JPH05328992A - ペプチドの製造方法 - Google Patents
ペプチドの製造方法Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】 生理活性ペプチド又はその前駆体を、酸性側
に等電点を有する融合蛋白質を経由して製造する方法の
提供。 【構成】 Ａ）融合蛋白Ａ−Ｌ−Ｂ（Ｂは目的ペプチ
ド、Ａは保護ペプチド、Ｌはリンカーペプチド）をコー
ドする遺伝子を発現することができるプラスミドにより
形質転換された宿主細胞を培養し、 Ｂ）該形質転換体の培養菌体を破砕して封入体の不溶性
画分を得、 Ｃ）該不溶性画分を可溶化剤で処理することにより、該
封入体中の融合蛋白を可溶化し、そして Ｄ）該可溶化された融合蛋白の前記リンカーアミノ酸残
基のＣ−末端と前記目的ペプチドのＮ−末端の間のペプ
チド結合を酵素又は化学物質により切断して該目的ペプ
チドを他のペプチドから切り離すことを特徴とする製造
方法。
に等電点を有する融合蛋白質を経由して製造する方法の
提供。 【構成】 Ａ）融合蛋白Ａ−Ｌ−Ｂ（Ｂは目的ペプチ
ド、Ａは保護ペプチド、Ｌはリンカーペプチド）をコー
ドする遺伝子を発現することができるプラスミドにより
形質転換された宿主細胞を培養し、 Ｂ）該形質転換体の培養菌体を破砕して封入体の不溶性
画分を得、 Ｃ）該不溶性画分を可溶化剤で処理することにより、該
封入体中の融合蛋白を可溶化し、そして Ｄ）該可溶化された融合蛋白の前記リンカーアミノ酸残
基のＣ−末端と前記目的ペプチドのＮ−末端の間のペプ
チド結合を酵素又は化学物質により切断して該目的ペプ
チドを他のペプチドから切り離すことを特徴とする製造
方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は生理活性ペプチド又はそ
の前駆体（本発明において目的ペプチドと称する場合が
ある）を、酸性側に等電点を有する融合蛋白質を経由し
て製造する方法に関する。
の前駆体（本発明において目的ペプチドと称する場合が
ある）を、酸性側に等電点を有する融合蛋白質を経由し
て製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】これまで組み換えＤＮＡ技術を用いて、
真核生物由来の生理活性ペプチド又は蛋白質を大腸菌等
の微生物で生産させようとする多くの試みがなされてい
る。この場合、比較的分子量の小さいショートペプチド
を大腸菌などを用いて直接発現系で生産を行うと、ショ
ートペプチドは菌体内で速やかに分解を受けてしまう。
真核生物由来の生理活性ペプチド又は蛋白質を大腸菌等
の微生物で生産させようとする多くの試みがなされてい
る。この場合、比較的分子量の小さいショートペプチド
を大腸菌などを用いて直接発現系で生産を行うと、ショ
ートペプチドは菌体内で速やかに分解を受けてしまう。
【０００３】この分解を押さえるために、一般的に目的
とするペプチドを他の蛋白質あるいはポリペプチド（以
下、保護ペプチドと言う）との融合蛋白として生産させ
た後、化学的あるいは酵素処理を行い、融合蛋白より目
的とするペプチドを特異的に切り出し、その後、分離精
製を行う方法が用いられている。
とするペプチドを他の蛋白質あるいはポリペプチド（以
下、保護ペプチドと言う）との融合蛋白として生産させ
た後、化学的あるいは酵素処理を行い、融合蛋白より目
的とするペプチドを特異的に切り出し、その後、分離精
製を行う方法が用いられている。
【０００４】融合蛋白から目的ペプチドを切り出す方法
として、目的ペプチドがその分子中にメチオニン残基を
含まない場合には保護ペプチドと目的ペプチドの間にリ
ンカーペプチドのＣ−末端アミノ酸としてメチオニン残
基を導入した融合蛋白を生産した後、臭化シアン（ＣＮ
Ｂｒ）処理によりメチオニン残基を開裂させて、目的ペ
プチドを切り出す方法 (Science 198, 1059,(1977), Pr
oc.Natl.Acad.Sci. 76, 106,(1978)）が知られている。
として、目的ペプチドがその分子中にメチオニン残基を
含まない場合には保護ペプチドと目的ペプチドの間にリ
ンカーペプチドのＣ−末端アミノ酸としてメチオニン残
基を導入した融合蛋白を生産した後、臭化シアン（ＣＮ
Ｂｒ）処理によりメチオニン残基を開裂させて、目的ペ
プチドを切り出す方法 (Science 198, 1059,(1977), Pr
oc.Natl.Acad.Sci. 76, 106,(1978)）が知られている。
【０００５】また、目的ペプチド分子内にアルギニン残
基やリジン残基を含まない場合には、リンカーペプチド
のＣ−末端アミノ酸としてアルギニン残基やリジン残基
を保護ペプチドと目的ペプチドの間に導入した融合蛋白
を生産した後、アルギニン残基やリジン残基のＣ−末端
を特異的に切断するトリプシン処理で切り出す方法（Na
ture.285, 456,(1980)）やリジン残基のＣ−末端を特異
的に切り出すリシルエンドペプチダーゼ（アクロモバク
タープロテアーゼ−Ｉ）処理で切り出す方法も場合によ
り目的ペプチドの切り出しに用いることができる。
基やリジン残基を含まない場合には、リンカーペプチド
のＣ−末端アミノ酸としてアルギニン残基やリジン残基
を保護ペプチドと目的ペプチドの間に導入した融合蛋白
を生産した後、アルギニン残基やリジン残基のＣ−末端
を特異的に切断するトリプシン処理で切り出す方法（Na
ture.285, 456,(1980)）やリジン残基のＣ−末端を特異
的に切り出すリシルエンドペプチダーゼ（アクロモバク
タープロテアーゼ−Ｉ）処理で切り出す方法も場合によ
り目的ペプチドの切り出しに用いることができる。
【０００６】融合蛋白を生産させる場合の保護ペプチド
には生産に用いる宿主微生物由来の蛋白質の断片がよく
用いられる。この場合、宿主微生物細胞内で高発現され
ている蛋白質のＮ−末端（アミノ末端側）からの適当な
大きさ（長さ）を持つポリペプチドが用いられている
が、そのポリペプチドの長さが融合蛋白の生産性に大き
く影響を与えることが知られている。
には生産に用いる宿主微生物由来の蛋白質の断片がよく
用いられる。この場合、宿主微生物細胞内で高発現され
ている蛋白質のＮ−末端（アミノ末端側）からの適当な
大きさ（長さ）を持つポリペプチドが用いられている
が、そのポリペプチドの長さが融合蛋白の生産性に大き
く影響を与えることが知られている。
【０００７】例えば、該保護ペプチド領域を小さくして
（短くして）融合蛋白に対する目的ペプチドの割合を大
きくして生産性を向上させることが考えられるが、必ず
しも該保護ペプチド領域を縮小しても目的ペプチドの生
産性が向上するとは限らない。例えば、インスリンを融
合蛋白の一部として大腸菌で生産させた場合、大腸菌β
−ガラクトシダーゼを保護ペプチドとして用い、β−ガ
ラクトシダーゼ領域を縮小させるとインスリンの生産性
は一旦上昇するが、さらに縮小させるとインスリンの生
産性は低下することが知られている (Gene, 29, 251, 1
984)。
（短くして）融合蛋白に対する目的ペプチドの割合を大
きくして生産性を向上させることが考えられるが、必ず
しも該保護ペプチド領域を縮小しても目的ペプチドの生
産性が向上するとは限らない。例えば、インスリンを融
合蛋白の一部として大腸菌で生産させた場合、大腸菌β
−ガラクトシダーゼを保護ペプチドとして用い、β−ガ
ラクトシダーゼ領域を縮小させるとインスリンの生産性
は一旦上昇するが、さらに縮小させるとインスリンの生
産性は低下することが知られている (Gene, 29, 251, 1
984)。
【０００８】このように融合蛋白の一部してある目的の
ペプチドを生産させる場合、保護ペプチドがどれくらい
の大きさであればよいかという定説はなく保護ペプチド
の大きさが融合蛋白の菌体内での安定性に大きく関わっ
ている。一般的には安定な融合蛋白は宿主細胞内で不溶
性の封入体を形成する。言い換えれば融合蛋白を宿主細
胞で高生産させるには安定な封入体を形成させればよい
ことになる。
ペプチドを生産させる場合、保護ペプチドがどれくらい
の大きさであればよいかという定説はなく保護ペプチド
の大きさが融合蛋白の菌体内での安定性に大きく関わっ
ている。一般的には安定な融合蛋白は宿主細胞内で不溶
性の封入体を形成する。言い換えれば融合蛋白を宿主細
胞で高生産させるには安定な封入体を形成させればよい
ことになる。
【０００９】しかし、場合によっては細胞あたりの封入
体の発現量を増加させると封入体が細胞にダメージを与
えることにより、細胞の増殖阻害を引き起こし培養容量
当たりの封入体の生産性が下がることが考えられる。菌
体内での封入体の形成のメカニズムについてはキャサリ
ンの論文 (Biotechnology. 7, 1141 (1989) ）に詳述さ
れているが、封入体形成には多くの要因が関与し、現在
のところまだ定説はなく、工業スケールで融合蛋白を安
定な封入体として菌体内で発現させ高生産を行う方法に
ついても確固たる方法は確立されておらず、この方法の
確立が待たれている。
体の発現量を増加させると封入体が細胞にダメージを与
えることにより、細胞の増殖阻害を引き起こし培養容量
当たりの封入体の生産性が下がることが考えられる。菌
体内での封入体の形成のメカニズムについてはキャサリ
ンの論文 (Biotechnology. 7, 1141 (1989) ）に詳述さ
れているが、封入体形成には多くの要因が関与し、現在
のところまだ定説はなく、工業スケールで融合蛋白を安
定な封入体として菌体内で発現させ高生産を行う方法に
ついても確固たる方法は確立されておらず、この方法の
確立が待たれている。
【００１０】ヒトカルシトニンを融合蛋白として大腸菌
を用いて製造する方法は数多く報告されている。例え
ば、ベネット等はクロラムフェニコールアセチルトラン
スフェラーゼ蛋白とヒトカルシトニン前駆体（ｈＣＴ−
Ｇｌｙ）の融合蛋白を大腸菌で発現し、ヒトカルシトニ
ン前駆体を製造する方法を報告している（特開昭６０−
５０１３９１）。しかし、この方法では融合蛋白４４mg
からわずかに１．１−２．０mgのヒトカルシトニン前駆
体しか得られず効率は低い。
を用いて製造する方法は数多く報告されている。例え
ば、ベネット等はクロラムフェニコールアセチルトラン
スフェラーゼ蛋白とヒトカルシトニン前駆体（ｈＣＴ−
Ｇｌｙ）の融合蛋白を大腸菌で発現し、ヒトカルシトニ
ン前駆体を製造する方法を報告している（特開昭６０−
５０１３９１）。しかし、この方法では融合蛋白４４mg
からわずかに１．１−２．０mgのヒトカルシトニン前駆
体しか得られず効率は低い。
【００１１】一方、本発明者等は大腸菌β−ガラクトシ
ダーゼ由来蛋白とヒトカルシトニン前駆体(hCT-Gly-Lys
-Lys-Arg) との融合蛋白を大腸菌体内で封入体として極
めて効率的に生産させる方法について報告した（特開昭
６４−１０９９９）。さらに本発明者等により、このよ
うにして大腸菌体内で生産した封入体の融合蛋白を尿素
を用いて可溶化した後、Ｖ８プロテアーゼでヒトカルシ
トニン前駆体(hCT-Gly-Lys-Lys-Arg) を融合蛋白より切
り出し、カルボキシペプチダーゼＢを用いてヒトカルシ
トニン前駆体(hCT-Gly-Lys-Lys-Arg) のＣ−末端部のＬ
ｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇを除き、ｈＣＴ−Ｇｌｙを得、さ
らにアフリカツメガエル由来のＣ−末端アミド化酵素を
用い、Ｃ−末端がアミド化されたヒトカルシトニンが効
率よく得られることが示されヒトカルシトニンの製造方
法が開示されている（特開平２−１９０１９３）。しか
しながら、さらに効率的なペプチドの製造方法が望まれ
ている。
ダーゼ由来蛋白とヒトカルシトニン前駆体(hCT-Gly-Lys
-Lys-Arg) との融合蛋白を大腸菌体内で封入体として極
めて効率的に生産させる方法について報告した（特開昭
６４−１０９９９）。さらに本発明者等により、このよ
うにして大腸菌体内で生産した封入体の融合蛋白を尿素
を用いて可溶化した後、Ｖ８プロテアーゼでヒトカルシ
トニン前駆体(hCT-Gly-Lys-Lys-Arg) を融合蛋白より切
り出し、カルボキシペプチダーゼＢを用いてヒトカルシ
トニン前駆体(hCT-Gly-Lys-Lys-Arg) のＣ−末端部のＬ
ｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇを除き、ｈＣＴ−Ｇｌｙを得、さ
らにアフリカツメガエル由来のＣ−末端アミド化酵素を
用い、Ｃ−末端がアミド化されたヒトカルシトニンが効
率よく得られることが示されヒトカルシトニンの製造方
法が開示されている（特開平２−１９０１９３）。しか
しながら、さらに効率的なペプチドの製造方法が望まれ
ている。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は生理
活性ペプチド又はその前駆体を効率的に大量生産できる
方法を提供しようとするものである。
活性ペプチド又はその前駆体を効率的に大量生産できる
方法を提供しようとするものである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、前記の問
題点の解決方法を検討した結果、融合蛋白の生産性を上
げるためには、融合蛋白の等電点がｐＩ４．９からｐＩ
６．９までの領域に入ることが融合蛋白の安定かつ高生
産につながるという事実を初めて実験的に明らかにし、
リンカーペプチド内のアミノ酸を電荷を持ったアミノ酸
（塩基性アミノ酸残基あるいは酸性アミノ酸残基）の数
を調整して融合蛋白自身の等電点をｐＩ４．９からｐＩ
６．９に調整することにより前記の問題点が解決される
という全く新しい知見を得、この知見に基づいてこの発
明を完成した。
題点の解決方法を検討した結果、融合蛋白の生産性を上
げるためには、融合蛋白の等電点がｐＩ４．９からｐＩ
６．９までの領域に入ることが融合蛋白の安定かつ高生
産につながるという事実を初めて実験的に明らかにし、
リンカーペプチド内のアミノ酸を電荷を持ったアミノ酸
（塩基性アミノ酸残基あるいは酸性アミノ酸残基）の数
を調整して融合蛋白自身の等電点をｐＩ４．９からｐＩ
６．９に調整することにより前記の問題点が解決される
という全く新しい知見を得、この知見に基づいてこの発
明を完成した。
【００１４】従って、本発明は、生理活性ペプチド又は
その前駆体（目的ペプチド）の製造方法であって Ａ）次の式で表される融合蛋白： Ａ−Ｌ−Ｂ （式中、Ｂは目的ペプチドであり、Ａは９０〜２００個
のアミノ酸残基からなる保護ペプチドであり、そしてＬ
は該保護ペプチドのＣ−末端と該目的ペプチドのＮ−末
端との間に位置するリンカーペプチドであり、かつ該融
合蛋白を酵素または化学物質により処理した場合に前記
目的ペプチドが切り離されるように選択されており、Ａ
−Ｌ−Ｂの融合蛋白の全体の等電点が４．９〜６．９の
範囲にあるように該保護ペプチド及びリンカーペプチド
が選択されている）をコードする遺伝子を発現すること
ができるプラスミドにより形質転換された宿主細胞を培
養し、 Ｂ）該大腸菌形質転換体の培養菌体を破砕して封入体の
不溶性画分を得、 Ｃ）不溶性画分を可溶化剤で処理することにより、封入
体中の融合蛋白を可溶化し、そして Ｄ）該可溶化された融合蛋白の前記リンカーアミノ酸残
基のＣ−末端と前記目的ペプチドのＮ−末端の間のペプ
チド結合を酵素又は化学物質により切断して該目的ペプ
チドを他のペプチドから切り離すことを特徴とする方法
を提供するものである。
その前駆体（目的ペプチド）の製造方法であって Ａ）次の式で表される融合蛋白： Ａ−Ｌ−Ｂ （式中、Ｂは目的ペプチドであり、Ａは９０〜２００個
のアミノ酸残基からなる保護ペプチドであり、そしてＬ
は該保護ペプチドのＣ−末端と該目的ペプチドのＮ−末
端との間に位置するリンカーペプチドであり、かつ該融
合蛋白を酵素または化学物質により処理した場合に前記
目的ペプチドが切り離されるように選択されており、Ａ
−Ｌ−Ｂの融合蛋白の全体の等電点が４．９〜６．９の
範囲にあるように該保護ペプチド及びリンカーペプチド
が選択されている）をコードする遺伝子を発現すること
ができるプラスミドにより形質転換された宿主細胞を培
養し、 Ｂ）該大腸菌形質転換体の培養菌体を破砕して封入体の
不溶性画分を得、 Ｃ）不溶性画分を可溶化剤で処理することにより、封入
体中の融合蛋白を可溶化し、そして Ｄ）該可溶化された融合蛋白の前記リンカーアミノ酸残
基のＣ−末端と前記目的ペプチドのＮ−末端の間のペプ
チド結合を酵素又は化学物質により切断して該目的ペプ
チドを他のペプチドから切り離すことを特徴とする方法
を提供するものである。
【００１５】
【具体的な説明】本発明の方法は生理活性ペプチド（目
的ペプチド）の融合蛋白、特にその封入体を経由して製
造するために適用することができ、このようなペプチド
として本発明において具体的に説明するヒトカルシトニ
ンのほかにヒト以外のカルシトニン及びその前駆体、Ａ
ＮＰ，ＢＮＰ，ＣＮＰ等のナトリウム利尿ペプチド（Ｎ
Ｐ）、細胞増殖因子、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）等を
あげることができるが、これらに限定されるものではな
い。
的ペプチド）の融合蛋白、特にその封入体を経由して製
造するために適用することができ、このようなペプチド
として本発明において具体的に説明するヒトカルシトニ
ンのほかにヒト以外のカルシトニン及びその前駆体、Ａ
ＮＰ，ＢＮＰ，ＣＮＰ等のナトリウム利尿ペプチド（Ｎ
Ｐ）、細胞増殖因子、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）等を
あげることができるが、これらに限定されるものではな
い。
【００１６】本発明における保護ペプチドは、宿主が本
来有するペプチドであることが好ましい。例えば宿主と
して大腸菌を用いる場合には大腸菌β−ガラクトシダー
ゼ又はその部分を用いるのが好ましい。大腸菌β−ガラ
クトシダーゼの部分を用いる場合にはそのＮ−末端部分
を用いるのが好ましく、例えばＮ−末端側の９０〜２１
０個のアミノ酸から成るものが好ましい。特に好ましい
保護ペプチドは大腸菌β−ガラクトシダーゼのＮ−末端
の１位から９７位までのアミノ酸から成るペプチドであ
る。さらに好ましいのは、この９７個のアミノ酸残基か
ら成るペプチドにおいてシステイン残基がセリン残基に
置き換えられているものであり、最も好ましくは、前記
９７個のアミノ酸残基から成るペプチドにおいてシステ
イン残基がセリン残基に置き換えられておりさらに４個
のグルタミン酸残基がアスパラギン酸残基に置き換えら
れているものである。
来有するペプチドであることが好ましい。例えば宿主と
して大腸菌を用いる場合には大腸菌β−ガラクトシダー
ゼ又はその部分を用いるのが好ましい。大腸菌β−ガラ
クトシダーゼの部分を用いる場合にはそのＮ−末端部分
を用いるのが好ましく、例えばＮ−末端側の９０〜２１
０個のアミノ酸から成るものが好ましい。特に好ましい
保護ペプチドは大腸菌β−ガラクトシダーゼのＮ−末端
の１位から９７位までのアミノ酸から成るペプチドであ
る。さらに好ましいのは、この９７個のアミノ酸残基か
ら成るペプチドにおいてシステイン残基がセリン残基に
置き換えられているものであり、最も好ましくは、前記
９７個のアミノ酸残基から成るペプチドにおいてシステ
イン残基がセリン残基に置き換えられておりさらに４個
のグルタミン酸残基がアスパラギン酸残基に置き換えら
れているものである。
【００１７】本発明の方法は、目的ペプチドを、４．９
〜６．９の間の等電点を有する融合蛋白の形で生成せし
めることを特徴としている。この場合、融合蛋白の等電
点は、そのアミノ酸配列から次の様にして算出すること
ができる。なお、等電点の計算方法はTrends in Analyt
ical Chemistry, Vol ５，No４, 82〜83頁（1986）に記
載されている方法によればよく、例えばこの方法に基い
て作成されたＤＮＡＳＩＳ（日立製造所）の等電点予測
プログラムを用いることができる。
〜６．９の間の等電点を有する融合蛋白の形で生成せし
めることを特徴としている。この場合、融合蛋白の等電
点は、そのアミノ酸配列から次の様にして算出すること
ができる。なお、等電点の計算方法はTrends in Analyt
ical Chemistry, Vol ５，No４, 82〜83頁（1986）に記
載されている方法によればよく、例えばこの方法に基い
て作成されたＤＮＡＳＩＳ（日立製造所）の等電点予測
プログラムを用いることができる。
【００１８】融合蛋白の等電点を上記の範囲に調整する
には、目的ペプチドのアミノ酸を変更することはできな
いから、保護ペプチド及び／又はリンカーペプチドアミ
ノ酸残基の調整により行う。この場合、保護ペプチド及
び／又はリンカーペプチドとして、目的ペプチドとの融
合蛋白として前記の等電点を与えるような天然ペプチド
又はその部分を選択することができる。他の方法として
は、天然ペプチド又はその部分のアミノ酸残基の置換、
除去又は導入により融合蛋白の等電点を調整することが
できる。
には、目的ペプチドのアミノ酸を変更することはできな
いから、保護ペプチド及び／又はリンカーペプチドアミ
ノ酸残基の調整により行う。この場合、保護ペプチド及
び／又はリンカーペプチドとして、目的ペプチドとの融
合蛋白として前記の等電点を与えるような天然ペプチド
又はその部分を選択することができる。他の方法として
は、天然ペプチド又はその部分のアミノ酸残基の置換、
除去又は導入により融合蛋白の等電点を調整することが
できる。
【００１９】この調整においては、酸性アミノ酸である
アスパラギン酸残基もしくはグルタミン酸残基の導入も
しくは除去、塩基性アミノ酸であるアルギニン残基もし
くはリジン残基の導入もしくは除去、又はこれらのアミ
ノ酸による他のアミノ酸の置換、あるいはこれらのアミ
ノ酸操作の組合せを用いることができる。前記のごと
く、融合蛋白の等電点は保護ペプチド及びリンカーペプ
チドのいずれか一方、又はその両者により行うことがで
きる。
アスパラギン酸残基もしくはグルタミン酸残基の導入も
しくは除去、塩基性アミノ酸であるアルギニン残基もし
くはリジン残基の導入もしくは除去、又はこれらのアミ
ノ酸による他のアミノ酸の置換、あるいはこれらのアミ
ノ酸操作の組合せを用いることができる。前記のごと
く、融合蛋白の等電点は保護ペプチド及びリンカーペプ
チドのいずれか一方、又はその両者により行うことがで
きる。
【００２０】この様なペプチドとして、ｐＢＲ３２２由
来のテトラサイクリン耐性遺伝子の４０３位〜４９５位
の塩基配列によりコードされ得るペプチド又はその部分
を用いることができる。図１及び配列番号：１に示すご
とく、この遺伝子領域には、３３個のアミノ酸残基中に
１０個のアルギニン残基をコードすることが可能であ
り、この領域中の種々部分を用いることにより、異る数
のアルギニン残基を含有する種々のリンカーペプチドを
得ることができる。この場合、１個以上、好ましくは３
個以上、特に好ましくは３〜８個のアルギニン残基を含
む部分を用いるのが好ましい。
来のテトラサイクリン耐性遺伝子の４０３位〜４９５位
の塩基配列によりコードされ得るペプチド又はその部分
を用いることができる。図１及び配列番号：１に示すご
とく、この遺伝子領域には、３３個のアミノ酸残基中に
１０個のアルギニン残基をコードすることが可能であ
り、この領域中の種々部分を用いることにより、異る数
のアルギニン残基を含有する種々のリンカーペプチドを
得ることができる。この場合、１個以上、好ましくは３
個以上、特に好ましくは３〜８個のアルギニン残基を含
む部分を用いるのが好ましい。
【００２１】融合蛋白から目的ペプチドを切り出すため
には、リンカーペプチドのＣ−末端には酵素的又は化学
的に開裂され得るアミノ酸残基が存在する必要がある。
これらのアミノ酸残基として、例えば、トリプシンによ
る切断のためのアルギニン残基又はリジン残基、リシル
エンドペプチダーゼによる切断のためのリジン残基、Ｖ
８プロテアーゼによる切断のためのグルタミン残基、臭
化シアンで切断するためのメチオニン残基等が用いられ
る。
には、リンカーペプチドのＣ−末端には酵素的又は化学
的に開裂され得るアミノ酸残基が存在する必要がある。
これらのアミノ酸残基として、例えば、トリプシンによ
る切断のためのアルギニン残基又はリジン残基、リシル
エンドペプチダーゼによる切断のためのリジン残基、Ｖ
８プロテアーゼによる切断のためのグルタミン残基、臭
化シアンで切断するためのメチオニン残基等が用いられ
る。
【００２２】次に、融合蛋白質を発現するプラスミドの
作製を、目的ペプチドがヒトカルシトニン前駆体である
場合を例にとって説明する。ヒトカルシトニンのアミノ
酸配列とそのＣ−末端に追加されたグリシン残基とから
成るヒトカルシトニン前駆体を種々のリンカーを含む融
合蛋白として発現させるための発現プラスミドを作製す
るための出発プラスミドとしてプラスミドｐＧ９７Ｓ４
ＤｈＣＴ〔Ｇ〕を用いる。
作製を、目的ペプチドがヒトカルシトニン前駆体である
場合を例にとって説明する。ヒトカルシトニンのアミノ
酸配列とそのＣ−末端に追加されたグリシン残基とから
成るヒトカルシトニン前駆体を種々のリンカーを含む融
合蛋白として発現させるための発現プラスミドを作製す
るための出発プラスミドとしてプラスミドｐＧ９７Ｓ４
ＤｈＣＴ〔Ｇ〕を用いる。
【００２３】このプラスミドにおいては、図２に示すご
とく、大腸菌β−ガラクトシダーゼのＮ−末端の９７個
のアミノ酸からなりこの中のシステイン残基がセリン残
基に置き換えられておりさらに４個のグルタミン酸残基
がアスパラギン酸残基に置き換えられている保護ペプチ
ドをコードする構造遺伝子（βｇａｌ９７Ｓ４Ｄ）とヒ
トカルシトニン前駆体の構造遺伝子とがＥcoＲＩ及びＸ
ｈｏＩ認識部位を介して連結されており、この融合蛋白
をコードする構造遺伝子はｌａｃプロモーターの制御下
にある。さらにこのプラスミドはテトラサイクリン耐性
遺伝子マーカーを含有する。
とく、大腸菌β−ガラクトシダーゼのＮ−末端の９７個
のアミノ酸からなりこの中のシステイン残基がセリン残
基に置き換えられておりさらに４個のグルタミン酸残基
がアスパラギン酸残基に置き換えられている保護ペプチ
ドをコードする構造遺伝子（βｇａｌ９７Ｓ４Ｄ）とヒ
トカルシトニン前駆体の構造遺伝子とがＥcoＲＩ及びＸ
ｈｏＩ認識部位を介して連結されており、この融合蛋白
をコードする構造遺伝子はｌａｃプロモーターの制御下
にある。さらにこのプラスミドはテトラサイクリン耐性
遺伝子マーカーを含有する。
【００２４】このプラスミドは特開平２−１９０１９３
に記載されているプラスミドｐＧ９７ＳＨＰＣＴＬＥ
〔Ｇ〕に由来するものであり、前記プラスミドｐＧ９７
Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕を含有する大腸菌Ｗ３１１０株は、
Eschevichia coli SBM323 として、工業技術院微生物工
業技術研究所に１９９１年８月８日に、ブダペスト条約
に基き寄託されており、受託番号微工研条寄第３５０３
号（ＦＥＲＭ ＢＰ−３５０３）が付与されている。
に記載されているプラスミドｐＧ９７ＳＨＰＣＴＬＥ
〔Ｇ〕に由来するものであり、前記プラスミドｐＧ９７
Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕を含有する大腸菌Ｗ３１１０株は、
Eschevichia coli SBM323 として、工業技術院微生物工
業技術研究所に１９９１年８月８日に、ブダペスト条約
に基き寄託されており、受託番号微工研条寄第３５０３
号（ＦＥＲＭ ＢＰ−３５０３）が付与されている。
【００２５】プラスミドｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕に
よりコードされている融合蛋白は、β−ガラクトシダー
ゼのＮ−末端末の９７個のアミノ酸から成りこの中でシ
ステイン残基がセリン残基に置き換えられておりさらに
４個のグルタミン酸残基がアスパラギン酸残基に置き換
えられている保護ペプチドと前記ヒトカルシトニン前駆
体とから成り、その発現は非常に低く、その等電点は
４．４３であった。従って、広範囲の等電点にわたる種
々の融合蛋白を発現させるため、前記β−ガラクトシダ
ーゼ遺伝子とヒトカルシトニン前駆体遺伝子との間に、
ＥcoＲＩ−ＸｈｏＩ部位を用いて、種々の等電点リンカ
ーペプチドをコードするＤＮＡを挿入する。
よりコードされている融合蛋白は、β−ガラクトシダー
ゼのＮ−末端末の９７個のアミノ酸から成りこの中でシ
ステイン残基がセリン残基に置き換えられておりさらに
４個のグルタミン酸残基がアスパラギン酸残基に置き換
えられている保護ペプチドと前記ヒトカルシトニン前駆
体とから成り、その発現は非常に低く、その等電点は
４．４３であった。従って、広範囲の等電点にわたる種
々の融合蛋白を発現させるため、前記β−ガラクトシダ
ーゼ遺伝子とヒトカルシトニン前駆体遺伝子との間に、
ＥcoＲＩ−ＸｈｏＩ部位を用いて、種々の等電点リンカ
ーペプチドをコードするＤＮＡを挿入する。
【００２６】この様なリンカーペプチドとしては、プラ
スミドｐＢＲ３２２のヌクレオチド位置８６−１２７３
のテトラサイクリン耐性遺伝子由来の遺伝子によりコー
ドされ得る３３個のアミノ酸からなるペプチド、又はそ
の部分を用いるのが便利である。このペプチド領域には
１０個のアルギニン残基が分布しており、この中の適当
な部分をリンカーペプチドとして用いることにより、種
々の等電点を有する融合蛋白を得ることができる。
スミドｐＢＲ３２２のヌクレオチド位置８６−１２７３
のテトラサイクリン耐性遺伝子由来の遺伝子によりコー
ドされ得る３３個のアミノ酸からなるペプチド、又はそ
の部分を用いるのが便利である。このペプチド領域には
１０個のアルギニン残基が分布しており、この中の適当
な部分をリンカーペプチドとして用いることにより、種
々の等電点を有する融合蛋白を得ることができる。
【００２７】このペプチド領域から得られるリンカーペ
プチド及びそれをコードするヌクレオチド配列を図１に
示す。これらのリンカーペプチドをコードする遺伝子
は、プラスミドｐＢＲ３２２から適当な制限酵素で切り
出すことにより、又は常法に従って化学合成することに
より得られる。これらのリンカーペプチドＲ1 ，Ｒ3 ，
Ｒ4 ，Ｒ5 ，Ｒ6 ，Ｒ8 及びＲ10は、それぞれ、１，
３，４，５，６，８、及び１０個のアルギニン残基を含
んでいる。これらのリンカーペプチドをコードする遺伝
子が、前記プラスミドｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕中の
ＥcoＲＩ−ＸｈｏＩ部位に挿入された発現プラスミドを
それぞれ、ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ１，ｐＧ９７
Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ３，ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕
Ｒ４，ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ５，ｐＧ９７Ｓ４
ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ６，ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ
８、及びｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ１０と称する。
プチド及びそれをコードするヌクレオチド配列を図１に
示す。これらのリンカーペプチドをコードする遺伝子
は、プラスミドｐＢＲ３２２から適当な制限酵素で切り
出すことにより、又は常法に従って化学合成することに
より得られる。これらのリンカーペプチドＲ1 ，Ｒ3 ，
Ｒ4 ，Ｒ5 ，Ｒ6 ，Ｒ8 及びＲ10は、それぞれ、１，
３，４，５，６，８、及び１０個のアルギニン残基を含
んでいる。これらのリンカーペプチドをコードする遺伝
子が、前記プラスミドｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕中の
ＥcoＲＩ−ＸｈｏＩ部位に挿入された発現プラスミドを
それぞれ、ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ１，ｐＧ９７
Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ３，ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕
Ｒ４，ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ５，ｐＧ９７Ｓ４
ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ６，ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ
８、及びｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ１０と称する。
【００２８】また、前記出発プラスミド及びこれらのプ
ラスミドにより形質転換して得られる大腸菌Ｗ３１１０
株を、それぞれＷ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ
〔Ｇ〕，Ｗ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ
１，Ｗ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ３，Ｗ
３１１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ４，Ｗ３１１
０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ５，Ｗ３１１０／ｐ
Ｇ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ６，Ｗ３１１０／ｐＧ９７
Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ８，Ｗ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４Ｄ
ｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ１０と称する。
ラスミドにより形質転換して得られる大腸菌Ｗ３１１０
株を、それぞれＷ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ
〔Ｇ〕，Ｗ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ
１，Ｗ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ３，Ｗ
３１１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ４，Ｗ３１１
０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ５，Ｗ３１１０／ｐ
Ｇ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ６，Ｗ３１１０／ｐＧ９７
Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ８，Ｗ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４Ｄ
ｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ１０と称する。
【００２９】これらの菌株が生産する融合蛋白の等電点
を計算すると Ｗ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕（リンカー領
域のアルギン残基数＝０）；等電点＝４．４３，Ｗ３１
１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ１（リンカー領域
のアルギン残基数＝１）；等電点＝４．７０，Ｗ３１１
０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ３（リンカー領域の
アルギン残基数＝３）；等電点＝４．９０，Ｗ３１１０
／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ４（リンカー領域のア
ルギン残基数＝４）；等電点＝５．８０，Ｗ３１１０／
ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ５（リンカー領域のアル
ギン残基数＝５）；等電点＝５．９１，Ｗ３１１０／ｐ
Ｇ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ６（リンカー領域のアルギ
ン残基数＝６）；等電点＝６．０１，Ｗ３１１０／ｐＧ
９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ８（リンカー領域のアルギン
残基数＝８）；等電点＝６．８３、及びＷ３１１０／ｐ
Ｇ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ１０（リンカー領域のアル
ギン残基数＝１０）；等電点＝７．８５となる。
を計算すると Ｗ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕（リンカー領
域のアルギン残基数＝０）；等電点＝４．４３，Ｗ３１
１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ１（リンカー領域
のアルギン残基数＝１）；等電点＝４．７０，Ｗ３１１
０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ３（リンカー領域の
アルギン残基数＝３）；等電点＝４．９０，Ｗ３１１０
／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ４（リンカー領域のア
ルギン残基数＝４）；等電点＝５．８０，Ｗ３１１０／
ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ５（リンカー領域のアル
ギン残基数＝５）；等電点＝５．９１，Ｗ３１１０／ｐ
Ｇ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ６（リンカー領域のアルギ
ン残基数＝６）；等電点＝６．０１，Ｗ３１１０／ｐＧ
９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ８（リンカー領域のアルギン
残基数＝８）；等電点＝６．８３、及びＷ３１１０／ｐ
Ｇ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ１０（リンカー領域のアル
ギン残基数＝１０）；等電点＝７．８５となる。
【００３０】上記に示した等電点４．４３から７．８５
までの融合蛋白を生産する大腸菌株を培養し、細胞数あ
たりの融合蛋白の生産量をＳＤＳポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動で調べてみたところ、Ｗ３１１０／ｐＧ９７
Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕；等電点＝４．４３の菌株及びＷ３
１１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ１；等電点＝
４．７０の菌株はわずかの融合蛋白を生産し、そのほか
の菌株は菌体内に大量の融合蛋白の封入体を生産してい
ることが明らかになった。したがって、融合蛋白の等電
点が４．５〜４．７付近以下になると融合蛋白の生産性
及びその封入体の生産量が悪くなることがこの結果より
示されたことになる。
までの融合蛋白を生産する大腸菌株を培養し、細胞数あ
たりの融合蛋白の生産量をＳＤＳポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動で調べてみたところ、Ｗ３１１０／ｐＧ９７
Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕；等電点＝４．４３の菌株及びＷ３
１１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ１；等電点＝
４．７０の菌株はわずかの融合蛋白を生産し、そのほか
の菌株は菌体内に大量の融合蛋白の封入体を生産してい
ることが明らかになった。したがって、融合蛋白の等電
点が４．５〜４．７付近以下になると融合蛋白の生産性
及びその封入体の生産量が悪くなることがこの結果より
示されたことになる。
【００３１】さらにＷ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ
〔Ｇ〕Ｒ１０；等電点＝７．８５の菌株では細胞数あた
りの融合蛋白の生産性は他の菌株と同程度であるが、培
養時における最終菌体濃度が他の菌株の半分しかならな
いことが明らかになった。これは融合蛋白の等電点が弱
アルカリ性の７．８５であることから、細胞あたりの融
合蛋白生成能は上がったが、急速に封入体を形成した為
かあるいは融合蛋白の等電点が弱アルカリ性である為か
の理由により細胞増殖阻害を引き起こし、結果として最
終細胞濃度が増加しなかったと考えられる。
〔Ｇ〕Ｒ１０；等電点＝７．８５の菌株では細胞数あた
りの融合蛋白の生産性は他の菌株と同程度であるが、培
養時における最終菌体濃度が他の菌株の半分しかならな
いことが明らかになった。これは融合蛋白の等電点が弱
アルカリ性の７．８５であることから、細胞あたりの融
合蛋白生成能は上がったが、急速に封入体を形成した為
かあるいは融合蛋白の等電点が弱アルカリ性である為か
の理由により細胞増殖阻害を引き起こし、結果として最
終細胞濃度が増加しなかったと考えられる。
【００３２】以上の結果より、融合蛋白を封入蛋白とし
て大腸菌体内で安定にかつ高生産させるには、融合蛋白
の等電点が４．９から６．９の間の酸性領域に入ること
が重要であることが本発明者等により初めて明らかにさ
れた。次に、本発明者等はこのようにして大腸菌体内で
生産されたヒトカルシトニン前駆体の融合蛋白の封入体
から効率よくヒトカルシトニン前駆体（ｈＣＴ−Ｇｌ
ｙ）の分離精製を行い、さらにアフリカツメガエル
（Ｘ．ｌａｅｖｉｓ）由来のアミド化酵素を用いてＣ−
末端がアミド化されたヒトカルシトニンが効率よく製造
できることを明らかにした。
て大腸菌体内で安定にかつ高生産させるには、融合蛋白
の等電点が４．９から６．９の間の酸性領域に入ること
が重要であることが本発明者等により初めて明らかにさ
れた。次に、本発明者等はこのようにして大腸菌体内で
生産されたヒトカルシトニン前駆体の融合蛋白の封入体
から効率よくヒトカルシトニン前駆体（ｈＣＴ−Ｇｌ
ｙ）の分離精製を行い、さらにアフリカツメガエル
（Ｘ．ｌａｅｖｉｓ）由来のアミド化酵素を用いてＣ−
末端がアミド化されたヒトカルシトニンが効率よく製造
できることを明らかにした。
【００３３】本発明の他の例として、融合蛋白質を発現
するプラスミドの作製を、目的ペプチドがヒトC-type n
atriuretic peptide-22 （Ｃ−タイプナトリウム利尿ペ
プチド：以下ヒトＣＮＰ−２２と略す）（配列番号：１
０）である場合を例にとって説明する。２２個のアミノ
酸よりなるヒトＣＮＰ−２２を種々のリンカーを含む融
合蛋白として発現させるための発現プラスミドを作製す
るための出発プラスミドとしてプラスミドｐＧ９７Ｓ４
ＤｈＣＮＰ−２２を用いた。
するプラスミドの作製を、目的ペプチドがヒトC-type n
atriuretic peptide-22 （Ｃ−タイプナトリウム利尿ペ
プチド：以下ヒトＣＮＰ−２２と略す）（配列番号：１
０）である場合を例にとって説明する。２２個のアミノ
酸よりなるヒトＣＮＰ−２２を種々のリンカーを含む融
合蛋白として発現させるための発現プラスミドを作製す
るための出発プラスミドとしてプラスミドｐＧ９７Ｓ４
ＤｈＣＮＰ−２２を用いた。
【００３４】このプラスミドは図１０に示すごとく、大
腸菌β−ガラクトシダーゼのＮ末端の９７個のアミノ酸
よりなり、この中のシステイン残基がセリン残基に置き
換えられ、さらに４個のグルタミン酸残基がアスパラギ
ン酸残基に置き換えられている保護ペプチドをコードす
る構造遺伝子（β−ｇａｌ９７Ｓ４Ｄ）とヒトＣＮＰ−
２２の構造遺伝子とがＥcoＲＩおよびＸｈｏＩ制限酵素
認識部位を介して連結され、この融合蛋白をコードする
構造遺伝子はｌａｃプロモーターの制御下にある。さら
にこのプラスミドはテトラサイクリン耐性遺伝子マーカ
ーを含む。このｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２２発現プラ
スミドを作製するにあたりヒトＣＮＰ−２２遺伝子及び
当該遺伝子を調製するのに使用したプラスミドｐＵＣＣ
ＮＰ１は特開平４−１３９１９９に開示されている。ま
た保護ペプチドをコードするプラスミドとして用いたｐ
Ｇ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔ＧＲＲＲ〕は実質的に前述のｐＧ
９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕と同じである。
腸菌β−ガラクトシダーゼのＮ末端の９７個のアミノ酸
よりなり、この中のシステイン残基がセリン残基に置き
換えられ、さらに４個のグルタミン酸残基がアスパラギ
ン酸残基に置き換えられている保護ペプチドをコードす
る構造遺伝子（β−ｇａｌ９７Ｓ４Ｄ）とヒトＣＮＰ−
２２の構造遺伝子とがＥcoＲＩおよびＸｈｏＩ制限酵素
認識部位を介して連結され、この融合蛋白をコードする
構造遺伝子はｌａｃプロモーターの制御下にある。さら
にこのプラスミドはテトラサイクリン耐性遺伝子マーカ
ーを含む。このｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２２発現プラ
スミドを作製するにあたりヒトＣＮＰ−２２遺伝子及び
当該遺伝子を調製するのに使用したプラスミドｐＵＣＣ
ＮＰ１は特開平４−１３９１９９に開示されている。ま
た保護ペプチドをコードするプラスミドとして用いたｐ
Ｇ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔ＧＲＲＲ〕は実質的に前述のｐＧ
９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕と同じである。
【００３５】プラスミドｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２２
によりコードされている融合蛋白の等電点は４．５６で
あり、先に示した融合蛋白の高発現のためには融合蛋白
の等電点がｐＩ＝４．９−６．９の領域に入ることが望
ましいという観点から考えると融合蛋白の高生産は期待
できないと考えられる。そこで、等電点４．９−６．９
にわたる種々の融合蛋白をデザインし融合蛋白を大腸菌
体内で大量に発現させる目的で前記β−ガラクトシダー
ゼ遺伝子とヒトＣＮＰ遺伝子の間のＥcoＲＩ−ＸｈｏＩ
領域に種々の塩基性アミノ酸をコードするリンカーペプ
チド遺伝子を挿入することを検討した。
によりコードされている融合蛋白の等電点は４．５６で
あり、先に示した融合蛋白の高発現のためには融合蛋白
の等電点がｐＩ＝４．９−６．９の領域に入ることが望
ましいという観点から考えると融合蛋白の高生産は期待
できないと考えられる。そこで、等電点４．９−６．９
にわたる種々の融合蛋白をデザインし融合蛋白を大腸菌
体内で大量に発現させる目的で前記β−ガラクトシダー
ゼ遺伝子とヒトＣＮＰ遺伝子の間のＥcoＲＩ−ＸｈｏＩ
領域に種々の塩基性アミノ酸をコードするリンカーペプ
チド遺伝子を挿入することを検討した。
【００３６】このようなリンカーペプチドとしては塩基
性アミノ酸をコードする遺伝子を人為的にデザインし化
学的に合成する方法が可能である。図１１に塩基性アミ
ノ酸をコードするリンカーペプチド遺伝子のデザインと
化学的に合成した遺伝子配列を示す。これらのリンカー
ペプチドＲ３−２〔配列番号１３および１４〕、Ｒ５−
２〔配列番号１５および１６〕並びにＲ５−３〔配列番
号１７および１８〕はそれぞれ３個、５個および５個の
アルギニン残基を含んでいる。これらのリンカーペプチ
ドをコードする遺伝子が前記ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−
２２中のＥcoＲＩ−ＸｈｏＩ領域部位に挿入された発現
プラスミドをそれぞれｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２２Ｒ
３−２，ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２２Ｒ５−２および
ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２２Ｒ５−３と称する。
性アミノ酸をコードする遺伝子を人為的にデザインし化
学的に合成する方法が可能である。図１１に塩基性アミ
ノ酸をコードするリンカーペプチド遺伝子のデザインと
化学的に合成した遺伝子配列を示す。これらのリンカー
ペプチドＲ３−２〔配列番号１３および１４〕、Ｒ５−
２〔配列番号１５および１６〕並びにＲ５−３〔配列番
号１７および１８〕はそれぞれ３個、５個および５個の
アルギニン残基を含んでいる。これらのリンカーペプチ
ドをコードする遺伝子が前記ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−
２２中のＥcoＲＩ−ＸｈｏＩ領域部位に挿入された発現
プラスミドをそれぞれｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２２Ｒ
３−２，ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２２Ｒ５−２および
ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２２Ｒ５−３と称する。
【００３７】また前記出発プラスミドおよびこれらのプ
ラスミドにより形質転換して得られる大腸菌Ｗ３１１０
株をそれぞれＷ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２
２，Ｗ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２２Ｒ３−
２，Ｗ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２２Ｒ５−
２およびＷ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２２Ｒ
５−３と称する。
ラスミドにより形質転換して得られる大腸菌Ｗ３１１０
株をそれぞれＷ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２
２，Ｗ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２２Ｒ３−
２，Ｗ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２２Ｒ５−
２およびＷ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２２Ｒ
５−３と称する。
【００３８】これらの菌株が生産する融合蛋白の等電点
を計算すると、Ｗ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−
２２（リンカー領域のアルギニン残基数＝０）；等電点
＝４．５６、Ｗ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２
２Ｒ３−２（リンカー領域のアルギニン残基数＝３）；
等電点＝４．９５、Ｗ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＮ
Ｐ−２２Ｒ５−２（リンカー領域のアルギニン残基数＝
５）；等電点＝６．２２、Ｗ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４Ｄ
ｈＣＮＰ−２２Ｒ５−３（リンカー領域のアルギニン残
基数＝５）；等電点＝５．５９となる。
を計算すると、Ｗ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−
２２（リンカー領域のアルギニン残基数＝０）；等電点
＝４．５６、Ｗ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２
２Ｒ３−２（リンカー領域のアルギニン残基数＝３）；
等電点＝４．９５、Ｗ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＮ
Ｐ−２２Ｒ５−２（リンカー領域のアルギニン残基数＝
５）；等電点＝６．２２、Ｗ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４Ｄ
ｈＣＮＰ−２２Ｒ５−３（リンカー領域のアルギニン残
基数＝５）；等電点＝５．５９となる。
【００３９】上に示した等電点４．５６から６．２２ま
での融合蛋白を生産する大腸菌株を培養し細胞あたりの
融合蛋白の生産量をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気
泳動法で調べてみたところ、Ｗ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４
ＤｈＣＮＰ−２２株（融合蛋白の等電点＝４．５６）の
融合蛋白の生産量はさほど高くなかったが、融合蛋白の
等電点をｐＩ４．９５−６．２２まで上げた菌株ではＷ
３１１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２２株に比べて融
合蛋白の発現量が高くなっていることが明らかになっ
た。
での融合蛋白を生産する大腸菌株を培養し細胞あたりの
融合蛋白の生産量をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気
泳動法で調べてみたところ、Ｗ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４
ＤｈＣＮＰ−２２株（融合蛋白の等電点＝４．５６）の
融合蛋白の生産量はさほど高くなかったが、融合蛋白の
等電点をｐＩ４．９５−６．２２まで上げた菌株ではＷ
３１１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２２株に比べて融
合蛋白の発現量が高くなっていることが明らかになっ
た。
【００４０】特に、等電点が５．５９のＷ３１１０／ｐ
Ｇ９７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２２Ｒ５−２株および等電点が
６．２２のＷ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２２
Ｒ５−３株ではＷ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−
２２株に比べ融合蛋白を高発現していることが明らかに
なった（図１４参照）。このヒトＣＮＰ−２２の場合に
おいても、融合蛋白の等電点が４．９から６．９の範囲
に入ることにより融合蛋白の生産性が良くなることが示
された。さらに、本発明者等はこのようにして大腸菌体
内で生産された融合蛋白の封入体からヒトＣＮＰ−２２
がＶ８プロテアーゼを用いて効率良く切り出され、ヒト
ＣＮＰ−２２が効率良く製造できることを明らかにし本
発明の有用性を示した。
Ｇ９７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２２Ｒ５−２株および等電点が
６．２２のＷ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２２
Ｒ５−３株ではＷ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−
２２株に比べ融合蛋白を高発現していることが明らかに
なった（図１４参照）。このヒトＣＮＰ−２２の場合に
おいても、融合蛋白の等電点が４．９から６．９の範囲
に入ることにより融合蛋白の生産性が良くなることが示
された。さらに、本発明者等はこのようにして大腸菌体
内で生産された融合蛋白の封入体からヒトＣＮＰ−２２
がＶ８プロテアーゼを用いて効率良く切り出され、ヒト
ＣＮＰ−２２が効率良く製造できることを明らかにし本
発明の有用性を示した。
【００４１】
【実施例】次に実施例により本発明をさらに具体的に説
明する。実施例１ ．発現ベクターの作製方法 リンカーペプチド領域にアルギニン残基を１個から１０
個有する融合蛋白を発現する発現プラスミドを以下のよ
うにして作製した。
明する。実施例１ ．発現ベクターの作製方法 リンカーペプチド領域にアルギニン残基を１個から１０
個有する融合蛋白を発現する発現プラスミドを以下のよ
うにして作製した。
【００４２】（Ａ）ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ１０
の作製 図１に示したＲ１０領域のアミノ酸をコードする遺伝子
をβ−ｇａｌ９７Ｓ４Ｄ（β−ガラクトシダーゼのＮ−
末端の９７個のアミノ酸から成りその中でシステイン残
基がセリン残基に置き換えられておりそして４個のグル
タミン酸残基がアスパラギン酸残基により置き換えられ
ているペプチド）遺伝子とｈＣＴ〔Ｇ〕（Ｃ−末端に１
個のグリシン残基を有するヒトカルシトニン前駆体）遺
伝子との結合部にＥcoＲＩ及びＸｈｏＩ切断部位を介し
て挿入するために以下の操作を行った。ｐＧ９７Ｓ４Ｄ
ｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ１０の作製方法を図２に示す。
の作製 図１に示したＲ１０領域のアミノ酸をコードする遺伝子
をβ−ｇａｌ９７Ｓ４Ｄ（β−ガラクトシダーゼのＮ−
末端の９７個のアミノ酸から成りその中でシステイン残
基がセリン残基に置き換えられておりそして４個のグル
タミン酸残基がアスパラギン酸残基により置き換えられ
ているペプチド）遺伝子とｈＣＴ〔Ｇ〕（Ｃ−末端に１
個のグリシン残基を有するヒトカルシトニン前駆体）遺
伝子との結合部にＥcoＲＩ及びＸｈｏＩ切断部位を介し
て挿入するために以下の操作を行った。ｐＧ９７Ｓ４Ｄ
ｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ１０の作製方法を図２に示す。
【００４３】まず、ｐＢＲ３２２のテトラサイクリン耐
性遺伝子中のＲ１０領域を単離するためにｐＢＲ３２２
を制限酵素を用いて切断した。Ｈｉｇｈ緩衝液（１０mM
Ｔｒｉｓ／ＨＣｌpH７．５，１００mMＮａＣｌ，１０mM
ＭｇＣｌ2 ，１mMジチオスレイトール；以下ＤＴＴ）３
００μｌ中で１５０μｇのｐＢＲ３２２をＢａｍＨＩ及
びＥco４７III それぞれ２００ユニットを用いて３７
℃，６０分間切断反応を行った。
性遺伝子中のＲ１０領域を単離するためにｐＢＲ３２２
を制限酵素を用いて切断した。Ｈｉｇｈ緩衝液（１０mM
Ｔｒｉｓ／ＨＣｌpH７．５，１００mMＮａＣｌ，１０mM
ＭｇＣｌ2 ，１mMジチオスレイトール；以下ＤＴＴ）３
００μｌ中で１５０μｇのｐＢＲ３２２をＢａｍＨＩ及
びＥco４７III それぞれ２００ユニットを用いて３７
℃，６０分間切断反応を行った。
【００４４】反応後、反応液に３０μｌのｄｙｅ溶液
（０．２５％ブロモフェノールブルー、０．２５％キシ
レンシアノール、４０％ショ糖）を加え、１．５％寒天
ゲル電気泳動（ＴＡＥ緩衝液；４０mMＴｒｉｓ−酢酸pH
８．０，２mMＥＤＴＡ．，１２０Ｖ，２時間）を行っ
た。泳動後、０．５μｇ／mlのエチジウムブロマイド溶
液中にゲルを浸し、染色を行い、目的とするＢａｍＨＩ
−Ｅco４７III （１１９bp）ＤＮＡ断片のバンドをゲル
から切り出した。
（０．２５％ブロモフェノールブルー、０．２５％キシ
レンシアノール、４０％ショ糖）を加え、１．５％寒天
ゲル電気泳動（ＴＡＥ緩衝液；４０mMＴｒｉｓ−酢酸pH
８．０，２mMＥＤＴＡ．，１２０Ｖ，２時間）を行っ
た。泳動後、０．５μｇ／mlのエチジウムブロマイド溶
液中にゲルを浸し、染色を行い、目的とするＢａｍＨＩ
−Ｅco４７III （１１９bp）ＤＮＡ断片のバンドをゲル
から切り出した。
【００４５】ゲルをＴＡＥ緩衝液を含む透析チューブに
入れ、電気泳動（１２０Ｖ，３０分）を行い、１１９bp
ＤＮＡ断片をゲルから溶出させた。その後、透析チュー
ブの溶液を回収し、常法に従い、フェノール処理、クロ
ロホルム処理、エタノール沈殿を行い、４０μｌのＴＥ
緩衝液（１０mMＴｒｉｓ／ＨＣｌpH８．０，１mMＥＤＴ
Ａ）にエタノール沈殿を溶かし、ＢａｍＨＩ−Ｅco４７
III （１１９bp）ＤＮＡ断片を精製した。このＢａｍＨ
Ｉ−Ｅco４７III （１１９bp）ＤＮＡ断片２０μｌ溶液
に２．５μｌの１０倍濃度Ｍｅｄ緩衝液（１００mMＴｒ
ｉｓ／ＨＣｌpH７．５，５００mMＮａＣｌ，１００mMＭ
ｇＣｌ2 ，１０mMＤＴＴ）及びＨａｅIII １０ユニット
を加え、３７℃，２時間反応を行った。反応後、２．５
μｌのｄｙｅ溶液を加えた後、１５％ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（ＴＢＥ緩衝液；８９mMＴｒｉｓ−ホウ
酸緩衝液pH８．０，２mMＥＤＴＡ）、１２０Ｖ，９０
分）を行った。
入れ、電気泳動（１２０Ｖ，３０分）を行い、１１９bp
ＤＮＡ断片をゲルから溶出させた。その後、透析チュー
ブの溶液を回収し、常法に従い、フェノール処理、クロ
ロホルム処理、エタノール沈殿を行い、４０μｌのＴＥ
緩衝液（１０mMＴｒｉｓ／ＨＣｌpH８．０，１mMＥＤＴ
Ａ）にエタノール沈殿を溶かし、ＢａｍＨＩ−Ｅco４７
III （１１９bp）ＤＮＡ断片を精製した。このＢａｍＨ
Ｉ−Ｅco４７III （１１９bp）ＤＮＡ断片２０μｌ溶液
に２．５μｌの１０倍濃度Ｍｅｄ緩衝液（１００mMＴｒ
ｉｓ／ＨＣｌpH７．５，５００mMＮａＣｌ，１００mMＭ
ｇＣｌ2 ，１０mMＤＴＴ）及びＨａｅIII １０ユニット
を加え、３７℃，２時間反応を行った。反応後、２．５
μｌのｄｙｅ溶液を加えた後、１５％ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（ＴＢＥ緩衝液；８９mMＴｒｉｓ−ホウ
酸緩衝液pH８．０，２mMＥＤＴＡ）、１２０Ｖ，９０
分）を行った。
【００４６】泳動後ゲルをエチジウムブロミド溶液中で
染色し、ＨａｅIII −Ｅco４７IIIＤＮＡ断片（８９b
p）のバンドをゲルから切り出した。このゲルを細かく
し、２００μｌのＤＮＡ溶出緩衝液（０．５Ｍ酢酸アン
モニウム、１mMＥＤＴＡpH８．０）を加え、３７℃で１
２時間放置した。その後、常法に従い、フェノール処
理、クロロホルム処理、エタノール沈殿を行い、５μｌ
のＴＥ緩衝液（１０mMＴｒｉｓ／ＨＣｌpH８．０，１mM
ＥＤＴＡ）にエタノール沈殿を溶かし、ＨａｅIII−Ｅc
o４７III ＤＮＡ断片（８９bp）を精製した。
染色し、ＨａｅIII −Ｅco４７IIIＤＮＡ断片（８９b
p）のバンドをゲルから切り出した。このゲルを細かく
し、２００μｌのＤＮＡ溶出緩衝液（０．５Ｍ酢酸アン
モニウム、１mMＥＤＴＡpH８．０）を加え、３７℃で１
２時間放置した。その後、常法に従い、フェノール処
理、クロロホルム処理、エタノール沈殿を行い、５μｌ
のＴＥ緩衝液（１０mMＴｒｉｓ／ＨＣｌpH８．０，１mM
ＥＤＴＡ）にエタノール沈殿を溶かし、ＨａｅIII−Ｅc
o４７III ＤＮＡ断片（８９bp）を精製した。
【００４７】次に、ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕プラス
ミド５μｇを５０μｌのＴＥ緩衝液（３３０mMＴｒｉｓ
／酢酸pH７．９，５００mMＮａＣｌ，１００mM酢酸マグ
ネシウム、５mMＤＴＴ，６６０mM酢酸カリウム、０．０
１％牛血清アルブミン）で、３０ユニットのＥcoＲＩを
用いて、３７℃，２時間反応を行った。さらにこの反応
液に各２５mMのｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴ
ＰからなるｄＮＴＰを１μｌと４ユニットＴ４ＤＮＡポ
リメレースを加え３７℃，５分間ＤＮＡ末端の平滑反応
を行い、その後、常法に従い、フェノール処理、クロロ
ホルム処理、エタノール沈殿を行い、１０μｌのＴＥ緩
衝液に溶解した。
ミド５μｇを５０μｌのＴＥ緩衝液（３３０mMＴｒｉｓ
／酢酸pH７．９，５００mMＮａＣｌ，１００mM酢酸マグ
ネシウム、５mMＤＴＴ，６６０mM酢酸カリウム、０．０
１％牛血清アルブミン）で、３０ユニットのＥcoＲＩを
用いて、３７℃，２時間反応を行った。さらにこの反応
液に各２５mMのｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴ
ＰからなるｄＮＴＰを１μｌと４ユニットＴ４ＤＮＡポ
リメレースを加え３７℃，５分間ＤＮＡ末端の平滑反応
を行い、その後、常法に従い、フェノール処理、クロロ
ホルム処理、エタノール沈殿を行い、１０μｌのＴＥ緩
衝液に溶解した。
【００４８】このＥcoＲＩ切断後、平滑反応を行なった
ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕５μｌとＨａｅIII −Ｅco
４７III ＤＮＡ断片（８９bp）５μｌを混合し、ＤＮＡ
ライゲーションキット（宝酒造）を用いてライゲーショ
ン反応を１６℃，１２時間行った。反応後、常法に従い
大腸菌Ｗ３１１０に形質転換を行い、テトラサイクリン
耐性形質転換株を得た。形質転換株のプラスミドの解析
は、ＢｓｐＨＩ及びＢｇｌIIを用いて切断後、１５％ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動を行い、正しい方向に挿
入されたものを選び、Ｗ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣ
Ｔ〔Ｇ〕Ｒ１０株を得た。
ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕５μｌとＨａｅIII −Ｅco
４７III ＤＮＡ断片（８９bp）５μｌを混合し、ＤＮＡ
ライゲーションキット（宝酒造）を用いてライゲーショ
ン反応を１６℃，１２時間行った。反応後、常法に従い
大腸菌Ｗ３１１０に形質転換を行い、テトラサイクリン
耐性形質転換株を得た。形質転換株のプラスミドの解析
は、ＢｓｐＨＩ及びＢｇｌIIを用いて切断後、１５％ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動を行い、正しい方向に挿
入されたものを選び、Ｗ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣ
Ｔ〔Ｇ〕Ｒ１０株を得た。
【００４９】（Ｂ）ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ６の
作製 図１に示したＲ６領域のアミノ酸をコードする遺伝子を
β−ｇａｌ９７Ｓ４Ｄ遺伝子とｈＣＴ〔Ｇ〕遺伝子との
結合部にＥcoＲＩ及びＸｈｏＩ切断部位を介して挿入す
るために以下の操作を行った。ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ
〔Ｇ〕Ｒ６の作製を図２に示す。
作製 図１に示したＲ６領域のアミノ酸をコードする遺伝子を
β−ｇａｌ９７Ｓ４Ｄ遺伝子とｈＣＴ〔Ｇ〕遺伝子との
結合部にＥcoＲＩ及びＸｈｏＩ切断部位を介して挿入す
るために以下の操作を行った。ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ
〔Ｇ〕Ｒ６の作製を図２に示す。
【００５０】まず、ｐＢＲ３２２のテトラサイクリン耐
性遺伝子中のＲ６領域を単離するためにｐＢＲ３２２を
制限酵素を用いて切断した。Ｈｉｇｈ緩衝液（１０mMＴ
ｒｉｓ／ＨＣｌpH７．５，１００mMＮａＣｌ，１０mMＭ
ｇＣｌ2 ，１mMＤＴＴ）３００μｌ中で１５０μｇのｐ
ＢＲ３２２をＢａｍＨＩ及びＥco４７III それぞれ２０
０ユニットを用いて３７℃，６０分間切断反応を行っ
た。反応後、反応液に３０μｌのｄｙｅ溶液（０．２５
％ブロモフェノールブルー、０．２５％キシレンシアノ
ール、４０％ショ糖）を加え、１．５％寒天ゲル電気泳
動（ＴＡＥ緩衝液；４０mMＴｒｉｓ−酢酸、２mMＥＤＴ
Ａ．，１２０Ｖ，２時間）を行った。
性遺伝子中のＲ６領域を単離するためにｐＢＲ３２２を
制限酵素を用いて切断した。Ｈｉｇｈ緩衝液（１０mMＴ
ｒｉｓ／ＨＣｌpH７．５，１００mMＮａＣｌ，１０mMＭ
ｇＣｌ2 ，１mMＤＴＴ）３００μｌ中で１５０μｇのｐ
ＢＲ３２２をＢａｍＨＩ及びＥco４７III それぞれ２０
０ユニットを用いて３７℃，６０分間切断反応を行っ
た。反応後、反応液に３０μｌのｄｙｅ溶液（０．２５
％ブロモフェノールブルー、０．２５％キシレンシアノ
ール、４０％ショ糖）を加え、１．５％寒天ゲル電気泳
動（ＴＡＥ緩衝液；４０mMＴｒｉｓ−酢酸、２mMＥＤＴ
Ａ．，１２０Ｖ，２時間）を行った。
【００５１】泳動後、０．５μｇ／mlのエチジウムブロ
マイド溶液中にゲルを浸し、染色を行い、目的とするＢ
ａｍＨＩ−Ｅco４７III （１１９bp）ＤＮＡ断片のバン
ドをゲルから切り出した。ゲルをＴＡＥ緩衝液を含む透
析チューブに入れ、電気泳動（１２０Ｖ，３０分）を行
い、１１９bpＤＮＡ断片をゲルから溶出させた。その
後、透析チューブの溶液を回収し、常法に従い、フェノ
ール処理、クロロホルム処理、エタノール沈殿を行い、
４０μｌのＴＥ緩衝液（１０mMＴｒｉｓ／ＨＣｌpH８．
０，１mMＥＤＴＡ）にエタノール沈殿を溶かし、Ｂａｍ
ＨＩ−Ｅco４７III （１１９bp）ＤＮＡ断片を精製し
た。
マイド溶液中にゲルを浸し、染色を行い、目的とするＢ
ａｍＨＩ−Ｅco４７III （１１９bp）ＤＮＡ断片のバン
ドをゲルから切り出した。ゲルをＴＡＥ緩衝液を含む透
析チューブに入れ、電気泳動（１２０Ｖ，３０分）を行
い、１１９bpＤＮＡ断片をゲルから溶出させた。その
後、透析チューブの溶液を回収し、常法に従い、フェノ
ール処理、クロロホルム処理、エタノール沈殿を行い、
４０μｌのＴＥ緩衝液（１０mMＴｒｉｓ／ＨＣｌpH８．
０，１mMＥＤＴＡ）にエタノール沈殿を溶かし、Ｂａｍ
ＨＩ−Ｅco４７III （１１９bp）ＤＮＡ断片を精製し
た。
【００５２】このＢａｍＨＩ−Ｅco４７III （１１９b
p）ＤＮＡ断片２０μｌ溶液に２．５μｌの１０倍濃度
ＴＡ緩衝液（３３０mMＴｒｉｓ／酢酸pH７．９，５００
mMＮａＣｌ，１００mM酢酸マグネシウム、５mMＤＴＴ，
６６０mM酢酸カリウム、０．０１％牛血清アルブミン）
及びＢａｎＩ１０ユニットを加え、３７℃，２時間反応
を行った。反応後、さらにこの反応液に２５mMｄＮＴＰ
を１μｌと４ユニットのＴ４ＤＮＡポリメレースを加え
３７℃，５分間ＤＮＡ末端の平滑反応を行った。反応
後、２．５μｌのｄｙｅ溶液を加えた後、１５％ポリア
クリルアミドゲル電気泳動（ＴＢＥ緩衝液；８９mMＴｒ
ｉｓ−ホウ酸緩衝液pH８．０，２mMＥＤＴＡ）、１２０
Ｖ，９０分間行った。
p）ＤＮＡ断片２０μｌ溶液に２．５μｌの１０倍濃度
ＴＡ緩衝液（３３０mMＴｒｉｓ／酢酸pH７．９，５００
mMＮａＣｌ，１００mM酢酸マグネシウム、５mMＤＴＴ，
６６０mM酢酸カリウム、０．０１％牛血清アルブミン）
及びＢａｎＩ１０ユニットを加え、３７℃，２時間反応
を行った。反応後、さらにこの反応液に２５mMｄＮＴＰ
を１μｌと４ユニットのＴ４ＤＮＡポリメレースを加え
３７℃，５分間ＤＮＡ末端の平滑反応を行った。反応
後、２．５μｌのｄｙｅ溶液を加えた後、１５％ポリア
クリルアミドゲル電気泳動（ＴＢＥ緩衝液；８９mMＴｒ
ｉｓ−ホウ酸緩衝液pH８．０，２mMＥＤＴＡ）、１２０
Ｖ，９０分間行った。
【００５３】泳動後ゲルをエチジウムブロミド溶液中で
染色し、ＢａｎＩ−Ｅco４７III ＤＮＡ断片（５６bp）
のバンドをゲルから切り出した。このゲルを細かくし、
２００μｌのＤＮＡ溶出緩衝液（０．５Ｍ酢酸アンモニ
ウム、１mMＥＤＴＡpH８．０）を加え、３７℃で１２時
間放置した。その後、常法に従い、フェノール処理、ク
ロロホルム処理、エタノール沈殿を行い、５μｌのＴＥ
緩衝液（１０mMＴｒｉｓ／ＨＣｌpH８．０，１mMＥＤＴ
Ａ）にエタノール沈殿を溶かし、ＢａｎＩ−Ｅco４７II
I ＤＮＡ断片（５６bp）を精製した。
染色し、ＢａｎＩ−Ｅco４７III ＤＮＡ断片（５６bp）
のバンドをゲルから切り出した。このゲルを細かくし、
２００μｌのＤＮＡ溶出緩衝液（０．５Ｍ酢酸アンモニ
ウム、１mMＥＤＴＡpH８．０）を加え、３７℃で１２時
間放置した。その後、常法に従い、フェノール処理、ク
ロロホルム処理、エタノール沈殿を行い、５μｌのＴＥ
緩衝液（１０mMＴｒｉｓ／ＨＣｌpH８．０，１mMＥＤＴ
Ａ）にエタノール沈殿を溶かし、ＢａｎＩ−Ｅco４７II
I ＤＮＡ断片（５６bp）を精製した。
【００５４】次に、ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕プラス
ミド５μｇを５０μｌのＴＡ緩衝液中で、３０ユニット
のＥcoＲＩを用いて、３７℃，２時間反応を行った。さ
らにこの反応液に２５mMｄＮＴＰを１μｌと４ユニット
のＴ４ＤＮＡポリメレースを加え３７℃，５分間ＤＮＡ
末端の平滑反応を行い、その後、常法に従い、フェノー
ル処理、クロロホルム処理、エタノール沈殿を行い、１
０μｌのＴＥ緩衝液に溶解した。
ミド５μｇを５０μｌのＴＡ緩衝液中で、３０ユニット
のＥcoＲＩを用いて、３７℃，２時間反応を行った。さ
らにこの反応液に２５mMｄＮＴＰを１μｌと４ユニット
のＴ４ＤＮＡポリメレースを加え３７℃，５分間ＤＮＡ
末端の平滑反応を行い、その後、常法に従い、フェノー
ル処理、クロロホルム処理、エタノール沈殿を行い、１
０μｌのＴＥ緩衝液に溶解した。
【００５５】このＥcoＲＩ切断後、平滑反応を行なった
ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕５μｌとＢａｎＩ−Ｅco４
７III ＤＮＡ断片（５６bp）５μｌを混合し、ＤＮＡラ
イゲーション（宝酒造）を用いてライゲーションキット
反応を１６℃，１２時間行った。反応後、常法に従い大
腸菌Ｗ３１１０に形質転換を行い、テトラサイクリン耐
性形質転換株を得た。形質転換株のプラスミドの解析
は、ＢｓｐＨＩ及びＢｇｌIIを用いて切断後、１５％ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動を行い、正しい方向に挿
入されたものを選び、Ｗ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣ
Ｔ〔Ｇ〕Ｒ６株を得た。
ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕５μｌとＢａｎＩ−Ｅco４
７III ＤＮＡ断片（５６bp）５μｌを混合し、ＤＮＡラ
イゲーション（宝酒造）を用いてライゲーションキット
反応を１６℃，１２時間行った。反応後、常法に従い大
腸菌Ｗ３１１０に形質転換を行い、テトラサイクリン耐
性形質転換株を得た。形質転換株のプラスミドの解析
は、ＢｓｐＨＩ及びＢｇｌIIを用いて切断後、１５％ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動を行い、正しい方向に挿
入されたものを選び、Ｗ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣ
Ｔ〔Ｇ〕Ｒ６株を得た。
【００５６】（Ｃ）ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ８の
作製 図１に示したＲ８領域のアミノ酸をコードする遺伝子を
β−ｇａｌ９７Ｓ４Ｄ遺伝子とｈＣＴ〔Ｇ〕遺伝子との
結合部にＥcoＲＩ及びＸｈｏＩ切断部位を介して挿入す
るために以下の操作を行った。ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ
〔Ｇ〕Ｒ８の作製を図３に示す。
作製 図１に示したＲ８領域のアミノ酸をコードする遺伝子を
β−ｇａｌ９７Ｓ４Ｄ遺伝子とｈＣＴ〔Ｇ〕遺伝子との
結合部にＥcoＲＩ及びＸｈｏＩ切断部位を介して挿入す
るために以下の操作を行った。ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ
〔Ｇ〕Ｒ８の作製を図３に示す。
【００５７】Ｈｉｇｈ緩衝液５０μｌ中にｐＧ９７Ｓ４
ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ１０を１０μｇずつ入れたチューブ３
本を用意し、各々のチューブにＢｂｅＩとＢｇｌII，Ｂ
ｂｅＩとＥcoＲＶ及びＢｇｌIIとＥcoＲＶをそれぞれ２
０ユニット入れ、３７℃，２時間反応後、１．５％寒天
ゲル電気泳動を行い、ＢｂｅＩ−ＢｇｌII（８９bp），
ＢｂｅＩ−ＥcoＲＶ（３５３bp）及びＢｇｌII−ＥcoＲ
Ｖ（２．７Kb）のバンドをゲルから切り出し、電気泳動
法によりゲルより溶出させた。その後、常法に従い、フ
ェノール処理、クロロホルム処理、エタノール沈殿を行
い、５μｌのＴＥ緩衝液に溶解した。このようにして得
られた３つのＤＮＡ断片を混ぜ、ＤＮＡライゲーション
キットを用いて１６℃，１２時間ライゲーション反応を
行った。反応後、常法に従い大腸菌Ｗ３１１０に形質転
換を行い、テトラサイクリン耐性形質転換株を得た。形
質転換株のプラスミドの解析は、制限酵素を用いて切断
後、ゲル電気泳動を行い、正しい方向に挿入されたもの
を選び、Ｗ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ８
株を得た。
ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ１０を１０μｇずつ入れたチューブ３
本を用意し、各々のチューブにＢｂｅＩとＢｇｌII，Ｂ
ｂｅＩとＥcoＲＶ及びＢｇｌIIとＥcoＲＶをそれぞれ２
０ユニット入れ、３７℃，２時間反応後、１．５％寒天
ゲル電気泳動を行い、ＢｂｅＩ−ＢｇｌII（８９bp），
ＢｂｅＩ−ＥcoＲＶ（３５３bp）及びＢｇｌII−ＥcoＲ
Ｖ（２．７Kb）のバンドをゲルから切り出し、電気泳動
法によりゲルより溶出させた。その後、常法に従い、フ
ェノール処理、クロロホルム処理、エタノール沈殿を行
い、５μｌのＴＥ緩衝液に溶解した。このようにして得
られた３つのＤＮＡ断片を混ぜ、ＤＮＡライゲーション
キットを用いて１６℃，１２時間ライゲーション反応を
行った。反応後、常法に従い大腸菌Ｗ３１１０に形質転
換を行い、テトラサイクリン耐性形質転換株を得た。形
質転換株のプラスミドの解析は、制限酵素を用いて切断
後、ゲル電気泳動を行い、正しい方向に挿入されたもの
を選び、Ｗ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ８
株を得た。
【００５８】（Ｄ）ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ１，
ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ３，ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣ
Ｔ〔Ｇ〕Ｒ４及びｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ５の作
製 図１に示したＲ１，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５領域のアミノ酸を
コードする遺伝子をβ−ｇａｌ９７Ｓ４Ｄ遺伝子とｈＣ
Ｔ〔Ｇ〕遺伝子との結合部にＥcoＲＩ及びＸｈｏＩ切断
部位を介して挿入するために以下の操作を行った。
ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ３，ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣ
Ｔ〔Ｇ〕Ｒ４及びｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ５の作
製 図１に示したＲ１，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５領域のアミノ酸を
コードする遺伝子をβ−ｇａｌ９７Ｓ４Ｄ遺伝子とｈＣ
Ｔ〔Ｇ〕遺伝子との結合部にＥcoＲＩ及びＸｈｏＩ切断
部位を介して挿入するために以下の操作を行った。
【００５９】ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ１，ｐＧ９
７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ３，ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ
〔Ｇ〕Ｒ４、ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ５の作製を
図４に示す。２５μｇのｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕を
５０μｌのＨｉｇｈ緩衝液に加え、３０ユニットのＸｈ
ｏＩ及びＥcoＲＩを加え３７℃，２時間、切断反応を行
った。反応後、１％の寒天ゲル電気泳動を行い２．７Kb
のＤＮＡ断片をゲルより電気泳動法を用いて回収した。
このＤＮＡ断片と図５に示した化学的に合成したオリゴ
ヌクレオチドをそれぞれ１００pmole とライゲーション
反応を行なった。反応後、常法に従い大腸菌Ｗ３１１０
に形質転換を行い、テトラサイクリン耐性形質転換株を
得た。
７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ３，ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ
〔Ｇ〕Ｒ４、ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ５の作製を
図４に示す。２５μｇのｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕を
５０μｌのＨｉｇｈ緩衝液に加え、３０ユニットのＸｈ
ｏＩ及びＥcoＲＩを加え３７℃，２時間、切断反応を行
った。反応後、１％の寒天ゲル電気泳動を行い２．７Kb
のＤＮＡ断片をゲルより電気泳動法を用いて回収した。
このＤＮＡ断片と図５に示した化学的に合成したオリゴ
ヌクレオチドをそれぞれ１００pmole とライゲーション
反応を行なった。反応後、常法に従い大腸菌Ｗ３１１０
に形質転換を行い、テトラサイクリン耐性形質転換株を
得た。
【００６０】形質転換株のプラスミドの解析は、制限酵
素を用いて切断後、ゲル電気泳動を行い確認を行い、Ｗ
３１１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ１株、Ｗ３１
１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ３株、Ｗ３１１０
／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ４株、及びＷ３１１０
／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ５株を得た。
素を用いて切断後、ゲル電気泳動を行い確認を行い、Ｗ
３１１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ１株、Ｗ３１
１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ３株、Ｗ３１１０
／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ４株、及びＷ３１１０
／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ５株を得た。
【００６１】以上、ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕のＥco
ＲＩ切断部位あるいはＥcoＲＩ−ＸｈｏＩ切断部位にテ
トラサイクリン耐性遺伝子の一部分を付加したプラスミ
ドを７種類作製した。これらの挿入遺伝子は塩基性アミ
ノ酸のアルギニンに対応するコドンを１個から最大１０
個含んでいるために、各々のキメラ蛋白質間で電荷が異
り等電点の異った融合蛋白が生産される。生産される融
合蛋白の構造を図６に示す。
ＲＩ切断部位あるいはＥcoＲＩ−ＸｈｏＩ切断部位にテ
トラサイクリン耐性遺伝子の一部分を付加したプラスミ
ドを７種類作製した。これらの挿入遺伝子は塩基性アミ
ノ酸のアルギニンに対応するコドンを１個から最大１０
個含んでいるために、各々のキメラ蛋白質間で電荷が異
り等電点の異った融合蛋白が生産される。生産される融
合蛋白の構造を図６に示す。
【００６２】実施例２．ｈＣＴ〔Ｇ〕融合蛋白の生産 作製した菌株の融合蛋白の等電点と生産性の関係を検討
するため、菌株を培養し、細胞数あたりの融合蛋白の生
産性をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて
調べた。作製した菌株を５００mlのＳＢ培地（０．５％
グリセリン、２．４％酵母エキス、１．２％トリプト
ン、１００mMリン酸水素カリウム緩衝液pH７．５、テト
ラサイクリン（１０μｇ／ml））で３７℃，１２時間、
フラスコで培養を行った。培養後、培養液の濁度（ＯＤ
６００）を分光光度計で測定し、〔ＯＤ６００値×培養
容量（ml）〕の値が５になるように培養液を採取し、１
２０００rpm ，５分間遠心を行い、菌体を分離した。
するため、菌株を培養し、細胞数あたりの融合蛋白の生
産性をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて
調べた。作製した菌株を５００mlのＳＢ培地（０．５％
グリセリン、２．４％酵母エキス、１．２％トリプト
ン、１００mMリン酸水素カリウム緩衝液pH７．５、テト
ラサイクリン（１０μｇ／ml））で３７℃，１２時間、
フラスコで培養を行った。培養後、培養液の濁度（ＯＤ
６００）を分光光度計で測定し、〔ＯＤ６００値×培養
容量（ml）〕の値が５になるように培養液を採取し、１
２０００rpm ，５分間遠心を行い、菌体を分離した。
【００６３】この菌体沈殿物に１mlのＳＤＳサンプルバ
ッファー（６３mMＴｒｉｓ−ＨＣｌpH６．８，１０％グ
リセリン、１０％ＳＤＳ，５％２−メルカプトエタノー
ル、１２．５mg／Ｌブロムフェノールブルー）を加え、
９５℃，５分間加熱し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル
電気泳動の試料とした。上記試料の５μｌを用いてＳＤ
Ｓ−１６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＴＥＦＣ
Ｏ製）を１８mA，９０分間の条件で行った。泳動後、ゲ
ルを染色液（１０％酢酸、４０％メタノール、２ｇ／Ｌ
クマジーブリリアントブルーＲ２５０）で染色し、各菌
株の生産したｈＣＴ〔Ｇ〕融合蛋白の細胞あたりの生産
性を比較した。電気泳動の結果を図７に示す。
ッファー（６３mMＴｒｉｓ−ＨＣｌpH６．８，１０％グ
リセリン、１０％ＳＤＳ，５％２−メルカプトエタノー
ル、１２．５mg／Ｌブロムフェノールブルー）を加え、
９５℃，５分間加熱し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル
電気泳動の試料とした。上記試料の５μｌを用いてＳＤ
Ｓ−１６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＴＥＦＣ
Ｏ製）を１８mA，９０分間の条件で行った。泳動後、ゲ
ルを染色液（１０％酢酸、４０％メタノール、２ｇ／Ｌ
クマジーブリリアントブルーＲ２５０）で染色し、各菌
株の生産したｈＣＴ〔Ｇ〕融合蛋白の細胞あたりの生産
性を比較した。電気泳動の結果を図７に示す。
【００６４】図７から明らかな様にＷ３１１０／ｐＧ９
７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕；等電点＝４．４３の菌株は非常
に極く僅かの融合蛋白の封入体しか生産できずＷ３１１
０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ１；等電点＝４．７
０の菌株は若干の融合蛋白を生産し、そのほかの菌株は
菌体内に大量の融合蛋白の封入体を生産していることが
明らかになった。したがって、融合蛋白の等電点が４．
５〜４．７付近以下になると融合蛋白の生産性及びその
封入体の生産量が悪くなることがこの結果より示された
ことになる。
７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕；等電点＝４．４３の菌株は非常
に極く僅かの融合蛋白の封入体しか生産できずＷ３１１
０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ１；等電点＝４．７
０の菌株は若干の融合蛋白を生産し、そのほかの菌株は
菌体内に大量の融合蛋白の封入体を生産していることが
明らかになった。したがって、融合蛋白の等電点が４．
５〜４．７付近以下になると融合蛋白の生産性及びその
封入体の生産量が悪くなることがこの結果より示された
ことになる。
【００６５】つぎに、Ｗ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣ
Ｔ〔Ｇ〕Ｒ３，Ｗ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ
〔Ｇ〕Ｒ４，Ｗ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕
Ｒ５，Ｗ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ６，
Ｗ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ８，Ｗ３１
１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ１０の菌株を用い
て、２０リッター培養槽での大量培養生産を行い大量培
養の条件下における融合蛋白の生産性、及び融合蛋白か
らＶ８プロテアーゼを用いてｈＣＴ〔Ｇ〕を切り出す効
率について検討した。
Ｔ〔Ｇ〕Ｒ３，Ｗ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ
〔Ｇ〕Ｒ４，Ｗ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕
Ｒ５，Ｗ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ６，
Ｗ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ８，Ｗ３１
１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ１０の菌株を用い
て、２０リッター培養槽での大量培養生産を行い大量培
養の条件下における融合蛋白の生産性、及び融合蛋白か
らＶ８プロテアーゼを用いてｈＣＴ〔Ｇ〕を切り出す効
率について検討した。
【００６６】実施例３．大量培養条件下における融合蛋
白の生産性とＶ８プロテアーゼにおける融合蛋白からの
ｈＣＴ〔Ｇ〕の切り出し 大量培養条件下における融合蛋白の生産性とＶ８プロテ
アーゼによる種々のｈＣＴ〔Ｇ〕融合蛋白からのｈＣＴ
〔Ｇ〕の切り出し効率を検討するため以下の実験を行っ
た。
白の生産性とＶ８プロテアーゼにおける融合蛋白からの
ｈＣＴ〔Ｇ〕の切り出し 大量培養条件下における融合蛋白の生産性とＶ８プロテ
アーゼによる種々のｈＣＴ〔Ｇ〕融合蛋白からのｈＣＴ
〔Ｇ〕の切り出し効率を検討するため以下の実験を行っ
た。
【００６７】前述のＳＢ培地を用いたフラスコ培養に於
て封入体の形成が認められた高発現株の６株（Ｗ３１１
０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ３株、Ｗ３１１０／
ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ４株、Ｗ３１１０／ｐＧ
９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ５株、Ｗ３１１０／ｐＧ９７
Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ６株、Ｗ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４
ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ８株、及びＷ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４
ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ１０株）について２０Ｌ培養槽を用い
て培養を行った。
て封入体の形成が認められた高発現株の６株（Ｗ３１１
０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ３株、Ｗ３１１０／
ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ４株、Ｗ３１１０／ｐＧ
９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ５株、Ｗ３１１０／ｐＧ９７
Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ６株、Ｗ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４
ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ８株、及びＷ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４
ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ１０株）について２０Ｌ培養槽を用い
て培養を行った。
【００６８】培地には酵母エキス４ｇ／Ｌ、リン酸二カ
リウム４ｇ／Ｌ、リン酸一カリウム４ｇ／Ｌ、リン酸二
ナトリウム２．７ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム１．２ｇ／
Ｌ、塩化アンモニウム０．２ｇ／Ｌ、Ｌ−メチオニン
２．０ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ２．０ｇ／Ｌ，Ｆ
ｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ４０mg／Ｌ，ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ
４０mg／Ｌ，ＡｌＣｌ3 ・６Ｈ2 Ｏ１０mg／Ｌ，ＣｏＣ
ｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ４mg／Ｌ，ＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ２mg／
Ｌ，Ｎａ2 ＭｏＯ4 ・２Ｈ2 Ｏ２mg／Ｌ，Ｎａ2ＭｏＯ
4 ・２Ｈ2 Ｏ２mg／Ｌ，ＣｕＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ１．０mg
／Ｌ，Ｈ3 ＢＯ3０．５mg／Ｌ、及びＭｎＳＯ4 ・ｎＨ
2 Ｏ１０mg／Ｌを含み炭素源として培養初期はグルコー
ス（２％）を用い、グルコース消費後はグリセリン（８
％）を炭素源とした。pHを７．０にコントロールしなが
ら２４時間培養を行った。最終到達菌体濃度の結果を表
１に示す。
リウム４ｇ／Ｌ、リン酸一カリウム４ｇ／Ｌ、リン酸二
ナトリウム２．７ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム１．２ｇ／
Ｌ、塩化アンモニウム０．２ｇ／Ｌ、Ｌ−メチオニン
２．０ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ２．０ｇ／Ｌ，Ｆ
ｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ４０mg／Ｌ，ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ
４０mg／Ｌ，ＡｌＣｌ3 ・６Ｈ2 Ｏ１０mg／Ｌ，ＣｏＣ
ｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ４mg／Ｌ，ＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ２mg／
Ｌ，Ｎａ2 ＭｏＯ4 ・２Ｈ2 Ｏ２mg／Ｌ，Ｎａ2ＭｏＯ
4 ・２Ｈ2 Ｏ２mg／Ｌ，ＣｕＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ１．０mg
／Ｌ，Ｈ3 ＢＯ3０．５mg／Ｌ、及びＭｎＳＯ4 ・ｎＨ
2 Ｏ１０mg／Ｌを含み炭素源として培養初期はグルコー
ス（２％）を用い、グルコース消費後はグリセリン（８
％）を炭素源とした。pHを７．０にコントロールしなが
ら２４時間培養を行った。最終到達菌体濃度の結果を表
１に示す。
【００６９】
【表１】
【００７０】表１から明らかなようにＷ３１１０／ｐＧ
９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ１０株は他の菌株に比べて著
しく増殖が悪く、他の菌株の約半分の最終到達菌体濃度
しかないことが明らかになった。Ｗ３１１０／ｐＧ９７
Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ１０株の生産する融合蛋白の等電
点が弱アルカリ性の７．８５であり、細胞あたりの融合
蛋白生成能は上がったが、急速に封入体を形成した為か
あるいは融合蛋白の等電点が弱アルカリである為に細胞
増殖阻害を引き起こした為かの理由により、結果的に細
胞到達濃度が低かったのではないかと考えられる。
９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ１０株は他の菌株に比べて著
しく増殖が悪く、他の菌株の約半分の最終到達菌体濃度
しかないことが明らかになった。Ｗ３１１０／ｐＧ９７
Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ１０株の生産する融合蛋白の等電
点が弱アルカリ性の７．８５であり、細胞あたりの融合
蛋白生成能は上がったが、急速に封入体を形成した為か
あるいは融合蛋白の等電点が弱アルカリである為に細胞
増殖阻害を引き起こした為かの理由により、結果的に細
胞到達濃度が低かったのではないかと考えられる。
【００７１】従って、これらの検討結果より、大腸菌体
内で融合蛋白を封入体として安定にかつ高生産させるに
は、融合蛋白の等電点が４．９から６．９の間の酸性領
域に収まることが重要であることが本発明者等により初
めて明らかにされた。また、ＳＤＳポリアクリルアミド
ゲル電気泳動後、蛋白の染色を行い、菌体あたりの融合
蛋白の生産量をゲルスキャナーで定量した結果を表１に
菌体当たりの封入体量（相対値）として示す。
内で融合蛋白を封入体として安定にかつ高生産させるに
は、融合蛋白の等電点が４．９から６．９の間の酸性領
域に収まることが重要であることが本発明者等により初
めて明らかにされた。また、ＳＤＳポリアクリルアミド
ゲル電気泳動後、蛋白の染色を行い、菌体あたりの融合
蛋白の生産量をゲルスキャナーで定量した結果を表１に
菌体当たりの封入体量（相対値）として示す。
【００７２】菌体あたりの融合蛋白量はＷ３１１０／ｐ
Ｇ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ４株を１００とした時に、
各々の菌株は９６−１１６の封入体を生産していた。培
養液あたりの総封入体量はＷ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４Ｄ
ｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ１０株では６１４８，Ｗ３１１０／ｐＧ
９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ８株では１３５６０と菌株に
より約２倍の違いが見られた。培養液あたりの総封入体
量ではＷ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ８株
がもっとも高かったが、ｈＣＴの製造にはキメラ蛋白質
からのＶ８プロテアーゼによる切断反応があり、キメラ
蛋白からのＶ８プロテアーゼによる切断反応効率が製造
工程の収量に大きく関わってくる。
Ｇ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ４株を１００とした時に、
各々の菌株は９６−１１６の封入体を生産していた。培
養液あたりの総封入体量はＷ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４Ｄ
ｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ１０株では６１４８，Ｗ３１１０／ｐＧ
９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ８株では１３５６０と菌株に
より約２倍の違いが見られた。培養液あたりの総封入体
量ではＷ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ８株
がもっとも高かったが、ｈＣＴの製造にはキメラ蛋白質
からのＶ８プロテアーゼによる切断反応があり、キメラ
蛋白からのＶ８プロテアーゼによる切断反応効率が製造
工程の収量に大きく関わってくる。
【００７３】そこで得られた封入体をもちいてＶ８プロ
テアーゼによる切断反応の効率を検討した。前述の３０
リッター培養槽による培養後、培養液１０００mlを採取
し高圧ホモジナイザー（Manton Gaulin Laboratory Hom
ogenizer 15M−8TA)を用いて、６００Kg／cm2 で菌体の
破砕処理を行い７０００rpm ，３０分間の遠心分離によ
り封入体を含む沈殿を回収した。その後、最初の容量に
等しくなるように沈殿画分に脱イオン水を加え、懸濁液
を再び遠心を行うことで沈殿の洗浄を行った。
テアーゼによる切断反応の効率を検討した。前述の３０
リッター培養槽による培養後、培養液１０００mlを採取
し高圧ホモジナイザー（Manton Gaulin Laboratory Hom
ogenizer 15M−8TA)を用いて、６００Kg／cm2 で菌体の
破砕処理を行い７０００rpm ，３０分間の遠心分離によ
り封入体を含む沈殿を回収した。その後、最初の容量に
等しくなるように沈殿画分に脱イオン水を加え、懸濁液
を再び遠心を行うことで沈殿の洗浄を行った。
【００７４】この洗浄操作をさらにもう一度繰り返し最
終的に得られた沈殿をＯＤ６００値が８００となるよう
に脱イオン水で懸濁後、以下に示すＶ８プロテアーゼに
よる切断反応に使用した。０．６mlの懸濁液を採取し、
この懸濁液に１ＭＴｒｉｓＨＣｌ（pH８．０）７５μ
ｌ、尿素５４０mg，１００mMＤＴＴ１８５μｌを加え、
１０分間放置後、最終容量が３．７mlになるように脱イ
オン水を加え、３０℃で１０分間予熱した後、Ｖ８プロ
テアーゼ（１mg／ml）を７μｌ加え、１時間反応を行っ
た。
終的に得られた沈殿をＯＤ６００値が８００となるよう
に脱イオン水で懸濁後、以下に示すＶ８プロテアーゼに
よる切断反応に使用した。０．６mlの懸濁液を採取し、
この懸濁液に１ＭＴｒｉｓＨＣｌ（pH８．０）７５μ
ｌ、尿素５４０mg，１００mMＤＴＴ１８５μｌを加え、
１０分間放置後、最終容量が３．７mlになるように脱イ
オン水を加え、３０℃で１０分間予熱した後、Ｖ８プロ
テアーゼ（１mg／ml）を７μｌ加え、１時間反応を行っ
た。
【００７５】切断されたｈＣＴ〔Ｇ〕はＹＭＣＰａｃｋ
ｅｄカラムＡ−３０２（０．４６cm×１５cm、山村化学
研究所）を用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）により定量を行った。溶出は０．１％トリフルオロ
酢酸（ＴＦＡ）と０．１％ＴＦＡ／５０％アセトニトリ
ルを用いた直線濃度勾配で行った。その結果、ｈＣＴ
〔Ｇ〕の融合蛋白からの切断の効率はｈＣＴ〔Ｇ〕融合
蛋白により大きく異ることが明らかになった。
ｅｄカラムＡ−３０２（０．４６cm×１５cm、山村化学
研究所）を用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）により定量を行った。溶出は０．１％トリフルオロ
酢酸（ＴＦＡ）と０．１％ＴＦＡ／５０％アセトニトリ
ルを用いた直線濃度勾配で行った。その結果、ｈＣＴ
〔Ｇ〕の融合蛋白からの切断の効率はｈＣＴ〔Ｇ〕融合
蛋白により大きく異ることが明らかになった。
【００７６】一番切断の効率が良いのはＷ３１１０／ｐ
Ｇ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ４株の９７％であり、一番
切断の効率が悪いのはＷ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣ
Ｔ〔Ｇ〕Ｒ５株の７％である。この切断の効率は最終菌
体濃度とは何ら相関がない。また、融合蛋白に挿入され
たリンカーペプチドの塩基性のアミノ酸残基の数にも相
関性は見られなく、むしろ、Ｖ８プロテアーゼの切断認
識部位領域のアミノ酸配列に影響されているものと考え
られる。いずれにせよＷ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣ
Ｔ〔Ｇ〕Ｒ４株が回収ｈＣＴ〔Ｇ〕がもっとも高く、こ
の菌株をもちいてヒトカルシトニン前駆体からアミド化
酵素によるヒトカルシトニンへの変換を行った。
Ｇ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ４株の９７％であり、一番
切断の効率が悪いのはＷ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣ
Ｔ〔Ｇ〕Ｒ５株の７％である。この切断の効率は最終菌
体濃度とは何ら相関がない。また、融合蛋白に挿入され
たリンカーペプチドの塩基性のアミノ酸残基の数にも相
関性は見られなく、むしろ、Ｖ８プロテアーゼの切断認
識部位領域のアミノ酸配列に影響されているものと考え
られる。いずれにせよＷ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣ
Ｔ〔Ｇ〕Ｒ４株が回収ｈＣＴ〔Ｇ〕がもっとも高く、こ
の菌株をもちいてヒトカルシトニン前駆体からアミド化
酵素によるヒトカルシトニンへの変換を行った。
【００７７】実施例４．ｈＣＴ〔Ｇ〕前駆体の精製とア
ミド化酵素によるヒトカルシトニンへの変換 Ｗ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ４菌株を用
いて２０リッター培養槽で前述のごとく培養後、前述の
方法に従い融合蛋白の封入体の懸濁液を得た。この封入
体の懸濁液６mlを採取し、１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH
８．０）７５０μｌ，０．５ＭＥＤＴＡ（pH８．０）７
５μｌ、尿素５．４ｇ及びＤＴＴ１７mgを加え、１０分
放置後、脱イオン水を最終容量３７mlになるように加
え、次に、Ｖ８プロテアーゼ（１mg／ml）を４０μｌ添
加し、３７℃で９０分間処理をした。
ミド化酵素によるヒトカルシトニンへの変換 Ｗ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ４菌株を用
いて２０リッター培養槽で前述のごとく培養後、前述の
方法に従い融合蛋白の封入体の懸濁液を得た。この封入
体の懸濁液６mlを採取し、１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH
８．０）７５０μｌ，０．５ＭＥＤＴＡ（pH８．０）７
５μｌ、尿素５．４ｇ及びＤＴＴ１７mgを加え、１０分
放置後、脱イオン水を最終容量３７mlになるように加
え、次に、Ｖ８プロテアーゼ（１mg／ml）を４０μｌ添
加し、３７℃で９０分間処理をした。
【００７８】その後反応液を脱イオン水で２倍に希釈
し、３０分放置後酢酸を加えpHを４．６にした。pHを
４．６にすることにより保護ペプチドのβ−ｇａｌ９７
Ｓ４Ｄは沈殿し、上清画分にｈＣＴ〔Ｇ〕は残り、１５
分の遠心操作により上清画分を分離し、この上清画分を
１０mM酢酸アンモニウム（pH４．６）で平衡化したＳＰ
セファロース（Ｔｏｓｏｈ）カラムにアプライしカラム
クロマトグラフを行う。ｈＣＴ〔Ｇ〕は４０mM酢酸アン
モニウム（pH６．５）で段階的に溶出した。培養液１リ
ッターあたり約０．８ｇのｈＣＴ〔Ｇ〕が得られた。
し、３０分放置後酢酸を加えpHを４．６にした。pHを
４．６にすることにより保護ペプチドのβ−ｇａｌ９７
Ｓ４Ｄは沈殿し、上清画分にｈＣＴ〔Ｇ〕は残り、１５
分の遠心操作により上清画分を分離し、この上清画分を
１０mM酢酸アンモニウム（pH４．６）で平衡化したＳＰ
セファロース（Ｔｏｓｏｈ）カラムにアプライしカラム
クロマトグラフを行う。ｈＣＴ〔Ｇ〕は４０mM酢酸アン
モニウム（pH６．５）で段階的に溶出した。培養液１リ
ッターあたり約０．８ｇのｈＣＴ〔Ｇ〕が得られた。
【００７９】このようにして得られたｈＣＴ〔Ｇ〕を特
開平２−１９０１９３に記載の方法に従ってアミド化酵
素を反応させることで効率よくヒトカルシトニンを製造
することができた。アミド化反応後、ＹＭＣｐａｃｋｅ
ｄカラムＡ−３０２（山村化学研究所）を用いて高速液
体クロマトグラフィーを行った結果を図８に示す。ヒト
カルシトニンはこの溶出条件では保持時間９．７分に溶
出され、この図から明らかなように非常に高収率で純度
の高いヒトカルシトニンが得られることがわかる。
開平２−１９０１９３に記載の方法に従ってアミド化酵
素を反応させることで効率よくヒトカルシトニンを製造
することができた。アミド化反応後、ＹＭＣｐａｃｋｅ
ｄカラムＡ−３０２（山村化学研究所）を用いて高速液
体クロマトグラフィーを行った結果を図８に示す。ヒト
カルシトニンはこの溶出条件では保持時間９．７分に溶
出され、この図から明らかなように非常に高収率で純度
の高いヒトカルシトニンが得られることがわかる。
【００８０】実施例５．ヒトＣＮＰ−２２遺伝子の調製 Ｖ８プロテアーゼの切断部位であるグルタミン酸残基を
Ｎ末端に付加したヒトＣＮＰ−２２をコードする遺伝子
を、試験管内ＤＮＡ増幅法（ＰＣＲ法）により以下のよ
うに調製した。鋳型ＤＮＡとしてｐＵＣＣＮＰ１プラス
ミドを用いた。Ｋ緩衝液（２０mMＴｒｉｓ／ＨＣｌpH
８．５，１００mMＫＣｌ，１mMジスレイトール；以下Ｄ
ＴＴ）１５７μｌ中で、ｐＵＣＣＮＰ１ １．５７μｇ
に１２ユニットのＥcoＲＩを３７℃、６０分間反応さ
せ、切断した。反応液を常法に従い、フェノール処理、
２−ブタノール処理、エタノール沈殿を行ない、切断し
たＤＮＡ断片をＴＥ緩衝液（１０mMＴｒｉｓ／ＨＣｌpH
８．０，１mMＥＤＴＡ）１５７μｌに溶解した。
Ｎ末端に付加したヒトＣＮＰ−２２をコードする遺伝子
を、試験管内ＤＮＡ増幅法（ＰＣＲ法）により以下のよ
うに調製した。鋳型ＤＮＡとしてｐＵＣＣＮＰ１プラス
ミドを用いた。Ｋ緩衝液（２０mMＴｒｉｓ／ＨＣｌpH
８．５，１００mMＫＣｌ，１mMジスレイトール；以下Ｄ
ＴＴ）１５７μｌ中で、ｐＵＣＣＮＰ１ １．５７μｇ
に１２ユニットのＥcoＲＩを３７℃、６０分間反応さ
せ、切断した。反応液を常法に従い、フェノール処理、
２−ブタノール処理、エタノール沈殿を行ない、切断し
たＤＮＡ断片をＴＥ緩衝液（１０mMＴｒｉｓ／ＨＣｌpH
８．０，１mMＥＤＴＡ）１５７μｌに溶解した。
【００８１】ＰＣＲ反応に用いるプライマーのデザイン
を図９に示す。プライマー１〔配列番号１１〕はヒトＣ
ＮＰ−２２のＮ末端にＶ８プロテアーゼが切断するグル
タミン酸残基を付加し、さらにその上流にＥcoＲＩおよ
びＸｈｏＩ制限酵素切断部位を持たせるように、プライ
マー２〔配列番号１２〕はヒトＣＮＰ−２２遺伝子の直
後にＳａｌｌ制限酵素切断部位を持たせるようにデザイ
ンした。これらのプライマーはＤＮＡ合成機（アプライ
ドバイオシステム社製 ３８０Ａ型）を用い合成した。
合成後、８Ｍ尿素を含む２０％ポリアクリルアミドゲル
電気泳動を行ない、プライマーに対応する長さのＤＮＡ
断片をゲルからきりだし、各々のプライマーを作製し
た。
を図９に示す。プライマー１〔配列番号１１〕はヒトＣ
ＮＰ−２２のＮ末端にＶ８プロテアーゼが切断するグル
タミン酸残基を付加し、さらにその上流にＥcoＲＩおよ
びＸｈｏＩ制限酵素切断部位を持たせるように、プライ
マー２〔配列番号１２〕はヒトＣＮＰ−２２遺伝子の直
後にＳａｌｌ制限酵素切断部位を持たせるようにデザイ
ンした。これらのプライマーはＤＮＡ合成機（アプライ
ドバイオシステム社製 ３８０Ａ型）を用い合成した。
合成後、８Ｍ尿素を含む２０％ポリアクリルアミドゲル
電気泳動を行ない、プライマーに対応する長さのＤＮＡ
断片をゲルからきりだし、各々のプライマーを作製し
た。
【００８２】前述のＥcoＲＩで切断したｐＵＣＣＮＰ１
１０ngとプライマー（各々１pmol）を含む反応液（１
０mMＴｒｉｓ ＨＣｌpH８．３，５０mMＫＣｌ，１．５
mMＭｇＣｌ2 ，０．１％ゼラチン、各々２００μＭのｄ
ＧＴＰ，ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰ）１００μ
ｌを９５℃、５分間放置した後、氷中で急冷した。その
後、０．５ユニットのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍ
ｐｌｉ−Ｔａｑ宝酒造）を添加し、さらにミネラルオイ
ルを加えた後、サーマルリアクター（ＨＹＢＡＩＤ社）
を使用しＰＣＲ反応を行なった。
１０ngとプライマー（各々１pmol）を含む反応液（１
０mMＴｒｉｓ ＨＣｌpH８．３，５０mMＫＣｌ，１．５
mMＭｇＣｌ2 ，０．１％ゼラチン、各々２００μＭのｄ
ＧＴＰ，ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰ）１００μ
ｌを９５℃、５分間放置した後、氷中で急冷した。その
後、０．５ユニットのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍ
ｐｌｉ−Ｔａｑ宝酒造）を添加し、さらにミネラルオイ
ルを加えた後、サーマルリアクター（ＨＹＢＡＩＤ社）
を使用しＰＣＲ反応を行なった。
【００８３】反応は熱変性（９２℃、１分間）、アニー
リング（５５℃、２分間）、およびＤＮＡ伸張反応（７
２℃、３分間）の連続反応を１サイクルとして３０サイ
クル繰り返した。最終サイクルのＤＮＡ伸張反応は更に
７分間延長した。反応後、ＴＥ緩衝液を加え、４００μ
ｌにメスアップした後、全量をＳＵＰＲＥＣ−０２（宝
酒造）に入れ、２，０００ｇで８分間遠心した。濾過液
を除き、さらにＴＥ緩衝液を入れ約４００μｌに液量を
増やした後、同様の遠心操作を行なった。フィルター付
きカップ中に残るＰＣＲ反応液をＴＥ緩衝液で４０μｌ
にした。
リング（５５℃、２分間）、およびＤＮＡ伸張反応（７
２℃、３分間）の連続反応を１サイクルとして３０サイ
クル繰り返した。最終サイクルのＤＮＡ伸張反応は更に
７分間延長した。反応後、ＴＥ緩衝液を加え、４００μ
ｌにメスアップした後、全量をＳＵＰＲＥＣ−０２（宝
酒造）に入れ、２，０００ｇで８分間遠心した。濾過液
を除き、さらにＴＥ緩衝液を入れ約４００μｌに液量を
増やした後、同様の遠心操作を行なった。フィルター付
きカップ中に残るＰＣＲ反応液をＴＥ緩衝液で４０μｌ
にした。
【００８４】このＰＣＲ反応液４０μｌに１０倍濃度の
Ｈｉｇｈ緩衝液（１００mMＴｒｉｓＨＣｌpH７．５，１
ＭＮａＣｌ，１００mMＭｇＣｌ2 ，１０mMＤＴＴ）５μ
ｌおよびＥcoＲＩ ３６ユニット、Ｓａｌｌ６０ユニッ
トを加え、水で全量を５０μｌにした後、３７℃、６０
分間反応を行なった。反応後、フェノール処理、２−ブ
タノール処理、エタノール沈殿を行ない、最終的にＴＥ
緩衝液に溶解し、遺伝子の両端にＥcoＲＩおよびＳａｌ
ｌ ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄをもつヒトＣＮＰ−２２
遺伝子を調製した。
Ｈｉｇｈ緩衝液（１００mMＴｒｉｓＨＣｌpH７．５，１
ＭＮａＣｌ，１００mMＭｇＣｌ2 ，１０mMＤＴＴ）５μ
ｌおよびＥcoＲＩ ３６ユニット、Ｓａｌｌ６０ユニッ
トを加え、水で全量を５０μｌにした後、３７℃、６０
分間反応を行なった。反応後、フェノール処理、２−ブ
タノール処理、エタノール沈殿を行ない、最終的にＴＥ
緩衝液に溶解し、遺伝子の両端にＥcoＲＩおよびＳａｌ
ｌ ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄをもつヒトＣＮＰ−２２
遺伝子を調製した。
【００８５】実施例６−（ａ） 発現プラスミドｐＧ９
７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２２の作製 図１０に示したヒトＣＮＰ−２２遺伝子のＰＣＲ産物
を、βｇａｌ９７Ｓ４Ｄ（β−ガラクトシダーゼのＮ末
端の９７個のアミノ酸からなり、その中でシステイン残
基がセリン残基に置き換えられ、さらに４個のグルタミ
ン残基がアスパラギン酸残基に置き換えられているペプ
チド）遺伝子を含有するプラスミドｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣ
Ｔ〔ＧＲＲＲ〕に、ＥcoＲＩおよびＳａｌｌ制限酵素切
断部位を介して挿入し、プラスミドｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣ
ＮＰ−２２の作製を行なった。その作製方法を以下に記
す。
７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２２の作製 図１０に示したヒトＣＮＰ−２２遺伝子のＰＣＲ産物
を、βｇａｌ９７Ｓ４Ｄ（β−ガラクトシダーゼのＮ末
端の９７個のアミノ酸からなり、その中でシステイン残
基がセリン残基に置き換えられ、さらに４個のグルタミ
ン残基がアスパラギン酸残基に置き換えられているペプ
チド）遺伝子を含有するプラスミドｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣ
Ｔ〔ＧＲＲＲ〕に、ＥcoＲＩおよびＳａｌｌ制限酵素切
断部位を介して挿入し、プラスミドｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣ
ＮＰ−２２の作製を行なった。その作製方法を以下に記
す。
【００８６】まず、ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔ＧＲＲＲ〕
１０μｇをＨｉｇｈ緩衝液７０μｌで３６ユニットのＥ
coＲＩおよび６０ユニットのＳａｌｌを用いて、３７
℃、６０分間切断反応を行なった。反応後、常法に従
い、１．０％寒天ゲル電気泳動を行ない目的とする３．
１kbのＥcoＲＩ−Ｓａｌｌ断片を含むゲルを切り出し
た。寒天ゲル内のＤＮＡ断片をマイクロ遠心チューブＳ
ＵＰＲＥＣ−０１（宝酒造）を用いて抽出した後、フェ
ノール処理、クロロフォルム処理、エタノール沈殿をお
こない精製した。
１０μｇをＨｉｇｈ緩衝液７０μｌで３６ユニットのＥ
coＲＩおよび６０ユニットのＳａｌｌを用いて、３７
℃、６０分間切断反応を行なった。反応後、常法に従
い、１．０％寒天ゲル電気泳動を行ない目的とする３．
１kbのＥcoＲＩ−Ｓａｌｌ断片を含むゲルを切り出し
た。寒天ゲル内のＤＮＡ断片をマイクロ遠心チューブＳ
ＵＰＲＥＣ−０１（宝酒造）を用いて抽出した後、フェ
ノール処理、クロロフォルム処理、エタノール沈殿をお
こない精製した。
【００８７】次に、このＥcoＲＩ−ＳａｌｌＤＮＡ断片
とＰＣＲ産物のヒトＣＮＰ−２２遺伝子断片（ＥcoＲＩ
−ＳａｌｌＤＮＡ断片）を各々５μｌを混合し、ＤＮＡ
ライゲーションキット（宝酒造）を用いて、ライゲーシ
ョン反応を行なった。反応後、常法に従い、大腸菌Ｗ３
１１０株に形質転換を行ない、テトラサイクリン耐性形
質転換株Ｗ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２２を
得た。
とＰＣＲ産物のヒトＣＮＰ−２２遺伝子断片（ＥcoＲＩ
−ＳａｌｌＤＮＡ断片）を各々５μｌを混合し、ＤＮＡ
ライゲーションキット（宝酒造）を用いて、ライゲーシ
ョン反応を行なった。反応後、常法に従い、大腸菌Ｗ３
１１０株に形質転換を行ない、テトラサイクリン耐性形
質転換株Ｗ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２２を
得た。
【００８８】実施例６−（ｂ） 発現プラスミドｐＧ９
７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２２Ｒ３−２およびｐＧ９７Ｓ４Ｄ
ｈＣＮＰ−２２Ｒ５−２の作製 図１１に示すＲ３−２およびＲ５−２のアミノ酸配列を
コードするリンカーペプチド遺伝子をβ−ｇａｌ９７Ｓ
４Ｄ遺伝子とヒトＣＮＰ−２２遺伝子との結合部に挿入
するため以下の操作を行なった。ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＮ
Ｐ−２２Ｒ３−２およびｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２２
Ｒ５−２の作製を図１２に示す。
７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２２Ｒ３−２およびｐＧ９７Ｓ４Ｄ
ｈＣＮＰ−２２Ｒ５−２の作製 図１１に示すＲ３−２およびＲ５−２のアミノ酸配列を
コードするリンカーペプチド遺伝子をβ−ｇａｌ９７Ｓ
４Ｄ遺伝子とヒトＣＮＰ−２２遺伝子との結合部に挿入
するため以下の操作を行なった。ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＮ
Ｐ−２２Ｒ３−２およびｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２２
Ｒ５−２の作製を図１２に示す。
【００８９】ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２２の３μｇを
５０μｌのＨｉｇｈ緩衝液中で、ＥcoＲＩおよびＸｈｏ
Ｉを各々１０ユニット加え、３７℃、２時間反応を行な
った。反応後、１％寒天ゲル電気泳動を行ない、２．７
kbのＤＮＡ断片をゲルから電気泳動法により回収した。
このＤＮＡ断片と化学合成したＲ３−２およびＲ５−２
配列をコードするオリゴヌクレオチド２０pmolをライゲ
ーションキット（宝酒造）をもちいて、ライゲーション
反応を行ない、その後、常法に従い大腸菌Ｗ３１１０に
形質転換を行なった。テトラサクリン耐性形質転換株よ
りプラスミドを単離し、プラスミドの構造解析を制限酵
素を用いて行ない、目的とするＷ３１１０／ｐＧ９７Ｓ
４ＤｈＣＮＰ−２２Ｒ３−２およびｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣ
ＮＰ−２２Ｒ５−２を得た。
５０μｌのＨｉｇｈ緩衝液中で、ＥcoＲＩおよびＸｈｏ
Ｉを各々１０ユニット加え、３７℃、２時間反応を行な
った。反応後、１％寒天ゲル電気泳動を行ない、２．７
kbのＤＮＡ断片をゲルから電気泳動法により回収した。
このＤＮＡ断片と化学合成したＲ３−２およびＲ５−２
配列をコードするオリゴヌクレオチド２０pmolをライゲ
ーションキット（宝酒造）をもちいて、ライゲーション
反応を行ない、その後、常法に従い大腸菌Ｗ３１１０に
形質転換を行なった。テトラサクリン耐性形質転換株よ
りプラスミドを単離し、プラスミドの構造解析を制限酵
素を用いて行ない、目的とするＷ３１１０／ｐＧ９７Ｓ
４ＤｈＣＮＰ−２２Ｒ３−２およびｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣ
ＮＰ−２２Ｒ５−２を得た。
【００９０】実施例６−（ｃ） ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＮ
Ｐ−２２Ｒ５−３の作製 図１１に示したＲ５−３のアミノ酸配列をコードするリ
ンカーペプチド遺伝子をβ−ｇａｌ９７Ｓ４Ｄ遺伝子と
ヒトＣＮＰ−２２遺伝子との結合部に挿入するため以下
の操作を行なった。ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２２Ｒ５
−３の作製方法を図１３に示す。
Ｐ−２２Ｒ５−３の作製 図１１に示したＲ５−３のアミノ酸配列をコードするリ
ンカーペプチド遺伝子をβ−ｇａｌ９７Ｓ４Ｄ遺伝子と
ヒトＣＮＰ−２２遺伝子との結合部に挿入するため以下
の操作を行なった。ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２２Ｒ５
−３の作製方法を図１３に示す。
【００９１】ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２２ ３μｇを
Ｈｉｇｈ緩衝液５０μｌ中でＥcoＲＩを１０ユニット加
え、３７℃、２時間反応を行なった後、０．５ユニット
のアルカリホスファターゼを加え、５′末端の脱リン酸
化反応を３７℃、１時間行なった。反応終了後、フェノ
ール処理を行なった後、１％寒天ゲル電気泳動を行な
い、２．７kbのＤＮＡ断片をゲルより電気泳動法により
回収した。次に、化学合成したＲ５−３のアミノ酸配列
をコードするオリゴヌクレオチド３μｇを１００μｌの
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ反応液（０．５ＭＴｒｉ
ｓＨＣｌpH８．０，０．１ＭＭｇＣｌ2 ，０．１Ｍ２−
ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ，１mMＡＴＰ）中でＴ
４ヌクレオチドキナーゼを２０ユニットを加え、３７
℃、１時間リン酸化反応を行なった。
Ｈｉｇｈ緩衝液５０μｌ中でＥcoＲＩを１０ユニット加
え、３７℃、２時間反応を行なった後、０．５ユニット
のアルカリホスファターゼを加え、５′末端の脱リン酸
化反応を３７℃、１時間行なった。反応終了後、フェノ
ール処理を行なった後、１％寒天ゲル電気泳動を行な
い、２．７kbのＤＮＡ断片をゲルより電気泳動法により
回収した。次に、化学合成したＲ５−３のアミノ酸配列
をコードするオリゴヌクレオチド３μｇを１００μｌの
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ反応液（０．５ＭＴｒｉ
ｓＨＣｌpH８．０，０．１ＭＭｇＣｌ2 ，０．１Ｍ２−
ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ，１mMＡＴＰ）中でＴ
４ヌクレオチドキナーゼを２０ユニットを加え、３７
℃、１時間リン酸化反応を行なった。
【００９２】このリン酸化したオリゴヌクレオチド２μ
ｌと前述したＥcoＲＩ切断、アルカリホスファターゼ処
理したｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２２とライゲーション
反応を行なった。その後、反応液を常法に従い、大腸菌
Ｗ３１１０に形質転換を行ない、テトラサイクリン耐性
形質転換株を得た。得られた形質転換株よりプラスミド
を単離し、制限酵素による解析を行ない、目的の形質転
換株Ｗ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２２Ｒ５−
３を得た。
ｌと前述したＥcoＲＩ切断、アルカリホスファターゼ処
理したｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２２とライゲーション
反応を行なった。その後、反応液を常法に従い、大腸菌
Ｗ３１１０に形質転換を行ない、テトラサイクリン耐性
形質転換株を得た。得られた形質転換株よりプラスミド
を単離し、制限酵素による解析を行ない、目的の形質転
換株Ｗ３１１０／ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２２Ｒ５−
３を得た。
【００９３】実施例７．ヒトＣＮＰ−２２融合蛋白の生
産 作製した菌株の融合蛋白の等電点と生産性の関係を検討
するため、菌株を培養し、細胞数あたりの融合蛋白のの
生産性をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を用い
て調べた。作製した菌株を５００mlのＮｕｌ培地（酵母
エキス０．４ｇ／Ｌ、リン酸二カリウム４ｇ／Ｌ、リン
酸−カリウム４ｇ／Ｌ、リン酸二ナトリウム２．７ｇ／
Ｌ、硫酸アンモニウム１．２ｇ／Ｌ、塩化アンモニウム
０．２ｇ／Ｌ、０．８％グリセリン、硫酸マグネシウム
２ｇ／Ｌおよびテトラサイクリン１０mg／Ｌ）で３７
℃、１２時間、フラスコで培養を行った。
産 作製した菌株の融合蛋白の等電点と生産性の関係を検討
するため、菌株を培養し、細胞数あたりの融合蛋白のの
生産性をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を用い
て調べた。作製した菌株を５００mlのＮｕｌ培地（酵母
エキス０．４ｇ／Ｌ、リン酸二カリウム４ｇ／Ｌ、リン
酸−カリウム４ｇ／Ｌ、リン酸二ナトリウム２．７ｇ／
Ｌ、硫酸アンモニウム１．２ｇ／Ｌ、塩化アンモニウム
０．２ｇ／Ｌ、０．８％グリセリン、硫酸マグネシウム
２ｇ／Ｌおよびテトラサイクリン１０mg／Ｌ）で３７
℃、１２時間、フラスコで培養を行った。
【００９４】培養後、培養液の濁度（ＯＤ660 ）を分光
光度計で測定し、〔ＯＤ660 値×培養容量（ml）〕の値
が５になるように培養液を採取し、１２０００rpm 、５
分間遠心を行い、菌体を分離した。この菌体沈殿物に１
mlのＳＤＳサンプルバッファー（６３mMＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌpH６．８，１０％グリセリン、１０％ＳＤＳ、５％２
−メルカプトエタノール、１２．５mg／Ｌブロムフェノ
ールブルー）を加え、９５℃ ５分間加熱し、ＳＤＳポ
リアクリルアミドゲル電気泳動の試料とした。
光度計で測定し、〔ＯＤ660 値×培養容量（ml）〕の値
が５になるように培養液を採取し、１２０００rpm 、５
分間遠心を行い、菌体を分離した。この菌体沈殿物に１
mlのＳＤＳサンプルバッファー（６３mMＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌpH６．８，１０％グリセリン、１０％ＳＤＳ、５％２
−メルカプトエタノール、１２．５mg／Ｌブロムフェノ
ールブルー）を加え、９５℃ ５分間加熱し、ＳＤＳポ
リアクリルアミドゲル電気泳動の試料とした。
【００９５】上記試料の５mlを用いてＳＤＳ−１５％ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（ＴＥＦＣＯ製）を１８
mA、９０分間の条件で行った。泳動後、ゲルを染色液
（１０％酢酸、４０％メタノール、２ｇ／Ｌクマジーブ
リリアントブルーＲ２５０）で染色し、各菌株の生産し
たヒトＣＮＰ−２２融合蛋白の細胞あたりの生産性を比
較した。電気泳動の結果を図１４に示す。
リアクリルアミドゲル電気泳動（ＴＥＦＣＯ製）を１８
mA、９０分間の条件で行った。泳動後、ゲルを染色液
（１０％酢酸、４０％メタノール、２ｇ／Ｌクマジーブ
リリアントブルーＲ２５０）で染色し、各菌株の生産し
たヒトＣＮＰ−２２融合蛋白の細胞あたりの生産性を比
較した。電気泳動の結果を図１４に示す。
【００９６】図１４に示すようにＷ３１１０／ｐＧ９６
７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２２：融合蛋白等電点＝４．５６の
菌株を他の菌株（Ｗ３１１０／ｐＧ９６７Ｓ４ＤｈＣＮ
Ｐ−２２Ｒ３−２：融合蛋白等電点＝４．９５、Ｗ３１
１０／ｐＧ９６７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２２Ｒ５−２：融合
蛋白等電点＝６．２２、Ｗ３１１０／ｐＧ９６７Ｓ４Ｄ
ｈＣＮＰ−２２Ｒ５−３：融合蛋白等電点＝５．５９）
を比較すると、Ｗ３１１０／ｐＧ９６７Ｓ４ＤｈＣＮＰ
−２２Ｒ３−２、Ｗ３１１０／ｐＧ９６７Ｓ４ＤｈＣＮ
Ｐ−２２Ｒ５−２およびＷ３１１０／ｐＧ９６７Ｓ４Ｄ
ｈＣＮＰ−２２Ｒ５−３菌株はＷ３１１０／ｐＧ９６７
Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２２より融合蛋白の生産性が向上して
いることが明らかになった。
７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２２：融合蛋白等電点＝４．５６の
菌株を他の菌株（Ｗ３１１０／ｐＧ９６７Ｓ４ＤｈＣＮ
Ｐ−２２Ｒ３−２：融合蛋白等電点＝４．９５、Ｗ３１
１０／ｐＧ９６７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２２Ｒ５−２：融合
蛋白等電点＝６．２２、Ｗ３１１０／ｐＧ９６７Ｓ４Ｄ
ｈＣＮＰ−２２Ｒ５−３：融合蛋白等電点＝５．５９）
を比較すると、Ｗ３１１０／ｐＧ９６７Ｓ４ＤｈＣＮＰ
−２２Ｒ３−２、Ｗ３１１０／ｐＧ９６７Ｓ４ＤｈＣＮ
Ｐ−２２Ｒ５−２およびＷ３１１０／ｐＧ９６７Ｓ４Ｄ
ｈＣＮＰ−２２Ｒ５−３菌株はＷ３１１０／ｐＧ９６７
Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２２より融合蛋白の生産性が向上して
いることが明らかになった。
【００９７】特にＷ３１１０／ｐＧ９６７Ｓ４ＤｈＣＮ
Ｐ−２２Ｒ５−２およびＷ３１１０／ｐＧ９６７Ｓ４Ｄ
ｈＣＮＰ−２２Ｒ５−３菌株は融合蛋白を高発現してい
ることが示された。従って、融合蛋白の等電点を４．９
から６．９の領域に入れることで融合蛋白の生産性が増
加することがこの実施例においても実証された。
Ｐ−２２Ｒ５−２およびＷ３１１０／ｐＧ９６７Ｓ４Ｄ
ｈＣＮＰ−２２Ｒ５−３菌株は融合蛋白を高発現してい
ることが示された。従って、融合蛋白の等電点を４．９
から６．９の領域に入れることで融合蛋白の生産性が増
加することがこの実施例においても実証された。
【００９８】実施例８．Ｖ８プロテアーゼによる融合蛋
白からヒトＣＮＰ−２２の切り出し。 融合蛋白からヒトＣＮＰ−２２をＶ８プロテアーゼを用
いた切り出しの効率を検討するため以下の実験を行なっ
た。Ｗ３１１０／ｐＧ９６７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２２Ｒ３
−２、Ｗ３１１０／ｐＧ９６７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２２Ｒ
５−２およびＷ３１１０／ｐＧ９６７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−
２２Ｒ５−３の菌株を前述のＮｕｌ培地で培養後、培養
液４００mlを採取し、高圧ホモジナイザー（Manton Gau
lin Laboratory Homogenizer 15M-8TA）を用いて６００
kg／cm3 で菌体の破砕処理を行なった。
白からヒトＣＮＰ−２２の切り出し。 融合蛋白からヒトＣＮＰ−２２をＶ８プロテアーゼを用
いた切り出しの効率を検討するため以下の実験を行なっ
た。Ｗ３１１０／ｐＧ９６７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２２Ｒ３
−２、Ｗ３１１０／ｐＧ９６７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２２Ｒ
５−２およびＷ３１１０／ｐＧ９６７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−
２２Ｒ５−３の菌株を前述のＮｕｌ培地で培養後、培養
液４００mlを採取し、高圧ホモジナイザー（Manton Gau
lin Laboratory Homogenizer 15M-8TA）を用いて６００
kg／cm3 で菌体の破砕処理を行なった。
【００９９】その後、７０００rpm 、３０分間の遠心分
離を行ない、封入体を含む沈殿を回収した。得られた沈
殿画分に４００mlの緩衝液Ａ（５０mMＴｒｉｓＨＣｌpH
８．０，２mMＥＤＴＡ，１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）
を添加し、懸濁後再び遠心することにより沈殿の洗浄を
行なった。この沈殿操作を緩衝液Ａを用いて２回、脱イ
オン水を用いて１回行なった。最終的に得られた沈殿を
ＯＤ６６０の値が２０となるように脱イオン水で懸濁
後、以下に示す方法でＶ８プロテアーゼによる融合蛋白
の切断反応を行なった。
離を行ない、封入体を含む沈殿を回収した。得られた沈
殿画分に４００mlの緩衝液Ａ（５０mMＴｒｉｓＨＣｌpH
８．０，２mMＥＤＴＡ，１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）
を添加し、懸濁後再び遠心することにより沈殿の洗浄を
行なった。この沈殿操作を緩衝液Ａを用いて２回、脱イ
オン水を用いて１回行なった。最終的に得られた沈殿を
ＯＤ６６０の値が２０となるように脱イオン水で懸濁
後、以下に示す方法でＶ８プロテアーゼによる融合蛋白
の切断反応を行なった。
【０１００】６０μｌの封入体懸濁液に１ＭＴｒｉｓＨ
ＣｌpH８．０を６μｌ、０．５ｍＭＥＤＴＡを０．６μ
ｌ、尿素３６mgおよび１ＭＤＴＴを３μｌ加えて懸濁
し、１０分間放置した。放置後、最終容量が３００μｌ
になるように脱イオン水を加え、Ｖ８プロテアーゼ（１
mg／ml）を１μｌ加え３０℃、１時間切断反応を行なっ
た。融合蛋白から切断されたヒトＣＮＰ−２２定量をＹ
ＭＣ ＰａｃｋｅｄカラムＡ−３０２（２．４６cm×１
５cm山村化学研究所）を用い高速液体クロマトグラフィ
ー（ＨＰＬＣ）により行なった。
ＣｌpH８．０を６μｌ、０．５ｍＭＥＤＴＡを０．６μ
ｌ、尿素３６mgおよび１ＭＤＴＴを３μｌ加えて懸濁
し、１０分間放置した。放置後、最終容量が３００μｌ
になるように脱イオン水を加え、Ｖ８プロテアーゼ（１
mg／ml）を１μｌ加え３０℃、１時間切断反応を行なっ
た。融合蛋白から切断されたヒトＣＮＰ−２２定量をＹ
ＭＣ ＰａｃｋｅｄカラムＡ−３０２（２．４６cm×１
５cm山村化学研究所）を用い高速液体クロマトグラフィ
ー（ＨＰＬＣ）により行なった。
【０１０１】Ｖ８切断反応液を２Ｍ尿素、６％酢酸溶液
で２０倍希釈し、その２０μｌをもちいＨＰＬＣ分析を
行なった。ＨＰＬＣの溶出は０．１％トリフルオロ酢酸
（ＴＦＡ）と０．１％ＴＦＡ、５０％アセトニトリルを
用いた直線濃度勾配で行なった。β−ｇａｌ９６７Ｓ４
Ｄ ｈＣＮＰ−２２Ｒ５−３融合蛋白のＶ８プロテアー
ゼ切断前、および切断後のＨＰＬＣの溶出パターンをそ
れぞれ図１５および図１６に示す。図１５および図１６
から明らかなようにＶ８プロテアーゼの切断により、融
合蛋白からヒトＣＮＰ−２２標準品と一致するピークが
出現し、融合蛋白からヒトＣＮＰ−２２が特異的に切り
出されることが示された。
で２０倍希釈し、その２０μｌをもちいＨＰＬＣ分析を
行なった。ＨＰＬＣの溶出は０．１％トリフルオロ酢酸
（ＴＦＡ）と０．１％ＴＦＡ、５０％アセトニトリルを
用いた直線濃度勾配で行なった。β−ｇａｌ９６７Ｓ４
Ｄ ｈＣＮＰ−２２Ｒ５−３融合蛋白のＶ８プロテアー
ゼ切断前、および切断後のＨＰＬＣの溶出パターンをそ
れぞれ図１５および図１６に示す。図１５および図１６
から明らかなようにＶ８プロテアーゼの切断により、融
合蛋白からヒトＣＮＰ−２２標準品と一致するピークが
出現し、融合蛋白からヒトＣＮＰ−２２が特異的に切り
出されることが示された。
【０１０２】ヒトＣＮＰ−２２の切断は他のβ−ｇａｌ
９６７Ｓ４Ｄ ｈＣＮＰ−２２Ｒ５−２およびβ−ｇａ
ｌ９６７Ｓ４Ｄ ｈＣＮＰ−２２Ｒ３−２に於ても効率
良く行なわれ、ヒトＣＮＰ−２２標準品と一致するピー
クを同定した。上記の条件で切り出されたヒトＣＮＰ−
２２の量と切断効率はｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＮＰ２２Ｒ３
−２；効率９９％、ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＮＰ２２Ｒ５−
２；効率９５％およびｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＮＰ２２Ｒ５
−３：効率９２％であった。
９６７Ｓ４Ｄ ｈＣＮＰ−２２Ｒ５−２およびβ−ｇａ
ｌ９６７Ｓ４Ｄ ｈＣＮＰ−２２Ｒ３−２に於ても効率
良く行なわれ、ヒトＣＮＰ−２２標準品と一致するピー
クを同定した。上記の条件で切り出されたヒトＣＮＰ−
２２の量と切断効率はｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＮＰ２２Ｒ３
−２；効率９９％、ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＮＰ２２Ｒ５−
２；効率９５％およびｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＮＰ２２Ｒ５
−３：効率９２％であった。
【０１０３】以上示した結果より、ヒトＣＮＰ−２２を
生産するにあたり融合蛋白の等電点を４．９から６．９
に調節するようにリンカーペプチド領域のアミノ酸の電
荷を変えることでヒトＣＮＰ−２２の高生産が行なえる
こと、さらにこのようにして高生産された融合蛋白から
Ｖ８プロテアーゼを用いることでヒトＣＮＰ−２２が特
異的に切り出されることが、本発明者が先に報告したヒ
トカルシトニンの例のみならず、この実施例においても
明らかになった。
生産するにあたり融合蛋白の等電点を４．９から６．９
に調節するようにリンカーペプチド領域のアミノ酸の電
荷を変えることでヒトＣＮＰ−２２の高生産が行なえる
こと、さらにこのようにして高生産された融合蛋白から
Ｖ８プロテアーゼを用いることでヒトＣＮＰ−２２が特
異的に切り出されることが、本発明者が先に報告したヒ
トカルシトニンの例のみならず、この実施例においても
明らかになった。
【０１０４】
【発明の効果】本発明では目的ペプチドを融合蛋白とし
て生産させるにあたり、融合蛋白の等電点を酸性側にな
るように融合蛋白をデザインし、菌体内で封入体として
融合蛋白を高生産することが本発明者等により初めて明
らかにされ、目的ペプチドを有する融合蛋白を高生産す
ることが可能になった。
て生産させるにあたり、融合蛋白の等電点を酸性側にな
るように融合蛋白をデザインし、菌体内で封入体として
融合蛋白を高生産することが本発明者等により初めて明
らかにされ、目的ペプチドを有する融合蛋白を高生産す
ることが可能になった。
【０１０５】従って、本発明における宿主細胞を用いた
大量培養により、目的ペプチドを有する融合蛋白の高い
生産性が得られ、工業スケールでの生理活性ペプチドの
生産に十分使用することが可能である。また、本発明で
得られた宿主細胞を用いて大量培養後、融合蛋白よりヒ
トカルシトニン前駆体を分離精製し、アミド化酵素を用
いてヒトカルシトニン前駆体よりＣ−末端がアミド化さ
れたヒトカルシトニンやヒトＣＮＰ−２２を高収率かつ
高純度で製造する方法を確立することができた。
大量培養により、目的ペプチドを有する融合蛋白の高い
生産性が得られ、工業スケールでの生理活性ペプチドの
生産に十分使用することが可能である。また、本発明で
得られた宿主細胞を用いて大量培養後、融合蛋白よりヒ
トカルシトニン前駆体を分離精製し、アミド化酵素を用
いてヒトカルシトニン前駆体よりＣ−末端がアミド化さ
れたヒトカルシトニンやヒトＣＮＰ−２２を高収率かつ
高純度で製造する方法を確立することができた。
【０１０６】
配列番号：１ 配列の長さ：９９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類： 起源：プラスミド ｐＢＲ３２２ 配列 CGG CAT CAC CGG CGC CAC AGG TGC GGT TGC TGG CGC CTA TAT CGC 45 Arg His His Arg Arg His Arg Cys Gly Cys Trp Arg Leu Tys Arg 5 10 15 CGA CAT CAC CGA TGG GGA AGA TCG GGC TCG CCA CTT CGG GCT CAT 90 Arg His His Arg Trp Gly Arg Ser Gly Ser Pro Leu Arg Ala His 20 25 30 GAG CAA TTC 99 Glu Gln Phe
【０１０７】配列番号：２ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AATTCTCGGG CTCGCCACTT CGGGCTCATC 30
【０１０８】配列番号：３ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TCGAGATGAG CCCGAAGTGG CGAGCCCGAG 30
【０１０９】配列番号：４ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AATTCCGCCT ATATCGCCGA C 21
【０１１０】配列番号：５ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TCGAGTCGGC GATATAGGCG G 21
【０１１１】配列番号：６ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AATTCCGGCA TCACCGGCGC CACAGGC 27
【０１１２】配列番号：７ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TCGAGCCTGT GGCGCCGGTG ATGCCGG 27
【０１１３】配列番号：８ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AATTCCGCCT ATATCGCCGA CATCACCGAT GGGGAAGAC 39
【０１１４】配列番号：９ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TCGAGTCTTC CCCATCGGTG ATGTCGGCGA TATAGGCGG 39
【０１１５】配列番号：１０ 配列の長さ：６９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類： 起源：プラスミド ｐＵＣＣＮＰ１ 配列 GGC TTG TCC AAG GGC TGC TTC GGC CTC AAG CTG GAC CGA ATC GGC 45 Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly 5 10 15 TCC ATG AGC GGC GTG GGA TGT TAG 69 Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 20
【０１１６】配列番号：１１ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TAAGAATTCC TCGAGGGCTT GTCCAAGGGC T 31
【０１１７】配列番号：１２ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TAAGTCGACT TAACATCCCA GGCCGCCGCT 30
【０１１８】配列番号：１３ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AATTCCGGCG CCGAGAGTTC C 21
【０１１９】配列番号：１４ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TCGAGGAACT CTCGGCGCCG G 21
【０１２０】配列番号：１５ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AATTCCGGCG CCATCACCGG CGCCACCGAG AGTTCC 36
【０１２１】配列番号：１６ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TCGAGGAACT CTCGGTGGCG CCGGTGATGG CGCCGG 36
【０１２２】配列番号：１７ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AATTTCGACG CCGTCGCCGA G 21
【０１２３】配列番号：１８ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AATTCTCGGC GACGGCGTCG A 21
【図１】図１はプラスミドｐＢＲ３２２中のヌクレオチ
ド位置４０３〜４９５耐性遺伝子の一部分のヌクレオチ
ド配列及び対応するアミノ酸配列、並びに各リンカーペ
プチドをコードする部分を示し、この配列を配列番号１
に示す。
ド位置４０３〜４９５耐性遺伝子の一部分のヌクレオチ
ド配列及び対応するアミノ酸配列、並びに各リンカーペ
プチドをコードする部分を示し、この配列を配列番号１
に示す。
【図２】図２はプラスミドｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕
Ｒ１０及びｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ６の作製過程
を示す。
Ｒ１０及びｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ６の作製過程
を示す。
【図３】図３はプラスミドｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕
Ｒ８の作製過程を示す。
Ｒ８の作製過程を示す。
【図４】図４はプラスミドｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕
Ｒ１〜Ｒ５の作製過程を示す。
Ｒ１〜Ｒ５の作製過程を示す。
【図５】図５はリンカー部分をコードするＤＮＡである
Ｒ１〜Ｒ５のヌクレオチド配列を示し、これらの配列は
さらに配列番号：２〜９にも示す。
Ｒ１〜Ｒ５のヌクレオチド配列を示し、これらの配列は
さらに配列番号：２〜９にも示す。
【図６】図６は各リンカーペプチドのアミノ酸配列を示
す。
す。
【図７】図７は、各発現プラスミドからの融合蛋白の発
現の状態を示す電気泳動図であり、図面に代る写真であ
る。
現の状態を示す電気泳動図であり、図面に代る写真であ
る。
【図８】図８は、本発明の方法により得られたヒトカル
シトニンの高速液体クロマトグラフィーの結果を示す。
シトニンの高速液体クロマトグラフィーの結果を示す。
【図９】図９は、ＣＮＰ−２２のアミノ酸配列及びそれ
をコードするヌクレオチド配列並びにその両端に制限酵
素部位を挿入するためのＰＣＲプライマーを示す。
をコードするヌクレオチド配列並びにその両端に制限酵
素部位を挿入するためのＰＣＲプライマーを示す。
【図１０】図１０は、プラスミドｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＮ
Ｐ−２２の作製過程を示す。
Ｐ−２２の作製過程を示す。
【図１１】図１１は、融合蛋白質の等電点を調節するた
めのリンカーペプチドおよびそれをコードするオリゴヌ
クレオチドの配列を示す。
めのリンカーペプチドおよびそれをコードするオリゴヌ
クレオチドの配列を示す。
【図１２】図１２は、プラスミドｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＮ
Ｐ−２２Ｒ３−２、及びｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２２
Ｒ５−２の作製過程を示す。
Ｐ−２２Ｒ３−２、及びｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２２
Ｒ５−２の作製過程を示す。
【図１３】図１３は、プラスミドｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＮ
Ｐ−２２Ｒ５−３の作製過程を示す。
Ｐ−２２Ｒ５−３の作製過程を示す。
【図１４】図１４は、等電点を調節した融合蛋白質の発
現量を比較した結果を示す電気泳動図である。
現量を比較した結果を示す電気泳動図である。
【図１５】図１５は、ｈＣＮＰ−２２を切り出す前の融
合蛋白質の高速液体クロマトグラフィーにおける溶出を
示す。
合蛋白質の高速液体クロマトグラフィーにおける溶出を
示す。
【図１６】図１６は、融合蛋白質からｈＣＮＰ−２２を
切り出した後の高速液体クロマトグラフィーにおける溶
出を示す。
切り出した後の高速液体クロマトグラフィーにおける溶
出を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/67 15/70 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 大末 和廣 群馬県邑楽郡千代田町大字赤岩字くらかけ 2716番地１ サントリー株式会社医薬セン ター内 (72)発明者 大島 武博 群馬県邑楽郡千代田町大字赤岩字くらかけ 2716番地１ サントリー株式会社医薬セン ター内 (72)発明者 小内 誠子 群馬県邑楽郡千代田町大字赤岩字くらかけ 2716番地１ サントリー株式会社医薬セン ター内 (72)発明者 孫田 浩二 大阪府三島郡島本町若山台１丁目１番１号 サントリー株式会社生物医学研究所内 (72)発明者 田中 正治 大阪府三島郡島本町若山台１丁目１番１号 サントリー株式会社生物医学研究所内
Claims (1)
- 【請求項１】 ペプチド（目的ペプチド）の製造方法で
あって、 Ａ）次の式で表される融合蛋白： Ａ−Ｌ−Ｂ （式中、Ｂは目的ペプチドであり、Ａは９０〜２００個
のアミノ酸残基からなる保護ペプチドであり、そしてＬ
は該保護ペプチドのＣ−末端と該目的ペプチドのＮ−末
端との間に位置するリンカーペプチドであり、かつ該融
合蛋白を酵素または化学物質により処理した場合に前記
目的ペプチドが切り離されるように選択されており、そ
してＡ−Ｌ−Ｂの融合蛋白全体の等電点が４．９〜６．
９の範囲にあるように該保護ペプチド及びリンカーペプ
チドが選択されている）をコードする遺伝子を発現する
ことができるプラスミドにより形質転換された宿主細胞
を培養し、 Ｂ）該形質転換体の培養菌体を破砕して封入体の不溶性
画分を得、 Ｃ）該不溶性画分を可溶化剤で処理することにより、該
封入体中の融合蛋白を可溶化し、そして Ｄ）該可溶化された融合蛋白の前記リンカーアミノ酸残
基のＣ−末端と前記目的ペプチドのＮ−末端の間のペプ
チド結合を酵素又は化学物質により切断して該目的ペプ
チドを他のペプチドから切り離すことを特徴とする製造
方法。
Priority Applications (9)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22352092A JP3531947B2 (ja) | 1991-08-19 | 1992-07-31 | ペプチドの製造方法 |
| AT92307577T ATE253639T1 (de) | 1991-08-19 | 1992-08-12 | Verfahren zur herstellung von peptiden |
| AU21078/92A AU656791C (en) | 1991-08-19 | 1992-08-17 | Process for producing peptide |
| CA002076320A CA2076320C (en) | 1991-08-19 | 1992-08-18 | Process for producing peptide |
| HU9202688A HU216335B (hu) | 1991-08-19 | 1992-08-19 | Eljárás peptidek előállítására |
| EP92307577A EP0528686B8 (en) | 1991-08-19 | 1992-08-19 | Process for producing peptides |
| ES92307577T ES2206443T3 (es) | 1991-08-19 | 1992-08-19 | Procedimiento para producir peptidos. |
| DE69233245T DE69233245T2 (de) | 1991-08-19 | 1992-08-19 | Verfahren zur Herstellung von Peptiden |
| US08/352,179 US5670340A (en) | 1991-08-19 | 1994-12-05 | Process for producing peptides in E. coli |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23076991 | 1991-08-19 | ||
| JP3-230769 | 1991-08-19 | ||
| JP22352092A JP3531947B2 (ja) | 1991-08-19 | 1992-07-31 | ペプチドの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05328992A true JPH05328992A (ja) | 1993-12-14 |
| JP3531947B2 JP3531947B2 (ja) | 2004-05-31 |
Family
ID=16912979
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22352092A Expired - Fee Related JP3531947B2 (ja) | 1991-08-19 | 1992-07-31 | ペプチドの製造方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5670340A (ja) |
| JP (1) | JP3531947B2 (ja) |
Cited By (3)
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|---|---|---|---|---|
| EP0700995A2 (en) | 1994-09-07 | 1996-03-13 | Suntory Limited | Process for production of protein |
| WO1999038984A1 (fr) * | 1998-01-30 | 1999-08-05 | Suntory Limited | Procede de production de peptide au moyen d'un peptide accessoire |
| JP2002520018A (ja) * | 1998-07-10 | 2002-07-09 | サイオス インコーポレイテッド | ８より上または５未満のｐＩを有するペプチドを産生するための方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3728945B2 (ja) * | 1998-10-30 | 2005-12-21 | オルガノ株式会社 | フォトレジスト現像廃液からの現像液の回収再利用方法及び装置 |
| KR100368073B1 (ko) * | 1999-03-09 | 2003-01-24 | 한국생명공학연구원 | 융합파트너를 이용한 재조합 단백질의 제조방법 |
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