JPS60203194A - Ｄνａ - Google Patents
ＤνａInfo
- Publication number
- JPS60203194A JPS60203194A JP59060375A JP6037584A JPS60203194A JP S60203194 A JPS60203194 A JP S60203194A JP 59060375 A JP59060375 A JP 59060375A JP 6037584 A JP6037584 A JP 6037584A JP S60203194 A JPS60203194 A JP S60203194A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- promoter
- neutral protease
- dna
- gene
- region
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/57—IFN-gamma
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
- C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
- C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
- C12N9/86—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in cyclic amides, e.g. penicillinase (3.5.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はＤＮＡに関する。。
今日まで多くの組み換えＤＮＡ研究は大腸菌（Ｅ、 ｃ
ｏｌｉ） ｋ用いてなされており、すでに多くの異種遺
伝子が大腸菌内で発現されている。しかし、この方法で
は発現された遺伝子産物が菌体内に蓄積される。したが
って目的とする遺伝子産物を純粋な杉で取得するまでの
過程で、目的物の菌体からの抽出およびその抽出液から
の精製に多大な時開と労力とｋ”Ａ４するだけではなく
、目的とする物質ｒ完全な形で１ｆ（ｌｉ粋に得ること
自体がきわめて内陸である。
ｏｌｉ） ｋ用いてなされており、すでに多くの異種遺
伝子が大腸菌内で発現されている。しかし、この方法で
は発現された遺伝子産物が菌体内に蓄積される。したが
って目的とする遺伝子産物を純粋な杉で取得するまでの
過程で、目的物の菌体からの抽出およびその抽出液から
の精製に多大な時開と労力とｋ”Ａ４するだけではなく
、目的とする物質ｒ完全な形で１ｆ（ｌｉ粋に得ること
自体がきわめて内陸である。
バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ）属卸１菌は古くから種
々の菌体外酵素の生産菌として工業的に利用されておシ
、これら菌体外酵素の遺伝子のプロモーターおよびシグ
ナルペプチドケコードするＤＮＡ領域をクローニングし
、その下流に目的とする蛋白質の構造遺伝子を連結して
、これを枯草菌に導入すれば、目的とする蛋白１１ｉ１
１伝子産物として菌体外へ分泌させることが可能になる
と考えられる。
々の菌体外酵素の生産菌として工業的に利用されておシ
、これら菌体外酵素の遺伝子のプロモーターおよびシグ
ナルペプチドケコードするＤＮＡ領域をクローニングし
、その下流に目的とする蛋白質の構造遺伝子を連結して
、これを枯草菌に導入すれば、目的とする蛋白１１ｉ１
１伝子産物として菌体外へ分泌させることが可能になる
と考えられる。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ属州菌においては２分泌される蛋白質
はアミノ末端側におよそ２０〜３０アミノ酸残基からな
るシグナルペプチドを持つ前駆体として合成されたのち
、この部分がシグナルペプチダーゼによって切断されて
、成熟した蛋白質になると考えられている。すでにＢａ
ｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｙｕｅｆａ −ｃｉｅｎ
ｓのα−アミラーゼ遺伝子〔工、 Ｐａ１ｖａｅｔａｌ
： Ｇｅｎｅ、２２，２２９（１９８３））。
はアミノ末端側におよそ２０〜３０アミノ酸残基からな
るシグナルペプチドを持つ前駆体として合成されたのち
、この部分がシグナルペプチダーゼによって切断されて
、成熟した蛋白質になると考えられている。すでにＢａ
ｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｙｕｅｆａ −ｃｉｅｎ
ｓのα−アミラーゼ遺伝子〔工、 Ｐａ１ｖａｅｔａｌ
： Ｇｅｎｅ、２２，２２９（１９８３））。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｅのベニ
シリノー−ゼ遺伝子（Ｓ、 Ｃｈａｎ（７＋ ｅｔ ａ
Ｌ ： ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ
Ｇｅｎｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ １ｎＢａｃｉｌｌｉ
＋ Ａｃ’ａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ＋ ６５９頁、１
９８２年） ！ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ
のα−アミラーゼ遺伝子〔山根国男、化学と生物、２１
． ６５９１９８３））がクローン化され、これらのシ
グナルペプチドを利用した異種蛋白質の分泌が報告され
ている〇一方、 Ｂ、 ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉ
ｅｎ８のアルカリ性プロテアーゼ遺伝子もクローニング
され、その塩基配列が報告されている（ Ｊ、Ａ、Ｗｅ
ｌｌｓｅｔ ａｌ、 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒ
ｅ８．旦、 ７９１１（１９８３））。また、Ｂ、 ａ
ｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓの中性プロテアーゼ
遺伝子も最近クローン化されたと報告された（富岡登ら
９日本農芸化学会昭和５８年度大会講演要旨集、３３頁
）がその塩基配列を決定した結果、該遺伝子は中性プロ
テアーゼをコードしていないことが明らかにされた〔古
谷義夫：第１回次世代産業基盤技術シンポジウム予価集
、２２３頁、１９８３年〕。
シリノー−ゼ遺伝子（Ｓ、 Ｃｈａｎ（７＋ ｅｔ ａ
Ｌ ： ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ
Ｇｅｎｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ １ｎＢａｃｉｌｌｉ
＋ Ａｃ’ａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ＋ ６５９頁、１
９８２年） ！ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ
のα−アミラーゼ遺伝子〔山根国男、化学と生物、２１
． ６５９１９８３））がクローン化され、これらのシ
グナルペプチドを利用した異種蛋白質の分泌が報告され
ている〇一方、 Ｂ、 ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉ
ｅｎ８のアルカリ性プロテアーゼ遺伝子もクローニング
され、その塩基配列が報告されている（ Ｊ、Ａ、Ｗｅ
ｌｌｓｅｔ ａｌ、 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒ
ｅ８．旦、 ７９１１（１９８３））。また、Ｂ、 ａ
ｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓの中性プロテアーゼ
遺伝子も最近クローン化されたと報告された（富岡登ら
９日本農芸化学会昭和５８年度大会講演要旨集、３３頁
）がその塩基配列を決定した結果、該遺伝子は中性プロ
テアーゼをコードしていないことが明らかにされた〔古
谷義夫：第１回次世代産業基盤技術シンポジウム予価集
、２２３頁、１９８３年〕。
本発明者らはＢ、 ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ
ｓから既知のものとは異なる制限０累切断地図を有し、
中性プロテアーゼ遺伝子（（ｉむＤＮＡ（ｊクローン化
したことおよびこのＤＮＡ１ベクターに連結してＢａｃ
ｉｌｌｕｓ属菌に導入することにより、すぐれた中性プ
ロテアーゼ生産菌を肯種し得ることを見出し、このシグ
ナルベグチドｒコードする領域を利用すれば有用な分泌
ベクターの（１４築がｉ１Ｊ能であることを知って本発
明を完成した。
ｓから既知のものとは異なる制限０累切断地図を有し、
中性プロテアーゼ遺伝子（（ｉむＤＮＡ（ｊクローン化
したことおよびこのＤＮＡ１ベクターに連結してＢａｃ
ｉｌｌｕｓ属菌に導入することにより、すぐれた中性プ
ロテアーゼ生産菌を肯種し得ることを見出し、このシグ
ナルベグチドｒコードする領域を利用すれば有用な分泌
ベクターの（１４築がｉ１Ｊ能であることを知って本発
明を完成した。
すなわち、本発明はプロモーターおよび中性プロテアー
ゼ遺伝子のシグナルペプチドをコードする領域を含有し
、中性プロテアーゼをコードする領域ｔ−３′末端側か
ら一部ないし全部欠（ＤＮＡを提供するものである。
ゼ遺伝子のシグナルペプチドをコードする領域を含有し
、中性プロテアーゼをコードする領域ｔ−３′末端側か
ら一部ないし全部欠（ＤＮＡを提供するものである。
中性プロテアーゼ遺伝子のシグナルペプチドケコードす
る領域を含有するＤＮＡとしては中性フ。
る領域を含有するＤＮＡとしては中性フ。
ロチアーゼを産生ずる微生物のものであればいかなるも
のであってもよく、敵生物としてはたとえばＢ、 ａｍ
ｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｅなどの中性プロテアー
ゼを産生ずるＢａｃｉｌｌｕｓ属菌があげられる。
のであってもよく、敵生物としてはたとえばＢ、 ａｍ
ｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｅなどの中性プロテアー
ゼを産生ずるＢａｃｉｌｌｕｓ属菌があげられる。
プロモーターとしてはＢａｃｉｌｌｕｓ属菌体内でプロ
モーターとして機能するものであればいがなるものであ
ってもよく、たとえばメタフィロコツカス（５ｔａｐｂ
ｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ）ＩＬｉ４１ Ｂａｃｉｌｌｕｅ
ｋなどのグフム陽性菌から得られるプロモーターがあげ
られる。好ましくはＢａｃｉｌｌｕｓ Ｍ菌から得られ
るプロモーターがあげられ、該バチルス属菌としてはた
とえば、Ｂ、ｅｕｂｔｉｌｉｓ＋ Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｐｕｍｉｌｕｅ＋Ｂ、 ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉ
ｅｎｓなどがあげられ、自体公知のプロモーター（例、
７０ｇプロモーター。
モーターとして機能するものであればいがなるものであ
ってもよく、たとえばメタフィロコツカス（５ｔａｐｂ
ｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ）ＩＬｉ４１ Ｂａｃｉｌｌｕｅ
ｋなどのグフム陽性菌から得られるプロモーターがあげ
られる。好ましくはＢａｃｉｌｌｕｓ Ｍ菌から得られ
るプロモーターがあげられ、該バチルス属菌としてはた
とえば、Ｂ、ｅｕｂｔｉｌｉｓ＋ Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｐｕｍｉｌｕｅ＋Ｂ、 ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉ
ｅｎｓなどがあげられ、自体公知のプロモーター（例、
７０ｇプロモーター。
ＳＰＯ＋プロモーター、５ＰＯ２プロモーター）を用い
てもよい。
てもよい。
使用されるプロモーターは１個だけでも、また複数個を
直列に連結したものでもよい。
直列に連結したものでもよい。
上記プロモーターおよび中性プロテアーゼ遺伝子のシグ
ナルペプチドをコードするＤＮＡは上記した微生物の染
色体ＤＮＡから得ることができる。
ナルペプチドをコードするＤＮＡは上記した微生物の染
色体ＤＮＡから得ることができる。
菌体からの染色体ＤＮＡの調製はそれ自体公知であシ、
たとえばＬｏｖｅｔｔらの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ、ｙ、６８． ３４２ （１９７９
） ） など？用いて行うことができる。
たとえばＬｏｖｅｔｔらの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ、ｙ、６８． ３４２ （１９７９
） ） など？用いて行うことができる。
染色体ＤＮＡから中性プロテアーゼ遺伝子を含むＤＮＡ
断片をクローニングする宿主−ベクター系としては、ベ
クターに挿入された染色体ＤＮＡ断片上に中性プロテア
ーゼ遺伝子の存在が確認できるものであれば如何なるも
のであってもよく、好ましくは枯草菌宿主−ベクター系
があげられる。
断片をクローニングする宿主−ベクター系としては、ベ
クターに挿入された染色体ＤＮＡ断片上に中性プロテア
ーゼ遺伝子の存在が確認できるものであれば如何なるも
のであってもよく、好ましくは枯草菌宿主−ベクター系
があげられる。
ベクターを用いて中性プロテアーゼ遺伝子を含むＤＮＡ
断片をクローニングする場合、たとえば制限酵素を用い
てベクターを開袋させた後、ＤＮＡリガーゼを用いてＤ
ＮＡ断片ｋ ；Ｉ入し、これを用いて、たとえばＢａｃ
ｉｌｌｕｓ ｓｕ’ｂｔｉｌｉｓの中性プロテアーゼ非
生産株または低生産株を形質転換させることによって中
性プロテアーゼ産生株を選択すればよい。ベクターが薬
ハｔｌ ＋ｒｊｔ性遺伝子？有し、さらに該遺伝子上に
挿入不活性化部位會有する場合、該部位にＤＮＡ断片？
挿入することにより、薬剤に対する感受性全選択の指標
として利用することもできる。ベクターとしては具体的
にプラスミドｐＢ’Ｉ’Ｍ＋１９．ｐｔＪＢ１１０など
があげられる。
断片をクローニングする場合、たとえば制限酵素を用い
てベクターを開袋させた後、ＤＮＡリガーゼを用いてＤ
ＮＡ断片ｋ ；Ｉ入し、これを用いて、たとえばＢａｃ
ｉｌｌｕｓ ｓｕ’ｂｔｉｌｉｓの中性プロテアーゼ非
生産株または低生産株を形質転換させることによって中
性プロテアーゼ産生株を選択すればよい。ベクターが薬
ハｔｌ ＋ｒｊｔ性遺伝子？有し、さらに該遺伝子上に
挿入不活性化部位會有する場合、該部位にＤＮＡ断片？
挿入することにより、薬剤に対する感受性全選択の指標
として利用することもできる。ベクターとしては具体的
にプラスミドｐＢ’Ｉ’Ｍ＋１９．ｐｔＪＢ１１０など
があげられる。
菌体外中性プロテアーゼ産生株は、たとえば１％カゼイ
ンを含有する欅大培地上でコロニーのまわりにハローを
形成する株として選択できる。また中性プロテプーゼ低
生産株としては、たとえばＢ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｉ
Ａ ２７４に挙けることができる（ Ｔｈｅ Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ ５ｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅ
ｒ：Ｃａｔａｌｏｇ ｏｆ ５ｔｒａｉｎｓ＋ ２ｎｄ
ｅｄｄｉｔｉｏｎ（１９８２））。形質転換の方法そ
れ自体は公知であシ、たとえばプロトプラスト法（Ｓ、
Ｃｈａｎｇ＆Ｓ、Ｎ、 Ｃｏｈｅｎ： Ｍｏ１．Ｇｅｎ
、 Ｇｅｎｅｔ、＋ ＋６１Ｌ１１１（＋９７９））や
コンピテント法（Ｄ。
ンを含有する欅大培地上でコロニーのまわりにハローを
形成する株として選択できる。また中性プロテプーゼ低
生産株としては、たとえばＢ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｉ
Ａ ２７４に挙けることができる（ Ｔｈｅ Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ ５ｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅ
ｒ：Ｃａｔａｌｏｇ ｏｆ ５ｔｒａｉｎｓ＋ ２ｎｄ
ｅｄｄｉｔｉｏｎ（１９８２））。形質転換の方法そ
れ自体は公知であシ、たとえばプロトプラスト法（Ｓ、
Ｃｈａｎｇ＆Ｓ、Ｎ、 Ｃｏｈｅｎ： Ｍｏ１．Ｇｅｎ
、 Ｇｅｎｅｔ、＋ ＋６１Ｌ１１１（＋９７９））や
コンピテント法（Ｄ。
Ｄｕｂｎａｕ ＆ Ｒ，Ｄ、 ＡｂｅｌＢＯｎ＋ Ｊ、
Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、 ＋江、２０９（１９７１））
などを用いることができる。得られた形質転換株の自体
からプラスミドを抽出し、これをたとえば制限酵素で切
断後、たとえばアガロ−スゲ／Ｌ”ｊ［気泳動あるいは
ポリアクリルアミトゲＡ／［気泳動によって挿入された
中性プロテアーゼ遺伝子を含むＤＮＡ１単離することが
できる。これら一連の基本操作は公知であり、文献（Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ＥｎｚｙｍｏｌｏＥｙ＋ ６８（
１９７９） ； Ｍｏ１ｅｃｕｌａ、ｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ （１９８２）。
Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、 ＋江、２０９（１９７１））
などを用いることができる。得られた形質転換株の自体
からプラスミドを抽出し、これをたとえば制限酵素で切
断後、たとえばアガロ−スゲ／Ｌ”ｊ［気泳動あるいは
ポリアクリルアミトゲＡ／［気泳動によって挿入された
中性プロテアーゼ遺伝子を含むＤＮＡ１単離することが
できる。これら一連の基本操作は公知であり、文献（Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ＥｎｚｙｍｏｌｏＥｙ＋ ６８（
１９７９） ； Ｍｏ１ｅｃｕｌａ、ｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ （１９８２）。
Ｃｏ１ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ ）に詳しく記載されている。
ｏｒｙ ）に詳しく記載されている。
中性プロテアーゼ遺伝子を含むＤＮＡの塩基配列はたと
えばジデオキシヌクレオチ°ド合成鎖停止法（Ｐｚ・ｏ
ｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 ８ｃｉ、＋ ＵＳＡ、
７４ ＋５４６３ （１９７７） ） 、 Ｍａｘａｍ
−Ｇｉｌｂａｒｔ法（Ａ、 Ｍ、 Ｍａｘａｍ ＆ Ｗ
、 Ｇ１１ｂ６ｒｔ ： Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。
えばジデオキシヌクレオチ°ド合成鎖停止法（Ｐｚ・ｏ
ｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 ８ｃｉ、＋ ＵＳＡ、
７４ ＋５４６３ （１９７７） ） 、 Ｍａｘａｍ
−Ｇｉｌｂａｒｔ法（Ａ、 Ｍ、 Ｍａｘａｍ ＆ Ｗ
、 Ｇ１１ｂ６ｒｔ ： Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、 ８ｃｉ、、 ＵＳＡ、 ７４．５６０ （
１９７７） ）−■■用いて決定できる。ＤＮＡ中の中
性プロテアーゼ遺伝子の位置は決定されたＤＮＡの塩基
配列から翻訳されるアミノ酸配列と公知の中性プロテア
ーゼのアミノ酸配列（Ｐ、Ｌ、 Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ
：Ｐｒｏｃ。
１９７７） ）−■■用いて決定できる。ＤＮＡ中の中
性プロテアーゼ遺伝子の位置は決定されたＤＮＡの塩基
配列から翻訳されるアミノ酸配列と公知の中性プロテア
ーゼのアミノ酸配列（Ｐ、Ｌ、 Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ
：Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ−Ｓｃｉ、、 ＵＳＡ、 ７２．
４３４１（１９７５））とを比較することにより決定で
きる。また、ＤＮＡ中に中性プロテアーゼ遺伝子？含む
ことは該ＤＮＡ１含むプラスミドで形質転換させた宿主
の産生ずる成熟中性プロテアーゼのアミノ酸配列を決定
することにより確認することもできる。
４３４１（１９７５））とを比較することにより決定で
きる。また、ＤＮＡ中に中性プロテアーゼ遺伝子？含む
ことは該ＤＮＡ１含むプラスミドで形質転換させた宿主
の産生ずる成熟中性プロテアーゼのアミノ酸配列を決定
することにより確認することもできる。
中性プロテアーゼのシグナルペプチドをコードする領域
はアミノ酸配列として Ｍｅｔ −Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｅ−Ｌｙｓ−
Ｌｅｕ−３ｅｒ−ＶａＪ−−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−
Ａｌａ−８ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−８ｅｒ−Ｌｅｕ−’
Ｔｈｒ−工１ｅ −８ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ −Ｇｌｙ
−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｘ〔式中、Ｘ１ｄＡ１ａ またはＡ
ｌａ−Ａｌａ ’ｆｒ示す〕で表わされるペプチドをコ
ードするポリヌクレオチドである。該ポリヌクレオチド
は上記アミノ酸配列のペプチドをコードし、かつ機能し
うるものであればいかなるコドンであってもよい。また
、シグナルペプチドとしての機能を保持する限シ、それ
を構成するアミノ酸が挿入あるいは欠落または他のアミ
ノ酸に変更されても、それらペプチドをコードするポリ
ヌクレオチドをシグナルペプチドをコードする領域とし
て用いてもよい。
はアミノ酸配列として Ｍｅｔ −Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｅ−Ｌｙｓ−
Ｌｅｕ−３ｅｒ−ＶａＪ−−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−
Ａｌａ−８ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−８ｅｒ−Ｌｅｕ−’
Ｔｈｒ−工１ｅ −８ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ −Ｇｌｙ
−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｘ〔式中、Ｘ１ｄＡ１ａ またはＡ
ｌａ−Ａｌａ ’ｆｒ示す〕で表わされるペプチドをコ
ードするポリヌクレオチドである。該ポリヌクレオチド
は上記アミノ酸配列のペプチドをコードし、かつ機能し
うるものであればいかなるコドンであってもよい。また
、シグナルペプチドとしての機能を保持する限シ、それ
を構成するアミノ酸が挿入あるいは欠落または他のアミ
ノ酸に変更されても、それらペプチドをコードするポリ
ヌクレオチドをシグナルペプチドをコードする領域とし
て用いてもよい。
中性プロテアーゼ遺伝子のシグナルペプチドをコードす
る領ｊＸｋ含有し、中性プロテアーゼをコードする領域
を３′末端側から一部ないし全部欠くＤＮＡは、中性プ
ロテアーゼ遺伝子ヲ含むＤＮＡ全、たとえば制限酵素で
完全あるいは部分消化することにより得ることができる
。また、中性プロテアーゼ遺伝子を含むＤＮＡ’ｊ制限
酵素で切断して中性グロテアーゼ遺伝子を含む、よシ小
さなりＮＡ断断片全サグクローニングた後に、たとえば
制限酵素で完全あるいは部分消化してもよい。
る領ｊＸｋ含有し、中性プロテアーゼをコードする領域
を３′末端側から一部ないし全部欠くＤＮＡは、中性プ
ロテアーゼ遺伝子ヲ含むＤＮＡ全、たとえば制限酵素で
完全あるいは部分消化することにより得ることができる
。また、中性プロテアーゼ遺伝子を含むＤＮＡ’ｊ制限
酵素で切断して中性グロテアーゼ遺伝子を含む、よシ小
さなりＮＡ断断片全サグクローニングた後に、たとえば
制限酵素で完全あるいは部分消化してもよい。
サブクローニングは中性プロテアーゼ遺伝子のクローニ
ングと同様な方法に従って、ベクター上に、より小さな
りＮＡＭ片をクローニングし、その形質転換体がコロニ
ーの周囲にカゼインを分解したことを示すハローを形成
することを指標として中性プロテアーゼ遺伝子がクロー
ニングされたことを確認することができる。使用される
ベクターは枯草菌ベクターたとえばｐＢＴＭＩ１９．ｐ
ＵＢｌｌｏ、ｐｐＬ６０３などが挙げられる。
ングと同様な方法に従って、ベクター上に、より小さな
りＮＡＭ片をクローニングし、その形質転換体がコロニ
ーの周囲にカゼインを分解したことを示すハローを形成
することを指標として中性プロテアーゼ遺伝子がクロー
ニングされたことを確認することができる。使用される
ベクターは枯草菌ベクターたとえばｐＢＴＭＩ１９．ｐ
ＵＢｌｌｏ、ｐｐＬ６０３などが挙げられる。
また、中性プロテアーゼ遺伝子のシグナルペプチドをコ
ードする領域を含有するＤＮＡは自体公知の方法、たと
えばトリエステル法（Ｐｒｏｃ。
ードする領域を含有するＤＮＡは自体公知の方法、たと
えばトリエステル法（Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 、 ＵＳＡ、 ７
５．５７６５（１９７Ｂ）：）によって化学的に全合成
あるいは半合成したものでもよい。
５．５７６５（１９７Ｂ）：）によって化学的に全合成
あるいは半合成したものでもよい。
染色体Ｄｍｈｗ用いてプロモーター活性を有するＤＮＡ
断片をクローニングする場合に用いられるベクター（プ
ロモータークローニングベクター）としては、たとえば
制限酵素切１１Ｊｒ部位にバチルス属菌の染色体ＤＮＡ
断片を挿入させ、その１４ｊｒ片中にプロモーターが存
在していることを知ることが出来るプラスミドでおれば
いかなるものであってもよく、たとえばプルモータ一部
分が欠損した遺伝子を有するプラスミドなどがあげられ
、具体的には１ラスミドｐＰＬ６０３（ｐＢＴＭ１２６
）（Ｊ−Ｂａｃｔ６ｒｉｏ１． 、１４６．１１６２
（１９８１） ） などがあげられる。
断片をクローニングする場合に用いられるベクター（プ
ロモータークローニングベクター）としては、たとえば
制限酵素切１１Ｊｒ部位にバチルス属菌の染色体ＤＮＡ
断片を挿入させ、その１４ｊｒ片中にプロモーターが存
在していることを知ることが出来るプラスミドでおれば
いかなるものであってもよく、たとえばプルモータ一部
分が欠損した遺伝子を有するプラスミドなどがあげられ
、具体的には１ラスミドｐＰＬ６０３（ｐＢＴＭ１２６
）（Ｊ−Ｂａｃｔ６ｒｉｏ１． 、１４６．１１６２
（１９８１） ） などがあげられる。
プロモーター活性ケ有するＤＮＡ断片は染色体ＤＮＡ断
片が挿入されたベクターで形質転換させた菌株から目体
公知の方法で１ラスミド１［製した後、これを、たとえ
ば制限酵素で切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動
、アガロ−スゲ／ｌ／電気泳動などの自体公知の方法？
用いて単離することができる。また、単離されたＤＮＡ
断片の塩基配列は自体公知の方法、たとえばジデオキシ
ヌクレオチド合成順序止法（前出） ＋ Ｍａｘａｍ−
Ｇｉｌｂｅｒｔ法〔曲用〕を用いて決定できる。
片が挿入されたベクターで形質転換させた菌株から目体
公知の方法で１ラスミド１［製した後、これを、たとえ
ば制限酵素で切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動
、アガロ−スゲ／ｌ／電気泳動などの自体公知の方法？
用いて単離することができる。また、単離されたＤＮＡ
断片の塩基配列は自体公知の方法、たとえばジデオキシ
ヌクレオチド合成順序止法（前出） ＋ Ｍａｘａｍ−
Ｇｉｌｂｅｒｔ法〔曲用〕を用いて決定できる。
また、プロモーター活性を有するＤｍＡ＋ａｌｒ片は自
体公知の方法、たとえばトリエステル法を用いて化学合
成することもできる５ 上記で得られる中性１０テアーゼ遺伝子のシグナルペプ
チドをコードする領域を含有するＤＮＡとプロモーター
活性を有するＤＮＡ断片は自体公知の方法によって連結
し、これをプラスミドに挿入すればプロモーターと中性
プロテアーゼ遺伝子のシグナルペプチド金コードする領
域を有するベクター′ｆｆ：構築することができる。ま
た、中性グロテアーゼ遺伝子のシグナルペプチドをコー
ドする領域を含有するＤｌｉＡ断片およびプロモーター
活性を有するＤＮＡ断片の一方が挿入されたベクターに
他方を挿入することによってプロモーターと中性プロテ
アーゼ遺伝子のシグナルペプチドをコードする領域を有
するベクターを構築することもできる。プロモーターと
して中性プロテアーゼプロモーターを用いる場合にはプ
ロモーターと中性プロテアーゼのシグナｐペプチド？コ
ードする領域を切断せずにベクター構築のために用いて
もよい。
体公知の方法、たとえばトリエステル法を用いて化学合
成することもできる５ 上記で得られる中性１０テアーゼ遺伝子のシグナルペプ
チドをコードする領域を含有するＤＮＡとプロモーター
活性を有するＤＮＡ断片は自体公知の方法によって連結
し、これをプラスミドに挿入すればプロモーターと中性
プロテアーゼ遺伝子のシグナルペプチド金コードする領
域を有するベクター′ｆｆ：構築することができる。ま
た、中性グロテアーゼ遺伝子のシグナルペプチドをコー
ドする領域を含有するＤｌｉＡ断片およびプロモーター
活性を有するＤＮＡ断片の一方が挿入されたベクターに
他方を挿入することによってプロモーターと中性プロテ
アーゼ遺伝子のシグナルペプチドをコードする領域を有
するベクターを構築することもできる。プロモーターと
して中性プロテアーゼプロモーターを用いる場合にはプ
ロモーターと中性プロテアーゼのシグナｐペプチド？コ
ードする領域を切断せずにベクター構築のために用いて
もよい。
目的とする蛋白質は転写開始に必要なプロモーター、リ
ポソーム結合部位（ＳＤ配列）および中性プロテアーゼ
遺伝子のシグナルペプチド金コードする領域の下流に目
的とする蛋白質會コードする遺伝子を連結させたＤＮＡ
でバチルス属菌全形質転換させ、得られる形質転換株を
培養することによ勺得ることができる。
ポソーム結合部位（ＳＤ配列）および中性プロテアーゼ
遺伝子のシグナルペプチド金コードする領域の下流に目
的とする蛋白質會コードする遺伝子を連結させたＤＮＡ
でバチルス属菌全形質転換させ、得られる形質転換株を
培養することによ勺得ることができる。
上記のＳＤ配列としては枯草菌内で機能するものであれ
ばいかなるものであっ°てもよく、またその配列のいく
つかは、すでに公知である（ Ｊ、Ｒ。
ばいかなるものであっ°てもよく、またその配列のいく
つかは、すでに公知である（ Ｊ、Ｒ。
ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ： Ｊ、 Ｂｉｏｌ
、 Ｃｈｅｍ、＋ ２５６ ＋１１２８３（＋９８１
ン ＋ Ｃ，Ｐ、Ｍｏｒａｎ Ｊｒ、ｅｔ ａｌ：Ｍｏ
１． Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、 １８Ｌ ４３９
（１９８２）：）。
、 Ｃｈｅｍ、＋ ２５６ ＋１１２８３（＋９８１
ン ＋ Ｃ，Ｐ、Ｍｏｒａｎ Ｊｒ、ｅｔ ａｌ：Ｍｏ
１． Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、 １８Ｌ ４３９
（１９８２）：）。
したがって、ＳＤ配列を含むオリゴヌクレオチドを染色
体ＤＮＡから単重するか、または自体公知の方法、たと
えばトリエステル法（前出）によって化学合成し、プロ
モーターと中性グロテアーゼ遺伝子のシグナルペプチド
をコードする領域を有するベクターにおいてプロモータ
ーの下流に挿入すればめる発現ベクターを構築すること
ができる。
体ＤＮＡから単重するか、または自体公知の方法、たと
えばトリエステル法（前出）によって化学合成し、プロ
モーターと中性グロテアーゼ遺伝子のシグナルペプチド
をコードする領域を有するベクターにおいてプロモータ
ーの下流に挿入すればめる発現ベクターを構築すること
ができる。
目的とする蛋白質？コードする遺伝子を連結する位置は
たとえば、中性プロテアーゼ遺伝子のシグナルペプチド
をコードする領域の直後、成４１中性フロテアーゼをコ
ードする領域の直前、または連結されている中性プロテ
アーゼ遺伝子内などの位置があげられる。
たとえば、中性プロテアーゼ遺伝子のシグナルペプチド
をコードする領域の直後、成４１中性フロテアーゼをコ
ードする領域の直前、または連結されている中性プロテ
アーゼ遺伝子内などの位置があげられる。
発現に使用される遺伝子は介在配列を有さす、かつ塩基
配列の明らかなものがより望ましく、染色体から単離さ
れた遺伝子、ｍＲＮＡから得られた相補ＤＮＡ 、化学
合成した遺伝子、半合成遺伝子などいかなるものであっ
てもよい。具体的にはＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）表面
抗原遺伝子、ＨＢＹコア抗原遺伝子、免疫グロブリンＥ
遺伝子。
配列の明らかなものがより望ましく、染色体から単離さ
れた遺伝子、ｍＲＮＡから得られた相補ＤＮＡ 、化学
合成した遺伝子、半合成遺伝子などいかなるものであっ
てもよい。具体的にはＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）表面
抗原遺伝子、ＨＢＹコア抗原遺伝子、免疫グロブリンＥ
遺伝子。
ヒト成長ホルモン遺伝子、インターロイキン−２遺伝子
、免疫インターフェロン遺伝子などがあげられ、該遺伝
子の全部または゛その一部ある込は複数種の遺伝子音連
結したものを便）１３Ｌ、てもよい。
、免疫インターフェロン遺伝子などがあげられ、該遺伝
子の全部または゛その一部ある込は複数種の遺伝子音連
結したものを便）１３Ｌ、てもよい。
また、これらの遺伝子を発現ベクターに挿入して発現デ
ラヌミドを構築する際、必要に応じ′Ｃ適当な合成オリ
ゴヌクレオチドを遺伝子に連結させてもよい。
ラヌミドを構築する際、必要に応じ′Ｃ適当な合成オリ
ゴヌクレオチドを遺伝子に連結させてもよい。
このようにして得られるグフスミドでバチルス属菌を形
質転換させる場合、宿主は特に限定する必要はなく、た
とえば、Ｂ、 ５ｕｂｔｉ：Ｌｉｓ ＢＧＳＣＩＡ ｌ
＋ＢＧＳＣＩ Ａ２７４ （Ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ＧｅｎｅｔｉｃＳｔｏｃｋ Ｇｅｎｔｅｒ： Ｃａｔ
ａｌｏｇ ｏｆ ５ｔｒａｉｎｓ ＋２ｎｄ ｅｄｉｔ
ｉｏｎ （１９８２））などのＢａｃｉｌｌｕｓ ＭＳ
４陶が苗げられ、なかでもグロテアーゼ低生産株または
非生産株が好ましい。
質転換させる場合、宿主は特に限定する必要はなく、た
とえば、Ｂ、 ５ｕｂｔｉ：Ｌｉｓ ＢＧＳＣＩＡ ｌ
＋ＢＧＳＣＩ Ａ２７４ （Ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ＧｅｎｅｔｉｃＳｔｏｃｋ Ｇｅｎｔｅｒ： Ｃａｔ
ａｌｏｇ ｏｆ ５ｔｒａｉｎｓ ＋２ｎｄ ｅｄｉｔ
ｉｏｎ （１９８２））などのＢａｃｉｌｌｕｓ ＭＳ
４陶が苗げられ、なかでもグロテアーゼ低生産株または
非生産株が好ましい。
得られる形質転換株の培養に使用される培地としては形
質転換株が生首して菌体外に目的とする蛋白質を産生じ
得るものであればいかなるものであってもよい。
質転換株が生首して菌体外に目的とする蛋白質を産生じ
得るものであればいかなるものであってもよい。
該培地に・ａ有される広本１としては、たとえばグルコ
ース、シュークロース、クリセリン、でん粉、デキスト
リン、曲ｈε、有機酸などが月いられる。該培地に含有
される窒素源としては、カゼイン、ペプトン、肉エキス
、酵母エギス、カザミノ酸〔ディフコ社（米国）製〕、
ＮＺ−アミン人〔シェフイールド社（米国）製〕、ソイ
ビーンミーμ、落丁生粉などの４−根屋素源、硫酸アン
モニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの
無機類素読が用いられる。その他、カルシウム塩、マグ
ネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム徳、リン酸塩、マ
ンガン塩、鉄塩、コバルト塩などの無機塩が必要に応じ
て培地に添加される。さらに、栄養要求を示す１株を用
いる場合は、その生首に必要な栄養物質を培地に添加す
ればよい。該栄誉物質としては、たとえば、アミノ酸類
、ビタミン類、核酸塩基類などが挙げられる。
ース、シュークロース、クリセリン、でん粉、デキスト
リン、曲ｈε、有機酸などが月いられる。該培地に含有
される窒素源としては、カゼイン、ペプトン、肉エキス
、酵母エギス、カザミノ酸〔ディフコ社（米国）製〕、
ＮＺ−アミン人〔シェフイールド社（米国）製〕、ソイ
ビーンミーμ、落丁生粉などの４−根屋素源、硫酸アン
モニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの
無機類素読が用いられる。その他、カルシウム塩、マグ
ネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム徳、リン酸塩、マ
ンガン塩、鉄塩、コバルト塩などの無機塩が必要に応じ
て培地に添加される。さらに、栄養要求を示す１株を用
いる場合は、その生首に必要な栄養物質を培地に添加す
ればよい。該栄誉物質としては、たとえば、アミノ酸類
、ビタミン類、核酸塩基類などが挙げられる。
さらに必要により、消泡剤（例、大豆油、ラード油など
）などを培地に加えてもより０また、培養に除して必要
があれば、培地に抗生物質たとえばクロラムフェニコー
ルが加えられる。
）などを培地に加えてもより０また、培養に除して必要
があれば、培地に抗生物質たとえばクロラムフェニコー
ルが加えられる。
培養温良は、通常約１５℃ないし４２’Ｃ，さらに好ま
しくは約２４”Ｃないし３７°Ｃ”’Ｃあり、培地のｐ
Ｈは初発ｐＨが約５１口ないし９．０でありさらに好ま
しくは約６．５ないし７．５である。
しくは約２４”Ｃないし３７°Ｃ”’Ｃあり、培地のｐ
Ｈは初発ｐＨが約５１口ないし９．０でありさらに好ま
しくは約６．５ないし７．５である。
培養時間は、通常約３ないし７２時間、さらに好１しく
は約５ないし４８時間である。
は約５ないし４８時間である。
目的とする蛋白質は自体公知の方法、たとえば遠心分離
などの方法で菌体を除去した後、−俸公知の弧白屓精製
法に従って拍製することができる。
などの方法で菌体を除去した後、−俸公知の弧白屓精製
法に従って拍製することができる。
本発明はさらにバチルス属菌出来の新規なグロモーター
に関する。
に関する。
バチルス属菌ではその細胞の生長時期により異なるＲＮ
Ａポリメラーゼが働きそれらによって認識されるプロモ
ーター仙域の異なるものがあることが知られている（
Ｎａｔｕｒｅ、 ３０２．８００（１９８３））。
Ａポリメラーゼが働きそれらによって認識されるプロモ
ーター仙域の異なるものがあることが知られている（
Ｎａｔｕｒｅ、 ３０２．８００（１９８３））。
すなわち、栄養細胞におけるＲＮＡポリメラーゼ（例、
Ｅσ ）と胞子形成細胞におけるＲＮＡポリメラーゼ（
例、Ｅσ 、Ｅσ ）はそれぞれ認識するプロモーター
領域が異なることが知られている。
Ｅσ ）と胞子形成細胞におけるＲＮＡポリメラーゼ（
例、Ｅσ 、Ｅσ ）はそれぞれ認識するプロモーター
領域が異なることが知られている。
本発明者らは中性グロテアーゼ遺伝子の発現根絶を鋭意
研究した結果、中性プロテアーゼ遺伝子ｔ−発現させる
ためのプロモーター（中性プロテアーゼプロモーター）
が優れた特性を有すること金知り、本発明全完成した。
研究した結果、中性プロテアーゼ遺伝子ｔ−発現させる
ためのプロモーター（中性プロテアーゼプロモーター）
が優れた特性を有すること金知り、本発明全完成した。
すなわち、本発明は一３５領域がＴＴＧＣＡＧ。
−１０領域がＴＡＴＴＡＴ（Ｅσ５５）であるか、−３
５領域がＡＧＴＴＴＴ、−１０領域がＧＡＧＡＴＴＯＣ
Ｔ（Ｅσ３７）であるか、または−３５領域がＡＡＴＴ
Ｃ。
５領域がＡＧＴＴＴＴ、−１０領域がＧＡＧＡＴＴＯＣ
Ｔ（Ｅσ３７）であるか、または−３５領域がＡＡＴＴ
Ｃ。
−１０領域がＴＡＧＴＴＴＴＡＴＡ（Ｅσ３２）でおる
プロモーターを提供するものである。
プロモーターを提供するものである。
プロモーターはたとえばＢ、 ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆ
ａｃｉ −ｅｎｓ などの中性プロテアーゼを産生する
Ｂａｃｉｌｌｕｓ属菌の染色体から得ることができる。
ａｃｉ −ｅｎｓ などの中性プロテアーゼを産生する
Ｂａｃｉｌｌｕｓ属菌の染色体から得ることができる。
また、自体公知の方法を用いて化学合成したものであっ
てもよい。
てもよい。
本発明のプロモーターの下流に目的とする蛋白質をコー
ドする遺伝子全連結したＤＮＡでＢａｃｉｌｌｕａ属菌
を形質転換させ、該組み換え体を培養すれば、目的とす
る蛋白質２Ｉることができる。目的とする蛋白質の菌体
外産生のために、プロモーターと該遺伝子の間に中性プ
ロテアーゼ遺伝子のシグナルペプチド會コードする領域
？挿入したＤＮＡを用いてもよい。
ドする遺伝子全連結したＤＮＡでＢａｃｉｌｌｕａ属菌
を形質転換させ、該組み換え体を培養すれば、目的とす
る蛋白質２Ｉることができる。目的とする蛋白質の菌体
外産生のために、プロモーターと該遺伝子の間に中性プ
ロテアーゼ遺伝子のシグナルペプチド會コードする領域
？挿入したＤＮＡを用いてもよい。
プロモーター中にはＲＮＡポリメラーゼの認識部位が少
なくとも１つあればよいが、異なった生長時期（例、栄
養＃ｌ胞、胞子形成細胞）でもプロモーターとしての機
能を発揮させるために、複数種のＲＮＡポリメラーゼの
認識部位を有するプロモーターがよシ好ましい。
なくとも１つあればよいが、異なった生長時期（例、栄
養＃ｌ胞、胞子形成細胞）でもプロモーターとしての機
能を発揮させるために、複数種のＲＮＡポリメラーゼの
認識部位を有するプロモーターがよシ好ましい。
以下に参考例、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説
明するが、本発明はこれらに限定されるべきものではな
い。
明するが、本発明はこれらに限定されるべきものではな
い。
参考例１
クローニングベクターｐＢＴＭＩＩ９の構築ｉ）薬剤耐
性プラスミドの調製 財団法人発酵研究所（工ＦＯ）に受託番号工ＦＯ−１４
２０３として寄「〔されているクロラムフェニコール耐
性のスタフィロコッカス・エビデルミゾイス（５ｔａｐ
ｈｙｌｏｃｏｃｃｕｅ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）ＦＳ
５０３０會１ｇ６トリグトン（ディフコ社、米国）。
性プラスミドの調製 財団法人発酵研究所（工ＦＯ）に受託番号工ＦＯ−１４
２０３として寄「〔されているクロラムフェニコール耐
性のスタフィロコッカス・エビデルミゾイス（５ｔａｐ
ｈｙｌｏｃｏｃｃｕｅ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）ＦＳ
５０３０會１ｇ６トリグトン（ディフコ社、米国）。
０．５９６酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム。
ｐＨ７，２からなる５ｗｔのＬ培地を含む試練管で３０
°Ｃ９１８時間振とり培養した。得られた培養液２０
ｚｔ （試験管４本分）を遠心分離し、菌体を１０ｍＭ
、ＥＤＴＡ、ｐＨ８，０で洗浄したのち２ｗｔのＴＢＬ
−＋ｒａ菌酵素溶液（１”ｆ／ｓｌ 、’ １０ ｍＭ
ＥＤＴＡ、］）Ｈ８，０）に簡渇し、３７°Ｃｆ３０分
間保温した。４ｗｔの１％ラウリｌｖ硫酸ナトリウムを
含む０．２Ｈ水酸化ナトリウムを加えて混合し・０℃で
５分間放ばした。さらに６ｗｔの３Ｍｌ’ｔｌｉ１ｍナ
トリウム（ｐＨ４、８）を加えて混合し、０°Ｃで６０
分間放置したのち遠心分離した。その上清に２倍量の冷
エタノーＡ／’ｉ加え、−２０℃で１夜放置し、遠心分
離した。沈澱ｋＯ，４ｔｇｌの０．４％ザμコシールに
浴解し、２．４ｗｔ１のＴＥＳ籾賞液よびＢＭＩの冷エ
タノー／Ｉ／？加えたのち、−２０°Ｃで１夜放置し、
遠心分離した。沈澱を０．４ｗｔのＴＥｄ向液（１０ｍ
Ｍ）リス・塩酸Ｈｍｓ液ｐＨ８，０、，１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ）に溶解し、同じｔｌ 伸ｓ ｉ＆ Ｔ透析して粗プ
ラヌミドを調製した。
°Ｃ９１８時間振とり培養した。得られた培養液２０
ｚｔ （試験管４本分）を遠心分離し、菌体を１０ｍＭ
、ＥＤＴＡ、ｐＨ８，０で洗浄したのち２ｗｔのＴＢＬ
−＋ｒａ菌酵素溶液（１”ｆ／ｓｌ 、’ １０ ｍＭ
ＥＤＴＡ、］）Ｈ８，０）に簡渇し、３７°Ｃｆ３０分
間保温した。４ｗｔの１％ラウリｌｖ硫酸ナトリウムを
含む０．２Ｈ水酸化ナトリウムを加えて混合し・０℃で
５分間放ばした。さらに６ｗｔの３Ｍｌ’ｔｌｉ１ｍナ
トリウム（ｐＨ４、８）を加えて混合し、０°Ｃで６０
分間放置したのち遠心分離した。その上清に２倍量の冷
エタノーＡ／’ｉ加え、−２０℃で１夜放置し、遠心分
離した。沈澱ｋＯ，４ｔｇｌの０．４％ザμコシールに
浴解し、２．４ｗｔ１のＴＥＳ籾賞液よびＢＭＩの冷エ
タノー／Ｉ／？加えたのち、−２０°Ｃで１夜放置し、
遠心分離した。沈澱を０．４ｗｔのＴＥｄ向液（１０ｍ
Ｍ）リス・塩酸Ｈｍｓ液ｐＨ８，０、，１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ）に溶解し、同じｔｌ 伸ｓ ｉ＆ Ｔ透析して粗プ
ラヌミドを調製した。
クロラムフェニコール耐性のＳ、 ｅｐｉｄｅｒｍｉｄ
ｉｓＦＳ５０３０の粗プフヌミド？用いて、プロトプラ
スト法によるＢａｃｉｌｌｕｓ ａｕｂｔｉｌｉｅ Ｊ
Ｂ−１−１６８（工ＦＯ−１４１４４）のル賀転換を行
い、クロラムフェニコール耐性（１２，５μ′ｇクロラ
ムフエニコーＩＬ／／ｍｅで生Ｔ４）の゛形質転換株全
分離−した。このように、このプラスミドがＢａｃｉｌ
ｌｕｓ１２４でも増殖可ｒｆｌデであり、Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ属菌内でその遺伝子ケ発現させ得ることから、この
プラスミドがＢａｃｉｌｌｕｓ属のベクターとなシ得る
ことが明らかとなった。そこで、形質転°換株の中から
クロラムフェニコール耐性を示すものｋ Ｂ、 ５ｕｂ
ｔｉｌｉｓ’Ｉ’２３と命名し、選択した。
ｉｓＦＳ５０３０の粗プフヌミド？用いて、プロトプラ
スト法によるＢａｃｉｌｌｕｓ ａｕｂｔｉｌｉｅ Ｊ
Ｂ−１−１６８（工ＦＯ−１４１４４）のル賀転換を行
い、クロラムフェニコール耐性（１２，５μ′ｇクロラ
ムフエニコーＩＬ／／ｍｅで生Ｔ４）の゛形質転換株全
分離−した。このように、このプラスミドがＢａｃｉｌ
ｌｕｓ１２４でも増殖可ｒｆｌデであり、Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ属菌内でその遺伝子ケ発現させ得ることから、この
プラスミドがＢａｃｉｌｌｕｓ属のベクターとなシ得る
ことが明らかとなった。そこで、形質転°換株の中から
クロラムフェニコール耐性を示すものｋ Ｂ、 ５ｕｂ
ｔｉｌｉｓ’Ｉ’２３と命名し、選択した。
このＢ、’５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｔ ２３ ｋ Ｌ培地で
２８℃。
２８℃。
１６時間振とり培養した。得られた５００ｇｆｆの培養
液を遠心分離して集めた菌体に、６０ｔｒｔｌの２５％
シヨ語？含むＴＥＳＦＡ陶液、ｌ２ｔｘｉ’の０．２５
Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ８，０，１６１１１の５り／ ｍｅ
リゾチーム溶液および０．８ｍｌの５ ’ｆ ／ ＃Ｉ
ｌリボヌクレアーゼＡ溶漱を加え、３７″Ｃで３０分間
保温した。さらにＦ３ｘｌの１０％ヲウリ／Ｉ／硫酸ナ
トリウム？加え、３７℃で１５分間保温した。つぎに２
０μｌの５Ｍ塩化ナトリウムを加え、口°Ｃで３時間放
置したのち遠心分離した。その上清に２倍容の冷エタノ
ールを加え、−２０°Ｃで１夜放置した。遠心分離して
得られた沈澱ｔ８．６ｔｘｔの０．４４ザμコンールを
含むＴＨＥｉ繭液に溶かし、９Ｆの塩化セシウムおよび
０．２５μｌの３０ｑ／ｌｅｌエチジウムブロマイド溶
液を加えたのち、ベックマン超遠心機（ローター５０Ｔ
ｉ）を用いて２０゛Ｃで３８．０００μｌｍ で４８時
間遠心した。紫外線照射によって検出されるグラスミド
のバンドを取り、これに（比Ｍ）＝１．６の塩化セシウ
ム−エチジウムブロマイド溶液を加え、再び３８，００
０ ｒｐｍで４８時間遠心した。プラスミドのバンドを
取り、ｎ−７”タノーμ抽出によってエチジウムブロマ
イドを除去したのちＴＥ緩耐液で透４７Ｆシ、クロラム
フェニコール耐性プラスミドｐＢＴＭ１０３ ｋ’４た
。
液を遠心分離して集めた菌体に、６０ｔｒｔｌの２５％
シヨ語？含むＴＥＳＦＡ陶液、ｌ２ｔｘｉ’の０．２５
Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ８，０，１６１１１の５り／ ｍｅ
リゾチーム溶液および０．８ｍｌの５ ’ｆ ／ ＃Ｉ
ｌリボヌクレアーゼＡ溶漱を加え、３７″Ｃで３０分間
保温した。さらにＦ３ｘｌの１０％ヲウリ／Ｉ／硫酸ナ
トリウム？加え、３７℃で１５分間保温した。つぎに２
０μｌの５Ｍ塩化ナトリウムを加え、口°Ｃで３時間放
置したのち遠心分離した。その上清に２倍容の冷エタノ
ールを加え、−２０°Ｃで１夜放置した。遠心分離して
得られた沈澱ｔ８．６ｔｘｔの０．４４ザμコンールを
含むＴＨＥｉ繭液に溶かし、９Ｆの塩化セシウムおよび
０．２５μｌの３０ｑ／ｌｅｌエチジウムブロマイド溶
液を加えたのち、ベックマン超遠心機（ローター５０Ｔ
ｉ）を用いて２０゛Ｃで３８．０００μｌｍ で４８時
間遠心した。紫外線照射によって検出されるグラスミド
のバンドを取り、これに（比Ｍ）＝１．６の塩化セシウ
ム−エチジウムブロマイド溶液を加え、再び３８，００
０ ｒｐｍで４８時間遠心した。プラスミドのバンドを
取り、ｎ−７”タノーμ抽出によってエチジウムブロマ
イドを除去したのちＴＥ緩耐液で透４７Ｆシ、クロラム
フェニコール耐性プラスミドｐＢＴＭ１０３ ｋ’４た
。
２６０ｎｍの吸光度から約７５μｇのプラスミドが得ら
れたことがわかった。
れたことがわかった。
１１）クローニングベクターの構築
４．５μｇのｐｎＴＭ１０３を制限酵素ＨｐａＩＩで３
７℃、６０分間完全消化した。いっぽう６．７５μｇの
ｐＵＢｌｌｏ（Ｊ、 Ｓｃｈｅｅｒ−Ａｂｒａｍｏｗｉ
ｔｚ ｅｔａｌ 、 ＊ Ｐｌａｓｍｉｄ 、下−，６
７（１９８１）＆照〕を制限酵素Ｈｐａｌ［で３７°Ｃ
，１Ｆ間消化した。自反応液を６５°Ｃで１５分間加熱
処理して反応を停止させ、エタノール沈［−行った。両
沈澱をそれぞれ３５μｌの水にＲ１／Ｎして混合し、６
６ｎモルのアデノシン三すン酸、１０ユニットのＴ４］
）ＮＡリガーゼ存在下で１１”Ｃ，３１時間反応させ、
エタノ−ｐ沈澱を行った。沈澱を５０μｌのＴＥ緩鮪液
に溶かし、その２５ ｔｔｌｊ ｋ用いてＢ、 ５ｕｂ
ｔｉｌｉｓ ＪＢ−１−１６８の形質転換を行った。カ
ナマイシンおよびクロラムフェニコールの両方に耐性を
示す形質転換株の中からＢ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｔ
３９ を選び、この菌株の培養液５００ｙｔｌから参考
例１−１）と同様の方法で複合グラスミドｐＢ’ｌ’Ｍ
１１９ （２０９μｇ）を得た。 グラスミドｐＢＴ
Ｍ １１９の分子量は約３．２５メガダμトンであり、
その制限酵素切断地図は第１図のごとくであった。
７℃、６０分間完全消化した。いっぽう６．７５μｇの
ｐＵＢｌｌｏ（Ｊ、 Ｓｃｈｅｅｒ−Ａｂｒａｍｏｗｉ
ｔｚ ｅｔａｌ 、 ＊ Ｐｌａｓｍｉｄ 、下−，６
７（１９８１）＆照〕を制限酵素Ｈｐａｌ［で３７°Ｃ
，１Ｆ間消化した。自反応液を６５°Ｃで１５分間加熱
処理して反応を停止させ、エタノール沈［−行った。両
沈澱をそれぞれ３５μｌの水にＲ１／Ｎして混合し、６
６ｎモルのアデノシン三すン酸、１０ユニットのＴ４］
）ＮＡリガーゼ存在下で１１”Ｃ，３１時間反応させ、
エタノ−ｐ沈澱を行った。沈澱を５０μｌのＴＥ緩鮪液
に溶かし、その２５ ｔｔｌｊ ｋ用いてＢ、 ５ｕｂ
ｔｉｌｉｓ ＪＢ−１−１６８の形質転換を行った。カ
ナマイシンおよびクロラムフェニコールの両方に耐性を
示す形質転換株の中からＢ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｔ
３９ を選び、この菌株の培養液５００ｙｔｌから参考
例１−１）と同様の方法で複合グラスミドｐＢ’ｌ’Ｍ
１１９ （２０９μｇ）を得た。 グラスミドｐＢＴ
Ｍ １１９の分子量は約３．２５メガダμトンであり、
その制限酵素切断地図は第１図のごとくであった。
参考例２
プロモータークローニングベクターｐＢＴＭ１２６の構
築 グラスミドｐＢＴＭ１２６は、Ｗｉｌｌｉａｍｓらの方
法（Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、 １４６ 、１１６
２（１９８１） ）に従い以下のように作製した。財団
法人発酵研究所より入手したＢ、 ｐｕｍｉｌｕｓ Ｎ
Ｃ１Ｂ８６０’０（工ＦＯ−１２０８９）よシＤＮＡ
をルｔ１１製し、そのＤＮＡ（６，５μｇ ）を４０ユ
ニツトの制限酵素ＥｃｏＲ工と３７℃、１時間反応させ
て切断したのち、６８℃で１５分間加熱し、エタノール
沈蝕ヲ行った。
築 グラスミドｐＢＴＭ１２６は、Ｗｉｌｌｉａｍｓらの方
法（Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、 １４６ 、１１６
２（１９８１） ）に従い以下のように作製した。財団
法人発酵研究所より入手したＢ、 ｐｕｍｉｌｕｓ Ｎ
Ｃ１Ｂ８６０’０（工ＦＯ−１２０８９）よシＤＮＡ
をルｔ１１製し、そのＤＮＡ（６，５μｇ ）を４０ユ
ニツトの制限酵素ＥｃｏＲ工と３７℃、１時間反応させ
て切断したのち、６８℃で１５分間加熱し、エタノール
沈蝕ヲ行った。
一方、プラスミドｐＵＢ１１０（２，０μｇ ）を２０
ユニツトの制限酵素ＥＣＯＲ工 と３７°Ｃで１時間反
応させて切断したのち、６８°Ｃで１５分間加熱し、エ
タノ−μ沈澱を行った。両法ｖＱ、ｆｔ水に溶かして混
合し、これに６０ ｎｍｏｌｅのＡＴＰ 、Ｉ ０−１
＝ツトのＴ４ＤＢ１リガーセ（宝泗造製）およびリガー
ゼ緩寓液を加えた反応液（１００μｌ）を１１℃で３０
時間保温し、エタノール沈１しを行った。沈澱（１−Ｔ
Ｅ緩韓液（５０μｌ）に浴解し、その２５μ２１用いて
Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｍ工１１４（Ｇｅｎｅ、 ２
４ 、２５５ （１９８３） ）の形質転Ｍｋ行った。
ユニツトの制限酵素ＥＣＯＲ工 と３７°Ｃで１時間反
応させて切断したのち、６８°Ｃで１５分間加熱し、エ
タノ−μ沈澱を行った。両法ｖＱ、ｆｔ水に溶かして混
合し、これに６０ ｎｍｏｌｅのＡＴＰ 、Ｉ ０−１
＝ツトのＴ４ＤＢ１リガーセ（宝泗造製）およびリガー
ゼ緩寓液を加えた反応液（１００μｌ）を１１℃で３０
時間保温し、エタノール沈１しを行った。沈澱（１−Ｔ
Ｅ緩韓液（５０μｌ）に浴解し、その２５μ２１用いて
Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｍ工１１４（Ｇｅｎｅ、 ２
４ 、２５５ （１９８３） ）の形質転Ｍｋ行った。
クロラムフェニコール耐性の形質転換株よシブラスミド
ｔ−調製し、該プラスミドｋｐＢＴＭ１２４と命名した
。次にプラスミドｐＢＴＭ １２４（２，５μｇ）を１
４ユニツトの制限酵素ＰｓｔＩと３７°Ｃ。
ｔ−調製し、該プラスミドｋｐＢＴＭ１２４と命名した
。次にプラスミドｐＢＴＭ １２４（２，５μｇ）を１
４ユニツトの制限酵素ＰｓｔＩと３７°Ｃ。
１時間反応させて切断し、６８゛Ｃで１５分間加熱処理
したのち、エタノール沈＃！ｌＩヲ行った。沈澱を水に
溶解し、６６ ｎｍｏｌｅのＡＴＰ、ＩＯユニットのＴ
４ＤＮＡ！Ｊガーゼ（宝酒造製）およびリガーゼ緩衝液
ケ加えた反応液（１００ｚｚ＃）を１１°Ｃで２４時間
保温し、エタノール沈澱を行った。
したのち、エタノール沈＃！ｌＩヲ行った。沈澱を水に
溶解し、６６ ｎｍｏｌｅのＡＴＰ、ＩＯユニットのＴ
４ＤＮＡ！Ｊガーゼ（宝酒造製）およびリガーゼ緩衝液
ケ加えた反応液（１００ｚｚ＃）を１１°Ｃで２４時間
保温し、エタノール沈澱を行った。
沈？！ｔＴＥａｍ液に溶解し、Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ
Ｍ工１１４を形質転換させ、カナマイシン耐性の形質
転換株からプラスミドを調製して、該プラスミドをｌ）
ＢＴＭ１２５と命名した。本プラスミドはプラスミＦｐ
ＢＴＭ１２４のクロラムフェニコール アセチｐトラン
ス７エフーゼ（ＣＡＴ）遺伝子のプロモータ一部位（Ｐ
ｓｔＩ 断片）が脱落したものである。次に１フスミド
ＰＢＴＭ １２５（２，５μｇ）ｔ１８ユニットの制限
酵素１３ａｍＨ工および１５ユニツトの制限酵素Ｂｇｌ
ＩＩと３７℃で１時間反応させて１７ＪＩＢ’ｔし、
６８℃で１５分間加熱処理したのちエタノール沈＃を行
った。沈峨會水に溶解したのち、６６ ｎｍｏｌ、ｅの
ＡＴｐ、１３ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝ｊｖＡ
造ｆＭ）およびリガーゼ緩衝？ｆｆ１ｔ含ｔｒ反応Ｍ（
１００ｐｌｊ ） 中テＩ Ｉ ’ＣＴ２８時間保温し
、これを用いてＢ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｍ工１１４の
形質転換を行った。カナマイシン耐性ｊ性の形質転換株
からグラスミドを調製し、該グラスミドをｐＢＴＭ１２
６と命名した。
Ｍ工１１４を形質転換させ、カナマイシン耐性の形質
転換株からプラスミドを調製して、該プラスミドをｌ）
ＢＴＭ１２５と命名した。本プラスミドはプラスミＦｐ
ＢＴＭ１２４のクロラムフェニコール アセチｐトラン
ス７エフーゼ（ＣＡＴ）遺伝子のプロモータ一部位（Ｐ
ｓｔＩ 断片）が脱落したものである。次に１フスミド
ＰＢＴＭ １２５（２，５μｇ）ｔ１８ユニットの制限
酵素１３ａｍＨ工および１５ユニツトの制限酵素Ｂｇｌ
ＩＩと３７℃で１時間反応させて１７ＪＩＢ’ｔし、
６８℃で１５分間加熱処理したのちエタノール沈＃を行
った。沈峨會水に溶解したのち、６６ ｎｍｏｌ、ｅの
ＡＴｐ、１３ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝ｊｖＡ
造ｆＭ）およびリガーゼ緩衝？ｆｆ１ｔ含ｔｒ反応Ｍ（
１００ｐｌｊ ） 中テＩ Ｉ ’ＣＴ２８時間保温し
、これを用いてＢ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｍ工１１４の
形質転換を行った。カナマイシン耐性ｊ性の形質転換株
からグラスミドを調製し、該グラスミドをｐＢＴＭ１２
６と命名した。
実施例１
中性グロテアーゼ遺伝子のクローニングＢ、 ａｍｙｌ
ｏｌｉｌｕｅｆａｃｉｅｎｅ （工ＦＯ−１４１４１）
〔工ｎ５ｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ
ｏｎ＋ ０ｓａｋａ＋Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎ
ｉｃａｔｉｏｎｓ ｈｈ Ｉｆ （１９８３ン 〕より
、自体公知の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎＥｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ、 ６８，３４２ （１９７９） ）に従い、
染色体ＤＮＡ１調製した。その染色体ＤＮＡ８．８ｐ、
ｇ ｔ ３６ ユ＝ ットの制限酵素Ｂｇｌ ＩＩと３
７’０゜５０分間反応させて切断し、６５℃で１５分間
加熱処理し、たのち、エタノ−／ｌ’を加えてＤＮＡを
沈澱させた。一方、参考例１で一一製したクローニング
ベクｐ−ｐＢＴＭｌ１９（２，９μｇ）ｋ３０ユ＝７ト
の制限酵素ＢｇＩＩＩと３７℃、５０分間反応させて切
断し、０．５ユニツトのアルカリ性フォスファターゼを
加えて６５”０．３０分間保温したのちフェノール抽出
、エーテル抽出し、エタノール沈澱を行った。両法＃ｉ
全水に溶解して混合し、これに６６ ｎｍｏｌ６ のＡ
ＴＰ、２８ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造製）
およびリガーゼ緩衝液を加えた反応液（１００μｌ）を
１１℃で３２時間保温したのち、エタノ−ｐ沈澱を行っ
た。沈毅ヲＴＥＨ蒲液に溶Ｐｉ＞ Ｌ、これケ用いてＢ
、 ｅｕｂｔｉｌｉｓＩＡ２７４の形質転換を行った。
ｏｌｉｌｕｅｆａｃｉｅｎｅ （工ＦＯ−１４１４１）
〔工ｎ５ｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ
ｏｎ＋ ０ｓａｋａ＋Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎ
ｉｃａｔｉｏｎｓ ｈｈ Ｉｆ （１９８３ン 〕より
、自体公知の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎＥｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ、 ６８，３４２ （１９７９） ）に従い、
染色体ＤＮＡ１調製した。その染色体ＤＮＡ８．８ｐ、
ｇ ｔ ３６ ユ＝ ットの制限酵素Ｂｇｌ ＩＩと３
７’０゜５０分間反応させて切断し、６５℃で１５分間
加熱処理し、たのち、エタノ−／ｌ’を加えてＤＮＡを
沈澱させた。一方、参考例１で一一製したクローニング
ベクｐ−ｐＢＴＭｌ１９（２，９μｇ）ｋ３０ユ＝７ト
の制限酵素ＢｇＩＩＩと３７℃、５０分間反応させて切
断し、０．５ユニツトのアルカリ性フォスファターゼを
加えて６５”０．３０分間保温したのちフェノール抽出
、エーテル抽出し、エタノール沈澱を行った。両法＃ｉ
全水に溶解して混合し、これに６６ ｎｍｏｌ６ のＡ
ＴＰ、２８ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造製）
およびリガーゼ緩衝液を加えた反応液（１００μｌ）を
１１℃で３２時間保温したのち、エタノ−ｐ沈澱を行っ
た。沈毅ヲＴＥＨ蒲液に溶Ｐｉ＞ Ｌ、これケ用いてＢ
、 ｅｕｂｔｉｌｉｓＩＡ２７４の形質転換を行った。
カナマイシン耐性の形質転換株の中からＣＰＩＪ大培地
（酵母エキス０ 、２！ｔｉｔ 、ペプトン１９６．拭
塩０．２％、カゼイン１９６．寒天１．５％、ｐＨ７，
３）のプレート上でハローＣＨ，１ｌｅｈａｒａら＋
Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 ＋１１９．８２（＋９７４
））を形成する菌株を迫択し、その１株から単離したグ
ラスミドをｐＢＴＭ１２７と命名した。本プラスミドは
プラスミドｐＢＴＭ１１９のＢｇｌｌＩ部位にＢ、 ａ
ｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉ −ｅｎｓ （工ＦＯ−１
４１４１）の中性プロテアーゼ遺伝子ｔ−’ａむＢｇｌ
Ｉ［断片（３，９Ｋｂ）が挿入きれたものであろ（第２
図参照）。
（酵母エキス０ 、２！ｔｉｔ 、ペプトン１９６．拭
塩０．２％、カゼイン１９６．寒天１．５％、ｐＨ７，
３）のプレート上でハローＣＨ，１ｌｅｈａｒａら＋
Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 ＋１１９．８２（＋９７４
））を形成する菌株を迫択し、その１株から単離したグ
ラスミドをｐＢＴＭ１２７と命名した。本プラスミドは
プラスミドｐＢＴＭ１１９のＢｇｌｌＩ部位にＢ、 ａ
ｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉ −ｅｎｓ （工ＦＯ−１
４１４１）の中性プロテアーゼ遺伝子ｔ−’ａむＢｇｌ
Ｉ［断片（３，９Ｋｂ）が挿入きれたものであろ（第２
図参照）。
なお、本プラスミドｐＢＴＭ１２７に有するＢ。
５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｉ Ａ２７４７９３１Ｍ１２Ｔは財
団法人発酵な［死所に工ＦＯ−１４３０６として寄託さ
れている。
団法人発酵な［死所に工ＦＯ−１４３０６として寄託さ
れている。
実施例２
中性プロテアーゼの生成
り、 ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｅ （工ＦＯ
−１４１４１）、 ｐＢＴＭｌ １９ｆｔ保持するＢ、
５ｕｂｔｉｌｉｓ ｌＡ２７４（Ｂ、 ｅｕｂｔｉｌ
ｉｓ １Ａ２７４／ｐＢＴＭ Ｉ Ｉ ９ ）および１
）ＢＴＭ １２７ ｋ保持するＢ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ
ＩＡ ２７４（Ｂ、 ａｕｂｔｉｌｉｓ ｌＡ２７４
／ｐＢＴＭ １２７ ） ｋそれぞれ酵母エキス０．２
％、ペプトン１％。
−１４１４１）、 ｐＢＴＭｌ １９ｆｔ保持するＢ、
５ｕｂｔｉｌｉｓ ｌＡ２７４（Ｂ、 ｅｕｂｔｉｌ
ｉｓ １Ａ２７４／ｐＢＴＭ Ｉ Ｉ ９ ）および１
）ＢＴＭ １２７ ｋ保持するＢ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ
ＩＡ ２７４（Ｂ、 ａｕｂｔｉｌｉｓ ｌＡ２７４
／ｐＢＴＭ １２７ ） ｋそれぞれ酵母エキス０．２
％、ペプトン１％。
Ｎａ１ｌ Ｏ、２％、カゼイン１９６からなる４０ｍ１
のＣＰ培地（ｐｌ（７，３）を含む２０（１＋／容三角
フラスコで２８℃２４餠聞及び４８時間振とう培養した
０なお、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａ
ｃｉｅｎｓ以外の場合には培地中に５μｇ／ａｔのクロ
ラムフエニコー／Ｌ’を加えた。得られた培妥液を遠心
分離し、その上清？水に対して１８１出透析して酵素液
會調製した。プロテアーゼ活性はＭｉｙａｔａらの方法
（Ａｇｒｉｃ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 、 ３４
、３１０（１９７０））を用いて、ｐＨ７および１０で
測足し、表１にその結果を示した。
のＣＰ培地（ｐｌ（７，３）を含む２０（１＋／容三角
フラスコで２８℃２４餠聞及び４８時間振とう培養した
０なお、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａ
ｃｉｅｎｓ以外の場合には培地中に５μｇ／ａｔのクロ
ラムフエニコー／Ｌ’を加えた。得られた培妥液を遠心
分離し、その上清？水に対して１８１出透析して酵素液
會調製した。プロテアーゼ活性はＭｉｙａｔａらの方法
（Ａｇｒｉｃ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 、 ３４
、３１０（１９７０））を用いて、ｐＨ７および１０で
測足し、表１にその結果を示した。
表１に示したように、Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ ｌ’Ａ
２７４／１）ＢＴＭＩ２７はＢ、 ａｍｙｌｏｌｉｑｕ
ｅｆａｃｉｅｎｓ （工Ｆ０１４１４１）に比べ１０倍
以上高い中性プロプトゼ生産能を示した。
２７４／１）ＢＴＭＩ２７はＢ、 ａｍｙｌｏｌｉｑｕ
ｅｆａｃｉｅｎｓ （工Ｆ０１４１４１）に比べ１０倍
以上高い中性プロプトゼ生産能を示した。
次にＢ、５ｕｂｔｉｌｉｓ ｌＡ２７４／ｐＢＴＭ１２
７ ｋ大量培養して得られた培養液の上清から、中性プ
ロテア−゛ゼ１に硫安分画、ＤＥＡＥセルロースカラム
クｃ＋’ｖトゲラフイーおよび５ｅｐｈａｄｅｘ 、Ｇ
−１００ゲμろ過によってはソ単一にまで精製した。
７ ｋ大量培養して得られた培養液の上清から、中性プ
ロテア−゛ゼ１に硫安分画、ＤＥＡＥセルロースカラム
クｃ＋’ｖトゲラフイーおよび５ｅｐｈａｄｅｘ 、Ｇ
−１００ゲμろ過によってはソ単一にまで精製した。
本標品に２９６トリクロμ酢酸を′加え、これを水に対
して透析したのち凍結乾燥して粉末を得た。
して透析したのち凍結乾燥して粉末を得た。
得られた粉末をハースの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎＥ
ｎｇ、１１，１９７ （１９６７））に従って過ギ酸酸
化したのち、これに気相プロテインシークエネーター（
アプライドバイオシステムズ社製４７０ Ａ型。
ｎｇ、１１，１９７ （１９６７））に従って過ギ酸酸
化したのち、これに気相プロテインシークエネーター（
アプライドバイオシステムズ社製４７０ Ａ型。
アメリカ）を用いる自動エドマン分解法〔工ｗａｎａｇ
ａ ｅｔ ａｌ、： Ｅｕｒ、 Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ
、＋ ８１１８９（＋９６９））ｋ適用して、Ｎ末端ア
ミノ酸配列を分析した。フェニルチオヒダントインアミ
ノ酸はミクロバック５Ｐ−ＯＤＳカラム（／＜リアン社
製、アメリカ）を用いる高速液体クロマトグラフィーに
より同定、足置した。得られたＮ末端アミノ酸配列（残
基１から１３まで）會以下の式に示す。
ａ ｅｔ ａｌ、： Ｅｕｒ、 Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ
、＋ ８１１８９（＋９６９））ｋ適用して、Ｎ末端ア
ミノ酸配列を分析した。フェニルチオヒダントインアミ
ノ酸はミクロバック５Ｐ−ＯＤＳカラム（／＜リアン社
製、アメリカ）を用いる高速液体クロマトグラフィーに
より同定、足置した。得られたＮ末端アミノ酸配列（残
基１から１３まで）會以下の式に示す。
Ｌｅｕ−Ｌｙｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｅ−
王妃の配列はＰ、 Ｌ、 Ｌｅｖｙら（Ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔｌ。
ｔｌ。
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、 ７２．４３４１ （
１９７５））によって報告されたＢａｃｉｌｌｕｓ Ｂ
ｕｂｔｉｌｉｓの中性プロテアーゼのアミノ酸配列と完
全に一致した。
１９７５））によって報告されたＢａｃｉｌｌｕｓ Ｂ
ｕｂｔｉｌｉｓの中性プロテアーゼのアミノ酸配列と完
全に一致した。
以上の結果から、実施例１でクローニングされた遺伝子
は中性プロテアーゼであることが明らかになった。
は中性プロテアーゼであることが明らかになった。
実施例３
中性プロテアーゼ遺伝子のサブクローニング実施例１で
得られたプラスミドｐＢＴＭ１２７（８０μｇ）を制限
酵素ＢｇｌＩＩ（２００ユニット）と３７”０．１時間
反応させて切断したのち０．７％アガロースゲル電気泳
動にかけ、分子量の小さい方のバンドのゲｌＶｋ切り取
った。とのゲμ中のＤＮＡ１電気泳動溶出法（遺伝子操
作マニュアル、高木康敬編著、購談社すイエンテイフイ
ク、１９８２年）で回収すると約１０μｇのＢｇｌＩＩ
断片（３、９Ｋｂ ）が得られた。
得られたプラスミドｐＢＴＭ１２７（８０μｇ）を制限
酵素ＢｇｌＩＩ（２００ユニット）と３７”０．１時間
反応させて切断したのち０．７％アガロースゲル電気泳
動にかけ、分子量の小さい方のバンドのゲｌＶｋ切り取
った。とのゲμ中のＤＮＡ１電気泳動溶出法（遺伝子操
作マニュアル、高木康敬編著、購談社すイエンテイフイ
ク、１９８２年）で回収すると約１０μｇのＢｇｌＩＩ
断片（３、９Ｋｂ ）が得られた。
得られたＢｇＩ ＩＦ断片（３μｇ ）を制限酵素Ｈｉ
ｎｄ１［（６ユニツト）で３７’Ｃ，１時間処理してＡ
断片（ＢｇＩＩＩ−Ｈｌｎｄｌｌｌ、約Ｑ、８Ｋｂ）、
Ｂ断片（Ｈｉｎ’ｄ ＩＩＩ −Ｈｉｎｄ ］［＋約ｉ
、１Ｋｂ）およびＣ断片（Ｈｌｎｄｕ−ＢｇｌＩＩ＋
約１，９Ｋｂ）の３つの一１片に切断し、エタノール沈
Ｍｌ−行った。一方、フ。
ｎｄ１［（６ユニツト）で３７’Ｃ，１時間処理してＡ
断片（ＢｇＩＩＩ−Ｈｌｎｄｌｌｌ、約Ｑ、８Ｋｂ）、
Ｂ断片（Ｈｉｎ’ｄ ＩＩＩ −Ｈｉｎｄ ］［＋約ｉ
、１Ｋｂ）およびＣ断片（Ｈｌｎｄｕ−ＢｇｌＩＩ＋
約１，９Ｋｂ）の３つの一１片に切断し、エタノール沈
Ｍｌ−行った。一方、フ。
フスミドｐＢＴＭ１２６（１μｇ）を制限酵１１ｉｉｎ
ｄＩＩＩ（５ユニツト）で３７°Ｃ，１時間反応させて
切断したのちエタノール沈鐵ヲ行った。自沈＃ｌ水で溶
解し、これに１００ ｎｍｏｌｅ のＡＴＰ、８．４ユ
ニツトのＴ４ＤＮＡ！Ｊガーゼ（宝酒造製）およびリガ
ーゼＭ衝液を加えた反応液（１００μ１）ｆｔｌ１°Ｃ
で２４時間保温し、Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ ｌ Ａ２
７４の形質転換を行った。カナマイシン耐性。
ｄＩＩＩ（５ユニツト）で３７°Ｃ，１時間反応させて
切断したのちエタノール沈鐵ヲ行った。自沈＃ｌ水で溶
解し、これに１００ ｎｍｏｌｅ のＡＴＰ、８．４ユ
ニツトのＴ４ＤＮＡ！Ｊガーゼ（宝酒造製）およびリガ
ーゼＭ衝液を加えた反応液（１００μ１）ｆｔｌ１°Ｃ
で２４時間保温し、Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ ｌ Ａ２
７４の形質転換を行った。カナマイシン耐性。
クロヲムフエニコー〃感受性の形質転換株からプラスミ
ドを調製した結果、２種類のプラスミドが得られ、それ
ぞれ倉ｐＢ’ｒＭ５０Ｂ（６，２Ｋｂ）およびＰＢＴＭ
５１５（７，７Ｋｂ）と命名した。プラスミドｐＢＴＭ
５１５はプラスミドｐＢＴＭ ｌ ２６のＨｉｎｄｆｆ
１部位にＡ断片とＣ断片が互に逆方向で挿入されｆｃも
のでちゃ、プラスミドｐＢＴＭ５０ Ｂはプラスミドｐ
ＢＴＭ１２６のＨ１ｎｄｌｌＩ部位にＢ断片が挿入され
たものである（第３図参照）。これらのプラスミドを保
持する菌株のＣＰ培地プレート上でのハロー形成能を調
べたところ、ｐＢＴＭ５１５保持株はハロー形成能を示
し、Ｉ）ＢＴＭ ５ 、ｐ ８保持株はハロー形成能を
示さなかった。
ドを調製した結果、２種類のプラスミドが得られ、それ
ぞれ倉ｐＢ’ｒＭ５０Ｂ（６，２Ｋｂ）およびＰＢＴＭ
５１５（７，７Ｋｂ）と命名した。プラスミドｐＢＴＭ
５１５はプラスミドｐＢＴＭ ｌ ２６のＨｉｎｄｆｆ
１部位にＡ断片とＣ断片が互に逆方向で挿入されｆｃも
のでちゃ、プラスミドｐＢＴＭ５０ Ｂはプラスミドｐ
ＢＴＭ１２６のＨ１ｎｄｌｌＩ部位にＢ断片が挿入され
たものである（第３図参照）。これらのプラスミドを保
持する菌株のＣＰ培地プレート上でのハロー形成能を調
べたところ、ｐＢＴＭ５１５保持株はハロー形成能を示
し、Ｉ）ＢＴＭ ５ 、ｐ ８保持株はハロー形成能を
示さなかった。
次にプラスミドｐＢＴＭ１２７（１μｇ ）、１Ｅｃｏ
Ｒ工（３ユニツト）およびＢｇｌｎ（２ユニツト）で、
またプラスミドｐＵＢＩＩＯ（１μｇ）ｉＥｃｏＲ工（
３ユニツト）およびＢａｍＨ工（５ユニツト）で３７°
Ｃ９１時間それぞれ反応させて切断したのち、６５°Ｃ
で１０分間加熱して反応を止め、それぞれエタノ−μ法
線を行った。両法＃を水に溶解したのち混合し、これに
ｌ ００ ｎｍｏｌｅ のＡＴＰ、８．４ユニツトのＴ
４ＤＮＡＩＪガーゼ（宝酒造製）およびリガーゼ後前液
を含む反応液（１００μｌ）を１１℃で２４時間保温し
、これｔ用いてＢ。
Ｒ工（３ユニツト）およびＢｇｌｎ（２ユニツト）で、
またプラスミドｐＵＢＩＩＯ（１μｇ）ｉＥｃｏＲ工（
３ユニツト）およびＢａｍＨ工（５ユニツト）で３７°
Ｃ９１時間それぞれ反応させて切断したのち、６５°Ｃ
で１０分間加熱して反応を止め、それぞれエタノ−μ法
線を行った。両法＃を水に溶解したのち混合し、これに
ｌ ００ ｎｍｏｌｅ のＡＴＰ、８．４ユニツトのＴ
４ＤＮＡＩＪガーゼ（宝酒造製）およびリガーゼ後前液
を含む反応液（１００μｌ）を１１℃で２４時間保温し
、これｔ用いてＢ。
５ｕｂｔｉｌｉｓ ｌ Ａ ２７４の形質転換を行った
。カナマイシン耐性の形質転換株の中からハローを形成
する株を選びそのプラスミドｋ ｐＢＴＭ５２３ Ｊニ
ー命名した。本プラスミドはプラスミドｐＵＢ１１０の
ＦｉｃｏＲニー ＢａｍＨ工部位にプラスミドｐＢＴＭ
１２７のＥｃｏＲニー ＢｇｌＩＩ断片が挿入されたも
のである（琳４図参照）。なおこのＥｃｏＲニーＢｇｌ
ｌｌ断片はＩ）ＢＴＭ＋２７０Ｂ ｇ Ｉ ＩＦ 断片
のＢ断片の１部およびＣ断片からなっている。
。カナマイシン耐性の形質転換株の中からハローを形成
する株を選びそのプラスミドｋ ｐＢＴＭ５２３ Ｊニ
ー命名した。本プラスミドはプラスミドｐＵＢ１１０の
ＦｉｃｏＲニー ＢａｍＨ工部位にプラスミドｐＢＴＭ
１２７のＥｃｏＲニー ＢｇｌＩＩ断片が挿入されたも
のである（琳４図参照）。なおこのＥｃｏＲニーＢｇｌ
ｌｌ断片はＩ）ＢＴＭ＋２７０Ｂ ｇ Ｉ ＩＦ 断片
のＢ断片の１部およびＣ断片からなっている。
以上の結呆から、中性プロテアーゼ遺伝子はＣ断片（１
，９Ｋｂ）の中に存在することが明らかとなった。
，９Ｋｂ）の中に存在することが明らかとなった。
ｐＢＴＭ５１５（１００μｇ）を制限酵素Ｂｇｌ ’１
（２００ユニツト）およびＨｉｎｄｌ［（２００ユニツ
ト）で３７℃、１時間反応させて切断し、１９６１カ゛
ロースゲルｌＩｔ気泳動にかけ、このゲμより１ 、９
ＫｂのＤＨＡ會電気泳助溶出法（Ｍ仏子操作マニュア
μ、亮木康敬編著、講談社）により回収すると約１０μ
ｇのｃｍ片が得られた。
（２００ユニツト）およびＨｉｎｄｌ［（２００ユニツ
ト）で３７℃、１時間反応させて切断し、１９６１カ゛
ロースゲルｌＩｔ気泳動にかけ、このゲμより１ 、９
ＫｂのＤＨＡ會電気泳助溶出法（Ｍ仏子操作マニュア
μ、亮木康敬編著、講談社）により回収すると約１０μ
ｇのｃｍ片が得られた。
第５図にとのＣ断片の制限部氷切断地図ケ示す。
実施例４
実施例３で得られたＣＩ＃ｒ片の塩基配列の一部をジデ
オキシヌクレオチド合成鎖序止法およびＭａｘａｍ−Ｇ
ｉｌｂｏｒｔ法を用いて決定した。Ｃ断片のＢｇｌ Ｉ
［サイト側からの塩基配列および翻訳したアミノ酸配列
を第６図に示す。本配列中にはプロモーターとしてＥσ
５５によって認識される一３５領域（ＴＴＧＣＡＧ）と
−１０領域（ＴＡＴ’Ｌ’ＡＴ） 。
オキシヌクレオチド合成鎖序止法およびＭａｘａｍ−Ｇ
ｉｌｂｏｒｔ法を用いて決定した。Ｃ断片のＢｇｌ Ｉ
［サイト側からの塩基配列および翻訳したアミノ酸配列
を第６図に示す。本配列中にはプロモーターとしてＥσ
５５によって認識される一３５領域（ＴＴＧＣＡＧ）と
−１０領域（ＴＡＴ’Ｌ’ＡＴ） 。
Ｂ 、３７によって認識される一３５領域（ＡＧＴＴＴ
Ｔ）と−１０領域（ＧＡＧＡＴＴＯＣＴ）およびＥσ３
２によって認識されると予想される一３５領域（ＡＡＴ
ＴＣ）と−１０領域（ＴＡＧ’ｌ”１’ＴＴＡＴＡ）が
見出される。
Ｔ）と−１０領域（ＧＡＧＡＴＴＯＣＴ）およびＥσ３
２によって認識されると予想される一３５領域（ＡＡＴ
ＴＣ）と−１０領域（ＴＡＧ’ｌ”１’ＴＴＡＴＡ）が
見出される。
なお、ＢｇｌＩ［−８ａｕ ３Ａ １断片（５３０ｂｐ
）（第５図参照）がプロモーター活性を有することは、
プロモータークローニングベクターｐＦＴＢ２８’＋（
青村ら、日本ｍ芸化学会昭和５８年度大会講演要旨集。
）（第５図参照）がプロモーター活性を有することは、
プロモータークローニングベクターｐＦＴＢ２８’＋（
青村ら、日本ｍ芸化学会昭和５８年度大会講演要旨集。
第２８頁）を用いることによって確認することが出来た
ので上記プロモーターが機能していると予想される。ま
た、プロモーターの下流にはＳＤ領領域よびオープンフ
レームが存在し、１番目のメチオニンから２７または２
８番目のアラニンまでが中性プロテアーゼのシグナルペ
プチドと思われる。２２２番目のアラニン以後のアミノ
酸配列は文献で報告されている中性プロテアーゼ（Ｐ、
Ｌ。
ので上記プロモーターが機能していると予想される。ま
た、プロモーターの下流にはＳＤ領領域よびオープンフ
レームが存在し、１番目のメチオニンから２７または２
８番目のアラニンまでが中性プロテアーゼのシグナルペ
プチドと思われる。２２２番目のアラニン以後のアミノ
酸配列は文献で報告されている中性プロテアーゼ（Ｐ、
Ｌ。
Ｌｅｖｙら＋ Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、＋ ７２ ＋４３４１（＋９７５））とは若干
異なったが実施例３に示した中性プロテアーゼのＮ末端
のアミノ酸配列とは完全に一致した。この時果、シグナ
ルペプチドと思われる配列と成Ｍ１蛋白質との間に約２
００個の機能の不明なベプタイドが存在することが予想
された。
Ｓｃｉ、＋ ７２ ＋４３４１（＋９７５））とは若干
異なったが実施例３に示した中性プロテアーゼのＮ末端
のアミノ酸配列とは完全に一致した。この時果、シグナ
ルペプチドと思われる配列と成Ｍ１蛋白質との間に約２
００個の機能の不明なベプタイドが存在することが予想
された。
次にＣ断片のＨｉｎｄ ｌ［サイ）ｉｌＪＩからの塩基
配列および翻訳したアミノ酸配列を第７図に示す。本ア
ミノ酸配列は上記の文献に示された中性プロテアーゼの
Ｃ末端のアミノ酸配列と完全に一致した。
配列および翻訳したアミノ酸配列を第７図に示す。本ア
ミノ酸配列は上記の文献に示された中性プロテアーゼの
Ｃ末端のアミノ酸配列と完全に一致した。
実施例５
実施例３で得られたＢｇｉｌ［−Ｈ１ｎｄｌｌＩ断片（
１，９Ｋｂ）の１０μｇ’Ｔｈ制限醇素Ａｃｅ工（５０
ユニツト）と３７°０．１時間反応させて切断した。こ
の反応液を１．２５＋！アガロ−スゲｌｖ電気泳動にか
け、１ 、７ ＫｂのＨｌｎｄＮ−Ａｃｅ工断片のバン
ドケ切シ取り、電気泳動溶出したのち、フェノール抽出
。
１，９Ｋｂ）の１０μｇ’Ｔｈ制限醇素Ａｃｅ工（５０
ユニツト）と３７°０．１時間反応させて切断した。こ
の反応液を１．２５＋！アガロ−スゲｌｖ電気泳動にか
け、１ 、７ ＫｂのＨｌｎｄＮ−Ａｃｅ工断片のバン
ドケ切シ取り、電気泳動溶出したのち、フェノール抽出
。
エーテル抽出およびエタノール沈峨２行い、３ｔｔｇの
Ｈｌｎｄｕ−Ａｃｃ工断片を得た。本断片の塩基配列を
Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ
、 Ａｃａｄ。
Ｈｌｎｄｕ−Ａｃｃ工断片を得た。本断片の塩基配列を
Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ
、 Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、、Ｂ工、５６０（１９７７））によって決定し
たところ、中性プロテアーゼの構造遺伝子のＣ末端から
約３０コのアミノ酸をコードする領域が欠損しているこ
とが明らかになった。
たところ、中性プロテアーゼの構造遺伝子のＣ末端から
約３０コのアミノ酸をコードする領域が欠損しているこ
とが明らかになった。
第１図はプラスミドｐＢＴＭＩ１９の制限酵素切断地図
を示し、第２図はプラスミドｐＢＴＭ１２７の制限酵素
切断地図を示す。 第３図はプラスミドＰＢＴＭ５０ＢおよびｐＢＴＭ５１
５の構築図を示し、第４図はプラスミドｐＢＴＭ ５２
３の構築図を示す。 第５図はＢ、ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ （
工ＦＯ−１４１４１）から得られた中性プロテアーゼ遺
伝子を含むＤＮＡ断片（９！施例３で得たＣ断片）の制
限酵素地図ケ示す。 Ｂｇ、はＢｇｌｌＩ、ＴはＴａｑＩ＋Ｓａは５ａｃｌ［
＋ＨａはＨａｅｆｆｌ、ＳはＳａｕ ３ＡＩ ＋ Ａは
ＡｃｃＩ＋ＢｅはＢｃｌ ＩおよびＨはＨｉｎｄＩ［ｉ
示す。 第６図はＢ、ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ （
工ＦＯ−１４１４１）から得られた中性プロテアーゼ遺
伝子を含むＤＮＡ断片（実施例３で得たＣ断片）の５′
側の塩基配列および該配列から翻訳されるアミノ酸配列
を示し、第７図は３’１ＬｌｌＩの塩基配列および該配
列から翻訳されるアミノ酸配列ケ示し、ＴＡＡは終止コ
ドンを示す。 第１図 テ ｇ 追 工 第２図 ｈＯ矛’ ”−ｈｏｌｏ ” 第４図 〒 ｈｏＪｏ” 第６図 くつづく〉 第６図−（２） Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｓｐ 手 続 補 正 書 （方式） 昭和５９年 ７ 月す日 特許庁長官殿 “ ｌ、事件の表示 昭和 ５９年持重願第 ６０８７５ 号２、発明の名称 ＮＡ ３、補正をする者 事件との関係 ｆ１許出願人 住 所 大阪市東区道１１１町２丁目２７番地名 称（
２９３）武Ｕ］薬品工業株式会社代表者 倉 林 育四
部 ４、代理人 住 所 大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号武田
薬品工業株式会社大阪工場内 氏 名 弁理士（６０２２）天 井 作 次東京連絡先
（特許法規課）電話２７８−２２１９乙 補正の対象 図面（第６図） ７ 補正の内容 別紙のとおり「第６図」の図面の番号を訂正する。 ｇ 添付書類の目録 （１）「第６図（その１）」および「第６図（その２）
」写各１通 以 上 °ユニ（？ ｔｑｔ： Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ
Ｔｙｒ ＶａｌＬｅｕ Ａｒｇ 八ｓｐ
を示し、第２図はプラスミドｐＢＴＭ１２７の制限酵素
切断地図を示す。 第３図はプラスミドＰＢＴＭ５０ＢおよびｐＢＴＭ５１
５の構築図を示し、第４図はプラスミドｐＢＴＭ ５２
３の構築図を示す。 第５図はＢ、ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ （
工ＦＯ−１４１４１）から得られた中性プロテアーゼ遺
伝子を含むＤＮＡ断片（９！施例３で得たＣ断片）の制
限酵素地図ケ示す。 Ｂｇ、はＢｇｌｌＩ、ＴはＴａｑＩ＋Ｓａは５ａｃｌ［
＋ＨａはＨａｅｆｆｌ、ＳはＳａｕ ３ＡＩ ＋ Ａは
ＡｃｃＩ＋ＢｅはＢｃｌ ＩおよびＨはＨｉｎｄＩ［ｉ
示す。 第６図はＢ、ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ （
工ＦＯ−１４１４１）から得られた中性プロテアーゼ遺
伝子を含むＤＮＡ断片（実施例３で得たＣ断片）の５′
側の塩基配列および該配列から翻訳されるアミノ酸配列
を示し、第７図は３’１ＬｌｌＩの塩基配列および該配
列から翻訳されるアミノ酸配列ケ示し、ＴＡＡは終止コ
ドンを示す。 第１図 テ ｇ 追 工 第２図 ｈＯ矛’ ”−ｈｏｌｏ ” 第４図 〒 ｈｏＪｏ” 第６図 くつづく〉 第６図−（２） Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｓｐ 手 続 補 正 書 （方式） 昭和５９年 ７ 月す日 特許庁長官殿 “ ｌ、事件の表示 昭和 ５９年持重願第 ６０８７５ 号２、発明の名称 ＮＡ ３、補正をする者 事件との関係 ｆ１許出願人 住 所 大阪市東区道１１１町２丁目２７番地名 称（
２９３）武Ｕ］薬品工業株式会社代表者 倉 林 育四
部 ４、代理人 住 所 大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号武田
薬品工業株式会社大阪工場内 氏 名 弁理士（６０２２）天 井 作 次東京連絡先
（特許法規課）電話２７８−２２１９乙 補正の対象 図面（第６図） ７ 補正の内容 別紙のとおり「第６図」の図面の番号を訂正する。 ｇ 添付書類の目録 （１）「第６図（その１）」および「第６図（その２）
」写各１通 以 上 °ユニ（？ ｔｑｔ： Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ
Ｔｙｒ ＶａｌＬｅｕ Ａｒｇ 八ｓｐ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）プロモーターおよび中性グロテアーゼ遺伝子のシグ
ナルペプチドをコードする領域を含有し、中性プロテア
ーゼをコードする領域を３′末端１１１から一部ないし
全部欠＜ＤＮＡ０ ２）シグナルペプチドがアミノ酸配列 Ｍｅ、ｔ −Ｇｌｙ−Ｌａｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ
−Ｌｅｕ−８ｅｒ−Ｖａｌ −Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ
−Ａｌａ−８ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−８ｅｒ−Ｌｅｕ−
Ｔｈｒ−工１ｅ−８ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ −Ｇｌｙ−
Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ａｌａで表わされるペプチドを含有す
る特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ０ ３）プロモーターが中性プロテアーゼプロモーターであ
る特許請求の範囲！＋または２項記載のＤＮＡ０ ４）プロモーターの一３５領域がＴＴＧＣＡＧ 。 −１０領域がＴＡＴＴＡＴ であるポリヌクレオチドで
ある特許請求の範囲第１ないし３項記載のＤＮ５）プロ
モーターの一３５狽域がＡＧＴＴＴＴ。 −１０領域がＧＡＧＡＴＴＧＣ’ｒであるポリヌクレオ
チドである特許請求の範囲第１ないし３項記載のＤＮＡ
０ ６）プロモーターの一３５領域がＡＡＴＴＣ、−１０領
域がＴＡＧＴ’ｌ”ＴＴＡＴＡ であるポリヌクレオチ
ドである特許請求の範囲第１ないし３項記載のＤＮＡ０ ７）特許請求の範囲第４，５および６項記戦のポリヌク
レオチドが１００塩基以内のポリヌクレオチド鎖中に共
存する特許請求の範囲第１ないし６項記載のＤＮＡ０ ８）＋００塩基以内のポリヌクレオチド鎖が５ ’ｕｊ
ｌがＡＡＴ’Ｌ’Ｃで始まり、３′側がＴＡＴＴＡＴ
で終るポリヌクレオチドを含有する特ｆｆ’ｊｎ求の範
囲第−ｒｍ記載のＤＮＡ０ ９）ポリヌクレオチド鎖が ＡＡＴＴＣＡＧＣＣＧＣＧＧＡＧＴＣＴＡＧＴＴＴ’Ｌ
’ＡＴＡＴＴＧＣＡＧＡＡＴＧＣＧＡＧＡ午ＴＧＣＴＧ
ＧＴＴＴＡＴＴＡＴであるポリヌクレオチド全含有する
特許請求の範囲第８項記載のＤＮＡ０
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59060375A JPS60203194A (ja) | 1984-03-27 | 1984-03-27 | Ｄνａ |
| EP84115551A EP0151760A1 (en) | 1984-01-06 | 1984-12-15 | Novel DNA and use thereof |
| KR1019850000022A KR850005497A (ko) | 1984-01-06 | 1985-01-05 | Dna 및 그의 이용 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59060375A JPS60203194A (ja) | 1984-03-27 | 1984-03-27 | Ｄνａ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60203194A true JPS60203194A (ja) | 1985-10-14 |
Family
ID=13140322
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59060375A Pending JPS60203194A (ja) | 1984-01-06 | 1984-03-27 | Ｄνａ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60203194A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0149241A2 (en) * | 1983-12-28 | 1985-07-24 | Agency Of Industrial Science And Technology | DNA base sequence containing regions involved in the production and secretion of a protein, recombinant DNA including the whole or a part of the DNA base sequence, and method of producing proteins by use of the recombinant DNA |
| JPS62163691A (ja) * | 1986-01-13 | 1987-07-20 | Agency Of Ind Science & Technol | ヒト成長ホルモンの生産法 |
-
1984
- 1984-03-27 JP JP59060375A patent/JPS60203194A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0149241A2 (en) * | 1983-12-28 | 1985-07-24 | Agency Of Industrial Science And Technology | DNA base sequence containing regions involved in the production and secretion of a protein, recombinant DNA including the whole or a part of the DNA base sequence, and method of producing proteins by use of the recombinant DNA |
| JPS62163691A (ja) * | 1986-01-13 | 1987-07-20 | Agency Of Ind Science & Technol | ヒト成長ホルモンの生産法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU638309B2 (en) | Process for enzymatical cleavage of recombinant proteins by means of iga proteases | |
| JPH0829091B2 (ja) | ハイブリッドｐｍａ配列の製造方法及び該方法に使用するベクター | |
| JPS6296086A (ja) | 複合プラスミド | |
| HUT57263A (en) | Process for producing bacterial vectors | |
| JP2727391B2 (ja) | 高発現ベクター及び該高発現ベクターを保有する微生物並びに該微生物を用いる有用物質の製造法 | |
| JPH10511845A (ja) | 細菌において細胞外タンパク質を製造するための方法 | |
| EP0151760A1 (en) | Novel DNA and use thereof | |
| EP0543195B1 (en) | Biosynthetic process for the preparation of proteins | |
| US5015574A (en) | DNA sequence involved in gene expression and protein secretion, expression-secretion vector including the DNA sequence and the method of producing proteins by using the expression-secretion vector | |
| JPH05268972A (ja) | Ｄｎａおよびその用途 | |
| US4935351A (en) | Process for preparing oligopeptide | |
| JPS60203194A (ja) | Ｄνａ | |
| US5672496A (en) | DNA sequences encoding porcine pancreatic carboxypeptidase B | |
| EP0352073A1 (en) | Vectors, cells transformed thereby, and their use in producing heterologous polypeptides | |
| WO1995022614A1 (en) | Production of glycosylphosphatidylinositol-anchored recombinant proteins | |
| EP0312346B1 (en) | E. coli sequence specific acid protease | |
| JPS59203495A (ja) | 外来遺伝子の新規な発現方法 | |
| JPS63501053A (ja) | 異種タンパク質の生産方法 | |
| EP0342658A1 (en) | Biosynthetic process for the preparation of chemical compounds | |
| EP0154284B1 (en) | Dna coding for a signal peptide and dna containing the same | |
| JPS6181789A (ja) | Ｄｎａおよびその用途 | |
| JP3164181B2 (ja) | 新規発現ベクタ−、該発現ベクタ−を保有する微生物、該微生物を用いる有用物質の製造法 | |
| JPH02100685A (ja) | ポリペプチド分泌発現ベクター，該ベクターで形質転換した微生物及び該微生物によるポリペプチドの製造 | |
| JP2500311B2 (ja) | 蛋白製造法 | |
| JP2507874B2 (ja) | 分泌シグナルペプチドをコ−ドするｄｎａ配列 |