiä keinoja ja muita bioteknisiä menetelmiä (esim. mikro-organismien fer-mentointi).
1 5
Haluttu proteiini on välituote tai lopputuote, jota voidaan käyttää esimerkiksi lääketieteessä, tutkimuksessa, ympäristön suojelussa tai teollisuusprosesseissa tai vastaavasti tuotteissa.
20
Keksinnön mukainen menetelmä käsittää sen, että fuusioidusta proteiinista (nimitetään myös proteiinifuusioksi) muo- ; ,·, dostetaan haluttu proteiini, jolloin fuusioitu proteiini • · ! vastaavasti proteiinifuusio koostuu useista kovalenttisesti t t · • · '*; 25 toisiinsa sitoutuneista fuusiopartnereista. Tällöin vähin- > t tään toinen fuusioproteiineista on haluttu proteiini. Fuu- • t · ·* «* siointipartnereiden ja niiden toistumisaste fuusioidussa * · !. *: proteiinissa on mikä tahansa, edullisesti se koostuu yhdes- V * tä aminoterminaalisesta kantajaproteiinista ja yhdestä kar- 30 boksiterminaalisesta halutusta proteiinista.
* * i * »
Kantajaproteiini, vastaavasti kantajaosa, on siksi, että se antaa halutulle proteiinille fuusioproteiinin muodossa eri- i · *,,, tyisiä ominaisuuksia. Tällaiset ominaisuudet voivat ilmetä t · 35 esimerkiksi fuusioitujen proteiinien kohonneena stabiiliu-tena, jotka voivat perustua rakenteellisiin erikoisuuksiin ja siten korkeampaan resistenssiin soluproteaaseja vastaan * t tai fuusiooitujen proteiinien siirtymiseen ympäristöön, jossa on vähemmän proteolyyttistä toimintaa. Lisäksi kanta- 21 109810 japroteiini voi sisältää ominaisuuksia, jotka mahdollistavat fuusioitujen proteiinien tehokkaan puhdistamisen. Tähän kuuluu esimerkiksi tiettyjen ligandien sitominen affini-teettikromatografisten menetelmien yhteydessä, fuusioitujen 5 proteiinien kerrostuminen vähäisillä kustannuksilla erotettaviin presipitointikappaleisiin ja proteiinien siirrot helposti päästäviin kohtiin.
Fuusioidun proteiinin sisällä olevat alueet, joissa fuusi-10 oidun proteiinin komponentit (kantajaproteiini ja haluttu proteiini) ovat keskenään kosketuksissa, on nimetty siir-tymäalueeksi.
Jokainen siirtymäalue voidaan määritellä yhdellä tai use-15 ämmällä aminohappojärjestyksellä. Aminohappojärejstyksen (kuten kaikkien aminohappojen ja proteiinien tavanomaiset järjestykset) ymmärretään ja esitetään aminoterminaalises-ta (vasemmalta) suuntaan karboksiterminaalinen (oikealle).
20 Keksinnön mukaisen menetelmän puitteissa sisältävät kaikki ne siirtymäalueella olevat aminohappojärjestykset, joiden pitäisi olla IgA-proteaaseilla pilkottavia, keksinnön mu-;kaisen pilkontasekvenssin, vastaavasti tunnistussekvenssin.
t i » t · ' · ·
I I I
,25 Aminohappojärjestyksen kahden aminohapon välissä olevaa ’’! kohtaa, jossa fuusioitujen proteiinien, vastaavasti prote- l i iinifuusioiden pilkonta, tapahtuu, nimitetään pilkontakoh- > i i daksi.
* · * * 30 Keksinnön mukainen menetelmä käsittää fuusioitujen proteii- I f \'·! nien entsymaattisen pilkkomisen siirtymäalueella IgA-pro- V * teaaseilla. IgA-proteaaseilla, vastaavasti igaaseilla, ym- ;·, märretään keksinnön mukaisen menetelmän puitteissa lajin i i »
Neisseria gonorrhea MS11 IgA -proteaasia ja kaikkia muita
I I
35 tämän proteaasin kanssa nukleotiditasolla ja sen muodosta-’*' · misprosessissa käytettyjä entsyymejä. Näihin kuuluvat eri- t » * * tyisesti myös sukujen Neisseria ja Haemophilus IgA -prote- aasit.
22 109810
Mikro-organismi E. coli ED 8654 talletettiin numerolla DSM 2102 Deutschen Sammlung der Mikro-organismeniin, Griese-bachstrasse 8, 3400 Göttingen.
5 Keksintöä kuvataan seuraavien esimerkkien ja piirrosten avulla.
Piirroksessa:
Kuvio 1 esittää kaaviomaisesti kantajaproteiini MS2 -poly-10 meraasin (99 aminohappoa) ja N. gonorrhoeaesta MS11 peräisin olevan IgA-proteaasiedeltäjän β-domeenin (aminohappo-asema 1195-1505) välistä proteiinituusiota. Näiden kummankin osan välinen siirtymäalue koostuu 12 aminohaposta ja sisältää pilkontasekvenssin -Pro-Pro·’ *Thr-Pro-Pro igaasil-15 le. Pilkontakohdan konstruoimiseksi sijoitettiin neljä oli-gonukleotidiä (1)-(4) restriktioleikkauskohtien Eco Rl ja Hindlll väliin. Polypeptidin valmistaminen ja puhdistetulla igaasilla pilkkominen on selostettu lähemmin esimerkissä 5.
20 Kuvio 2 esittää proteiinifuusiota, joka koostuu kantajaproteiinista (MS2-polymeraasin 99 aminohappoa ja 6 plasmi-dikoodattua aminohappoa) ja 206 aminohaposta, jotka on ih-:·*: misen T-lymfosyyttien CD8-proteiinista. CD8-proteiinin ami- : nohappoj är j estyksessä on luonnollinen pilkontasekvenssi, 25 jonka igaasi pilkkoo (katso esimerkki 6).
,·/; Kuvio 3 esittää fuusioproteiinia B63*, joka tuotettiin E.
coli -solujen ilmentämis-sekreetiojärjestelmällä. Se koos-* tuu aminopäässä koleratoksiini B -alayksiköstä (103 amino- 30 happoa), mitä seuraa sitomisalue (11 aminohappoa) igaasi- • · * ’· pilkontakohtaan ja karboksyylipäässä IgA-proteaasiedeltä- v : jän β-domeenin osasta (aminohappoasema 1097-1160). Igaasi- :\ leikkauskohta rakennettiin kummallakin oligonukleotidilla .···. Tk006 ja Tk007 kummankin proteiinidomeenin väliin.
'·" 35
Kuvio 4 esittää kaaviomaisesti proteiinifuusioita B49 ja : .· B59. Ne koostuvat koleratoksiini B -alayksiköstä ja IgA- proteaasiedeltäj än β-domeenista. Näiden osien välissä on kaksi erilaista siirtymäaluetta, joissa on kaksi erilaista 23 1 0 9 8 1 0 igaaasipilkontasekvenssia (-Pro-Pro-Ala-Pro- ja Pro-Pro-Thr-Pro). Pilkontasekvenssi konstruoitiin synteettisillä oligonukleotideillä (katso kuvio 3).
5 Esimerkki 1
Plasmidin konstruointi metioniinivapaan G-CSF;n ilmentämiseksi
Konstruointi suoritetaan käyttämällä ilmentämisvektoria pPZ07-mgllac (WO/ 88/09373). Ilmentämisvektori pPZ07-mgllac 10 pilkotaan Neo I:llä ja ulkonevat päät poistetaan Mung-papu-nukleaasilla. Seuraavaksi pilkotaan vektori Bam Hl:llä. IgA-tunnistussekvenssi tehdään valmiiksi DNA-tasolla seu-raavilla oligonukleotideillä: 15 Oligonukleotidi A: 5' AAT TCG GAG GAA AAA TTA ATG ACA CCA CTG CGA CCT CCT ACA CCA CTG GGC CCT G 3'
Oligonukleotidi B: 5' GAT CC AGG GCC CAG TGG TGT AGG AGG TCG CAG TGG TGT CAT 20 TAA TTT TTC CTC CGA ATT 3'
Kumpaakin oligonukleotidia yhdistetään ekvimolaariset mää- • ·’; rät ja viedään noin 1 00-kertaisessa ylimäärässä edellä ku- .vattuun pilkottuun vektoriin pPZ07-mgllac. Uudelleenliga-
« · I
25 toimisen jälkeen transformoidaan tavanomaisella tavalla |·*·\ kompetentiksi tehdyt solut. DNA eristetään soluista tunne- t · *. tuilla menetelmillä ja pilkotaan APA I:llä ja Bam Hiillä.
• · ·
Eristetään noin 520 bp pitkä G-CSF-fragmentti G-CSF-sek-'·* ' venssissä käyttämällä restriktioendonukleaasia APA I ja Bam 30 HI (Science 232 (1986), 61-65). Tämä fragmentti ligatoidaan samoin Apa Iillä ja BamHIillä pilkottuun vektoriin.
• » ·
Esimerkki 2 .···. IgAl-tunnistussekvenssin lisäksi fuusioproteiini voi sisäl- 35 tää myös muita peptidejä puhdistusapuna. Nämä voivat koos-tua DNA:sta, joka koodaa streptavidiinia. Streptavidiini-• ’.· geeni (WO 89/03422) kloonataan oikeaan translaatiorasteriin ennen IgA-proteaasitunnistussekvenssiä.
24 1 0 9 8 1 0
Esimerkki 3 E. coli K12 -solut (ED 8654, DSM 2102) transformoidaan esimerkissä 1 kuvatulla plasmidilla, valikoidaan antibiootti-merkkiaineelle (ampisilliini) ja plasmidi karakterisoidaan 5 restriktioanalyysillä. Tällaista kloonia käytetään G-CSF:n viljelemiseen ja ilmentämiseen. Solut otetaan täysväliai-neeseen. Tämä väliaine sisältää litraa kohti 16 g Bacto-tryptonia (Difco), 10 g hiivauutetta (Difco) ja 5 g natri-umkloridia. Solujen annetaan kasvaa 2,0:n OD 546:een ja 10 sitten ne indusoidaan 10-3 mmoolilla/1 IPTG. Seuraavan 4 tunnin kuluttua solut kerätään sentrifugoimalla, liuotetaan lysotsyymi/EDTA:11a ja G-CSF eristetään sulkeumakappaleina (IB's, vrt. EP-A 0 219 874).
15 Eristettyjen liukenemattomien G-CSF-fuusiopartikkelien de-naturointi, vastaavasti renaturointi, suoritetaan siten kuin EP-A 0 219 874:ssä kuvataan. Denaturointi tapahtuu dialysoimalla 6 mmoolin/1 guanidiini-hydrokloridia vasten. Jo tästä voidaan ottaa alikvootti ja käyttää 5 mmoolin/1 20 kaliumfosfaattipuskuria pH 7 vasten dialysoinnin jälkeen IgA-proteaasilla pilkkomiseen (esimerkki 4).
25 1 0 9 8 1 0 sen pään proteiinisekvennointi osoittaa, että puhdistettu G-CSF alkaa oikealla aminohappojaksolla (Thr(+1)-Pro(+2).
Esimerkki 5 5 Proteiinifuusion valmistaminen ja liukenemattomien proteii-niaggreqaattien pilkkominen "sulkeumakappaleista" igaasille spesifisessä leikkauskohdassa
Prokaryoottinen iImentämisvektori pEX31C (K. Strebel, Journal of Virology 57, 983-991, 1986) modifioitiin siten, että 10 tällä järjestelmällä E. colissa sivutuotettu proteiinifuu-sio voitiin pilkkoa kantajaproteiiniksi ja halutuksi proteiiniksi. Tätä varten synteettisesti valmistetuista oligo-nukleotideistä koostettiin kaksijuosteinen DNA-fragmentti, joka koodaa aminohapposekvenssiä Thr-Pro-Ala-Pro-Arg-Pro-15 Pro··-Thr-Pro. Tämä DNA-fragmentti sijoitettiin geeniteknisillä menetelmillä ilmentämisvektorin pEX31 C EcoRI-leik-kauskohtaan. HindiII-kohtaan liitettiin suoraan rajoittu-vasti kaksi muuta synteettistä DNA-fragmenttia, jotka sisälsivät joukon sopivia leikkauskohtia restriktioendonuk-20 leaaseille ja terminaatiosignaaleja geeniekspressioon osallistuville bakteerientsyymeille. Täten syntyneeseen ilmen-tämisplasmidiin pEV37 sijoitettiin käyttämällä Smal:n ja : HindIII:n leikkauskohtia DNA-fragmentti, joka koodaa Neis- ; seria gonorrhoeaesta olevan IgA-proteaasi-edeltäjäproteii- 25 nin β-domeeneja. Täten syntyi hybridigeeni, jonka E. colis-sa ilmentämisessä muodostui fuusioproteiini. Se sisältää aminopäässä kantajaproteiinina MS2-polymeraasin 99 amino-!,/ happoa, mitä seuraa 12 aminohapon keskeinen siirtymäalue, jossa on igaasipilkontasekvenssi ja halutut B-domeenit kar-30 boksyylipäässä (katso kuvio 1). Puhdistetulla igaasilla '· voidaan pilkkoa pois β-domeenit proteiinifuusion karboksyy- V * lipäästä pilkontakohdassa Pro*J*Thr siirtymäalueen sisäpuo- lella.
35 Plasmidi, jossa on hybridigeeni, vietiin transformoimalla E. coli -soluihin, jotka sisältävät proteiinifuusion sää-: .* dettävää sivutuotantoa varten bakteriofagista lambda peräi sin olevan säätelytekijän CI^57 (e. Remaut, Gene 22, 103-113, 1983). Cl857 -repressori inaktivoitiin korottamalla 26 109810 lämpötila 28 °C:sta 42 °C:een ja sen johdosta aktivoituu proteiinituotanto rekombinanttisissa E. coli -soluissa. Tätähän lisättiin 50 ml 12 h 28 °C:ssa viljeltyä E. coli -viljelmää 200 ml:ssa etukäteen 45 °C:een lämmitetyssä vä-5 liaineessa ja inkuboitiin 2 tuntia 42 °C:ssa. Tässä vaiheessa proteiinifuusio rikastui bakteerien sytoplasmassa suurina määrinä sulkeumakappaleiden muodossa. Bakteerit kerättiin sen jälkeen sentrifugoimalla, ne suspendoitiin 20 ml:ssa lyysipuskuria (10 % sakkaroosia, 50 mM Tris/HCl 10 pH 8,0 , 1 mM EDTA) ja niitä inkuboitiin 30 min 22 °C:ssa sen jälkeen, kun oli lisätty 400 μΐ lysotsyymiliuosta (5 mg/ml). Detergenttiä Triton X-100 lisättiin loppukonsen-traatioon 0,1 % ja liuosta inkuboitiin uudelleen 30 min. Solyjen lyysissä vapautunut DNA hienonnettiin ultra-ääni-15 käsittelyllä, liukenemattomat aineosat, mm. presipitaatio-kappaleissa oleva proteiinifuusio, sentrifugoitiin pois ja pestiin seuraavaksi 5 ml:ssa H1NTE-puskuria (1 M ureaa, 50 mM NaCl, 50 mM Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA). Toistetun sen-trifugoinnin jälkeen sakka suspendoitiin ultraäänellä 5 20 ml:aan PBS-puskuria (20 mM kaliumfosfaattia, pH 7,5, 140 mM NaCl) ja pestiin. Tämä menettely toistettiin ureajäännösten poistamiseksi kokonaan. Lopuksi liukenematon frak-: .·. tio, joka sisälsi fuusioproteiinin, suspendoitiin ultraää nellä 5 ml:aan PBS-puskuria.
'V 25
Suspendoidun proteiinifuusion laatu ja määrä määritettiin \ SDS-polyakryyliamidielektroforeesilla (12,5 %) ja sitä seu-
I » I
*· · raavalla Coomassie-Blue-värjäyksellä. Pilkkomista varten '·* ’ proteiinisuspensiota inkuboitiin entsyymi/substraattisuh- 30 teessä 1/100 (paino/paino) 3 h 37 °C:ssa. Puhdistamattoman :,'*i ja liukenemattoman proteiinifuusion tapahtunut pilkkoutu-
• « I
il : minen tutkittiin analyyttisellä SDS-polyakryyliamidigeeli- :·' elektroforeesilla, jolloin ilmeni, että oli syntynyt poly- t I « peptidi, jonka koko oli β-proteiinille odotettu. Tämä pro-35 teiini vietiin nitroselluloosakalvolle ja alistettiin auto-matisoituun sekvenssianalyysiin. Päässä olevien aminohap- \· pojen järjestys vahvisti sen synnyn proteiinifuusiosta oi kean pilkkoutumisen kautta igaasilohkontapaikassa.
27 109810
Pilkonnassa muuttui kuitenkin vain noin 50 % käytetyn substraatin kokonaismäärästä. Lisäämällä suurempia määriä igaasia ja pidemmällä reaktioajalla ei saavutettu mitään lisäystä. Tämä osoittaa, että fuusioproteiinin leikkaamat-5 tomassa osassa oleva igaasileikkauskohta ei ole luoksepääs-tävissä. Hybridiproteiini ja pilkontatuotteet olivat myös igaasilla inkuboinnin jälkeen edelleen liukenemattomien aggregaattien muodossa ja voidaan sen seurauksena sedimen-toida suspensiosta sentrifugoimalla.
10 90 % pilkontasaantoja saavutettiin, kun käytettiin epäpuhtaan sulkeumakappalefraktion sijasta proteiinifuusiota, joka oli alistettu edellä lisäpuhdistusvaiheeseen. Tällöin liukenematon sakka otettiin pesemisen jälkeen H1INTE-pus-15 kuriin (s.o.) 5 ml:ssa H7NTE-puskuria (7 M ureaa, 50 mM NaCl, 50 mM Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA). Liukenemattomat osat erotettiin sentrifugoimalla ja liukenevat fraktiot dialysoitiin vasten 5 1 PBS-puskuria 4 °C:ssa. Poistettaessa urea dialyysillä fuusioproteiini presipitoitui liuokses-20 ta liukenemattomien aggregaattien muossa. Laskeutuneet aggregaatit muutettiin ultraäänikäsittelyllä hienoksi suspensioksi ja pilkottiin ja analysoitiin, kuten edellä kuvat-: **: tiin.
• » · * « « 25 Esimerkki 6
Renaturoidun, liukenevan proteiinifuusion spesifinen igaa-silla pilkonta Käyttämällä pEX-ilmentämisjärjestelmää valmistettiin hybridiproteiini (katso esimerkki 1), joka koostuu MS2-polyme-30 raasista ja ihmisen sytotoksisten T-lymfosyyttien CD8-pro-’· teiinin osasta (katso kuviio 2). Proteiinin esipuhdistami- • i i V : sen ja liuottamisen sulkeumakappaleista H7TE-puskurissa j’.>t jälkeen käytettiin toisena puhdistusvaiheena preparatiivis- ta 12,5 X SDS-polyakryyliamidigeeliä. Proteiinifuusio lei-• i 35 kattiin yksittäisenä kaistana Coomassie-Bluella värjäämisen jälkeen geelistä ja seuraavaksi se erotettiin Hunkapillerin ; ,· menetelmän (Methods in Enzymology 91, 227-235, 1983) mukai sesti geelimateriaalista. Elektroeluointi tehtiin TAE-pus-kurissa (40 mM Tris/asetaatti, pH 7,9), johon oli lisätty 28 109810 0,1 % SDS (natriumlauryylisulfaatti). SDS poistettiin myöhemmin dialysoimalla vasten 5 1 TAE-puskuria 22 °C:ssa. Seuraavassa dialysoinnissa proteiini siirrettiin säilytys-puskuriin (20 mM kaliumfosfaattia, pH 7,5, 140 mM NaCl, 50 5 % glyseriiniä). Tällä tavalla saatu liukeneva fuusioprote- iini inkuboitiin puhdistetulla igaasilla (katso esimerkki 5) ja se pilkkoutui tällöin täydellisesti CD8-molekyylin sisältävässä pilkontakohdassa (-Pro-Pro*«Thr-Pro-Ala-, katso kuvio 2) kahdeksi polypeptidifragmentiksi. Pilkkoutu-10 misen spesifisyys tutkittiin analysoimalla pienemmän pil-kontatuotteen aminopäässä oleva aminohappojärjestys. Siinä ilmeni odotetusti sekvenssi Thr-Pro-Ala-Pro-Thr-Ile.
Esimerkki 7 15 Liukenevan, viljelysupernatanteista talteenotetun proteii-nifuusion spesifinen igaasilla pilkkominen Proteiinifuusio, joka koostuu koleratoksiini B -alayksiköstä ja N. gonorrhoeae MS11:n IgA-proteaasiedeltäjän b-domee-nin osasta (Pos. 1097-1160; J. Pohlner, Nature 325, 458-20 462, 1987) otettiin talteen liukenevassa muodossa rekombi- nantti-E. coli -solujen viljelysupernatanteista. Kummankin proteiiniosan toisistaan erottamiseksi oli koletoksiini B : -alayksikön ja B-domeenin väliselle siirtymäalueelle lii- • tetty geeniteknisillä menetelmillä keinotekoinen pilkonta- .:.25 sekvenssi igaasia varten (Pro-Pro· · «Thr-Pro-). Tätä varten liitettiin oligonukleotidit Tk006 ja Tk007 siirtymäalueella ,·. : olevien restriktioleikkauskohtien EcoRI ja SacII väliin (katso kuvio 3). Fuusioproteiini rikastettiin 12 h 37 °C:s-sa kasvaneen bakteeriviljelmän 2 lista supernatanttia saos- t 30 tamalla ammoniumsulfaatilla ja seuraavaksi se dialysoitiin » » · *· 5 l:n PBS-puskuria vastaan. Pilkkomiseksi sitä inkuboitiin V 1 konsentraatiossa 50 μg/ml PBS-puskurissa entsyymi/sub-straattisuhteessa 150 (paino/paino) puhdistetulla igaasilla ,·**, 2 h 37 °C:ssa. Immuniblottausanalyysi osoitti, että täydel- * t 35 lisessä pilkoutumisessa esiintyvä suurempi pilkontafrag- I » · · * ‘ ' mentti vastaa molekyylipainoltaan ja reagoimiseltaan anti-: seerumin kanssa luonnollista koleratoksiini B -alayksikköä.
29 1 0 9 8 1 0
Esimerkki 8
Proteiinifuusioiden spesifinen pilkkominen gram-negatiivis-ten bakteerien pinnalla igaasilla Käytettiin ekspressio-sekreetiojärjestelmää koleratoksiini 5 B -alayksiköstä ja IgA-proteaasista koostuvien proteiini-fuusioiden TKB49 ja TKB59 ilmentämiseksi rekombinanttien salmonellien pinnalla ulos. TkB49:ää koodaava hybridigeeni sisälsi toksiini- ja B-domeenin välisellä siirtymäalueella alkuperäisen pilkontasekvenssin (c) (-Pro-Pro···Ala-Pro-) 10 igaasia varten. Sitä vastoin geeniin TkB59:ää varten liitettiin keinotekoinen DNA-fragmentti, joka koostuu oligo-nukleotideistä Tk006 ja Tk007, restriktioleikkauskohtien EcoRI ja SacII väliin ja joka koodaa pilkontasekvenssiä (-Pro-Pro*·*Thr-Pro-) (katso kuvio 3). Kun intaktit baktee-15 rit, joissa on pinnallaan ankkuroituneita fuusioproteiine-ja, inkuboitiin puhdistetulla igaasilla, niin silloin voitiin havaita spesifinen pilkkoutuminen igaasileikkauskoh-dissa. Immuunianalyysiblottauskokeissa osoitettiin, että pilkkoutumisessa esiintulevat pienet pilkontafragmentit 20 vastasivat kooltaan ja antiseerumiin reagoimiseltaan luonnollista koleratoksiini B -alayksikköä.
: Esimerkki 9 « » "1 , Aktiivisen igaasin puhdistaminen rekombinanttisten E. coli Y# 25 -solujen viljelysupernatanteista
Rekombinantti E. coli C600 -solut, jotka sisälsivät plasmi-\ din pEX1070 (DE 36 22 221 .6), jossa on modifioitu IgA-pro- ;/ teaasigeeni, erittivät aktiivista igaasia viljelysuperna- ’ tanttiin. Vilj elysupernatantissa oleva entsyymi voitiin 30 rikastaa kalvosuodatuksella ja seuraavaksi se voidaan saos-Y*· ta ammoniumsulfaatilla (0,42 g/ml) ammoniumsulfaatilla.
Y : Sentrifugoinnin jälkeen sakka liuotettiin Biorex-puskuriin :·, (50 mM kaliumfosfaattia, pH 7,0, 8,6 % glyseriiniä) (1 ml I I · |... puskuria kohti 1 1 vilj elysupernatanttia), se tasapainotet-
• I
35 tiin vasten 2 1 puskuria ja seuraavaksi se alistettiin ka-tioninvaihtokromatografiaan (Biorex70). Sitoutunut IgA-pro-Y_’ teaasi eluoitiin ja fraktioitiin pylväästä yhdessä vaihees sa eluointipuskurilla (500 mM kaliumfosfaattia, pH 7,0, 8,6 % glyseriiniä). IgA-proteaasia sisältävät fraktiot analy- 30 109810 soitiin seuraavaksi SDS-polyakryyliamidigeelielektroforee-silla (12,5 %). Tässä puhdistuskohdassa ilmeni 90 % keskimääräinen puhtausaste. Igaasin valmistamiseksi puhtaassa muodossa suoritettiin geelisuodatus Sephacryl HR300:lla 5 Biorex-puskurissa, mitä seurasi lisäksi kationinvaihtokro-matografia (s.o.). Igaasin aktiivisuus testattiin inkuboi-malla IgAl-vasta-aineilla ja syntyneiden pilkontatuotteiden erottaminen SDS-polyakryyliamidigeelillä.
10 Esimerkki 1 0
Plasmidin konstruoiminen metioniinittömän interleukiinin ilmentämiseksi
Konstruointi suoritetaan käyttämällä ilmentämisvektoria pPZ07-mgllac (WO/09373). Ilmentämisvektori pPZ07-mgllac 15 pilkotaan NCOI:llä ja ylimääräiset päät poistetaan Mung-papunukleaasilla. Seuraavaksi vektori pilkotaan BamHI:llä. Fuusioproteiinin optimoitu aminoterminaalinen alue valmistetaan DNA-tasolla seuraavan oligonukleotidin kautta: 20 Aloittaja 1A: 5' AATTCGGAGGAAAAATTAATGAAAGCCAAACGTTTTAAAAAACATGTCGACCATG GAG 3' ft k » · « ft * 1 · , ,Aloittaja 1 B: < i »
25 5' GGATCCTCCATGGTCGACATGTTTTTTAAAACGTTTGGCTTTCATTAATTTTTCC
» : ‘'! TCCGAATT 3' I * · I i < · « * ·
Kumpaakin oligonukleotidiä yhdistetään ekvimolaarisina mää- * * » ' rinä ja viedään noin 100-kertaisena ylimääränä edellä ku- 30 vattuun pilkottuun vektoriin pPZ07-mgllac. Ligatoinnin jäi- * · \''i keen tavanomaisella tavalla kompetentiksi tehdyt E. coli V 1 -solut transformoidaan. DNA eristetään tavanomaisella ta- ;·, valla soluista, pilkotaan Sall/BamHI:11a ja ligatoidaan » » < DNA-fragmenttiin, joka sisältää interleukiini 3:n koodaavan * 35 alueen ilman signaalisekvenssiä (kuvattu jäljempänä).
i t ♦ « * » ft j V Interleukiinin 3 koodaavan alueen, jossa on tunnistusalue
IgA-proteaasia varten DNA-tasolla, valmistaminen tapahtuu tunnetulla PCR:n tekniikalla, jossa suoritetaan PCR-reaktio 31 109810 interleukiinin 3 c-DNA:n templaattina kanssa ja jäljempänä olevien aloittajien kanssa.
Aloittaja 2A: 5 5' AAGCTTGTCGACCCACGTCCACCAGCTCCCATGACCCAGACAACGCCC 3'
Aloittaja 2B: 5' TTCGTTGGATCCCTAAAAGATCGCGAGGCTCAAAGT 3' 10 Saatu PCR-fragmentti leikataan entsyymeillä Sal I ja Bam HI ja se voidaan liittää siten suoraan edellä kuvattuun vektori-DNA:hän ja sitoa kovalenttisesti ligaasin avulla.
DNA:n sopivaan isäntään, esim. E. coli K12 C600, transfor-15 moimisen jälkeen voidaan II 3 syntetoida E. colisssa Rb:i-den muodossa ja eristää seuraavaksi. Kuten G-CSF:n osalta kuvattiin, suoritetaan proteiinin de- ja renaturointi ja renaturoitu proteiini pilkotaan IgA-proteaasilla. Täten valmistettua met-vapaata II 3:a voidaan käyttää muiden 20 lisäpuhdistusvaiheiden jälkeen hoitoon.
Esimerkki 11 * *’· Plasmidin konstruoiminen metioniinittomän inter leukiinin • * . ilmentämiseksi ' · « ' ' .......... i i i i i · « 25 Konstruointi voidaan suorittaa käyttämällä ilmentämisvek- « toria pPZ07-mgllac (WO/09373), joka pilkotaan aloittajien » · \ 1A ja 1B insertoinnin jälkeen, kuten esimerkissä 10 kuva- i * · taan Sall/Bam Hlrllä. Interleukiinin 2 koodaavan alueen, » * · '** ’ jossa on IgA-proteaasitunnistusalue DNA-tasolla, valmista- 30 minen tapahtuu PCR:n tekniikalla, jossa suoritetaan PCR-reaktio interleukiinin 2 c-DNA:n templaattina kanssa ja f ! t V * aloittajien 3A ja 3B kanssa, jotka koodaavat samaten tun- * ;\ nistusaluetta IgA-proteaasille.
i · t
Iti 1 » » » '' 35 Aloittaja 3A: » 5' AAGCTTGTCGACCCACGTCCACCAGCACCTACTTCAAGTTCTACAAAG 3' I 1 1 f · f * · t t
Aloittaja 3B: 5' TTCGTTGGATCCTCAAGTTAGTGTTGAGATGATGCTTT 3' 32 1 0 9 8 1 0
Saatu PCR-fragmentti leikataan entsyymeillä Sal I ja Bam HI ja se voidaan liittää siten suoraan edellä kuvattuun vektori-DNA:han. Jatkomenettely tapahtuu kuten II 3 osalta on kuvattu. Edeltävässä esimerkissä kuvattiin, miten käyt-5 tämällä sopivasti IgA-proteaasitunnistuskohtaa ja muulla menetelmällä voidaan valmistaa metioniinittömiä terapeuttisia proteiineja, jotka alkavat aminohapposekvenssillä Ala Pro. Muut proteiinit, joita voidaan valmistaa analogisesti edellä kuvattujen esimerkkien mukaisesti metionivapaasti, 10 joskin käyttämällä oligonukleotideja, jotka sisältävät tun-nistusalueen IgA-proteaasille sekä alueen, joka vastaa analogisesti julkaistun sekvenssin 5'-, vast. 3'-päätä ja voidaan näin ollen valmistaa PCR-vahvistuksella. Seuraavassa annetaan muita terapeuttisesti relevantteja proteiineja, 15 jotka alkavat kypsässä luonnossa esiintyvässä muodossa Ala Pro:11a ja jotka voidaan valmistaa siten analogisella tavalla keksinnön mukaisella menetelmällä.
Katepsiini L (EC 3.4.22.15), Mason, R.W et ai. Biochem. J. 20 240, 373-377, 1986.
Erytropoietiini, Lai, P.H. et ai. J. Biol. Chem. 261, 3166-: ·’: 3121 , 1986.
25 Interleukiini-1 beeta, Zsebo, K.M. et ai. Blood 71 , 962-968, 1988.
• ·
Osteonektiini, Fisher, L.W. et ai. J. Biol. Chem. 262, ♦ * · 9702-9708, 1987.
30 • * · * "· Tyypin IV kollagenaasi, Collier I.E. et ai, J. Biol. Chem.
» t · V : 263, 6579-6587, 1988.
* * · ,···. Lisäksi tällä tavalla voidaan valmistaa proteiineja, jotka • ^ 35 alkavat kypsässä muodossa aminohapposekvenssillä Ser, Pro.
Esimerkkinä voidaan tällöin mainita:
Alfa-1 antitrypsiini, Hill, R.E. et ai., Nature 311, 175-177, 1984.
33 109810
Atriaalinen natriureettinen tekijä, Kambayashi, Y. et al., FEBS Lett. 259, 341-345, 1990.
Muut esimerkit proteiineista, jotka alkavat kypsässä 5 muodossa Thr Pro ja jotka voivat olla terapeuttisesti relevantteja, ovat esimeriksi:
Komplementtitekijä B, Campell, R.D. et ai., Proc. nat. Acad. Sei. 80, 4464-4468,1983.
10
Apolipoproteiini A, Eaton, D.L. et ai., Proc. Nat. Acad. Sei. 84, 3224-3228, 1987.
Seuraavaksi on annettu mainitun mikro-organismin talletus-15 tiedot.
• 1 · * 1 « .- . ., ... . . - 1./ 1 . u'.A ' ανΓγ>Γκ'*' ·ι·· '.· f r ·Ί von u;*u'»pcai. -"'N λλΛΊΛ
FjA OH 2KUXL VO'· PATENT V£R'"AHRf.N lUyö IU
34
INTERNATIONALES FORmBLATT
Γ n
Boehringer Mannheim GmbH empfangsbestätigung bei ersthinterlegung, ousgestellt oufgrund der Regel 7.1 von der
Postfach 120 unten ongeoebenen INTERNATIONALEN HINTER
LEGUNGSSTELLE
8132 Tutzing
L _J
!-'-
: I. KENNZEICHNUNG DES MIKROORGANIS^US
l___ • , > Vom HINTERLEGER zugeteiltes Bezugs- Von der INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGS- I zeichen: STELLE zugeteilte EINGANGSNIAMER: BMTU 2602 DSM 2102 II. WIS5ENSCHAFTLICHE BESCHREIBUNG UND/ODER VORGESCHLAGENE TAXONOMISCHE BEZEICHNUNG MIt dem unter I bezeichneten Mikroorgonismus wurde
□ eine wissenschofilicbe Beschreibung I
( -
| 0 eine vorgeschlogene toxonomische BezeicKnung I
! eingereicht j (Zutreffendes ankreuzen.) j- - : · :
III. "$INGANG UNO ANNAHME
·** __ · · _ _ _ _ _ ,! Diase «Internationale Hinterlegungsstelle nimmt den unter I bezeichneten Mikroorgonismus on, der ' j be? irtr on 01.10.1981 (OotiÄ) der Ersthinterlegung)^ eingeoongen ist.
' ' 1 · #* t ~ I-*r.l.____ j IV .'"INTERNATIONALE hinteruegungsstelle I Hottjii J DEUTSCHE SAJ-M.UNG Unterschrift (en) der zur Vertretung I ’. * · VON MIKROORGANISMEN der internotionolen Hinterlegungsstelle i , 'J·,,. , . , . . _ befugten Person (en) oder des (der) von ihr • \ D-3A00 Göttingen ermochUgten Bedzensteten: j ... Datum: 02.06.1982 IL· .CDi-uif I ' . . · * .
! L_f;··'.*--——- ^ Ure’Fill der Regel 6.A Buchstöbe d ist dies der Zeitponkt, zu dem der Stotus einer internotionolen Hinterlegungsstelle erworben vorden ist; vird eine ouBerholb des Budopester Vertrogs vorgenommene Hinterlegung noch dem Erwerb des Stotus einer Internotionolen Hinterlegungsstelle in eine Hinter-1 eoung oufgrund des Budopester Vertrogs uogevandelt, so 1st dies der Zeitpunkt, zu dem der Kikroor-gonismus bei der internotionolen Hinterlegungsstelle eingegangen ist.
Fonrölott D^_8?/A (einzige Seite) 1081
Claims (36)
1. Menetelmä fuusioitujen proteiinien entsymaattiseksi pilkkomiseksi ja näiden fuusioitujen proteiinien haluttujen 5 osien talteenottamiseksi, tunnettu siitä, että (1) modifioidaan geeniteknisillä keinoilla siirtymäalue, jossa fuusioidun proteiinin kaksi osaa ovat toisiinsa kytkeytyneenä, siten, että tälle siirtymäalueelle syntyy vähintään yksi IgA-proteaasitunnistuskohta, jossa on amino- 10 happosekvenssi Y-Pro ! X-Pro, jossa X voi olla mikä tahansa aminohappo ja Y voi olla mikä tahansa yksi tai useampi aminohappo , (2) vaiheesta (1) saatu fuusioitu proteiini pilkotaan IgA-proteaasilla ':11a merkityssä tunnistuskohdan asemassa, ja 15 (3) pilkkomisen jälkeen otetaan talteen fuusioidun proteii nin yksi tai useampi haluttu osa, jolloin fuusioitu proteiini ei sisällä sellaisia polypepti-diosia, joita koodaa IgA-proteaasiprekursorigeenin geeni-osa, joka käsittää luonnolliset IgA-proteaasitunnistuskoh-20 dat.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fuusioidun proteiinin siirtymäalueen modifiointi saavutetaan nukleotidisekvenssien rakentamisella, jotka 25 koodaavat IgA-proteaasitunnistuskohtaa tai sen osaa, jol- ; loin nukleotidisekvenssit rakennetaan yhden tai useamman ·’ DNA-kappaleen eteen tai/ja jälkeen, jotka koodaavat fuusi- » · oidun proteiinin haluttua osaa. » ·· 30
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnet- : tu siitä, että modifioidaan fuusioitu proteiini, jossa ei ole alunperin mitään luonnollista IgA-tunnistuskohtaa.
.··. 4. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetel- 35 mä, tunnettu siitä, että modifioidaan fuusioidun proteiini ϊ nin, joka sisältää halutun osan lisäksi yhden tai useampia ·,,,· kantajaosia, siirtymäalue. » i · »Il » · • · · 3« 109810
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fuusioidun proteiinin kantajaosa sisältää β-galak-tosidaasin osan.
6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu sii tä, että fuusioidun proteiinin kantajaosa sisältää useita varautuneita aminohappoja ja/tai yhden spesifiseen substanssiin suurella affiniteetilla sitoutuvan proteiinin tai polypeptidin. 10
7. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että X tarkoittaa Ser, Thr tai Ala.
8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu sii-15 tä, että X tarkoittaa Ser tai Thr.
9. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Y päättyy sekvenssiin Pro, Pro-Ala, Arg-Pro, Pro-Arg-Pro, Ala-Pro-Arg-Pro tai Pro-Ala-Pro-
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että IgA-proteaasitunnistuskohdassa on aminohapposekvenssi 25 (a) Pro-Ala-Pro !'Ser-Pro (b) Pro-Pro'! Ser-Pro (c) Pro-Arg-Pro-Pro ! Ala-Pro ,I ! (d) Pro-Pro'' 'Thr-Pro \ \ (e) Ala-Pro-Arg-Pro-Pro'! Thr-Pro tai • ’* 30 (f) Pro-Ala-Pro-Arg-Pro-Pro ! Thr-Pro • I » t · • »
11. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetel- : ‘J mä, tunnettu siitä, että » · ' ' (1) solu transformoidaan rekombinantti-DNA:11a tai rekombi- • » · . 35 nanttivektorilla, jolloin DNA, vastaavasti vektori, sisäl- • t * tää geenin, joka koodaa fuusioitua proteiinia, vähintään **;*’ yhden kopion, joka proteiini sisältää vähintään yhden IgA- : : : proteaasitunnistuskohdan siirtymäalueella, (2) transformoitu solu viljellään sopivassa väliaineessa, 37 109810 (3) fuusioitua proteiinia koodaava geeni saatetaan ilmentymään transformoidussa solussa, (4) fuusioitu proteiini pilkotaan IgA-proteaasilla ja (5) yksi tai useampi haluttu fuusioidun proteiinin osa 5 eristetään.
12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fuusioitu proteiini pilkotaan IgA-proteaasilla väliaineessa soluliuottamisen jälkeen ja/tai soluproteiini- 10 en erottamisen jälkeen.
13. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fuusioidun proteiinin pilkkomiseen käytetään IgA-proteaasia, joka on peräisin suvun Neisseria 15 patogeenisistä bakteerikannoista, erityisesti Neisseria go-norrhoeae ja Neisseria meningitidis, tai suvun Haemophilus kannoista, erityisesti Haemophilus influenzae ja Haemophilus aegypticus tai sen kaltaisesta IgA-proteaasista modifioimalla johdetusta proteiinista. 20
14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fuusioidun proteiinin pilkkomiseen käytetään IgA-proteaasia, joka on otettu talteen ylituottavasta, ei-patogeenisestä bakteerikannasta. 25
15. Patenttivaatimuksen 13 tai 14 mukainen menetelmä, tun- ··’ nettu siitä, että fuusioidun proteiinin pilkkomiseen käyte- tään IgA-proteaasia immobilisoidussa muodossa. * ,'·· 3 0
16. Jonkin patenttivaatimuksen 11-15 mukainen menetelmä, : : tunnettu siitä, että pilkotaan fuusioitu proteiini, joka on liukenevassa, liukenemattomassa, kalvoon assosioituneessa | tai soluun sitoutuneessa muodossa.
17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen menetelmä, tunnettu M *· siitä, että pilkotaan fuusioitunut proteiini, joka on liu- ·,,,· kenemattomana presipitaatiokappaleena. „ 109810 J O
18. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että rekombinanttiproteiinien, joissa ei ole N-terminaalista metioniinitähdettä, valmistamiseksi prokaryoottisista soluista pilkotaan IgA-proteaasilla fuu- 5 sioitu proteiini, jossa on sekvenssi Met-Y-Pro 1 X-Pro-A, jossa X tarkoittaa mitä tahansa aminohappoa ja Y tarkoittaa mitä tahansa yhtä tai useampaa aminohappoa ja A tarkoittaa mitä tahansa aminohapposekvenssiä, jolloin pilkontatuottee-na saadaan proteiini, vastaavasti peptidi, jossa on amino-10 happosekvenssi X-Pro-A.
19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fuusioidun proteiinin haluttu osa alkaa aminohapposekvenssillä X-Pro. 15
20. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että IgA-proteaasilla pilkkomisen jälkeen fuusioidun proteiinin haluttu osa käsitellään lisävaiheessa dipepti-dyyliaminopeptidaasilla ja tällä tavalla pilkotaan pois N- 20 terminaalinen sekvenssi X-Pro.
20 Arg-Pro.
21. Patenttivaatimuksen 20 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että N-terminaalisen sekvenssin X-Pro poispilkkomi-seen käytetään X-Pro-dipeptidyyliaminopeptidaasia. 25
22. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetel- ·' mä, tunnettu siitä, että X-Pro-A on ihmisen granulosyyt- - tipesäkettä stimuloiva tekijä (G-CFS)tai sen johdannainen. /·· 30
23. Patenttivaatimuksen 22 mukainen menetelmä, tunnettu : : : siitä, että X-Pro-A on prokaryooteista peräisin oleva re- kombinantti-G-CSF tai rekombinantti-G-CSF-johdannainen, jossa ei ole N-terminaalista metioniinitähdettä, ja että G-CSF tai G-CSF-johdannainen on oleellisesti vapaa prokaryoo-35 teista peräisin olevasta G-CSF:stä, jossa on N-terminaali-: · '· nen metioniinitähde. 39 1 0 9 8 1 0
24. Patenttivaatimuksen 23 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että G-CSF tai G-CSF-johdannainen on alle 0,1 % muiden proteiinien saastuttama.
25. Patenttivaatimuksen 23 tai 24 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että G-CSF tai G-CSF-johdannainen on alle 10"3 % muiden proteiinien saastuttama ja kvantitatiivisesti vapaa G-CSF:stä, jossa on N-terminaalinen metioniinitähde.
26. Fuusioitu proteiini, joka sisältää useita polypeptidi- osia, tunnettu siitä, että siinä on vähintään yhdellä, kunkin polypeptidiosan välissä olevalla siirtymäalueella yksi tai useampi geeniteknisillä keinoilla sisäänviety IgA-pro-teaasitunnistuskohta, jossa on aminohapposekvenssi Y-15 Pro 1 X-Pro, jolloin X tarkoittaa mitä tahansa aminohappoa, edullisesti Ser, Thr tai Ala, ja Y voi olla mikä tahansa yksi tai useampi aminohappo, jolloin fuusioitu proteiini ei sisällä sellaisia polypeptidiosia, joita koodaa IgA-prote-aasiprekursorigeenin geeniosa, joka käsittää luonnolliset 20 IgA-proteaasitunnistuskohdat.
27. Patenttivaatimuksen 26 mukainen fuusioitu proteiini, tunnettu siitä, että siinä on aminohapposekvenssi Met-Y-Pro ' X-Pro-A, jossa X:n ja Y:n merkitys on edellä annettu 25 ja A tarkoittaa mitä tahansa aminohapposekvenssiä.
28. Patenttivaatimuksen 26 tai 27 mukainen fuusioitu proteiini, tunnettu siitä, että Y sisältää päässään sekvenssin Pro, Pro-Ala, Pro-Arg-Pro, Ala-Pro-Arg-Pro tai Pro-Ala-Pro- .**: 3 0 Arg-Pro.
29. Jonkin patenttivaatimuksen 26-28 mukainen fuusioitu t proteiini, tunnettu siitä, että aminohapposekvenssi X-Pro-A .·'·. on ihmisen granulosyyttipesäkettä stimuloiva tekijä tai sen 35 johdannainen. > i
· : 30. Rekombinantti-DNA, tunnettu siitä, että se koodaa jon- : kin patenttivaatimuksen 2 6-2 9 mukaista fuusioitua proteii- . nia. 40 109810
31. Rekombinanttivektori, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 30 mukaisen rekombinantti-DNA:n yhden tai useamman kopion. 5
32. Patenttivaatimuksen 31 mukainen rekombinanttivektori, tunnettu siitä, että rekombinantti-DNA on indusoitavan il-mentymissignaalin ohjauksessa.
33. Patenttivaatimuksen 31 tai 32 mukainen rekombinantti vektori, tunnettu siitä, että se on prokaryoottivektori.
34. Jonkin patenttivaatimuksen 30-32 mukainen rekombinanttivektori, tunnettu siitä, että se on plasmidi. 15
35. Solu, tunnettu siitä, että se on transformoitu patenttivaatimuksen 30 mukaisella DNA:11a tai jonkin patenttivaatimuksen 31-34 mukaisella vektorilla.
35 1 0 9 8 1 0 Pat entt ivaat imukset
36. Patenttivaatimuksen 35 mukainen solu, tunnettu siitä, että se on prokaryoottinen solu.
Applications Claiming Priority (10)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4003149 | 1990-02-03 | ||
| DE4003149 | 1990-02-03 | ||
| DE4015922A DE4015922A1 (de) | 1990-05-17 | 1990-05-17 | Verfahren zur enzymatischen prozessierung von proteinen unter verwendung von iga-proteasen (igase) |
| DE4015922 | 1990-05-17 | ||
| DE4015921 | 1990-05-17 | ||
| DE4015921 | 1990-05-17 | ||
| DE4039415 | 1990-12-10 | ||
| DE4039415A DE4039415A1 (de) | 1990-02-03 | 1990-12-10 | Verfahren zur herstellung rekombinanter proteine ohne n-terminalen methioninrest |
| PCT/EP1991/000192 WO1991011520A1 (de) | 1990-02-03 | 1991-02-01 | VERFAHREN ZUR ENZYMATISCHEN SPALTUNG REKOMBINANTER PROTEINE UNTER VERWENDUNG VON IgA-PROTEASEN |
| EP9100192 | 1991-02-01 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI923463A FI923463A (fi) | 1992-07-31 |
| FI923463A0 FI923463A0 (fi) | 1992-07-31 |
| FI109810B true FI109810B (fi) | 2002-10-15 |
Family
ID=27434868
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI923463A FI109810B (fi) | 1990-02-03 | 1992-07-31 | Menetelmä rekombinanttiproteiinien entsymaattiseksi pilkkomiseksi käyttämällä IgA-proteaaseja |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5427927A (fi) |
| EP (2) | EP0602688B1 (fi) |
| JP (2) | JPH0789952B2 (fi) |
| KR (1) | KR960011919B1 (fi) |
| AT (2) | ATE124456T1 (fi) |
| AU (1) | AU638309B2 (fi) |
| CA (1) | CA2074943C (fi) |
| CZ (1) | CZ284774B6 (fi) |
| DK (1) | DK0513073T3 (fi) |
| ES (2) | ES2076521T3 (fi) |
| FI (1) | FI109810B (fi) |
| HU (1) | HU217103B (fi) |
| IE (1) | IE64938B1 (fi) |
| IL (1) | IL97119A0 (fi) |
| LV (1) | LV10309B (fi) |
| NO (1) | NO311142B1 (fi) |
| NZ (1) | NZ236819A (fi) |
| PT (1) | PT96658B (fi) |
| WO (1) | WO1991011520A1 (fi) |
Families Citing this family (42)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5718893A (en) * | 1984-04-15 | 1998-02-17 | Foster; Preston F. | Use of G-CSF to reduce acute rejection |
| DE4344350C2 (de) * | 1993-12-23 | 1995-09-21 | Max Planck Gesellschaft | Bakterien zur Herstellung stabiler Fusionsproteine und Verfahren zu deren Nachweis |
| US5536495A (en) * | 1994-04-15 | 1996-07-16 | Foster; Preston F. | Use of G-CSF to reduce acute rejection |
| AU3651595A (en) * | 1994-09-21 | 1996-04-09 | Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. | Drug for the prevention and treatment of auto-immune and viral diseases, and diagnostic agents for detecting said diseases |
| AT404838B (de) * | 1995-11-24 | 1999-03-25 | Immuno Ag | Herstellung von proteinen aus pro-proteinen durch fusionsproteine abgeleitet von furin oder furinanalogen |
| DE19549232C2 (de) * | 1995-12-20 | 1998-05-20 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verwendung von G-CSF in Kombination mit einem Chemotherapeutikum bei der Behandlung von Erkrankungen, die eine periphere Stammzelltransplantation erfordern |
| GB9618960D0 (en) | 1996-09-11 | 1996-10-23 | Medical Science Sys Inc | Proteases |
| US6444202B1 (en) | 1996-11-25 | 2002-09-03 | Bundesrepublic Deutschland, Vertreten Durch Den Bundesminister Fur Gesundheit | Processed polypeptides with IL-16 activity, processes for their production and their use |
| EP1121425B1 (en) * | 1998-10-13 | 2005-06-29 | The University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Stabilized bioactive peptides and methods of identification, synthesis and use |
| US20030190740A1 (en) * | 1998-10-13 | 2003-10-09 | The University Of Georgia Research Foundation, Inc | Stabilized bioactive peptides and methods of identification, synthesis, and use |
| KR100356140B1 (ko) * | 1999-07-08 | 2002-10-19 | 한미약품공업 주식회사 | 인간 과립구 콜로니 자극인자 변이체 및 이의 생산 방법 |
| US7332275B2 (en) * | 1999-10-13 | 2008-02-19 | Sequenom, Inc. | Methods for detecting methylated nucleotides |
| CA2507189C (en) * | 2002-11-27 | 2018-06-12 | Sequenom, Inc. | Fragmentation-based methods and systems for sequence variation detection and discovery |
| US8541200B2 (en) * | 2003-04-23 | 2013-09-24 | Hoffmann-La Roche Inc. | Cleavage of fusion proteins using Granzyme B protease |
| US20050009053A1 (en) * | 2003-04-25 | 2005-01-13 | Sebastian Boecker | Fragmentation-based methods and systems for de novo sequencing |
| US9394565B2 (en) * | 2003-09-05 | 2016-07-19 | Agena Bioscience, Inc. | Allele-specific sequence variation analysis |
| EP2267154A1 (en) | 2003-10-23 | 2010-12-29 | Illumigen Biosciences, Inc. | Oligoadenylate synthetase |
| US7220407B2 (en) | 2003-10-27 | 2007-05-22 | Amgen Inc. | G-CSF therapy as an adjunct to reperfusion therapy in the treatment of acute myocardial infarction |
| SI21639A (sl) * | 2003-12-23 | 2005-06-30 | LEK farmacevtska dru�ba d.d. | Farmacevtski pripravek, ki vsebuje nemicelarne sulfobetaine |
| WO2005098050A2 (en) * | 2004-03-26 | 2005-10-20 | Sequenom, Inc. | Base specific cleavage of methylation-specific amplification products in combination with mass analysis |
| US7608394B2 (en) | 2004-03-26 | 2009-10-27 | Sequenom, Inc. | Methods and compositions for phenotype identification based on nucleic acid methylation |
| US20060073501A1 (en) * | 2004-09-10 | 2006-04-06 | Van Den Boom Dirk J | Methods for long-range sequence analysis of nucleic acids |
| AU2005306894B2 (en) | 2004-11-05 | 2011-11-24 | Northwestern University | Use of SCF and G-CSF in the treatment of cerebral ischemia and neurological disorders |
| UA95446C2 (ru) | 2005-05-04 | 2011-08-10 | Іллюміджен Байосайєнсіз, Інк. | Мутаци в генах oas1 |
| CL2007002502A1 (es) * | 2006-08-31 | 2008-05-30 | Hoffmann La Roche | Variantes del factor de crecimiento similar a insulina-1 humano (igf-1) pegilados en lisina; metodo de produccion; proteina de fusion que la comprende; y su uso para tratar la enfermedad de alzheimer. |
| KR101106795B1 (ko) * | 2006-08-31 | 2012-01-18 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 인슐린-유사 성장 인자-ｉ의 제조 방법 |
| US20090006002A1 (en) * | 2007-04-13 | 2009-01-01 | Sequenom, Inc. | Comparative sequence analysis processes and systems |
| DE202007018629U1 (de) | 2007-08-27 | 2008-12-24 | Biogenerix Ag | Flüssigformulierung von G-CSF |
| EP2076243B9 (de) | 2007-08-27 | 2015-01-14 | ratiopharm GmbH | Flüssigformulierung von g-csf |
| US8501449B2 (en) * | 2007-12-04 | 2013-08-06 | Proteon Therapeutics, Inc. | Recombinant elastase proteins and methods of manufacturing and use thereof |
| CA2720478A1 (en) * | 2008-04-03 | 2009-10-08 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Pegylated insulin-like-growth-factor assay |
| MX2010010495A (es) * | 2008-04-03 | 2010-10-15 | Hoffmann La Roche | Uso de variantes del factor de crecimiento similar a la insulina (igf-i) pegiladas para el tratamiento de trastornos neuromusculares. |
| US8053222B2 (en) * | 2009-02-12 | 2011-11-08 | Academia Sinica, Taiwan | Protein expression system involving mutated severe respiratory syndrome-associated coronavirus 3C-like protease |
| US20110152188A1 (en) * | 2009-12-23 | 2011-06-23 | Hanns-Christian Mahler | Pharmaceutical compositions of igf/i proteins |
| HUE034398T2 (en) | 2010-01-19 | 2018-02-28 | Hanmi Science Co Ltd | Liquid preparations for sustained G-CSF conjugate |
| WO2012028523A2 (en) * | 2010-08-30 | 2012-03-08 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Prokaryotic expression construct |
| WO2014187974A1 (en) * | 2013-05-24 | 2014-11-27 | Novo Nordisk A/S | Fusion protease |
| EP3083977B1 (en) * | 2013-12-20 | 2018-02-28 | F. Hoffmann-La Roche AG | Improved recombinant polypeptide production methods |
| DK3313879T3 (da) | 2015-06-24 | 2022-03-14 | Hoffmann La Roche | Anti-transferrinreceptor-antistoffer med tilpasset affinitet |
| AR106189A1 (es) | 2015-10-02 | 2017-12-20 | Hoffmann La Roche | ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS CONTRA EL A-b HUMANO Y EL RECEPTOR DE TRANSFERRINA HUMANO Y MÉTODOS DE USO |
| CN114014936A (zh) | 2015-10-02 | 2022-02-08 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 双特异性抗人cd20/人转铁蛋白受体抗体及使用方法 |
| US10446928B2 (en) | 2017-06-09 | 2019-10-15 | Mitsubishi Electric Corporation | Phased array antenna |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL60184A (en) * | 1979-05-31 | 1984-05-31 | Schering Ag | Process for the specific cleavage of protein sequences from proteins |
| WO1986004605A1 (en) * | 1985-02-08 | 1986-08-14 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Human granulocyte colony stimulating factor |
| JPS62129298A (ja) * | 1985-12-02 | 1987-06-11 | Chugai Pharmaceut Co Ltd | 新規ポリペプチド |
| US5087564A (en) * | 1985-06-20 | 1992-02-11 | Monsanto Company | Release of recombinant peptides from polypeptides using V8 endopeptidase |
| ATE67517T1 (de) * | 1985-09-30 | 1991-10-15 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Menschlicher granulozyten-colony stimulierender faktor. |
| DE3545568A1 (de) * | 1985-12-21 | 1987-07-16 | Hoechst Ag | Gm-csf-protein, seine derivate, herstellung solcher proteine und ihre verwendung |
| FR2594846B1 (fr) * | 1986-02-21 | 1989-10-20 | Genetica | Procede de preparation de la serum albumine humaine mature |
| US4828988A (en) * | 1986-05-15 | 1989-05-09 | Smith Kline - Rit | Hybrid polypeptides comprising somatocrinine and alpha1 -antitrypsin, method for their production from bacterial clones and use thereof for the production of somatocrinine |
| DE3622221A1 (de) * | 1986-07-02 | 1988-01-14 | Max Planck Gesellschaft | Verfahren zur gentechnologischen gewinnung von proteinen unter verwendung gramnegativer wirtszellen |
| WO1988001297A1 (en) * | 1986-08-11 | 1988-02-25 | Cetus Corporation | Expression of g-csf and muteins thereof |
| IT1223577B (it) * | 1987-12-22 | 1990-09-19 | Eniricerche Spa | Procedimento migliorato per la preparazione dell'ormone della crescita umano naturale in forma pura |
| ATE111921T1 (de) * | 1988-06-03 | 1994-10-15 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Menschlicher kristallinischer granulocyt- koloniestimulierungsfaktor und dessen herstellung. |
| WO1990006370A1 (en) * | 1988-12-01 | 1990-06-14 | The Trustees Of The University Of North Carolina | Synthetic interleukin-6 |
| US5055555A (en) * | 1989-01-05 | 1991-10-08 | Helmut Sassenfeld | Purification of G-CSF |
| US5073627A (en) * | 1989-08-22 | 1991-12-17 | Immunex Corporation | Fusion proteins comprising GM-CSF and IL-3 |
-
1991
- 1991-01-18 NZ NZ236819A patent/NZ236819A/xx unknown
- 1991-01-31 IL IL97119A patent/IL97119A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1991-02-01 HU HU9202511A patent/HU217103B/hu unknown
- 1991-02-01 KR KR1019920701858A patent/KR960011919B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1991-02-01 US US07/917,034 patent/US5427927A/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-02-01 ES ES91902956T patent/ES2076521T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-02-01 AT AT91902956T patent/ATE124456T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-02-01 AT AT93121015T patent/ATE219518T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-02-01 WO PCT/EP1991/000192 patent/WO1991011520A1/de active IP Right Grant
- 1991-02-01 DK DK91902956.1T patent/DK0513073T3/da active
- 1991-02-01 CA CA002074943A patent/CA2074943C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-02-01 IE IE35891A patent/IE64938B1/en not_active IP Right Cessation
- 1991-02-01 EP EP93121015A patent/EP0602688B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-02-01 JP JP3503102A patent/JPH0789952B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1991-02-01 ES ES93121015T patent/ES2177536T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-02-01 PT PT96658A patent/PT96658B/pt not_active IP Right Cessation
- 1991-02-01 AU AU71496/91A patent/AU638309B2/en not_active Ceased
- 1991-02-01 CZ CS91241A patent/CZ284774B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1991-02-01 EP EP91902956A patent/EP0513073B1/de not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-07-30 NO NO19923010A patent/NO311142B1/no unknown
- 1992-07-31 FI FI923463A patent/FI109810B/fi active
-
1993
- 1993-09-24 LV LVP-93-1094A patent/LV10309B/lv unknown
-
1995
- 1995-01-04 JP JP7000120A patent/JP2766621B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI109810B (fi) | Menetelmä rekombinanttiproteiinien entsymaattiseksi pilkkomiseksi käyttämällä IgA-proteaaseja | |
| CA1338642C (en) | Bacterial methionine n-terminal peptidase | |
| JP2686090B2 (ja) | 新規融合蛋白質およびその精製方法 | |
| JPH08242881A (ja) | 部分的合成遺伝子の発現によるペプチドの製法 | |
| US5459051A (en) | Methods and vectors for over-expression of ubiquitin fusion proteins in host cells | |
| JP2018514231A (ja) | 増殖とタンパク質生成との分離 | |
| AU704594B2 (en) | Production of recombinant peptides as natural hydrophobic peptide analogues | |
| CN113025599B (zh) | 一种重组溶组织梭菌i型胶原酶及其制备方法和应用 | |
| AU636261B2 (en) | Recombinant iga protease | |
| RU2120475C1 (ru) | Способ получения представляющего интерес полипептида, гибридная днк (варианты), слитый белок (варианты) | |
| RU2108386C1 (ru) | Рекомбинантный гранулоцит-колониестимулирующий фактор (g - csf) без дополнительного остатка метионина на n-конце | |
| RU2453604C1 (ru) | Гибридный белок (варианты), штамм бактерий escherichia coli - продуцент гибридного белка (варианты) и способ получения безметионинового интерферона альфа-2 человека | |
| KR910001811B1 (ko) | 배지의 당분농도제어에 의한 외래유전자 발현제어방법 및 그에 따른 외래유전자 산물의 생산방법 | |
| RU2143492C1 (ru) | Рекомбинантная плазмида, кодирующая гибридный белок - предшественник инсулина человека (варианты), штамм бактерий e.coli - продуцент гибридного белка - предшественника инсулина человека (варианты), способ получения инсулина человека | |
| JPH01273591A (ja) | ヒト成長ホルモン分泌プラスミド、ならびにそれを用いた形質転換体および蛋白質分泌生産法 | |
| CA1200775A (en) | Expression linkers | |
| JPH0695940B2 (ja) | 枯草菌およびその形成方法 | |
| JPS62163691A (ja) | ヒト成長ホルモンの生産法 | |
| Ma | Expression and purification of alpha-human atrial natriuretic peptide in Escherichia coli by fusion with Erwinia chrysanthemi L-asparaginase | |
| JPH0588110B2 (fi) | ||
| KR19980075705A (ko) | 헤리코박터 피로리의 항원단백질 UreB를 발현하는 재조합 미생물 |