JPS6296086A

JPS6296086A - 複合プラスミド

Info

Publication number: JPS6296086A
Application number: JP60233371A
Authority: JP
Inventors: Masabumi Nishizawa; 西澤　正文; Fumio Hishinuma; 菱沼　文男; Fumiko Ozawa; 小澤　史子
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1985-10-21
Filing date: 1985-10-21
Publication date: 1987-05-02
Also published as: JPH0336516B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）（発明の構成）酵母は、細胞の構造や機能が高等生物の特徴を備え、ま
た食品、医薬品、飼料等の原料として、人間の日常生活
と深い係わり合いを持つ有用な微生物であり、遺伝子工
学に於ける宿主としての開発が期待されている。

しかしながら、酵母の細胞表層は細胞膜の外側に強固な
細胞壁を有するため、遺伝子組換え技術によって生産さ
れた有用物質（異種蛋白質）の精製が困難な場合が多く
、精製を簡略化するために、生産物を菌体外に分泌させ
る系の開発が望まれている。

本発明者等は、酵母を宿主とする遺伝子組換え技術にお
いて、菌体内で生産された有用物質を効率よく分泌させ
ることのできるプラスミド・ヘクターを探索した結果、
本発明を達成したもので、その要旨は、酵母サッカロマ
イセス・セレビシエインベルターゼ遺伝子のプロモータ
ー配列、シグナル配列及びターミネータ−配列を含有す
る複合プラスミドに存する。

本発明を以下詳細に説明するに、インベルターゼは、酵
母サツカロマイセス・セレビシェの代表的な分泌酵素と
して知られているが、本酵素は細胞膜と細胞壁との間に
局在し、ごく一部が菌体外に漏出するに過ぎない。これ
は、本酵素の分子量が大きいため細胞壁を通過てきない
と考えられている。

本発明は、上記インベルターゼ遺伝子の特定の領域を利
用することによって、菌体内で生産された有用物質を分
泌させることのできる複合プラスミドを提供するもので
ある。

サツカロマイセス・セレビシェのインベルターゼ遺伝子
としては、ＳυＣ２遺伝子が知られ、そのヌクレオチド
配列及び対応するアミノ酸配列が解明されている［　Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　％ＩＩ
巻、６号、１９４３〜１９５３頁、特にその１９４８〜
１９４９頁を参照］。

本発明の複合プラスミドにおける、インベルターゼ遺伝
子の利用領域としては、インベルターゼ遺伝子のプロモ
ーター配列とシグナル配列（１９アミノ酸残基からなる
）とを含むＥｃｏＲＩ　−Ａｖａ１１領域、即ち上記５
ＵＣ２遺伝子中、インベルターゼの翻訳開始コドンより
約９００　ｂｐ上流にあるＥｃｏＲ１部位から、成熟イ
ンベルターゼのＮ末’１７４５ｅｒ（ＴＣＡ）より下流
１２番目のＶａ　ｌ　（ＧＴＣ）の位置にある　Ａｖａ
■部位までの塩基配列が使用される。また、ターミネー
タ−配列を含む領域として、インベルターゼの終止コド
ンより約７０　ｂｐ上流にある５ａｕ３Ａ　１部位から
約５００　ｂｐＴ流にあるＡｌｕ　Ｉ部位までの５ａｕ
３Ａ　Ｉ〜Ａｌｕ　ｌ領域が使用される。

なお、プラスミド２μｍ　ＤＮＡ及びｐＢＲ３２２等の
複製起点が使用され、また、ＴＲＰｌ、　ＡｐＹ等の選
択マーカーが使用される。

以下に、本発明の複合プラスミドの調製法と、このプラ
スミドにマウスアミラーゼ遺伝子を挿入し、酵母を形質
転換した場合の有用性について説明する。

ｌ［プラスミドｐＳＭＦ２，３，４（３，８ｋｂ　）の
調製コインベルターゼ遺伝子Ｓｔ、ｌＣ２を含むプラス
ミドｐＲＢ５８［Ｃｅ１ｌ　、　２８巻、１４５〜１５
４頁（１９８２年）］をＸｈＯＩ及びＢａｍＨ！で切断
して、５ＵＣ２のブロモター配列及びシグナルペプチド
配列を含むＸｈｏ　Ｉ〜Ｂａ＊ＨＩ断片（約２．９　ｋ
ｂ）を単離し、更にＡｖａ　ＩＩで切断して約１．３　
ｋｂのＤＮＡ断片を得る。この両端を充填した後８ａｍ
ＨＩリンカ−（８ｍｅｒ、ＩＯｍｅｒ、１２ｗｅｒ）を
連結する。

得られた３種のＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ
て切断して、５ＵＣ２のプロモーター配列及びシグナル
ペプチド配列を含む約１　ｋｂのＥｃｏＲＩ　−Ｂａｌ
１ｌ）Ｉ　Ｉ断片を得る。

次いで、これをプラスミドｐＵｃ８　［Ｂｅｔｈｅｓｄ
ａ　Ｒｅ−タｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、
Ｉｎｃ、発行のＢＲＬカタログ（Ａ−、ｕｇｕｓｔｌ、
１９８３　）、Ｃａｔ／　Ｎｏ、５３５９　ＳＡ記！！
］のＥｃｏＲ［〜Ｂａ１Ｈ１部位に挿入して、夫々プラ
スミドｐｓＭＦ２゜３．４を得る。（第１図参照）２［プラスミドｐＳＭＦ６（３，３ｋｂ　）の調！！］
前記プラスミド　ｐＲＢ５８をＸｂａ　Ｉ及びＥｃｏＲ
Ｉで切断してインベルターゼ遺伝子のターミネータ−配
列を含むＸｂａ　Ｉ〜ＥｃｏＲＩ断片を単離し、次いで
これを５ａｕ３Ａ　Ｉ及びＤｄｅ　Ｉで切断して５ａｕ
３Ａ　−ＤｄｅＩ断片を得、この両端を充填後、Ｂａｎ
）Ｉ　Ｉリンカ−（１０ｍｅｒ　）を連結し、ＢａｍＨ
Ｉ及びＡｌｕｌで切断し、得られた　ＤＮＡ断片（約０
．５５　ｋｂ　’）を、プラスミドｐＵＣ８のＢａｗｌ
−Ｉ　Ｉ〜ＨｉｎｃＩ［部位に挿入してプラスミドｐＳ
ＭＦ６を得る。（第１図参照）３　［ｐＳＭＦ１２．１５．１８　（３，９ｋｂ　）の
調製］（１）プラスミドｐ８Ｒ３２２を　Ｐｖｕｌｌて
切断し、Ｈｉｎｄ［ＩＩクリンカを連結してＰｖｕ１１
部位をＨｉｎｄＩＩＩ部位に変えた後、ＥｃｏＲＩ及び
旧ｎｄＩＩＩで切断して、大腸菌のＡＲＳ及びアンピシ
リン耐性遺伝子を含むＥｃｏＲＩ〜ＨｉｎｄＩ［Ｉ断片
を作製し、（２）前記プラスミドｐＳＭＦ２，３．４をＥｃｏＲＩ
及びＢａｍＨ■で切断してＥｃｏＲＩ〜ＢａｍＨＩ断片
を作製し、（３）前記プラスミドｐｓＭＦ６をＢａｍＨ
Ｉ及び）ＩｉｎｄＩＩＩで切断してＢａｖａＨＩ　〜Ｈ
Ｉｎｄｍ断片を作製し、上記（＋）　（２）及び（３）
の３種のＤＮＡ断片を、Ｔ４４　　［ｐＳＭＦ３２Ｔ、
３５Ｔ、３８Ｔ（６，６ｋｂ　　）　　の調製コ（１）
酵母プラスミド２μ１ｌｌＤＮＡをＥｃｏＲＩ及びＰｓ
ｔＩで切断してＡＲＳを含むＥｃｏＲＩ　−Ｐｓｔ　Ｉ
断片を得る。

（２）一方、プラスミドＶＲｐ７０Ｎａｔｕｒｅ　、２
８２巻、３９〜４３頁　（１９７９）コのＴＲＰＩとＡ
Ｒ５Ｉを含むＥｃｏＲＩ　〜ＥｃｏＲＩ断片を　Ｐｓｔ
Ｉで切断して、ＴＲＰＩのみを含むＥｃｏＲＩ〜Ｐｓｔ
ｌ断片を調製する。

（１）及び（２）の断片を結合させることにより得られ
た、２μｍ　ＤＮＡの複製起点とＹＲｐ７のＴＲＰ　ｌ
とを含、むＥｃｏＲＩ　〜ＥｃｏＲＩ断片を、ｐｓＭＦ
１２，１５．１８のＥｃｏＲ■部位に挿入してｐＳＭＦ
３２Ｔ　、　３５Ｔ　、　３８Ｔを得る。（第１図参照
）上記で得られたｐＳＭＦ３２Ｔ　、　３５Ｔ　、　３８
Ｔは、サツカロマイセス・セレビシェ　インベルターゼ
遺伝子のプロモーター配列、シグナル配列及びターミネ
ター配列を有し、２μｒａＤＮＡ及びｐＢＲ３２２由来
の複製起点を有するシャトルベクターであり、ＴＲＲＩ
、　Ａｐ’等の選択マーカーを持っている。

このため、例えば、このＢａｎ＋ＨＩサイトに、前述下
記５及び６のプラスミドを使用しても同様の結果が得ら
れる。

５　［ｒ＋ＳＭＦ３２，３５．３８（５，４ｋｂ　）の
調製］前記４におけるＹＲｐ７をＥｃｏＲＩて切断して
、ＴＲＰＩ遺伝子とＡＲ５Ｉとを含むＥｃｏＲＩ〜Ｅｃ
ｏＲＩ断片を単離し、前記ｐｓＭＦ１２，１５．１８に
おけるＥｃｏＲ１部位に挿入してｐＳＭＦ３２，３５．
３８を得る。

６　［ｐＳＭＦ３２Ｓ、３５Ｓ、３８Ｓ（５，８ｋｂ　
）の調製］り１）プラスミド　２μｍ　ＤＮＡをＡｖａ
　Ｉで切断して、Ａｖａ　Ｉ　〜Ａｖａ　Ｉ断片を採取
し、充填した後ＥｃｏＲＩて切断して、ＲＥＰ３遺伝子
を含む８５０　ｂｐの平滑ＤＮＡ断片を得る。

（２）一方、ＹＲｐ　７をＥｃｏＲＩ及びＲｓａ　Ｉで
切断してＴＲＰＩ及びＡＲ５Ｉを含むＥｃｏＲＩ　〜Ｒ
ｓａ　Ｉ断片を：Ａｉ！する。

（１）及び（２）の断片を結合させることによりＴＲＰ
Ｉ、ＡＲ５Ｉ及びＲＥＰ３を含むＥｃｏＲＩ　〜Ｅｃｏ
ＲＩ断片を調製し、これを前記ＰＳＭＦ１２，１５．１
８のＥｃｏＲＩ部位に挿入してρＳＭＦ３２Ｓ　、　３
５Ｓ　、　３８Ｓを得る。

７［分泌ベクターの構築］（１）マウスアミラーゼ遺伝子の導入（イ）マウスすい臓由来のアミラーゼ遺伝子を含有する
プラスミドｐＭｓａ１０４　［Ｃｅ１ｌ、１７９巻、２
１頁（１９８０年）］をＰｓｔ　Ｉで切断し、得られた
ＰｓｔＩ　〜Ｐｓｔ　Ｔ断片をプラスミド　ｐ（ＪＣ１
３［Ｐｈａｒｍａｃｉａ社カタログ、Ｐ　−Ｌ　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　２７頁、２７−４９７３記載］
のＰｓｔＩ部位に挿入して、マウスアミラーゼ遺伝子を
含むプラスミドρＲＥ＋０７５　（４，３ｋｂ　）を作
製する。

ｐＲＥ１０７５をＡｐａ　Ｉで切断し、得られたＡｐａ
　Ｉ　〜Ａｐａ　Ｉ断片をＳ１ヌクレアーゼ処理して平
滑端とし、次いてＤｒａ　Ｉで切断して、アミラーゼ前
駆体の最初の１５個のアミノ酸を欠いたアミラーゼ蛋白
質をコートする　Ａｐａ　Ｉ〜Ｄｒａｌ断片を採取する
。（この遺伝子はアミラーゼの分泌シグナルを欠失して
いる）。これにＢａｍＨＩリンカ−（例えば１２ｍｅｒ
）を結合し、Ｂａｒａｌ　Ｉで切断して両端にＢａｍ８
１部位を持つＤＮＡ断片を得る。

（ロ）一方、ｐＳＭＦ３２Ｔ、３５Ｔ、３８Ｔ　（ｐＳ
ＭＦ３２，３５．３８又はｐＳＭＦ３２Ｓ　、　３５Ｓ
　、　３８Ｓでもよい）をＢａｍ）Ｉ　Ｉで切断後、仔
牛小腸由来のアルカリ性ホスファターゼ（ＣＩＡＰ）処
理してリン酸基を除去する。

（イ）及びく口）で得たＤＮＡ断片を結合してマウスア
ミラーゼ遺伝子を含むプラスミド　ｐＲＥｌｌｏｏ（８
，１ｋｂ　）を得る。（第２図参照）（発明の効果）上記により構築された複合プラスミド　ｐＲＥＩＩｏｏ
を、例えば酢酸リチウムを用いた形質転換法により酵母
サツカロマイセス・セレビシェに導入し、形質転換株を
培養すると、後記実施例に示すようにアミラーゼを培地
中に分泌させることができる。

（実施例）以下に実施例を挙げて、本発明を更に詳細に説明する。

なお、以下の実施例における操作は、特に記載する場合
を除き、次の■〜Ｘの方法によった。

■［制限酵素による　ＤＮＡの切断と回収］制限酵素に
よる切断用緩衝液は、下記３種類を用い（１）　〜（３
）の使い分けは、Ａｄｖａｎｃｅｄ　　Ｂａｃｔｅ−ｒ
ｉａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　（＋９８１）（Ｃｏｌｄ　
ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ＮｅｗＹｏｒｋ）に従っ
た。また切断条件は、２単位／μｇＤＮＡの制限酵素を
用い、３７℃または６５℃、３０分間処理する。

次いて、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ　　のトリス塩酸ｐＨ８
，０及びｌ　ｍＭのＥＤＴＡからなる）で飽和したフエ
ノールで１回抽出し、エーテルでフェノールを除き２倍
容のエタノールを加えて一２０℃で３０分間放置した後
、遠心分離してｏＮＡを回収する。

（１）低塩濃度緩衝液１０　ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７，４）　、　ｔｏ　ｍ
Ｍの１ｉｊＬ酸マグネシウム及び１　ｍＭのジチオスレ
イトールからなる。

（２）中塊濃度緩衝液５０℃門のＮａＣｌ　、１０　ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ
７，４）ｌｏｍＭの硫酸マグネシウム及びＩ　ｍＭのジ
チオス■［大１１ｉｉ（Ｅ、ｃｏｌｉ）からのプラスミ
ド　ＤＮＡの調製］（１＞ミニ調製法（ｍ１ｎｉ　ｐｒｅｐ法）　［Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ　、　７巻、１５１３〜１
５２３頁（１９７９）］プラスミドＤＮＡを含む大ｌｉ
菌を、５００μｍのし−プロス（１０ｇのペプトン、５
ｇの酵母エキス、１ｇのグルコース、５ｇのＮａＣ１／
Ｉからなる　ｐＨ７，２）を用いて一夜間培養し、遠心
分離して集菌した菌体を、１００μｍの溶液ＡＣ５０ｍ
Ｍのグルコース、１０ｗＭのＥＤＴＡ、　２５ｍＭのト
リス塩酸（ｐＨ８，０）及びリゾチーム２ｍｇ／ｍｌか
らなるコに懸濁し、氷水中で３０分間放置する。

次いで氷水中で２００μｍの溶液８［１χの５Ｏ５（ド
デシル硫酸ナトリウム）を含む０．２ＮのＮａＯＨ］を
加え振盪して同時にＤＮＡの変性を行う。

１５０μｍ０３Ｍ酢酸ソーダ溶液（ｐＨ４，８）を加え
水冷後遠心分離し、上清に冷エタノールを加え、−７０
℃に冷却して遠心分離し沈澱を集める。

沈澱を、４００μｍの溶液Ｃ［５０ｍＭのトリス塩酸（
ｐＨ８，０）及び０．１　Ｍの酢酸ソーダからなるコに
溶解し、不溶物を除去後、冷エタノールを加え、７°ニ
ープラスミド　ＤＮＡを含む大腸菌を、１００１のし一ブ
ロス（薬剤耐性プラスミドの場合は薬剤を含む）を用い
て培養し、集菌、洗浄後、３１の溶液Ａ（５０ｍＭのグ
ルコース、１０ｗＭのＥＤＴＡ、　２５ｍＭのトリス′
塩酸（ｐＨ８，０）及びリゾチーム２曙ｇｅｍ　ｌから
なる）を加え振盪して、同時にＤＮＡの変性を行う。

３　ｍｌの３Ｍ酢酸ソーダ溶液（ｐＨ４，８）を加え水
冷後、遠心分離し、上清に０．６容のイソプロパツール
を加え、−２０℃で２０分間放置する。

遠心分離して沈澱を集め、エタノールで洗浄後２１０Ｔ
ε（ｐＨ７，５）緩衝液に懸濁する。次いで、１０μｍ
のＲＮａｓｅ　Ａ　（１０ｍｇ　／ｎ１ｌ）を加え、３
７℃で３０分閏放置後フェノール抽出を行う。水層に０
．２容の５　Ｍ　ＮａＣｌと　１／３容の３０χポリエ
チレングリコール６０００を加えて一２０℃で４０分間
、次いで４℃で４０分間放置する。遠心分離して沈澱を
集め、４００１の水に溶解し、ＤＮＡをエタノールで沈
澱させ、洗浄後１００μｍのＴＥ緩衝液に溶解する。

ｍ［Ｔ４ＤＮＡリガーゼによる連結］連結する　２個のＤＮＡ断片は、　１ｇｇ７１０μｍに
なるように、連結用緩衝液［６６ｍＭのトリス塩酸（ｐ
Ｈ７，５）　、６．６　ａ＋Ｍの塩化マグネシウム、Ｉ
Ｑ　ｍＭのジチオスレイトールからなるコに溶解し６５
℃で１０分間処理した後、４℃で６６μ門のＡＴＰ　（
アデノシントリフオスフェート）を加え、更にＴ４す１
０分間処理する。

■［大腸菌の形質転換］　［Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｂａｃ
ｔｅｒｉａｌ　Ｇｅ−ｎｅｔｉｃｓ（＋９８１）　　（
Ｃｏｌｄ　　５ｐｒｉｎ、ｇ　　）ｆａｖｏｒ、Ｎｅｗ
　　Ｙｏｒｋ　　）］５１のし一ブロスに大腸菌を植菌
し、−夜間培養する。この０．２１を２０　ｍｌのし一
ブロスに植え、３７℃でクレットユニットが６０に達す
るまで振盪培養する。菌体を集め水冷した５０　ｍＭの
塩化カルシウムとｌｏｎ＋Ｍのトリス塩酸（ｐ）Ｉ　８
．０）とからなる緩衝液１０　ｍｌに懸濁し、３０分間
氷冷する。遠心分離した菌体を１１の塩化カルシウム溶
液に懸濁し、この０．１１を　ｌＯμＩのＤＮＡ溶液と
混合し０℃で３０分間、４２℃で２分間インキュベート
した後、１．５１のし一ブロスを加え３７℃で３０分間
培養し、この０．１　ｍｌを寒天培地に植える。

Ｖ［Ｓｌヌクレアーゼによる　ＤＮＡ粘着末端の除去コ
粘着末端を持つＤＮＡを、２００μｍの高塩濃度緩衝液
［３０ｍＭの酢酸ソーダ（＋）８４．２５）　、０．３
　ＭのＮａＣｌ及び４ａ＋ＭのＦａ酸亜鉛からなるコに
溶解し、Ｓｌヌクレアーゼを２０単位／μｇ　ＤＮＡ加
え、２２℃で４０分間処理し、ＴＥ緩衝液で飽和したフ
ェノールで抽出処理した後、エーテルでフェノールを除
き、−冷エタノールを加え、−２０℃に冷却し、遠心分
離き・。

７．２）　、１０　ｍＭの硫酸マグネシウム、０．１　
ｍＭのジチオスレイトール、５０μｇ／ｍｌの牛血清ア
ルブミン（ＢＳＡ　）及び０．２　ｍＭのｄＮＴＰに溶
かし、１．２５単位のｋｌｅｎｏｗ断片（大腸菌のＤＮ
Ａポリメラーゼ■の大きな断片）を加え室温で３０分間
反応させる。次いで、１μｍの０．５Ｍ　ＥＤＴＡ　（
ｐＨ８゜０）を加えて反応を停止させ、フェノール及び
エーテルで逐次抽出し、フェノールを除去し、ＤＮＡを
エタノール沈澱により回収する。

■［Ｂａｍｌ−１１リンカ−のリン酸化］ＢａｍＨＩリ
ンカ−（Ｂ、Ｒ，Ｌ社！り８ｍｅｒ：　５’ＣＧＧＡＴ
ＣＣＧ　３’　、ＩＯｍｅｒ：　５＃ＣＣＧＧＡＴＣＣ
ＧＧ　３’１２＊ｅｒ：　５’　ＣＣＣＧＧＡＴＣＣＧ
ＧＧ　３’（二重鎖のうち一本鎖のみを示した）は、末端にリン酸基が付いていないので、Ｔ４キナーゼ
でリン酸化を行なった。

３　ｎ　ｇｏｔのＢａｍＨＴリンカ−を、４１μｍの８
０＋ＩＩＭトリス塩酸（ｐＨ７，５）及び　１２　ｍＭ
の塩化マグネシウムに溶解し、６０℃で１０分間インキ
ュヘートし■［ＢａｍＨＩリンカ−の平滑末端への連結
］平滑末端のＤＮＡ断片（１，２ｐ　１ｌｏｌ末端）と
上記■でリン酸化したＢａｍＨＩリンカ−（ｔｏｏ　ｐ
　ｍｏｌ末端）を連結用緩衝液［６６ｍＭのトリス塩酸
（ｐＨ７，５）　、　６．６　ｍＭの塩化マグネシウム
、１０　ｍＭのジチオスレイトールからなる］に溶解し
、１単位のＴ４リガーゼを加え４℃でＩ８時間反応後、
ＢａｗＨＩで処理して余分のＢａｍＨＩリンカ−を除き
、ＴＥａ衝液で飽和したフェノールでＤＮＡを抽出し、
エーテルでフェノールを除去後エタノール沈殿でＤＮＡ
を回収する。

［Ｘ［ＤＮＡ断片の１牛小腸アルカリンフォスファター
ゼ（ＣＩＡＰ　’）による処理］リガーゼ反応によるプラスミド　ＤＮＡの自己連結を阻
止するために、リガーゼ反応に先だって、プラスミド　
ＤＮＡの制限酵素による切断断片をＣＩＡＰで処理する
。

制限酵素で切断したプラスミド　ＤＮＡ（１０ｐ　ｍｏ
１５′　　末端）を　５０μｍ　のＣＩＡＰ緩ｆ％ｊｐ
　［：　　５０　ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ９，０）　、
　ｌ　ｍＭの塩化マグネシウム、０．１１１１Ｍの塩化
亜鉛及びＩ　ｍＭのスペルミジンからなる］に溶解し、
Ｉ　ｐ　ｍｏｌ末端当り、０．０１単位のＣＩＡＰを加
え３７℃で３０分間反応後、１０μｍの０．１　Ｍトリ
ス塩酸（ｐｈ　８．０　）、ｌ　Ｍ　ＮａＣ１，１０ｒ
ａＭ　ＥＤＴＡ、５　μ＋　＋７）１０　！　ＳＤＳ、
４０μ１（７）水を加え、６５℃で１５分間保持する。

冷却後ＴＥ緩衝液で飽和したフェノールで抽出処理し、
エーテルでフェノールを除去し、エタノール沈澱により
プラスミド　ＤＮＡを回酵母サツカロマイセス・セレビ
シェを１０１のＹＥＰＤ培地中で３０℃で一夜閏培養し
、集菌して一回ＴＥ　ｗｉ衝液で洗浄した後、同緩衝液
に懸濁し、細胞数が２Ｘ　ｔｏ　ｃｅｌｌｓ／　ｍｌと
なるようにする。

この懸濁液５００μｌに同量の０．２Ｍ酢酸リチウム（
ｐｈ　７．５　）を加え、３０℃で１時間保持した後、
１００μｍ宛試験管に分注し、０℃でこれにＤＮＡを添
加し、０℃で３０分間混合する。１００μｍの７０工ポ
リエチレングリコール４０００を含むＴＥ緩？ｇｊ液を
加え、よく混合した後３０℃で１時間、次いて４２℃で
５分間深持し、遠心分離して集菌し、滅菌水て洗浄する
。

これを５００μｌの滅菌水に懸濁し、１００μｍ宛を選
択培地上に植菌し、３０℃で３〜４日間培養して形質転
換株を得る。

実施例１　［プラスミドｐＳＭＦ４（３，８ｋｂ　）の調製コ
インベルターゼ遺伝子５ＵＣ２を含むプラスミドｐＲＢ
５８をＸｈｏ　Ｉ及びＢａｍＨＩで切断して５ＵＣ２の
ブロモター配列及びシグナルペプチド配列を含むＸｈ。

１〜Ｒａｍ）ｌ　Ｉ断片（約２．９　ｋｂ）を単離し、
更にＡｖａ■で切断して約１．３　ｋｂのＤＮＡ断片を
得、この両で、５ＵＣ２のプロモーター配列及びシグナ
ルペプチド配列を含む約１　ｋｂのＥｃｏＲＩ　〜Ｂａ
ｍ＋ＨＩ断片を得た。

次いて、これをプラスミドｐＵＣ８のＥｃｏＲＩ　〜Ｂ
ａｍＨ■部位に挿入して、プラスミドｐＳＭＦ４を得た
。

２［プラスミドｐＳＭＦ６（３，３ｋｂ　）の調製コ前
記プラスミドｐＲＢ５８をＸｂａ　Ｉ及びＥｃｏＲＩで
切断してインベルターゼ遺伝子のターミネータ−配列を
含むＸｂａ　Ｔ　−ＥｃｏＲＩ断片を単離し、次いてこ
れを５ａｕ３ＡＩ及びＯｄｅ　Ｉで切断して５ａｕ３Ａ
　−ＤｄｅＩ断片を得、この両端を充填後、ＢａｍＨＩ
リンカ−（１０ｍｅｒ　）を連結し、ＢａｍＨＩ及びＡ
ｌｕ　Ｉで切断し、得られたＤＮＡ断片（約０．５５　
ｋｂ　）を、プラスミドｐＵｃ８のＢａＩＩＨＩ　−Ｈ
ｉｎｃ１１部位に挿入してプラスミドｐＳＭＦ６を得た
。

３　［ｐＳＭＦＩ８　（３，９ｋｂ　）の調ｌ］（１）
プラスミドｐＢＲ３２２を　Ｐｖｕ■で切断し、Ｈｉｎ
ｄｌＩ［リンカ−を連結してＰｖｕ　１１部位をＨｉｎ
ｄｍ部位に変えた後、ＥｃｏＲＩ及び旧ｎｄｍで切断し
て、大１１ｉ菌のＡＲ５及びアンピシリン耐性遺伝子を
含むＥｃｏＲＩ〜Ｈｉｎｄｍ断片を作製し、（２）前記プラスミドｐＳＭＦ４をＥｃｏＲＩ及びＢａ
１ＨＩで切断してＥｃｏＲＩ〜ＢａｎＨＩ断片を作製し
、（３）前記プラスミドｐｓＭＦ６をＢａ１ｌ）ｌ　Ｉ
及び１ｌｉｎｄｌｌｌて切断してＢａｍＨＩ　−Ｈｉｎ
ｄＩＩ［断片を作製し、上記（１）、（２）及び（３）
の３種のＤＮＡ断片を、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを用いて
連結してｐｓＭＦ１８を作製した。

４　［ｐＳＭＦ３８Ｔ（６，６ｋｂ　）の調製］（１）
酵母プラスミド２μｌｌｌＤＮＡをＥｃｏＲＩ及びＰｓ
ｔＩで切断してＡＲ５を含むＥｃｏＲＩ　−Ｐｓｔ　Ｉ
断片を得た。

（２）プラスミドＹＲｐ７のＴＲＰＩとＡＲ５Ｉを含む
ＥｃｏＲＩ　〜ＥｃｏＲＩ断片をＰｓｔｌで切断しＴＲ
ＰＩのみを含むＥｃｏＲ■〜Ｐｓｔｌ断片を調製した。

（＋）及び（２）の断片を結合させることにより得られ
た、２７１ｍＤＮＡの復製起点とＹＲｐ７のＴＲＰＩと
を含むＥｃｏＲｒ　−ＥｃｏＲＩ断片を、ｐｓＭＦ１８
のＥｃｏＲ１部位に挿入してｐＳＭＦ３８Ｔを得た。

上記で得られた　ｐＳＭＦ３８Ｔは、サツカロマイセス
・セレビシェ　インベルターゼ遺伝子のプロモーター配
列、シグナルペプチド配列及びターミネ−配列を有し、
２μｍ　ＤＮＡ及びｐＢＲ３２２由来の複製起点を有す
るシャトルベクターであり、ＴＲＲＩ、Ａｐｒ等の選択
マーカーを有する。

７［分泌ベクターの構築］（１）マウスアミラーゼ遺伝子の導入（イ）マウスすい臓由来のアミラーゼ遺伝子を含有する
プラスミドｐＭｓａ＋０４を　Ｐｓｔ　Ｉて切断し、得
られたＰｓｔ　Ｉ〜Ｐｓｔ　Ｉ断片をプラスミド　ｐｌ
ＪｃＩ３のＰｓｔ１部位に挿入して、マウスアミラーゼ
遺伝子を含むプラスミドｐＲＥ１０７５　（４，３ｋｂ
）を作製した。

ｐＲＥ１０７５をＡｐａ　Ｉて切断し、得られたＡｐａ
Ｉ〜Ａｐａ　Ｉ断片をＳ＋ヌクレアーゼ処理して平滑端
とし、次いてＤｒａ　Ｉで切断して、アミラーゼ前駆体
の最初の１５個のアミノ酸を欠いたアミラーゼ蛋白質（
この遺伝子はアミラーゼの分秘、シグナルを欠失してい
る）をコートする　Ａｐａ　Ｉ　−Ｄｒａ　Ｉ断片を採
取した。これにＢａｍＨｒリンカ−（１２ｍｅｒ）を結
合し、Ｂａｎ＋）Ｉ　Ｉで切断して両端にＢａｍ８１部
位を持つＤ　Ｎ　Ａ断片を得た。

（ロ）一方、ｐＳＭＦ３８ＴをＢａｍＨＩで切断後、修
生小腸由来のアルカリ性ホスファターゼ（ＣＬＡＰ　）
処理してリン酸基を除去した。

（イ）及び（ロ）で得たＤＮＡ断片を結合してマウスア
ミラーゼ遺伝子を含むプラスミド　ｐＲＥｌ　ｔｏｏ（
８，１ｋｂ　）を得た。

８アミラーゼ活性（分泌）の確認上記方法により構築したプラスミド　ｐＲＥｌｌｏｏを
用いて酵母サツカロマイセス・セレビシェＹＮＮ２７株
をにＵ法により形質転換した。

得られた形質転換株を　ｌχ澱粉を炭素源とする’／Ｅ
Ｐ寒天培地上に接種し、３０℃で３日間培養した結果、
アミラーゼの分泌生産による顕著なハロー（ｈａｌｏ）
の形成が観察された。

なお、アミラーゼ遺伝子を含まない前記プラスミドｐｓ
ＭＦｓ８Ｔを用いて上記と同様にＹＮＮ２７株を形質転
換し、形質転換株を　ｌ　Ｘｌ１２粉を炭素源とするＶ
ＥＰ寒天培地上に接種し、３０℃で３日間培養した場合
には、ハローの形成は観察されなかった。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は、本発明の複合プラスミドの構成ル
ートを示す模式図であって、図中の記号Ａ、　Ａｐ、　
Ａｕ、Ｂ　、Ｄ　、　Ｏｒ、Ｅ　、　Ｈ、Ｈｃ、　Ｐ　
、　Ｐｖ、Ｓ、　　Ｘ、Ｘｈ等は夫々下記の制限酵素を
示す。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）酵母サッカロマイセス・セレビシエ　インベルタ
ーゼ遺伝子のプロモーター配列、シグナル配列及びター
ミネーター配列を含有する複合プラスミド。