JPS62163691A - ヒト成長ホルモンの生産法 - Google Patents
ヒト成長ホルモンの生産法Info
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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- C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
-
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- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
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-
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- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
れた蛋白質の分泌に関与する領域を含むＤＮＡ塩基配列
の下流に、ヒト成長ホルモンをコードする遺伝子を含む
ＤＮＡ塩基配列を結合させたＤＮＡ塩基配列が、バチル
ス属細菌で複製可能なプラスミドに由来するＤＮＡに結
合していることを特徴とする組み換え体ＤＮＡ分子に関
するものである。
の下流に、ヒト成長ホルモンをコードする遺伝子を含む
ＤＮＡ塩基配列を結合させたＤＮＡ塩基配列が、バチル
ス属細菌で複製可能なプラスミドに由来するＤＮＡに結
合していることを特徴とする組み換え体ＤＮＡ分子に関
するものである。
本発明は、特に、組み換え体ＤＮＡ分子を用いて、パチ
ルス属細菌を形質転換し、得られた形質転換株を培養し
、その培養上清からヒト成長ホルモンを回収することを
特徴とするヒト成長ホルモンの生産法に関するものであ
る。
ルス属細菌を形質転換し、得られた形質転換株を培養し
、その培養上清からヒト成長ホルモンを回収することを
特徴とするヒト成長ホルモンの生産法に関するものであ
る。
以下本発明の詳細な説明する。
一般的に、動物の成長ホルモンは、脳下垂体好酸球性細
胞から分泌されるペプチドホルモンの一つである。ヒト
、ウシ、トリ、ヒツジなどの成長ホルモンは、いずれも
１９１個のアミノ酸残基より成り、分子量は、２２００
０である。これらの成長ホルモンのアミノ酸残基につい
ては、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタではほぼ等しいが、ヒ
トの場合は、これらと約５５％の差がある。成長ホルモ
ンの特徴は、ヒトに対してはヒトの成長ホルモンのみが
有効で、一般的に、系統発生的に上位の動物の成長ホル
モンは下位の動物に有効であるが、逆方向は、無効であ
る。ヒト成長ホルモンの生理活性としては、成長促進作
用の他、タンパク賀同化作用、脂質代謝作用糖代謝作用
などが知られている。
胞から分泌されるペプチドホルモンの一つである。ヒト
、ウシ、トリ、ヒツジなどの成長ホルモンは、いずれも
１９１個のアミノ酸残基より成り、分子量は、２２００
０である。これらの成長ホルモンのアミノ酸残基につい
ては、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタではほぼ等しいが、ヒ
トの場合は、これらと約５５％の差がある。成長ホルモ
ンの特徴は、ヒトに対してはヒトの成長ホルモンのみが
有効で、一般的に、系統発生的に上位の動物の成長ホル
モンは下位の動物に有効であるが、逆方向は、無効であ
る。ヒト成長ホルモンの生理活性としては、成長促進作
用の他、タンパク賀同化作用、脂質代謝作用糖代謝作用
などが知られている。
たとえは、逆子出産などが原因で成長ホルモンの分泌が
停止すると＃艮が著しく低い下垂体性小人症となる。こ
の場合、成長期にるる子供のうちに成長ホルモンを投与
して治療することにより、ほぼ正常の身長に到達するこ
とが可能である。しかしながら、現在のヒト成長ホルモ
ンの生産は、ヒト遺体の脳下垂体摘出によってなされて
いる。この方法では、ヒト成長ホルモンの生産法は極め
て低いことから、ヒト成長ホルモンの充分な供給が不可
能でるる。更に、遺体からのヒト成長ホルモン生産に伴
う大きな問題点としてウィルスの混入による投与患者の
死亡が指摘される（Ａｎｎａｌｓｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａ
ｌ Ｍｅｄｉｓｉｎｅ １０５（２） ２８Ｂ（１９８
５））に至り、遺体に依存しない新たなヒト成長ホルモ
ンの生産法の確立が熱望されることとなりた。遺体に依
存しない生産方法としてに、組み換えＤＮＡ利用技術の
応用が考えられる。しかしながら、現在時点において実
用化可能な遺伝子組み換えの方法に、宿主として通′シ
大腸菌を用いる。この場合は、大腸沼の菌体内にヒト成
長ホルモンが＃漬されるので、ヒト成長ホルモンの棺製
ニ非常に困雌となり、また、発ＰＡ物質の混入が避けら
れず大きな問題となっている。さらに、大腸菌で生産さ
れるヒト成長ホルモンは、天然型ヒト成畏ホルモンと異
なり、Ｎ−末端にメチオニンが付加しているメチオニル
舎ヒト成長ホルモンである。しかも、このメチオニル・
ヒト成長ホルモンは、患者に対する血中抗体産生レベル
を上昇させる点から、該メチオニン残基のないヒト成長
ホルモンの組み換えＤＮＡ利用技術を用いる生産法の確
立が望まれる。
停止すると＃艮が著しく低い下垂体性小人症となる。こ
の場合、成長期にるる子供のうちに成長ホルモンを投与
して治療することにより、ほぼ正常の身長に到達するこ
とが可能である。しかしながら、現在のヒト成長ホルモ
ンの生産は、ヒト遺体の脳下垂体摘出によってなされて
いる。この方法では、ヒト成長ホルモンの生産法は極め
て低いことから、ヒト成長ホルモンの充分な供給が不可
能でるる。更に、遺体からのヒト成長ホルモン生産に伴
う大きな問題点としてウィルスの混入による投与患者の
死亡が指摘される（Ａｎｎａｌｓｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａ
ｌ Ｍｅｄｉｓｉｎｅ １０５（２） ２８Ｂ（１９８
５））に至り、遺体に依存しない新たなヒト成長ホルモ
ンの生産法の確立が熱望されることとなりた。遺体に依
存しない生産方法としてに、組み換えＤＮＡ利用技術の
応用が考えられる。しかしながら、現在時点において実
用化可能な遺伝子組み換えの方法に、宿主として通′シ
大腸菌を用いる。この場合は、大腸沼の菌体内にヒト成
長ホルモンが＃漬されるので、ヒト成長ホルモンの棺製
ニ非常に困雌となり、また、発ＰＡ物質の混入が避けら
れず大きな問題となっている。さらに、大腸菌で生産さ
れるヒト成長ホルモンは、天然型ヒト成畏ホルモンと異
なり、Ｎ−末端にメチオニンが付加しているメチオニル
舎ヒト成長ホルモンである。しかも、このメチオニル・
ヒト成長ホルモンは、患者に対する血中抗体産生レベル
を上昇させる点から、該メチオニン残基のないヒト成長
ホルモンの組み換えＤＮＡ利用技術を用いる生産法の確
立が望まれる。
この点に鑑み本発明者は、バチルス属細菌でのヒト成長
ホルモンの分泌生産に着目した。バチルス属細菌は、優
れ友゛ゲ全性と多量の蛋白質を歯体外へ分泌する能力を
有しており、古来納豆の製造にも用いられ、１念、酵素
、アミノ酸、抗生物質等の生産用工業微生物としての使
用経験も長い（Ｄｅｂａｎｏｖ、 ’ Ｔｉｍｅ Ｍｏ
１ｅｃｕａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅＢａｃｉ
ｌｌｉ ’ １３２２． （１９８２） Ａｃａｄｅｍ
ｉｃ Ｐｒｅｓｓ）点から安全性の高い優れ定宿主であ
ると考えられるものである。
ホルモンの分泌生産に着目した。バチルス属細菌は、優
れ友゛ゲ全性と多量の蛋白質を歯体外へ分泌する能力を
有しており、古来納豆の製造にも用いられ、１念、酵素
、アミノ酸、抗生物質等の生産用工業微生物としての使
用経験も長い（Ｄｅｂａｎｏｖ、 ’ Ｔｉｍｅ Ｍｏ
１ｅｃｕａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅＢａｃｉ
ｌｌｉ ’ １３２２． （１９８２） Ａｃａｄｅｍ
ｉｃ Ｐｒｅｓｓ）点から安全性の高い優れ定宿主であ
ると考えられるものである。
また、発現の結果産生された蛋白質の菌体内から菌体外
への分泌には、通常シグナル配列と呼ばれるポリペプチ
ドが重要な働きをし、該シグナル配列は、菌体外に存在
する成熟蛋白質のＮ末端上流に結合しｔ形で合成され、
分泌の際の細胞膜通過の過程で除かれることが知られて
いる（ ｎ、ＨＩｏｂｅ−１、：Ｊ、Ｃｅ１１．Ｂ１０
１．６７、 （１９７５））。即ち、一般に分泌蛋白質
は、菌体内でその成熟蛋白質のＮ−末端上流ポリペプチ
ドが付加した形の前駆体として合成され、分が時に成熟
蛋白質のＮ−末端上流に存在するポリペプチド（一般に
シグナルポリペプチドと呼ばれる）がプロセスされる訳
である。この点から、バチルスｍａｆｌｉを宿主として
、バチルス楕細菌により多量に分泌される蛋白質の前駆
体における成熟蛋白質のＮ−末端上流に存在するポリペ
プチドをヒト成長ホルモンのＮ−末端上流に結合した形
の融合蛋白質を菌体内で発現させると、該ポリペプチド
の１＃きで融合蛋白質は、菌体内から菌体外へ移動し、
細胞膜通過の際に該ポリペプチドが除かれる。即ち、こ
のことによりメチオニル・ヒト成長ホルモンでないヒト
成長ホルモンの分泌生産が可能となる。菌体外に分泌さ
れたヒト成長ホルモンは、菌体内に蓄積され之場合と異
な９、精製が容易で、しかも、異物混入の恐れを顕著に
減少出来る。ま念、菌体あ友りの生産性も増加させるこ
とができる。これらのことから、バチルス属細菌ヲ宿主
としてヒト成長ホルモンを分泌生産させることは、安全
性と工業生産性の観点から、大きな意義を有するもので
ある。
への分泌には、通常シグナル配列と呼ばれるポリペプチ
ドが重要な働きをし、該シグナル配列は、菌体外に存在
する成熟蛋白質のＮ末端上流に結合しｔ形で合成され、
分泌の際の細胞膜通過の過程で除かれることが知られて
いる（ ｎ、ＨＩｏｂｅ−１、：Ｊ、Ｃｅ１１．Ｂ１０
１．６７、 （１９７５））。即ち、一般に分泌蛋白質
は、菌体内でその成熟蛋白質のＮ−末端上流ポリペプチ
ドが付加した形の前駆体として合成され、分が時に成熟
蛋白質のＮ−末端上流に存在するポリペプチド（一般に
シグナルポリペプチドと呼ばれる）がプロセスされる訳
である。この点から、バチルスｍａｆｌｉを宿主として
、バチルス楕細菌により多量に分泌される蛋白質の前駆
体における成熟蛋白質のＮ−末端上流に存在するポリペ
プチドをヒト成長ホルモンのＮ−末端上流に結合した形
の融合蛋白質を菌体内で発現させると、該ポリペプチド
の１＃きで融合蛋白質は、菌体内から菌体外へ移動し、
細胞膜通過の際に該ポリペプチドが除かれる。即ち、こ
のことによりメチオニル・ヒト成長ホルモンでないヒト
成長ホルモンの分泌生産が可能となる。菌体外に分泌さ
れたヒト成長ホルモンは、菌体内に蓄積され之場合と異
な９、精製が容易で、しかも、異物混入の恐れを顕著に
減少出来る。ま念、菌体あ友りの生産性も増加させるこ
とができる。これらのことから、バチルス属細菌ヲ宿主
としてヒト成長ホルモンを分泌生産させることは、安全
性と工業生産性の観点から、大きな意義を有するもので
ある。
本発明者らはバチルス属細菌によるヒト成長ホルモンの
分泌生産法を確立するため、検討を重ね友Ｍｌｋ、バチ
ルス・アミロリキファシエンスの中性プロテアーゼの遺
伝子の発現およびその結果産生された中性プロテアーゼ
の分泌に関与する′領域を含むＤＮＡ塩基配列の下流に
、ヒト成長ホルモンをコードする遺伝子を含むＤＮＡ塩
基配列を結合させ７’ｊＤＮＡ塩基配列が、バチルス属
細菌で複製可能なプラスミド、！ｆｃｔ’！、それに由
来するＤＮＡ塩基配列に結合していることを特徴とする
組み換え体ＤＮＡ分子を創製し、該組み換え体ＤＮＡ分
子を用いて形質転換しｔバチルス属細＠を用いて、ヒト
成長ホルモンを多量に菌体外に分泌せしめることに成功
し本発明を完成し友。
分泌生産法を確立するため、検討を重ね友Ｍｌｋ、バチ
ルス・アミロリキファシエンスの中性プロテアーゼの遺
伝子の発現およびその結果産生された中性プロテアーゼ
の分泌に関与する′領域を含むＤＮＡ塩基配列の下流に
、ヒト成長ホルモンをコードする遺伝子を含むＤＮＡ塩
基配列を結合させ７’ｊＤＮＡ塩基配列が、バチルス属
細菌で複製可能なプラスミド、！ｆｃｔ’！、それに由
来するＤＮＡ塩基配列に結合していることを特徴とする
組み換え体ＤＮＡ分子を創製し、該組み換え体ＤＮＡ分
子を用いて形質転換しｔバチルス属細＠を用いて、ヒト
成長ホルモンを多量に菌体外に分泌せしめることに成功
し本発明を完成し友。
以下本発明を更に詳細に説明する。
本発明で言う遺伝子の発現に関与する領域とは、ＲＮＡ
ポリメラーゼが′＃ｇａｔ、結合する領域である−３５
および一１０領域を含むプロモーター領域、およびＲＮ
Ａポリメラーゼによシ合成され７念ｍＲＮＡがリボゾー
ムと結合する友めのＤＮＡ塩基配列をコードするりボゾ
ーム結合領域を含むものである。
ポリメラーゼが′＃ｇａｔ、結合する領域である−３５
および一１０領域を含むプロモーター領域、およびＲＮ
Ａポリメラーゼによシ合成され７念ｍＲＮＡがリボゾー
ムと結合する友めのＤＮＡ塩基配列をコードするりボゾ
ーム結合領域を含むものである。
これらの領域が遺伝子の発現にＴｆＬ喪な役割を呆几し
、これらの領域の構造は直接的に発現鼠に関係している
ことは今日広く知られている（ ＲＯ５ｅｎｂ−ｅｒｇ
、 Ｍ、、 Ｃｏｕｒｔ 、 Ｄ、 ： Ａｎｎ、Ｒｅ
ｖ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１３１９ （１９７９） ）
。
、これらの領域の構造は直接的に発現鼠に関係している
ことは今日広く知られている（ ＲＯ５ｅｎｂ−ｅｒｇ
、 Ｍ、、 Ｃｏｕｒｔ 、 Ｄ、 ： Ａｎｎ、Ｒｅ
ｖ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１３１９ （１９７９） ）
。
バチルス属細菌を宿主菌として所望の蛋白質の遺伝子を
発現させる場合は、バチルス！ＦＡ細菌のＲＮＡポリメ
ラーゼおよびリボゾームが、プロモーター領域およびリ
ボゾーム結合領域の認識に関して厳格な特異性をもつた
め（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｐ、Ｍｏｒａｎ：ｆｒ 、、らＭ
ｏｌ、 Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｎｔ、、 １８６５５９（
１９８２） ）それらの領域が、バチルス属由来のもの
でるることが望ましい（ｏｏｌｄｆａｒｂ、Ｄ、８．、
らＮａｔｕｒｅ２．９５．５０９（１９８１） ）。
発現させる場合は、バチルス！ＦＡ細菌のＲＮＡポリメ
ラーゼおよびリボゾームが、プロモーター領域およびリ
ボゾーム結合領域の認識に関して厳格な特異性をもつた
め（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｐ、Ｍｏｒａｎ：ｆｒ 、、らＭ
ｏｌ、 Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｎｔ、、 １８６５５９（
１９８２） ）それらの領域が、バチルス属由来のもの
でるることが望ましい（ｏｏｌｄｆａｒｂ、Ｄ、８．、
らＮａｔｕｒｅ２．９５．５０９（１９８１） ）。
また、発現の結果産生された蛋白質の菌体内から菌体外
への分泌に関与する領域については、菌体外に存在する
成熟蛋白質の上流部分に存在するポリペプチドをコード
するＤＮＡ塩基配列が重要なことがよく知られており、
該ポリペプチドは、菌体内で成Ｊ！！１ｍ白のアミノ末
端上流に結合しｔ形で合成され、分泌の際に細胞膜通過
において重要な役割を果友すことが明らかになりている
（Ｇ。
への分泌に関与する領域については、菌体外に存在する
成熟蛋白質の上流部分に存在するポリペプチドをコード
するＤＮＡ塩基配列が重要なことがよく知られており、
該ポリペプチドは、菌体内で成Ｊ！！１ｍ白のアミノ末
端上流に結合しｔ形で合成され、分泌の際に細胞膜通過
において重要な役割を果友すことが明らかになりている
（Ｇ。
Ｂｌｏｂｅｌ、 Ｊ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、６７、８３
５（１９７５） ）。
５（１９７５） ）。
実用上の観点からは、遺伝子の発現およびその結果産生
され蛋白質の分泌に関与する領域を含むＤＮＡ塩基配列
の下流に、異種遺伝子をコードするＤＮＡ塩基配列を含
むＤＮＡ塩基配列１に結合させることが可能で、しかも
バチルス属Ｍｊｉｍで複製可能な組み換え体ＤＮＡ分子
ｔ−ｊｉｌＪ製する場合は、高発現および大量分泌生産
という点で菌体外に短時間のうちに多量に分泌生産され
る駒体外酵素遺伝子を用いることが非常に重要である。
され蛋白質の分泌に関与する領域を含むＤＮＡ塩基配列
の下流に、異種遺伝子をコードするＤＮＡ塩基配列を含
むＤＮＡ塩基配列１に結合させることが可能で、しかも
バチルス属Ｍｊｉｍで複製可能な組み換え体ＤＮＡ分子
ｔ−ｊｉｌＪ製する場合は、高発現および大量分泌生産
という点で菌体外に短時間のうちに多量に分泌生産され
る駒体外酵素遺伝子を用いることが非常に重要である。
そのような酵素としては、鉋体外プロテアーゼ、α−ア
ミラーゼ、レバンシェークラーゼ等が知られておりそれ
らのいずれの酵素の遺伝子も該組み換え体ＤＮＡ分子の
構築に用いられるが、本発明者らは先に述べ定ような観
点から、特にバチルス・アミロリキファシエンスの中性
プロテアーゼが該細菌で短時間の間に多量に分泌される
蛋白質であることに注目し、該中性プロテアーゼ遺伝子
をバチルス・ズブチリスを宿主菌としてクローン化しく
ＭＴ−ｏ１５０（Ｐ朧−ＢＰ−４２５） ）、そのＤＮ
Ａ塩基配列をすでに決定し、該中性プロテアーゼ遺伝子
の発現に関与するブロモ−ター領域および発現し之蛋白
質の分泌に関与する領域を含む、中性プロテアーゼ遺伝
子の全ＤＮＡｊ１塩基配列を明らかにしｔ（特願昭５９
−１７５１５８ ）。その結果、該中性プロテアーゼ遺
伝子には、分泌され友中性プロテアーゼをコードするＤ
ＮＡ塩基配列の上流に６６３ ｍ基対からなるオープン
・リーディング・フレームが存在していることを見出し
之（Ｈ４ｈｉｍａｄａ、ら、 ：ｒ、Ｂｉｏｔ−ｅｃｈ
ｎｏｌ、２７５ （１９８５） ）。このことより、
該中性プロテアーゼ遺伝子にハ、菌体外中性プロテアー
ゼをコードするＤＮＡ塩基配列の上流に２２１アミノ酸
からなるプレプロペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列
が存在することが明らかになった。
ミラーゼ、レバンシェークラーゼ等が知られておりそれ
らのいずれの酵素の遺伝子も該組み換え体ＤＮＡ分子の
構築に用いられるが、本発明者らは先に述べ定ような観
点から、特にバチルス・アミロリキファシエンスの中性
プロテアーゼが該細菌で短時間の間に多量に分泌される
蛋白質であることに注目し、該中性プロテアーゼ遺伝子
をバチルス・ズブチリスを宿主菌としてクローン化しく
ＭＴ−ｏ１５０（Ｐ朧−ＢＰ−４２５） ）、そのＤＮ
Ａ塩基配列をすでに決定し、該中性プロテアーゼ遺伝子
の発現に関与するブロモ−ター領域および発現し之蛋白
質の分泌に関与する領域を含む、中性プロテアーゼ遺伝
子の全ＤＮＡｊ１塩基配列を明らかにしｔ（特願昭５９
−１７５１５８ ）。その結果、該中性プロテアーゼ遺
伝子には、分泌され友中性プロテアーゼをコードするＤ
ＮＡ塩基配列の上流に６６３ ｍ基対からなるオープン
・リーディング・フレームが存在していることを見出し
之（Ｈ４ｈｉｍａｄａ、ら、 ：ｒ、Ｂｉｏｔ−ｅｃｈ
ｎｏｌ、２７５ （１９８５） ）。このことより、
該中性プロテアーゼ遺伝子にハ、菌体外中性プロテアー
ゼをコードするＤＮＡ塩基配列の上流に２２１アミノ酸
からなるプレプロペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列
が存在することが明らかになった。
該中性プロテアーゼハ、菌体内ではプレプロペプチドを
結合した形の前駆体として、合成される。
結合した形の前駆体として、合成される。
しかしながら、菌体外に分泌され友中性プロテアーゼに
は、このプレプロペプチドが存在していない。このこと
は、このプレプロペプチドが、中性プロテアーゼの分泌
の際に除去されるものでるり、また、該中性プロテアー
ゼの分泌において′Ｍ要な役割を果たしていると考えら
れる。即ち、従来知られている菌体外酵素の前駆体蛋白
質のＮ−末端に存在するベグチド扛、２０アミノ酸から
４０アミノ酸からなるものでめる（ Ｐｅｒｌｍａｎ、
Ｄ、Ｊ、。
は、このプレプロペプチドが存在していない。このこと
は、このプレプロペプチドが、中性プロテアーゼの分泌
の際に除去されるものでるり、また、該中性プロテアー
ゼの分泌において′Ｍ要な役割を果たしていると考えら
れる。即ち、従来知られている菌体外酵素の前駆体蛋白
質のＮ−末端に存在するベグチド扛、２０アミノ酸から
４０アミノ酸からなるものでめる（ Ｐｅｒｌｍａｎ、
Ｄ、Ｊ、。
Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、６７、３９１（１９８３） ）。
しかし、これらは、該中性プロテアーゼのプレプロペプ
チドに比べ著しく小さい。然も、これらのペプチドを有
する菌体外酵素の分泌効率は、バチルス・アミロリキフ
ァシエンスの中性プロテアーゼに比べて低いものでるる
。これらのことから、該中性プロテアーゼ遺伝子の発現
に関与する領域と該中性プロテアーゼのプレプロペプチ
ドは、この中性プロテアーゼの高発現・多量分泌という
性質に大きな影響を与えていると考えられる。そこで、
本発明者らは、従来知られている菌体外酵素の前駆体の
Ｎ −末端に存在するペプチドとこの中性プロテアーゼ
のプレプロペプチドの相違点に着目しプレプロペプチド
によりヒト成長ホルモンの分泌を可能ならしめる組み換
え体ＤＮＡ分子の創製を企図した。
チドに比べ著しく小さい。然も、これらのペプチドを有
する菌体外酵素の分泌効率は、バチルス・アミロリキフ
ァシエンスの中性プロテアーゼに比べて低いものでるる
。これらのことから、該中性プロテアーゼ遺伝子の発現
に関与する領域と該中性プロテアーゼのプレプロペプチ
ドは、この中性プロテアーゼの高発現・多量分泌という
性質に大きな影響を与えていると考えられる。そこで、
本発明者らは、従来知られている菌体外酵素の前駆体の
Ｎ −末端に存在するペプチドとこの中性プロテアーゼ
のプレプロペプチドの相違点に着目しプレプロペプチド
によりヒト成長ホルモンの分泌を可能ならしめる組み換
え体ＤＮＡ分子の創製を企図した。
即ち、中性プロテアーゼ遺伝子の発現に関与する領域お
よびプレプロペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列とか
らなるＤＮＡ塩基配列（第１図）の下流に、ヒト成長ホ
ルモンをコードするＤＮＡ塩基配列を結合することの可
能なバチルス属で複製可能な組み換え体ＤＮＡ分子ｐＥ
Ｓ１５０を作成した。
よびプレプロペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列とか
らなるＤＮＡ塩基配列（第１図）の下流に、ヒト成長ホ
ルモンをコードするＤＮＡ塩基配列を結合することの可
能なバチルス属で複製可能な組み換え体ＤＮＡ分子ｐＥ
Ｓ１５０を作成した。
次に、該組み換え体ＤＮＡ分子ｐＥＳ１５０に含、ｉ五
る第１図に示したＤＮＡ塩基配列の下流に日ヒト暖長ホ
ルモンをコードするＤＮＡ塩基配列を宜むＤＮＡ塩基配
列を結合させ念組み換え体Ｄ Ｎ Ａ”分、子ぜザーａ
ｐ、将 ｐＥｓｌ ５０−ＧＨ（ＭＴ−０１５５）を作成した。
る第１図に示したＤＮＡ塩基配列の下流に日ヒト暖長ホ
ルモンをコードするＤＮＡ塩基配列を宜むＤＮＡ塩基配
列を結合させ念組み換え体Ｄ Ｎ Ａ”分、子ぜザーａ
ｐ、将 ｐＥｓｌ ５０−ＧＨ（ＭＴ−０１５５）を作成した。
次に、該組み換え体ＤＮＡ分子ｐＫｓ１５０−ＧＨで形
質転換したバチルス属細菌によるヒト成長ホルモンの発
現・分泌に検討を加えた。その結果、本発明者らが期待
したように、該中性プロテアーゼ遺伝子の発現に関与す
る領域およびプレプロペプチドをコードするＤＮＡ塩基
配列とからなるＤＮＡ塩基配列を用いることにより、ヒ
ト成長ホルモン遺伝子を強力に発現させその結果産生さ
れたヒト成長ホルモンを培地中に極めて多量に分泌させ
うろことを見出し、本発明を完成した。分泌されたヒト
成長ホルモンの量は、培地１１、あたり５０■得られた
形質転換株によるヒト成長ホルモンの発現・分泌に検討
を加えた。その結果、驚くべきことに、本発明者らは、
該中性プロテアーゼの発現に関与するＤＮＡ塩基配列と
該プレプロペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列に成る
長さの欠失を設けたＤＮＡ塩基配列とからなるＤＮＡ塩
基配列（第２図）に、中性プロテアーゼ遺伝子の発現に
関与する領域およびプレプロペプチドをコードするＤＮ
Ａ塩基配列とからなるＤＮＡ塩基配列（第１図）と同程
度にヒト成長ホルモン遺伝子Ｋｌ” ’！力に発現はせ
その結果産生され之ヒト成長ホルモンを多量に培地中に
分泌させる能力、すなわち、培・地１１、めたり５０ｓ
９ものヒト成長ホルモンを分泌させる能力が存在してい
ることを発見した。
質転換したバチルス属細菌によるヒト成長ホルモンの発
現・分泌に検討を加えた。その結果、本発明者らが期待
したように、該中性プロテアーゼ遺伝子の発現に関与す
る領域およびプレプロペプチドをコードするＤＮＡ塩基
配列とからなるＤＮＡ塩基配列を用いることにより、ヒ
ト成長ホルモン遺伝子を強力に発現させその結果産生さ
れたヒト成長ホルモンを培地中に極めて多量に分泌させ
うろことを見出し、本発明を完成した。分泌されたヒト
成長ホルモンの量は、培地１１、あたり５０■得られた
形質転換株によるヒト成長ホルモンの発現・分泌に検討
を加えた。その結果、驚くべきことに、本発明者らは、
該中性プロテアーゼの発現に関与するＤＮＡ塩基配列と
該プレプロペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列に成る
長さの欠失を設けたＤＮＡ塩基配列とからなるＤＮＡ塩
基配列（第２図）に、中性プロテアーゼ遺伝子の発現に
関与する領域およびプレプロペプチドをコードするＤＮ
Ａ塩基配列とからなるＤＮＡ塩基配列（第１図）と同程
度にヒト成長ホルモン遺伝子Ｋｌ” ’！力に発現はせ
その結果産生され之ヒト成長ホルモンを多量に培地中に
分泌させる能力、すなわち、培・地１１、めたり５０ｓ
９ものヒト成長ホルモンを分泌させる能力が存在してい
ることを発見した。
本発明のｐＥＳ１５０及びｐＦｉｓａａ＠に含１れる′
＃１−図、第２図に示し７’？−ＤＮＡ塩基配列それぞ
れに′黴ト成長ホルモンを含むＤＮＡ塩基配列ｔ−結合
テｊせる方法に、種々考えられるが、ｐｌ！ｊ８１５０
及び、ｉΣ５１８４メにヒト成長ホルモンをコードする
ＤＮｈｔＥ基配列を含むＤＮＡ塩基配列を結合させるこ
とが、可能であればいかなる方法を用いることも可能で
ある。
＃１−図、第２図に示し７’？−ＤＮＡ塩基配列それぞ
れに′黴ト成長ホルモンを含むＤＮＡ塩基配列ｔ−結合
テｊせる方法に、種々考えられるが、ｐｌ！ｊ８１５０
及び、ｉΣ５１８４メにヒト成長ホルモンをコードする
ＤＮｈｔＥ基配列を含むＤＮＡ塩基配列を結合させるこ
とが、可能であればいかなる方法を用いることも可能で
ある。
また、本発明の組み換え体ＤＮＡ分子を構成するプラス
ミドとしては、バチルス属細菌でｖｌ製可能なものであ
ればいかなるものでも使用可能であるが、通常よく用い
られるものとしてはスタフィロコッカス由来のｐＵＢｌ
ｌｏ 、 ｐＴＰ５ 、 ｐＣ１９４。
ミドとしては、バチルス属細菌でｖｌ製可能なものであ
ればいかなるものでも使用可能であるが、通常よく用い
られるものとしてはスタフィロコッカス由来のｐＵＢｌ
ｌｏ 、 ｐＴＰ５ 、 ｐＣ１９４。
ｐＥ１９４．１）日Ａ［＋５１０ 、 ｐＢＤ６等およ
びその誘導体を挙げることができる。
びその誘導体を挙げることができる。
本発明者らは、本発明の組み換え体ＤＮＡ分子ｐ兇１５
０−ＧＨ及びｐｈＧＨ９２８を宿主菌となるバチルス川
細菌へ導入することにより、ヒト成長ホルモンをコード
する遺伝子を宿主菌で発現させその結果産生され友ヒト
成長ホル七ンを、該宿主鋼の培養液中に多量に分泌生産
させて、培養上清から簡単な工程で回収哨装することが
可能とならしめ九〇実際に、本発明組み換え体ＤＮＡ分
子ｐＥＳ１５０−ＧＨとｐｈＧＨ９２Ｂそれぞｆ′Ｌを
用いて、バチルス・ズブチリスで、世界に先駆けてヒト
成長ホルモンをへ分子ｐＥｓ１５０及びｐＥＳ１５Ｏ−
ＧＨ及びｐ託８４〆及びｐｈＧＨ９２８のｆｉｌｌ 製
法およびバチルス・ズブチリスを宿主菌としたヒト成長
ホルモン遺伝子の発現とその結果産生嘔れたヒト成長ホ
ルモンの分泌生産について説明する。なお、本発明は以
下の実施例により何ら制限されるものでない。
０−ＧＨ及びｐｈＧＨ９２８を宿主菌となるバチルス川
細菌へ導入することにより、ヒト成長ホルモンをコード
する遺伝子を宿主菌で発現させその結果産生され友ヒト
成長ホル七ンを、該宿主鋼の培養液中に多量に分泌生産
させて、培養上清から簡単な工程で回収哨装することが
可能とならしめ九〇実際に、本発明組み換え体ＤＮＡ分
子ｐＥＳ１５０−ＧＨとｐｈＧＨ９２Ｂそれぞｆ′Ｌを
用いて、バチルス・ズブチリスで、世界に先駆けてヒト
成長ホルモンをへ分子ｐＥｓ１５０及びｐＥＳ１５Ｏ−
ＧＨ及びｐ託８４〆及びｐｈＧＨ９２８のｆｉｌｌ 製
法およびバチルス・ズブチリスを宿主菌としたヒト成長
ホルモン遺伝子の発現とその結果産生嘔れたヒト成長ホ
ルモンの分泌生産について説明する。なお、本発明は以
下の実施例により何ら制限されるものでない。
更に、本発明者らは、該中性プロテアーゼの発現に関与
する領域をコードするＤＮＡ塩基配列と該中性プロテア
ーゼのプレプロペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列に
棹々の長さの欠失を設けたＤ Ｎ、 Ａ塩基配列とから
なるＤＮＡ塩基配列にも該中性プロテアーゼの高発現・
多斌分泌に関する性質が存在しているかどうかという点
に看目しプレプロペプチド部分に欠失を設けたペプチド
によりヒト成長ホルモンの分泌を可能ならしめる組み換
え体ＤＮＡ分子の創製を企図し友。即ち、該中性プロテ
アーゼの発現に関与する領域をコードするＤＮＡ塩基配
列と該中性プロテアーゼのプレプロペプチドをコードす
るＤＮＡ塩基配列に咄々の長さの欠失を設けｆ（ＤＮＡ
塩基配列とからなるＤＮＡ塩基配列を作成した。次に、
これらのＤＮＡ塩基配列と、アミラーゼ遺伝子の発現に
関与する領城をコードするＤＮＡｔＪ基配列とアミラー
ゼの前駆体のＮ−末端に存在するポリペプチドをコード
するＤＮＡ塩基配列とを欠くα−アミラーゼ遺伝子を結
合させた種々の組み換え体ＤＮＡ分子を作成しｔｏさら
に、これらの組み換え体ＤＮＡ分子で形ＶＬ転喫したバ
チルス属細菌が分泌産生ずるα−アミラーゼのｌＪｔを
調べることにより、これらのＤＮＡ断片の有する、該α
−アミラーゼ遺伝子を７１′ｉ現きせその結果産生され
友α−アミラーゼを分泌させる能力（産生・分泌能）に
検討を加えた。
する領域をコードするＤＮＡ塩基配列と該中性プロテア
ーゼのプレプロペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列に
棹々の長さの欠失を設けたＤ Ｎ、 Ａ塩基配列とから
なるＤＮＡ塩基配列にも該中性プロテアーゼの高発現・
多斌分泌に関する性質が存在しているかどうかという点
に看目しプレプロペプチド部分に欠失を設けたペプチド
によりヒト成長ホルモンの分泌を可能ならしめる組み換
え体ＤＮＡ分子の創製を企図し友。即ち、該中性プロテ
アーゼの発現に関与する領域をコードするＤＮＡ塩基配
列と該中性プロテアーゼのプレプロペプチドをコードす
るＤＮＡ塩基配列に咄々の長さの欠失を設けｆ（ＤＮＡ
塩基配列とからなるＤＮＡ塩基配列を作成した。次に、
これらのＤＮＡ塩基配列と、アミラーゼ遺伝子の発現に
関与する領城をコードするＤＮＡｔＪ基配列とアミラー
ゼの前駆体のＮ−末端に存在するポリペプチドをコード
するＤＮＡ塩基配列とを欠くα−アミラーゼ遺伝子を結
合させた種々の組み換え体ＤＮＡ分子を作成しｔｏさら
に、これらの組み換え体ＤＮＡ分子で形ＶＬ転喫したバ
チルス属細菌が分泌産生ずるα−アミラーゼのｌＪｔを
調べることにより、これらのＤＮＡ断片の有する、該α
−アミラーゼ遺伝子を７１′ｉ現きせその結果産生され
友α−アミラーゼを分泌させる能力（産生・分泌能）に
検討を加えた。
その結果、罵＜べさことに、中性プロテアーゼの発現に
関与する領域をコードするＤＮＡ塩基配列と、該プレプ
ロペプチドをコードするＤＮＡ塩基からなるＤＮＡ塩基
配列と同８度に、しかも、本来のα−アミラーゼの発現
に関与する領域をコードするＤＮＡ塩基配列とアミラー
ゼの前駆体のＮ−末端に存在するポリペプチドをコード
するＤＮＡ塩基配列とからなるＤＮＡ塩基配列よりもα
−アミラーゼ遺伝子を強力に発現させその結果産生きれ
たα−アミラーゼを多量に分泌させる能力が存在してい
ることを発見し、このような性質を有するＤＮＡ塩基配
列を決定することに成功しｔ０次に、該ＤＮＡ塩基配列
（第２図）の下流に、次作成し几。次に、該組み換え体
ＤＮＡ分子ｐ田８４２に含１れる第２図に示しｔＤＮＡ
塩基配列の下流にヒト成長ホルモンをコードするＤＮＡ
塩基配列を含むＤＮＡ塩基配列を結合させた組み換え体
ＤＮＡ分子ｐｈＧＨ９２８を作成した。
関与する領域をコードするＤＮＡ塩基配列と、該プレプ
ロペプチドをコードするＤＮＡ塩基からなるＤＮＡ塩基
配列と同８度に、しかも、本来のα−アミラーゼの発現
に関与する領域をコードするＤＮＡ塩基配列とアミラー
ゼの前駆体のＮ−末端に存在するポリペプチドをコード
するＤＮＡ塩基配列とからなるＤＮＡ塩基配列よりもα
−アミラーゼ遺伝子を強力に発現させその結果産生きれ
たα−アミラーゼを多量に分泌させる能力が存在してい
ることを発見し、このような性質を有するＤＮＡ塩基配
列を決定することに成功しｔ０次に、該ＤＮＡ塩基配列
（第２図）の下流に、次作成し几。次に、該組み換え体
ＤＮＡ分子ｐ田８４２に含１れる第２図に示しｔＤＮＡ
塩基配列の下流にヒト成長ホルモンをコードするＤＮＡ
塩基配列を含むＤＮＡ塩基配列を結合させた組み換え体
ＤＮＡ分子ｐｈＧＨ９２８を作成した。
実施例１
（バチルス アミロリキファシエンスの中性プロテアー
ゼ遺伝子を含むプラスミドのｖ＠製）バチルス・７ミロ
リキ７アシエンスＦ ｇ （ＡＴＣ０２３５５０）を肉
汁培地（Ｄｉｆｃｏ社製二ニ社製ソニートリエンドブロ
ス用いて３７℃で１５時間培養しｔ後集醒し、Ｓａｉ
ｔｏ−Ｍｉｕｒａの方法（８ａｉｔｏ、 Ｈ，。
ゼ遺伝子を含むプラスミドのｖ＠製）バチルス・７ミロ
リキ７アシエンスＦ ｇ （ＡＴＣ０２３５５０）を肉
汁培地（Ｄｉｆｃｏ社製二ニ社製ソニートリエンドブロ
ス用いて３７℃で１５時間培養しｔ後集醒し、Ｓａｉ
ｔｏ−Ｍｉｕｒａの方法（８ａｉｔｏ、 Ｈ，。
ａｎｄ Ｍｉｕｒａ、 Ｋ−工、、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ ａｃｔａ ７２゜６１９ （１９６３）
）に従い１０１６９の精製染色体ＤＮＡを得た。この
染色体Ｄ Ｎ Ａ ５００μ２を制限酵素５ａｕｉ工（
全酒造１）１ｏｏ＄位を用いて３７℃で５分間反応させ
た。反応系の組成は１０ｍＭトリス−堪酸緩９７９ （
ｐＨ７，５） 、７ ｍＭ ＭｇＣｌ、、１００ｍＭ
Ｎａｃｌでめる。反応後１μｔのＤＮＡを供試し１チア
ガロースゲル１に気泳勧により調べ友結果、本反応物ｉ
２ｋｂ −８ｋｂのサイズのＤＮＡ７ラグメントヲ主
とする・供与染色体の部分切断物であることが認められ
た。そこで本反応物の残り全量全１７％低臓点アガロー
スゲル電気泳動によジ１００ Ｖ ５時間泳動しおよそ
ｔ５ｋｂ −９ｋｂ部分のゲルを切り出し、フェノール
抽出およびクロロホルム抽出によジ梢徊しエタノール沈
澱によりＤＮＡを回収した。この回収ＤＮＡは、５０ｍ
Ｍ）リスー塩１１２緩衝＊ （１）Ｈ７，５） ２００
ｐＬ ＶＣｆｆｊ解し、以後の反応に使用した。
ｉｏｐｈｙｓ ａｃｔａ ７２゜６１９ （１９６３）
）に従い１０１６９の精製染色体ＤＮＡを得た。この
染色体Ｄ Ｎ Ａ ５００μ２を制限酵素５ａｕｉ工（
全酒造１）１ｏｏ＄位を用いて３７℃で５分間反応させ
た。反応系の組成は１０ｍＭトリス−堪酸緩９７９ （
ｐＨ７，５） 、７ ｍＭ ＭｇＣｌ、、１００ｍＭ
Ｎａｃｌでめる。反応後１μｔのＤＮＡを供試し１チア
ガロースゲル１に気泳勧により調べ友結果、本反応物ｉ
２ｋｂ −８ｋｂのサイズのＤＮＡ７ラグメントヲ主
とする・供与染色体の部分切断物であることが認められ
た。そこで本反応物の残り全量全１７％低臓点アガロー
スゲル電気泳動によジ１００ Ｖ ５時間泳動しおよそ
ｔ５ｋｂ −９ｋｂ部分のゲルを切り出し、フェノール
抽出およびクロロホルム抽出によジ梢徊しエタノール沈
澱によりＤＮＡを回収した。この回収ＤＮＡは、５０ｍ
Ｍ）リスー塩１１２緩衝＊ （１）Ｈ７，５） ２００
ｐＬ ＶＣｆｆｊ解し、以後の反応に使用した。
このようにして得友供与染色体のＤＮＡ断片を、制限酵
素ＢａｍＨ工（全酒造製）で完全に切断して大腸菌アル
カリ性ホスファターゼ（Ｗｏｒｔｈｉｇｔｏｎ社裏）で
末端リン酸エステル金加水分解したプラスミドｐＵＢ１
１０に結合し比。
素ＢａｍＨ工（全酒造製）で完全に切断して大腸菌アル
カリ性ホスファターゼ（Ｗｏｒｔｈｉｇｔｏｎ社裏）で
末端リン酸エステル金加水分解したプラスミドｐＵＢ１
１０に結合し比。
ｐＵＢｌ １０のＢ ａｍＨ工処塩処理ｐＵＢｌ １０
１００ｐｆ／ 。
１００ｐｆ／ 。
ＢａｍＨ工（全酒造製）５０単位で３７℃４時間のイン
キエベーシｌンで行った。反応系の組成に、１０ｍＭ
）リス−塩ｅ１ ａ ｉｉＡ液（ｐＨ８，０）、７ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ□、１００ｍＭ Ｎａｃｌ 、 ２ｍＭ
２−メルカプ） 工ｌ ／ −／ｌ／、α０１チウシ
血清アルブミンである。得られ友ＢａｍＨ工切断ｐＵＢ
１１Ｄはフェノール抽出２３回行いエタノール沈殿で回
収した。回収ｐＵＢ１１０１ｑ次に大腸国アルカリ性ホ
スファターゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ社製ＢＡＰＦ
） ５単位、０．１ Ｍ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ＆
ｏ ）で６５℃ ４時間インキエペーシ磨ンすることで
反応全行った。七の佐フェノール抽出とエタノール沈ａ
ｔ−行いｐＵＢｌ １０を回収し友。回収ｐＵＢ１１０
は１００μｔの５０ｍＭ ）リス−１Ｍ ｆ＆ ｔｌ
衝液（ｐ）１７．５ ）で溶解し念。
キエベーシｌンで行った。反応系の組成に、１０ｍＭ
）リス−塩ｅ１ ａ ｉｉＡ液（ｐＨ８，０）、７ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ□、１００ｍＭ Ｎａｃｌ 、 ２ｍＭ
２−メルカプ） 工ｌ ／ −／ｌ／、α０１チウシ
血清アルブミンである。得られ友ＢａｍＨ工切断ｐＵＢ
１１Ｄはフェノール抽出２３回行いエタノール沈殿で回
収した。回収ｐＵＢ１１０１ｑ次に大腸国アルカリ性ホ
スファターゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ社製ＢＡＰＦ
） ５単位、０．１ Ｍ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ＆
ｏ ）で６５℃ ４時間インキエペーシ磨ンすることで
反応全行った。七の佐フェノール抽出とエタノール沈ａ
ｔ−行いｐＵＢｌ １０を回収し友。回収ｐＵＢ１１０
は１００μｔの５０ｍＭ ）リス−１Ｍ ｆ＆ ｔｌ
衝液（ｐ）１７．５ ）で溶解し念。
かくして得られたＢａｍＨ工およびホスファターゼで処
理したｐＵＢｌｌｏと先に得た供与染色体ＤＮＡ断片と
の結合’ｅ Ｔ、 ！ｊガーゼ（宝酒造！Ｆ３りを用い
て行った。反応系の組成は供与染色体断片５０μｔ１ｐ
ＵＢ１１０２０ｐｔＸ？、リガーゼ５単位、６６ｍＭ）
リス−塩酸緩衝！＆、（１）Ｈ７，５）、ｌｈ６ｍＭ
ＭｇＯ１、，１０ｍＭジテオスレイトール、１ｍＭ
ＡＴＰ（アデノシン５リンｔｆりである。反応は１５℃
で４時間行り之。
理したｐＵＢｌｌｏと先に得た供与染色体ＤＮＡ断片と
の結合’ｅ Ｔ、 ！ｊガーゼ（宝酒造！Ｆ３りを用い
て行った。反応系の組成は供与染色体断片５０μｔ１ｐ
ＵＢ１１０２０ｐｔＸ？、リガーゼ５単位、６６ｍＭ）
リス−塩酸緩衝！＆、（１）Ｈ７，５）、ｌｈ６ｍＭ
ＭｇＯ１、，１０ｍＭジテオスレイトール、１ｍＭ
ＡＴＰ（アデノシン５リンｔｆりである。反応は１５℃
で４時間行り之。
反応後一部を用いて１％アガロースゲル寛気気泳動行り
友結果、ベクターであるｐＵＢｌ １０と供与染色体Ｄ
ＮＡとが結合し組み換え体ＤＮＡ分子を形成しているこ
とが認められた。
友結果、ベクターであるｐＵＢｌ １０と供与染色体Ｄ
ＮＡとが結合し組み換え体ＤＮＡ分子を形成しているこ
とが認められた。
このようにして得られｔ組み換え体ＤＮＡ分子による形
質転換はＯｈａｕｇのプロトゲラスト法（ｃｈａｎｇ、
ｓ、ａｎｄ Ｃ！ｏｈｅｎ、 Ｓ＋Ｎ、、 Ｍｏｌ
、Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ。
質転換はＯｈａｕｇのプロトゲラスト法（ｃｈａｎｇ、
ｓ、ａｎｄ Ｃ！ｏｈｅｎ、 Ｓ＋Ｎ、、 Ｍｏｌ
、Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ。
１６８、 １１１ （１９７８） ）に従って実施し
九〇グロトプラストの再生培地には硫酸カナマイシンを
最終製置１００μｔ／ｌｘｔとなるように９口え几。ク
ローニングの宿主菌にはバチルス・スプチリス１Ａ２７
４株（オハイオ大学バチルスストックセンター保存株）
を用いｔｏ 形質転換によって得られｔカナマイシン耐性株は、０．
８％カゼイン−４０μｆ／／ｇｔカナマイシンを含むＴ
ＢＡＢ寒天培地（Ｄｉｆｃｏ社製）に植え継ぎ５７℃で
１４時間培養してコロニーの１ゎりのハロー形成の有無
を調べ友。約１万株のカナマイシン耐性株について調べ
之結果、１株（＋１５０）はコロニーの１わりにｗ４著
に大きいハローを形成していｔｏ このようにして得た大ハローを形成する形質転換株◆１
５０をシングルコロニー単離して得た大ハロー形成株を
ペンアクセイ培地（Ｄｉｆｃｏ仕喪）５Ｑｄを用いて３
７℃１４時間培養果菌した。巣ω菌体を５０ｍＭ）リス
−塩は緩衝液（ｐＨ７，５）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、 ５
０ｍＭ ＮａＣ１で洗浄しｆｃあとでアルカリ法（Ｂｉ
ｒｎｂｏｉｍ、 Ｈ，Ｃ，ａｎｄ Ｐｏ１ｙ、 Ｊ、、
Ｎｕｃｌｅ＋ｃａｃｉｄｒｅｓ、７１５１５（１９７
９） ）に依りプラスミド全調製した。得られたプラス
ミドを制限酵素ＥｃｏＲ工およびＢｇｌエエ、ＢａｍＨ
工で処理し７ｔｆ１チアガロースゲル電気泳動で調ぺｔ
ところｋｏＲ工、Ｂｇｌｚ工で該プラスミドは１ケ所切
断され、サイズは４２ｋｂのものであることが、および
Ｂａｎｆｆ１工では切断されないことが見出され友。ベ
クターとして用いたｐＵＢｌ １０のサイズは４．５ｋ
ｂでＩＣＯＲ工、ＢｇｌエエおよびＢａｍＨ工により１
ケ所切断されるものであるから大ハロー形成形質転換株
から得られ九プラスミドにはｐＵＢｌ １０のＢａｍＨ
工部位に約ｔ７ｋｂの供与染色体ＤＮＡすなわちバチル
ス アミロリキファシエンスの中性プロテアーゼ遺伝子
が挿入した組み換え体ＤＮＡ分子であることがわかり九
〇この組み換え体プラスミドｊｉｐＮＰ１５０と名付は
友。
九〇グロトプラストの再生培地には硫酸カナマイシンを
最終製置１００μｔ／ｌｘｔとなるように９口え几。ク
ローニングの宿主菌にはバチルス・スプチリス１Ａ２７
４株（オハイオ大学バチルスストックセンター保存株）
を用いｔｏ 形質転換によって得られｔカナマイシン耐性株は、０．
８％カゼイン−４０μｆ／／ｇｔカナマイシンを含むＴ
ＢＡＢ寒天培地（Ｄｉｆｃｏ社製）に植え継ぎ５７℃で
１４時間培養してコロニーの１ゎりのハロー形成の有無
を調べ友。約１万株のカナマイシン耐性株について調べ
之結果、１株（＋１５０）はコロニーの１わりにｗ４著
に大きいハローを形成していｔｏ このようにして得た大ハローを形成する形質転換株◆１
５０をシングルコロニー単離して得た大ハロー形成株を
ペンアクセイ培地（Ｄｉｆｃｏ仕喪）５Ｑｄを用いて３
７℃１４時間培養果菌した。巣ω菌体を５０ｍＭ）リス
−塩は緩衝液（ｐＨ７，５）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、 ５
０ｍＭ ＮａＣ１で洗浄しｆｃあとでアルカリ法（Ｂｉ
ｒｎｂｏｉｍ、 Ｈ，Ｃ，ａｎｄ Ｐｏ１ｙ、 Ｊ、、
Ｎｕｃｌｅ＋ｃａｃｉｄｒｅｓ、７１５１５（１９７
９） ）に依りプラスミド全調製した。得られたプラス
ミドを制限酵素ＥｃｏＲ工およびＢｇｌエエ、ＢａｍＨ
工で処理し７ｔｆ１チアガロースゲル電気泳動で調ぺｔ
ところｋｏＲ工、Ｂｇｌｚ工で該プラスミドは１ケ所切
断され、サイズは４２ｋｂのものであることが、および
Ｂａｎｆｆ１工では切断されないことが見出され友。ベ
クターとして用いたｐＵＢｌ １０のサイズは４．５ｋ
ｂでＩＣＯＲ工、ＢｇｌエエおよびＢａｍＨ工により１
ケ所切断されるものであるから大ハロー形成形質転換株
から得られ九プラスミドにはｐＵＢｌ １０のＢａｍＨ
工部位に約ｔ７ｋｂの供与染色体ＤＮＡすなわちバチル
ス アミロリキファシエンスの中性プロテアーゼ遺伝子
が挿入した組み換え体ＤＮＡ分子であることがわかり九
〇この組み換え体プラスミドｊｉｐＮＰ１５０と名付は
友。
このようにして得られた組み換え体プラスミドｐＮＰ１
５０ ｒｌコンピテント法によりバチルス・ズブチリス
１人２０株（オハイオ大字バチルスストックセンター保
存株ンを形質転換し友。コンピテント法の形質転換ｒ４
Ａｎａｇｎｏｓｔｏｐｏｕｌｏｓ−Ｂｐｉｚｉｚｅｎ
の方法（Ａｎａｇｎｏｓｔｏｐｏｕｌｏｓ、 Ｃ，、ａ
ｎｄ ５ｐｉｚｉｚｅｎ。
５０ ｒｌコンピテント法によりバチルス・ズブチリス
１人２０株（オハイオ大字バチルスストックセンター保
存株ンを形質転換し友。コンピテント法の形質転換ｒ４
Ａｎａｇｎｏｓｔｏｐｏｕｌｏｓ−Ｂｐｉｚｉｚｅｎ
の方法（Ａｎａｇｎｏｓｔｏｐｏｕｌｏｓ、 Ｃ，、ａ
ｎｄ ５ｐｉｚｉｚｅｎ。
Ｊ、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、８１７４１ （１９６
１）に従り九。約５μ２０組み換え体ＤＮＡ分子取り込
み後の培養！（１ｍｇ）は１８チカゼイン−４０μｔ／
厘！カナマイシン含有ＴＢＡＢ寒天培地に５ｏμｔずつ
ブレーティングしｔ０得られ定カナマイシン耐性形質転
換株の１００％が大ハロー形成株であった。
１）に従り九。約５μ２０組み換え体ＤＮＡ分子取り込
み後の培養！（１ｍｇ）は１８チカゼイン−４０μｔ／
厘！カナマイシン含有ＴＢＡＢ寒天培地に５ｏμｔずつ
ブレーティングしｔ０得られ定カナマイシン耐性形質転
換株の１００％が大ハロー形成株であった。
この形質転換株バチルスズプチルスＭＴ−０１５０（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−４２５）から、常法によりバチルス ア
ミロリキファシエンスの中性プロテアーゼを含むＤＮＡ
塩基配列がプラスミドｐＵＢ１１０に結合したプラスミ
ドｐＮＰ１５０を自製し九〇 実施例２ （ｇ！を図に示しｔ工程に従つ之組み換え体ＤＮＡ分子
ｐＥＳ１５０の作成法） 実施例１で得几グラスミドｐＮＰ１５０を、制限エンド
ヌクレアーゼ！３ｐｈ工で切断すると約５．４ｋｂ。
ＥＲＭ ＢＰ−４２５）から、常法によりバチルス ア
ミロリキファシエンスの中性プロテアーゼを含むＤＮＡ
塩基配列がプラスミドｐＵＢ１１０に結合したプラスミ
ドｐＮＰ１５０を自製し九〇 実施例２ （ｇ！を図に示しｔ工程に従つ之組み換え体ＤＮＡ分子
ｐＥＳ１５０の作成法） 実施例１で得几グラスミドｐＮＰ１５０を、制限エンド
ヌクレアーゼ！３ｐｈ工で切断すると約５．４ｋｂ。
大フラグメントと約１ｋｂの小フラグメントを得７？：
（第３図（ａ））。
（第３図（ａ））。
この大フラグメント’を低融点アガロースゲル電気泳動
法により分離回収した。回収したＤＮＡは常法に従いカ
ラムクロマトグラフィーおよびフェノール抽出、エーテ
ル抽出、エタノール沈澱により精製した。
法により分離回収した。回収したＤＮＡは常法に従いカ
ラムクロマトグラフィーおよびフェノール抽出、エーテ
ル抽出、エタノール沈澱により精製した。
該精製Ｄ Ｎ Ａ ０．１μグをＴ、ＩＪガーゼ５単位
を用いて結合し環状プラスミドとした（第３図（ｂ））
。
を用いて結合し環状プラスミドとした（第３図（ｂ））
。
結合反応系の組成は６６ｍＭトリス−塩酸緩衝液（＋）
Ｈ７，５）、６．６ｍＭ Ｍｇｃ１２．１０ｍＭジチオ
スライトール、２ ｍＭ ＡＴＰである。反応は１５℃
で３時間行なった。
Ｈ７，５）、６．６ｍＭ Ｍｇｃ１２．１０ｍＭジチオ
スライトール、２ ｍＭ ＡＴＰである。反応は１５℃
で３時間行なった。
この反応混液を用いてバチルス ズブチリスｌＡ３１０
（オハイオ大学バチルス ストックセンター保存株）
をプロトプラスト法により形質転換した。
（オハイオ大学バチルス ストックセンター保存株）
をプロトプラスト法により形質転換した。
得られたカナマイシン耐性形質転換株（ＭＴ−１１５０
（Ｆｌｉ：ＲＭ ＢＰ−７２２）からアルカリ法により
プラスミドを抽出して各種制限エンドヌクレアーゼを用
いて物理地図を作成した。
（Ｆｌｉ：ＲＭ ＢＰ−７２２）からアルカリ法により
プラスミドを抽出して各種制限エンドヌクレアーゼを用
いて物理地図を作成した。
その結果、得られたこのプラスミドｐＫｓ１５０はを有
し、プロ構造の切断点近傍のＤＮＡ塩基配列に存在する
８ｐｈ工切断部位から下流の成熟菌体外中性プロテアー
ゼをコードするＤＮＡ塩基配列が削除され之形のプラス
ミドであることが確認された。
し、プロ構造の切断点近傍のＤＮＡ塩基配列に存在する
８ｐｈ工切断部位から下流の成熟菌体外中性プロテアー
ゼをコードするＤＮＡ塩基配列が削除され之形のプラス
ミドであることが確認された。
第３図に示す様に、本プラスミドは唯一のｓｐｈ工切断
部位を有し、該部位に直接或にリンカ−等を用いて間接
に所望の蛋白質をコードする領域を含むＤＮＡ塩基配列
をコドンの読みと９のずれがお＠ない様に結合すれば所
望の蛋白質を分泌生産する際に用いられるｉＩｉ換え体
ＤＮＡが容易に構築できる発現・分泌ベクターである。
部位を有し、該部位に直接或にリンカ−等を用いて間接
に所望の蛋白質をコードする領域を含むＤＮＡ塩基配列
をコドンの読みと９のずれがお＠ない様に結合すれば所
望の蛋白質を分泌生産する際に用いられるｉＩｉ換え体
ＤＮＡが容易に構築できる発現・分泌ベクターである。
更にｐＥＳ１５０１μｔを８ｐｈ工で切断して開環し几
後Ｔ４ポリメラーゼの有するエキンヌクレアーゼ活性を
用−て突出末端を除去し、第４図に示すＤＮＡ塩基配列
を平滑末端ライジエーシ四ンによって結合して第３図に
示す組み換え体ＤＮＡ分子ｐｓＢ１５０およびｐＢｓ１
５０ ｔ−構築しｔ０本発現・分泌ベクターは中性プロ
テアーゼのプロ構造切断点をコードするＤＮＡ塩基配列
の下流に第４図に示すＤＮＡ塩基配列が結合しており、
該配列中には制限エンドヌクレアーゼｓｍａ工およびＢ
ａｍＨＩの切断部位が存在する。
後Ｔ４ポリメラーゼの有するエキンヌクレアーゼ活性を
用−て突出末端を除去し、第４図に示すＤＮＡ塩基配列
を平滑末端ライジエーシ四ンによって結合して第３図に
示す組み換え体ＤＮＡ分子ｐｓＢ１５０およびｐＢｓ１
５０ ｔ−構築しｔ０本発現・分泌ベクターは中性プロ
テアーゼのプロ構造切断点をコードするＤＮＡ塩基配列
の下流に第４図に示すＤＮＡ塩基配列が結合しており、
該配列中には制限エンドヌクレアーゼｓｍａ工およびＢ
ａｍＨＩの切断部位が存在する。
従って該切断部位のいずれかに所望の蛋白質をコードす
る領域を含むＤＮＡ塩基配列をコドンの読みとりのずれ
がおきないように直接或はリンカ−等を用いて間接に結
合すれば所望の蛋白’］を分泌生産する際に用いられる
組み換え体ＤＮＡが容易に構築でさるものである。
る領域を含むＤＮＡ塩基配列をコドンの読みとりのずれ
がおきないように直接或はリンカ−等を用いて間接に結
合すれば所望の蛋白’］を分泌生産する際に用いられる
組み換え体ＤＮＡが容易に構築でさるものである。
以下にｐＫ８１５０からのｐ８Ｂ１５０およびｐＢ８１
５０の造成に就いて述べる。
５０の造成に就いて述べる。
１μＶのｐＫｓ１５０を８ｐｈ工を用いて常法に従い切
断開環した。得られた線状ｐＫＥ＋１５０を７エノール
抽出、エーテル抽出およびエタノール沈澱に依って精製
した。このものを乾燥後３２μｔの蒸留水に溶解し１０
倍濃度のＴ４ポリメラーゼ緩衝液４μｔ１２ｍＭａＮＴ
Ｐ ２ｐｌおよび’ｒ、 Ｄ Ｎ Ａポリメラーゼ（宝
掬造製）３単位を加えて３７℃でインキエペートした。
断開環した。得られた線状ｐＫＥ＋１５０を７エノール
抽出、エーテル抽出およびエタノール沈澱に依って精製
した。このものを乾燥後３２μｔの蒸留水に溶解し１０
倍濃度のＴ４ポリメラーゼ緩衝液４μｔ１２ｍＭａＮＴ
Ｐ ２ｐｌおよび’ｒ、 Ｄ Ｎ Ａポリメラーゼ（宝
掬造製）３単位を加えて３７℃でインキエペートした。
３０分後に１５０μｔのＤ Ｎ Ａ緩衝液（１０ｍＭ）
リス−塩酸緩衝液ｐＨ＆ｏ、１０ｍＭ ＫＣｔ、 α
１ｍＭ ］！ｆｆ１Ａを加えてフェノール抽出、エーテ
ル抽出、エタノール沈＃を行いＤＮＡを精製した。得ら
れたＤＮＡは乾燥後５０μｔのトリス−塩酸緩衝液（５
０ｍＭ、ｐＨ７，５）に溶解しうち１０μｔを以下の操
作に供した。
リス−塩酸緩衝液ｐＨ＆ｏ、１０ｍＭ ＫＣｔ、 α
１ｍＭ ］！ｆｆ１Ａを加えてフェノール抽出、エーテ
ル抽出、エタノール沈＃を行いＤＮＡを精製した。得ら
れたＤＮＡは乾燥後５０μｔのトリス−塩酸緩衝液（５
０ｍＭ、ｐＨ７，５）に溶解しうち１０μｔを以下の操
作に供した。
即ち、このＤＮＡ１０μｔに別途合成法に依り調製した
第４図に示すＤＮＡ塩基配列０．２μｆを加えＴ、リガ
ーゼにより結合反応を行った。
第４図に示すＤＮＡ塩基配列０．２μｆを加えＴ、リガ
ーゼにより結合反応を行った。
反応系はＴ４リガーゼ（宝酒造製）２０単位、６６ｍＭ
トリス塩酸−緩ｍｕ （ｐＨ７，５）、＆６ｍＭＭｇＣ
ムい １０ｍどジチオスライトール、２哩ＡＴＰで、反
応は４℃で２０時間行なった。
トリス塩酸−緩ｍｕ （ｐＨ７，５）、＆６ｍＭＭｇＣ
ムい １０ｍどジチオスライトール、２哩ＡＴＰで、反
応は４℃で２０時間行なった。
尚、反応液な全量で５０μｔとなるようにした。
かくして得られ友反応液２０μｔを用い、バチルス ズ
ブチリス ｌＡ３１．Ｏをプロトゲラスト法により形質
転換し友。得られ友カナマイシン耐性株からプラスミド
を調製し、常法に従い物理地図を作成し之結果得られた
プラスミドはＳｐｈ工切断部位を有嘔ず、８ｍａ工、Ｂ
ａｍＨＩの切＃部位が各１か所存在するものであった。
ブチリス ｌＡ３１．Ｏをプロトゲラスト法により形質
転換し友。得られ友カナマイシン耐性株からプラスミド
を調製し、常法に従い物理地図を作成し之結果得られた
プラスミドはＳｐｈ工切断部位を有嘔ず、８ｍａ工、Ｂ
ａｍＨＩの切＃部位が各１か所存在するものであった。
このものは第４図に示すＤＮＡ塩基配列の挿入方向によ
り２種類ありそれぞれｐ８Ｂ１５０およびｐＢｓ１５０
と命名しｔｏ 実施例５ 第５図に示した工程に従った本発明の組み換え体ＤＮＡ
分子１）ＥＳｌ ５Ｏ−ＧＨの作成法と該組み換え体Ｄ
ＮＡ分子ｐＲＥ３１５０−ＧＨによるヒト成長ホルモン
の分泌生産 グラスミドｐＧＨ２０は、ヒト成長ホルモンの分泌に（
＞１４与する分泌シグナル部分を削除し次成長ホルモン
の成熱蛋白ｙ！、をコードするＤＮＡ塩基配列を含むＤ
ＮＡ塩基配列の両端に制限酵素ＥＣＯＲ工切断部位およ
び制限酵素ｐｖｕエエ切断部位が存在するように、合成
り Ｎ Ａ リンカ−を用いて造成したものである。
り２種類ありそれぞれｐ８Ｂ１５０およびｐＢｓ１５０
と命名しｔｏ 実施例５ 第５図に示した工程に従った本発明の組み換え体ＤＮＡ
分子１）ＥＳｌ ５Ｏ−ＧＨの作成法と該組み換え体Ｄ
ＮＡ分子ｐＲＥ３１５０−ＧＨによるヒト成長ホルモン
の分泌生産 グラスミドｐＧＨ２０は、ヒト成長ホルモンの分泌に（
＞１４与する分泌シグナル部分を削除し次成長ホルモン
の成熱蛋白ｙ！、をコードするＤＮＡ塩基配列を含むＤ
ＮＡ塩基配列の両端に制限酵素ＥＣＯＲ工切断部位およ
び制限酵素ｐｖｕエエ切断部位が存在するように、合成
り Ｎ Ａ リンカ−を用いて造成したものである。
筐ず、該プラスミドｐＧＨ２０を制限酵素Ｆｔ、ＯＲ工
と制限酵素Ｐｖｕエエとで分解し約９００ｂｐからなる
ヒト成長ホルモンをコードするＤＮＡ塩基配列を含むＤ
１４ Ａ塩基配列（ｈ ｏ ｕ＃４造遺伝子）を得た
（第５図ａ）。次いで、該ｈａｇ構造遺伝子の両末端ｅ
、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼエ（宝酒造製）を用いて、平
滑末端とし定ＤＮＡ断片（Ｄ Ｎ Ａ＠片Ａ）を得た（
第５図ｂ）。反応系及び反応条件ｎ、ｈＧＨ（４造遺伝
子０．５ ｐ？、それぞれ２ ｍＭのｄＡＴＰ 。
と制限酵素Ｐｖｕエエとで分解し約９００ｂｐからなる
ヒト成長ホルモンをコードするＤＮＡ塩基配列を含むＤ
１４ Ａ塩基配列（ｈ ｏ ｕ＃４造遺伝子）を得た
（第５図ａ）。次いで、該ｈａｇ構造遺伝子の両末端ｅ
、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼエ（宝酒造製）を用いて、平
滑末端とし定ＤＮＡ断片（Ｄ Ｎ Ａ＠片Ａ）を得た（
第５図ｂ）。反応系及び反応条件ｎ、ｈＧＨ（４造遺伝
子０．５ ｐ？、それぞれ２ ｍＭのｄＡＴＰ 。
ｄＯＴＰ、 ｄＧＴＰ、 ｄＴＴＰ （いずれも宝酒造
製）の混合液１μｔ１ニクク トランスレージせン バ
ッファー（α５Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，２）
、０、１ Ｍ ＭｇＣｌ２．１ｍＭ ジチオスＬ／
イトール。
製）の混合液１μｔ１ニクク トランスレージせン バ
ッファー（α５Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，２）
、０、１ Ｍ ＭｇＣｌ２．１ｍＭ ジチオスＬ／
イトール。
５００μ？ ／ ｘｉ ウシ血清アルブミン）２．５
μｔ１水１０μｔで、反応温度２２℃、反応時間１５分
。
μｔ１水１０μｔで、反応温度２２℃、反応時間１５分
。
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼエ ２Ｕｎｉｔｓである。
一方、制限酵素ＢａｍＨＩで切断したｐ１８１５０の両
末端を、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼエ（宝酒造製）を用い
て平滑末端としたＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片Ｂ）を得た（
第５図Ｃ）。反応系及び反応条件に、前述の通りである
。
末端を、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼエ（宝酒造製）を用い
て平滑末端としたＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片Ｂ）を得た（
第５図Ｃ）。反応系及び反応条件に、前述の通りである
。
次に、ＤＮＡ断片α２μＶとＤＮＡ断片Ｂα３μｔとを
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造、１りＴｈ用いて結合
させた（第５図ｄ）。反応系及び反応条件は、前述の通
りである。
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造、１りＴｈ用いて結合
させた（第５図ｄ）。反応系及び反応条件は、前述の通
りである。
この反応混液を用いてバチルス ズブチリスｌＡ２Ｂ９
株をプロトプラスト法を用いて形質転換し、１％澱粉を
含有するＤＭ−５−カナマイシン（１５０μｔ／ゴ）培
地上で大型ハローを形成しないコロニーから２０株を選
択した。
株をプロトプラスト法を用いて形質転換し、１％澱粉を
含有するＤＭ−５−カナマイシン（１５０μｔ／ゴ）培
地上で大型ハローを形成しないコロニーから２０株を選
択した。
該形質転換株ｔ″ＢＹＢＹ培地マイシン５μ２／Ｈ１ｉ
ｑｉ加）で５０℃１８時間培養し、その培養上清を用い
てＥＩＡ法によりヒト成長ホルモン活性を測定しｔｏ その結果、≠２５形質転換株（ＭＴ−０１５５） ｉ、
５゜ｑ／ｌのヒト成長ホルモンを培地上清中に分泌して
いることが認められた。
ｑｉ加）で５０℃１８時間培養し、その培養上清を用い
てＥＩＡ法によりヒト成長ホルモン活性を測定しｔｏ その結果、≠２５形質転換株（ＭＴ−０１５５） ｉ、
５゜ｑ／ｌのヒト成長ホルモンを培地上清中に分泌して
いることが認められた。
次に、ｐＥＳ１５０Ｇ）（ＤＮＡ Ｊ） Ｄ Ｎ Ａ塩
基配列をマキ丈ム・ギルバート法で決定した。その結果
、該組み・１つえ体ＤＮＡ分子ｐＥｓ１５０ＧＨｔＤ、
第２図に示した中性プロテアーゼ遺伝子の発現に関与す
る領域およびグレグロタンパクをコードするＤ Ｎ Ａ
塩＞’に配列の下流に、ヒト成長ホルモン全コードす
るＤＮＡ磁基配列が、合成りＮＡＩＪンカーを介して結
合しているＤＮＡ塩基配列（第９図）を含んでいる組み
換え体ＤＮＡ分子であることが認められた。
基配列をマキ丈ム・ギルバート法で決定した。その結果
、該組み・１つえ体ＤＮＡ分子ｐＥｓ１５０ＧＨｔＤ、
第２図に示した中性プロテアーゼ遺伝子の発現に関与す
る領域およびグレグロタンパクをコードするＤ Ｎ Ａ
塩＞’に配列の下流に、ヒト成長ホルモン全コードす
るＤＮＡ磁基配列が、合成りＮＡＩＪンカーを介して結
合しているＤＮＡ塩基配列（第９図）を含んでいる組み
換え体ＤＮＡ分子であることが認められた。
実施例４
グレグロタンパクをコードするＤＮＡ塩基配列に禎々の
長さの欠失を設けたＤＮＡ１基配列を有するＤＮＡ断片
の作成法およびその分泌能の検定。
長さの欠失を設けたＤＮＡ１基配列を有するＤＮＡ断片
の作成法およびその分泌能の検定。
中性プロテアーゼ遺伝子の発現およびその結果産生され
た蛋白質の分泌に関与する領［は、バチルス・アミロリ
キファシエンス由米の中性プロテアーゼ遺伝子とプラス
ミドｐＵＢ１１０ Ｄ Ｎ Ａから成るグラスミドＩ）
ＮＰ１５０ Ｄ Ｎ Ａから、エキソヌクレアーゼ（Ｂ
ａ１５１ ）を用いて、中性プロテアーゼ遺伝子のグレ
グロベブテドをコードするＤ Ｎ Ａ４基配列に４１々
の長さの欠失を設けたＤＮＡ塩基配列を含むｎｈＡＩＩ
ｒ片を′ｊＡ製した。ｐＮＰｌ ５０ＤＮＡに、実施１
ｆｌＪ １に述べた様にして調製した。このようにして
得られたプラスミドｐＮＰ１５０ＤＮＡ １０μ？を匍
ｊ限酵素Ｐｖｕ工（ペーリンガー・マンハイム仕Ｆ）１
０単位を用いて、３７℃で１１４間反応させ完全に切断
し友（ｒ４７図（ａ） ） 、そのＰｖｕ工切断ｎＮＡ
ｈ、フエノール抽出を三回繰り返し、残留するフェノー
ルをエーテル抽出により除去したのち、エタノール沈ｍ
ｋ行って回収し友。その回収ＤＮＡは、エキソヌクレア
ーゼ Ｂａ１３１ （ペーリンガー・マンハイム社製）
１０単位を用いて３０℃で５０分間反応させた（第７図
（ｂ））。反応系の組成は、２０ｍＭトリス−塩（ｊｌ
［衝ｉ （ｐＨｓ、１ ） １ｍＭ ｇｎＴＡ、１２ｍ
ｕｃａｃ１２ 、１２ｍＭ ＭｇＣｌ２．６００ｍＭ
５ａｃｔである。反応終了後、フェノール抽出、エーテ
ル抽出、エタノール沈澱を＋ｐ次行ったｉ、ＤＮＡを回
収しｔ０回収ＤＮＡ （以後、エキソヌクレアーゼ処理
ＤＮＡと称す。）は、５０μｔの５０ｍＭ トリス−塩
酸緩イ荀濱（ｐＨ７，５） （以後、ＤＮＡバッファー
と称す。
た蛋白質の分泌に関与する領［は、バチルス・アミロリ
キファシエンス由米の中性プロテアーゼ遺伝子とプラス
ミドｐＵＢ１１０ Ｄ Ｎ Ａから成るグラスミドＩ）
ＮＰ１５０ Ｄ Ｎ Ａから、エキソヌクレアーゼ（Ｂ
ａ１５１ ）を用いて、中性プロテアーゼ遺伝子のグレ
グロベブテドをコードするＤ Ｎ Ａ４基配列に４１々
の長さの欠失を設けたＤＮＡ塩基配列を含むｎｈＡＩＩ
ｒ片を′ｊＡ製した。ｐＮＰｌ ５０ＤＮＡに、実施１
ｆｌＪ １に述べた様にして調製した。このようにして
得られたプラスミドｐＮＰ１５０ＤＮＡ １０μ？を匍
ｊ限酵素Ｐｖｕ工（ペーリンガー・マンハイム仕Ｆ）１
０単位を用いて、３７℃で１１４間反応させ完全に切断
し友（ｒ４７図（ａ） ） 、そのＰｖｕ工切断ｎＮＡ
ｈ、フエノール抽出を三回繰り返し、残留するフェノー
ルをエーテル抽出により除去したのち、エタノール沈ｍ
ｋ行って回収し友。その回収ＤＮＡは、エキソヌクレア
ーゼ Ｂａ１３１ （ペーリンガー・マンハイム社製）
１０単位を用いて３０℃で５０分間反応させた（第７図
（ｂ））。反応系の組成は、２０ｍＭトリス−塩（ｊｌ
［衝ｉ （ｐＨｓ、１ ） １ｍＭ ｇｎＴＡ、１２ｍ
ｕｃａｃ１２ 、１２ｍＭ ＭｇＣｌ２．６００ｍＭ
５ａｃｔである。反応終了後、フェノール抽出、エーテ
ル抽出、エタノール沈澱を＋ｐ次行ったｉ、ＤＮＡを回
収しｔ０回収ＤＮＡ （以後、エキソヌクレアーゼ処理
ＤＮＡと称す。）は、５０μｔの５０ｍＭ トリス−塩
酸緩イ荀濱（ｐＨ７，５） （以後、ＤＮＡバッファー
と称す。
にｆｒ４解し友。その溶解液のＤＮＡの度を定量したと
ころ、エキソヌクレアーゼ処理ＤＮＡｅ４液のＤＨＡ（
＝’ｌｌＬは、ｃＬ１μ？／μｔでめりｔ。この行程に
よりプラスミドｐＮＰ１５０のプレプロペプチドをコー
ドするＤＮＡ塩基配列に種々の長さの欠失を設けたＤＮ
Ａ断片が得られた。これらの１）ＨＡ断片がＭする種々
の長さのプレプロペプチドをコードする領域の分泌能音
調べるためにそれ自身の分泌シグナルを欠くα−アミラ
ーゼ遺伝子を用いてα−アミラーゼの菌体外へ分泌生産
される肴について調べ友。
ころ、エキソヌクレアーゼ処理ＤＮＡｅ４液のＤＨＡ（
＝’ｌｌＬは、ｃＬ１μ？／μｔでめりｔ。この行程に
よりプラスミドｐＮＰ１５０のプレプロペプチドをコー
ドするＤＮＡ塩基配列に種々の長さの欠失を設けたＤＮ
Ａ断片が得られた。これらの１）ＨＡ断片がＭする種々
の長さのプレプロペプチドをコードする領域の分泌能音
調べるためにそれ自身の分泌シグナルを欠くα−アミラ
ーゼ遺伝子を用いてα−アミラーゼの菌体外へ分泌生産
される肴について調べ友。
次に、分泌シグナルを欠くα−アミラーゼ遺伝子を、該
遺伝子を含むプラスミドｐＡＭ２９を用いてＡＭＪ＃し
た。プラスミドｐＡＭ２９は、α−アミラーゼの分泌に
関与する分泌シグナル部分を削除した成熟型α−アミラ
ーゼをコードするＤＮＡ塩基配列のＮ−末端側に制限酵
素ＳｍａＩ切断部位、制限酵素ＢａｍＨ工切断部位を、
またＣ末端側に制限酵素Ｈｉｎｄエエエ切断部位、制限
酵素Ｐｖｕ Ｘ Ｘ切断部位が存在するように、合成り
ＮＡｉ用いて造成し友ものである。該プラスミド（１０
μ２）全制限酵素８口１ａ工（全酒造ｌ！り１０単位と
制限酵素Ｐｖｕエエ（全酒造製）１０単位とで分解した
のち、１％アガロースゲル電気泳動を行って、１７００
塩基対から成るα−アミラーゼの分泌に関与する分泌シ
グナル部分を削除し念成熟型α−アミラーゼをコードす
るＤＮＡ塩基配列で、そのＮ末端には制限酵素ＢａｍＨ
工切断部位をま念、七のＣ末端には制限酵素Ｈｉｎｄエ
エエ切断部位を有するＤＮＡ断片（以後、α−アミラー
ゼ構造遺伝子と称す。）ｔ−６μｆｖＩ４製し友（第７
図（ｃ））。これを、５０μｔのＤＮＡバッファーに溶
解した。ここで、得られ定ＤＮＡ断片と先に述べたｐＮ
Ｐ１５０のプレプロペプチドをコードするＤＮＡ塩基配
列に種々の長さの欠失を設けｆＤＮＡ断片との結合によ
る組み換え体ＤＮＡ分子の作成は、下記の様にして行っ
た。すなわち、α−アミラーゼ構造遺伝子を溶解し之Ｄ
ＮＡバッファー１０μｔとエキソヌクレアーゼ処理ｎＮ
入浴ｇ１ｏμｔとを、火陥ＴＩＩ Ｔ４ ’Ｊガーゼ（
全酒造製）１０単位を用いて１０℃で１８時間反応させ
、組み換え体ＤＮＡ分子を作成し７ｊ （ｍ７図（ｄ）
）。この反応系の組成は、６（ＳＩＴＩＭ ）リスー塩
酸緩伽液（ｐＨ７，ｓ ）４６ｍＭＭｇ（！ｌ □、
１０ｍＭジチオスレイトール、２ｍＭ ＡＴＰ （ア
デノシン三リン酸）である。組み換え体ＤＮＡ分子を用
いてバチルス・ズブチリスをプロトプラスト法（Ｃｈａ
ｎｇ、Ｓ ＆ Ｃｏｈｅｎ、Ｓ、Ｎ、、Ｍｏ１．Ｇｅｎ
。
遺伝子を含むプラスミドｐＡＭ２９を用いてＡＭＪ＃し
た。プラスミドｐＡＭ２９は、α−アミラーゼの分泌に
関与する分泌シグナル部分を削除した成熟型α−アミラ
ーゼをコードするＤＮＡ塩基配列のＮ−末端側に制限酵
素ＳｍａＩ切断部位、制限酵素ＢａｍＨ工切断部位を、
またＣ末端側に制限酵素Ｈｉｎｄエエエ切断部位、制限
酵素Ｐｖｕ Ｘ Ｘ切断部位が存在するように、合成り
ＮＡｉ用いて造成し友ものである。該プラスミド（１０
μ２）全制限酵素８口１ａ工（全酒造ｌ！り１０単位と
制限酵素Ｐｖｕエエ（全酒造製）１０単位とで分解した
のち、１％アガロースゲル電気泳動を行って、１７００
塩基対から成るα−アミラーゼの分泌に関与する分泌シ
グナル部分を削除し念成熟型α−アミラーゼをコードす
るＤＮＡ塩基配列で、そのＮ末端には制限酵素ＢａｍＨ
工切断部位をま念、七のＣ末端には制限酵素Ｈｉｎｄエ
エエ切断部位を有するＤＮＡ断片（以後、α−アミラー
ゼ構造遺伝子と称す。）ｔ−６μｆｖＩ４製し友（第７
図（ｃ））。これを、５０μｔのＤＮＡバッファーに溶
解した。ここで、得られ定ＤＮＡ断片と先に述べたｐＮ
Ｐ１５０のプレプロペプチドをコードするＤＮＡ塩基配
列に種々の長さの欠失を設けｆＤＮＡ断片との結合によ
る組み換え体ＤＮＡ分子の作成は、下記の様にして行っ
た。すなわち、α−アミラーゼ構造遺伝子を溶解し之Ｄ
ＮＡバッファー１０μｔとエキソヌクレアーゼ処理ｎＮ
入浴ｇ１ｏμｔとを、火陥ＴＩＩ Ｔ４ ’Ｊガーゼ（
全酒造製）１０単位を用いて１０℃で１８時間反応させ
、組み換え体ＤＮＡ分子を作成し７ｊ （ｍ７図（ｄ）
）。この反応系の組成は、６（ＳＩＴＩＭ ）リスー塩
酸緩伽液（ｐＨ７，ｓ ）４６ｍＭＭｇ（！ｌ □、
１０ｍＭジチオスレイトール、２ｍＭ ＡＴＰ （ア
デノシン三リン酸）である。組み換え体ＤＮＡ分子を用
いてバチルス・ズブチリスをプロトプラスト法（Ｃｈａ
ｎｇ、Ｓ ＆ Ｃｏｈｅｎ、Ｓ、Ｎ、、Ｍｏ１．Ｇｅｎ
。
Ｇｅｎｅｔ、、 １６８１１１（１９７Ｂ） ）によ
り形質転換した。
り形質転換した。
該プロトプラスト再生培地には、硫酸カナマイシン（ペ
ーリンガー・マンハイム社製）ｔａｏｏμ？／ ａｔ
、および可溶性デンプンを最終の＃度１チになるように
加え友。形質転換に用いた宿王菌に、アミラーゼ生産能
を欠くバチルス・ズブチリス１人２８９株（オハイオ大
学、バチルスストックセンター保存株）を用いた。アミ
ラーゼを分泌産生じている形質転換株の選択に、ヨード
・ヨードカリ法（、ｒ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １１９４
１６ （１９７４） ）により行つ友。その台来、アミ
ラーゼ全分泌産生している形質転換株を７８株得ｔ０こ
れらの株をＢＹ培地（Ｑ、５％肉エキス、０．２％イー
スト・エクストラクト、Ｑ、２％Ｍａｉｌ、１％ポリペ
プトン２よびカナマイシン５．μＷ ／ ｘｉ ）で３
７℃で１０時間振とう培養した後、遠心分ｉａ法によＶ
固体と培養上ｍとに分離し友。次に、培養土ｆｆｌに存
在するα−アミラーゼの活性を、ジニトロサリチル酸を
用いる四層性デンプンからの還元基の生ａ ｋ ｒＡべ
ろ方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｉｎｆｏｒｍａｔｉ
ｏｎ 工工ｐ２８−４０ ペーリンガー・マンハイム
社喪カタログ）により行った。
ーリンガー・マンハイム社製）ｔａｏｏμ？／ ａｔ
、および可溶性デンプンを最終の＃度１チになるように
加え友。形質転換に用いた宿王菌に、アミラーゼ生産能
を欠くバチルス・ズブチリス１人２８９株（オハイオ大
学、バチルスストックセンター保存株）を用いた。アミ
ラーゼを分泌産生じている形質転換株の選択に、ヨード
・ヨードカリ法（、ｒ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １１９４
１６ （１９７４） ）により行つ友。その台来、アミ
ラーゼ全分泌産生している形質転換株を７８株得ｔ０こ
れらの株をＢＹ培地（Ｑ、５％肉エキス、０．２％イー
スト・エクストラクト、Ｑ、２％Ｍａｉｌ、１％ポリペ
プトン２よびカナマイシン５．μＷ ／ ｘｉ ）で３
７℃で１０時間振とう培養した後、遠心分ｉａ法によＶ
固体と培養上ｍとに分離し友。次に、培養土ｆｆｌに存
在するα−アミラーゼの活性を、ジニトロサリチル酸を
用いる四層性デンプンからの還元基の生ａ ｋ ｒＡべ
ろ方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｉｎｆｏｒｍａｔｉ
ｏｎ 工工ｐ２８−４０ ペーリンガー・マンハイム
社喪カタログ）により行った。
この方法により、得られた形質転換株の中から最も多量
に（ｔＪｆ性株の３００倍）α−アミラーゼを菌体外へ
分泌する形質転換株（φ８４）を選択しｔ０該形質転換
株（峰８４）から、アルカリ法（Ｂｉｒｎ−ｂｏｉ＋ｎ
、Ｈ，Ｏ，らａｕｃｌｅｉｃ、Ａｃ１ｄｓ、Ｒｅｓ、７
１５１５ （１９７９） ）で組み換え体ＤＮＡ分子（
ｐＮＰＡ８４ ）を得た。該組み換え体ＤＮＡ分子（ｆ
）ＮＰＡ８４ ）のＤＮＡ塩基配列をマキサム・ギルバ
ート法（ＭａＸａ弓ＡＪＩ−＆ Ｇ１１ｂｅｒｔ、 ｗ
、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ 、Ａｃａｄ、８ｃｉ、Ｕ、８゜
Ａ、 ７４５６０（１９７７） ）で決定し友。その結
果、ｐＮＰＡ８４は、第１図に示したＤＮＡ塩基配列か
らなるＤＮＡ断片の下流にα−アミラーゼ構造遺伝子が
結合し九プラスミドであることが判明した。
に（ｔＪｆ性株の３００倍）α−アミラーゼを菌体外へ
分泌する形質転換株（φ８４）を選択しｔ０該形質転換
株（峰８４）から、アルカリ法（Ｂｉｒｎ−ｂｏｉ＋ｎ
、Ｈ，Ｏ，らａｕｃｌｅｉｃ、Ａｃ１ｄｓ、Ｒｅｓ、７
１５１５ （１９７９） ）で組み換え体ＤＮＡ分子（
ｐＮＰＡ８４ ）を得た。該組み換え体ＤＮＡ分子（ｆ
）ＮＰＡ８４ ）のＤＮＡ塩基配列をマキサム・ギルバ
ート法（ＭａＸａ弓ＡＪＩ−＆ Ｇ１１ｂｅｒｔ、 ｗ
、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ 、Ａｃａｄ、８ｃｉ、Ｕ、８゜
Ａ、 ７４５６０（１９７７） ）で決定し友。その結
果、ｐＮＰＡ８４は、第１図に示したＤＮＡ塩基配列か
らなるＤＮＡ断片の下流にα−アミラーゼ構造遺伝子が
結合し九プラスミドであることが判明した。
該α−アミラーゼ構造遺伝子は、それ自身の発現および
分泌に関与する領域を欠いている。このことから、第１
図に示したＩ）ＮＡ塩基配列を有するＤＮＡ断片に、遺
伝子を発現させその結果産生されｆｃｉｊｉ白質を極め
て効率よく分泌させる機能を有していることが明らかに
なり友。
分泌に関与する領域を欠いている。このことから、第１
図に示したＩ）ＮＡ塩基配列を有するＤＮＡ断片に、遺
伝子を発現させその結果産生されｆｃｉｊｉ白質を極め
て効率よく分泌させる機能を有していることが明らかに
なり友。
実施例５
第８図に示しｔ工程に従った組み換え体ＤＩＮ！・Ａ・
。
。
分子ｐＷＢ８４〆の作成法
実施例４により第１図に示したＤＮＡ塩基配列は異種遺
伝子の発現・分泌に有効であることが判明しｔｏぞこで
この領域を有する組み換え体ＤＮＡ分子すなわち、中性
プロテアーゼ遺伝子の発現およびその結果産生された蛋
白質の分泌に関与する領域の下流に、所望の蛋白質の遺
伝子が結合可能な制限酵素切断部位を有するＤＮＡ塩基
配列が結合し、かつ、バチルス属細菌で複製可能な組み
換え体ＤＮＡ分子ｐＥＳ８４を創製し友。以下、その創
製法（第８図）を示す。
伝子の発現・分泌に有効であることが判明しｔｏぞこで
この領域を有する組み換え体ＤＮＡ分子すなわち、中性
プロテアーゼ遺伝子の発現およびその結果産生された蛋
白質の分泌に関与する領域の下流に、所望の蛋白質の遺
伝子が結合可能な制限酵素切断部位を有するＤＮＡ塩基
配列が結合し、かつ、バチルス属細菌で複製可能な組み
換え体ＤＮＡ分子ｐＥＳ８４を創製し友。以下、その創
製法（第８図）を示す。
中性プロテアーゼ遺伝子の発現およびその結果°産生さ
れた蛋白質の分泌に関与する領域の調製は、実施例５の
第１図に示し７’ＣＤＮＡ塩基配列を含配列ＮＡ断片を
有する組み換え体ＤＮＡ分子ｐＮＰＡ８４を用いて行り
几。該組み換え体ＤＮＡ分子ｐＮＰＡ８４ＤＮＡを形質
転換株（す８４）よりアルカリ法（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ、
Ｈ，Ｃ，らＮｕｃｌｅｉｃ、Ａｃ１ｄｓ、Ｒｅｓ、 ７
１５１Ｍ （１９７９） ）で２μを調製した。続い
て、このＤＮＡを１０μｔのＤＮＡバクファーに溶解さ
せ友。
れた蛋白質の分泌に関与する領域の調製は、実施例５の
第１図に示し７’ＣＤＮＡ塩基配列を含配列ＮＡ断片を
有する組み換え体ＤＮＡ分子ｐＮＰＡ８４を用いて行り
几。該組み換え体ＤＮＡ分子ｐＮＰＡ８４ＤＮＡを形質
転換株（す８４）よりアルカリ法（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ、
Ｈ，Ｃ，らＮｕｃｌｅｉｃ、Ａｃ１ｄｓ、Ｒｅｓ、 ７
１５１Ｍ （１９７９） ）で２μを調製した。続い
て、このＤＮＡを１０μｔのＤＮＡバクファーに溶解さ
せ友。
このｐＮＰＡ８４ＤＮＡ ｆｔ含む溶液１０μｔを制限
酵素ＢａｍＨ工（宝酒造製）と制限酵素Ｈｉ ｎｄエエ
エ（宝酒造製）で分解し友のち（第８図（ａ））、アガ
ロースゲル電気体拘法により、α−アミラーゼ構造遺伝
子を削除し７’ｊＤＮＡ断片（以後、ＤＮＡ断片Ｃと称
す。）α２μ２を調製し、（第８図（ｂ））。これを２
μｔのＤＮＡバッファーで＃＋解し友。
酵素ＢａｍＨ工（宝酒造製）と制限酵素Ｈｉ ｎｄエエ
エ（宝酒造製）で分解し友のち（第８図（ａ））、アガ
ロースゲル電気体拘法により、α−アミラーゼ構造遺伝
子を削除し７’ｊＤＮＡ断片（以後、ＤＮＡ断片Ｃと称
す。）α２μ２を調製し、（第８図（ｂ））。これを２
μｔのＤＮＡバッファーで＃＋解し友。
次に、所望の蛋白質を結合させることが可能な制限酵素
切ｌＩ、ｌｒ部位を有するＤＮＡ断片の化学合成を以下
のように行った（第８図（Ｃ））。
切ｌＩ、ｌｒ部位を有するＤＮＡ断片の化学合成を以下
のように行った（第８図（Ｃ））。
所望の蛋白質を結合させることが可能な制限酵素切断部
位を有するＤＮＡ断片−の塩基配列は、第１６図に示し
友ごとくである。ｇ（１１ｓ図に示しｔＤ Ｎ Ａ 、
ｔｇ基配列の両方の鎖をそれぞれ定法に従い化学合成し
精夷し之（大塚栄子、化学の領域、３５（１０） ７６
２ （１９８１） ）。合成りＮＡ １μ２をそれぞ
れ１０μｔのＤＮＡバッファーに溶解させた。次に、画
一本領ＤＮＡ間で再構成を行わせ第１３図に示したＤＮ
Ａ塩基配列を有する二本鎖ＤＮＡを得た。再構成は、一
本領ＤＮＡを含むそれぞれ５μｔを混合後、９０℃で５
分間処理し、更に、０℃で１時間放置する方法により二
本鎖ＤＮＡを作成し友。（５ｇ８図（Ｃ）） 前述の二本鎖ＤＮＡｆｔ含むＴＩ８液１０μｔとＤＮＡ
断片Ａを含む溶液２μｔを大腸菌Ｔ４Ｉ）ＮＡＵガーゼ
（宝酒造尖）１０単位を用いて、４℃で１６１Ｅ！ｆ間
反応させることにより（第８凶（ｄ） ） 、合成二本
ｉＱ Ｄ Ｎ ＡとＤＮＡ断片Ａとからなる組み換え体
ＤＮＡ分子を作成した。この反応系の組成は、６μ５ｍ
Ｍトリスー塩酸緩衝！ｉ （ｐＨ７，５） 、 ６．
６ｍＭｙｇｃｌ□、Ｉ ＤｍＭ ジチオスレイトール
、２＋ｎＭ ＡＴＰ （アデノシン三リン酸）である。
位を有するＤＮＡ断片−の塩基配列は、第１６図に示し
友ごとくである。ｇ（１１ｓ図に示しｔＤ Ｎ Ａ 、
ｔｇ基配列の両方の鎖をそれぞれ定法に従い化学合成し
精夷し之（大塚栄子、化学の領域、３５（１０） ７６
２ （１９８１） ）。合成りＮＡ １μ２をそれぞ
れ１０μｔのＤＮＡバッファーに溶解させた。次に、画
一本領ＤＮＡ間で再構成を行わせ第１３図に示したＤＮ
Ａ塩基配列を有する二本鎖ＤＮＡを得た。再構成は、一
本領ＤＮＡを含むそれぞれ５μｔを混合後、９０℃で５
分間処理し、更に、０℃で１時間放置する方法により二
本鎖ＤＮＡを作成し友。（５ｇ８図（Ｃ）） 前述の二本鎖ＤＮＡｆｔ含むＴＩ８液１０μｔとＤＮＡ
断片Ａを含む溶液２μｔを大腸菌Ｔ４Ｉ）ＮＡＵガーゼ
（宝酒造尖）１０単位を用いて、４℃で１６１Ｅ！ｆ間
反応させることにより（第８凶（ｄ） ） 、合成二本
ｉＱ Ｄ Ｎ ＡとＤＮＡ断片Ａとからなる組み換え体
ＤＮＡ分子を作成した。この反応系の組成は、６μ５ｍ
Ｍトリスー塩酸緩衝！ｉ （ｐＨ７，５） 、 ６．
６ｍＭｙｇｃｌ□、Ｉ ＤｍＭ ジチオスレイトール
、２＋ｎＭ ＡＴＰ （アデノシン三リン酸）である。
これらの組み藺え体ＤＮＡ分子を用いて、プロトプラス
ト法（ｍ述）でバチルス・ズブチリスＩ Ａ２８９床全
形質転換し、該形質転換株から、アルカリ法（前述）で
組み換えＤＮＡ分子をイξすた。該組み慄え体ＤＮＡ分
子のＤＮＡ塩基配列をマキサム・ギルバート法（前述）
で決定した。七のＭ来、該組み換え体ＤＮＡ分子は中性
プロテアーゼ遺伝子の発現およびその結果産生された蛋
白質の分泌に関与する領域の下流に１１゛ Ａ断片を有する組み換え体ＤＮＡ分子ｐＥＳ８４％であ
ることが判明した。さらに、組み換え体ＤＮＡ実施例６ 第１０図に示した工程に従った本発明の組み換え体ＤＮ
Ａ分子ｐｈＧＨ９２Ｂを用いたヒト成長ホルモ７遺伝子
のバチルス・ズブチリスにおける発現とヒト成長ホルモ
ンの分泌生産 ヒト成長ホルモン遺伝子は、実施例５で示した該遺伝子
を含むプラスミドｐｈＧＨ２Ｄを用いて調製した。前述
のように、該プラスミドｐｈＧＨ２０を制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩ （全酒造製）と制限酵素ＰｖｕＩＩ （全酒造製
）とで分解し、約９００塩基対のヒト成長ホルモンをコ
ードするＤＮＡｍＮＡｍ全配列ＤＮＡ塩基配列（前述、
ＤＮＡ断片Ａ）を調製した（第１ｏ１９（ａ））。次に
、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（宝′ｒｆＵ造製）を用いて
ｔＪＩ Ｄ Ｎ Ａ断片Ｂの両末端を平滑末端で切断し
く第１０図（Ｃ） ） 、次いで、生じた両末端をＴ４
ＤＮＡポリメラーゼ（全酒造製）を用いて平滑末端とし
く第１０図（ｄ））、ＤＮＡｗｒ片（Ｄ Ｎ Ａｍ片Ｅ
）ｔ−得た（いずれの反応系及び反応条件も前述の４り
である）。このようにして得られたＤＮＡ＃片Ａ （（
１１μｔ）とＤＮＡ断片Ｅ（α１μ２）とを、大腸菌”
４ＤＮＡ！Ｊガーゼ（全酒造製）を用いて反応させ、組
み侯え体ＤＮＡ分子を作成した（第１０図（ｅ）Ｌ（反
応条件、反応系の組成は、前述の通り）。該組み換え体
ＤＮＡ分子を用い、バチルス・ズブチリス（ＭＴ−０２
０７） ｅプロトプラスト法（前述）により、形質転換
し形質転換株（ＭＴ−０９２８）を得友。次に、該形質
転換株（ＭＴ−０９２８）をペンアッセイ培地（Ｄｉｆ
ＣＯ社製）を用いて、３０℃で１６時間撮とう培養した
後、遠心分離法により培養上清と菌体を分離した。培養
土ｍに含まれるヒト成長ホルモンの免疫活性の測定には
、抗ヒト成長ホルモン血清を用い几酵素免疫測定法（前
述）を用い友。該形質転換株（ＭＴ−０９２８）の培養
上清に、ヒト成長ホルモンに対する免役活性が認められ
友。その分泌生産量に、３０■／ｌでめった。
ト法（ｍ述）でバチルス・ズブチリスＩ Ａ２８９床全
形質転換し、該形質転換株から、アルカリ法（前述）で
組み換えＤＮＡ分子をイξすた。該組み慄え体ＤＮＡ分
子のＤＮＡ塩基配列をマキサム・ギルバート法（前述）
で決定した。七のＭ来、該組み換え体ＤＮＡ分子は中性
プロテアーゼ遺伝子の発現およびその結果産生された蛋
白質の分泌に関与する領域の下流に１１゛ Ａ断片を有する組み換え体ＤＮＡ分子ｐＥＳ８４％であ
ることが判明した。さらに、組み換え体ＤＮＡ実施例６ 第１０図に示した工程に従った本発明の組み換え体ＤＮ
Ａ分子ｐｈＧＨ９２Ｂを用いたヒト成長ホルモ７遺伝子
のバチルス・ズブチリスにおける発現とヒト成長ホルモ
ンの分泌生産 ヒト成長ホルモン遺伝子は、実施例５で示した該遺伝子
を含むプラスミドｐｈＧＨ２Ｄを用いて調製した。前述
のように、該プラスミドｐｈＧＨ２０を制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩ （全酒造製）と制限酵素ＰｖｕＩＩ （全酒造製
）とで分解し、約９００塩基対のヒト成長ホルモンをコ
ードするＤＮＡｍＮＡｍ全配列ＤＮＡ塩基配列（前述、
ＤＮＡ断片Ａ）を調製した（第１ｏ１９（ａ））。次に
、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（宝′ｒｆＵ造製）を用いて
ｔＪＩ Ｄ Ｎ Ａ断片Ｂの両末端を平滑末端で切断し
く第１０図（Ｃ） ） 、次いで、生じた両末端をＴ４
ＤＮＡポリメラーゼ（全酒造製）を用いて平滑末端とし
く第１０図（ｄ））、ＤＮＡｗｒ片（Ｄ Ｎ Ａｍ片Ｅ
）ｔ−得た（いずれの反応系及び反応条件も前述の４り
である）。このようにして得られたＤＮＡ＃片Ａ （（
１１μｔ）とＤＮＡ断片Ｅ（α１μ２）とを、大腸菌”
４ＤＮＡ！Ｊガーゼ（全酒造製）を用いて反応させ、組
み侯え体ＤＮＡ分子を作成した（第１０図（ｅ）Ｌ（反
応条件、反応系の組成は、前述の通り）。該組み換え体
ＤＮＡ分子を用い、バチルス・ズブチリス（ＭＴ−０２
０７） ｅプロトプラスト法（前述）により、形質転換
し形質転換株（ＭＴ−０９２８）を得友。次に、該形質
転換株（ＭＴ−０９２８）をペンアッセイ培地（Ｄｉｆ
ＣＯ社製）を用いて、３０℃で１６時間撮とう培養した
後、遠心分離法により培養上清と菌体を分離した。培養
土ｍに含まれるヒト成長ホルモンの免疫活性の測定には
、抗ヒト成長ホルモン血清を用い几酵素免疫測定法（前
述）を用い友。該形質転換株（ＭＴ−０９２８）の培養
上清に、ヒト成長ホルモンに対する免役活性が認められ
友。その分泌生産量に、３０■／ｌでめった。
該形質転換株（ＭＴ−０９２８）から、組み換え体ＤＮ
Ａ分子を調製して調べた結果、第１１図に示すもの（ｐ
ｈＧＨ９２Ｂと命名）でろることか確認されｔ０ｐｈＧ
Ｈ９２ＢＤＮＡのＤＮＡ塩基配列をマキサム・ギルバー
トｆ：（前述）で決定し友。その結果、該組み換え体Ｄ
ＮＡ分子ｐｈＧＨ９２８に、第１図に示し友遺伝子の発
現およびその結果産生され之蛋白質の分泌に関与するＤ
ＮＡ塩基配列の下流に、ヒト成長ホルモンをコードする
ＤＮＡ塩ｉｋ配列が、合成りＮ Ａ リンカ−を介して
結合しているＤＮＡ塩基配列（第１２図）を含んでいる
組み換え体Ｄ Ｎ Ａｌｌ子であることが認められた。
Ａ分子を調製して調べた結果、第１１図に示すもの（ｐ
ｈＧＨ９２Ｂと命名）でろることか確認されｔ０ｐｈＧ
Ｈ９２ＢＤＮＡのＤＮＡ塩基配列をマキサム・ギルバー
トｆ：（前述）で決定し友。その結果、該組み換え体Ｄ
ＮＡ分子ｐｈＧＨ９２８に、第１図に示し友遺伝子の発
現およびその結果産生され之蛋白質の分泌に関与するＤ
ＮＡ塩基配列の下流に、ヒト成長ホルモンをコードする
ＤＮＡ塩ｉｋ配列が、合成りＮ Ａ リンカ−を介して
結合しているＤＮＡ塩基配列（第１２図）を含んでいる
組み換え体Ｄ Ｎ Ａｌｌ子であることが認められた。
第１図は、組み換え体ＤＮＡ分子ｐＦｉ８８４．ｉ／に
含Ｉまれる遺伝子の発現及びその結果産 生された蛋白質の分泌に関与するＤ ＮＡ塩基配列を示す図でら９、 ＠２図は、組み換え体ＤＮＡ分子ｐＫ８１５０に含まれ
る遺伝子の発現及びその結果余 生され之蛋白質の分泌に関与するＤ ＮＡ塩基配列を示す図であり、 第５図は、組み換え体ＤＮＡ分子ｐＥＳ１５（］。 ｐＢｓ１５０、ｐｓＢｌ ５０の作成法を示す図であり
、 第４図は、制限酵素切断部位を有するＤＮＡ断片を示す
図でめ９、 第５図に、組み換え体ＤＮＡ分子ｐＥｓ１５Ｑ−ＧＨの
作成法を示す図でめり、 第６図は、組み換え体ＤＮＡ分子ｐＫｓ１５０−ＧＨの
制限酵素地図を示す図であり、 第７図は、中性プロテアーゼのプレグロタンパクをコー
ドするＤ Ｎ Ａ 塩基配列に種々の長さの欠失を設け
たＤＮＡ１ｌ／ｉ片を作成法を示す図であり、 第９図に、組み襖え体ＤＮＡ分子ｐｇｓ１５Ｏ−ＧＨに
含１れているＤＮＡ塩基配列を示す図で あり、 ；４罵１０図は、組み換え体ＤＮＡ分子ｐｈＧＨ９２Ｂ
の作成法を示す図であり、 刀１１図は、組み換え体ＤＮＡ分子ｐｈＧＨ９２８に含
１れているＤＮＡ塩基配列を示す図であ り１ 、Ｊ１２図は、組み換え体ＤＮＡ分子ｐｈＧＨ９２Ｂの
制限酵素地図を示す図で８９、 第１３図に、制限酵素切〃ｒ部位を有するＤＮＡ断片を
示す図でるる。 なお、第１図、第２図、第４図、第９図、：”ＦＳ １
１図、第１３図において、ＡＨ、アデニンを、Ｃは、ヒ
トシンｋ、ａＶｘ、グアニンを、Ｔ（グ、チミンをそれ
ぞれ示す。 また、第５図、第５図、第６図、第７図、第８図、り；
１０図、第１２図において Ｐｌｉ、中性プロテアーゼ遺伝子の発現に関与する与す
る領域であり、 Ｍａｔ、 ＩＱ、Ｐ性プロテアーゼをコードするＤＮＡ
塩基配列でおり、 アミで囲った部分は、α−アミラーゼをコードするＤＮ
Ａ塩基配列でめジ、 ぬり潰した部分は、ヒト成長ホルモンをコードするＤＮ
Ａ塩基配列でめり、 小さいｖ′：Ｊ−を記入し７ｔ、部分は、第１３図に示
すＤＮＡ塩基配列からなるフラグメントである。 第１図 １１Ｌ、１１１１りしハし＋ｂし＋ ＩＭＡＡ ＣＡＩ
ＧＧＣＴＴＣＧ ＴＡＡＧＡＡＡＣＣＡ ＣＧＴＴ３Ｇ
ＡＧＴＣＧＡＡＴ
含Ｉまれる遺伝子の発現及びその結果産 生された蛋白質の分泌に関与するＤ ＮＡ塩基配列を示す図でら９、 ＠２図は、組み換え体ＤＮＡ分子ｐＫ８１５０に含まれ
る遺伝子の発現及びその結果余 生され之蛋白質の分泌に関与するＤ ＮＡ塩基配列を示す図であり、 第５図は、組み換え体ＤＮＡ分子ｐＥＳ１５（］。 ｐＢｓ１５０、ｐｓＢｌ ５０の作成法を示す図であり
、 第４図は、制限酵素切断部位を有するＤＮＡ断片を示す
図でめ９、 第５図に、組み換え体ＤＮＡ分子ｐＥｓ１５Ｑ−ＧＨの
作成法を示す図でめり、 第６図は、組み換え体ＤＮＡ分子ｐＫｓ１５０−ＧＨの
制限酵素地図を示す図であり、 第７図は、中性プロテアーゼのプレグロタンパクをコー
ドするＤ Ｎ Ａ 塩基配列に種々の長さの欠失を設け
たＤＮＡ１ｌ／ｉ片を作成法を示す図であり、 第９図に、組み襖え体ＤＮＡ分子ｐｇｓ１５Ｏ−ＧＨに
含１れているＤＮＡ塩基配列を示す図で あり、 ；４罵１０図は、組み換え体ＤＮＡ分子ｐｈＧＨ９２Ｂ
の作成法を示す図であり、 刀１１図は、組み換え体ＤＮＡ分子ｐｈＧＨ９２８に含
１れているＤＮＡ塩基配列を示す図であ り１ 、Ｊ１２図は、組み換え体ＤＮＡ分子ｐｈＧＨ９２Ｂの
制限酵素地図を示す図で８９、 第１３図に、制限酵素切〃ｒ部位を有するＤＮＡ断片を
示す図でるる。 なお、第１図、第２図、第４図、第９図、：”ＦＳ １
１図、第１３図において、ＡＨ、アデニンを、Ｃは、ヒ
トシンｋ、ａＶｘ、グアニンを、Ｔ（グ、チミンをそれ
ぞれ示す。 また、第５図、第５図、第６図、第７図、第８図、り；
１０図、第１２図において Ｐｌｉ、中性プロテアーゼ遺伝子の発現に関与する与す
る領域であり、 Ｍａｔ、 ＩＱ、Ｐ性プロテアーゼをコードするＤＮＡ
塩基配列でおり、 アミで囲った部分は、α−アミラーゼをコードするＤＮ
Ａ塩基配列でめジ、 ぬり潰した部分は、ヒト成長ホルモンをコードするＤＮ
Ａ塩基配列でめり、 小さいｖ′：Ｊ−を記入し７ｔ、部分は、第１３図に示
すＤＮＡ塩基配列からなるフラグメントである。 第１図 １１Ｌ、１１１１りしハし＋ｂし＋ ＩＭＡＡ ＣＡＩ
ＧＧＣＴＴＣＧ ＴＡＡＧＡＡＡＣＣＡ ＣＧＴＴ３Ｇ
ＡＧＴＣＧＡＡＴ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、遺伝子の発現およびその結果産生された蛋白質の分
泌に関与する領域を含むＤＮＡ塩基配列の下流に、ヒト
成長ホルモンをコードする遺伝子を含むＤＮＡ塩基配列
を結合させたＤＮＡ塩基配列が、バチルス属で複製可能
なプラスミド、または、それに由来するＤＮＡ塩基配列
に結合していることを特徴とする組み換え体ＤＮＡ分子 ２、遺伝子の発現およびその結果産生された蛋白質の分
泌に関与する領域を含むＤＮＡ塩基配列が、バチルス属
細菌の菌体外プロテアーゼ遺伝子に由来することを特徴
とする特許請求の範囲第１項に記載の組み換え体ＤＮＡ
分子 ３、バチルス属細菌が、バチルス・アミロリキファシエ
ンスに由来することを特徴とする特許請求の範囲第２項
に記載の組み換え体ＤＮＡ分子４、菌体外プロテアーゼ
が、中性プロテアーゼに由来することを特徴とする特許
請求の範囲第２項に記載の組み換え体ＤＮＡ分子 ５、遺伝子の発現およびその結果産生された蛋白質の分
泌に関与する領域を含むＤＮＡ塩基配列の下流に、ヒト
成長ホルモンをコードする遺伝子を含むＤＮＡ塩基配列
を結合させたＤＮＡ塩基配列の片方の鎖が下記に示す順
序であることを特徴とするＤＮＡ塩基配列が、バチルス
属細菌で複製可能なプラスミド、または、それに由来す
るＤＮＡ塩基配列に結合していることを特徴とする組み
換え体ＤＮＡ分子 【遺伝子配列があります】 ６、遺伝子の発現およびその結果産生された蛋白質の分
泌に関与する領域を含むＤＮＡ塩基配列の下流に、ヒト
成長ホルモンをコードする遺伝子を含むＤＮＡ塩基配列
を結合させたＤＮＡ塩基配列の片方の鎖が下記に示す順
序であることを特徴とするＤＮＡ塩基配列が、バチルス
属細菌で複製可能なプラスミド、または、それに由来す
るＤＮＡ塩基配列に結合していることを特徴とする組み
換え体ＤＮＡ分子 【遺伝子配列があります】 ７、特許請求の範囲第５項および第６項に記載の遺伝子
の発現およびその結果産生された蛋白質の分泌に関与す
る領域を含むＤＮＡ塩基配列の下流に、ヒト成長ホルモ
ンをコードする遺伝子を含むＤＮＡ塩基配列を結合させ
たＤＮＡ塩基配列の一部を塩基の削除、挿入、転移等を
行うことにより得られるＤＮＡ塩基配列が、バチルス属
細菌で複製可能なプラスミドまたは、それに由来するＤ
ＮＡ塩基配列に結合していることを特徴とする組み換え
体ＤＮＡ分子。 ８、特許請求の範囲第５項に記載の遺伝子の発現および
その結果産生された蛋白質の分泌に関与する領域を含む
ＤＮＡ塩基配列の下流に、ヒト成長ホルモンをコードす
る遺伝子を含むＤＮＡ塩基配列を結合させたＤＮＡ塩基
配列が、バチルス属細菌で複製可能なプラスミドｐＵＢ
１１０に由来するＤＮＡ塩基配列に結合していることを
特徴とする組み換え体ＤＮＡ分子ｐｈＧＨ９２８ ９、特許請求の範囲第６項に記載の遺伝子の発現および
その結果産生された蛋白質の分泌に関与する領域を含む
ＤＮＡ塩基配列の下流に、ヒト成長ホルモンをコードす
る遺伝子を含むＤＮＡ塩基配列を結合させたＤＮＡ塩基
配列が、バチルス属細菌で複製可能なプラスミドｐＵＢ
１１０に由来するＤＮＡ塩基配列に結合していることを
特徴とする組み換え体ＤＮＡ分子ｐＥＳ１５０ＧＨ １０、特許請求の範囲第１項から第９項に記載のいずれ
かの組み換え体ＤＮＡ分子で形質転換した微生物 １１、形質転換される微生物がバチルス属細菌であるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第１０項に記載のいずれ
かの微生物 １２、組み換え体ＤＮＡ分子を用いて、バチルス属細菌
を形質転換し、得られた形質転換株を培養しその培養上
清からヒト成長ホルモンを回収することを特徴とするヒ
ト成長ホルモンの生産法 １３、組み換え体ＤＮＡ分子が、特許請求の範囲第１項
から第９項に記載のいずれかの組み換え体ＤＮＡ分子で
あることを特徴とする特許請求の範囲第１２項に記載の
ヒト成長ホルモンの生産法。 １４、形質転換株が、特許請求の範囲第１０項、または
、第１１項に記載のいずれかの微生物であることを特徴
とする特許請求の範囲第１２項に記載のヒト成長ホルモ
ンの生産法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61003499A JP2500312B2 (ja) | 1986-01-13 | 1986-01-13 | ヒト成長ホルモンの生産法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61003499A JP2500312B2 (ja) | 1986-01-13 | 1986-01-13 | ヒト成長ホルモンの生産法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62163691A true JPS62163691A (ja) | 1987-07-20 |
| JP2500312B2 JP2500312B2 (ja) | 1996-05-29 |
Family
ID=11559040
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61003499A Expired - Lifetime JP2500312B2 (ja) | 1986-01-13 | 1986-01-13 | ヒト成長ホルモンの生産法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2500312B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02446A (ja) * | 1987-08-07 | 1990-01-05 | Eniricerche Spa | ヒト成長ホルモンの製法 |
| WO1997017991A1 (fr) * | 1995-11-15 | 1997-05-22 | Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited | Medicament contre l'insuffisance hepatique aigue |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5636499A (en) * | 1979-06-01 | 1981-04-09 | Univ California | Dna introduced vector |
| JPS60203194A (ja) * | 1984-03-27 | 1985-10-14 | Takeda Chem Ind Ltd | Ｄνａ |
| JPS60210986A (ja) * | 1984-04-03 | 1985-10-23 | Agency Of Ind Science & Technol | 蛋白の発現と分泌に関与する領域を含むｄｎａ配列 |
-
1986
- 1986-01-13 JP JP61003499A patent/JP2500312B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5636499A (en) * | 1979-06-01 | 1981-04-09 | Univ California | Dna introduced vector |
| JPS60203194A (ja) * | 1984-03-27 | 1985-10-14 | Takeda Chem Ind Ltd | Ｄνａ |
| JPS60210986A (ja) * | 1984-04-03 | 1985-10-23 | Agency Of Ind Science & Technol | 蛋白の発現と分泌に関与する領域を含むｄｎａ配列 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02446A (ja) * | 1987-08-07 | 1990-01-05 | Eniricerche Spa | ヒト成長ホルモンの製法 |
| WO1997017991A1 (fr) * | 1995-11-15 | 1997-05-22 | Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited | Medicament contre l'insuffisance hepatique aigue |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2500312B2 (ja) | 1996-05-29 |
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|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |