NO813248L

NO813248L - Fremstilling av human-fibroblast-interferon.

Info

Publication number: NO813248L
Application number: NO813248A
Authority: NO
Inventors: Roberto Crea; David Van Norman Goeddel
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 1980-09-25
Filing date: 1981-09-24
Publication date: 1982-03-26
Also published as: EP0048970A2; AU7564981A; ATA410381A; NL8104400A; MTP900B; EP0048970A3; IT1139487B; PL233194A1; IE51679B1; YU44835B; ZW23981A1; KE3630A; DD209477A5; ES515032A0; FR2490675B1; SE8105657L; DD209652A5; ES505742A0; CH656388A5; IE812224L

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører området rekombinant DNA-teknologi, dvs. fremgangsmåter som brukes i rekombinant DNA-teknologi og produkter som erholdes ved disse fremgangsmåter.

Nærmere bestemt vedrører foreliggende oppfinnelse polypeptider, spesielt fullstendig, menneskelig fibroblastinterferon, farmasøytiske blandinger som inneholder dem og en fremgangsmåte for fremstilling derav som består i å få en kultur av en mikroorganisme som er transformert med en rep-liserbar mikrobiell ekspresjonsbærer som er i stand til å uttrykke disse polypeptider til å vokse opp og uttrykke disse polypeptider. Foreliggende oppfinnelse omfatter også ekspresjonsbærerne som brukes i denne fremgangsmåten.og de nye mikroorganismer som inneholder disse ekspresjonsbærere samt fremgangsmåtene for fremstilling derav. Til slutt ved-rører oppfinnelsen DNA-sekvenser som omfatter sekvenser for koding for aminosyresekvensen til fullstendig, menneskelig fibroblastinterferon.

Menneskelig fibroblastinterferon (FIF) er et protein med antivirus og et stort spektrum av andre biologiske aktiviteter (for oversikt se W.E. Stewart II, The Interferon System, Springer-Verlag, New York-Wien, 1979). Det er angitt å være renset homogent som ett enkelt polypeptid med en mole-kylvekt på 19000 - 20000 med en spesifikk aktivitet på 2-10

x 10 Denheter/mg (E. Knight, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 73, 520-523 [1976]; W. Berthold et al., J. Biol. Chem. 253, 5206

-5212 [1978]). Sekvensen til de 13 NH2~terminale aminosyrer i FIF er fastslått å være Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser- (E.Knight et al., Science 207, 525-526

[1980]). Houghton et al. (Nucleic Acids Res. 8, 1913-1931

[1980]) har brukt syntetiske deoksyoligonukleotider (forutsagt fra denne aminosyresekvens) til å bestemme sekvensen til de 276 5'-terminale nukleotider i FIF mRNA. Taniguchi et al. (Nature 285, 547-549 [1980]; Gene 10, 11-15 [1980] og Derynck et al. (Nature 285, 542-547 [1980]) har nylig kunnet identifisere nukleotidsekvensen for klonede cDNA-kopier av FIF mRNA i E. coli og har derav utledet den fullstendige aminosyresekvensen til menneskelig FIF innbefattet en 21 aminosyrer signalsekvens. Det fullstendige peptid er 166 aminosyrer langt. Til slutt har Taniguchi et al. (Proe. Nati. Acad. Sei. USA 7J7, 5230-5233 [1980]) konstruert et plasmid som dirigerer ekspresjon i E. coli for det menneskelige FIF-gen som gir fullstendig FIF.

Gjennom utviklingen av rekombinant DNA-teknologi har den kontrollerte mikrobielle fremstilling av et enormt utvalg av nyttige polypeptider blitt mulig. Til rådighet står allerede bakterier som er modifisert gjennom denne teknologi for å muliggjøre fremstilling av slike polypeptidprodukt-er som somatostatin, A- og B-kjedene til menneskelig insulin, menneskelig veksthormon (Itakura et al., Science 198, 1056-1063 [1977]; Goeddel et al., Nature 281, 544-548 [1979]). Enda senere er rekombinante DNA-teknikker brukt for å indu-sere bakteriell produksjon av proinsulin, tymosin og leukocyttinterferon.

Arbeidshesten til rekombinant DNA-teknologi er plasmidet,

en ikke-kromosom sløyfe av dobbelt-kjedet DNA som er funnet i bakterier og andre mikrober, ofte i multiple kopier pr. celle.. Innebefattet i informasjonen som er innkodet i plasmid DNA er det- som kreves for å reprodusere plasmidet i datterceller (dvs. et "replikon") og normalt ett eller flere seleksjonskarakteristika så som i tilfellet bakterier, resistens mot antibiotika som tillater gjenkjennelse av kloner hos vertscellene som inneholder plasmidet av interesse og fortrinnsvis vekst i selektive medier. Anvendelsen av plasmider ligger i det faktum at de spesifikt kan spaltes av en eller annen restriksjonsendonuklease eller "restriksjonsenzym" som hver gjenfinner et forskjellig sted på det plasmidiske DNA. Deretter kan heterologe gener eller genefrag-menter innsettes i plasmidet ved endekobling ved spaltningspunktet eller ved rekonstruerte ender nær spaltningspunktet. DNA-rekombinasjon utføres utenfor cellen, men det resulterende "rekombinant" plasmid kan innføres i den ved en fremgangsmåte som er kjent som transformasjon og store mengder av det heterologe geneholdige rekombinant plasmid frembring-es ved å dyrke transformanten. Hvor genet innsettes riktig

i forhold til deler av plasmidet som styrer transkripsjon

og translasjon av det innkodede DNA-budskap kan videre den resulterende ekspresjonsbærer brukes til virkelig å fremstille polypeptidsekvenser som det innsatte gen koder, en prosess som kalles ekspresjon.

Ekspresjon innledes i et område som er kjent som promotoren som finnes av og bindes av RNA-polymerase. I noen tilfeller som i tryptofan eller "trp"-promotoren som foretrekkes i ut-førelsen av foreliggende oppfinnelse er promotorområder over-lappet av "operator"-området under dannelse av en kombinert promotor-operator. Operatorer er DNA-sekvenser som gjen-kjennes av såkalte repressorproteiner som tjener til å regu-lere frekvensen til transkripsjonspåbegynnelse ved en spe-siell promotor. Polymerasen går langs DNA'et, transkriberer informasjonen i kodekjedeh fra sin 5'- til 3'-ende i budbringer RNA som igjen overføres i et polypeptid med den aminosyresekvens som DNA1 et koder. Hver aminosyre kodes av en nukleotidtriplett eller "kodon" som for følgende formål kalles det "strukturelle gen", dvs. den del som koder aminosyresekvensen til det uttrykte produkt. Etter binding til promotoren transkriberer RNA-polymerasen først nukleotider som.koder et ribosombindingspunkt, deretter en translasjons-påbegynnelse eller "start"-signal (normalt ATG, hvilket i det resulterende budbringer RNA blir AUG), deretter nukleo-tidkodoner innenfor selve det strukturelle gen. Såkalte stoppkodoner transkriberes ved enden av det strukturelle gen hvoretter polymerasen kan danne en ytterligere sekvens

av budbringer RNA som, på grunn av det tilstedeværende stopp-signal, vil forbli ikke-oversatt av ribosomene. Ribosomene binder til bindingsstedet som er tilveiebragt på budbringer RNA'et, i bakterier normalt ettersom mRNA'et dannes, og pro-duserer selv det kodede polypeptid ved å begynne ved trans-las jonsstartsignalet og ende ved det forut nevnte stoppsig-nal. Det ønskede produkt fremstilles hvis sekvensene som koder ribosombindingsstedet er riktig plassert i forhold til AUG-påbegynnelseskodonet og hvis alle gjenværende kodoner følger initiseringskodonet i fase. Det resulterende produkt kan oppnås ved å spalte vertscellen og isolere produktet ved

hensiktsmessig rensing fra annet bakterielt protein.

Skjønt isolering fra donorfibroblaster har gitt tilstrekke-lig materiale for partialkarakterisering og begrensede kliniske studier med homogent leukocyttinterferon, er det en fullstendig utilfredsstillende kilde for de mengder av int-érferon som trengs for kliniske forsøk i stor skala og for profylaktisk og/eller terapeutisk bruk i stor skala deretter. Således har kliniske undersøkelser hittil som har anvendt menneskelige fibroblastavledede interferoner i anti-tumor-og anti-virusutprøving prinsippielt vært begrenset til rå

( dvs. < 1 % rene) preparater av materialet, og lange lede-tider for fremstilling av tilstrekkelige mengder, selv ved urealistiske prisnivåer, har i kritisk grad forsinket under-søkelser på en fremskutt front.

Søkeren har funnet at anvendelse av rekombinant DNA-teknologi ville være den mest effektive måte for å tilveiebringe store mengder av fibroblastinterferon som, til tross for at det i det således erholdte materiale ikke vil være tilstede glykosyleringsegenskapene som finnes i human-avledet materiale, vil kunne anvendes klinisk i behandling av et stort spektrum virus og neoplastiske sykdommer og lyktes i å fremstille fullstendig humant fibroblastinterferon mikrobielt ved å konstruere et gen for dette som kunne innsettes i mikrobielle ekspresjonsbærere og uttrykkes under kontroll av mikrobielle generegulator-kontroHører.

Veien til fremstilling av et fibroblastgen medførte de følg-ende: 1. Partielle aminosyresekvenser fra menneskelig fibroblastinterferon ble brukt til å konstruere sett av syntetiske DNA-prøver hvis kodoner i agregatet representerte alle mulige kombinasjoner som var i stand til å kode de partielle aminosyresekvenser. 2. Bakterielle kolonibanker ble fremstilt som inneholdt komplementært DNA (cDNA) fra indusert budbringer RNA. Prøvene fra del (1) ble brukt for å igangsette syntesen av radioaktivt markert enkeltkjedet cDNA for bruk som hybridiserings-prøver. De syntetiske prøvene ville hybridisere med indusert mRNA som sjablon og utvides ved revers transkripsjon til å danne indusert, radioaktivt markerte cDNA. Kloner fra kolonibanken som hydribiserte til radioaktivt markert cDNA.erholdt på denne måte er videre undersøkt for å bekref-te nærværet av et interferonkodingsgen med full lengde. Enhver delvis lengde antatt genefragmént som erholdtes ble i seg selv brukt som en prøve på genet med fullstendig lengde. 3. Genet med fullstendig lengde erholdt ovenfor ble sammen-føyet ved bruk av syntetisk DNA slik at enhver ledersekvens ble fjernet som kunne forhindre mikrobiell ekspresjon av det fullstendige polypeptid og tillot korrekt plassering i en ekspresjonsbærer i forhold til startsignalene og ribosom-bindingspunktet til en mikrobiell promotor. Uttrykt interferon ble renset til et punkt som gjorde det mulig å fast-slå dets karakter og bestemme dets aktivitet.

Ved å anvende metoder for rekombinant DNA-teknologi som beskrevet ovenfor er en rekke repliserbare plasmidiske ekspresjonsbærere konstruert som dirigerer høynivåsyntesen i transformantmikroorganismer for et fullstendig polypeptid med egenskapene til autentisk menneskelig fibroblastinterfer-, on. Polypeptidproduktet oppviser aminosyresekvensen til dette interferonet og er aktivt i in vitro forsøk til tross for mangelen på glykosyleringskarakteristikumet til det materiale som er isolert fra mennesker. Uttrykket "ekspresjon av fullstendig fibroblastinterferon" betegner her den bakterielle eller annen mikrobiell fremstilling av et inter-feronmolekyl som ikke inneholder noen glykosylgrupper eller en forsekvens som straks deltar i mRNA translasjonen av det menneskelige fibroblastinterferon-genom. Fullstendig fibroblastinterferon ifølge foreliggende oppfinnelse uttrykkes øyeblikkelig fra et translasjons-startsignal (ATG) som også koder det første aminosyrekodon i det naturlige produkt. Tilstedeværelse eller mangel på metioninet, første aminosyre<:>i det mikrobielt uttrykte produkt, styres av et kinetisk fen- omen avhengig av fermenteringsvekst-betingelser og/eller grader av ekspresjon i transformantverten. Fullstendig fibroblastinterferon kunne uttrykkes sammen med et konjugert protein helt forskjellig fra den konvensjonelle leder, idet konjugatet var spesifikt spaltbart i et intra- eller ekstra-cellulært miljø (se britisk patent nr. 2007676A). Endelig kunne det fullstendige interferon fremstilles i forbindelse med et mikrobielt "signal" peptid som transporterer konjugatet til celleveggen hvor signalet behandles og det ferdige polypeptid utskilles.

De herved medfølgende figurer 1 til 5 er beskrevet i detalj, i teksten senere. Figur 6 angir skjematisk konstruksjonen

av plasmider som koder for direkte ekspresjon av fullstendig fibroblastinterferon. Restriksjonspunkter og rester er vist som ("Pst I", etc). "Ap<R>" og "Tc<R>" betegner deler av plasmidet som uttrykker henholdsvis ampicillin- og tetracyklinresistens. Uttrykket "p o" er en forkortelse for 'promotor operator".

BESKRIVELSE AV FORETRUKNE UTFØRELSESFORMER

A. Anvendte mikroorganismer

Det beskrevne arbeid innbefattet bruken av mikroorganismen E. coli K-12 stamme 294 (ende A, thi , hsr , hsm£), som beskrevet i britisk patent nr. 2055382 A. Denne stammen er deponert hos the American Type Culture Collection, ATCC Accession No. 31446. Alt rekombinant DNA-arbeide ble ut-ført i overensstemmelse med de angitte retningslinjer fra National Institutes of Health.

Selv om oppfinnelsen er beskrevet i sine sterkest foretrukne utførelsesformer under henvisning til E. coli K-12 stamme 294 som ovenfor angitt, omfatter den også andre kjente E. coli-stammer så som E. coli B, E. coli x 1776 og E. coli

W 3110, eller andre mikrobielle stammer hvorav mange er deponert og (potensielt) tilgjengelige fra anerkjente mikroorganisme-deponeringsinstitusjoner så som American Type Cul ture Collection (ATCC). Se også tysk Offenlegungsschrift 2644432. Disse andre mikroorganismer omfatter f.eks. basil-ler så som Bacillus subtilis og andre enterobakteriaceae hvorav kan nevnes som eksempler Salmonella typhimurium og Serråtia marcescens ved bruk av plasmider som kan replisere og uttrykke heterologe genesekvenser deri. Gjær, så som Saccharomyces cerevisiae kan også med fordel anvendes som vertsorganisme i fremstilling av interferonprotein ved å uttrykke genene som koder for dette under kontrollen av en gjærpromotor.

B. Generelle metoder

Restriksjonsenzymer ble kjøpt fra New England Biolabs og brukt som foreskrevet. Plasmid DNA ble fremstilt ved en standard klaret lysatfremgangsmåte (D.B. Clewell, J. Bacteri-ol. 110, 667-676 [1972] og renset ved kolonnekromatografi på Biogel A-50M. DNA-sekvensdannelse ble utført ved metoden til Maxam and Gilbert (Methods Enzymol. 65, 499-560 [1980]. DNA-restriksjonsfragmenter ble isolert fra polyakrylamidgel-er ved elektroeluering. DNA-fragmenter ble radioaktivt markert for bruk som hydridiseringsprøver ved den statistiske kalvetymus DNA-primingsmetoden til Taylor et al. (Biochim. Biophys. Acta 442, 324-330 [1976]). In situ kolonihybridi-seringer ble utført ved Grunstein-Hogness metode (Proe. Nati. Acad. Sei. USA 72, 3961-3965 [1975]).

C. Kjemisk syntese av deoksyoligonukleotider

Deoksyoligonukleotidene ble syntetisert ved den modifiserte fosfortriestermetode i løsning (Crea et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 75, 5765-5769 [1978]), ved bruk av trideoksy-nukleotider som byggestener (Hirose et al., Tetrahedron Letters 28.'2449-2452 [1978]). Materialene og de generelle metoder var lik med dem som er beskrevet av Crea et al.,Nucleic Acids Res. £3, 2331-2348 [1980]. De 6 samlinger av primere (fig. 1) som inneholder 4 dodecanukleotider hver fikk man ved separat å koble 2 heksamersamlinger (fra 2 forskjellige 5<1->terminale sekvenser hver) med 3 forskjellige heksamersamlinger (av 2 forskjellige 3'-terminale sekvenser hver).

D. Induksjon av fibroblaster

Menneskelige fibroblaster (cellelinje GM-2504A) ble dyrket som tidligere beskrevet av Pestka et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 12_ t 3898-3901 [1975]. Vekstmedium (Eagle's mini-male essensielle medium inneholdende 10 % fetalt kalveserum) ble fjernet fra rulleflasker (850 cm 3) og erstattet med 50 ml vekstmedium inneholdende 50 jug/ml poly(I): poly(C) og 10 ^g/ml cykloheksimid. Dette induksjonsmediet ble fjernet etter 4 timer ved 37°C og cellemonosjikt ble vasket med fosfatpufret saltvann (PBS; 0.14M NaCl, 3mM KC1, 1.5 mMKH2P04, 8mM Na2HP04), Hver flaske ble inkubert ved 37°C med 10 ml av en trypsin - EDTA-løsning (Gibco 610-5305) inntil cellene var løsrevet og fetalt kalveserum ble tilsatt til en konsentrasjon på 10 %. Celler ble rotert i 15 min. ved 500 x g og klumpene ble resuspendert i PBS, sammenslått og resedimentert. Celler ble frosset i flytende nitrogen. Ca. 0.17 g celler ble erholdt pr. rulleflaske.

E. Fremstilling og måling av interferon mRNA

Poly(A)-inneholdende mRNA ble fremstilt fra humanfibroblaster ved fenolekstraksjoner og oligo(dT)-cellulosekromatografi som beskrevet av Green et al. (Arch. Biochem. Biophys. 172, 74-89 [1975]). Det poly (A)-holdige RNA ble anriket med : interferon mRNA ved sentrifugering på en linjær 5-20 % (vekt pr. volum) sukrosegradient. RNA-prøvene ble oppvarmet til 80°C i 2 min., raskt avkjølt, sjiktet over gradienten, og sentrifugert 20 timer ved 30000 omdr./min. ved 4°C i en Beckman SW-40 rotor. Fraksjoner ble oppsamlet, etanol presipitert og oppløst i ^0.

Et mikrogram prøver av mRNA ble injisert i Xenopus laevis oocytes som beskrevet av Cavalieri et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 1±, 3287-3291 [1977]. De injiserte oocytter ble inkubert '24 timer ved 21°C, homogenisert og sentrifugert i 5 min. ved 10 000 x g. Interferonet i supernatanten ble målt ved den cytopatiske virkning (CPE) inhibieringsmåling (Stewart, The Interferon System, Springer-Verlag, New-York-■ Wien, 1979) ved bruk av Sindbis virus og menneskelige diplo-ide celler (WISH). Interferonstyrker på 1 000 til 6 000 enheter gjenvunnet (NIH referansestandard) pr. mikrogram pr. RNA injisert erholdtes for 12S artene av mRNA.

F. Syntese og kloning av cDNA

Enkeltkjedet cDNA ble fremstilt i 100 p. 1 reaksjoner inneholdende 5 ug 12S fraksjon mRNA, 20 mM Tris-HCl (pH 8,3), 20 mM

32 KC1, 8mM MgCl2, 30 mM 3-merkaptoetanol, 100 yUCi av (a P) dCTP og 1 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP. Primeren var den syntetiske Hindlll dekamer dCCAAGCTTGG (Scheller et al., Science 196, 177-180 [1977]) som var blitt utvidet på 3'-enden med ca. 20 til 30 deoksytymidinrester ved bruk av terminal deok-synukleotidyl-transferase (Chang et al., Nature 275, 617-624 [1978]). 100 enheter revers transkriptase ble tilsatt og reaksjonsblandingen ble inkubert ved 42°C i 30 min. Den andre DNA-kjedesyntesen ble utført som forut beskrevet (Goeddel et al., Nature 281, 544-548 [1979]). Det dobbelt-kjedede cDNA ble behandlet med 1200 enheter Sl nukleåse i 2 timer ved 37°C i 25 mM natriumacetat (pH 4,5), lmM ZnCl2,

0,3M NaCl. Etter fenolekstraksjonen ble blandingen adskilt ved elektroforese på en 8 % polyakrylamidgel. cDNA (~0,5 pg) varierende fra 550 - 1500 basepar i størrelse ble gjenvunnet ved elektroeluering. En 20 ng alikvot ble utvidet med deok-syC-rester ved bruk av terminal deoksynukleotidyltransferase (Chang et al., supra) og herdet med 100 ng pBR322 som var blitt spaltet med Pstl og avsluttet med deoksyG-rester (Chang et al., supra). Den herdede blanding ble brukt til å transformere E. coli K-1.2 stamme 294 ved en publisert fremgangsmåte (Hershfield et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 71, 3455-3459 [1974]).

32

G. Fremstilling av indusert og ikke- indusert P- cDNA-prøver

5 ug 12S mRNA ble kombinert med enten 2 yug'oligo (dT) -^ 2- 18 eller 5 jug av hver syntetisk primersamling (fig. 1) i 60 ^1 lOiruM Tris-HCl (pH 8) , 1 mM EDTA. Blandingene ble kokt 3

min. og bråkjølt på is. 60 ;ul 40 mM Tris-HCl (pH 8,3), 40 mM KC1, 16mM MgCl2, 60 mM 3-merkaptoetanol, 1: mM dATP, dGTP, dTTP og 5 x 10~7M (a-<32>P) dCTP (2 000 - 3 000 Ci/mM) ble t satt til hver sjablon-primerblanding ved 0°C. Etter tilset-"; ningen av 100 enheter revers transkriptase ble reaksjonene inkubert ved 4 2°C i 30 min. og renset ved føring over 10 ml Sephadex G-50 kolonner. Produktene ble behandlet med 0,3N NaOH i 30 min ved 70°C, nøytralisert og etanol presipitert.

32

P-cDNA'ene ble kombinert med 100 ug poly(A) mRNA fra ikke-induserte fibroblaster i 50 jai 0,4M natriumfosfat (pH 6,8), 0,1 % natriumdodecylsulfat (SDS). Blandingene ble oppvarmet

o o ved 98 C i 5 min. og fikk herde 15 timer ved 45 C. DNA-RNA-hybridene (inneholdende ikke-indusert cDNA-sekvenser)

ble skilt fra enkeltkjedet DNA. (induserte cDNA-sekvenser) ved kromatografi på hydroksyapatitt som beskrevet av Galau et al. (Proe. Nati. Acad. Sei. USA 2A> 1020-1023 [1977]. DNA-RNA-hybridene ble behandlet med alkali for å fjerne RNA.

32

H. Undersøkelse av rekombinant plasmider med P- cDNA-prøver

Ca. 1 jag prøver av plasmid DNA ble fremstilt fra individuelle transformanter ved en publisert fremgangsmåte (Birn-boim et al., Nucleic Acids Res. 1_, 1513-1523 [1979]). DNA-prøvene ble linearisert ved behandling med EcoRI, denaturert i alkali og ført på hvert av 3 nitrocellulosefiltere ved dott-hybridiseringsmetoden (Kafatos et al., Nucleic Acids Res.

7, 1541-1552 [1979]). Filtrene ble hybridisert med<32>P-cDNA prøvene i 16 timer ved 42°C i 50 % formamid, 10x Denhardt<1>s løsning (Biochem. Biophys. Res. Comm. 2_3, 641-646 [1966]), 6xSSC 40 mM Tris-HCl (pH 7,5), 2mM EDTA, 40 jug/ml gjær RNA. Filtere ble vasket med 0,lxSSC, 0,1 % SDS to ganger i 30 min.

ved 42°C, tørket og utsatt for Kodak XR-2 røntgenfilm ved bruk av "Dupont Lightning-Plus intensifying screens" ved -80°C. [SSC inneholder 0,15 M NaCl og 0,015 M natriumsitrat, pH 7,0] .

I. Konstruksjon av plasmider for direkte ekspresjon av FIF

De syntetiske primere I (dATGAGCTACAAC) og II (dCATGAGCTACAAC) ble fosforisert ved bruk av T4 polynukleotidkinase og

32

(Y- P)ATP til en spesifikk aktivitet på 700 Ci/mM som ber skrevet av Goeddel et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 76, 106-110 [1979]. Primerreparasjonsreaksjoner ble utført som følger: 250 pM av 3 2P-primerene ble kombinert med 8 jug

(10 pM) av et 1200 bp Hhal restriksjonsfragment inneholdende FIF cDNA-sekvensen. Blandingen ble etanolpresipitert, resuspendert i 50 pl ^O, kokt 3 min., bråkjølt i et tørris-etanolbad og slått sammen med en 50 pl løsning av 20mM Tris-HCl (pH 7,5), 14 mM MgCl^ 120 mM NaCl, 0,5 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP ved 0°C. 10 enheter DNA-polymerase I Klenow-fragment ble tilsatt og blandingen ble inkubert ved 37 oC i 4,5 timer. Etter ekstraksjon med fenol/CHCl^og restriksjon med Pstl ble det ønskede produkt renset på en 6 % polyakrylamidgel. Etterfølgende ligeringer ble foretatt ved romtemp-eratur (klebende ender) eller 4°C (avvisende ender) ved bruk av tidligere angitte betingelser (Goeddel et al., supra).

J. Måling av interferonekspresjon i E. coli

Bakterieekstrakter ble fremstilt for IF-måling som følger:

1 ml kulturer ble dyrket natten over i LB (Luria-Bertani) medium inneholdende 5 jug/ml tetracyklin, deretter fortynnet i 25 ml M9 medium tilsatt 0,2 % glukose, 0,5 % kasaminosyrer og 5 ,ug/ml tetracyklin. 10 ml prøver ble oppsamlet ved sentrifugering når absorbsjonen ved 550 nm (A^^q) nådde 1,0. Celleklumpene ble raskt frosset i et tørris-etanolbad og klarede lysater ble fremstilt som beskrevet av Clewell (supra). Interferonaktivitet i supernantantene ble bestemt ved sammenligning med NIH FIF standarder ved bruk av CPE-inhibieringsmålinger. To forskjellige målinger ble utført: (a) WISH (human amnion) celler ble plassert i mikrotiterskål-er. Prøver ble tilsatt 16 til 20 timer senere og fortynnet med seriemessige 2 gangers fortynning. Sindbis-virus ble tilsatt etter minst 3 timers inkubering. Plater ble farget 20 til 24 timer senere med krystallfiolett. (b) MDBK (stor-fenyre) cellerekke ble sådd samtidig med 2 gangers fortynn-' inger av prøver. Vesikulær stomatitis virus ble tilsatt etter 2 til 3 timers inkubering og plater ble farget med krystallfiolett 16 til 18 timere senere. For å prøve pH 2 stabilitet ble bakterielle ekstrakter og standarder fortynnet i minimalt essensielt medium til en konsentrasjon på 1000 enheter/ml. 1 ml alikvoter ble justert til pH 2 med IN HCl, inkubert ved 4°C i 16 timer og nøytralisert ved tilsetning av NaOH. IF-aktivitet ble målt ved CPE-inhibieringsmåling ved bruk av humane amnionceller for å etablere antigenidenti-tet ble 25 /al alikvoter av 1000 enheter/ml interferon prøver .(ubehandlet) inkubert ved 2 5 ul kanin-antihuman leukocyttinterferon i 60 min. ved 37°C. Sentrifugert ved 12 000 x g i 5 min. og supernatanten målt. Fibroblast- og leukocytt-interferonstandarder erholdtes fra National Institutes of Health. Kanin-antihuman-leukocyttinterferon erholdtes' fra National Institute of Allergy and Infectious Diseases.

K. Kjemisk syntese av primersamlinger komplementære til

FIF mRNA ,

Den kjente amino-terminale proteinsekvens fra human-fibroblastinterferon gjorde det mulig å dedusere de 24 mulige mRNA-sekvenser som kunne kode de 4 første aminosyrer. De 24 komplementære deoksyoligonukleotider ble syntetisert i

6 samlinger på 4 dodekamerer hver (fig. 1).

De 6 samlinger av 4 deoksyoligonukleotider ble hver syntetisert ved den modifiserte fosfortriestermetode i løsning og på fast fase (Crea et al., supra). Den grunnleggende stra-tegi lå i å omsette 2 forskjellige 3<1->blokkerte trimerer med et overskudd av et enkelt 5'-beskyttet trimer hvilket ga en samling av 2 heksamerer, som alle var likt representert. Koblingen av de 2 samlinger som hver inneholdt 2 heksamerer

. resulterte i en samling på 4 dodekamerer.

L. Identifikasjon av FIF cDNA- kloner

Ved å bruke 12S mRNA fra induserte humanfibroblaster (1 000 enheter IF-aktivitet pr. pg i oocyttmåling), ble dobbelt-kjedet cDNA fremstilt og insatt i pBR322 ved Pstl-punktet ved standard dG:dC sammensetningsmetoden som er beskrevet av Chang et al., ovenfor. En fibroblast cDNA-samling bestående av 30 000 ampicillin-sensitive, tetracyklinresistente transformanter av E. coli K-12 stamme 294 erholdtes fra 20 ng cDNA varierende i størrelse fra 550 til 1300 basepar. Plasmid DNA ble fremstilt fra 600 av transformantene og satt på 3 sett av nitrocellulosefiltere som ovenfor beskrevet.

Det prinsipp som ble fulgt ved identifisering av hybrid-plasmider inneholdende fibroblastinterferon cDNA-sekvenser var lignende med det som ble brukt for å identifisere menneskelig leukocyttinterf eron rekombinantplasmider (Goeddel et al., Nature 2 87, 411-416 [1980]). Radioaktivt markerte cDNA hybridiseringsprøver ble fremstilt ved å bruke enten de 24 syntetiske dodekamerer eller oligo (dT) -j^-is som primere og 12S RNA fra induserte fibroblaster (5000 enheter/ug i oocytter) .som sjablon..:. 3 2 P-cDNA1 er (spesifikk aktivitet > 5 x 10<8>cpm/ijg) som erholdtes ble hybridisert i stor utstrekning av mRNA isolert fra ikke-induserte menneskelige fibroblaster, og mRNA-cDNA-hybridene ble skilt fra ureagert cDNA ved hydroksyapatitt-kromatografi (Galau et al., supra). De enkelt-kjedede cDNA-fraksjoner burde anrikes på sekvenser som fore-ligger i induserte fibroblaster men ikke er tilstede i uin-duserte celler, og mRNA-cDNA-hybridene skulle representere sekvenser som er felles for både induserte og ikke-induserte celler. Ca. 4 x 10 cpm enkeltkjedet cDNA (hybridiserings-prøve A) og 8 x IO<6>cpm cDNA-mRNA-hybrider erholdtes ved å bruke oligo(dT) primet cDNA; 1,5 x 10^ cpm enkeltkjedet 12-18 g (hybridiseringsprøve B) og 1,5 x 10 cpm hybrider erholdtes fra cDNA som var primet ved å bruke syntetiske dodekamersam-lihger 1-6. cDNA-mRNA-hybridene fra begge fraksjoner ble sammenslått, RNA1 et hydrolysert ved behandling med alkali og

<32>P-cDNA brukt som hybridiseringsprøve C. Mange av de 600 plasmidprøver hybridiserte med begge prøver A og C hvilket indikerte at hybridiseringsreaksjonene mellom ikke-indusert mRNA og<32>P-cDNA (før hydroksyapatitt-fraksjoneringstrinnet) ikke var fullstendig. Imidlertid hybridiserte bare en av de 600 plasmider (pF526) sterkt med den spesifikt primede, induserte cDNA- prøve B (Fig. 2). Plasmid pF526 hybridiserte også med det totale primede oligo(dT)12-i8'indusert cDNA prøve A, og ga ikke påviselig hybridisering med den kombiner-te ikke-induserte prøve C.

Pstl-behandling av pF526 viste at den klonede cDNA-innsats var ca. 550 basepar lang, sannsynligvis for kort til å inneholde hele kodeområdet for fibroblastinterferon. Derfor ble

32

en P-markert DNA-prøve fremstilt fra dette Pstl-fragment ved statistisk priming med kalvetymus DNA (Taylor et al., ovenfor). Denne prøven ble brukt til å undersøke 2000 individuelle kolonier fra en nykonstruert fibroblast cDNA-samling (den nye cDNA-samlingen ble fremstilt ved å bruke 12S mRNA fra induserte fibroblaster med styrke på 6000 enheter pr. ml.i oocytt-målesystemet. 16 kloner hybridiserte til prøven. Plasmidet fremstilt fra hovedsaken av disse frigjor-de 2 fragmenter ved spaltning med Pstl hvilket indikerte at cDNA'et inneholdt et indre Pstl-punkt. Klonet pFIF3 inneholdt den største cDNA-innsats, ca. 800 basepar. DNA-sekvensen til innsatsen ble bestemt ved Maxam-Gilbert<1>s metode (ovenfor) og er vist i fig. 3. Aminosyresekvensen til humant fibroblastinterferon forutsagt frahukleotid-sekvensen er identisk med den som nylig er angitt av Taniguchi et al. (Gene 10_, 11-15 [1980] og av Derynck et al.

(ovenfor) fra DNA-sekvensering av FIF cDNA-kloner. En per-kursor eller signalpeptid på 21 aminosyrer etterfølges av en sekvens på 166 aminosyrer som utgjør det fullstendige interferon, et strekk på 196 3'-utranslaterte nukleotider og en poly(A)hale. De NH^-terminale 20 aminosyrer i fullstendig FIF er blitt direkte bestemt ved protein mikrosekvensering og er de samme som de som er forutsagt fra DNA-sekvensen.

M. Direkte ekspresjon av fibroblastinterferon

For å uttrykke store mengder fullstendig fibroblastinterferon i E. coli må initieringen av proteinsyntese opptre ved ATG kodonet for det fullstendige polypeptid (aminosyre 1) ! fremfor ved ATG for signalpeptidet (aminosyre Sl) (fig. 3).

Foreliggende prinsipp å fjerne signalpeptid-kodeområdene J fra pFIF3 er vist i fig. 4. Et 1200 bp DNA-fragment som inneholdt hele cDNA-innsatsen ble isolert fra en polyakrylamid- j

i

gel etter behandling av pFIF3 med Hhal. 2 separate synteti-

ske deoksyoligonukleotidprimere, dATGAGCTACAAC(I) og

dCATGAGCTACAAC (II) ble fremstilt. Begge primere inneholder

kodesekvensen for de første 4 aminosyrer av fullstendig fibroblastinterferon; primer II har en ytterligere C ved 5'-enden. Primerreparasjonsreaksjoner og etterfølgende

ligering ble utført separat for primere I og II og ga nesten identiske resultater. Derfor omtales her i detalj bare reaksjoner som anvender primer I. Primerene ble 5'-radio- |

32 markert ved å bruke (y- P)ATP og T4 polynukleotidkinase, kombinert med 1200 bp Hhal DNA-fragmentet og blandingene ble denaturert ved koking. Etter hybridisering av primeren

til det denaturerte Hhal DNA-fragment, ble E. coli DNA-poly-

merase I Kelnow fragment (Klenow et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 6j>, 168-175 [1970] brukt for å katalysere repara-

sjonssyntesen av pluss (topp) kjeden (fig. 4). Dertil fjernet den medfølgende 3' —> 5' eksonukleaseaktivitet av Klenow- 1 fragmentet den 3<1->fremstikkende ende fra minus (bunn) kjeden og tilbakelot en direkte ende. Analyser av prøver av reaksjonsblandingen ved polyakrylamidgel-elektroforese indikerte at reparasjonssyntesen ikke hadde gått fullstendig, men stoppet ved flere avgrensede punkter. Derfor ble hele reaksjonsblandingen behandlet med Pstl og det ønskede 141 bp fragment (180 000 Cerenkow cpm;^0,3 pM) ble renset ved polyakrylamidgel-elektrof orese (fig. 5). Ligering av dette fragment til 1 ug (~4 pM) av 363 bp PstI-BglII-fragmentet isolert fra

' pFIF3. (fig. 4)', etterfulgt av Bglll-behandling ga 50 000

Cerenkov cpm (~0,1 pM,/v30 ng) av 504 bp DNA-fragment som

■ inneholdt hele kodesekvensen for fullstendig fibroblastinter<->

feron. De samme reaksjoner ved bruk av primer II ga 83 000

cpm (~0,15 pM, ^ 50 ng) av 505 bp produkt.

Konstruksjonen av plasmider som dirigerer syntesen av human-j

fibroblastinterferon er vist i fig. 6. Separate ekspresjons-

plasmider ble konstruert som satte FIF-syntesen under konrr trollen av E. coli lac eller trp-promotor-operatorsystemer. Begge disse systemer har vist seg nyttige for direkte ekspresjon av eukaryotiske gener i E. coli: humant veksthormon har blitt effektivt syntetisert ved bruk av lac-system (Goeddel et al., Nature 281, 544-548 [1979] og humant leuko-j

cyttinterferon har blitt produsert i store mengder ved bruk !

i av trp-systemet (Goeddel .-et al., Nature 287 , 411 [1980]). i i

- ' ' ■ i

pBRH trp ble behandlet med EcoRI restriksjonsenzym og det ! resulterende fragment isolert ved PAGE og elektroeluering.

EcoRI-behandlet plasmid pSom 11 (Itakura et al., Science 198,

1056-1063 [1977]); G.B. patent publikasjon nr. 2 007 676 A)', ble kombinert med det ovennevnte fragment. Blandingen ble ligert med T. DNA-ligase og det resulterende DNA transfor- j mert i. E. coli K-12 stamme 294 som forut beskrevet. Trans- I formantbakterier ble utvalgt på ampicillinholdige plater. Resulterende ampicillinresistente kolonier ble undersøkt ved kolonihybridisering (Grunstein et al., supra) ved som en ! prøve å bruke det trp-promotor-operator-holdige ovennevnte '

fragment isolert fra pBRHtrp, som var blitt radioaktivt mar-32 kert med P . Flere kolonier, som viste seg positive ved

kolonihybridisering ble utvalgt, plasmid DNA ble isolert og orienteringen av de innsatte fragmenter bestemt ved restrik-sjonsanalyse under anvendelse av restriksjonsenzymer BglH

og BamHI i dobbelt behandling. E. coli 294 som inneholdt

plasmidet kalt pSOM7A2, som hadde trp promotor-operator-fragmentet i den ønskede orientering ble dyrket i LB-medium<\>inneholdende 10 iig/ml ampicillin. Cellene ble dyrket til j optisk densitet 1(ved 550 nM), oppsamlet ved sentrifugering

og gjenoppslemmet i M9-medier i 10 gangers fortynning. Cell-

er ble dyrket i 2-3 timer, igjen til optisk densitet 1, der-' etter spaltet og totalt celleprotein analysert ved SDS urea .

(15 %) PAGE (Maizel et al., Methods Virol. 5, 180-246 [1971]).

Plasmid pBR322 ble Hindlll-behandlet og de fremstikkende Hindlll-ender igjen behandlet med Sl nuklease. Sl-nuklease-behandlingen innbefattet behandling av 10 ug Hindlll-spaltet pBR322 i 30 ul Sl-puffer (0,3 M NaCl, 1 mM ZnCl2, 25 mM natriumacetat, pH 4,5) med 300 enheter Sl-nuklease i 30 min. ved 15°C. Reaksjonen ble stoppet ved tilsetning av 1 iil 30

x Sl-nuklease stoppløsning (0,8m Tris base, 50 mM EDTA). Blandingen ble fenolekstrahert, kloroformekstrahert og etanolpresipitert, så EcoRI-behandlet som forut beskrevet og det store fragment (1) erholdt ved PAGE-metoden etterfulgt av elektroeluering. Det erholdte fragment hadde en første EcoRI-bindende ende og en andre avvisende ende hvis kode-kjede begynner med nukleotidet tymidin.

Plasmid pSom7A2, som fremstilt ovenfor, ble Bglll-behandlet og de Bglll-bindende ender som resulterte gjort dobbeltkjed-et med Klenow polymerase I metoden som anvender alle 4 deo-ksynukleotidtrifosfater. EcoRI-spaltning av det resulterende produkt etterfulgt av PAGE og elektroeluering av det lille fragmentet (2) ga et lineært stykke DNA som inneholdt tryptofan promotor-operator og kodoner for LE' "proximal" sekvens oppstrøms fra Bglll-stedet ("LE'(p)"). Produktet hadde enEcoRI-ende og en avvisende ende som resulterte fra fyllingen i Bglll-punktet. Imidlertid rekonstitueres Bglll-punktet ved ligering av den avvisende ende av fragment (2) til den avvisende ende av fragment (1). Således ble de 2 fragmenter ligert i nærvær av T^DNA-ligase og dannet det resirkulerte plasmid pHKY 10 som ble propagert ved transformasjon i kom-petente E. coli stamme 294-celler..

Plasmid pGMl har E. coli tryptofan-operon som innebærer ute-latelsen ALE1413 (Miozzari et al., J. Bacteriology 133, 1457-1466 [1978]) og derfor uttrykker et fusjonsprotein som inneholder de første 6 aminosyrer av trp-lederen og omtrent den siste tredjedelen av trp E-polypeptidet (heretter i konjunk-sjon kalt LE'), samt trp D polypeptidet i sin helhet, alt under kontroll av trp promotor-operator-systemet. Plasmidet 20 ug, ble behandlet med restriksjonsenzymet PvuII som spal-ter plasmidet på 5 steder. Genefragmentene ble deretter kombinert med EcoRI-bindere (bestående av et selvkomplemen-<1>

j terende oligonukleotid med sekvensen: pCATGAATTCATG) som'tilveiebringer et EcoRI-spaltningspunkt for en senere kloning til et plasmid som inneholder et EcoRI-punkt. De 20 \ p. g DNA-fragmenter som erholdtes fra pGMl ble behandlet med 10 enheter T. DNA-ligase i nærvær av 200 pico mol 5'-fosforyl-

ert syntetisk oligonukleotid pCATGAATTCATG og i 20 ul T :DNA-

ligasepuffer (20mM Tris, pH 7,6, 0,5 mM ATP, 10 mM M<g>Cl2, 5 mM ditiotreitol) ved 4°C natten over. Løsningen ble så j oppvarmet 10 min. ved 70°C for å stoppe ligering. Sammen-' binderne ble spaltet ved EcoRI-behandling og fragmentene,

i nå med EcoRI-ender ble separert ved bruk av 5 %'ig PAGE og i de 3 største fragmenter isolert fra gelen ved først å be- j handle med etidiumbromid, lokalisere fragmentene med ultra- i

fiolett lys og skjære fra gelen de deler som var av interesse.

Hvert gelfragment med 300 mikroliter 0,lxTBE ble plassert i en dialysepose og underkastet elektroforese ved 100 V i en time i 0,lxTBE-puffer (TBE-puffer inneholder: 10,8 gm Tris base, 5,5 gm borsyre, 0,09 gm Na2EDTA i 1 liter H20). Den vandige løsning ble oppsamlet fra dialyseposen, fenolekstra-, hert, kloroformekstrahert og gjort 0,2 M natriumklorid, og DNA utvunnet i vann etter etanolutfelling. trp promotor-operatoren som inneholdt genet med EcoRI festende ender ble identifisert i den følgende beskrevne fremgangsmåte som med-fører innsetting av fragmenter i et tetracyklinsensitivt plasmid som etter promotor-operator-innsetting blir tetracyklinresistent.

Plasmid pBRHl (Rodriguez et al., Nucleic Acids Research _6, 3267-3287 [1979]) uttrykte ampicillinresistens og inneholder, genet for tetracyklinresistens, men da det ikke er noen til-knyttet promotor, uttrykker det ikke denne resistens. Plas-| midet er følgelig tetracyklinresistent. Ved å innføre et promotor-operatorsystem i EcoRI-punktet, kan plasmidet gjøres tetracyklinresistent.

pBRHl ble behandlet med EcoRI og enzymet fjernet ved fenol-

ekstraksjon etterfulgt av kloroformekstraksjon og gjenvunnetj i vann etter etanolutfelling. Det resulterende DNA-molekyl i

ble i separate reaksjonsblandinger kombinert med hver av de 3 DNA-fragmentene som erholdtes ovenfor og ligert med T DNA-ligase som tidligere beskrevet. Det foreliggende DNA i reaksjonsblandingen ble brukt til å transformere kompetent E. coli K-12 .stamme 294 ved standardteknikker (Hershfield et al., supra) og bakteriene plassert på LB-plater som inneholdt 20 yug/ml ampicillin og 5 yug/ml tetracyklin. Flere tetracyklin-resistente kolonier ble utvalgt, plasmid DNA isolert og tilstedeværelsen av det ønskede fragment bekreftet ved res-triks jonsenzymanalyse . Det resulterende plasmid kalles pBRHtrp.

Et EcoRI- og BamHI-behandlingsprodukt fra det virale genom

av hepatitt B erholdtes ved konvensjonelle midler og ble klonet i EcoRI- og BamHI-punktene til plasmid pGH6 (Goeddel et al., Nature 281, 544-548 [1979] og dannet plasmidet pHS32. Plasmidet pHS32 ble spaltet med Xbal, fenolekstrahert, kloroformekstrahert og etanolutfelt. Det ble deretter behandlet med 1 jai E. coli polymerase I, Klenow-fragment i 30 yul poly-merasepuffer (50 mM kaliumfosfat pH 7,4, 7mM MgC^/ 1 mM 3~merkaptoetanol) inneholdende 0,ImM dTTP og 0,ImM dCTP i 30 min. ved 0°C, deretter 2 timer ved 37°C. Denne behandlingen gir innfylling av 2 av de 4 hukleotider som er komplementære til den 5' utstikkende ende av■Xbal-spaltningsstedet:

2.nukleotider, dC og dT, ble innsatt og ga en ende med 2 5' utstikkende nukleotider. Denne linjære resten av plasmid pHS32 (etter fenol- og kloroformekstraksjon og gjenvinning i- vann etter etanolutf elling) ble spaltet med EcoRI. Det store plasmidfragmentet ble skilt ut fra det lille EcoRI-Xbal-fragmentet ved PAGE og isolert etter elektroeluering.. Dette DNA-fragmentet fra pHS32 (0,2 yug) ble ligert under lignende betingelser til det som er beskrevet ovenfor, til EcoRI-Taq I-fragmentet av tryptofanoperonet (~0,01 ^ig) , utledet fra pBRHtrp. I metoden for ligering av fragmentet fra pHS32 til EcoRI-Taql-fragmentet som ovenfor beskrevet ligeres den Taql-utstikkende ende til den Xbal gjenværende utstikkende ende selv om den ikke er fullstendig Watson-Crick base-paret:'

En del av denne ligeringsreaksjonsblandingen ble transform- ■ ert i E. coli 294 celler, varmébehandlet og satt på LB-plater inneholdende ampicillin. 24 kolonier ble utvalgt, dyrket i 3 ml LB-medier og plasmid isolert. 6 av disse ble funnet å ha Xbal-punkter regenerert gjennom E. coli katalysert DNA-reparasjon og replikasjon.

Disse plasmider ble også funnet å spaltes både med EcoRI og Hpal og gi de forventede restriksjonsfragmenter. Et plasmid kalt pTrpl4 ble brukt for ekspresjon av heterologe polypeptider som omtalt i det følgende.

Plasmidet. pHGH 107 (Goeddel et al., Nature 281, 544-548

[1979]) inneholder et gen for humant veksthormon oppbygget av 23 aminosyrekodoner fremstilt fra syntetiske DNA-fragmenter og 163 aminosyrekodoner erholdt fra komplementært DNA fremstilt gjennom revers transkripsjon av humant veksthormon budbringer RNA. Dette gen, selv om det mangler kodonene for "pre"-sekvensen til humant veksthormon, inneholder et ATG-translasjonspåbegynnelseskodon. Dette genet ble isolert fra 10 /ug pHGH 107 etter behandling med EcoRI etterfulgt av E. coli-polymerase I Klenow-fragment og dTTP og dATP som beskrevet ovenfor. Etter fenol- og kloroformekstraksjon og etanolutfelling ble plasmidet behandlet med BamHI.

Det humane veksthormon (HGH) geneholdige fragment ble isolert fra PAGE etterfulgt av elektroeluering. Det resulteren de DNA-fragment inneholder også de første 350 nukleotider fra det tetracyklinresistente strukturelle gen, men mangler tetracyklinpromotor-operator-systemet slik at'-ved etterfølg-ende kloning i et ekspresjonsplasmid, kan plasmidene som inneholder innsatsen lokaliseres ved restaurering av tetracyklinresistens. Fordi EcoRI-enden til fragmentet er fylt inn ved Klenow-polymerase I-metoden, har fragmentet bare en avvisende og en bindende ende som sikrer riktig orientering ved senere innsetning i et ekspresjonsplasmid.

Ekspresjonsplasmidet pTrpl4 ble deretter fremstilt til å motta det HGH geneholdige fragment fremstilt ovenfor. Således ble pTrpl4 Xbal-behandlet og de resulterende bindende ender fylt inn ved Klenow-polymerase I-fremgangsmåten som anvender dATP, dTTP, dGTP og dCTP. Etter fenol- og kloroformekstraksjon og etanolutfelling ble det resulterende DNA behandlet med BamHI og det resulterende store plasmidfrag-ment isolert ved PAGE og elektroeluering. pTrpl4-utledet fragment hadde en avvisende og en bindende ende, og tillot rekombinering i riktig orientering med HGH-genet som inneholdt det forut beskrevne fragment.

HGH-genfragmentet og pTRP14AXba-BamHI-fragmentet ble kombinert og ligert sammen under lignende betingelser til.de ovenfor beskrevne. De innsatte Xbal-og EcoRI-endene ligerte sammen ved avvisende endeligering under gjenskapning av både Xbal-og EcoRI-punktene:

Denne oppbygningen gjenskaper også tetracyklinresistensgenet. Da plasmidet pHGH 107 uttrykker tetracyklinresistens fra en promotor som ligger oppstrøms fra HGH-genet (lac-promotoren) muliggjør denne oppbygning kalt pHGH 207 ekspresjon av genet for tetracyklinresistens under kontroll av tryptofan-promo-:- tor-operatoren. Således ble ligeringsblandingen overført i E. coli 294 og kolonier utvalgt på LB plater inneholdende 5 yug/ml tetracyklin..

Plasmid pHGH 207 ble EcoRI-behandlet og det trp-promotor-holdige EcoRI-fragment gjenvunnet ved PAGE etterfulgt av elektroeluering. Plasmid pBRHl ble EcoRI-behandlet og de spaltede ender behandlet med bakteriell alkalisk fosfatase (BAP, 1/ag, i 50 mM Tris, pH 8, og 10 mM MgCl2i 30 min. ved 65°C) for å fjerne fosfatgruppene på de utstikkende EcoRI-ender. Overskudd av bakterielt alkalisk fosfatase ble fjernet ved fenolekstraksjon, kloroformekstraksjon og etanolutfelling. Det resulterende lineære DNA vil fordi det mangler fosfater på de utstikkende ender under ligering motta bare innsatser hvis komplementære bindende ender er fosforylerte men vil ikke i seg selv resirkulere, hvilket muliggjør lett-ere søkning etter plasmider som inneholder innsatsene.

EcoRI-fragmentet utledet fra pHGH 207 og det lineære DNA erholdt fra pBRHl ble kombinert i nærvær av T^-ligase som forut beskrevet og ligert.. En del av den resulterende blanding ble transformert i E. coli stamme 294 som forut beskrevet, satt på LB-medier inneholdende 5 yug/ml tetracyklin og de 12 tetracyklinresistente kolonier ble utvalgt. Plasmid ble. isolert fra hver koloni og undersøkt med hensyn til nærvær av en DNA-innsats ved restriksjonsendonuklease-analyse ved anvendelse av EcoRI og Xbal. Et plasmid inneholdende innsatsen ble kalt pHKYl.

Det ovenfor beskrevne plasmid pHKYlO er et derivat av pBR322 som inneholder et Bglll-punkt mellom tetracyklinresistans (Tc ) promotor og strukturelt gen. Det store DNA-fragment isolert etter behandling av pHKYlO med Pstl og BglH inneholder derfor deler, av ampicillinresistens (Ap R)-genet og

R R

hele det Tc strukturelle gen, men mangler Tc promotoren (fig. 6). Plasmidet pGH6 (Goeddel et al., Nature 281, 544-548 [1979]) ble behandlet' med EcoRI, de resulterende enkelt-båndender ble fylt inn med DNA-polymerase I, og plasmidet ble spaltet med Pstl. Det lille fragment, som inneholdt en

del av Ap R-genet, en dobbel lac-promotor og lac-ribosombind-ingspunktet, men manglet en ATG-initierlngstriplett ble isolert. Et lignende trp-promotorfragment som inneholdt trp-lederribosombindingspunktet, men manglet en ATG-sekvens (Goeddel et al., Nature 287, 411-416[1980]), kan isoleres fra pHKYl beskrevet ovenfor.

Det nettopp nevnte trp-fragment er en analog av E. coli tryptofan-operonet fra hvilket det såkalte trp-svekkingsledd er sløyfet (Miozzari et al., J. Bact. 133, 1457-1466 [1978]) for kontrollerbart å høyne ekspresjonsnivåer. Ekspresjons-plasmider inneholdende det modifiserte trp-regulon kan dyrk-es til forut bestemte nivåer, i næringsmedier som inneholder tilsatt tryptofan i tilstrekkelige mengder til å undertrykke promotor-operator-systemet, deretter befris for tryptofan for å oppheve undertrykkelsen av systemet og forårsake ekspresjon av det tilsiktede produkt.

Ekspresjonsplasmidene kan settes sammen gjennom 3 delliger-ingsreaksjoner som vist i fig. 6. 15 ng (0,05 pM) av det sammensatte FIF-gen (504 eller 505 bp) , 0,5 jug (0,2 pM) av det store Pstl - BglII-fragment av pHKYlO og 0,2 pg (0,3 pM) av det riktige promotorfragment ble ligert og blandingen brukt for å transformere E. coli 294 (Goeddel et al., Nature 287, 411-416 [1980]). Plasmid DNA ble fremstilt fra individuelle transformanter og analysert ved restriksjonskartlegg-hing. Korrekt kobling av det' sammensatte gen til promotor-fragmentet skulle restaurere EcoRI (lac) eller Xbal (trp) gjenkjenningssekvensene. Størstedelen av plasmidene ga de ventede restriksjonsenzymbehandlingsmønstere. Individuelle kloner (12 inneholdende trp-promotoren og 12 inneholdende lac-promotoren) ble dyrket og ekstraktet fremstilt for in-terf eronmåling som beskrevet ovenfor.

Ved måling på humant amnion (WISH) celler med hensyn til antivirusaktivitet ved CPE-inhibieringsmålingen var 5 av trp-transformantene positive (hver omtrent ekvivalent); 11 av lac-transformantene ga ekvivalente IF-aktiviteter. Derfor ble en transformant fra hver serie (pFlFlac9 og pFIFtrp69) utvalgt for videre studier (tabell 1). DNA-sekvensanalyse viste at den ønskede sammenknytning av promotor til FIF-strukturgen hadde funnet sted i begge tilfeller.

Celler ble dyrket og ekstrakter fremstilt som beskrevet ovenfor. Det humane amnion (WISH) cellelinje ble brukt for CPE-inhibieringsmålingen. Angitte aktiviteter er gjennomsnittet fra 3 uavhengige eksperimenter. For å bestemme antallet av IF-molekyler pr. celle ble en FIF spesifikk aktivitet på

4 x 10 8 enheter/mg brukt (Knight, ovenfor).

Mengdene av fibroblastinterferon produsert av pFIFlac9 og pFIFtrp69 er vist i tabell 1. trp-promotoren ga et FIF-ekspresjonsnivå målbart høyere enn lac-promotoren gjorde. I eti forsøk på å øke FIF-ekspresjonsnivåene ytterligere,

ble pFIFtrp69 spaltet med EcoRI og 2 300 basepar EcoRI-fragmenter inneholdende trp-promotoren (Goeddel et.al., Nature 287, 411-416 [1980]) ble satt inn. Det resulterende plasmid, pFIFtrp 369, inneholder 3 påfølgende trp-promotorer som leser mot FIF-genet. Mengden av FIF syntetisert av E. coli K-12 stamme 294/pFIF trp<3>69 er 4-5 ganger den som produseres av pEIFtrp69 (tabell 1). Dette skyldes åpenbart derepresjonen av trp-promotoren som opptrer når trp-repressornivåer titrer-es med de multiple kopier av trp-operatoren.

FIF som produseres av E. coli K-12 stamme 294/pFIFtrp69 opptrer som autentisk human FIF. Som vist i tabell 2 er dets antivirusaktivitet ca. 30 ganger større på menneskeceller enn på storfeceller. Dertil er det bakterielt fremstilte FIF stabilt overfor behandling ved pH 2 natten over og nøy-traliseres ikke av kanin-antihuman-leukocyttinterferon-antistoffer (tabell 3).

LelF og FIF var NIH standardløsninger med 20 000 enheter/ml og henholdsvis 10 000 enheter/ml. Målinger ble utført som beskrevet ovenfor.

Eksperimentelle fremgangsmåter beskrevet ovenfor. Målt med ■

CPE-inhibiering ved bruk av WISH celler/Sindbis-virus.

N. Rensing

Rensingsmetoden for bakterielt avledet fibroblastinterferon er som følger: 1. Frosne celler oppslemmes i 12 ganger volumet pr. vekt-enhet med sukrosespaltningspuffer (lOOmM Tris-HCl, 10 % suk-rose, 0,2M NaCl, 50mM EDTA, 0, 2mM PMSF [fenylmetylsulfonyl-klorid], pH 7,9) inneholdende lysozym i 1 mg/ml. Cellesus-pensjonen røres 1 time ved 4°C og sentrifugeres. Fibroblast-interferonaktivitet forblir i supernatanten. 2. Polyetylenimin (5 %, volum/volum) tilsettes til den ultralydbehandlede supernatant til en sluttkonsentrasjon på 0,5 % (volum/volum). Løsningen røres 1 time ved 4°C og sentrifugeres. Interferonaktivitet forblir i supernatanten. 3. Fast ammoniumsulfat settes til polyetyleniminsupernatan-ten til en sluttkonsentrasjon på 50 % metning, røres i 30 min. ved 4°C og sentrifugeres. Interferonaktivitet er i 50 % klumpen. 4. 50 % ammoniumsulfatklumpen oppslemmes i halvparten av volumet av 50 % ammoniumsulfatsuspensjonen med PBS (20 mM natriumfosfat, 0,15MNaCl, pH 7.4). Polyetylenglykol 6000 (50 %, vekt/volum, i PBS) tilsettes inntil en sluttkonsentrasjon på 12.5 % (volum/volum), røres ved 4°C i 2 timer og sentrifugeres. Interferonaktivitet er i klumpen. Klumpen oppslemmes i et minimalt volum av sukrosespaltningspuffer og bringes klar gjennom sentrifugering.

Denne første ekstraksjonsfremgangsmåten fører til en rens-ning av fibroblastinterferon fra 0,001 % av det totale protein til 0,05 % av det totale protein. Dette materialet kan videre renses frem til homogenitet ved de følgende kolon-nekromatografitrinn.

5. Affinitetskromatografi på Amicon Blue B i sukrosespaltningspuffer. 6. Anionbytterkromatografi på QAE Sephadex i sukrosespalt-ningspuf f er i fravær av 0.2M NaCl. 7. Størrelseseksklusjonskromatografi på Sephadex G-75 i sukrosespaltningspuffer.

8. Reversert fase-høytrykksvæske-kromatografi.

0. Parenteral administrering

FIF kan gis parenteralt til pasienter som krever antitumor-eller antivirusbehandling. Doseringer og doseringshastig-het kan være parallelt med det som brukes i kliniske under-søkelser av humanutledede materialer, f.eks. ca. (1-10) x 10^ enheter daglig, og i tilfellet materialer med høyere renhet enn 1 %, sannsynligvis opptil ca. 15 x 10 7 enheter daglig. Doser av bakterielt fremstilt FIF kunne økes betraktelig for større virkning på grunn av at andre humanproteiner enn FIF nesten ikke er tilstede, hvilke proteiner i fibroblastavledede materialer kan virke som pyrogener, som oppviser skadelige virkninger, f .eks. ubehag, temperaturstigning., osv.

Som et eksempel på en passende doseringsform for hovedsake-:,'"lig homogent bakterielt FIF i parenteral form, kan 3 mg FIF med spesifikk aktivitet på f.eks. 2 x 10 8 enheter/mg oppløses i 25 ml 5 % humanserumalbumin, løsningen føres gjennom et bakteriologisk filter og den filtrerte løsning oppdeles aseptisk i 100 flasker som hver inneholder 6 x 10^ enheter rent interferon egnet for parenteral administrering.Glassene lagres fortrinnsvis kaldt (-20°C) før bruk.

Forbindelsene ifølge foreligg.ende oppfinnelse kan formuler-es ifølge kjente metoder for å fremstille farmasøytisk' an-vendelige blandinger, hvorved polypeptidet herav kombineres i blanding med et farmasøytisk akseptablet bæremiddel. Egn-<!>ede bæremidler og deres formulering er beskrevet i Reming-ton's Pharmaceutical Sciences av E.W. Martin. Slike blandinger vil inneholde' en virksom mengde av interferonproteinet sammen med en passende mengde bæremiddel for å gi farmasøy-tisk akseptable blandinger som er egnet for effektiv administrering til verten. En foretrukket administreringsmetode

er den parenterale.

Claims

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av et polypeptid bestående av aminosyresekvensen til et fullstendig human-fibroblastinterferon uten noen tilsvarende forsekvenser eller deler derav, karakterisert ved at man bringer en mikroorganisme som er transformert med en gjentagbar mikrobiell ekspresjonsbærer som er i stand til å uttrykke dette polypeptidet til å vokse og uttrykke dette polypeptid og utvinne det.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at polypeptidet ikke følges av tilhørende glykosylering.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at polypeptidet eventuelt inneholder amino-syren metionin som den ordinære første aminosyre av fibro-blastinterf eronet .

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at polypeptidet eventuelt inneholder et spaltbart konjugat eller mikrobielt signalprotein knyttet til N-enden av den ordinære første aminosyre av fibroblast-interf eronet .

5. Fremgangsmåte ved fremstilling av mikroorganismer som kan produsere et polypeptid bestående av aminosyresekvensen til et fullstendig human-fibroblastinterferon uten følge av noen tilsvarende forsekvens eller del derav, karakterisert ved at man transformerer en mikroorganisme med en gjentagbar mikrobiell ekspresjonsbærer som kan uttrykke dette polypeptid og kultivere den transformerte mikroorganisme.

6. Fremgangsmåte ved fremstilling av en gjentagbar mikrobiell ekspres jonsbærer som i en transf ormant-mikroorganisme kan uttrykke et polypeptid bestående av aminosyresekvensen til et fullstendig human-fibroblastinterferon uten følge av noen tilsvarende forsekvens eller del derav, karakterisert ved at man oppbygger en første DNA-sekvens som koder dette polypeptid og opererbart knytter den første DNA-sekvens til en andre DNA-sekvens som kan utøve mikrobiell ekspresjon av den første DNA-sekvens.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at den andre DNA-sekvens består av en multippel trp-promotor-operator.

8. Fremgangsmåte ved fremstilling av farmasøytiske blandinger inneholdende et mikrobielt fremstilt polypeptid bestående av aminosyresekvensen til et fullstendig human- fibroblastinterferon uten følge av noen tilsvarende forsekvens eller del derav, karakterisert ved at man blander dette polypeptid med ikke-toksiske, inerte, terapeutisk fordragelige bæremidler og bringer den resulterende blanding i en egnet farmasøytisk doseringsform.

9. Farmasøytisk blanding karakterisert ved at den inneholder et mikrobielt fremstilt polypeptid bestående av aminosyresekvensen tilet fullstendig human-fibroblastinterferon uten følge av noen tilsvarende forsekvens eller del derav og et ikke-toksisk, inert, terapeutisk fordragelig bæremateriale.

10.F remgangsmåter ved fremstilling av polypeptider, gjen-tagbare mikrobielle ekspresjonsbærere og mikroorganismer som forut beskrevet.

11. DNA-sekvens karakterisert ved at den består av en sekvens som koder aminosyresekvensen til et. fullstendig human-fibroblastinterferon uten følge av noen tilsvarende forsekvens eller del derav.

12. DNA-sekvens karakterisert ved at den består av en sekvens som koder for aminosyresekvensen til et fullstendig human-fibroblastinterferon idet aminosyr- en metionin eventuelt er den første ordinære aminosyre i dette interferon.

13. DNA-sekvens karakterisert ved at den består av en sekvens som koder for aminosyresekvensen til et fullstendig human-fibroblastinterferon samt aminosyresekvensen til et spaltbart konjugat eller mikrobielt signalprotein knyttet til N-enden til den ordinære første aminosyre i dette interferon.

14. DNA-sekvens ifølge kravene 11-13, karakterisert ved at den er operabelt knyttet til en DNA-sekvens som er i stand til å utføre mikrobiell ekspresjon av det innkodede polypeptid.

15. Gjentagbar mikrobiell ekspresjonsbærer, karakterisert ved at den er i stand til i en transformant mikroorganisme å uttrykke et polypeptid kodet av en DNA-sekvens ifølge kravene 11 - 14.

16. Ekspresjonsbærer ifølge krav 15, karakterisert ved at det er et plasmid.

17. Plasmid karakterisert ved at det er valgt fra gruppen pFIFlac9, pFIFtrp69 og pFIFtrp <3> 69.

18. Mikroorganisme transformert med en ekspresjonsbærer ifølge kravene 15 -17.

19. Mikroorganisme ifølge krav 18, karakterisert ved at den fremstilles ved å transformere en E. coli stamme.

20. Transformert mikroorganisme ifølge krav 19, . karakterisert ved at E. coli stammen er E. coli K-12 stamme 294.

21. Transformert mikroorganisme ifølge krav 18, karakterisert ved at den erholdes ved å transformere Bacillus subtilis.

22. Transformert mikroorganisme ifølge krav 18, karakterisert ved at den erholdes ved å transformere Saccharomyces cerevisiae.