KR19980075705A - 헤리코박터 피로리의 항원단백질 UreB를 발현하는 재조합 미생물 - Google Patents

헤리코박터 피로리의 항원단백질 UreB를 발현하는 재조합 미생물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 헤리코박터 피로리(Helicobacter pylori)의 항원단백질 UreB(urease B subunit) 유전자와 비브리오 코레라이(Vibrio cholerae) 균의 톡신 유전자(toxin gene) 중 A2/B 서브유니트 유전자가 연결된 융합 유전자를 포함하는 발현벡터, 그로 형질전환된 재조합 미생물 및 전기 발현벡터를 이용하여 헤리코박터 피로리의 UreB와 비브리오 코레라이 톡신의 A2/B 서브유니트가 융합된 키메라 단백질(chimeric protein)을 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 재조합 DNA는 그의 발현과 유전자 조작이 용이하도록 인위적으로 설계되었고, 아울러 헤리코박터 피로리에 대한 우수한 면역원성을 나타내며, 위내의 환경에 안정하고, 위점막을 쉽게 투과하여 분비성 면역글로불린(sIgA)의 생성을 촉진시킬 수 있는 단백질을 제공하는 유전자의 조합으로 이루어졌기 때문에 산업적 유용성을 극대화시킬 수 있다. 따라서, 이와 같은 재조합 DNA로부터 발현된 키메라 단백질은 헤리코박터 피로리에 대한 진단시약 혹은 헤리코박터 피로리 관련 질환의 예방 또는 치료용 백신의 제조에 유효성분으로서 이용될 수 있고, 헤리코박터 피로리에 대한 항체 생성에도 이용될 수 있을 것이다.

Description

헤리코박터 피로리 항원단백질 UreB를 발현하는 재조합 미생물
본 발명은 헤리코박터 피로리(Helicobacter pylori)의 항원단백질 UreB(urease B subunit)를 발현하는 재조합 DNA 및 전기 재조합 DNA로 형질전환된 재조합 미생물에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 헤리코박터 피로리 균의 항원결정기를 코딩하는 UreB 유전자와 비브리오 코레라이(Vibrio cholerae) 균의 톡신 유전자(toxin gene) 중 A2/B 서브유니트 유전자가 연결된 융합 유전자를 포함하는 발현벡터, 그로 형질전환된 재조합 미생물 및 전기 발현벡터를 이용하여 헤리코박터 피로리의 UreB와 비브리오 코레라이 톡신의 A2/B 서브유니트가 융합된 키메라 단백질(chimeric protein)을 제조하는 방법에 관한 것이다.
위염 및 위십이지장궤양을 포함한 위염관련 질병은 흡연, 스트레스 등 여러가지 원인에 의하여 유발될 수 있지만, 위표피의 점액층, 점액 분비성 표피세포의 세포내 경계부와 십이지장과 같은 장내 변형성 표피조직에 서식하는 미호기성 그람음성의 간상균인 헤리코박터 피로리에 의해서 주로 야기된다(참조:Marshall, B.J., J. Infect. Dis., 153:650-657(1986); Maaroos, H.I. et al., Scand. J. Gastroenterol., 26(suppl. 186):65-72(1991); Walsh, J.H. and Peterson, W.I., N. Engl. J. Med., 333(15):984-991(1995); Tytgat, G.N.J., Scand. J. Gastroenterol., 31(suppl.215):70-73(1996)). 지역적인 차이는 있으나 아시아인의 90% 이상, 유럽인의 60% 이상이 헤리코박터 피로리 균에 감염되어 있으며, 개발도상국과 백인외의 인종에게서 감염율이 높은 것으로 알려져 있다(참조:Ateshkali A. et al., Clin. Pharm., 12:34-48(1993); Tompkins L.S. and Falkow S., Science, 267:1621-1622(1995); Sanders S.W., Clin. Ther., 18(1):2-34(1996)). 또한, 위염 및 위십이지장궤양은 화학요법제에 의한 치료 후에도 약물에 대하여 내성을 가지는 헤리코박터 피로리 균에 의하여 재발되며(참조:Coghlan, J.G. et al. Lancet, 2:1109-1111(1987); Tatsuta, M. et al., Gut., 31:973-976(1990); Graham, D.Y. et al., Ann. Intern. Med., 116:705-708(1992)), 결국 여러해 지나 위암으로 진행되는 것으로 알려져 있다(참조:Tsujii, M. et al., Cancer Lett., 65:15-18(1992); Parsonnet, J. et al., N. Engl. J. Med., 325:1127-1131(1991); The Eurogfgast Study Group., Lancet, 341:1359-1362(1993); Forman, D. et al., Brit. Med. J., 302:1302-1305(1991)).
이와 같이 헤리코박터 피로리 균에 의해 유발되는 위염 관련 질병을 치료하기 위해서, 종래에는 항생제 또는 항궤양제를 포함한 여러가지 화학요법제 등을 사용하여 왔으나, 이들 약물은 위점막의 투과에 한계가 있었고, 내성균의 현저한 증가, 감염 재발, 약물 부작용 등을 일으키는 문제점이 있었다.
따라서, 헤리코박터 피로리 균을 화학요법이 아닌 면역요법 등으로 제거할 수 있는 신규한 약물의 개발이 절실히 요구되었다. 그리하여, 최근에는 상기 문제점들을 해결하고자 헤리코박터 피로리 균에 대한 백신(vaccine) 개발이 시도되고 있다. 즉, 지금까지 밝혀진 헤리코박터 피로리의 항원결정기를 코딩하는 유전자인 우레아제(urease)(참조:Labigne, A. et al., J. Bacteriol., 173:1920-1931(1991)), CagA(cytotoxin-associated gene A)(참조:Covaccin, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90:5791-5795(1993)), 플라겔라(flagella)(참조:Leying, H. et al., Mol. Microb., 6(19):2863-2874(1992)), 어드헤신(adhesin)(참조:Evans, P.G. et al., Gene, 163:97-102(1995)), 슈퍼옥사이드디스뮤타제(superoxide dismutase)(참조:Spiegelhalder, C. et al., Infect. Immun., 61:5315-5325(1993)), 카탈라제(catalase)(참조:Hazell, S.L. et al., J. Gen. Microbiol., 137:57-61(1991)), 액포형성 사이토톡신(vacuolating cytotoxin)(참조:Telford, J.L. et al., J. Exp. Med., 179:1653-1658(1994)) 유전자 등을 이용한 헤리코박터 피로리 균주의 진단과 예방 백신 등이 개발되어 전임상 단계에 있는 백신도 있으나, 상업화에 여러가지 단점을 가지고 있기 때문에 아직까지는 제품화되지 못하고 있다. 예를 들면, 액포형성 사이토톡신 유전자를 이용한 백신은 이태리의 CiBa/Geigy사에 의해 개발되어 전임상 단계에 있는데, 면역원성이 뛰어나나, 사이토톡신 자체의 세포내 독성이 문제가 되며; 어드헤신 유전자를 이용한 백신은 미국의 Antex Biologics사에 의해 개발되어 임상 1상 단계에 있는데, 분비성 면역글로불린(secretory IgA:sIgA)의 생성을 활발히 촉진하지 못하여 백신으로서의 효능이 저하되고; CagA 유전자를 이용한 백신은 미국의 Oravax사에 의해 개발되어 전임상 단계에 있는데, 면역원성이 우수하나, 이 유전자가 모든 헤리코박터 피로리 균에 존재하는 것이 아니기 때문에, 모든 헤리코박터 피로리 균에 대하여 약효를 발휘할 수 없다는 단점을 가지고 있으며; 우레아제 유전자를 이용한 백신은 미국의 Oravax사에 의해 개발되어 임상 2상 단계에 있는데, 이 유전자가 모든 헤리코박터 피로리 균에 존재하므로 모든 헤리코박터 피로리 균에 대하여 약효를 발휘할 수 있다는 장점이 있으나, 면역원성이 약하다는 단점을 가지고 있다.
아울러, 헤리코박터 피로리 균은 위점막의 상피세포간 접합부에 서식하고 있기 때문에, 체액성 면역글로불린보다는 분비성 면역글로불린에 의하여 균이 제거되는데, 상기와 같은 백신은 위점막을 쉽게 투과하지 못하여 점액성 면역계(mucosal immune system)를 자극하지 못하므로, 분비성 면역글로불린(sIgA)의 생성을 촉진하는 기능이 저하되어, 헤리코박터 피로리 균에 대한 면역효과가 감소되고, 또한 위산(pH 1∼2)에 의하여 쉽게 변성되어 활성이 떨어진다는 심각한 문제점을 가지고 있었다.
이와 같이 헤리코박터 피로리 유전자를 단독으로 이용하여 개발된 백신은 전술한 여러가지 문제점을 가지고 있었기 때문에, 본 발명자들은 위점막을 쉽게 투과해서 점액성 면역계를 자극하여 분비성 면역글로불린(sIgA)의 생성을 유발시키는 기능을 가지는 단백질이 융합파트너로 결합된 키메라 단백질을 제조하여 이를 백신으로 이용하고자 하였다.
우선, 본 발명자들은 상기와 같은 기능을 나타내는 융합파트너의 탐색 도중에 비브리오 코레라이 톡신 유전자의 하기와 같은 특징에 주목하였다. 비브리오 코레라이 톡신 유전자는 A1, A2, B의 3가지 서브유니트로 구성되어 있는데(참조:Mekalanos, J.J. et al., Nature, 306:551-557(1983)), A1 서브유니트 유전자는 톡신 단백질의 독성을 나타내는 부분이며, A2 서브유니트 유전자는 5개의 B 서브유니트를 한 분자로 연결시켜 주는 부분이고, B 서브유니트는 숙주세포에 결합하여 sIgA 생성을 촉진시키고 주위 환경에 대한 단백질의 안정성을 증진시키는 부분이다. 또한, 코레라이 톡신 유전자 전체(intact cholera toxin)를 융합파트너로 이용한 각종 백신은 A1 서브유니트의 독성 때문에 사람에게 직접 사용하지 못하는 반면, 비브리오 코레라이 톡신 유전자중 A2/B 서브유니트를 이용하여 제조된 백신은 사람에게 사용될 수 있어 매우 유용하다. 이에, 비브리오 코레라이 A2/B 서브유니트를 융합파트너로 이용하여 제조한 백신에 대한 연구결과로서, 비브리오 코레라이 A2/B 서브유니트에 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)의 어드헤신 유전자를 결합시켜 키메라 단백질을 제조한 다음, 이를 경구용 백신으로 투여하면, 분비성 면역글로불린(sIgA) 및 체액성 면역글로불린(serum IgG)의 생성이 촉진될 뿐만 아니라, 6개월 이상 항체의 생성이 지속되는 것으로 보고되었다(참조:Hajishengallis, G., J. Immunol., 154:4322-4332(1995)).
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 최초로 헤리코박터 피로리의 항원결정기 코딩 유전자중 UreB 유전자와 비브리오 코레라이 톡신 유전자중 A2/B 서브유니트 유전자를 연결시킨 융합 DNA를 포함하는 재조합 발현벡터로부터 키메라 단백질이 성공적으로 발현됨을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다. 이렇게 발현된 키메라 단백질은 헤리코박터 피로리에 대한 우수한 면역원성을 나타내며, 위내의 환경에 안정하고, 위점막을 쉽게 투과하여 분비성 면역글로불린(sIgA)의 생성을 촉진시킴으로써, 전술한 종래 백신의 문제점을 해결하여 헤리코박터 피로리에 대한 효과적인 백신으로 이용될 수 있다.
결국, 본 발명의 첫번째 목적은 헤리코박터 피로리 균의 UreB 유전자와 비브리오 코레라이 균의 톡신 유전자중 A2/B 서브유니트 유전자를 연결시킨 융합 DNA의 염기서열 및 그로부터 번역되는 아미노산 서열을 제공하는 것이다.
본 발명의 두번째 목적은 전기 융합 DNA 서열을 포함하는 발현벡터 및 그로 형질전환된 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 세번째 목적은 전기 형질전환된 미생물로부터, 헤리코박터 피로리의 항원단백질 UreB와 비브리오 코레라이 톡신의 A2/B 서브유니트가 융합된 키메라 단백질을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
제1도는 헤리코박터 피로리의 UreB 유전자와 비브리오 코레라이 톡신(toxin)의 A2/B 서브유니트 유전자를 연결한 융합 유전자의 염기서열을 나타낸다.
제2도는 제1도에 기재된 융합 유전자의 염기서열로부터 번역되는 아미노산 서열을 나타낸다.
제3도는 헤리코박터 피로리 UreB의 발현벡터 pHU044을 구축하는 과정을 도식적으로 나타낸 그림이다.
제4도는 발현벡터 pHU044으로 형질전환된 대장균의 세포파쇄액을 12% SDS-PAGE한 결과를 나타내는 사진이다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.
헤리코박터 피로리에 대한 항체생산을 촉진하기 위하여, 면역원성이 우수한 헤리코박터 피로리 UreB의 유전자와, 항원의 안정성 및 점액성 면역반응을 촉진시키는 비브리오 코레라이 A2/B 서브유니트 유전자를 사용하여 키메라 단백질을 제조하고자 하였다. 즉, 헤리코박터 피로리 UreB 유전자와 비브리오 코레라이 톡신 유전자의 A2/B 서브유니트 유전자를 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction:PCR)으로 각각 제조한 다음, 각 단편 유전자를 제한효소 EcoRⅠ으로 절단하고, T4DNA 연결효소로 두 유전자를 결합시켰다. 이렇게 연결된 융합유전자를 적절한 제한효소로 절단하고, 단백질을 발현케 하는 프로모터를 갖는 플라스미드에 연결시켜 재조합 발현벡터를 제조하였다. 바람직하게는, 상기 융합 유전자를 제한효소 DsaⅠ 및 PstⅠ으로 절단하고, pTED 플라스미드에 삽입하여 발현벡터 pHU044을 제조하였다. 이 발현벡터로 대장균을 형질전환시키고 재조합 대장균을 배양한 다음, 헤리코박터 피로리의 UreB와 비브리오 코레라이 톡신의 A2/B 서브유니트가 융합된 키메라 단백질을 수득하였다.
본 발명의 아미노산 서열에 있어서, 기능적으로 동등한이란 키메라 단백질의 아미노산 서열 중에서 Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; 및, Phe, Tyr과 같은 조합으로 치환된 모든 단백질을 의미한다. 또한, 본 발명의 염기서열에 있어서, 기능적 등가물이라 함은 융합 유전자의 염기서열 중에서 전기조합의 아미노산을 제공할 수 있는 염기서열을 가지는 모든 유전자를 의미한다.
상기에서 제조된 키메라 단백질은 헤리코박터 피로리에 대한 진단시약 혹은 헤리코박터 피로리 관련 질환의 예방 또는 치료용 백신의 제조에 유효성분으로서 이용될 수 있고, 헤리코박터 피로리에 대한 항체 생성에도 이용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[실시예 1:헤리코박터 피로리의 염색체 DNA 분리]
헤리코박터 피로리 11637 RPH 13487(ATCC 43504)를 소혈청이 5% 첨가된 BHI(brain heart infusion) 액체배지(반코마이신(vancomycin) 10mg/ml, 트리메토프림(trimetofrim) 5mg/ml, 앰포테리신 비(amphotericin B) 4mg/ml로 구성된 배지)에 10% CO2배양기에서 72시간 배양한 다음, 통상적인 방법으로 염색체 DNA를 분리하였다.
[실시예 2:올리고뉴클레오티드의 합성, 정제 및 분석]
헤리코박터 피로리의 UreB 유전자 증폭(하기 실시예 3)에 사용되는 하기와 같은 37머(mer)와 30머(mer) 2개의 올리고뉴클레오티드를 합성하였다:
5'-CCGTGGATGAAAAAGATTAGCAGAAAAGAATATGCTT-3'
5'-AGAATTCTCACTTTATTGGCTGGTTTAGAG-3'
아울러, 비브리오 코레라이 톡신 유전자의 A2/B 서브유니트 유전자 증폭(하기 실시예 3)에 사용되는 하기와 같은 28머(mer)와 27머(mer) 2개의 올리고뉴클레오티드를 합성하였다:
5'-AGAATTCGAAGAGCCGTGGATTCATCAT-3'
5'-ACTGCAGCACATAATACGCACTAAGGA-3'
상기에서, 올리고뉴클레오티드는 자동화된 뉴클레오티드 합성기기(Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden)를 이용하여 합성하였다.
이렇게 합성된 각 올리고뉴클레오티드는 실리카에 부착된 채료 TTD(티오페놀/트리에틸아민/디옥산=1/2/2(v/v/v)) 용액과 반응시키고, 메탄올과 에탄올로 충분히 세척한 다음, 강 암모니아수를 처리하여 실리카 매트릭스로부터 합성 올리고뉴클레오티드를 분리시켰다. 이렇게 분리된 올리고뉴클레오티드 용액에 강 암모니아수를 추가로 가하여 50℃에서 12시간 반응시키고, 가스 제거와 함께 용액을 0.5ml가 될 때까지 감압농축시켰다. 이어, 농축된 올리고뉴클레오티드는 SEP-PAK 카트리지(Waters Inc., USA)를 이용하여 아세토니트릴/트리에틸아민 완충용액으로 일차 정제하고, 15% 폴리아크릴아마이드젤(TE-붕산, pH 8.3)을 이용하여 각각 전기영동하였다. 전기영동 후, 단파장 자외선으로 올리고뉴클레오티드의 위치를 확인하여 그 부위만을 절단하였다. 그런 다음, 절단한 젤 절편에서 올리고뉴클레오티드를 추출하고, 주사기에 연결시킨 SEP-PAK 카트리지를 이용하여 아세토니트릴/트리에틸아민 완충용액으로 염을 제거하여, 각 올리고뉴클레오티드를 정제하였다. 정제된 각각의 올리고뉴클레오티드는 T4폴리뉴클레오티드키나제(New England Biolabs, # 201S, USA)를 사용하여 r-「32P」-ATP로 표지하고, 막삼길버트 서열분석법(참조:Maxam, A.M. Gilbert, W., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74:560-564(1977))으로 각 올리고뉴클레오티드의 서열을 결정하였다.
[실시예 3:중합효소 연쇄반응(PCR)]
주형 DNA(10ng∼100ng), 10μl의 10×Taq 중합효소 완충용액(500mM KCl, 15mM MgCl2및 0.1%(v/v) 젤라틴을 함유한 10mM Tris-HCl, pH 8.3), 10μl의 dNTP's 혼합액(dGTP, dATP, dTTP, dCTP를 각각 1.25mM씩 함유), 프라이머(실시예 2에서 합성한 올리고뉴클레오티드) 2μg씩, 0.5μl의 Ampli Taq DNA 중합효소(Perkin Elmer Cetus, USA)를 혼합한 용액에 증류수를 가하여 총 부피가 100μl되게 하였다. 여기에 용액의 증발을 막기 위해, 50μl의 미네랄 오일을 첨가하였다. 이때, 헤리코박터 피로리의 UreB 유전자를 증폭시키고자 하는 경우에, 주형 DNA는 실시예 1에서 분리한 헤리코박터 피로리의 염색체 DNA이고, 프라이머는 실시예 2에서 합성한 37머와 30머의 올리고뉴클레오티드이며; 비브리오 코레라이 톡신 유전자의 A2/B 서브유니트 유전자를 증폭시키고자 하는 경우에, 주형 DNA는 비브리오 코레라이의 염색체 DNA이고, 프라이머는 실시예 2에서 합성한 28머와 27머의 올리고뉴클레오티드이다.
PCR 반응을 위하여, 온도순환기(Thermal Cycler, Cetus/Perkin-Elmer, USA)를 사용하여 변성(denaturation)(95℃, 1분), 결합(annealing)(55℃, 1분), 연장(extension)(72℃, 2분)을 30회(cycle) 진행시키고, 마지막으로 72℃에서 10분간 추가 반응시켰다. 그런 다음, 중합효소를 제거하기 위하여, 반응 혼합물에 동일 부피의 페놀/클로로포름 혼합용액(1:1(v/v))을 첨가하고 잘 혼합하여 원심분리하였다. 상층액을 새로운 튜브에 옮기고 1/10 부피의 3M 소다움아세테이트, 2배 부피의 100% 에탄올을 첨가하고 혼합한 다음, 원심분리하여 이중나선의 핵산을 얻었다. 이 핵산을 20μl의 TE 완충용액에 용해시키고 추후의 실험에 사용하였다.
[실시예 4:발현벡터 pHU044의 제조]
유전자의 융합을 위하여, 실시예 3에서 증폭한 헤리코박터 피로리 UreB 유전자와 비브리오 코레라이 톡신 유전자의 A2/B 서브유니트 유전자를 EcoRⅠ 제한효소로 각각 절단한 다음, DNA 1μg씩을 혼합하고, 10배 농도의 접합 농축액(10mM DTT 및 100mM MgCl2를 함유한 600mM Tris-HCl, pH 7.5) 3μl, 10mM ATP 1μl 및 T4DNA 연결효소(ligase) 10단위(unit)를 가하여 전체 반응부피를 30μl로 조정하고 14℃에서 16시간 반응시켰다. 반응물을 1% 아가로스 젤 전기영동하여 2.4kb 정도의 융합 유전자를 수득하고, 그의 염기서열을 결정하였다(참조:제1도). 제1도에서, 염기서열 1번부터 1679번까지는 UreB의 구조유전자에 해당하는 서열이고, 염기서열 1680번부터 1712번까지는 비브리오 코레라이 B 서브유니트의 신호 펩타이드에 해당하는 서열을 나타낸다. 제2도는 제1도 기재의 융합 DNA의 염기서열로부터 번역되는 아미노산 서열을 나타낸다.
상기에서 결정된 염기서열을 가지는 융합 유전자를 제한효소 DsaⅠ과 PstⅠ으로 이중절단 다음, 이를 전기 제한효소로 이중절단된 유전자 운반체 pTED에 삽입하여 환상의 플라스미드를 제조하였는데, 이를 pHU044라 명명하였다. 전기 플라스미드 pTED는 pTE105의 형질전환체인 대장균(Escherichia coli) JM101(DW/BT-2042)(KCCM 10027)로부터 분리한 pTE105에 DsaⅠ 제한효소 인식부위를 창출시킨 2.95kb의 플라스미드이다(참조:제3도). 제3도는 발현벡터 pHU044의 구축과정을 도식적으로 나타낸 그림이다.
아울러, 발현벡터 pHU044에 제한효소를 처리하고, 1% 아가로스 젤 전기영동하여 단일 제한효소 부위가 전기 발현벡터 pHU044에서 존재하는 것을 확인함으로써, 헤리코박터 피로리 UreB 유전자와 비브리오 코레라이 A2/B 서브유니트 유전자가 바르게 삽입되어 있는 것을 알 수 있었다.
[실시예 5:형질전환체의 제조]
발현벡터 pHU044를 숙주세포로 도입하기 위하여, 우선 대장균(E. coli) JM101 균주를 액체 LB배지에 접종하고, 650nm에서의 흡광도 수치가 0.25 내지 0.5에 도달할 때까지 37℃에서 배양한 다음, 세포를 수득하고 0.1M MgCl2을 가하여 세척하였다. 이어, 원심분리하여 침전물을 수득하고, 여기에 다시 0.1M CaCl2, 0.05M MgCl2용액과 실시예 4에서 제조한 발현벡터 pHU044를 첨가하여 얼음위에서 정치시켰다. 이들 세포를 다시 원심분리시켜 동일 용액에 균일하게 분산시켰다(참조:DNA Cloning Vol. I. A Practical Approach, IRL press, 1985). 상기에서 사용한 모든 용액 및 용기는 4℃에서 냉각시켜 사용하였다.
그런 다음, 테트라사이클린 12.5μg/ml을 함유한 액체 LB배지가 도포된 패트리디시에 상기에서 얻은 세포현탁액 0.2ml을 가하고 37℃에서 밤새 배양하여, pHU044를 함유하는 대장균 JM101 형질전환체를 수득하였다. 이 형질전환체를 대장균 DW/HU-044(Escherichia coli DW/HU-044)으로 명명하고, 1997년 3월 7일 국제기탁기관인 사단법인 한국종균협회 부설 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁번호 KFCC-10957로 기탁되었다.
[실시예 6:키메라 단백질의 발현]
형질전환체 대장균 DW/HU044을 하기 표 1의 발현배지 약 3ml에 접종하고, 37℃에서 250rpm으로 밤새 배양한 다음, 이 배양액 0.5ml를 하기 표 1의 발현배지 약 50ml에 다시 접종하고, 37℃에서 250rpm으로 진탕배양시켜 650nm에서의 흡광도 값이 1.8에서 2.0에 도달할 때까지 배양시켰다. 이어, 0.1M IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactoside) 0.25ml를 가하고, 37℃에서 250rpm으로 24시간 동안 배양시켜 재조합 단백질을 발현시킨 다음, 원심분리하여 세포를 수득하고, 완충용액(0.1% 트리톤(Triton) X-100, 2mM EDTA 및 1mM PMSF를 함유한 10mM 트리스-HCl, pH 8.0)에 현탁시키고 세포를 파쇄하여, 그 파쇄액을 12% SDS-PAGE하였다(참조:제4도).
[표 1:발현배지의 조성]
제4도에서, 제M레인은 분자량 크기 마커이고, 제1레인은 IPTG 유도 직전의 세포파쇄액을 전기영동한 결과이며, 제2레인은 IPTG 유도 후 24시간 배양한 세포의 파쇄액을 전기영동한 결과를 각각 나타내고; 위 화살표는 헤리코박터 피로리 UreB와 비브리오 코레라이 A2 서브유니트가 융합된 키메라 단백질의 위치, 아래 화살표는 비브리오 코레라이 B 서브유니트 단백질의 위치를 나타낸다. 제4도에서 보듯이, 형질전환체 대장균 DW/HU-044에서 키메라 단백질이 발현됨을 알 수 있었다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 헤리코박터 피로리의 UreB 유전자와 비브리오 코레라이 톡신 유전자중 A2/B 서브유니트 유전자의 융합 재조합 DNA는 그의 발현과 유전자 조작이 용이하도록 인위적으로 설계되었고, 아울러 헤리코박터 피로리에 대한 우수한 면역원성을 나타내며, 위내의 환경에 안정하고, 위점막을 쉽게 투과하여 분비성 면역글로불린(sIgA)의 생성을 촉진시킬 수 있는 단백질을 제공하는 유전자의 조합으로 이루어졌기 때문에 산업적 유용성을 극대화시킬 수 있다. 따라서, 이와 같은 재조합 DNA로부터 발현된 키메라 단백질은 헤리코박터 피로리에 대한 진단시약 혹은 헤리코박터 피로리 관련 질환의 예방 또는 치료용 백신의 제조에 유효성분으로서 이용될 수 있고, 헤리코박터 피로리에 대한 항체 생성에도 이용될 수 있을 것이다.

Claims (8)

  1. 헤리코박터 피로리(Helicobacter pylori)의 항원단백질 UreB(urease B subunit) 유전자와 비브리오 코레라이(Vibrio cholerae) 톡신 유전자의 A2/B 서브유니트(A2/B subunit) 유전자가 연결된, 하기와 같은 염기서열 또는 그의 기능적 등가물을 가지는 재조합 DNA:
  2. 제1항의 재조합 DNA로부터 번역되는 하기와 같은 아미노산 서열 또는 이와 기능적으로 동등한 아미노산 서열을 갖는, 헤리코박터 피로리의 UreB와 비브리오 코레라이 톡신의 A2/B 서브유니트가 융합된 키메라 단백질(chimeric protein):
  3. 제1항의 재조합 DNA를 포함하며, 헤리코박터 피로리의 UreB와 비브리오 코레라이 톡신의 A2/B 서브유니트가 융합된 키메라 단백질을 발현할 수 있는 재조합 발현벡터.
  4. 제1항의 재조합 DNA를 포함하며, 헤리코박터 피로리의 UreB와 비브리오 코레라이 톡신의 A2/B 서브유니트가 융합된 키메라 단백질을 발현할 수 있는 하기와 같은 유전자 지도를 갖는 재조합 발현벡터 pHU044:
    t5
  5. 제4항의 발현벡터 pHU044로 형질전환된 대장균 DW/HU-044(Escherichia coli DW/HU-044)(KFCC-10957).
  6. 제1항의 재조합 DNA로 형질전환된 숙주미생물을 배양하고, 헤리코박터 피로리의 UreB와 비브리오 코레라이 톡신의 A2/B 서브유니트가 융합된 키메라 단백질을 수득하는 공정을 포함하는 전기 키메라 단백질의 제조방법.
  7. 제6항에 있어서,
    형질전환된 숙주미생물은 대장균 DW/HU-044(Escherichia coli DW/HU-044)(KFCC-10957)인 것을 특징으로 하는
    키메라 단백질의 제조방법.
  8. 제1항의 재조합 DNA로 형질전환된 숙주미생물을 배양하고, 헤리코박터 피로리의 UreB와 비브리오 코레라이 톡신의 A2/B 서브유니트가 융합된 키메라 단백질을 수득하는 공정을 포함하는 방법에 의해 제조된 키메라 단백질.
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