JPS60203194A - Dνa - Google Patents

Dνa

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JPS60203194A
JPS60203194A JP59060375A JP6037584A JPS60203194A JP S60203194 A JPS60203194 A JP S60203194A JP 59060375 A JP59060375 A JP 59060375A JP 6037584 A JP6037584 A JP 6037584A JP S60203194 A JPS60203194 A JP S60203194A
Authority
JP
Japan
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promoter
neutral protease
dna
gene
region
Prior art date
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Pending
Application number
JP59060375A
Other languages
English (en)
Inventor
Masakazu Kikuchi
正和 菊池
Kazuo Nakahama
中浜 一雄
Koji Yoshimura
浩二 吉村
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Takeda Chemical Industries Ltd
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Publication date
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Priority to KR1019850000022A priority patent/KR850005497A/ko
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    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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    • C07K14/555Interferons [IFN]
    • C07K14/57IFN-gamma
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    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
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    • C12N15/625DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
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    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
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    • C12N15/75Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はDNAに関する。。
今日まで多くの組み換えDNA研究は大腸菌(E、 c
oli) k用いてなされており、すでに多くの異種遺
伝子が大腸菌内で発現されている。しかし、この方法で
は発現された遺伝子産物が菌体内に蓄積される。したが
って目的とする遺伝子産物を純粋な杉で取得するまでの
過程で、目的物の菌体からの抽出およびその抽出液から
の精製に多大な時開と労力とk”A4するだけではなく
、目的とする物質r完全な形で1f(li粋に得ること
自体がきわめて内陸である。
バチルス(Bacillus )属卸1菌は古くから種
々の菌体外酵素の生産菌として工業的に利用されておシ
、これら菌体外酵素の遺伝子のプロモーターおよびシグ
ナルペプチドケコードするDNA領域をクローニングし
、その下流に目的とする蛋白質の構造遺伝子を連結して
、これを枯草菌に導入すれば、目的とする蛋白11i1
1伝子産物として菌体外へ分泌させることが可能になる
と考えられる。
Bacillus属州菌においては2分泌される蛋白質
はアミノ末端側におよそ20〜30アミノ酸残基からな
るシグナルペプチドを持つ前駆体として合成されたのち
、この部分がシグナルペプチダーゼによって切断されて
、成熟した蛋白質になると考えられている。すでにBa
cillus amyloliyuefa −cien
sのα−アミラーゼ遺伝子〔工、 Pa1vaetal
: Gene、22,229(1983))。
Bacillus licheniformieのベニ
シリノー−ゼ遺伝子(S、 Chan(7+ et a
L : MolecularCloning and 
Gene Regulation 1nBacilli
+ Ac’ademic Press+ 659頁、1
982年) ! Bacillus 5ubtilis
のα−アミラーゼ遺伝子〔山根国男、化学と生物、21
. 6591983))がクローン化され、これらのシ
グナルペプチドを利用した異種蛋白質の分泌が報告され
ている〇一方、 B、 amyloliquefaci
en8のアルカリ性プロテアーゼ遺伝子もクローニング
され、その塩基配列が報告されている( J、A、We
llset al、 Nucleic Ac1ds R
e8.旦、 7911(1983))。また、B、 a
myloliquefaciensの中性プロテアーゼ
遺伝子も最近クローン化されたと報告された(富岡登ら
9日本農芸化学会昭和58年度大会講演要旨集、33頁
)がその塩基配列を決定した結果、該遺伝子は中性プロ
テアーゼをコードしていないことが明らかにされた〔古
谷義夫:第1回次世代産業基盤技術シンポジウム予価集
、223頁、1983年〕。
本発明者らはB、 amyloliquefacien
sから既知のものとは異なる制限0累切断地図を有し、
中性プロテアーゼ遺伝子((iむDNA(jクローン化
したことおよびこのDNA1ベクターに連結してBac
illus属菌に導入することにより、すぐれた中性プ
ロテアーゼ生産菌を肯種し得ることを見出し、このシグ
ナルベグチドrコードする領域を利用すれば有用な分泌
ベクターの(14築がi1J能であることを知って本発
明を完成した。
すなわち、本発明はプロモーターおよび中性プロテアー
ゼ遺伝子のシグナルペプチドをコードする領域を含有し
、中性プロテアーゼをコードする領域t−3′末端側か
ら一部ないし全部欠(DNAを提供するものである。
中性プロテアーゼ遺伝子のシグナルペプチドケコードす
る領域を含有するDNAとしては中性フ。
ロチアーゼを産生ずる微生物のものであればいかなるも
のであってもよく、敵生物としてはたとえばB、 am
yloliquefacieneなどの中性プロテアー
ゼを産生ずるBacillus属菌があげられる。
プロモーターとしてはBacillus属菌体内でプロ
モーターとして機能するものであればいがなるものであ
ってもよく、たとえばメタフィロコツカス(5tapb
ylococcus )ILi41 Bacillue
kなどのグフム陽性菌から得られるプロモーターがあげ
られる。好ましくはBacillus M菌から得られ
るプロモーターがあげられ、該バチルス属菌としてはた
とえば、B、eubtilis+ Bacillus 
pumilue+B、 amyloliquefaci
ensなどがあげられ、自体公知のプロモーター(例、
70gプロモーター。
SPO+プロモーター、5PO2プロモーター)を用い
てもよい。
使用されるプロモーターは1個だけでも、また複数個を
直列に連結したものでもよい。
上記プロモーターおよび中性プロテアーゼ遺伝子のシグ
ナルペプチドをコードするDNAは上記した微生物の染
色体DNAから得ることができる。
菌体からの染色体DNAの調製はそれ自体公知であシ、
たとえばLovettらの方法(Methods in
Enzymolog、y、68. 342 (1979
) ) など?用いて行うことができる。
染色体DNAから中性プロテアーゼ遺伝子を含むDNA
断片をクローニングする宿主−ベクター系としては、ベ
クターに挿入された染色体DNA断片上に中性プロテア
ーゼ遺伝子の存在が確認できるものであれば如何なるも
のであってもよく、好ましくは枯草菌宿主−ベクター系
があげられる。
ベクターを用いて中性プロテアーゼ遺伝子を含むDNA
断片をクローニングする場合、たとえば制限酵素を用い
てベクターを開袋させた後、DNAリガーゼを用いてD
NA断片k ;I入し、これを用いて、たとえばBac
illus su’btilisの中性プロテアーゼ非
生産株または低生産株を形質転換させることによって中
性プロテアーゼ産生株を選択すればよい。ベクターが薬
ハtl +rjt性遺伝子?有し、さらに該遺伝子上に
挿入不活性化部位會有する場合、該部位にDNA断片?
挿入することにより、薬剤に対する感受性全選択の指標
として利用することもできる。ベクターとしては具体的
にプラスミドpB’I’M+19.ptJB110など
があげられる。
菌体外中性プロテアーゼ産生株は、たとえば1%カゼイ
ンを含有する欅大培地上でコロニーのまわりにハローを
形成する株として選択できる。また中性プロテプーゼ低
生産株としては、たとえばB、 5ubtilis I
 A 274に挙けることができる( The Bac
illus Genetic 5tock Cente
r:Catalog of 5trains+ 2nd
 eddition(1982))。形質転換の方法そ
れ自体は公知であシ、たとえばプロトプラスト法(S、
Chang&S、N、 Cohen: Mo1.Gen
、 Genet、+ +61L111(+979))や
コンピテント法(D。
Dubnau & R,D、 AbelBOn+ J、
 Mo1. Biol、 +江、209(1971))
などを用いることができる。得られた形質転換株の自体
からプラスミドを抽出し、これをたとえば制限酵素で切
断後、たとえばアガロ−スゲ/L”j[気泳動あるいは
ポリアクリルアミトゲA/[気泳動によって挿入された
中性プロテアーゼ遺伝子を含むDNA1単離することが
できる。これら一連の基本操作は公知であり、文献(M
ethods in EnzymoloEy+ 68(
1979) ; Mo1ecula、r Clonin
g (1982)。
Co1d SpringHarbor Laborat
ory )に詳しく記載されている。
中性プロテアーゼ遺伝子を含むDNAの塩基配列はたと
えばジデオキシヌクレオチ°ド合成鎖停止法(Pz・o
c、 Natl、 Acad、 8ci、+ USA、
74 +5463 (1977) ) 、 Maxam
−Gilbart法(A、 M、 Maxam & W
、 G11b6rt : Proc、Natl。
Acad、 8ci、、 USA、 74.560 (
1977) )−■■用いて決定できる。DNA中の中
性プロテアーゼ遺伝子の位置は決定されたDNAの塩基
配列から翻訳されるアミノ酸配列と公知の中性プロテア
ーゼのアミノ酸配列(P、L、 Levy et al
:Proc。
Natl、 Acad−Sci、、 USA、 72.
4341(1975))とを比較することにより決定で
きる。また、DNA中に中性プロテアーゼ遺伝子?含む
ことは該DNA1含むプラスミドで形質転換させた宿主
の産生ずる成熟中性プロテアーゼのアミノ酸配列を決定
することにより確認することもできる。
中性プロテアーゼのシグナルペプチドをコードする領域
はアミノ酸配列として Met −Gly−Leu−Gly−Lye−Lys−
Leu−3er−VaJ−−Ala−Val−Ala−
Ala−8er−Phe−Met−8er−Leu−’
Thr−工1e −8er−Leu−Pro −Gly
−Val−Gln−X〔式中、X1dA1a またはA
la−Ala ’fr示す〕で表わされるペプチドをコ
ードするポリヌクレオチドである。該ポリヌクレオチド
は上記アミノ酸配列のペプチドをコードし、かつ機能し
うるものであればいかなるコドンであってもよい。また
、シグナルペプチドとしての機能を保持する限シ、それ
を構成するアミノ酸が挿入あるいは欠落または他のアミ
ノ酸に変更されても、それらペプチドをコードするポリ
ヌクレオチドをシグナルペプチドをコードする領域とし
て用いてもよい。
中性プロテアーゼ遺伝子のシグナルペプチドをコードす
る領jXk含有し、中性プロテアーゼをコードする領域
を3′末端側から一部ないし全部欠くDNAは、中性プ
ロテアーゼ遺伝子ヲ含むDNA全、たとえば制限酵素で
完全あるいは部分消化することにより得ることができる
。また、中性プロテアーゼ遺伝子を含むDNA’j制限
酵素で切断して中性グロテアーゼ遺伝子を含む、よシ小
さなりNA断断片全サグクローニングた後に、たとえば
制限酵素で完全あるいは部分消化してもよい。
サブクローニングは中性プロテアーゼ遺伝子のクローニ
ングと同様な方法に従って、ベクター上に、より小さな
りNAM片をクローニングし、その形質転換体がコロニ
ーの周囲にカゼインを分解したことを示すハローを形成
することを指標として中性プロテアーゼ遺伝子がクロー
ニングされたことを確認することができる。使用される
ベクターは枯草菌ベクターたとえばpBTMI19.p
UBllo、ppL603などが挙げられる。
また、中性プロテアーゼ遺伝子のシグナルペプチドをコ
ードする領域を含有するDNAは自体公知の方法、たと
えばトリエステル法(Proc。
Natl、 Acad、 Sci、 、 USA、 7
5.5765(197B):)によって化学的に全合成
あるいは半合成したものでもよい。
染色体Dmhw用いてプロモーター活性を有するDNA
断片をクローニングする場合に用いられるベクター(プ
ロモータークローニングベクター)としては、たとえば
制限酵素切11Jr部位にバチルス属菌の染色体DNA
断片を挿入させ、その14jr片中にプロモーターが存
在していることを知ることが出来るプラスミドでおれば
いかなるものであってもよく、たとえばプルモータ一部
分が欠損した遺伝子を有するプラスミドなどがあげられ
、具体的には1ラスミドpPL603(pBTM126
)(J−Bact6rio1. 、146.1162 
(1981) ) などがあげられる。
プロモーター活性ケ有するDNA断片は染色体DNA断
片が挿入されたベクターで形質転換させた菌株から目体
公知の方法で1ラスミド1[製した後、これを、たとえ
ば制限酵素で切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動
、アガロ−スゲ/l/電気泳動などの自体公知の方法?
用いて単離することができる。また、単離されたDNA
断片の塩基配列は自体公知の方法、たとえばジデオキシ
ヌクレオチド合成順序止法(前出) + Maxam−
Gilbert法〔曲用〕を用いて決定できる。
また、プロモーター活性を有するDmA+alr片は自
体公知の方法、たとえばトリエステル法を用いて化学合
成することもできる5 上記で得られる中性10テアーゼ遺伝子のシグナルペプ
チドをコードする領域を含有するDNAとプロモーター
活性を有するDNA断片は自体公知の方法によって連結
し、これをプラスミドに挿入すればプロモーターと中性
プロテアーゼ遺伝子のシグナルペプチド金コードする領
域を有するベクター′ff:構築することができる。ま
た、中性グロテアーゼ遺伝子のシグナルペプチドをコー
ドする領域を含有するDliA断片およびプロモーター
活性を有するDNA断片の一方が挿入されたベクターに
他方を挿入することによってプロモーターと中性プロテ
アーゼ遺伝子のシグナルペプチドをコードする領域を有
するベクターを構築することもできる。プロモーターと
して中性プロテアーゼプロモーターを用いる場合にはプ
ロモーターと中性プロテアーゼのシグナpペプチド?コ
ードする領域を切断せずにベクター構築のために用いて
もよい。
目的とする蛋白質は転写開始に必要なプロモーター、リ
ポソーム結合部位(SD配列)および中性プロテアーゼ
遺伝子のシグナルペプチド金コードする領域の下流に目
的とする蛋白質會コードする遺伝子を連結させたDNA
でバチルス属菌全形質転換させ、得られる形質転換株を
培養することによ勺得ることができる。
上記のSD配列としては枯草菌内で機能するものであれ
ばいかなるものであっ°てもよく、またその配列のいく
つかは、すでに公知である( J、R。
McLaughlin et al: J、 Biol
、 Chem、+ 256 +11283(+981 
ン + C,P、Moran Jr、et al:Mo
1. Gen、 Genetics、 18L 439
(1982):)。
したがって、SD配列を含むオリゴヌクレオチドを染色
体DNAから単重するか、または自体公知の方法、たと
えばトリエステル法(前出)によって化学合成し、プロ
モーターと中性グロテアーゼ遺伝子のシグナルペプチド
をコードする領域を有するベクターにおいてプロモータ
ーの下流に挿入すればめる発現ベクターを構築すること
ができる。
目的とする蛋白質?コードする遺伝子を連結する位置は
たとえば、中性プロテアーゼ遺伝子のシグナルペプチド
をコードする領域の直後、成41中性フロテアーゼをコ
ードする領域の直前、または連結されている中性プロテ
アーゼ遺伝子内などの位置があげられる。
発現に使用される遺伝子は介在配列を有さす、かつ塩基
配列の明らかなものがより望ましく、染色体から単離さ
れた遺伝子、mRNAから得られた相補DNA 、化学
合成した遺伝子、半合成遺伝子などいかなるものであっ
てもよい。具体的にはB型肝炎ウィルス(HBV)表面
抗原遺伝子、HBYコア抗原遺伝子、免疫グロブリンE
遺伝子。
ヒト成長ホルモン遺伝子、インターロイキン−2遺伝子
、免疫インターフェロン遺伝子などがあげられ、該遺伝
子の全部または゛その一部ある込は複数種の遺伝子音連
結したものを便)13L、てもよい。
また、これらの遺伝子を発現ベクターに挿入して発現デ
ラヌミドを構築する際、必要に応じ′C適当な合成オリ
ゴヌクレオチドを遺伝子に連結させてもよい。
このようにして得られるグフスミドでバチルス属菌を形
質転換させる場合、宿主は特に限定する必要はなく、た
とえば、B、 5ubti:Lis BGSCIA l
+BGSCI A274 (The Bacillus
 GeneticStock Genter: Cat
alog of 5trains +2nd edit
ion (1982))などのBacillus MS
4陶が苗げられ、なかでもグロテアーゼ低生産株または
非生産株が好ましい。
得られる形質転換株の培養に使用される培地としては形
質転換株が生首して菌体外に目的とする蛋白質を産生じ
得るものであればいかなるものであってもよい。
該培地に・a有される広本1としては、たとえばグルコ
ース、シュークロース、クリセリン、でん粉、デキスト
リン、曲hε、有機酸などが月いられる。該培地に含有
される窒素源としては、カゼイン、ペプトン、肉エキス
、酵母エギス、カザミノ酸〔ディフコ社(米国)製〕、
NZ−アミン人〔シェフイールド社(米国)製〕、ソイ
ビーンミーμ、落丁生粉などの4−根屋素源、硫酸アン
モニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの
無機類素読が用いられる。その他、カルシウム塩、マグ
ネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム徳、リン酸塩、マ
ンガン塩、鉄塩、コバルト塩などの無機塩が必要に応じ
て培地に添加される。さらに、栄養要求を示す1株を用
いる場合は、その生首に必要な栄養物質を培地に添加す
ればよい。該栄誉物質としては、たとえば、アミノ酸類
、ビタミン類、核酸塩基類などが挙げられる。
さらに必要により、消泡剤(例、大豆油、ラード油など
)などを培地に加えてもより0また、培養に除して必要
があれば、培地に抗生物質たとえばクロラムフェニコー
ルが加えられる。
培養温良は、通常約15℃ないし42’C,さらに好ま
しくは約24”Cないし37°C”’Cあり、培地のp
Hは初発pHが約51口ないし9.0でありさらに好ま
しくは約6.5ないし7.5である。
培養時間は、通常約3ないし72時間、さらに好1しく
は約5ないし48時間である。
目的とする蛋白質は自体公知の方法、たとえば遠心分離
などの方法で菌体を除去した後、−俸公知の弧白屓精製
法に従って拍製することができる。
本発明はさらにバチルス属菌出来の新規なグロモーター
に関する。
バチルス属菌ではその細胞の生長時期により異なるRN
Aポリメラーゼが働きそれらによって認識されるプロモ
ーター仙域の異なるものがあることが知られている( 
Nature、 302.800(1983))。
すなわち、栄養細胞におけるRNAポリメラーゼ(例、
Eσ )と胞子形成細胞におけるRNAポリメラーゼ(
例、Eσ 、Eσ )はそれぞれ認識するプロモーター
領域が異なることが知られている。
本発明者らは中性グロテアーゼ遺伝子の発現根絶を鋭意
研究した結果、中性プロテアーゼ遺伝子t−発現させる
ためのプロモーター(中性プロテアーゼプロモーター)
が優れた特性を有すること金知り、本発明全完成した。
すなわち、本発明は一35領域がTTGCAG。
−10領域がTATTAT(Eσ55)であるか、−3
5領域がAGTTTT、−10領域がGAGATTOC
T(Eσ37)であるか、または−35領域がAATT
C。
−10領域がTAGTTTTATA(Eσ32)でおる
プロモーターを提供するものである。
プロモーターはたとえばB、 amyloliquef
aci −ens などの中性プロテアーゼを産生する
Bacillus属菌の染色体から得ることができる。
また、自体公知の方法を用いて化学合成したものであっ
てもよい。
本発明のプロモーターの下流に目的とする蛋白質をコー
ドする遺伝子全連結したDNAでBacillua属菌
を形質転換させ、該組み換え体を培養すれば、目的とす
る蛋白質2Iることができる。目的とする蛋白質の菌体
外産生のために、プロモーターと該遺伝子の間に中性プ
ロテアーゼ遺伝子のシグナルペプチド會コードする領域
?挿入したDNAを用いてもよい。
プロモーター中にはRNAポリメラーゼの認識部位が少
なくとも1つあればよいが、異なった生長時期(例、栄
養#l胞、胞子形成細胞)でもプロモーターとしての機
能を発揮させるために、複数種のRNAポリメラーゼの
認識部位を有するプロモーターがよシ好ましい。
以下に参考例、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説
明するが、本発明はこれらに限定されるべきものではな
い。
参考例1 クローニングベクターpBTMII9の構築i)薬剤耐
性プラスミドの調製 財団法人発酵研究所(工FO)に受託番号工FO−14
203として寄「〔されているクロラムフェニコール耐
性のスタフィロコッカス・エビデルミゾイス(5tap
hylococcue epidermidis)FS
5030會1g6トリグトン(ディフコ社、米国)。
0.596酵母エキス、0.5%塩化ナトリウム。
pH7,2からなる5wtのL培地を含む試練管で30
°C918時間振とり培養した。得られた培養液20 
zt (試験管4本分)を遠心分離し、菌体を10mM
、EDTA、pH8,0で洗浄したのち2wtのTBL
−+ra菌酵素溶液(1”f/sl 、’ 10 mM
EDTA、])H8,0)に簡渇し、37°Cf30分
間保温した。4wtの1%ラウリlv硫酸ナトリウムを
含む0.2H水酸化ナトリウムを加えて混合し・0℃で
5分間放ばした。さらに6wtの3Ml’tli1mナ
トリウム(pH4、8)を加えて混合し、0°Cで60
分間放置したのち遠心分離した。その上清に2倍量の冷
エタノーA/’i加え、−20℃で1夜放置し、遠心分
離した。沈澱kO,4tglの0.4%ザμコシールに
浴解し、2.4wt1のTES籾賞液よびBMIの冷エ
タノー/I/?加えたのち、−20°Cで1夜放置し、
遠心分離した。沈澱を0.4wtのTEd向液(10m
M)リス・塩酸Hms液pH8,0、,1mM EDT
A)に溶解し、同じtl 伸s i& T透析して粗プ
ラヌミドを調製した。
クロラムフェニコール耐性のS、 epidermid
isFS5030の粗プフヌミド?用いて、プロトプラ
スト法によるBacillus aubtilie J
B−1−168(工FO−14144)のル賀転換を行
い、クロラムフェニコール耐性(12,5μ′gクロラ
ムフエニコーIL//meで生T4)の゛形質転換株全
分離−した。このように、このプラスミドがBacil
lus124でも増殖可rflデであり、Bacill
us属菌内でその遺伝子ケ発現させ得ることから、この
プラスミドがBacillus属のベクターとなシ得る
ことが明らかとなった。そこで、形質転°換株の中から
クロラムフェニコール耐性を示すものk B、 5ub
tilis’I’23と命名し、選択した。
このB、’5ubtilis T 23 k L培地で
28℃。
16時間振とり培養した。得られた500gffの培養
液を遠心分離して集めた菌体に、60trtlの25%
シヨ語?含むTESFA陶液、l2txi’の0.25
M EDTA pH8,0,16111の5り/ me
リゾチーム溶液および0.8mlの5 ’f / #I
lリボヌクレアーゼA溶漱を加え、37″Cで30分間
保温した。さらにF3xlの10%ヲウリ/I/硫酸ナ
トリウム?加え、37℃で15分間保温した。つぎに2
0μlの5M塩化ナトリウムを加え、口°Cで3時間放
置したのち遠心分離した。その上清に2倍容の冷エタノ
ールを加え、−20°Cで1夜放置した。遠心分離して
得られた沈澱t8.6txtの0.44ザμコンールを
含むTHEi繭液に溶かし、9Fの塩化セシウムおよび
0.25μlの30q/lelエチジウムブロマイド溶
液を加えたのち、ベックマン超遠心機(ローター50T
i)を用いて20゛Cで38.000μlm で48時
間遠心した。紫外線照射によって検出されるグラスミド
のバンドを取り、これに(比M)=1.6の塩化セシウ
ム−エチジウムブロマイド溶液を加え、再び38,00
0 rpmで48時間遠心した。プラスミドのバンドを
取り、n−7”タノーμ抽出によってエチジウムブロマ
イドを除去したのちTE緩耐液で透47Fシ、クロラム
フェニコール耐性プラスミドpBTM103 k’4た
260nmの吸光度から約75μgのプラスミドが得ら
れたことがわかった。
11)クローニングベクターの構築 4.5μgのpnTM103を制限酵素HpaIIで3
7℃、60分間完全消化した。いっぽう6.75μgの
pUBllo(J、 Scheer−Abramowi
tz etal 、 * Plasmid 、下−,6
7(1981)&照〕を制限酵素Hpal[で37°C
,1F間消化した。自反応液を65°Cで15分間加熱
処理して反応を停止させ、エタノール沈[−行った。両
沈澱をそれぞれ35μlの水にR1/Nして混合し、6
6nモルのアデノシン三すン酸、10ユニットのT4]
)NAリガーゼ存在下で11”C,31時間反応させ、
エタノ−p沈澱を行った。沈澱を50μlのTE緩鮪液
に溶かし、その25 ttlj k用いてB、 5ub
tilis JB−1−168の形質転換を行った。カ
ナマイシンおよびクロラムフェニコールの両方に耐性を
示す形質転換株の中からB、 5ubtilis T 
39 を選び、この菌株の培養液500ytlから参考
例1−1)と同様の方法で複合グラスミドpB’l’M
 119 (209μg)を得た。 グラスミドpBT
M 119の分子量は約3.25メガダμトンであり、
その制限酵素切断地図は第1図のごとくであった。
参考例2 プロモータークローニングベクターpBTM126の構
築 グラスミドpBTM126は、Williamsらの方
法(J、 Bacteriol、、 146 、116
2(1981) )に従い以下のように作製した。財団
法人発酵研究所より入手したB、 pumilus N
 C1B860’0(工FO−12089)よシDNA
をルt11製し、そのDNA(6,5μg )を40ユ
ニツトの制限酵素EcoR工と37℃、1時間反応させ
て切断したのち、68℃で15分間加熱し、エタノール
沈蝕ヲ行った。
一方、プラスミドpUB110(2,0μg )を20
ユニツトの制限酵素ECOR工 と37°Cで1時間反
応させて切断したのち、68°Cで15分間加熱し、エ
タノ−μ沈澱を行った。両法vQ、ft水に溶かして混
合し、これに60 nmoleのATP 、I 0−1
=ツトのT4DB1リガーセ(宝泗造製)およびリガー
ゼ緩寓液を加えた反応液(100μl)を11℃で30
時間保温し、エタノール沈1しを行った。沈澱(1−T
E緩韓液(50μl)に浴解し、その25μ21用いて
B、 5ubtilis M工114(Gene、 2
4 、255 (1983) )の形質転Mk行った。
クロラムフェニコール耐性の形質転換株よシブラスミド
t−調製し、該プラスミドkpBTM124と命名した
。次にプラスミドpBTM 124(2,5μg)を1
4ユニツトの制限酵素PstIと37°C。
1時間反応させて切断し、68゛Cで15分間加熱処理
したのち、エタノール沈#!lIヲ行った。沈澱を水に
溶解し、66 nmoleのATP、IOユニットのT
4DNA!Jガーゼ(宝酒造製)およびリガーゼ緩衝液
ケ加えた反応液(100zz#)を11°Cで24時間
保温し、エタノール沈澱を行った。
沈?!tTEam液に溶解し、B、 5ubtilis
 M工114を形質転換させ、カナマイシン耐性の形質
転換株からプラスミドを調製して、該プラスミドをl)
BTM125と命名した。本プラスミドはプラスミFp
BTM124のクロラムフェニコール アセチpトラン
ス7エフーゼ(CAT)遺伝子のプロモータ一部位(P
stI 断片)が脱落したものである。次に1フスミド
PBTM 125(2,5μg)t18ユニットの制限
酵素13amH工および15ユニツトの制限酵素Bgl
 IIと37℃で1時間反応させて17JIB’tし、
68℃で15分間加熱処理したのちエタノール沈#を行
った。沈峨會水に溶解したのち、66 nmol、eの
ATp、13ユニツトのT4DNAリガーゼ(宝jvA
造fM)およびリガーゼ緩衝?ff1t含tr反応M(
100plj ) 中テI I ’CT28時間保温し
、これを用いてB、 5ubtilis M工114の
形質転換を行った。カナマイシン耐性j性の形質転換株
からグラスミドを調製し、該グラスミドをpBTM12
6と命名した。
実施例1 中性グロテアーゼ遺伝子のクローニングB、 amyl
oliluefaciene (工FO−14141)
〔工n5titute for Fermentati
on+ 0saka+Re5earch Commun
ications hh If (1983ン 〕より
、自体公知の方法(Methods inEnzymo
logy、 68,342 (1979) )に従い、
染色体DNA1調製した。その染色体DNA8.8p、
g t 36 ユ= ットの制限酵素Bgl IIと3
7’0゜50分間反応させて切断し、65℃で15分間
加熱処理し、たのち、エタノ−/l’を加えてDNAを
沈澱させた。一方、参考例1で一一製したクローニング
ベクp−pBTMl19(2,9μg)k30ユ=7ト
の制限酵素BgIIIと37℃、50分間反応させて切
断し、0.5ユニツトのアルカリ性フォスファターゼを
加えて65”0.30分間保温したのちフェノール抽出
、エーテル抽出し、エタノール沈澱を行った。両法#i
全水に溶解して混合し、これに66 nmol6 のA
TP、28ユニツトのT4DNAリガーゼ(宝酒造製)
およびリガーゼ緩衝液を加えた反応液(100μl)を
11℃で32時間保温したのち、エタノ−p沈澱を行っ
た。沈毅ヲTEH蒲液に溶Pi> L、これケ用いてB
、 eubtilisIA274の形質転換を行った。
カナマイシン耐性の形質転換株の中からCPIJ大培地
(酵母エキス0 、2!tit 、ペプトン196.拭
塩0.2%、カゼイン196.寒天1.5%、pH7,
3)のプレート上でハローCH,1leharaら+ 
J、Bacteriol、 +119.82(+974
))を形成する菌株を迫択し、その1株から単離したグ
ラスミドをpBTM127と命名した。本プラスミドは
プラスミドpBTM119のBgllI部位にB、 a
myloliquefaci −ens (工FO−1
4141)の中性プロテアーゼ遺伝子t−’aむBgl
I[断片(3,9Kb)が挿入きれたものであろ(第2
図参照)。
なお、本プラスミドpBTM127に有するB。
5ubtilis I A2747931M12Tは財
団法人発酵な[死所に工FO−14306として寄託さ
れている。
実施例2 中性プロテアーゼの生成 り、 amyloliquefaciene (工FO
−14141)、 pBTMl 19ft保持するB、
 5ubtilis lA274(B、 eubtil
is 1A274/pBTM I I 9 )および1
)BTM 127 k保持するB、 5ubtilis
 IA 274(B、 aubtilis lA274
/pBTM 127 ) kそれぞれ酵母エキス0.2
%、ペプトン1%。
Na1l O、2%、カゼイン196からなる40m1
のCP培地(pl(7,3)を含む20(1+/容三角
フラスコで28℃24餠聞及び48時間振とう培養した
0なお、Bacillus amyloliquefa
ciens以外の場合には培地中に5μg/atのクロ
ラムフエニコー/L’を加えた。得られた培妥液を遠心
分離し、その上清?水に対して181出透析して酵素液
會調製した。プロテアーゼ活性はMiyataらの方法
(Agric、 Biol、 Chem、 、 34 
、310(1970))を用いて、pH7および10で
測足し、表1にその結果を示した。
表1に示したように、B、 5ubtilis l’A
274/1)BTMI27はB、 amyloliqu
efaciens (工F014141)に比べ10倍
以上高い中性プロプトゼ生産能を示した。
次にB、5ubtilis lA274/pBTM12
7 k大量培養して得られた培養液の上清から、中性プ
ロテア−゛ゼ1に硫安分画、DEAEセルロースカラム
クc+’vトゲラフイーおよび5ephadex 、G
−100ゲμろ過によってはソ単一にまで精製した。
本標品に296トリクロμ酢酸を′加え、これを水に対
して透析したのち凍結乾燥して粉末を得た。
得られた粉末をハースの方法(Methods inE
ng、11,197 (1967))に従って過ギ酸酸
化したのち、これに気相プロテインシークエネーター(
アプライドバイオシステムズ社製470 A型。
アメリカ)を用いる自動エドマン分解法〔工wanag
a et al、: Eur、 J、 Biochem
、+ 81189(+969))k適用して、N末端ア
ミノ酸配列を分析した。フェニルチオヒダントインアミ
ノ酸はミクロバック5P−ODSカラム(/<リアン社
製、アメリカ)を用いる高速液体クロマトグラフィーに
より同定、足置した。得られたN末端アミノ酸配列(残
基1から13まで)會以下の式に示す。
Leu−Lye−Gly−Lye− 王妃の配列はP、 L、 Levyら(Proc、Na
tl。
Acad、 Sci、 USA、 72.4341 (
1975))によって報告されたBacillus B
ubtilisの中性プロテアーゼのアミノ酸配列と完
全に一致した。
以上の結果から、実施例1でクローニングされた遺伝子
は中性プロテアーゼであることが明らかになった。
実施例3 中性プロテアーゼ遺伝子のサブクローニング実施例1で
得られたプラスミドpBTM127(80μg)を制限
酵素BglII(200ユニット)と37”0.1時間
反応させて切断したのち0.7%アガロースゲル電気泳
動にかけ、分子量の小さい方のバンドのゲlVk切り取
った。とのゲμ中のDNA1電気泳動溶出法(遺伝子操
作マニュアル、高木康敬編著、購談社すイエンテイフイ
ク、1982年)で回収すると約10μgのBglII
断片(3、9Kb )が得られた。
得られたBgI IF断片(3μg )を制限酵素Hi
nd1[(6ユニツト)で37’C,1時間処理してA
断片(BgIII−Hlndlll、約Q、8Kb)、
B断片(Hin’d III −Hind ][+約i
、1Kb)およびC断片(Hlndu−BglII+ 
約1,9Kb)の3つの一1片に切断し、エタノール沈
Ml−行った。一方、フ。
フスミドpBTM126(1μg)を制限酵11iin
dIII(5ユニツト)で37°C,1時間反応させて
切断したのちエタノール沈鐵ヲ行った。自沈#l水で溶
解し、これに100 nmole のATP、8.4ユ
ニツトのT4DNA!Jガーゼ(宝酒造製)およびリガ
ーゼM衝液を加えた反応液(100μ1)ftl1°C
で24時間保温し、B、 5ubtilis l A2
74の形質転換を行った。カナマイシン耐性。
クロヲムフエニコー〃感受性の形質転換株からプラスミ
ドを調製した結果、2種類のプラスミドが得られ、それ
ぞれ倉pB’rM50B(6,2Kb)およびPBTM
515(7,7Kb)と命名した。プラスミドpBTM
515はプラスミドpBTM l 26のHindff
1部位にA断片とC断片が互に逆方向で挿入されfcも
のでちゃ、プラスミドpBTM50 Bはプラスミドp
BTM126のH1ndllI部位にB断片が挿入され
たものである(第3図参照)。これらのプラスミドを保
持する菌株のCP培地プレート上でのハロー形成能を調
べたところ、pBTM515保持株はハロー形成能を示
し、I)BTM 5 、p 8保持株はハロー形成能を
示さなかった。
次にプラスミドpBTM127(1μg )、1Eco
R工(3ユニツト)およびBgln(2ユニツト)で、
またプラスミドpUBIIO(1μg)iEcoR工(
3ユニツト)およびBamH工(5ユニツト)で37°
C91時間それぞれ反応させて切断したのち、65°C
で10分間加熱して反応を止め、それぞれエタノ−μ法
線を行った。両法#を水に溶解したのち混合し、これに
l 00 nmole のATP、8.4ユニツトのT
4DNAIJガーゼ(宝酒造製)およびリガーゼ後前液
を含む反応液(100μl)を11℃で24時間保温し
、これt用いてB。
5ubtilis l A 274の形質転換を行った
。カナマイシン耐性の形質転換株の中からハローを形成
する株を選びそのプラスミドk pBTM523 Jニ
ー命名した。本プラスミドはプラスミドpUB110の
FicoRニー BamH工部位にプラスミドpBTM
127のEcoRニー BglII断片が挿入されたも
のである(琳4図参照)。なおこのEcoRニーBgl
ll断片はI)BTM+270B g I IF 断片
のB断片の1部およびC断片からなっている。
以上の結呆から、中性プロテアーゼ遺伝子はC断片(1
,9Kb)の中に存在することが明らかとなった。
pBTM515(100μg)を制限酵素Bgl ’1
(200ユニツト)およびHindl[(200ユニツ
ト)で37℃、1時間反応させて切断し、1961カ゛
ロースゲルlIt気泳動にかけ、このゲμより1 、9
 KbのDHA會電気泳助溶出法(M仏子操作マニュア
μ、亮木康敬編著、講談社)により回収すると約10μ
gのcm片が得られた。
第5図にとのC断片の制限部氷切断地図ケ示す。
実施例4 実施例3で得られたCI#r片の塩基配列の一部をジデ
オキシヌクレオチド合成鎖序止法およびMaxam−G
ilbort法を用いて決定した。C断片のBgl I
[サイト側からの塩基配列および翻訳したアミノ酸配列
を第6図に示す。本配列中にはプロモーターとしてEσ
55によって認識される一35領域(TTGCAG)と
−10領域(TAT’L’AT) 。
B 、37によって認識される一35領域(AGTTT
T)と−10領域(GAGATTOCT)およびEσ3
2によって認識されると予想される一35領域(AAT
TC)と−10領域(TAG’l”1’TTATA)が
見出される。
なお、BglI[−8au 3A 1断片(530bp
)(第5図参照)がプロモーター活性を有することは、
プロモータークローニングベクターpFTB28’+(
青村ら、日本m芸化学会昭和58年度大会講演要旨集。
第28頁)を用いることによって確認することが出来た
ので上記プロモーターが機能していると予想される。ま
た、プロモーターの下流にはSD領領域よびオープンフ
レームが存在し、1番目のメチオニンから27または2
8番目のアラニンまでが中性プロテアーゼのシグナルペ
プチドと思われる。222番目のアラニン以後のアミノ
酸配列は文献で報告されている中性プロテアーゼ(P、
L。
Levyら+ Proc、 Natl、 Acad、 
Sci、+ 72 +4341(+975))とは若干
異なったが実施例3に示した中性プロテアーゼのN末端
のアミノ酸配列とは完全に一致した。この時果、シグナ
ルペプチドと思われる配列と成M1蛋白質との間に約2
00個の機能の不明なベプタイドが存在することが予想
された。
次にC断片のHind l[サイ)ilJIからの塩基
配列および翻訳したアミノ酸配列を第7図に示す。本ア
ミノ酸配列は上記の文献に示された中性プロテアーゼの
C末端のアミノ酸配列と完全に一致した。
実施例5 実施例3で得られたBgil[−H1ndllI断片(
1,9Kb)の10μg’Th制限醇素Ace工(50
ユニツト)と37°0.1時間反応させて切断した。こ
の反応液を1.25+!アガロ−スゲlv電気泳動にか
け、1 、7 KbのHlndN−Ace工断片のバン
ドケ切シ取り、電気泳動溶出したのち、フェノール抽出
エーテル抽出およびエタノール沈峨2行い、3ttgの
Hlndu−Acc工断片を得た。本断片の塩基配列を
Maxam−Gilbert法(Proc、 Natl
、 Acad。
Sci、、B工、560(1977))によって決定し
たところ、中性プロテアーゼの構造遺伝子のC末端から
約30コのアミノ酸をコードする領域が欠損しているこ
とが明らかになった。
【図面の簡単な説明】
第1図はプラスミドpBTMI19の制限酵素切断地図
を示し、第2図はプラスミドpBTM127の制限酵素
切断地図を示す。 第3図はプラスミドPBTM50BおよびpBTM51
5の構築図を示し、第4図はプラスミドpBTM 52
3の構築図を示す。 第5図はB、amyloliquefaciens (
工FO−14141)から得られた中性プロテアーゼ遺
伝子を含むDNA断片(9!施例3で得たC断片)の制
限酵素地図ケ示す。 Bg、はBgllI、TはTaqI+Saは5acl[
+HaはHaeffl、SはSau 3AI + Aは
AccI+BeはBcl IおよびHはHindI[i
示す。 第6図はB、amyloliquefaciens (
工FO−14141)から得られた中性プロテアーゼ遺
伝子を含むDNA断片(実施例3で得たC断片)の5′
側の塩基配列および該配列から翻訳されるアミノ酸配列
を示し、第7図は3’1LllIの塩基配列および該配
列から翻訳されるアミノ酸配列ケ示し、TAAは終止コ
ドンを示す。 第1図 テ g 追 工 第2図 hO矛’ ”−holo ” 第4図 〒 hoJo” 第6図 くつづく〉 第6図−(2) Leu Arg Asp 手 続 補 正 書 (方式) 昭和59年 7 月す日 特許庁長官殿 “ l、事件の表示 昭和 59年持重願第 60875 号2、発明の名称 NA 3、補正をする者 事件との関係 f1許出願人 住 所 大阪市東区道111町2丁目27番地名 称(
293)武U]薬品工業株式会社代表者 倉 林 育四
部 4、代理人 住 所 大阪市淀川区十三本町2丁目17番85号武田
薬品工業株式会社大阪工場内 氏 名 弁理士(6022)天 井 作 次東京連絡先
(特許法規課)電話278−2219乙 補正の対象 図面(第6図) 7 補正の内容 別紙のとおり「第6図」の図面の番号を訂正する。 g 添付書類の目録 (1)「第6図(その1)」および「第6図(その2)
」写各1通 以 上 °ユニ(? tqt: Ser Glu Ser Gly Lys 
Tyr ValLeu Arg 八sp

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1)プロモーターおよび中性グロテアーゼ遺伝子のシグ
    ナルペプチドをコードする領域を含有し、中性プロテア
    ーゼをコードする領域を3′末端111から一部ないし
    全部欠<DNA0 2)シグナルペプチドがアミノ酸配列 Me、t −Gly−Lau−Gly−Lys−Lys
    −Leu−8er−Val −Ala−Val−Ala
    −Ala−8er−Phe−Met−8er−Leu−
    Thr−工1e−8er−Leu−Pro −Gly−
    Val−Gln−Alaで表わされるペプチドを含有す
    る特許請求の範囲第1項記載のDNA0 3)プロモーターが中性プロテアーゼプロモーターであ
    る特許請求の範囲!+または2項記載のDNA0 4)プロモーターの一35領域がTTGCAG 。 −10領域がTATTAT であるポリヌクレオチドで
    ある特許請求の範囲第1ないし3項記載のDN5)プロ
    モーターの一35狽域がAGTTTT。 −10領域がGAGATTGC’rであるポリヌクレオ
    チドである特許請求の範囲第1ないし3項記載のDNA
    0 6)プロモーターの一35領域がAATTC、−10領
    域がTAGT’l”TTATA であるポリヌクレオチ
    ドである特許請求の範囲第1ないし3項記載のDNA0 7)特許請求の範囲第4,5および6項記戦のポリヌク
    レオチドが100塩基以内のポリヌクレオチド鎖中に共
    存する特許請求の範囲第1ないし6項記載のDNA0 8)+00塩基以内のポリヌクレオチド鎖が5 ’uj
    lがAAT’L’Cで始まり、3′側がTATTAT 
    で終るポリヌクレオチドを含有する特ff’jn求の範
    囲第−rm記載のDNA0 9)ポリヌクレオチド鎖が AATTCAGCCGCGGAGTCTAGTTT’L
    ’ATATTGCAGAATGCGAGA午TGCTG
    GTTTATTATであるポリヌクレオチド全含有する
    特許請求の範囲第8項記載のDNA0
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JP (1) JPS60203194A (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0149241A2 (en) * 1983-12-28 1985-07-24 Agency Of Industrial Science And Technology DNA base sequence containing regions involved in the production and secretion of a protein, recombinant DNA including the whole or a part of the DNA base sequence, and method of producing proteins by use of the recombinant DNA
JPS62163691A (ja) * 1986-01-13 1987-07-20 Agency Of Ind Science & Technol ヒト成長ホルモンの生産法

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EP0149241A2 (en) * 1983-12-28 1985-07-24 Agency Of Industrial Science And Technology DNA base sequence containing regions involved in the production and secretion of a protein, recombinant DNA including the whole or a part of the DNA base sequence, and method of producing proteins by use of the recombinant DNA
JPS62163691A (ja) * 1986-01-13 1987-07-20 Agency Of Ind Science & Technol ヒト成長ホルモンの生産法

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