NO810986L - Bakteriell polypeptid-ekspresjon under anvendelse av tryptofon-promoter-operator - Google Patents

Description

Ved innføringen av rekombinant DNA-teknologi er det blitt mulig å få en kontrollert materiell produksjon av en rekke forskjellige verdifulle polypeptider. Det finnes alle-, rede bakterier som er modifisert ved hjelp åv denne teknologi til at de produserer polypeptidprodukter så som somatostatin (K. Italura et al., Science 198, 1056 (1977)), (komponent)

A og B -kjedene i det humane insulin (D.V.Goeddel et al.,

Proe Nat' Acad Sei, USA 76, 106 (1979)), og det humane vekst-hormon (D.V. Goeddel et al., Natur 281, 544 (1979)). I den senere tid har rekombinant DNA-teknikk vært brukt for å få en bakteriell produksjon av tymosin alfa 1, en immunfrembringende forbindelse som fremstilles av tymuskjertelen (US-patent-søknad innsendt av Robert Crea og Ronald Wetzel den 28 februar 1980). Denne teknologi er nå så godt utviklet at man kan fremstille et nesten hvert ønsket polypeptid ved hjelp av bakterier, og nevnte teknikk kan brukes for kontrollert fremstilling av hormoner, enzymer, antistoffer og vaksiner mot en rekke forskjellige sykdommer. De ovennenvte artikler er kun ment som referanser og for å illustrere oppfinnelsens bakgrunn.

Den strukturelle enhet som har gjort den rekombinante DNA-teknologi mulig, er plasmiden, en ikke-kromosomal sløyfe

av dobbelttrådet DNA som finnes i bakterier, ofte i flere ko-pier pr. bakteriecelle. I den informasjon som er kodet inn i nevnte plasmid-DNA, er det som er nødvendig for å reprodu-sere plasmiden i en datter-celle (dvs. en "replikon"), og mer vanlig en eller flere såkalte seleksjonskarakterer, dvs. mot-stand mot antibiotika, og dette muliggjør kloning av vert-cellen som inneholder den plasmid man er interessert i, og som gjør at vert-cellen kan gjenkjennes å dyrket i et selek-tivt medium. Bakterieplasmidenes anvendbarhet bygger på det . faktum at de spesikt kan spaltes fra hverandre ved hjelp av restriksjonsendonuclease eller "restriksjons-enzymer", som hver for seg igjenkjenner forskjellige posisjoner langs det plasmidiske DNA. Deretter kan heterologe gener eller genefragmenter innsettes i plasmiden ved at de forbindes med de avspaltede ender eller plasseres på rekonstruerte ender nær spaltningsposisjonen. Med begrepet "heterologt" forstås et

gen som vanligvis ikke finnes i E-coli eller en polypeptid-sekvens som vanligvis ikke produseres av E-coli, mens begrepet "homologt" refererer seg til et gen eller et polypeptid som fremstilles i E-coli av vill-typen. DNA-rekombinasjonen ut-føres utenfor bakterien, men den resulterende "rekombinant"-plasmid kan føres inn i bakterien ved hjelp av en fremgangsmåte som vanligvis kalles transformasjon, hvorved man ved å dyrke bakterien kan få fremstilt store mengder av den rekombinante plasmid som inneholder de heterologe gener. Videre er det slik at når genet er passende innsatt med hensyn til de deler av plasmiden som styrer transkripsjonen og oversettelsen av det innkodede DNA-budskap, så kan man bruke plasmiden til å produsere den polypeptid-sekvens som genet koder for, en fremgangsmåte som betegnes "ekspresjon".

Nevnte ekspresjon starter i et område som ofte kalles promotoren, som gjenkjennes av å bindes av RNA-polymerase. I noen tilfeller, som f.eks. i den trp operon som er nevnt nedenfor, så vil promotorområdene være overlappet av "operator"-områder, slik at man får en kombinert promotor-operator. Operatorene er DNA-sekvenser som gjenkjennes av såkalte repressor proteiner, og disse regulerer hvor mange ganger transkripsjonen starter i en spesiell promotor. Polymerasen vandrer langs nevnte DNA, transkriberer den i en formasjon som forefinnes i den koden tråden fra dets 5' til 3' ende over i messenger RNA for så igjen å oversettes til et polypeptid som har den aminosyresekvens som er kodet inn i nevnte DNA. Hver aminosyre er innkodet ved hjelp av en enestående nucleotidtripplet eller "codon", som i den foreliggende beskrivelse ofte er betegnet som "det strukturelle gen", dvs. den del som utkoder aminosyresekvensen i det frem-stilte produkt. Etter at RNA-polymerasen er bundet til promotoren, så vil det først transkribere nukleotider som koder en ribosonbindingsposisjon, deretter et oversettelses-"start"-signal, (vanligvis ATG, som i det resulterende messenger RNA blir AUG), deretter nucleotidkodonet inne i selve det strukturelle gen. Såkalte stoppkodiner transkriberes på slutten av det strukturelle gen, hvoretter polymerasen danner en ny sekvens av messenger RNA, som på grunn av nærværet av nevnte stopp-signal, vil forbli uoversatt en ribosomene. Ribosomene binder seg til den bindingsposisjon som er tilveiebragt på nevnte messenger RNA, i bakterier vanligvis samtidig' som mRNA blir dannet, og de vil i seg selv produsere det innpodede polypeptid, idet det binder ved oversettelses-start-signalet og slutter ved det tidligere nevnte stoppsignal. Man får fremstilt det forønskede produkt hvis de sekvenser som koder ribosombindings-posisjonen er passende plassert med hensyn til nevnte AUG initiator-kodon, og hvis alle de gjenværende kodoner følger initiator-kodonet i fase. Det resulterende produkt kan oppnås ved å oppløse verts-cellen og innvinne produktet ved at man anvender passende rensningsteknikk.

Polypeptider som er fremstilt ved hjelp av rekombinant DNA teknologi kan være helt ut.heterologe, noe som er tilfelle i en direkte produksjon eller ekspresjon av det men-neskelige veksthormon, eller det kan alternativt bestå av et heterologt polypeptid som i det minste er tilfestet en aminosyresekvens av et homologt peptid, noe som f.eks. er tilfelle ved produksjonen av mellomprodukter for somatostatin og nevnte komponenter i det humane insulin. I det sistnevnte tilfelle vil feks. det sammensatte homologe polypeptid bestå delvis av aminosyresekvensen for beta galaktosidase. I slike tilfeller vil det bioaktive produkt være inaktivert ved hjelp av det tilfestede homologe polypeptid inntil dette avspaltes i et annet miljø. Tilfestede proteiner av den type som er nevnt ovenfor, kan utformes slik at man får et meget spesifik av-spaltning av forløperproteinet slik at man får fremstilt det forønskede produkt, f.eks. ved at man lar cyanogenbromid virke på metionin, eller man kan alternativt bruke enzyma-tisk spaltning. Se f.eks. G.B.-patent nr, 2.007.676 A.

Hvis rekombinant DNA-teknologi skal få full praktisk anvendelse, så må man utvikle systemer som gir optimal uttrykning av de innsatte gener, slik at de påtenkte polypeptidprodukter kan fremstilles i høyt utbytte. De beta-laktamase og laktose-promotor-operatorsystemer som tidligere har vært brukt, har ikke vært fullt ut tilfreddsstillende på dette punkt. Det har således vært et behov for en bakteriell plasmid som er i stand til å gi en kontrollert uttrykning av de forønskede polypeptidprodukter i høyt utbytte.

Tryptofan er aminosyre som fremstilles av bakterier og som brukes som en del i de homologe polypeptider som man finner i den biosyntetiske syntesevei som går på følgende måte: Chorisminsyre antranilinsyre > fosforibosylantra-nilinsyre > CDRP [enol-1-(o-karboksyfenylamino)-1-desoksy-D-ribulose-5-fosfat] > indol-3-glycerol-fosfat, og til slutt til selve tryptofanet. De enzymatiske reaksjoner langs denne syntesevei katalyseres av produktene fra et tryptofan eller "trp" operon, et polycistronisk DNA segment som transkriberes under styring av et rtg promotor-operator-system. Det resulterende polycistroniske messenger RNA innkoder den såkalte rtg-ledersekvens, og deretter.de polypeptider som betegnes trp E, trp D, trp C, trp B og trgp A. Disse polypeptider katalyserer og regulerer individuelle trinn i nevnte biosyntesevei fra chorisminsyre til tryptofan.

I villtypen av E-coli er nevnte tryptofan-operon under minst 3 forskjellige typer av kontroll. I . forbindelse med promotor-operator represjon, så virker tryptofan som en korepressor og binder seg til sin aprorepressor og danner et aktivt repressorkompleks som binder operatoren, og derved lukker hele synteseveien. Den annen form for kontroll er en fremgangsmåte hvor man har en tilbakeføringsinnhibering, og her binder tryptofan et kompleks i nevnte rtp E og trp D-polypeptidene, hvorved man hindrer deres medvirkning i syntesen. Den tredje form for kontroll skjer ved hjelp av en fremgangsmåte som ofte kalles svekking, under kontroll av det såkalte "svekkende område" på genet, et område som ligger innenfor nevnte trp-ledersekvens. Se G.G.Miozzari et al.,

J. Bacteriologi 133, 1457 (1978): The Operon 263-302, Cold Sprind Harbor Lab. (1978), Miller og Reznikoff, red.: F. Lee et al., Proe. Nat. Acad. Sei. USA 74, 4365 (1977) og K. Bert-rand et al., J. Mol. Biol. 103, 319 (1967). Graden av svekking synes å være styrt av den intracellulære konsentrasjonen av tryptofan, og i villtypen av E-coli synes nevnte svekking å avslutte uttrykningen i ca. 9 av 10 tilfeller, antagelig gjennom dannelsen av en sekundær struktur, eller en såkalt "avslutningssløyfe", i messenger RNA som gjør at RNA polymerasen for tidlig avspaltes fra det tilknyttede DNA.

Andre undersøkelser har anvendt nevnte trp operon

for å få en viss heterolog polypeptiduttrykning. Disse under-søkelser antar man er kommet i stand på grunn av problemer i forbindelse med represjon og svekking ved en tilsetning av indol akrylsyre, en såkalt induseringsforbindelse og analog som konkurrerer med tryptofan for trp-repressormolekyler, og som derved gir en derepresjon på grunn av konkurrerende inhi-bering. Samtidig vil nevnte forbindelse nedsette svekkingen ved at man hemmer den enzymatiske omdannelsen av indol til tryptofan, hvoretter cellen etterhvert vil bli tømt for tryptofan. Som et resultat av dette, vil mer polymerase bli av-lest igjennom nevnte svekkende område på genet. Denne fremgangsmåten er imidlertid problematisk på grunn av at man ikke får en fullstendig og konsistent oversettelse ettersom den tryptofan-holdige proteinsekvensen blir avsluttet for tidlig under syntesen, noe som skyldes mangel på anvendbart tryptofan. Hvis man skal få en effektiv opphevning av nevnte svekking ved hjelp av denne fremgangsmåten, så er man fullstendig avhengig av at det skjer en kraftig utsultning av tryptofan i cellen.

I foreliggende oppfinnelse er problemer i forbindelse med tryptofan-represjon og svekking angrepet på en annen måte, og oppfinnelsen tilveiebringer (1) en fremgangsmåte for fremstilling av en uttrykningsplasmid som er utformet for en direkte uttrykning av heterologe gener fra trp promotor-operatoren, (2) en fremgangsmåte for fremstilling av plasmider som er utformet for uttrykning, fra tryptofan operator-promotor, av spesifikt avspaltbare polypeptider som er kodet ved hjelp av homologe-heterologe genesammensetninger, og (3) en fremgangsmåte for å uttrykke heterologe polypeptider på en kontrollerbar og effektiv måte med høyt utbytte.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer nye plasmidiske uttrykningsstrukturer slik at man .i bakterier kan frem stille heterologe polypeptidprodukter, og hvor nevnte struk-turer har en sekvens av dobbelttrådet DNA som innbefatter en trp promotor-operator som i fase fra en første 5' til en annen 3' ende av den kodende tråden inneholder nucleotider' som utkoder den trp-ledende ribosom-bindings-posisjonen, samt nucleotider som innkoder oversettelsen av starten for uttrykning av et strukturelt gen som innkoder aminosyresekvensen i det heterologe polypeptid. Den angitte DNA-sekvens inneholder hverken et rtp-svekkende område eller nucleotider som innkoder for den trp E ribosombindende posisjonen. Snarere tvert imot så brukes den trp-ledende ribosomsbindingsposisjonen effektivt for å frembringe en uttrykning av den informasjon som finnes

i det innsatte gen.

Celler blir omdannet ved tilsetning av trp promotor-operatorholdige plasmider som mangler nevnte svekkende områder, og nevnte celler dyrkes opp i nærvær av tilsatt tryptofan. Bruken av et tryptofanrikt medium gjør at man får tilveiebragt tilsetrekkelig tryptofan til at man i alt vesentlig fullstendig undertrykker trp promotor-operatoren igjennom trp og undertryk-kerreaksjoner, slik at celleveksten kan skje uhemmet av en for tidlig uttrykning av store mengder av det heterologe polypeptid som er innkodet, noe som ellers ville skje under en kontroll av trp promotor-operatorsystemet. Når den rekombinante kulturen er dyrket frem til et nivå som er passende for industriell produksjon av polypeptidet, så fjerner man på den annen side den ytre tryptofan-kilden hvorved cellen bare vil være avhengig av det tryptofan den selv kan produsere. Resultatet er en svakt tryptofanbegrensning, og følgelig så vil undertrykningen av synteseveien bli opphevet og man får en meget effektiv uttrykning av de heterologe gener, og dette vil skje uhindret av en svekning, fordi det såkalte svekkende område er borte fra systemet. På denne måten så vil cellene aldri være i særlig stort underskudd på tryptofan, og alle proteiner enten de inneholder tryptofan eller ikke, kan fremstilles i vesentlig utbytte.

Oppfinnelsen tilveiebringer videre anordninger for å spalte den dobbelttrådede DNA på ethvert ønskelig punkt, selv når man ikke har en posisjon for et begrensende enzym, og denne teknikk kan bl.a. brukes for å danne trp operoner som mangler svekkende områder som er forskjellig fra det man tidligere oppnådde ved hjelp av valg av mutanter.

Endelig tilveiebringer oppfinnelsen en rekke bruk-bare mellomprodukter og sluttprodukter, da spesielt spaltbare heterologe-homologe sammensetningsproteiner som er stabile mot nedbrytning under de betingelser som hersker under uttrykningen.

De ovennevnte hensikter og fordeler ved oppfinnelsen vil fremgå av den etterfølgende detaljerte beskrivelse, og de. vedlagte tegninger hvor: Fig. 1 og 2 illustrerer et foretrukket skjema for danning av plasmider som er i stand til å uttrykke heterologe gener som sammensmeltninger med endel av trp D polypeptidet, og hvorfra nevnte gener siden kan avspaltes; Fig. 3 er resultatet av en polyakrylgensegregering av celleprotein inneholdende homologe (trp D')-heterologe (somatostatin eller tymosin a 1) sammensatte proteiner; Fig. 4, 5 og 6 illustrerer suksessive trinn i et foretrukket skjema for dannelsen av et plasmid som er i stand til direkte å uttrykke et heterologt gen (humant veksthormon) under kontroll av nevnte trp promotor-operator-system; Fig. 7 er resultatet av en polyakrylamidgel-segre-gering av celleprotein inneholdende humant vekst-hormon direkte uttrykt under kontroll av nevnte trp promotor-operator-system; Fig. 8 og 9 ( a-b) og 10 illustrerer suksessive trinn i et foretrukket skjema for dannelse av plasmider som er i stand til å uttrykke heterologe gener (i det illustrerte tilfelle somatostatin) ved en sammenset-ning med en del av trp E polypeptidet, og hvor nevnte heterologe gen siden kan avspaltes; Fig. 11 er et resultat av en polyakrylamidgel-segre-

gering av celleprotein inneholdende homologe (trp E)-heterologe sammensatte proteiner for fremstilling henholdsvis av somatostatin, tymosin, alfa 1, humant proinsulin og A og B-kjedene i humant insulin;

Fig. 12 og 13 illustrerer suksessive trinn hvorved plasmiden som er dannet ved det skjema som er angitt på fig. 8-10 kan manipuleres slik at man får et system hvor andre heterologe gener kan uttrykkes som sammensetninger med trp E polypeptid-sekvenser.

Av illustrasjonsmessige årsaker har man på figurene . bare angitt den kodende tråden i det dobbelt-trådede plasmidiske og lineære DNA. Antibiotika-resistente innkodende gener er angitt ap<R>(ampicillin) og tc<R>(tetracyklin). Symbolet tc^ angir et gen for tetracyklinresistens som ikke er under kontroll av et promotor-operator-system, og at plasmider som inneholder dette gen ikke desto mindre vil være tetracyklin-følsomt. Symbolet "ap betegner en ampicillin-følsomhet som er et resultat av at man fra endel av genet har utelatt den del som innkoder ampiccilin-følsomhet. Plasmidiske promotorer og operatorer er betegnet "p" og "o". Bokstavene A, T, G og C henhodsvis betegner nukleotider inneholdende basene adenin, tymin, guanin og cytosin. Andre figurfor klar inger fremgår av teksten.

De foretrukne utførelser av oppfinnelsen som er beskrevet nedenfor, innbefatter at man bruker en rekke vanlige tilgjengelige begrensende endonucleaser som er identifisert i det etterfølgende, og deres tilsvarende gjenkjennelses-sekvenser og (angitt ved hjelp av en pil) spaltningsmønstere:

I de tilfeller hvor spaltningspunktene befinner seg

i en viss avstand fra hverandre på de respektive trådene, så vil de avspaltede ender være såkalte "klebrige", dvs. at de er i stand til å feste seg på nytt eller feste seg til andre komplementære "klebrige" DNA-melekyler ved hjelp av Watson-Crick base modellen (A til T og G til C) på en måte som ofte betegnes "han og hun"-tapping. Noen av de begrensende enzym-ene så som Hpal og PvuII spaltes slik at man får såkalte "avrundede"-ender. De ovenfor angitte nucleotid-sekvenser er angitt på en vanlig konvensjonell måte, og den øvre tråden er den proteinkodende tråd, og når man går fra venstre til høyre på denne tråden så beveger man seg fra nevnte 5' til nevnte 3' ende, dvs. i transkripsjonsretningen fra et "proximalt" mot et "distalt" punkt.

I overensstemmelse med vanlige konvensjoner betegner symbolet "A" en utelukkelse. Når man f.eks. refererer til en plasmid fulgt av f.eks. "AEcoRI-Xbal" så beskrver dette en plasmid hvor nucleotidsekvensene mellom Ecorl og Xbal posisjonene for det begrensende enzym er blitt fjernet ved hjelp av disse enzymer. Av hensiktsmessighetsgrunner er visse ute-lukkelser angitt ved hjelp av tall. Hvis man således begynner på det første baseparet "bp" i nevnte Ecorl i igjenkjennelses-posisjon, som ligger foran genet for tetracyklinresistens i foreldreplasmiden pBR322, "Al" betegne en utelukkelse av bpl-30, (dvs. AEcoRI-Hind III), hvorved man utelukker tetracyklin promotor-operator-systemet; og "A2" betegner en utelukkelse av bp 1-375 (dvs. AEcoRI-BamHI) hvorved man både fjerner tetracyklin promotor-operator-systemet og det strukturelle gen som innkoder tetracyklin-resistens; og "A3" betegner en utelukkelse av bp 3611-4359 (dvs. APstl-EcoRI) og eliminasjon av ampicclin-resistens. "A4" brukes for å betegne fjerning av bp~900 -~1500 fra trp operon fragment 5_ fig. 1), hvorved man eliminerer det strukturelle gen for trp D polypeptidet.

trp-leder sekvensen utgjøres, av baseparene. ("bp") 1-162, som starter fra startpunktet for trp mRNA. Et fjorten-aminosyre antatt trp-leder-polypeptid innkodes av bp 27-71 fulgt av ATG nukleotidene som innkoder oversettelses-startsignalet. Det trp-undertrykkende området består av suksessive GC-rike og AT-rike sekvenser som ligger mellom bp 114 og 156, og undertrykkingen utføres tilsynelatende på mRNA nukleotidene som er innkodet av bp~134-141 i leder-sekvensen. For å få uttrykt et heterologt polypeptid under styring av trp leder ribosombindingsposisjonen, og på samme tid unngå en undertrykking, må man observere følgende kri-terier:

1. Baseparene 134-141 eller utenfor må stryket ut; 2. ATG-codonet i det innsatte gen må være plassert i korrekt forhold til ribosom-bindingsposisjonen, noe som er kjent (se f.eks. J.A.Steitz "Genetic signals an nucleotide sequences in messenger RNA" i "Biological Regulation and Control (ed. R. Gold-berger" Plenum press, New York, 1978. 3. Når man ønsker å fremstille et homologt-heterologt sammensatt protein, så må oversettelsessignalét for en homolog polypeptid-sekvens være tilgjengelig,

og kodonene for den homologe delen av det sammensatte proteinet må innsettes i fase uten avbrytende oversettelses-stoppsignaler.

Hvis man f.eks. stryker ut alle baseparene innen leder sekvensen som er distalt i forhold til bp. 70, så vil man-fjerne det undertrykkende området, hvorved man vil ha igjen ATG-sekvensen som innkoder oversettelses-startsignalet, og man vil få eliminert de avbrytende oversettelses-stopp-signalene som er innkodet av TCA (bp. 69-71), ved at man eliminrerer A og følgende nucleotider. En slik utstrykning vil resultere i en uttrykning av et sammensatt protein som begynner med leder-polypeptidet og ender med det som er inn kodet av de heterologe innsetninger, og det vil videre innbefatte et distalt området fra et av de trp operon-polypeptider ■ som ligger etter lederen, og som bestemmes at graden av utstrykning i 3' retningen. Hvis en utstrykning således fort-setter inn i E-genet, så ville dette føre til en uttrykning av en homolog forløper som består av L-sekvensen og det distale området i E (utover utstrykningsendepunktet), festet til den sekvens som innkodes av eventuelle etterfølgende innsetninger etc.

To spesielt anvendbare plasmider hvor det undertrykkende området er utstrøket, er plasmidene GMl og GM3, G.F. Miozzari et al., J. Bacteriology 133, 1457 (1978). Disse har henholdsvis utstrykningene trp ALE 1413 og trp ALE 1417 og uttrykker (under kontroll av trp p.romotor-operatoren) et polypeptid som består av omtrent de første seks aminosyrene i trp-lederen og det distale området av E-polypeptidet. I det mest foretrukkede tilfellet, nemlig pCMl, så vil bare den siste 3.del av E-polypeptidet bli uttrykt, mens pGMl uttrykker nesten den distale halvpart av E-polypeptid-kodonene. E. coli K-12-rasen W3110 tna 2~trp~A102 som inneholder pGMl er inn-levert til American Type Culture Collection (tilvekstnr. nr. 31622). pGMl kan hensiktsmessig fjernes fra rasen og brukes i fremgangsmåter som er beskrevet nedenfor.

Alternativt kan utstrykningene utføres ved hjelp av anordninger som tilveiebringes av foreliggende oppfinnelse, hvor man spesielt spalter dobbelttrådet DNA på ethvert ønskelig punkt. Et eksempel på denne spaltningsteknikk er beskrevet i del 4 i den etterfølgende eksperimentelle del. Dobbelt-trådet DNA blir således omdannet til enkelttrådet DNA i det området som omgir det påtenkte spaltningspunkt, noe som skjer ved en reaksjon med lamda-exonuclease. En syntetisk eller annen enkelttrådet DNA-primer blir så hybridisert på den tidligere dannede enkelttråd-lengden, noe som skjer ved hjelp av Watson-Crick base-parene, og primer-sekvensen er slik at man sikrer at 5' enden vil ha sin avslutning på samme sted som nucleotidene i første tråd, dvs. like før det påtenkte spaltningspunkt. Primer blir så forlenget i 3' retningen ved at den reageres med DNA-polymerase, hvorved man gjenskaper den del av den opprinnelige dobbelttrådede DNA som forefantes før spaltningen og som ble tapt i første trinn. Samtidig eller deretter blir den del av den første tråden som' gikk ut over det påtenkte spaltningspunktet oppløst eller fjernet på annen måte. Denne fremgangsmåte er vist nedenfor, hvor "v" markerer det påtenkte spaltningspunkt:

I den mest foretrukne utførelsen blir trinnene d og e utført samtidig idet man bruker en polymerase som samtidig nedbryter den fremstikkende enkelttråd-enden i 3<*>> 5' retningen og forlenger primeren ( i et nærvær av dATP, dGTP, dTTP og dCTP) i 5' > 3' retningen. Det enzym som er foretrukket for dette formål er Klenow-polymerase I, dvs. et fragment som oppnås ved proteolyttisk spaltning av DNA-polymerase I som inneholder den 5' > 3' polymer iserende aktiviteten og den 3' > 5' eksonucleolyttiske aktiviteten fra foreldre-enzymet, men mangler 5' > 3' endonucleolyttisk aktivitet. ;Se A. Kornberg, DNA Synthesis, 98, W.H.Freeman and Co., SFO ;(1974). ;Ved å bruke fremgangsmåten som er beskrevet ovenfor, kan man utføre utstrykninger av undertrykkende områder på enhver ønskelig måte i en trp-operon-holdig plasmid som først er gjort lineær, f.eks. ved spaltning ved en restrik-sjonsposisjon som ligger nedenfor det punkt hvor molekylet skal ha en stump ende ("v" ovenfor). En resirkuler ing etter en utstrykning av det undertrykkende området kan således ut-føres ved at man utfører en såkalt ombinding av den stumpe enden, eller på annen måte som i seg selv er kjent. ;Skjønt oppfinnelsen innbefatter direkte uttrykning av heterologe polypeptider under styring av en trp-promotor-operator, så vil foretrukne tilfeller også innbefatte uttrykning av sammensatte proteiner som både inneholder homologe og heterologe sekvenser, og hvor sistnevnte er spesielt avspaltbare fra førstnevnte i ekstracellulære omgivelser. Spesielt foretrukne er sammensatte proteiner hvor den homologe delen består av en eller flere aminosyrer av trp-leder-polypeptidet, og ca. 1/3 eller mer av trp E aminosyre-sekvensen (den distale ende) . Sammensatte proteiner av denne type er bemerkelsesverdig stabile overfor nedbrytning under uttrykning sbe tinge Ise r . ;Bakterien E. coli K-12 rase W3110 tna 2"trp~Ai02 (pGMl), ATCC nr. 31622, kan brukes for å øke mengden av den pGMl plasmid som fortrinnsvis brukes for å konstruere trp-promotor-operator—systemet som mangler undertrykkende områder ifølge foreliggende oppfinnelse. Denne rasen er fenotypisk trp<+>i nærvær av antranilat og kan dyrkes i minimale media så som LB tilsatt ca 50 ug/ml antranilat.- ;Alle de.bakterie-raser som brukes i den trp promotor-operator-styrte uttrykning ifølge foreliggende oppfinnelse er trp repressor<+>("trp R<+>"), noe som er tilfelle også med vill-typen av E.coli, noe som er gjort for å sikre en represjon inntil man ønsker en heterolog uttrykning. ;DNA rekombinasjonen i den foretrukne utførelse ut-føres i E. coli K-12 rasen 294 (ende A, thi , hsr , hsm£), ATCC nr. 31446, idet dette er en bakterierase som har slike membranegenskaper at det letter transformasjoner. Heterologe polypeptid-produserende plasmider som dyrkes i rase 294 kan hensiktsmessig ekstraheres og holdes i oppløsning (f.eks. ;10 mM tris, ImM EDTA, pH 8) fra -20° til ca. +4°C. For uttrykning under industrielle betingelser foretrekker man på den annen side en mer herdig rase, dvs. E. coli K-12 A F RV-308 str<r>, gal 308~ ATCC nr. 31608. RV 308 er næringsmessig en vill-type og gror meget godt i minimale media, og synte-tiserer alle nødvendige makromolekyler fra vanlige blandinger av ammonium, fosfat og magnesiumsalter, samt spormetaller og glukose. Etter transformasjon av RV 308-kulturen med den rase 294-avledede plasmid, utstrykes kulturen på media som er selektive for en markør (så som en antibiotikaresistens) som bæres av plasmiden, og en transformantkoloni plukkes ut og dyrkes i kolbekultur. Porsjoner av sistnevnte i 10% ;DMSO eller glycerol-oppløsning (i sterile Wheaton ampuller) kan så fryses i et etanol-tørris-bad og fryses ved -80°. ;For å produsere det innkodede heterolog polypeptid, kan kulturprøvene dyrkes i media som inneholder tryptofan slik at man får en undertrykking av trp promotor-operatoren, hvoretter man fjerner tryptofan fra systemet når man ønsker uttrykning. ;For det første veksttrinn kan man f.eks. anvende;LB medium (J.H.Miller, Experiments in Molecular Genetics, 433, Cold Spring Harbor Laboratory 1972) som pr. liter vann-dig oppløsning inneholder 10 g. Bacto trypton, 5 g. Bactp-gjørekstrakt, og 10 g NaCl. Inokuleringsmiddelet bør fortrinnsvis dyrkes til en optisk tetthet ("o.d.") på 10 eller mer (ved 550 nM), mer foretrukket til en o.d. på 20 eller mer, mest foretrukket til en o.d. på 30 eller mer, skjønt til mindre enn den stasjonære fase. ;For derepresjon og uttrykning dyrkes deretter ino-kuler ingsmiddele t under tilstander hvor man tapper cellen for tilsatt tryptofan. Et passende media for dette formål er M9 (J.H.Miller, supra ved 431) som kan fremstilles på følgende måte pr. liter: ; Dette medium autoklaveres, hvoretter man tilsetter: ; eller DIFCA cas.aminosyrere 40 ug/ml. ;Aminosyretilsetningen er et tryptofan-manglende syrehydrolysat av kasein. ;For å begynne uttrykning av det heterologe polypeptid så kan inokuleringsmiddelet som har vært dyrket i et tryptofanrikt medium, f.eks. fortynnes til et større volum med medium som inneholder intet tilsatt tryptofan (f.eks. en fortynning på.fra 2-10 ganger), og deretter dyrkes opp til et forønsket nivå (fortrinnsvis like under stasjonær vekstfase), hvoretter det forønskede produkt kan oppnås ved oppløsning, sentrifugering og rensning. I dette vekststa-dium bær cellene fortrinnsvis dyrkes til en optisk tetthet på 10, fortrinnsvis over 20, og mest .fortrinnsvis til eller ut over optisk tetthet på 30 (alle verdier målt ved 550nM) før man innvinner produktet. ;Alle de DNA-rekombineringseksperimenter som er beskrevet i den etterfølgende eksperimentelle del, ble ut-ført ved Genetech Inc. i overensstemmelse med de retnings-linjer for rekombinante DNA- undersøkelser som er fastlagt av the National Institute. ;I. Uttrykning av D- polypep. tidsammensatt protein.;En foretrukket fremgangsmåte for uttrykning av sammensatte proteiner som innbefatter de forønskede polypeptider og festet til disse en del av den aminosyre-sekvens i trp D-polypeptidet som lar seg separere in vitro ved hjelp av en metionin-aminosyre som er spesifikt sensitiv overfor NBr-spaltning, er beskrevet med henvisning til fig. 1-3. ;A. Konstruksjon av pBHRtrp.;Plasmid pGMl (1, fig. 1) bærer E- coli-tryptofan- operonet inneholdende utstrykningen LE1413 (G.F.Miozzari et al., (1978) J. Bacteriology 1457-1466) og uttrykker følge-lig et sammensatt protein bestående av de første 6 aminosyrene i trp-lederen og ca. den siste 3-del av trp E-polypeptidet (i det etterfølgende betegnet som LE'), såvel som trp D-polypeptidet i sin helhet, alle under kontroll av trp promotor-operator-systemet. Plasmidet som veide 20 yg, ble oppløst ved hjelp av begrensende enzym PvuII som spalter plasmidet på 5 punkter. Genefragmentene 2- ble så kombinert med EcoRI-forbindere (bestående av et selvkomplementært oligonucleotid 3 med følgende sekvens: pCATGAATTCATG), som tilvéiebringer en EcoRI-spaltningsposis.jon for senere kloning til et plasmid som inneholder en EcoRI-posisjon (20). ;20 yg av DNA fragmentene 2 oppnådd fra pGMl ble behandlet med 10 enheter DNA-ligase i nærvær av 200 picomol av det 5<1->fosforylerte syntetiske oligonukleotid pCATGAATTCATG (3) og i 20 yl T4DNA-ligasebuffer (20 mmol tris, pH 7,6, 0.5 mmol ATP, 10 mmol MgCl2, 5 mmol. ditiotreitol) ved 4°C over natten. Oppløsningen ble så oppvarmet i 10 min. til 70°C for å stoppe sammenbindingen. De sammenbindende elementer ble så spaltet ved EcoRI-nedbrytning, og fragmentene med EcoRI-endene ble skilt idet man brukte 5% polyacrylamid-gel-elektroforese (i det etterfølgende betegnet PAGE), og de tre største fragmentene ble isolert fra gelen ved først å farge med etidiumbromid, lokalisere fragmentene med ultra-fiolett lys, og skjøre ut av gelen de deler som var av interesse. Hvert gel-fragment med 300 mikroliter 0,1 x TBE ble plassert i en dialysepose og underkastet elektroforese ved 100 v i en time i 0,1 x TBE buffer (en TBE-buffer inneholder 10,8 g tris base,' 5,5 g borsyre, 0,09 g Na2EDTA i 1 liter H2O). Den vanndige oppløsningen fra dialyseposen ble fenolekstrahert, deretter kloroformekstrahert og tilsatt 0,2 molar natriumklorid, hvoretter DNA ble innvunnet i vann etter etanolutfelling. (Alle de etterfølgende DNA-fragment-isoleringer ble utført ved hjelp av PAGE fulgt av den ovennevnte elektroelueringsmetode). Det trp-promotor-operator-holdige gen med EcoRI med de "klebrige"-ender 5 ble identi fisert ved hjelp av den fremgangsmåte som er beskrevet i det etterfølgende, som bl.a. innbefatter at man. innsetter fragmentene i et tetracyklinfølsomt plasmid, J5, som ved innsetning av nevnte promotor-operator blir tetracyklinresistent. ;B. Dannelse av plasmiden pBRHtrp som uttrykker tetracyklin-resistens under kontroll av trp promotor-operatoren og identifikasjon og forsterkning av trp promotor-operator-holdig DNA-fragment _5 isolert som beskrevet under avsnitt A ovenfor. ;Plasmid pBRHl (6), (R.I.Rodriguez et al., Nucleic Acids Research 6, 3267-3287 (1979), uttrykker ampicillin-resistens og inneholder genet for tetracyklinresistens, men ettersom det er ingen tilknyttet promotor, så vil denne resistens ikke bli- uttrykt. Plasmidet er. følgelig tetracyklin-følsomt. Ved å innføre et promotor-operator-system i EcoRI-posisjonen, kan nevnte plasmid gjøres tetracyklinresistent. ;pBRHl ble nedbrutt ved hjelp av EcoRI, og enzymet ble fjernet ved fenolekstraksjon fulgt av kloroformekstraksjon og innvinning i vann etter etanolutfellning. Det resulterende DNA-molekyl, 1_, ble i separate reaksjonsblandinger kombinert med hver av de 3 DNA-fragmenter som ble oppnådd i del A ovenfor, og forbundet med T4DNA-ligase som tidligere beskrevet. Det DNA som var tilstede i reaksjonsblandingen ble brukt for å omforme kompetent E. coli K-12 rase 294, ;K. Backman et al., Proe. Nat'l Acad Sei USA 73, 4174-4198 ;(1976) (ATCC nr. 31448) ved hjelp av standard teknikk (V. Hershfield et al., Proe. nat'l Acad Sei USA 71, 3455-3459 ;(1974), hvoretter bakterien ble utstrøket på LB-plater inneholdende 20 yg/ml ampicillin og 5 yg/ml tetracyklin. Flere tetracyklin-resistente kolonier ble valgt ut, plasmid DNA ble isolert og nærvær av de forønskede fragmenter ble bekreftet ved en begrensende enzymanalyse. Det resulterende plasmid 8_ betegnet pBRHtrp, uttrykker g-laktamase, noe som gir ampicillin-resistens, og det inneholder et DNA-fragment som innbefatter trp promotor-operatoren og innkoder et første protein som består av en sammensmeltning av de første 6 aminosyrene i trp-lederen og ca. den siste 3.del av trp E-polypeptidet (dette polypeptid er betegnet LE'), og et annet protein som tilsvarer omtrent den første halvpart at trp D-polypeptidet (dette polypeptid er betegnet D<1>), og et tredje protein som er kodet ved hjelp av tetracyklinresistente gen. C. Kloning av gener for forskjellige sluttproduktpolypeptider og uttrykning av disse som sammensatte proteiner som består av endeproduktet og en spesifikt avspaltbar trp D-polypeptid-forløper (fig . 2) . ;Et DNA-fragment besto av trp promotor-operatoren;og kodoner for LE' og D' polypeptidene ble oppnådd fra plasmid pBRHtrp og innsatt i plasmider som inneholdt strukturelle gener for forskjellige forønskede polypeptider, og denne fremgangsmåte er eksemplifisert i forbindelse med somatostatin (fig. 2). ;pBRHtrp ble nedbrutt ved hjelp av EcoRI-begrensende enzym, og det resulterende fragment 5_ ble isolert ved hjelp av PAGE og elektroeluering. Det EcoRI-nedbrutte plasmid pSom 11 (K-Itakura et al., Science 198, 1056 (1977): G.B. patent publikasjon nr. 2 007 676 A) ble kombinert med fragment 5_. Blandingen ble forbundet med T4DNA-ligase som beskrevet ovenfor, og det resulterende DNA ble transformert inn i E. coli K-12 rase 294 som beskrevet tidligere. Transformante bakter-rier- ble valgt på ampicillinholdige plater. De resulterende ampicillinresistente kolonier ble undersøkt ved hjelp av kolo-nihybridisering (M. Gruenstein et al., Proe Nat'l Acad Sei USA 72, 3951-3965 (1975)), idet man brukte trp promotor-operator -holdig fragment 5_ som var isolert fra pBRHtrp, og som var radioaktivt merket med p^<2>. Flere kolonier som var positive ved denne kolonohydrid iser ing ble valgt ut, og plasmid DNA ble isolert og orienteringen på de innsatte fragmenter ble bestemt ved hjelp av begrensende analyse hvor man brukte begrensningsenzymene Bglll og BamHl ved en dobbeltnedbrytning. E.coli 294 som inneholdt plasmidet som fikk betegnelsen pSOM7A2, 11, som har trp promotor-operatorfragmentet i den for-ønskede orientering, ble dyrket i LB medium som inneholdt loug ;pr. ml ampicillin. Cellene ble dyrket til en optisk tetthet på 1 (ved 550 nM), deretter sentrifugert og resuspendert i M9-medium i ti gangers fortynning. Cellene ble dyrket i fra 2 til 3, igjen til en optisk tetthet på 1, deretter opp-løst, og det totale cellulære protein ble analysert ved hjelp av SDS (natriumdodcylsulfat) urean (15%) polyacrylamid gel elektroforese (J.V.Maizel Jr. et al., Meth Viral _5. 180-246 ;(1971)). ;Fig. 3 illustrerer en protein gel-analyse hvor det totale protein fra forskjellige kulturer ble separert ved hjelp av størrelse. Tettheten på de individuelle bånd reflek-terer mengden av de respektive proteiner. På fig. 3 er kolonne 1 og 7 kontroller og består av en rekke proteiner som på forhånd var bestemt med hensyn til størrelse, og som tjener ;som komparative referanser. Kolonnene 2 og 3 skiller cellulært protein fra koloniene av E.coli 294 omdannet med plasmid pSom7A2, og henholdsvis dyrket i LB (kolonne 2) og M9 (kolonne 3) media. Kolonne 4 og 5 skiller cellulært protein oppnådd fra lignende celler omdannet ved hjelp av plasmid pTHa7A2 et thymosin-uttrykkende plasmid oppnådd ved hjelp av de fremgangsmåter som er beskrevet ovenfor, idet man begynner med plasmidet pTHal (se US patent-søknad fra Roberto Crea og Ronald B. Wetzel, innsendt 28. februar 1980 for Thymosin ;Alfa 1-produksjon, og denne søknad inngår her som en referanse). Kolonne 4 skiller cellulært protein fra E.coli 294/pTha7 A2 dyrket i LB- media, mens kolonne 5 skiller celleprotein fra samme transformant dyrket i M9-media. Kolonne 6 som er annen kontroll, er proteinmønsteret fra E.coli 294/pBR322 dyrket i LB. ;En sammenligning med kontrollene viser at den øvre del av de mest fremtredende båndene i hver av kolonne 3 og 5, ;er proteiner av den størrelse man kunne forvente med hensyn til uttrykning av et sammensatt protein bestående av D' polypeptidet, og henholdsvis somatostatin og tymosin, (det andre fremtredende båndet representerer det LE' polypeptid som opp-står ved en utstrykning av det undertrykkende området). ;Fig. 3 békrefter at uttrykningen holdes tilbake i et tryptofan rikt medium, men utløses under betingelser hvor det er et underskudd på tryptofan. D. Cyanogen bromid-spaltning og radioimmuniprøve for hormon-produkt. ;Både fra tilfellene med tymosin og somatostatin,;ble det totale cellulære protein cyanogen-bromid-spaltet, hvoretter det spaltede produkt ble innvunnet og etter tørking resuspendert i buffer, og analysert ved hjelp av en radio-immunoprøve, idet man bekreftet at produktet var uttrykt og immunologisk identisk henholdsvis med somatostatin og tymosin. Syanogen-bromid-spaltning er beskrevet av D.V.Goeddel et al., Proe Nat'1 Acad Sc i.USA 76, 106-110 (1979)). II. Konstruksjon av plasmider for direkte uttrykning av heterologe gener under kontroll av trp promotor- operator-systemet . ;Den strategi man anvender for direkte uttrykning innbefatter at man danner et plasmid som inneholder en enestående begrensende posisjon distalt for alle kontrollelementer i trp operonet, og heri kan alle heterologe gener klones isteden-for trp leder sekvensen, og de vil få et passende mellomrom i ;forhold til trp leder-polypeptidets ribosombindende posisjon. Denne direkte uttrykning er i det etterfølgende eksemplifisert i forbindelse med uttrykning av det humane veksthormon. ;Plasmidet pSom7 A2, 10 yg ble spaltet med EcoRI, og DNA-fragmentet 5_ inneholdende de tryptofangenetiske elementer ble isolert ved PAGE og elektroeluering. Dette fragment som veide 2 yg ble nedbrutt ved hjelp av begrensende endonuclease Taq 1, 2 enheter i 10 minutter ved 37°C, slik at man i middel, bare fikk spaltet en av de omtrent 5 Taq 1-posisjonene i hvert molekyl. Denne delvis nedbrutte blandingen av fragmenter ble skilt ved hjelp av PAGE, og et fragment 12 med ca. 300 basepar (fig. 4), som inneholdt en EcoRI-ende og en Taq 1-ende ble isolert ved elektroeluering. Den tilsvarende Taq 1-posisjonen er plassert mellom transkripsjonsstartposisjonen og overset-telsesstartposisjonen og er 5 nucleotider ovenfor ATG kodonet i trp-lederpeptidet. DNA sekvensen omkring denne posisjon er vist i fig. 4. Ved hjelp av foregående fremgangsmåte kunne man isolere et fragment som inneholdt alle kontrollelementene i nevnte trp operon, dvs. promotor-operatorsystemet, trans-kripsjonsstartsignalet og trp leder-r ibosom-bindingsposis jonen.. ;Taq 1 residuet ved 3'-enden av det resulterende fragment inntil oversettelses-start-signalet for trp leder-sekvensen, ble så omdannet til en Xbal posisjon slik det er vist på fig. 5. Dette ble gjort ved å forbinde fragment 12 fremstilt som beskrevet ovenfor, til et plasmid inneholdende en enestående (dvs. bare 1) EcoRI-posisjon, og en enestående Xbal-posisjon. For dette formål, kan man i alt vesentlig anvende ethvert plasmid som i følgende rekkefølge inneholder, en replikon, en velgbar markør så som antibiotikaresistens, og EcoRI, Xbal, og BamHI-posisjoner. Således kan f.eks. en Xbal posisjon innføres mellom EcoRI og BamHI-posisjonen i pBR322 (F.Bolivar et al., Gene 2, 95-119 (1977)), f.eks. ved å spalte plasmidets enestående Hind III-posisjon med Hind III fulgt av en enkelttrådet spesifik nuclease-nedbrytning av de resulterende Eklebrige" ender, og så foreta en forbinding med et selvbin-dende dobbelttrådet syntetisk nucleoid som inneholder gjen-kjennelsesposisjonen så som CCTCTAGAGG. Alternativt kan man anvende naturlige DNA-fragmenter, f.eks. som ble gjort i .foreliggende tilfeller, som inneholder en enkelt Xbal-posisjon mellom EcoRI og BamHI spaltnings-residuene. Således ble et EcoRI og BamHI nedbrytningsprodukt av det virale genom i hepatitis B oppnådd på vanlig kjent måte og klonet inn i';EcoRI og BamHI posisjonene i plasmid pGH6 (D.V.Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979)), hvorved man fikk fremstilt plasmiden pHS32. Denne plasmid ble så spaltet med Xbal, fenolekstrahert, kloroformekstrahert og fenolutfelt. Den ble så behandlet med 1 yl E. coli polymerase I, Klenow fragment (Boehringer-Mannheim) i 30 yl polymerasebuffer (50 mM kaliumfosfoat pH ;7,4 7 mM MgCl2, 1 mM B-merkaptoetanol) inneholdende o,l mM dTTP og 0,1 mM dCTP i h time ved 0°C og så 2 timer ved 37°C. Denne behandling gjør at 2 av de 4 nucleotider som er komplementære til de 5' utstikkende ender på Xbal spaltningsposi-sjonene blir fylt opp: ; ; Nucleotidene dC og dT ble inkorporert og ga en ende ved to utstikkende 5' nucleotider. Dette lineære residum av plasmid pHS32 (etter fenol og kloroform ekstrak-sjon og innvinning i vann etter etanol utfelning) ble spaltet med EcoRI. Det største plasmidfragment 1_3 ble utskilt fra det mindre EcoRI*-XbaI-f ragment ved hjelp av PAGE og isolert etter elektroeluering. Dette DNA-fragment fra pHS32 (0,2<y>g) ble forbundet ved hjelp av lignende betingelser som er beskrevet ovenfor, til EcoRI-Taq-fragmentet fra tryptofan-operonet (-0,01 yg) slik det er vist på fig. 5. Ved hjelp av denne fremgangsmåte blir den utstikkende enden på Taq 1 forbundet med den gjenværende utstikkende ende på Xbal, selv om det ikke er fullt ut basepar ifølge Watson-Crick modellen:

En del av denne reaksjonsblanding ble omdannet til E coli 294 celler som beskrevet i del I ovenfor, varmebehand-let og utstrøket på LB-plater inneholdende ampicillin. 24 kolonier ble valgt ut, dyrket i 3 ml LB-media, og plasmid-isolert. 6 av isolatene ble funnet å ha Xbal-posisjon re-generert via E.coli-katalysert DNA reparasjon og replikasjon:

Disse plasmider kunne også spaltes både med EcoRI og Hpal og man fikk de forventede begrensende fragmenter. Et plasmid, 14^, som ble gitt betegnelsen pTrp 14, ble brukt for uttrykking av heterologe polypeptider, slik dette er beskrevet i det etterfølgende.

Plasmidet pHGH 107 (19 i fig. 5 D.V. Goeddel et al., Nature, 281, 544,(1979)), inneholder et gen for det humane vekst-hormon som er fremstilt av 23 aminosyrekodoner fremstilt fra syntetiske DNA-fragmenter og 163 aminosyrekodoner oppnådd fra komplementært DNA produsert via revers transkrip-sjon av humant veksthormon messenger RNA. Dette geni, 21, skjønt det mangler kodonet for "pre"-sekvensen for det humane veksthormon, inneholder et ATG-oversettelses-startkondon. Dette gen ble isolert fra 10 yg pHGH 107 etter behandling med EcoRI fulgt av E. coli polymerase L Klenow-fragment og dTTP og dATPsom beskrvet ovenfor. Etter fenol og kloroformekstraksjon og etanolutfellning ble plasmidet behandlet med BamHI. Se fig. 6.

Det humane veksthormon ("HGH") gen-holdige fragment 21 ble isolert ved PAGE fulgt av elektroeluering. Det resulterende DNA-fragment inneholder også de første 350 nucleotidene av det tetracyklinresistente strukturelle gen, men mangler tetracyklin promotor-operatorsystemet, slik at når det etterpå klones inn i et uttrykningsplasmid, så vil et plasmid inneholdende denne innsetning kunne lokaliseres ved gjenskapning av tetracyklinresistensen. Etter som EcoRI-enden på fragment 21 er blitt fylt ved hjelp av Klenow-polymerase I, så har fragmentet 1 såkalt stumpende og en såkalt klebrig ende, noe som sikrer orienteringen når dette senere innsettes i et uttrykningsplasmid. Se. fig. 6.

Uttrykningsplasmidet pTrpl4 ble så fremstilt slik

at det kunne motta det HGH-genholdige fragment som er fremstilt som beskrevet ovenfor. pTrpl4 ble således nedbrutt ved hjelp av Xbal, og de resulterende klebrige ender fylt opp med Klenow-polymerase I idet man anvendte dATP, dTTP, dGTP og dCTP. Etter fenol og kloroformekstraksjon og etanolutfellning ble det resulterende DNA _16 behandlet med BamHI,

og det resulterende store plasmidfragment 17 isolert ved hjelp av PAGE og elektroeluering. Det pTrpl4-avledede fragment 17 hadde en såkalt stump ende og en klebrig ende, noe som gjør at man får en rekombinasjon i riktig orientering med det HGH-genholdige fragment 21. slik dette er beskrevet tidligere.

HGH genefragment 2_1 og nevnte pTrp 14 AXba-BamHO-fragment 17 ble kombinert og forbundet under de betingelser som er beskrevet tidligere. De fylte Xbal og EcoRI-ender ble bundet sammen ved hjelp av forbinding over de såkalte stumpe ender, og dette gjenskaper både Xbal og EcoRI posisjonene:

Denne konstruksjon gjenskaper også det tetracyklin-resistente gen. Etter som plasmidet pHGH 107 uttrykker tetracyklinresistens fra en promotor som ligger ovenfor det angitte HGH-gen (lac-promotoren), så vil denne konstruksjon, 22, som er gitt betegnelsen pHGH 207, muliggjøre en uttrykning av genet for tetracyklinresistens under kontroll av tryptofan promotor-operatoren. Denne forbindingsblandingen ble således omdannet i E. coli 294 og kolonier ble valgt på LB plater inneholdende 5 yg/ml av tetracyklin.

For å bekrefte den direkte uttrykningen av humant veksthormon fra plasmid pHGH 207, så ble det totale cellulære protein avledet fra E. coli 294/pHGH 207 som var dyrket til en optisk tetthet på 1 i LB-media inneholdende 10 yg/ml ampicillin og fortynnet til 1 til 10 i M9-media, og igjen dyrket til en optisk tetthet på 1, underkastet en SDS-gel-elektroforese som angitt under del I ovenfor, og sammenlig-net med tilsvarende elektroforesedata oppnådd for det humane veksthormon slik dette tidligere er rapportert av andre, (D.V. Goeddel et al., Nature, 281, 544 (1979)). Fig. 7 er

et fotograf av den resulterende farvede gel hvor: kolonnene 1 og 7 inneholder proteinmarkører med forskjellig kjente størrelser; kolonne 2 er kontroll som skiller det totale cellulære protein i E. coli rasen 294 pBR322; mens kolonne 3 skiller protein fra E. coli 294/pHGH 107 dyrket i LB medium, kolonne skiller protein fra E.coli 294/pHGH 107 dyrket i m9 media, kolonne 5 skiller protein fra E.coli 294/pHGH 207 dyrket i LB-medium, mens kolonne 6 skiller protein fra

E.coli 294 pHGH 207 dyrket i M9. Det tette bånd i kolonne 6 er humant veksthormon, noe som er vist ved sammenligning med tilsvarende bånd i kolonnene 2-4. Som forutsatt i foreliggende oppfinnelse, så produserte organismen E. coli '294/ pHGH 207 når denne ble dyrket i et tryptofanrikt LB-medium, mindre humant veksthormon på grunn av samvirket mellom tryptofan-repressoren og operatoren, og produserte betydelig mer HGH når det ble dyrket i M9 medium enn E. coli 294/pHGH 107, noe som skylles en induksjon av det sterkere tryptofan promotor-operator-system i forhold til nevnte lac promotor-operator-system i pHGH 107. III. Dannelse av et generelt uttrykningsplasmid for direkte uttrykning av heterologe gener under kontroll av tryptofan- promotor- operatoren.

Plasmidet pHGH 207 fremstilt som beskrevet i foran-nevnte avsnitt, ble deretter brukt for å oppnå et DNA-fragment inneholdende kontrollelementene i tryptofanoperonet (som mangler i undertrykkende områder), og for å skape en plasmid "uttryknings-vektor" som er egnet for direkte uttrykning av forskjellige innsatte strukturelle gener. Den strategi som ble brukt for dannelsen av dette generelle uttrykningsplasmid, innbefatter en fjerning av tryptofankontroll-området fra pHGH 207 ved EcoRI-nedbrytning og innsetning av det EcoRI-nedbrutte plasmid pBRHl som ble brukt i del 1 ovenfor. pBRHl, som tidligere angitt, er et ampicillinresistent plasmid som inneholder det tetracyklinresistente gen, men er tetracyklinsensitivt på grunn av et fravær av et egnet promotor-operator-system. Det resulterende plasmid pHKYl, hvis konstruksjon er mer detaljert beskrevet i det etterfølgende og vist i fig. 8, er både ampicillin- og tetracyklinresistent, inneholder tryptofan-promotor-operator-systemet og mangler de tryptofan-undertrykkende områder, og inneholder en enestående distal Xbal posisjon fra tryptofan promotor-operatoren. Sistnevnte og nevnte enestående Xbal-posisjon ér vunnet ved hjelp av EcoRI-posisjoner, slik at det promotor- operator-Xbal-holdige fragment kan fjernes for innsetting i andre plasmider som inneholder strukturelle gener.

Alternativt kan heterologe strukturelle gener innsettes, enten i nevnte Xbal- posisjon eller (etter delvis EcoRI-nedbrytning) i nevnte EcoRI-posisjon distalt i forhold til tryptofankontroll-området, og i begge tilfeller slik at det kommer under kontroll av nevnte tryptofan-promotor-operatorsystem.

Plasmid pHGH 207 ble EcoRI-nedbrutt, og trp-promotoren inneholdende EcoRI-fragment 23 ble innvunnet ved hjelp av PAGE fulgt av elektroeluering.

Plasmid pBRHl ble EcoRI-nedbrutt og de spaltede ender behandlet med bakteriell alkalisk fosfatase ("BAP")

(1 yg i 50 mM tris pH 8 og 10 mM MgCl2i 30 minutter ved 65°),

for å fjerne fosfatgruppene på de utstikkende EcoRI-endene. . Overskudd av bakteriell alkalisk fosfatase ble fjernet ved fenolekstraksjon, kloroformekstraksjon og etanolutfellning. Det resulterende lineære DNA 7_a på grunn av at det mangler fosfater på de utstikkende ender, vil i forbinding bare akseptere innsatte genefragmenter hvis komplementære.klebrige ender .er fosforylert, men vil ikke i seg selv bli resirkulert, noe som gjør at man får en lettere undersøkelse og sikting for plasmider som inneholder de innsatte gener..EcoRI-fragmentet som er avledet fra pHGH 207 og lineært DNA oppnådd fra pBRHl ble kombinert i nærvær av T4~ligase slik det er beskrevet ovenfor og forbundet. Endel av den resulterende blanding ble omdannet i E.coli rase 294 slik det er beskrevet tidligere, og utstrøket på LB-media inneholdende 5 yg pr. ml tetracyklin og man valgte deretter ut 12 tetracyklinresistente kolonier.Plasmider ble isolert fra hver koloni, og under-søkt for nærvær av en DNA-innsetning ved såkalt begrensende endonuclease-analyse, idet man anvendte EcoRI og Xbal.

Et plasmid inneholdende nevnte innsatte gen ble betegnet pHKYl..

IV. Dannelse av et plasmid inneholdende et tryptofan- operon som er i stand til å uttrykke et spesifikt spaltbart sammensatt protein bestående av 6 aminosyrer av trp- leder- peptidet og den siste 3. delen av trp E polypeptidet ( betegnet LE') og et heterologt strukturelt gene-produkt.

Den strategi man brukte for å danne et LE' sammensatt proteinuttrykningsplasmid innbefattet følgende trinn: a. Man tilveiebrakte et genfragment som besto av kodoner for det distale området i nevnte LE' polypeptid med Bgl II ogEcoRI klebrige ender henholdsvis ved 5' og 3' ender i den kodende tråden; b. Eliminering av kodoner fra det distale området i LE' genet-fragmentet og de for trp D genet fra plasmid SOM 7 A2 og innsetning av det fragment som er fremstilt under trinn 1, hvoretter man rekonstituerer LE' kodon-sekvensen umiddelbart ovenfor det heterologe gen for somatostatin. 1. Med henvisning til fig. 9(a) så ble plasmid pSom7 A2 Hind III-nedbrutt fulgt av nedbrytning med lambda eksonuklease (et 5' til 3' eksonuklease) under slike betingelser at man fikk en nedbrytning ut over Bgl II-begrensningsposisjonen med nevnte LE' innkodningsområde. 20 yg av Hind III-nedbrutt pSom7 A2 ble oppløst i buffer (20 mM glycinbuffer, pH 9,6, 1 mM MgCl2,l mM 8-merkaptoetanol). Den resulterende blandingen ble behandlet med 5 enheter av lambda eksonuklease i 60 minutter ved romtemperatur. Den oppnådde reaksjonsblandingen ble så fenolekstrahert, kloroformekstrahert og etanolutfelt.

For tilslutt å danne et EcoRI-residum i den distale enden av LE<1->genefragmentet, så syntetiserte man en primer<32>pCCTGTGCATGATved hjelp av den forbedrede fosfortriester-metoden (R.Crea et al., Proe Nat'l Acad Sei USA 75, 5765

(1978)), og hybridiserte denne til den enkelttrådede enden

av LE'-genefragmentet som oppsto ved hjelp av nevnte lambda eksonukleasenedbrytning. Hydribiser ingen ble utført som beskrevet nedenfor.

20 yg av det lambda- eksonuklease-behandlede Hind III nedbrutte produkt av plasmid pSom7 A2 ble oppløst i 20 yl

H 20 og blandet med 6 yl av en oppløsning inneholdende ca.

80 picomol av det 5<1->fosforylerte oligonukleotid som er beskrevet ovenfor. Det syntetiske fragment ble hybridisert til 3<1>enden av den.LE'-kodende sekvens, og den gjenværende enkelttrådede delen av LE'-fragmentet ble fylt inn ved hjelp av Klenow-polymerase I slik dette er beskrevet ovenfor, idet man brukte dATP, dTTP, dGTP og dCTP..

Reaksjonsblandingen ble oppvarmet til 50° og lang-.somt avkjølt til 10°, hvoretter man tilsatte 4 yl Klenow-enzym. Etter 15 minutter ved romtemperatur fulgt av 30 minutter ved 37°C ble reaksjonen stoppet ved å tilsette 5 yl 0,25 molar EDTA. Reaksjonsblandingen ble fenolekstrahert, kloroformekstrahert 'og etanolutfelt. DNA ble deretter spaltet med begrensningsenzym Bgl II. De oppståtte fragmenter ble skilt ved hjelp av PAGE. Et autoradiogram fra gelen viste et 32p_mer|<;et fragment av den forventede lengde på ca. 470 bp, og dette fragment ble innvunnet ved elektroeluering.

Som nevnte ovenfor har dette fragment LE<1>(d) en Bgl II og

en "stump" ende som faller sammen med begynnelsen av primeren.

Plasmidet pThal som er beskrevet i del I (C) ovenfor, bærer et strukturelt gen for tymosin alfa 1 som er klonet på enden av dets 5' kodende tråd i en EcoRI-posisjon, og i den 3'-enden i en BamHI-posisjon. Som vist på fig. 9, inneholder tymosin-genet også en Bgl II-posisjon.

Plasmidet pThal inneholder også et gen som spesifi-serer ampicillinresistens. For å danne et plasmid som er i stand til å akseptere det LE' (d) fragment som er fremstilt som beskrevet ovenfor, så ble pThal nedbrutt ved hjelp av EcoRI og deretter ved hjelp av en reaksjon med Klenow-polymerase, med dTTP og dATP for å avrunde eller gjøre EcoRI-residuane stumpe. En Bgl II nedbrytning av det resulterende produkt ga et lineært DNA-fragment 33, som inneholder genet for ampicillin-resistens, og som i sine motsatte ender har

et "klebrig" Bgl II-residum og en avrundet eller stump ende. Det resulterende produkt ble gjendannet til en sirkel ved hjelp av en reaksjon med det LE' (d)-fragment som inneholder en Bgl II-klebrig ende og en avrundet eller stump ende i nær-

vær av T^-legase, slik at man fikk dannet plasmidet pTrp24 (fig. 9b). Ved hjelp av denne fremgangsmåten gjenskapte man en EcoRI-posisjon på det sted hvor man fikk sammenbinding mellom de avrundede eller stumpe ender.

Som vist på fig. 10, vil en suksessiv nedbrytning av pTrp24 med Bgl II og EcoRI, fulgt av PAGE og elektroeluering gi et fragment med kodoner for LE1 (d) polypeptidet med en Bgl II-klebrig ende og en EcoRI-klebrig ende inntil dets 3'-kodende sluttgruppe. LE1 (d)-fragment _38 kan klones inn i Bgl II-posisjonen i plasmid pSom7 A2,'hvorved man får fremstilt et LE<1>polypeptid/somatostatin-sammensatt protein som uttrykkes under kontroll av tryptofan promotor-operatoren, slik det er vist på fig. 10. For å oppnå dette, må følgende krav være oppfylt (1) delvis EcoRI nedbrytning av pSom7 A2 for å spalte EcoRI-posisjonen distalt til tryptofan promotor-operatoren slik det er vist på fig. 2, og (2) ved et passende valg av primer-sekvens (fig. 9) slik at man opprettholder den kodende avlesningsrammen, og deretter gjenskape en EcoRI spaltningsposisjon.

Således ble 16 yg plasmid pSom7 A2 fortynnet i 200 yl buffer inneholdende 20 mM Tris, pH 7,5, m mM MgCl2, 0,02 NP40 vaskemiddel, 100 mM NaCl og ble behandlet med 0,5 enheter EcoRI. Etter 15 minutter ved 37°C ble blandingen fenolekstrahert, klorof orrnekstraher t og etanolutfelt, og deretter nedbrutt med Bgl II. Det største resulterende fragment.

36 ble isolert ved hjelp av PAGE og så elektroeluert. Dette fragment inneholder kodonene "LE'(p)" for den proksimale enden av LE' polypeptidet, dvs. den del som ligger ovenfor Bgl II-posis jonen. Fragmentet 3_6 ble så bundet til fragmentet 3_8 i nærvær av T^DNA-ligase, slik at man fikk dannet plasmiden pSom7 A2A4, som ved transformasjon i E.coli rase 29.4 slik det tidligere er beskrevet, gir et sammensatt protein som består av det helrekonstituerte LE<1>polypeptid og somtatostatin under kontroll av tryptofan promotor-operatoren. Det sammensatte protein hvorfra somatostatin spesifikt kan avspaltes på grunn av et nærvær av metionin i den 5' enden av somatostatin-sekvensen, ble utskilt ved hjelp av

SDS polyakrylamin gel elektroforese slik det er beskrevet tidligere. Det sammensatte proteinproduktet er det mest fremtredende bånd i kolonne 6 på fig. 11, noe som er mer detaljert beskrevet i del VI nedenfor. V. Dannelse av et uttrykningssytem for trp LE' polypeptid-sammensetninger hvor tetracyklinresistensen er plassert under kontroll av tryptofan promotor- operatoren.

Den strategi man bruker for å danne et plasmid som er i stand til å motta en rekke heterologe polypeptidgener for uttrykning av trp LE'-sammensatte proteiner under kontroll av tryptofan-operonet, innbefatter en konstruksjon av et plasmid med følgende egenskaper: 1. Tetracyklinresistens som ville gå tapt hvis man tok vekk et promotor-operator-system som kontrol-lerte de gener som ga en slik resistens. 2. Fjerning promotor-operator-systemet som kon-trollerer tetracyklinresistens og gjenskaper den sirkulære form på kromosomet ved en forbinding mellom det heterologe gen og et tryptofan promotor-operator-system i en passende avlesningsfase, hvorved man gjenskaper tetracyklinresistensen og følgelig muliggjør en identifikasjon av plasmider inneholdende det innsatte heterologe gen.

På bakgrunn av det som står ovenfor, så var det således en hensikt å skape et lineært fragment av DNA som hadde et Pst-residum i den 3' ende og et Bgl II-residum i den 5' ende, og bundet til et gen som var i stand til å spesifisere tetracyklinresistens når det ble bragt under kontroll av et promotor-operator-system.

som vist på fig. 12, så ble plasmid pBR322 Hind III-nedbrutt, og de utstikkende Hind III-ender ble så igjen nedbrutt ved hjelp av Sl nuclease. Denne Sl nuclease-nedbrytningen innbefattet behandling av 10 yg Hind III-avspaltet pBR322 i 30 yl Sl-buffer (0,3 M Nacl, ImM ZnCl2, 25 mM na-, triumacetat, pH 4,5) med 300 enheter Sl nuclease i 30 minutter ved 15°. Reaksjonen ble stoppet ved å tilsette 1 yl 30 x Sl

nuclease stoppoppløsning (0,8 M tris base, 50 mM EDTA). Blandingen ble fenolekstrahert, kloroformekstrahert og etanolutfelt, og deretter EcoRI-nedbrutt som beskrevet tidligere, og det største fragment 4_6 ble utskilt ved hjelp av PAGE

og deretter elektroeluert. Dette fragment hadde en første EcoRI klebrig ende, og en annen avrundet eller stump ende hvis kodende tråd begynte med nucleotidtymidinet. Som vist i det etterfølgende, så kan det Sl-nedbrutte Hind III-residum som begynner med tymidin' forbindes til et Bgl II-residum som er behandlet med en Klenow-polymerase I, slik at man rekonstituerer Bgl II-begrensningsposisjonen ved hjelp av en slik binding.

Plasmid pSom7 A2 fremstilt som beskrevet i del I ovenfor, ble nedbrutt ved hjelp av Bgl II, og de Bgl II-klebrige ender ble gjort dobbelttrådet med Klenow polymerase I idet man brukte alle 4 deoksynucleotid-trifosfåtene.

En EcoRI-spaltning av det resulterende produkt fulgt av PAGE og elektroeluer ing av det minste fragment 4_2, ga et lineært stykke DNA inneholdende tryptofan promotor-operatoren og kodoner for LE' "proksimal"-sekvensen som ligger ovenfor Bgl II-posisjonen ("LE'(p)"). Dette produkt hadde en EcoRI-ende og en stump eller avrundet ende på grunn av innfyllingen i Bgl II-posisjonen. Imidlertid så ble sistnevnte posisjon rekonstituert ved en binding av den avrundede enden på fragment 4<_>2til den avrundede eller stumpe enden i fragment 46.

De to fragmenter ble således bundet sammen i nærvær av T4DNA-ligase, hvorved man fikk et sirkulært plasmid pHKY 10 (se -fig. 12), som ble oppformert ved transformasjon i celler av E. coli rase 294. Tetracyklinresistente celler som bærer rekombinantplasmidet pHKY 10 ble dyrket, plasmid DNA ekstra-hert og nedbrutt med Bgl II og Pst,fulgt av isolasjon ved PAGE prosedyren og elektroeluering av det store fragment,

et mineært stykke av DNA med Pst og Bgl II klebrige ender. Dette DNA fragment 49_ inneholder opprinnelsen for replikasjon og kan derfor brukes som en første komponent i konstruksjon av plasmider hvor begge genene koder for trp LE' poly-peptidsammensatte proteiner, og hvor • tet-resistensgenet kon-

trolleres av trp promotor/operatoren.

Plasmid pSom7 A2A4 hvis fremstilling er beskrevet under del IV, kan manipuleres slik at man får en annen komponent i et system som er i stand til å motta en rekke forskjellige heterologe strukturelle gener. Som vist på fig.13, ble plasmiden underkastet en partiell EcoRI-nedbrytning (se del IV) , fulgt av Pst-nedbrytning hvoretter fragment 51. inneholder trp-promotor/operatoren ble isolert ved hjelp av PAGE og elektroeluering. Delvis EcoRI-nedbrytning var nødvendig for å oppnå et fragment som ble spaltet nær 5'-enden av somatostatin-genét, -men ikke ble spaltet ved den EcoRI-posisjonen som er tilstede mellom ampicillin-resistens-genet og trp-promotor-operatoren. Ampicillin-resistenten som gikk tapt ved Pst I-nedbrytningen i ap<R->genet, kunne gjenskapes ved en forbindelse med fragment 51.

I et første forsøk ble tredje-komponenten, dvs.

et strukturelt gen for tymosin alfa-en, fremstilt ved hjelp av EcoRI og BamHI-nedbrytning av plasmid pThal. Fragmentet nr. 5_2 ble renset ved PAGE og elektroeluer ing.

De tre genefragmentene 4_9, 51 og _52 kunne nå settes sammen i riktig orientering, slik det er vist på fig. 13, og man fikk dannet plasmidet pTha7AlA4, som så kunne velges ut på grunn av at man fikk gjenskapt ampicillin og tetracyklinresistensen. Plasmidet ble overført i en E.coli rase 294

og dyrket opp under samme betingelser som beskrevet i del I, og uttrykker et trp LE' polypeptid-sammensatt protein hvorfra tymocin alfa kunne .avspaltes spesifikt ved hjelp av behandling med cyanogenbromid. Når andre heterologe strukturelle gener med sluttgruppene EcoRI og BamHI på samme måte ble forbundet med de komponenter som er avledet av pHKYlO-

og pS0M7 A2A4, så fikk man fremstilt trp LE' polypeptid-sammensatte proteiner inneholdende polypeptider som var ut-kodet via de heterologe genene. Fig. 11 viser en SDS-polyakrylamid-gel-elektroforeseseparasjon av de totale cellulære proteiner fra E. coli rase 294-transformanter,

og det mørkeste bånd i hver kolonne representerer det sammensatte proteinprodukt som var fremstilt under kontroll av

tryptofan promotor-operator-systemet. På fig. 11 er kolonne 1 en kontroll som skiller det totale cellulære protein fra E.,coli 294/pBR322. Kolonne 2 inneholder somatostatin-sammensatt produkt fra plasmid pSom7 A2A4, fremstilt som beskrevet under del IV. Kolonne 3 er det somtostatin-holdige uttrykte produkt av pSom7 A1A4. Kolonne 4 inneholder uttryk-ningsproduktet av pTh 7 14, mens kolonne 5 inneholder det produkt man fikk uttrykt fra en plasmid som ble fremstilt når pHKY-10-avledede og pSom7 A2A4-avledede fragmenter som angitt ovenfor, ble forbundet med et strukturelt gen som var avsluttet ved hjelp av EcoRI/BamHI, og som utkoder humant proinsulin og som delvis ble fremstilt av foreliggende søk-ere. Kolonne 6 og 7 henholdsvis inneholder som det mørkeste bånd et trp LE' polypeptid-sammensatt protein fra hvilket man kan avspalte B og A-kjedene i det humane insulin. De insulin B og A-strukturelle gener ble oppnådd ved hjelp av en EcoRI og BamHI-nedbrytning av plasmidene pIBI og pIAll henholdsvis, og sammensetningen og konstruksjonen av disse er beskrevet av D.V.Goeddel et al., Proe. Nat'l Acad Sei USA 76, 106 (1979). Kolonne 8 inneholder som tidligere størrelsesmarkører.

Skjønt oppfinnelsen i sin mest foretrukkede utfør-else er beskrevet med henvisning til E. coli, så er det underforstått at man også kan bruke andre bakterier fra bakteriefamilien enterobakteriase som vertsceller for uttrykning og som kilder for trp-operoner, og som eksempelvis kan man nevne Salmonella typhimurium og Serratia marcesans. Oppfinnelsen er således ikke begrenset av de utførelser som her er angitt.

Claims (34)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av polypeptidprodukt ved at man i bakterier får en uttrykning av et strukturelt gen som koder for nevnte polypeptid,: karakterisert ved at man: (a) tilveiebringer en bakteriell inokulant som er transformert med en reproduserbar plasmidisk uttrykningsstruktur som har en sekvens av dobbelttrådet DNA som i fase fra en første 5' til en annen 3' ende av den kodende tråd består av følgende elementer: (i) et bakterielt trp promotor-operator system; (ii) nucleotider som utkoder for en ribosombindende posisjon for oversettelse av element (IV); (iii) nucleotider som utkoder for et oversettelses-startsignal for oversettelse av element (IV); (IV) et strukturelt gen som utkoder aminosyresekven sen for et heterologt polypeptid, og hvor nevnte sekvens hverken innbefatter noen form for evne til trp undertrykning eller nucleotider som utkoder for en trp E ribosombindingsposisjon; b) plassere nevnte transformerte inokulant i et fermen-teringskar og dyrke nevnte inokulant til et forutbe-stemt nivå i et egnet næringsmedium inneholdende tilsatt tryptofan i en så stor mengde at man undertrykker nevnte promotor-operator-system; og c) fjerne nevnte additiv fra nevnte bakterier slik at man opphever under trykningen av nevnte system og frembringer en uttrykning av det produkt som nevnte strukturelle gen utkoder for.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det polypeptid som uttrykkes av nevnte strukturelle gen, er fullstendig heterologt.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det polypeptid som uttrykkes er ,et sammensatt protein bestående av et heterologt polypeptid, og i det minste en del av en aminosyresekvens fra et homologt polypeptid.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at nevnte del er en del av aminosyresekvensen i et enzym som inngår i den biosyntetiske syntesevei fra chorisminsyre til tryptofan.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at det heterologe polypeptid er et bioaktivt polypeptid og at det tilfestede homologe polypeptid er et spesifikt spaltbart bioinaktiveringspolypeptid.

6.. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at det homologe polypeptid er et trp E polypeptid og hvor nevnte ribosombindingsposisjon er ribosombindingsposisjon for trp-leder-polypeptidet.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at det homologe polypeptid er et trp D polypeptid.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at det sammensatte protein innbefatter et heterologt polypeptid og et homologt polypeptid som i seg selv er sammensatt av ca. de første 6 aminosyrene i trp-leder polypeptidet, og aminosyresekvensen som er innkodet av i det minste den distale 3.delen av trp E polypeptidgenet.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at fjerningen av nevnte tryptofan fra nevnte medium utføres ved at man ikke lenger utsetter nevnte additiv og ved at man fortynner fermenteringsmediet hvor nevnte inokulant dyrkes.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at vertsbakterien er E. coli.

11. Plasmidisk uttrykningsstruktur for fremstilling av et heterologt polypeptidprodukt i E.coli-bakterier, karakterisert ved at nevnte struktur har en sekvens av dobbelt-trådet DNA, som i fase fra en første 5' til en annen 3' ende av den kodende tråd bestående av følgende elementer : (a) et bakterielt trp promotor-operatorsystem; (b) nucleotider som koder for en ribosombindingsposisjon for oversettelse av element (IV); (c) nucleotider som utkoder for et oversettelses-startsignal for oversettelse av element (IV); og (d) et strukturelt gen som utkoder aminosyresekvensen i et heterologt polypeptid; og hvor nevnte sekvens hverken innbefatter en evne til en trp undertrykning eller nucleotider som utkoder for en bindingsposisjon for trp E ribosom.

12. Struktur ifølge krav 11, karakterisert ved at det polypeptid som uttrykkes av nevnte strukturelle gen, er fullstendig heterologt.

13. ' Struktur ifølge krav 11, karakterisert ved at det polypeptid som uttrykkes er et sammensatt protein som innbefatter et heterologt polypeptid, og i det minste en del av aminosyresekvensen fra et homologt polypeptid.

14. Struktur ifølge krav 13, karakterisert ved at nevnte del er en del av aminosyresekvensen i det enzym som inngår i den biosyn.tetiske syntesevei fra chorisminsyre til tryptofan.

15. Struktur ifølge krav 14, karakterisert ved at det heterologe polypeptid er et bioaktivt polypep tid, og at det tilfestede homologe polypeptid er et spesifikt spaltbart bioinaktiviseringspolypeptid.

16. Struktur ifølge krav 13, karakterisert ved at det homologe polypeptid er et trp E polypeptid og hvor nevnte bindingsposisjon for nevnte ribosom er bindingsposisjon for ribosomet for . trp-lederpolypeptidet.

17. Struktur ifølge krav 13, karakterisert ved at det homologe polypeptid er trp D polypeptidet.

18. Struktur ifølge krav 16, karakterisert ved at det sammensatte protein innbefatter et heterologt polypeptid og et homologt polypeptid som i seg selv er sammensatt av ca. 6 aminosyrene i trp-lederpolypeptidet og en aminosyresekvens som er innkodet i det minste av distale 3.-del av trp E-polypeptidgenet.

19. Plasmidet pBRHtrp.

20. Plasmidet.pSOM7A2.

21. Plasmidet pHGH207.

22. Plasmidet pHKYl.

23. Plasmidet pSOM7A2A4.

24. Plasmidet pThya7AlA4.

25. Fremgangsmåte for å skape en uttrykningsplasmid for å få uttrykt et heterologt gen, karakterisert ved at man i fase frembringer en samtidig sammenbinding av: (a) et første lineært dobbelt-trådet DNA-fragment som inneholder en replikon og et gen som uttrykker en velgbar egenskap når denne blir plassert under styring av en bakteriell promotor, og hvor nevnte fragment mangler enhver slik promotor; (b) et annen lineært dobbelttrådet DNA-fragment som innbefatter nevnte heterologe gen; (c) et tredje dobbelttrådet DNA-fragment som inneholder en bakteriell promotor; og hvor de sammenbindbare ender av nevnte fragmenter har en sådan konfigurasjon at de ved sammenbinding danner en reproduserbar plasmid både med hensyn til genet for den velgbare egenskapen og for det heterologe gen som kommer under styring av promotoren, hvorved man kan bruke.den velgbare egenskapen for å utvelge transformante bakteriekolonier som er i stand til å uttrykke det heterologe gen.

26. Fremgangsmåte ifølge krav 25, karakterisert ved at den velgbare egenskapet er antibiotikaresistens.

27. Fremgangsmåte ifølge krav 26, karakterisert ved at den velgbare egenskapen er tetracyklin-resistens, og hvor den bakterielle promotor er trp promotoren.

28. Fremgangsmåte ifølge krav 27, karakterisert ved at sammenbindingen rekonstituerer en operon for uttrykning av ampicillinresistens også.

29. Fremgangsmåte for spalting av en dobbelttrådet DNA på ethvert gitt punkt, karakterisert ved at man: (a) omdanner en dobbelttrådet DNA til enkelttrådet DNA i et område som omgir nevnte; (b) hybridiserer til det enkelttrådede området fremstilt som beskrevet under avsnitt (a) ovenfor, en komplementær primer-lengde av en enkelttrådet DNA, og hvor 5' enden på primeren ligger motsatt det nucleotid som ligger inn mot det påtenkte spaltningspunkt ; (c) gjenskaper den del av den annen tråd som ble eliminert i trinn (a) som ligger i 3' retningen fra nevnte primer, ved en reaksjon med DNA-polymerase i nærvær av adenin, tymin, guanin og cytosin-holdig deoksonucleotidtrifosfat; og (d) nedbryter den gjenværende enkelttrådede lengde av DNA som stikker ut forbi det påtenkte spaltningspunkt.

30. Fremgangsmåte ifølge krav 29, karakterisert ved at trinnene (c) og (d) blir utført samtidig ved en reaksjon med DNA-polymerase som polymeriserer i retningen 5' > 3 <1> og som er eksonucleolyttisk i retning av 3 <1> > 5', men ikke-eksonucleolyttisk i retningen 5' > 3'.

31. Fremgangsmåte ifølge krav 30, karakterisert ved at nevnte polymerase er Klenow-polymerase I.

32. Plasmiden pTha7A2.

33. ' Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det heterologe polypeptid innbefatter et innvinnbart polypeptid som er valgt fra gruppen bestående av humant veksthormon, humant proinsulin, somatostatin, tymosin alfa 1, og A-kjeden fra human insulin og B-kjeden fra humant insulin.

34. Struktur ifølge krav 11, karakterisert ved at det heterologe polypeptid innbefatter et innvinnbart polypeptid valgt fra gruppen bestående av humant veksthormon, humant proinsulin, somatotostatin, tymosin alfa 1, og A-og B-kjeden i det humane insulin