CN100445394C

CN100445394C - 控制OmpT蛋白酶切割的方法

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Publication number: CN100445394C
Application number: CNB008006261A
Authority: CN
Inventors: 奥野和昭; 籔田雅之; 大末和广
Original assignee: Asubio Pharma Co Ltd
Current assignee: Asubio Pharma Co Ltd
Priority date: 1999-03-04
Filing date: 2000-03-03
Publication date: 2008-12-24
Anticipated expiration: 2020-03-03
Also published as: AU758633B2; EP1076097A4; DE60040771D1; ATE414164T1; WO2000052193A1; KR20010043333A; KR100916169B1; JP4471501B2; CN1302337A; AU2828800A; CA2327524A1; EP1076097A1; EP1076097B1; ES2316352T3; CA2327524C; IL139338A0; US7344856B1

Abstract

OmpT蛋白酶的特性已被阐明，从而提供了作为蛋白酶的新用途和产生预期多肽的新方法。更具体地说，提供了控制通过OmpT蛋白酶进行多肽切割的方法，包括将多肽中任意两连续氨基酸组成的序列位点和/或此位点周围的氨基酸转变成其它的氨基酸，此方法的特征在于：(1)相对于上述位点为-1位置的氨基酸是赖氨酸或精氨酸，将+1位置的氨基酸转变成特异氨基酸；和/或(2)从上述位置数为-4位置和/或-6位置的氨基酸被转变成特异氨基酸，从而防止通过OmpT蛋白酶切割下不需要的多肽部分。

Description

控制OmpT蛋白酶切割的方法

发明领域

本发明涉及通过应用调查大肠杆菌OmpT蛋白酶的底物特异性已发现的新切割和识别位点控制OmpT蛋白酶对多肽的切割的方法。

一方面，本发明涉及利用OmpT蛋白酶切割多肽的方法。更具体地说，它涉及利用OmpT蛋白酶的新切割和识别位点切割多肽的方法。

另一方面，本发明涉及利用OmpT蛋白酶从融合蛋白质中切出生理活性肽、蛋白质及其衍生物的方法。更具体地说，它涉及这样一种方法，即通过调查OmpT蛋白酶的底物特异性，从而发现新切割方法及切割和识别位点，然后利用此特性从融合蛋白质中有效生产生理活性肽、蛋白质及其衍生物。

本发明进一步涉及避免在非预期位点由OmpT蛋白酶对多肽进行切割的方法。尤其是，它涉及避免在宿主细胞产生的状态下由OmpT蛋白酶切割生理活性肽、蛋白质和其衍生物的方法。也就是说，本发明提供了通过改变OmpT蛋白酶切割位点或其附近的氨基酸序列而制备不(或几乎不)可被OmpT蛋白酶切割的生理活性肽、蛋白质或其衍生物的方法。

现有技术

大肠杆菌OmpT蛋白酶是存在于大肠杆菌外膜部分的蛋白酶并主要选择性的切割碱性氨基酸对之间的键(Sugimura，K.和Nishihara，T.细菌学杂志(J.Bacteriol.170：5625-5632，1988)。此酶分子量为36000，似乎归类于丝氨酸蛋白酶类。Sugimura等人调查了该OmpT蛋白酶的底物特异性，并报道了此酶特异切割碱性氨基酸对精氨酸-精氨酸、赖氨酸-赖氨酸、精氨酸-赖氨酸和赖氨酸-精氨酸中心的肽键。此外，已发现了氨基酸序列中除上述碱基对之外的其它切割位点。即，已报道通过OmpT蛋白酶的切割出现于精氨酸-甲硫氨酸(Zhao，G-P.和Somerville，R.L.生物化学杂志268，14912-14920，1993)、精氨酸-丙氨酸(Lassen S.F.等，Biochem.Int.27：601-611，1992)和精氨酸-缬氨酸(Maurer，J.细菌学杂志179：794-804，1997)。此蛋白酶的特征在于它并非切割含这些序列的所有蛋白质和多肽，而是专门在特异位点切割特异蛋白质和肽。例如，γ-干扰素包含如上所述的10个序列，但其中只有两个序列可被OmpT蛋白酶专门切割(Sugimura，K.和Higashi，N.细菌学杂志170：3650-3654，1988)。T7RNA聚合酶含如上所述的17个序列，但其中只有两个序列可专门被OmpT蛋白酶切割(Grodberg，J和Dunn，J.J.细菌学杂志170：1245-1253，1988)。这些事实表明关于OmpT蛋白酶切割位点的上述资料不可应用于其切割位点的估计，它不同于通常应用在蛋白质肽谱中的AP-1和胰蛋白酶，后二者的切割位点可以已知数据为基础进行估计。既然OmpT蛋白酶的切割产生于蛋白质或肽的特异位点，预期除上述氨基酸序列外的其它氨基酸序列(即切割位点的N-末端和C-末端氨基酸序列)可能参与切割。不过，至今仍未知什么氨基酸序列允许(或不允许)切割。

然而，因为它对切割位点具有高特异性且是大肠杆菌内源蛋白酶之一，OmpT蛋白酶已被用于从基因重组技术构建的融合蛋白质中切下靶多肽。为了利用大肠杆菌释放和产生胆固醇酯酶，Hanke等人成功地将酯酶与大肠杆菌溶血素A蛋白质融合且融合蛋白质被释放于细胞外，然后通过外膜上的OmpT蛋白酶处理蛋白质从而成功地从融合蛋白质中获得活性胆固醇酯酶。Hanke等人应用具有精氨酸-赖氨酸序列的接头并用OmpT蛋白酶切割此序列(Hanke，C等人，Mol.Gen.Genet.233：42-48，1992)。

本发明的发明者发现OmpT蛋白酶抗变性剂，他们阐明利用上述特性可在变性剂存在下切割作为包涵体表达的融合蛋白质。即，通过在大肠杆菌表达系统中以包涵融合体形式表达S.aureus V8蛋白酶衍生物融合蛋白质，用尿素将其溶解，然后在尿素存在下利用OmpT蛋白酶从融合蛋白质中释放V8蛋白酶衍生物部分并最后再折叠，本发明的发明者成功地生产了具有酶促活性的V8蛋白酶衍生物(Yabuta，M.，Ochi，N和Ohsuye，K.应用微生物工程技术44：118-125，1995)。

为了从融合蛋白质中释放靶肽或靶蛋白，习惯上应用对氨基酸序列具有高度特异性的酶。已知应用于此目的的蛋白酶例子包括Xa因子、凝血酶、肠激酶等等，它们是来源于哺乳动物的酶，供给量少而花费又高。因此，这些酶不适用于通过融合蛋白质方式大量生产的肽和蛋白质的工业处理。当靶肽或蛋白质用作药品时，还需要考虑来源于酶的病毒污染。相比之下，因为来源于大肠杆菌，OmpT蛋白酶在供应、成本和安全性上明显优于这些酶。

然而，此酶的底物特异性还未充分研究，因此现阶段难于任意设计预期切除部分的切割位点。此外，OmpT蛋白酶并非切割所有上述序列(即，精氨酸-精氨酸、赖氨酸-赖氨酸、精氨酸-赖氨酸、赖氨酸-精氨酸、精氨酸-甲硫氨酸、精氨酸-丙氨酸和精氨酸-缬氨酸)，而是专门切割蛋白质的特异位点。因此，当由这些两氨基酸组成的序列之一只是简单地位于融合蛋白质的接头位点处时，此位点通常不能被OmpT蛋白酶切割。即使它可被切割，OmpT蛋白酶切割由两氨基酸组成的切割位点中心处的肽键。因此，当此酶切割依次含保护肽、OmpT蛋白酶切割位点氨基酸序列和靶多肽的融合蛋白时，位于切割位点+1位置处的氨基酸将被添加至靶多肽的N-末端。而且，此添加氨基酸不可任意选择，而是基于迄今报道的OmpT蛋白酶识别序列而局限于精氨酸、赖氨酸、缬氨酸、丙氨酸或甲硫氨酸。这些OmpT蛋白酶的特性在作为蛋白酶用于切割融合蛋白时是不利的。

另一方面，已知蛋白酶木瓜蛋白酶的切割效率不仅受底物中的切割位点序列影响，还受其邻近氨基酸序列的影响(Schechter，I.和Berger，A.Biochem.Biophys.Res.Commun.27：157-162，1967)。最近还对Kex2(Rockwell，N.C.，Wang，G.T.，Krafft，G.A.和Fuller，R.S.生物化学36，1912-1917，1997)和弗林蛋白酶(Krysan，D.J.，Rockwell，N.C.和Fuller，R.S.生物化学杂志274，23229-23234，1999)进行了详细的研究，它们是切割碱性氨基酸对C-末端侧的蛋白酶。在Kex2和弗林蛋白酶中，通过比较底物氨基酸序列已阐明切割位点处的共有序列及其附近的氨基酸序列。以OmpT蛋白酶为例，基于目前已知的底物比较，认为精氨酸或赖氨酸是切割位点N-末端侧1位置必需的氨基酸，但迄今为止还未发现其它明显的共有序列。尽管推测切割位点的识别和OmpT蛋白酶的切割效率可能不仅受底物切割位点的影响，还可能受其邻近氨基酸序列的影响，现阶段还不可能利用这些特性控制OmpT蛋白酶的切割。

在本发明中，多肽内各氨基酸的定位表示如下。多肽中由两任意连续氨基酸组成的序列位点被称为切割位点或待OmpT蛋白酶切割的位点。在涉及此位点的氨基酸间，N-末端侧的氨基酸被称为-1位置，而C-末端侧的氨基酸被称为+1位置。然后此位点N-末端侧第1、2、3位等处的氨基酸分别被称为位于-1、-2、-3等等位置的氨基酸，而此位点C-末端侧第1、2、3位等处的氨基酸分别被称为位于+1、+2、+3等等位置的氨基酸。当氨基酸取代被引入此位点或其附近以使该位点变成不可切割或可切割时，序列中的相应氨基酸用上述编号代表。

例如，当氨基酸序列亮氨酸-酪氨酸-赖氨酸-精氨酸-组氨酸将在赖氨酸和精氨酸(即两任意连续氨基酸)间的键处被切割时，亮氨酸、酪氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸分别为位于-3、-2、-1、+1和+2位置的氨基酸。

发明概述

如上所述，OmpT蛋白酶非常有用。不过，当OmpT蛋白酶被用作切割融合蛋白质的酶时，目前会引起一些问题，诸如未知任何设计切割位点处的氨基酸序列以便特异切割，由于靶肽N-末端氨基酸的局限性限制了切割获得的靶肽，以及切割不能有效完成。不过，预期通过进一步研究切割位点及其附近的氨基酸序列并建立新切割方法或新识别/切割序列，从而制备更利于切割融合蛋白质的OmpT蛋白酶，可解决这些问题。

相反，有时在利用大肠杆菌的肽或蛋白质生产中出现OmpT蛋白酶切割问题。OmpT蛋白酶切割可通过，例如用OmpT蛋白酶缺陷型大肠杆菌菌株作为宿主或在保温和纯化步骤中添加OmpT蛋白酶抑制剂避免。不过，这些方法还未被普遍应用，因为应用于前一种方法中的突变株在某些情况下不适合作为宿主，而后一方法中酶抑制剂的添加引起生产成本的提高或害怕抑制剂可能残留于产物中。此外，在这些情况下，不可能使用OmpT蛋白酶作为切割融合蛋白质的酶。

如果通过改变不期望有的OmpT蛋白酶切割位点处或其邻近的氨基酸可避免切割，则OmpT蛋白酶可能可用作切割酶。因此，如果有可能通过阐明OmpT蛋白酶识别/切割序列的特性，预期切割可被有效避免，同时使氨基酸序列的改变最小。

附图简述

图1是pG117S4HR6GLP-1构建的概略说明，其中β-gal117S4H代表编码来源于大肠杆菌β-半乳糖苷酶之N-末端117个氨基酸的保护蛋白质的区域；PSRHKR代表编码氨基酸序列PSRHKR(SEQ ID NO：60)的区域；GLP-1[G]代表编码人胰高血糖素样肽-1的区域；R6代表编码氨基酸序列QMHGYDAELRLYRRHHRWGRSGS(SEQ ID NO：61)的区域；Tc^r代表四环素抗性基因；而lac PO代表大肠杆菌乳糖启动子操纵子基因。关于pG117S4HGP，参阅日本公开的专利申请9-296000和EP 794255。

图2是pG117S4HompRHKR构建的概略说明，其中β-gal117S4H代表编码来源于大肠杆菌β-半乳糖苷酶之N-末端117个氨基酸的保护蛋白质的区域；PSRHKR代表编码氨基酸序列PSRHKR的区域；GLP-1[G]代表编码人胰高血糖素样肽-1的区域；R6代表编码氨基酸序列QMHGYDAELRLYRRHHRWGRSGS的区域；Tc^r代表四环素抗性基因；L1代表氨基酸序列QMHGYDAELRLYRRHHGSGS(SEQ ID NO：62)；而lac PO代表大肠杆菌乳糖启动子操纵子基因。

图3是pG117S4HompRHPR构建的概略说明，其中β-gal117S4H代表编码来源于大肠杆菌β-半乳糖苷酶之N-末端117个氨基酸的保护蛋白质的区域；PSRHKR代表编码氨基酸序列PSRHKR的区域；GLP-1[G]代表编码人胰高血糖素样肽-1的区域；R6代表编码氨基酸序列QMHGYDAELRLYRRHHRWGRSGS的区域；Tc^r代表四环素抗性基因；L1代表氨基酸序列QMHGYDAELRLYRRHHGSGS；PSRHPR代表编码氨基酸序列PSRHPR(SEQ ID NO：63)的区域；连接肽代表编码氨基酸序列QMHGYDAELRLYRRHHGSGSPSRHPR(SEQID NO：64)的区域，其中L1是与PSRHPR连接的合成DNA；而lac PO代表大肠杆菌乳糖启动子操纵基因。

图4显示由pG117S4HompRHPR编码的融合蛋白质PR的完整氨基酸序列，其中下划线部分相应于人胰高血糖素样肽-1(GLP-1[G])的氨基酸序列；双下划线部分相应于已转换成另一氨基酸的精氨酸；而箭头显示OmpT蛋白酶的切割位点。数字符号表示从N-末端计数的氨基酸号。来源于大肠杆菌β-半乳糖苷酶之N-末端117个氨基酸的保护蛋白质(β-gal117S4H)包括从1位甲硫氨酸至127位精氨酸的氨基酸序列。连接肽包含从128位谷氨酰胺至153位精氨酸的氨基酸序列。前-GLP-1[G]包含从+1位精氨酸(针对OmpT蛋白酶切割位点)至184位甘氨酸的氨基酸序列。

图5是pG117ompPRX构建的概略说明，其中β-gal117S4H代表编码来源于大肠杆菌β-半乳糖苷酶之N-末端117个氨基酸的保护蛋白质的区域；GLP-1[G]代表编码人胰高血糖素样肽-1的区域；Tc^r代表四环素抗性基因；连接肽代表编码从128位谷氨酰胺至153位精氨酸的氨基酸序列的区域；而lac PO代表大肠杆菌乳糖启动子操纵基因。

图6是显示由pG117ompPRX编码之融合蛋白质PRX结构的概略说明，其中数字符号表示从融合蛋白质PRX N-末端计数的氨基酸号。β-gal117S4H代表来源于大肠杆菌β-半乳糖苷酶之N-末端117个氨基酸的保护蛋白质；GLP-1[G]代表人胰高血糖素样肽-1；前-GLP-1[G]代表包括从141至184位含GLP-1[G]之氨基酸序列的靶肽；而连接肽代表从128位谷氨酰胺至153位精氨酸的氨基酸序列。融合蛋白质PR中相应于OmpT蛋白酶切割位点的位点(精氨酸140-X141)显示于此图中。

图7是pOmpTTc构建的概略说明，其中β-gal117S4H代表编码来源于大肠杆菌β-半乳糖苷酶之N-末端117个氨基酸的保护蛋白质的区域；GLP-1[G]代表编码人胰高血糖素样肽-1的区域；Tc^r代表四环素抗性基因；Ap^r代表氨苄青霉素抗性基因；连接肽代表编码氨基酸序列QMHGYDAELRLYRRHHGSGSPSRHPR的区域；OmpT代表OmpT蛋白酶基因；lac PO代表大肠杆菌乳糖启动子操纵基因；而trpP代表大肠杆菌色氨酸启动子基因。

从转录起始位点至OmpT蛋白酶翻译起始点之后第五个氨基酸密码子的核苷酸序列是5′AATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAGAATTCATGCGGGCGAAACTT3′(SEQ ID NO：65)，其中下划线部分相应于EcoRI识别位点。关于pGP501，参阅K.Sugimura，Biochem.Biophys.Res.Commun.153：753-759，1988。

图8是pOmpTTcB构建的概略说明，其中OmpT代表OmpT蛋白酶基因；Tc^r代表四环素抗性基因；而lac PO代表大肠杆菌乳糖启动子操纵基因。

从转录起始位点至OmpT蛋白酶翻译起始点之后第五个氨基酸密码子的核苷酸序列是5′AATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAGAATTCAAAATGCGGGCGAAACTG3′(SEQ ID NO：66)，其中下划线部分相应于EcoRI识别位点。

图9是pOmpTTcB构建的概略说明，其中OmpT代表OmpT蛋白酶基因；Tc^r代表四环素抗性基因；而lac PO代表大肠杆菌乳糖启动子操纵基因。

从转录起始位点至OmpT蛋白酶翻译起始点之后第五个氨基酸密码子的核苷酸序列是5′AATTGTGAGCGGATAAAAATTACAGACAGGAAGAATTCATGCGGGCGAAACTT3′(SEQ ID NO：67)，其中下划线部分相应于EcoRI识别位点。

图10是pOmpTTcE构建的概略说明，其中OmpT代表OmpT蛋白酶基因；Tc^r代表四环素抗性基因；而lac PO代表大肠杆菌乳糖启动子操纵基因。

从转录起始位点至OmpT蛋白酶翻译起始点之后第五个氨基酸密码子的核苷酸序列是5′AATTGTGAGCGGATAAAAATTACAGACAGGAAGAATTCAAAATGCGGGCGAAACTG3′(SEQ ID NO：68)，其中下划线部分相应于EcoRI识别位点。

图11是用OmpT蛋白酶切割融合蛋白质PRX的SDS-PAGE(16％)的照片。

在此图中，Mr表示分子量标记蛋白质；O表示纯化的OmpT蛋白酶泳道；-代表无OmpT蛋白酶的泳道；而+代表添加OmpT蛋白酶的泳道。

A：PRA，V：PRV，L：PRL，I：PRI，P：PRP，F：PRF，W：PRW，M：PRM，G：PRG，S：PRS，

T：PRT，C：PRC，Y：PRY，N：PRN，Q：PRQ，D：PRD，E：PRE，K：PRK，R：PRR，H：PRH.

4.9kDa的肽片段表示已被OmpT蛋白酶切下的含GLP-1[G]的肽片段。

图12是pG117OmpPKX构建的概略说明，其中β-gal117S4H代表编码来源于大肠杆菌β-半乳糖苷酶之N-末端117个氨基酸的保护蛋白质的区域；GLP-1[G]代表编码人胰高血糖素样肽-1的区域；Tc^r代表四环素抗性基因；连接肽代表编码从128位谷氨酰胺至153位精氨酸的氨基酸序列的区域；lac PO代表大肠杆菌乳糖启动子操纵基因。

图13是显示由pG117ompPKX编码之融合蛋白质PKX结构的概略说明，其中数字符号表示从融合蛋白质PKX N-末端计数的氨基酸号。β-gal117S4H代表来源于大肠杆菌β-半乳糖苷酶之N-末端117个氨基酸的保护蛋白质；GLP-1[G]代表人胰高血糖素样肽-1；前-GLP-1[G]代表包括从141至184位含GLP-1[G]之氨基酸序列的靶肽；而连接肽代表从128位谷氨酰胺至153位精氨酸的氨基酸序列。融合蛋白质PRR中相应于OmpT蛋白酶切割位点的位点(赖氨酸140-X141)显示于此图中。

图14是用OmpT蛋白酶切割融合蛋白质PKX的SDS-PAGE(16％)的照片。在此图中，Mr表示分子量标记蛋白质；O表示纯化的OmpT蛋白酶泳道；-代表无OmpT蛋白酶的泳道；而+代表添加OmpT蛋白酶的泳道。

KA、KS、KK、KR、KD和KE分别代表PKA、PKS、PKK、PKR、PKD和PKE。

4.9kDa的肽片段表示已被OmpT蛋白酶切下的含GLP-1[G]的肽片段。

图15是pG117ompPRhANP构建的概略说明，其中β-gal117S4H代表编码来源于大肠杆菌β-半乳糖苷酶之N-末端117个氨基酸的保护蛋白质的区域；GLP-1[G]代表编码人胰高血糖素样肽-1的区域；α-hANP代表编码α-型人心房肽的区域；Tc^r代表四环素抗性基因；连接肽1代表编码氨基酸序列QFK(SEQ ID NO：69)的区域；连接肽2代表编码氨基酸序列QMHGYDAELRLYRRHHGSGSPYRHPR(SEQ ID NO：70)的区域；连接肽3代表编码氨基酸序列QMHGYDAELRLYR(SEQ ID NO：71)的区域；lac PO代表大肠杆菌乳糖启动子操纵基因。至于pGHα97SII，参阅“Daichokin o shukushu toshita seirikassei peputidoseisankei ni kansuru kenkyu(关于利用大肠杆菌作为宿主的生理活性肽生产系统的研究)”，Koji Magota，Doctoral Dissertation，Kyushu大学，1991。

图16是显示由pG117ompPRhANP编码之融合蛋白质PRhANP结构的概略说明，其中数字符号表示从融合蛋白质PRhANP N-末端计数的氨基酸号。β-gal117S4H代表来源于大肠杆菌β-半乳糖苷酶之N-末端117个氨基酸的保护蛋白质；α-hANP代表α-型人心房肽；而连接肽代表从128位谷氨酰胺至140位精氨酸的氨基酸序列。融合蛋白质PRR中相应于OmpT蛋白酶切割位点的位点(精氨酸140-丝氨酸141)显示于此图中。

图17是pG117ompPRhCT构建的概略说明，其中β-gal117S4H代表编码来源于大肠杆菌β-半乳糖苷酶之N-末端117个氨基酸的保护蛋白质的区域；β-gal197S4D代表编码来源于大肠杆菌β-半乳糖苷酶之N-末端97个氨基酸的保护蛋白质的区域；GLP-1[G]代表编码人胰高血糖素样肽-1的区域；Tc^r代表四环素抗性基因；连接肽1代表编码氨基酸序列EFRHHRRHRLE(SEQ ID NO：72)的区域；连接肽2代表编码氨基酸序列QMHGYDAELRLYRRHHGSGSPYRHPR的区域；连接肽3代表编码氨基酸序列QMHGYDAELRLYR的区域；lac PO代表大肠杆菌乳糖启动子操纵基因。至于pG97S4DhCT[G]R4，参阅Yabuta，M.，Suzuki，Y.和Ohsuye，k.应用微生物工程技术42：703-708，1995。

图18是显示由pG117ompPRhCT编码之融合蛋白质PRhCT结构的概略说明，其中数字符号表示从融合蛋白质PRhCT N-末端计数的氨基酸号。β-gal117S4H代表来源于大肠杆菌β-半乳糖苷酶之N-末端117个氨基酸的保护蛋白质；hCT[G]代表人降钙素前体；而连接肽代表从128位谷氨酰胺至140位精氨酸的氨基酸序列。融合蛋白质PRR中相应于OmpT蛋白酶切割位点的位点(精氨酸140-半胱氨酸141)显示于此图中。

图19是用OmpT蛋白酶切割融合蛋白质PRhANP和PRhCT的SDS-PAGE(16％)的照片。在此图中，Mr表示分子量标记蛋白质；O表示纯化的OmpT蛋白酶；-代表无OmpT蛋白酶的泳道；而+代表添加OmpT蛋白酶的泳道。

hANP和hCT分别代表PRhANP和PRhCT。

图20是pGRShANP构建的概略说明，其中β-gal197S代表编码来源于大肠杆菌β-半乳糖苷酶之N-末端97个氨基酸的保护蛋白质的区域；α-hANP代表编码α-型人心房肽的区域；Tc^r代表四环素抗性基因；连接肽1代表编码氨基酸序列QFK的区域；连接肽2代表编码氨基酸序列QFR(SEQ ID NO：73)的区域；lac PO代表大肠杆菌乳糖启动子操纵基因。

图21显示由pGRShANP编码的融合蛋白质RShANP的完整氨基酸序列，其中下划线部分代表α-hANP(α-型人心房肽)的氨基酸序列；双下划线部分相应于已转换成另一氨基酸的丝氨酸；而箭头显示OmpT蛋白酶的切割位点。数字符号表示从N-末端计数的氨基酸号。来源于大肠杆菌β-半乳糖苷酶之N-末端97个氨基酸的保护蛋白质(β-gal197S)包括从1位甲硫氨酸至98位丙氨酸的氨基酸序列。连接肽包含从99位谷氨酰胺至101位精氨酸的氨基酸序列。

图22是pGRSXhANP构建的概略说明，其中β-gal97S代表编码来源于大肠杆菌β-半乳糖苷酶之N-末端97个氨基酸的保护蛋白质的区域；修饰的α-hANP代表编码N-末端氨基酸取代成精氨酸、丙氨酸或半胱氨酸的α-型人心房肽衍生物的区域；Tc^r代表四环素抗性基因；连接肽代表编码氨基酸序列QFK的区域；lac PO代表大肠杆菌乳糖启动子操纵基因。

图23是显示融合蛋白质RXhANP结构的概略说明，其中数字符号表示从融合蛋白质PRhANP N-末端计数的氨基酸号。β-gal97S代表来源于大肠杆菌β-半乳糖苷酶之N-末端97个氨基酸的保护蛋白质；修饰的α-hANP代表N-末端氨基酸取代成精氨酸、丙氨酸或半胱氨酸的α-型人心房肽衍生物；而连接肽代表从99位谷氨酰胺至101位精氨酸的氨基酸序列。融合蛋白质RShANP中相应于OmpT蛋白酶切割位点的位点(精氨酸101-X102)显示于此图中。

图24是用OmpT蛋白酶切割融合蛋白质RShANP和RXhANP的SDS-PAGE(16％)的照片。

在此图中，Mr表示分子量标记蛋白质；-代表无OmpT蛋白酶的泳道；而+代表添加OmpT蛋白酶的泳道。RS、RR、RA和RC分别代表RShANP、RRhANP、RAhANP和RChANP。

图25是显示由pG117ompPRRXA编码之融合蛋白质PRRXA结构的概略说明，其中-10、-5、-1、+1和+4分别表示针对融合蛋白质PRR之OmpT蛋白酶切割位点的-10、-5、-1、+1和+4位置。融合蛋白质PRR和PRRXA的氨基酸序列(从-10至+4位置)显示于图中。β-gal117S4H代表来源于大肠杆菌β-半乳糖苷酶之N-末端117个氨基酸的保护蛋白质；GLP-1[G]代表人胰高血糖素样肽-1；连接肽相应于图6所示氨基酸序列第128位谷氨酰胺至153位精氨酸的氨基酸序列。融合蛋白质PRR中的OmpT蛋白酶切割位点显示于此图中。融合蛋白质以粗线表示，而被取代的丙氨酸用下划线标出。

图26是pG117ompPRR-2A、-3A和-4A构建的概略说明，其中β-gal117S4H代表编码来源于大肠杆菌β-半乳糖苷酶之N-末端117个氨基酸的保护蛋白质的区域；GLP-1[G]代表编码人胰高血糖素样肽-1的区域；Tc^r代表四环素抗性基因；连接肽相应于图6所示氨基酸序列中第128位谷氨酰胺至153位精氨酸的氨基酸序列；而lac PO代表大肠杆菌乳糖启动子操纵基因。

图27是pG117ompPRR-5A和-6A构建的概略说明，其中β-gal117S4H代表编码来源于大肠杆菌β-半乳糖苷酶之N-末端117个氨基酸的保护蛋白质的区域；GLP-1[G]代表编码人胰高血糖素样肽-1的区域；Tc^r代表四环素抗性基因；连接肽相应于编码图6所示氨基酸序列中第128位谷氨酰胺至153位精氨酸的氨基酸序列的区域；而lac PO代表大肠杆菌乳糖启动子操纵基因。

图28是pG117ompPRR-8A、-9A和-10A构建的概略说明，其中β-gal117S4H代表编码来源于大肠杆菌β-半乳糖苷酶之N-末端117个氨基酸的保护蛋白质的区域；GLP-1[G]代表编码人胰高血糖素样肽-1的区域；Tc^r代表四环素抗性基因；连接肽相应于编码图6所示氨基酸序列中第128位谷氨酰胺至153位精氨酸的氨基酸序列的区域；而lac PO代表大肠杆菌乳糖启动子操纵基因。

图29是pG117ompPRR-1A构建的概略说明，其中β-gal117S4H代表编码来源于大肠杆菌β-半乳糖苷酶之N-末端117个氨基酸的保护蛋白质的区域；GLP-1[G]代表编码人胰高血糖素样肽-1的区域；Tc^r代表四环素抗性基因；连接肽相应于编码图6所示氨基酸序列中第128位谷氨酰胺至153位精氨酸的氨基酸序列的区域；而lac PO代表大肠杆菌乳糖启动子操纵基因。

图30是用OmpT蛋白酶切割融合蛋白质PRR和PRRXA的SDS-PAGE(16％)的照片。在此图中，Mr表示分子量标记蛋白质；O表示纯化的OmpT蛋白酶泳道；-代表无OmpT蛋白酶的泳道；而+代表添加OmpT蛋白酶的泳道。

-1A：PRR-1A，-2A：PRR-2A，-3A：PRR-3A，-4A：PRR-4A，-5A：PRR-5A

-6A：PRR-6A，-8A：PRR-8A，-9A：PRR-9A，-10A：PRR-10A.

4.9kDa的肽片段表示已被OmpT蛋白酶切下的含GLP-1[G]的肽片段。

图31是显示由pG117ompPRR-4X编码之融合蛋白质PRR-4X结构的概略说明，其中-10、-5、-1、+1和+4分别表示相应于融合蛋白质PRR之OmpT蛋白酶切割位点的-10、-5、-1、+1和+4位置。融合蛋白质PRR的氨基酸序列(从-10至+4位置)以及融合蛋白质PRR-4X之-4位置的取代氨基酸显示于图中。β-gal117S4H代表来源于大肠杆菌β-半乳糖苷酶之N-末端117个氨基酸的保护蛋白质；GLP-1[G]代表人胰高血糖素样肽-1；连接肽相应于图6所示氨基酸序列中第128位谷氨酰胺至153位精氨酸的氨基酸序列。融合蛋白质PRR中的OmpT蛋白酶切割位点显示于此图中。融合蛋白质以粗线表示。

图32是显示由pG117ompPRR-6X编码之融合蛋白质PRR-6X结构的概略说明，其中-10、-5、-1、+1和+4分别表示相应于融合蛋白质PRR之OmpT蛋白酶切割位点的-10、-5、-1、+1和+4位置。融合蛋白质PRR的氨基酸序列(从-10至+4位置)以及融合蛋白质PRR-6X之-6位置的取代氨基酸显示于图中。β-gal117S4H代表来源于大肠杆菌β-半乳糖苷酶之N-末端117个氨基酸的保护蛋白质；GLP-1[G]代表人胰高血糖素样肽-1；连接肽相应于图6所示氨基酸序列中第128位谷氨酰胺至153位精氨酸的氨基酸序列。融合蛋白质PRR中的OmpT蛋白酶切割位点显示于此图中。融合蛋白质以粗线表示。

图33是pG117ompPRR-4X(其中X是K、D、E、N或Q)构建的概略说明。在此图中，β-gal117S4H代表编码来源于大肠杆菌β-半乳糖苷酶之N-末端117个氨基酸的保护蛋白质的区域；GLP-1[G]代表编码人胰高血糖素样肽-1的区域；Tc^r代表四环素抗性基因；连接肽相应于编码图6所示氨基酸序列中第128位谷氨酰胺至153位精氨酸的氨基酸序列的区域；而lac PO代表大肠杆菌乳糖启动子操纵基因。

图34是pG117ompPRR-6X(其中X是K、D、E、N或Q)构建的概略说明。在此图中，β-gal117S4H代表编码来源于大肠杆菌β-半乳糖苷酶之N-末端117个氨基酸的保护蛋白质的区域；GLP-1[G]代表编码人胰高血糖素样肽-1的区域；Tc^r代表四环素抗性基因；连接肽相应于编码图6所示氨基酸序列中第128位谷氨酰胺至153位精氨酸的氨基酸序列的区域；而lac PO代表大肠杆菌乳糖启动子操纵基因。

在图35中，A是用OmpT蛋白酶切割融合蛋白质PRR和PRR-4X的SDS-PAGE(16％)的照片。在此图中，Mr表示分子量标记蛋白质；-代表无OmpT蛋白酶的泳道；而+代表添加OmpT蛋白酶的泳道。

-4K：PRR-4K，-4A：PRR-4A，-4N：PRR-4N，-4Q：PRR-4Q，-4D：PRR-4D，-4E：PRR-4E

4.9kDa的肽片段表示已被OmpT蛋白酶切下的含GLP-1[G]的肽片段。

在图35中，B是用OmpT蛋白酶切割融合蛋白质PRR和PRR-4X的SDS-PAGE(16％)的照片。在此图中，Mr表示分子量标记蛋白质；-代表无OmpT蛋白酶的泳道；而+代表添加OmpT蛋白酶的泳道。

-6R：PRR-6R，-6K：PRR-6K，-6A：PRR-6A，-6N：PRR-6N，-6Q：PRR-6Q，-6D：PRR-6D.

4.9kDa的肽片段表示已被OmpT蛋白酶切下的含GLP-1[G]的肽片段。

图36是显示由pRShANPR编码之融合蛋白质RShANPR结构的概略说明，其中-10、-5、-1、+1和+4分别表示相应于融合蛋白质RShANP之OmpT蛋白酶切割位点的-10、-5、-1、+1和+4位置。融合蛋白质RShANP和RShANPR的氨基酸序列(从-10至+4位置)显示于图中。β-gal97S4H代表来源于大肠杆菌β-半乳糖苷酶之N-末端97个氨基酸的保护蛋白质；α-hANP代表α型人心房肽；而连接肽代表图23所示氨基酸序列中第99位谷氨酰胺至101位精氨酸的氨基酸序列。融合蛋白质RShANP中的OmpT蛋白酶切割位点显示于此图中。融合蛋白质以粗线表示，而在-6和-4位置的被取代精氨酸用下划线标出。

图37是pGRShANPR构建的概略说明，其中β-gal97S4H代表编码来源于大肠杆菌β-半乳糖苷酶之N-末端97个氨基酸的保护蛋白质的区域；α-hANP代表编码α-型人心房肽的区域；Tc^r代表四环素抗性基因；连接肽代表编码氨基酸序列QFR(SEQ ID NO：73)的区域；lac PO代表大肠杆菌乳糖启动子操纵基因。

发明详述

在这些情况下，从切割位点周围的氨基酸序列对OmpT蛋白酶的底物识别和切割是重要的观点出发，本发明发明者已通过利用已知切割位点调查切割位点及附近的氨基酸序列发现了新的底物特异性模式。为了将此新底物特异性模式应用于融合蛋白质的切割，本发明的发明者已进行了透彻的研究并因而完成了本发明。更具体地说，在本发明的方法中，利用于OmpT蛋白酶专门切割含已知切割位点之特异氨基酸序列中存在的精氨酸-X键或赖氨酸-X键(其中X是除谷氨酸、天冬氨酸或脯氨酸外的氨基酸)的高度特异作用特性，而切割效率受切割位点-6和-4位置处氨基酸上的电荷影响。

因此，本发明提供了利用上述特性控制OmpT蛋白酶对多肽切割的方法，它包括将所述多肽中由两任意连续氨基酸组成之序列位点的氨基酸和/或所说位点附近的氨基酸转变成另一或其它氨基酸，其特征在于(1)将赖氨酸或精氨酸设为所说位点-1位置的氨基酸并将特异氨基酸设为+1位置的氨基酸；和/或(2)将位于所说位点-4和/或-6位置的氨基酸设置为特异氨基酸；以便所说多肽的合乎需要部分可被OmpT蛋白酶切割并/或不合乎需要部分不可被OmpT蛋白酶切割。

因此，一方面，本发明提供了用OmpT蛋白酶控制靶多肽的方法，包括设置赖氨酸或精氨酸为含靶多肽之融合蛋白质氨基酸序列中切割位点-1位置的氨基酸，所述位点可被OmpT蛋白酶切割，并将氨基酸X(X是除谷氨酸、天冬氨酸或脯氨酸外的氨基酸)设置为相应氨基酸序列(下文称为相应序列)+1位置的氨基酸。另一方面，本发明提供了通过在将酸性氨基酸之外的氨基酸(优选碱性氨基酸，更优选赖氨酸或精氨酸)设置为OmpT蛋白酶可切割的氨基酸序列切割位点的-6和/或-4位置的氨基酸时切下靶多肽，而提高切割效率的方法。

例如，当利用遗传工程技术表达融合蛋白质并随后用本发明方法切割时，融合蛋白质以此方式表达以便将“相应序列”至少作为融合蛋白质的一部分并随后用OmpT蛋白酶处理后者。这样，靶多肽可被释放。此外，按照本发明，通过设置碱性氨基酸为切割位点-6和-4位置的氨基酸，靶多肽可被更有效地切下。术语“靶多肽”用于此处时表示通过分泌表达、直接表达等方式获得、以融合蛋白质或多肽形式表达的任何多肽。例如，在待OmpT蛋白酶切割的融合蛋白质中，多肽可在OmpT蛋白酶切割或翻译后加工后立即发挥生理活性。或者，可为此应用通过上述反应后进一步切割形成生理活性肽的生产中间物(即，也称前体肽)。

目前认为待OmpT蛋白酶切割的氨基酸序列定义为相对于切割位点从约-20至+20位置的序列。因此，用于此处的“相应序列”可选自相对于已知或已由实验证实可被OmpT蛋白酶切割之氨基酸序列切割位点为约-20至+20位置范围内的序列。例如，“相应序列”可选自从-20至-1位置、从-20至+1位置、从-1至+20位置或从+1-至+20位置。

当存在OmpT蛋白酶可切割的氨基酸序列时，用本发明方法通过将切割位点+1位置的氨基酸转换成谷氨酸、天冬氨酸或脯氨酸可防止切割的发生。当在+1位置这样的转换不可能时，可通过将-6和-4位置处的氨基酸之一或都转换成酸性氨基酸而降低切割效率。

联合以上方法，OmpT蛋白酶的切割可受到控制。

当含靶多肽的融合蛋白质以大肠杆菌为宿主生产并随后用大肠杆菌固有的OmpT蛋白酶从融合蛋白质中切下靶多肽时，这一点尤其有利。

因此，本发明涉及以下方法。

a)控制OmpT蛋白酶对多肽进行切割的方法，它包括将所述多肽中由两任意连续氨基酸组成之序列位点的氨基酸和/或所说位点附近的氨基酸转变成其它氨基酸，其特征在于(1)将赖氨酸或精氨酸设为所说位点-1位置的氨基酸并将特异氨基酸设为+1位置的氨基酸；和/或(2)将相对所说位点-4和/或-6位置的氨基酸设置为特异氨基酸；以便所说多肽的合乎需要部分可被OmpT蛋白酶切割并/或不合乎需要部分不可被OmpT蛋白酶切割。

b)以上a)中所述控制OmpT蛋白酶对多肽进行切割的方法，它包括将所述多肽中由两任意连续氨基酸组成之序列位点的氨基酸和/或所说位点附近的氨基酸转变成其它氨基酸，其特征在于(1)将赖氨酸或精氨酸设为所说位点-1位置的氨基酸并将特异氨基酸设为+1位置的氨基酸；和/或(2)将特异氨基酸设置为相对于所说位点为-4和/或-6位置的氨基酸；以便所说多肽的合乎需要部分可被OmpT蛋白酶切割。

c)以上b)中所述的方法，其特征在于(1)将除谷氨酸、天冬氨酸或脯氨酸之外的氨基酸设置为+1位置的氨基酸；和/或(2)将酸性氨基酸之外的氨基酸(优选碱性氨基酸，并更优选赖氨酸或精氨酸)设置为相对于所说位点为-6和/或-4位置的氨基酸。

d)如以上a)至c)中任一条所述的方法，其特征在于，当所说多肽中由两任意连续氨基酸组成的序列位点的-1位置上的氨基酸既非赖氨酸也非精氨酸时，将所说的氨基酸转换成赖氨酸或精氨酸，并将氨基酸X(其中X是除谷氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、精氨酸、赖氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸或缬氨酸之外的氨基酸)设置为+1位置的氨基酸，以便所说多肽中的合乎需要部分被OmpT蛋白酶切割。

e)如以上a)中所述用于控制OmpT蛋白酶对多肽切割的方法，它包括将多肽中由两任意连续氨基酸组成之序列位点的氨基酸和/或所说位点附近的氨基酸转变成其它氨基酸，其特征在于(1)将赖氨酸或精氨酸设为相对于所说位点为-1位置的氨基酸并将特异氨基酸设为+1位置的氨基酸；和/或(2)将特异氨基酸设置为相对于所说位点为-4和/或-6位置的氨基酸；以便所说多肽中不合乎需要的部分不被OmpT蛋白酶切割。

f)如以上e)中所述的方法，其特征在于(1)将谷氨酸、天冬氨酸或脯氨酸设置为+1位置的氨基酸；和/或(2)将酸性氨基酸设置为相对于所说位点为-6和/或-4位置的氨基酸。

g)在编码多肽的基因表达于宿主细胞中且所说多肽原本被OmpT蛋白酶切割于不合乎需要部分的情况下应用以上e)或f)中所述方法的方法。

h)通过在宿主细胞中表达编码所说多肽的基因而生产多肽的方法，其特征在于在所说多肽被OmpT蛋白酶切割于不合乎需要部分的情况下如上a)至g)所述转换氨基酸。

i)如以上a)至f)中任一所述的方法，它包括将编码融合蛋白质的基因表达于宿主细胞中，该融合蛋白质由通过切割位点(任选地位于连接肽中)与保护肽融合的靶多肽组成，并在所说切割位点处可被OmpT蛋白酶切割，及用OmpT蛋白酶在所说切割位点处切下蛋白质从而从融合蛋白质中获得靶多肽。

j)如以上i)中所述的方法，其中OmpT蛋白酶可切割的氨基酸序列存在于组成所说融合蛋白质的保护肽、连接肽和/或靶多肽的氨基酸序列中。

k)生产靶多肽的方法，包括将编码融合蛋白质的基因表达于宿主细胞中，该融合蛋白质由通过切割位点(任选地位于连接肽中)与保护肽融合的靶多肽组成并在所说切割位点处可被OmpT蛋白酶切割，及用OmpT蛋白酶在所说切割位点处切下蛋白质从而从融合蛋白质中获得靶多肽，其特征在于利用以上a)至f)中任一所述的方法转换切割位点和/或其附近的氨基酸。

l)如以上k)中所述的方法，其中OmpT蛋白酶可切割的氨基酸序列存在于组成所说融合蛋白质的保护肽、连接肽和/或靶多肽的氨基酸序列中。

m)如以上g)至l)中任一所述的方法，其中的宿主细胞是大肠杆菌。

n)如以上g)至m)中任一所述的方法，其中的靶多肽是钠尿肽。

可应用本发明方法的蛋白质和肽如下：促肾上腺皮质激素、Adrenomedullin、糊精、血管紧张肽I、血管紧张肽II、血管紧张肽III、A-型钠尿肽、B-型钠尿肽、缓激肽、降钙素、降钙素基因相关肽、缩胆囊素、促肾上腺皮质激素释放因子、Cortistatin、C-型钠尿肽、α-Defesin 1、β-Defesin 1、β-Defesin 2、δ睡眠诱导肽、强啡肽A、Elafin、α-内啡肽、β-内啡肽、γ-内啡肽、内皮素-1、内皮素-2、内皮素-3、Big Endothelin-1、Big Endothelin-2、Big Endothelin-3、脑啡肽、Galanin、Big Gastrin、胃泌素、肠抑胃肽、胃泌素释放肽、Ghrelin、胰高血糖素、胰高血糖素样肽1、胰高血糖素样肽2、生长激素释放因子、生长激素、鸟苷蛋白、Uroguanylin、histatin 5、胰岛素、J肽、黄体素释放激素、促黑激素、Midkine、促胃动素、神经激肽A、神经激肽B、神经调节肽B、神经调节肽C、神经肽Y、神经降压肽、催产素、Proadrenomedullin N-末端20肽、甲状旁腺激素、甲状旁腺激素相关蛋白质、垂体腺苷酸环化酶活化多肽38、血小板因子-4、T肽、促胰液素、血清胸腺因子、促生长素抑制素、P物质、促甲状腺素释放激素、Urocortin、血管活性肠肽、血管升压素等等及其衍生物(例如，以上述肽中的ANP为例，可利用的不仅是由28个氨基酸组成的天然ANP(即ANP(1-28))，还有氨基酸序列中具氨基酸缺失的衍生物，如ANP(3-28)和ANP(4-28))。

本发明将被更详细地描述。

pG117S4HompRHPR是表达含胰高血糖素样肽-1(GLP-1[G])之融合蛋白质(PR)的表达质粒。此融合蛋白质的保护蛋白质包括来源于大肠杆菌β-半乳糖苷酶N-末端117个氨基酸的保护蛋白质、由含精氨酸-精氨酸序列之35个氨基酸组成的接头序列，和人胰高血糖素样肽-1(GLP-1[G])。本发明发明者已发现大肠杆菌OmpT蛋白酶切割接头序列中精氨酸-精氨酸序列的中央肽键以便释放含GLP-1[G]由44个氨基酸组成的靶肽。本发明的发明者通过基于PCR的定位诱变将由pG117S4HompRHPR编码的融合蛋白质之精氨酸-精氨酸序列转换成精氨酸-X(其中X代表切割位点+1位置的氨基酸)，并检查这样取代的融合蛋白质PRX(其中X代表氨基酸的单字母密码(选自总20种氨基酸)；例如，取代成丙氨酸的融合蛋白质称为PRA)是否在此位点被OmpT蛋白酶切割。为了表达各融合蛋白质，利用了OmpT蛋白酶缺陷的大肠杆菌菌株W3110 M25。因为这样的融合蛋白质在细胞中以包涵体形式积聚，所以裂解细胞并离心收集包涵体。然后用尿素溶解包涵体并用于OmpT蛋白酶反应中。在含4M尿素、50mM磷酸钠(pH7.0)、2mM EDTA和各融合蛋白包涵体的反应液中添加20mU OmpT蛋白酶，进行反应。通过SDS-PAGE(16％)分析融合蛋白质的切割产物并用蛋白质测序仪测定这样切下的靶肽的N-末端氨基酸序列。

结果，本发明的发明者第一次阐明了OmpT蛋白酶具有切割精氨酸-X序列中中心肽键的活性(其中X是除天冬氨酸、谷氨酸或脯氨酸之外的氨基酸)。也就是说，本发明的发明者阐明了OmpT蛋白酶不仅具有切割迄今为止报道的氨基酸序列(即，精氨酸-精氨酸、精氨酸-赖氨酸、赖氨酸-精氨酸、赖氨酸-赖氨酸、精氨酸-丙氨酸、精氨酸-甲硫氨酸和精氨酸-缬氨酸)的活性，还具有切割精氨酸-X(其中X是除天冬氨酸、谷氨酸和脯氨酸之外的氨基酸)代表的氨基酸序列的活性。

通过使用这些融合蛋白质，进一步检查赖氨酸-X(其中X位于切割位点的+1位置且代表丙氨酸、丝氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸或谷氨酸)是否被切割并因而得到了相似的结果。预期OmpT蛋白酶主要受切割位点附近的氨基酸序列影响。因此，进一步进行检查以研究融合蛋白质PRhANP和PRhCT(其中融合蛋白质PR的靶肽区域分别被α-hANP(α-型人心房肽)和hCT[G](人降钙素前体)取代)是否可被OmpT蛋白酶切割。结果发现PRhANP在精氨酸和丝氨酸之间被OmpT蛋白酶切割并从中切下α-hANP。另一方面，PRhCT不被OmpT蛋白酶切割。PRhCT之精氨酸-半胱氨酸序列不被OmpT蛋白酶切割的事实表明OmpT蛋白酶的底物识别和切割受切割位点附近的氨基酸序列影响，这支持了如本发明发明者推测的利用被OmpT蛋白酶切割的已知氨基酸序列的重要性。

利用具已知切割位点之氨基酸序列的融合蛋白质PR通过一系列研究获得上述结果。此外，还检查通过取代另一融合蛋白质RShANP(即，切割位点周围具有不同于PR之氨基酸序列的α-hANP融合蛋白质)+1位置的氨基酸是否获得相似的结果。应用于此检查中的融合蛋白质RShANP含β-gal197S，它来源于大肠杆菌β-半乳糖苷酶N-末端的97个氨基酸，作为保护蛋白质，还含有通过3个氨基酸(谷氨酰胺-苯丙氨酸-精氨酸)组成之接头与此键合的α-hANP。尝试用OmpT蛋白酶切割融合蛋白质，其中此融合蛋白质+1位置的氨基酸已被精氨酸、丙氨酸和半胱氨酸取代。结果发现这些+1位置处氨基酸已被取代的融合蛋白质也被OmpT蛋白酶切割而产生α-hANP的N-末端衍生物。

这些结果表明，当应用具已知OmpT蛋白酶切割序列的区域(其中切割位点的-1和+1位置用精氨酸-X或赖氨酸-X代表)且所说的X被除天冬氨酸、谷氨酸或脯氨酸之外的氨基酸取代时，这样取代的融合蛋白质仍可被OmpT蛋白酶切割。因此，当依次由保护肽、OmpT蛋白酶切割位点氨基酸序列和靶肽组成的融合蛋白质要被此酶切割时，从天冬氨酸、谷氨酸和脯氨酸之外的氨基酸中选择添加至靶肽N-端的氨基酸是可能的。通过应用此方法，可构建靶肽N-端具不同氨基酸的衍生物。也可能取代N-末端氨基酸以便提高分离/纯化效率。还可能将不被切割的序列转换成可切割序列。

此外，通过利用所具X为天冬氨酸、谷氨酸或脯氨酸的肽不可被OmpT蛋白酶切割这一结果，还可能将融合蛋白或蛋白质转换成不可被OmpT蛋白酶消化的蛋白质。更具体地说，有时观察到，在生产表达于大肠杆菌的蛋白质的过程中，由于OmpT蛋白酶消化靶蛋白而难于分离。在这样的情况下，通过将切割位点+1位置的识别氨基酸取代为天冬氨酸、谷氨酸或脯氨酸，可将所说的蛋白质转换为融合蛋白或蛋白质，这明显促进了生产。

本发明的发明者进一步取代了融合蛋白PRR的OmpT蛋白酶切割位点-10至-1位置的氨基酸，并检查OmpT蛋白酶对这些融合蛋白质的切割。结果，他们发现切割位点的N-末端氨基酸序列影响切割效率。尤其是，将诸如精氨酸或赖氨酸之类的碱性氨基酸设为-4位置的氨基酸提高了切割效率，而将诸如天冬氨酸或谷氨酸之类的酸性氨基酸设为此位置的氨基酸会降低切割效率。对于-6位置的氨基酸观察到相似的结果。基于这些结果，认为OmpT蛋白酶识别这些位置氨基酸的电荷。当-1位置的精氨酸被丙氨酸取代时，不发生切割。此事实再次表明，此位置的氨基酸在切割中起重要作用。

另外，使用了在切割位点周围具有与PRR不同的氨基酸序列的α-hANP融合蛋白RShANP，在融合蛋白RShANPR中观察到了切割效率的提高，其中分别在切割位点-6和-4位置的酪氨酸和丙氨酸已均被精氨酸所取代。

因此，通过将-6或-4位置之一或这两个位置的氨基酸转换成碱性氨基酸可提高切割效率，而将这些氨基酸转换成酸性氨基酸可降低切割效率。也就是说，可在不取代切割位点处的氨基酸(即，-1-或+1位置)的情况下在一定程度上控制切割效率。

此外，将首先详述实施例中未描述的实验操作。

(1)材料和方法

除非另外在实施例中提及，实验操作进行如下。

DNA引物合成于Pharmacia。用带7-脱氮-dGTP的Thermo测序酶荧光标记引物循环测序试剂盒(Amersham制造)通过A.L.F.DNA测序仪(Pharmacia制造)测定核苷酸序列。用PI-100∑(Kurabo制造)将质粒DNA分离自大肠杆菌。用限制酶以500-2000U/ml的浓度进行反应2小时切割DNA。使用0.5-1μg DNA在10μl液体反应混合物中分析质粒的结构。使用5-10μg DNA在30μl液体反应混合物中制备DNA片段。按制造商说明书确定反应条件(温度、缓冲液，等等)。将1/10倍体积的样品缓冲液加至液体反应混合物中制备琼脂糖凝胶电泳的样品。TAE缓冲液(40mM Tris-醋酸，1mM EDTA)被用作琼脂糖凝胶电泳的缓冲液。100V进行电泳30分钟-1小时。用溴化乙锭水溶液染色后，UV-照射凝胶检测DNA带。依待分级的DNA片段大小调节琼脂糖凝胶浓度至0.8或2.0％(w/v)。琼脂糖凝胶电泳后，切下靶DNA带并用SUPREC-01(Takara Shuzo制造)从凝胶中提取DNA。酚/氯仿处理此DNA溶液，然后乙醇沉淀并溶于TE缓冲液(10mM Tris-HCl(pH8.0)，1mMEDTA)中。用Ligation high(Toyobo制造)以预定的反应混合物组成在16C进行连接反应30分钟或过夜。利用KOD Dash或KOD DNA聚合酶(Toyobo制造)进行PCR。按制造商说明书分别确定PCR条件(温度、缓冲液等等)和液体反应混合物的组成。

以购自Takara Shuzo的JM109菌株作为感受态细胞用氯化钙方法进行质粒对大肠杆菌的转化。使用四环素(10μg/ml)选择转化子。除非在实施例中另外提及，一般将JM109应用于大肠杆菌的转化。

(2)OmpT蛋白酶的活性检测

以Dynorphine A为底物(Peptide Institute Inc.制造)检测OmpT蛋白酶的活性。

将5μg 1mg/ml的Dynorphine A加入含0.1％Triton X-100的40μl50mM磷酸钠(pH6.0)中。然后加入检测OmpT蛋白酶活性的5μl样品起始反应。反应在25℃进行10分钟并随后加入5μl 1N HCl中止。将液体反应混合物离心(10000x g，2分钟)。收集上清并用HPLC分析其20μl部分。用YMC PROTEIN RP柱进行HPLC分析，柱温40℃，流速1ml/分钟。用含0.1％三氟乙酸的10％乙腈洗3分钟后，混合物以含0.1％三氟乙酸的10-15％的乙腈线性梯度洗脱10分钟。监测220nm处的吸收并因而检测消化产物肽YGGFLR。OmpT蛋白酶活性单位定义为，在此条件下25℃每分钟切割1μmol Dynorphine A的酶量。

(3)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

以16％Wide-PAGEmini(Tefco制造)为凝胶、Tricine电泳缓冲液(Tefco制造)为电泳缓冲液、分子量标准蛋白质(Tefco制造)为分子量标准进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。在样品中加入等量含4M尿素(倘若在分析OmpT蛋白酶蛋白质时不含尿素)的2X SDS-PAGE样品缓冲液，混合物100℃加热2分钟。然后取其10μl在Tefco’s说明书的条件下电泳。电泳完成后，凝胶用含考马斯亮兰R-250的染色液染色。

(4)包涵体的制备

融合蛋白PRX、PKX、PRhANP、PRhCT、RShANP、RXhANP、PRRXA、PRR-4X、PRR-6X和RShANPR分别作为包涵体以如下方式制备。

分别表达PRX、PKX、PRhANP、PRhCT、RShANP、RXhANP、PRRXA、PRR-4X、PRR-6X和RShANPR的大肠杆菌在装有含10mg/l四环素之400ml LB液体培养基(0.5％(w/v)酵母提取物，1％(w/v)tryptone，0.5％氯化钠)的2升Erlenmeyer摇瓶中以150rpm转速，37℃培养过夜。第二天，离心收集细胞(4℃，6000Xg，10分钟)并用超声波法破碎。在此破碎细胞溶液中加入去离子水至终体积30ml。然后将混合物离心(4℃，25000Xg，15分钟)去上清。回收沉淀部分(包涵体)并进一步悬浮于含5mM EDTA和1％Triton X-100的30ml 50mM TrisHCl(pH8.0)中。将悬浮液离心(4℃，25000Xg，15分钟)。由此获得的沉淀悬浮于去离子水中并离心(4℃，25000Xg，15分钟)。然后回收沉淀并在其中加入去离子水至总体积1.5ml。沉淀悬浮起来后，再将悬浮液离心(4℃，10000Xg，30分钟)得到沉淀。然后重复以上步骤直至去离子水中的沉淀悬浮液达OD₆₆₀＝100或OD₆₆₀＝200。将这样制备的包涵体作为底物应用于OmpT蛋白酶反应中。

(5)OmpT蛋白酶反应

用PRX、PKX、PRhANP、PRhCT、PRRXA、PRR-4X和PRR-6X为底物，以如下方式进行OmpT蛋白酶反应。添加2.5μl 1M磷酸钠(pH7.0)和2μl 50mM EDTA至20μl 10M尿素中。然后在其中加入10μl融合蛋白包涵体(OD₆₆₀＝100)并溶解包涵体。加入10.5μl水后，往其中加入5μl 4U/ml(在PRR-4X情况下是20U/ml，在PRR-6X情况下是1U/ml)OmpT蛋白酶，以液体混合物体积50μl起始反应。25℃进行反应30或60分钟。

分别分离以PRX、PKX、PRRXA、PRR-4X和PRR-6X为底物通过OmpT蛋白酶反应获得的肽，在如下指定条件下通过HPLC定量。在OmpT蛋白酶反应混合物中加入等量的12％乙酸和4M尿素中止反应。然后离心(10000xg，2分钟)液体反应混合物并用YMC PROTEIN RP柱处理20μl或50μl上清液。以柱温40℃、流速1ml/分钟进行HPLC。用含0.1％三氟乙酸的30-50％乙腈线性梯度洗脱16分钟后，监测214nm的吸收并因此将肽分离和定量。

用RShANP和RXhANP底物，以如下方式进行OmpT蛋白酶反应。添加2.5μl 1M磷酸钠(pH7.0)和2μl 50mM EDTA至20μl 10M尿素中。然后在其中加入5μl融合蛋白包涵体(OD₆₆₀＝200)并溶解包涵体。加入15.5μl水后，往其中加入5μl 10U/ml OmpT蛋白酶，以液体混合物体积50μl起始反应。37℃进行反应120分钟。

用RShANP和RShANPR底物，以如下方式进行OmpT蛋白酶反应。添加1.0μl 1M磷酸钠(pH7.0)和0.8μl 50mM EDTA至8μl 10M尿素中。然后在其中加入4μl融合蛋白包涵体(OD₆₆₀＝100)并溶解包涵体。加入4.2μl水后，往其中加入2μl 20U/ml OmpT蛋白酶，以液体混合物体积20μl起始反应。25℃进行反应90分钟。

分别分离以PRhANP、RShANP、RXhANP和RShANPR为底物通过OmpT蛋白酶反应获得的肽，在如下指定条件下通过HPLC定量。在OmpT蛋白酶反应混合物中加入等量的12％乙酸和4M尿素中止反应。然后离心(10000xg，2分钟)液体反应混合物并用YMC A-302 ODS柱处理20μl或50μl上清液。以柱温40℃、流速1ml/分钟进行HPLC。用含0.1％三氟乙酸的21.5-32％乙腈线性梯度洗脱15分钟后，监测214nm的吸收并因此将肽分离和定量。

(6)肽的N-末端氨基酸序列分析

使用蛋白质测序仪477A-120A或PROCISE492(ABI制造)测定如上获得的各肽N-末端氨基酸序列的5个氨基酸残基。

实施例

参考以下实施例，本发明将得到更详细的描述。

实施例1：融合蛋白PRX的制备

OmpT蛋白酶是存在于大肠杆菌外膜中的内切蛋白酶。尽管此酶具有高度底物特异性，迄今为止对此酶所识别底物中氨基酸序列的特性仍未有足够的阐明。已知OmpT蛋白酶切割碱性氨基酸对(精氨酸-精氨酸、精氨酸-赖氨酸、赖氨酸-精氨酸和赖氨酸-赖氨酸)的中心键。此外，据报道，OmpT蛋白酶切割碱性氨基酸(精氨酸-甲硫氨酸、精氨酸-丙氨酸和精氨酸-缬氨酸)的C-末端肽键。不过，OmpT蛋白酶并不总能切割蛋白质和肽氨基酸序列中的这些位点，此酶的切割受切割位点附近的氨基酸序列影响很大。因此估计此酶具有高底物特异性并专门切割特异位点。本发明的发明者预期，通过使用此酶已知的切割位点检查切割位点+1位置的氨基酸序列将发现此酶的新底物特异性。从这点出发，他们进行了如下实验。

在结构如图4所示，OmpT蛋白酶可切割的融合蛋白质PR(即，由来自大肠杆菌β-半乳糖苷酶N-末端117个氨基酸的保护蛋白质(β-gal117S4H)和人胰高血糖素样肽-1(GLP-1[G])组成的融合蛋白)的+1位置进行氨基酸取代从而形成融合蛋白质PRX(图6：其中X代表所取代氨基酸(总共20种)的单字母密码；即，具有取代为丙氨酸的融合蛋白质表示为PRA)。在融合蛋白PRX中，原融合蛋白PR的OmpT蛋白酶切割位点-RLYR↓RHHG-(SEQ ID NO：1)被转换成-RLYRXHHG-(SEQID NO：2)。然后检测OmpT蛋白酶的切割。

用如下5个步骤制备融合蛋白质PRX。

(1)步骤1：pG117S4HR6GLP-1的构建(图1)

首先，构建质粒pG117S4HR6GLP-1。此质粒携带一作为OmpT蛋白酶识别/切割位点插入融合蛋白质接头部分的序列精氨酸-精氨酸。在构建中，将R6合成DNA序列(见图1)插入pG117S4HGP(见日本特许公开专利申请9-296000和EP 794255)的StuI位点从而得到pG117S4HR6GLP-1。在图1中，β-gal117S4H代表来自大肠杆菌β-半乳糖苷酶N-末端117个氨基酸的保护蛋白质，而GLP-1[G]代表人胰高血糖素样肽-1。

(2)步骤2：pG117S4HompRHKR的构建(图2)

为了进一步增强OmpT蛋白酶的有效切割，以如下方式修饰R6部分中的序列。用NsiI和HindIII切割pG117S4HR6GLP-1获得3.2kbp片段(片段1)，用BamHI和HindIII切割pG117S4HR6GLP-1获得0.2kbp片段(片段2)，并与编码具有精氨酸-精氨酸序列(即，OmpT蛋白酶的识别/切割位点)之氨基酸序列L1(见图2)的L1合成DNA(见图2)连接起来从而构建pG117S4HompRHKR。

(3)步骤3：pG117S4HompRHPR的构建(图3)

因为位于pG117S4HompRHKR所表达之融合蛋白GLP-1[G]N-末端前紧邻的赖氨酸-精氨酸(KR)序列(相应于图4的152和153位)可被OmpT蛋白酶切割，通过预备实验已知当用OmpT蛋白酶处理时此融合蛋白被切割于两个位点。因此，为了便于分析，用脯氨酸-精氨酸(PR)取代此序列从而防止其被OmpT蛋白酶切割。合成引物P1：5’-GACTCAGATCTTCCTGAGGCCGAT-3’(SEQ ID NO：3)和P2：5’-AAAGGTACCTTCCG CATGCCGCGGATGTCGAGAAGG-3’(SEQ ID NO：4)并pG117S4HompRHKR为模板进行PCR得到0.1kbp DNA片段。用BglII和SphI处理获得的片段(片段3)，然后与用BglI1和HindIII切割pG117S4HompRHKR获得的3.2kbp片段(片段4)和用SphI和HindIII切割pG117S4HompRHKR得到的0.2kbp片段(片段5)连接，从而构建pG117S4HompRHPR。图4显示了由pG117S4HompRHPR编码的融合蛋白质PR的全氨基酸序列。

(4)步骤4：pG117ompPRX的构建(图5)

将由pG117S4HompRHPR编码的融合蛋白质PR的OmpT蛋白酶切割位点-RLYR↓RHHG-转换成-RLYRXHHG-(其中X代表选自20种类型的氨基酸)。通过将突变引入pG117S4HompRHPR进行转换。

用pG117S4HompRHPR为模板通过PCR引入突变。引物使用P3：5’-ACCCCAGGCTTTACACTTTA-3’和P4X：5’-CCGGATCCGT GATGNNNGCGATACAGGCG-3’(其中X代表氨基酸(总共20种)的单字母密码子；而当分别期望转换成丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸或组氨酸时，NNN代表AGC、AAC、CAG、GAT、CGG、GAA、CCA、CAT、GCC、AGA、GGT、GCA、GTA、GTT、CTG、GTC、TTC、TTT、ACG或ATG)。用PvuI和BamHI消化由此获得的PCR产物得到0.3kb片段(片段6)。此外，pG117S4HompRHPR为模板，P5：5’-ACGGATCCGGTTCCCCTTATCGACATCCG-3’和P6：5’-TTGCGCATTCACAGTTCTCC-3’为引物进行PCR。用BamHI和HindIII消化由此获得的PCR产物得到0.2kbp片段(片段7)。将这些片段6和7以及通过PvuI和HindIII消化pG117S4HompRHPR获得的3.0kbp片段(片段8)连接以便进行转化。从由此获得的各克隆中分离质粒并进行突变位点的限制酶分析和核苷酸测序以便将其鉴定为靶融合蛋白PRX的表达质粒。这些质粒共同称为pG117ompPRX(其中X代表氨基酸(共20种)的单字母密码；即，用pG117ompPRA表示具有丙氨酸取代的融合蛋白质)(图5)。

(5)步骤5：融合蛋白质PRX的制备

当pG117ompPRX表达于大肠杆菌中时，融合蛋白质PRX(图6)表达为包涵体。在OmpT蛋白酶表达于大肠杆菌中的情况下，仅仅通过尿素溶解包涵体即可被OmpT蛋白酶所切割。因此，为了避免切割，将pG117ompPRX转染入W3110 M25(即，OmpT蛋白酶缺陷型大肠杆菌菌株)并因而以包涵体形式制备融合蛋白质PRX。

实施例2：纯化OmpT蛋白酶样品的制备

为了制备纯化的OmpT蛋白酶，将OmpT蛋白酶表达质粒转染入大肠杆菌W3110菌株以构建OmpT蛋白酶高表达大肠杆菌菌株。通过以下5个步骤从此菌株的膜部分纯化OmpT蛋白酶。

(1)步骤1：pOmpTTC的构建(图7)

为了提高OmpT蛋白酶的表达水平，构建OmpT蛋白酶表达质粒pOmpTTc。用定位诱变将EcoRI和SalI限制酶位点分别引入含OmpT蛋白酶基因的质粒pGP501(Sugimura，K.Biochem.Biophys.Res.Commun.153：753-759，1988)中的翻译起始位点前紧邻处和OmpT基因3’-末端。用这些限制酶消化质粒得到1.3kbp片段(片段9)。

为了将EcoRI限制酶位点引入lac启动子的下游，用pG117S4HompRHPR为模板、P7：5’-GCGGGTGTTGGCGGGTGTCG-3’和P8：5’-TGAATTCTTCCTGTGTGAAATTGTTAT-3’为引物进行PCR。用EcoRI和AlwNI消化由此获得的PCR产物得到0.5kbp片段(片段10)。将这些片段9和10及通过AlwNI和SalI获自pG117S4HompRHPR的2.3kbp片段(片段11)连接从而构建pOmpTTc。

(2)步骤2：pOmpTTcB的构建(图8)

利用构建高水平表达蛋白质于大肠杆菌的质粒的方法(ShunjiNatori，Yoshinobu Nakanishi，Zoku Iyakuhimm no Kaihatsu(药物开发续集)，vol.7，29-61，1991，HiroRawa Shoten)，试图从以下两方面改进pOmpTTc。1.将OmpT蛋白酶翻译起始位点放于SD序列下游9个碱基处。2.修饰核苷酸以便使转录起始位点和OmpT蛋白酶翻译起点第五个氨基酸之间mRNA二级结构中主干和环的形成最小化。通过改进1构建pOmpTTcB(图8)和通过改进2构建pOmpTTcC(图9)后，构建了已经过1和2改进的pOmpTTcE(图10)。

以如下方式构建具1改进的pOmpTTcB(图8)。

用HincII和MfeI消化pOmpTTc得到1.0kbp片段(片段12)，用EcoRI和MfeI消化pOmpTTc得到2.9kbp片段(片段13)。

为了完成改进1，pOmpTTc为模板，P9：5’-TGAATTCAAAATGCGGGCGAAACTGCTGGG-3’和P10：5’-TGCCGAGGATGACGATGAGC-3’为引物进行PCR。用EcoRI和HincII消化由此获得的PCR产物，并将产生的0.2kbp片段(片段14)与片段12和13连接从而构建pOmpTTcB。

(3)步骤3：pOmpTTcC的构建(图9)

以如下方式构建具2改进的pOmpTTcC(图8)。

用EcoRI和SalI消化pOmpTTc得到1.3kbp片段(片段15)，用AlwNI和SalI消化pOmpTTc得到2.3kbp片段(片段16)。

为了完成改进2，pOmpTTc为模板，P11：5’-CTATCGTCGCCGCACTTATG-3’和P12：5’-TGAATTCTTCCTGTCTGTAATTTTTATCCGCTCACAATT-3’为引物进行PCR。用EcoRI和AlwNI消化由此获得的PCR产物，并将产生的0.5kbp片段(片段17)与片段15和16连接从而构建pOmpTTcC。

(4)步骤4：pOmpTTcE的构建(图10)

为了提高OmpT蛋白酶的表达水平，以如下方式构建具1和2改进的pOmpTTcE。

将用EcoRI和SalI消化pOmpTTcB获得的1.3kbp片段(片段18)与用EcoRI和SalI消化pOmpTTcC获得的2.8kbp片段(片段19)连接从而构建pOmpTTcE。

(5)步骤5：纯化OmpT蛋白酶样品的制备

为了得到纯化的OmpT蛋白酶样品，将pOmpTTcE转染入大肠杆菌W3110菌株从而产生OmpT蛋白酶高表达大肠杆菌菌株。然后，以如下方式培养OmpT蛋白酶高表达大肠杆菌菌株并纯化OmpT蛋白酶。

将W3110/pOmpTTcE菌株在装有含10mg/l四环素之100ml液体LB培养基的500ml Erlenmeyer摇瓶中37℃振荡培养过夜。第二天，将其转移至含2L培养基的带搅拌子的培养瓶中，培养基中包含4g/lKH₂PO₄、4g/l K₂HPO₄、2.7g/l Na₂HPO₄、0.2g/l NH₄Cl、1.2g/l(NH₄)₂SO₄、4g/l酵母提取物、2g/l MgSO₄·7H₂O、40mg/l CaCl₂·2H₂O、40mg/lFeSO₄·7H₂O、10mg/l MnSO₄·nH₂O、10mg/l AlCl₃·6H₂O、4mg/l CoCl₂·6H₂O、2mg/l ZnSO₄·7H₂O、2mg/l Na₂MoO₄·2H₂O、1mg/l CuCl₂·2H₂O、0.5mg/lH₃BO₄、1g/l葡萄糖、10g/l甘油和10mg/l四环素，在其中37℃培养12小时。培养完成后，离心培养基(4℃，6000xg，10分钟)得到80g包裹细胞。将这些细胞悬浮于600ml 50mM Tris-HCl(pH7.5)中，离心(4℃，6000xg，10分钟)悬浮液以收集细胞。重复此步骤后，将细胞悬浮于600ml 50mM Tris-HCl(pH7.5)中并以Manton-Gorlin破碎细胞。离心(4℃，1000xg，10分钟)所破碎细胞的悬浮液，弃沉淀，并回收上清。将上清进一步离心(4℃，36000xg，40分钟)。回收沉淀，悬浮于150ml 50mM Tris-HCl(pH7.5)中并再次离心(4℃，36000xg，40分钟)。将含0.1％salcosyl的120ml 50mM Tris-HCl(pH7.5)加入由此获得的1/6沉淀中。混合后，混合物在10℃摇1小时。1小时后，离心(4℃，36000xg，40分钟)并回收沉淀。此外，将其悬浮于含0.1％Triton X-100和5mM EDTA的120ml 50mM Tris-HCl中并室温摇1小时。再离心(4℃，36000xg，40分钟)并回收上清以得到粗酶样品。

将120ml此粗酶样品以流速4ml/分钟上已用含0.1％TritonX-100的50mM Tris-HCl(pH7.5)(以下称为缓冲液A)平衡的Benzamidine Sepharose 6B柱(直径12mmx70mm，8ml)，然后用80ml缓冲液A清洗。随后用含0.3M NaCl的缓冲液A洗脱，洗脱液收集为10ml/部分，共得到8个部分。

经16％SDS-PAGE证实为均一的第五部分被称为纯化的OmpT蛋白酶样品。当用Coomassie Plus Protein Assay Reagent(PIERCE制造)并以牛血清清蛋白为标准测定时，纯化OmpT蛋白酶样品的蛋白质浓度是120μg/ml。用Dynorphine A为底物测定的OmpT蛋白酶活性是40U/ml。

实施例3：用OmpT蛋白酶切割PRX

本实施例检测通过取代具OmpT蛋白酶可切割结构的融合蛋白PR(图4)中+1位置处(从N-端数141位)的氨基酸而构建的融合蛋白PRX(图6)是否可被OmpT蛋白酶切割。PRX与纯化的OmpT蛋白酶样品在pH7.0于25℃反应30分钟。酶促反应后进行SDS-PAGE分析。图11显示分析结果，其中-表示无OmpT蛋白酶的泳道，而+代表用OmpT蛋白酶处理的融合蛋白的泳道。

在PRD和PRE中，未观察到OmpT蛋白酶的切割(图11，泳道D和E)。相反，在除PRD和PRE之外的蛋白质中均观察到OmpT蛋白酶的切割。

为了确定切割位点，将OmpT蛋白酶处理后得到的肽消化产物用HPLC分离并测定N-端氨基酸序列。由此确定的OmpT蛋白酶的切割位点列于表1中。

表1：融合蛋白PRX的OmpT蛋白酶切割位点

PRX 切割位点

↓代表OmpT蛋白酶切割位点。融合蛋白PRX中从138位亮氨酸(从N-端数)至146位甘氨酸的区域显示为切割位点处的氨基酸序列。

在PRP中，观察到切割不在-RX-处而专门在-ELR↓LYRPHHG-处发生。不过，在除PRD、PRE和PRP之外的所有蛋白质中，观察到切割在R↓X-处发生(表1)。基于这些结果，推测+1位置处具17种氨基酸之一[即，除天冬氨酸和谷氨酸(酸性氨基酸)和脯氨酸(亚氨基酸)之外的氨基酸]的氨基酸序列是OmpT蛋白酶可切割的。

实施例4：融合蛋白PKX的制备

同样地，为了检测+1位置处的氨基酸被除天冬氨酸和谷氨酸(酸性氨基酸)和脯氨酸之外的氨基酸之一取代后以及当OmpT蛋白酶切割位点-1位置处具有作为碱性氨基酸的赖氨酸时是否可被OmpT蛋白酶切割，构建了PKX，其中融合蛋白PRX的-RLYRXHHG-转换成-RLYKXHHG-(图13)。在以下实施例中，X选自丙氨酸、丝氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸和谷氨酸(以各氨基酸的单字母密码表示)。在这些氨基酸中，形成碱性氨基酸对的赖氨酸和精氨酸用作正对照。丙氨酸和丝氨酸由于在实施例3中具有相对高的切割效率而被采用。天冬氨酸和谷氨酸被用于检测PKD和PKE是否可切割，因为含这些氨基酸的PRD和PRE不可切割。

用以下两步骤制备融合蛋白PKX。

(1)步骤1：pG117ompPKX的构建(图12)

编码融合蛋白PKX(其中X是A、S、K、R、D或E)(图13)的质粒pG117ompPKX(其中X是A、S、K、R、D或E)(图12)以如下方式形成。

用PCR将-RLYRXHHG-转换成-RLYKXHHG-(其中X是A、S、K、R、D或E)。

以pG117ompPRA、pG117ompPRS、pG117ompPRK、pG117ompPRR、pG117ompPRD和pG117ompPRE为模板，P3：5’-ACCCCAGGCTTTACACTTTA-3’和P13X：5’-CCGGATCCG TGATGNNNTTTATACAGGCG-3’为引物(NNN：当用pG117ompPRA为模板时是AGC；用pG117ompPRS时是AGA；用pG117ompPRK时是TTT；用pG117ompPRR时是ACG；用pG117ompPRD时是GTC；用pG117ompPRE时是TTC)进行PCR。将用PvuI和BamHI消化以上获得之PCR产物得到的0.3kbp片段(片段20)与用BamHI和SalI消化pG117ompPRR得到的0.1kbp片段(片段21)和用PvuI和SalI消化pG117ompPRR得到的3.1kbp片段(片段22)连接，并进行转化。从由此获得的各克隆中分离质粒并进行限制酶分析和突变位点处的核苷酸测序，以确认表达靶融合蛋白质的质粒。这些质粒统称为pG117ompPKX(其中X代表所取代氨基酸的单字母密码，例如，pG117ompPKA代表具有丙氨酸取代的质粒)。(图12)

(2)步骤2：融合蛋白PKX的制备

当pG117ompPKX于大肠杆菌中表达时，融合蛋白PKX(图13)表达为包涵体。在大肠杆菌中表达OmpT蛋白酶时，包涵体仅通过用尿素溶解即被OmpT蛋白酶切割。为了避免这种现象，将pG117ompPKX转化入OmpT蛋白酶缺陷的大肠杆菌菌株W3110M25中并从而将融合蛋白质PKX制备为包涵体。

实施例5：用OmpT蛋白酶切割PKX

检测融合蛋白PKX(图13)是否可被OmpT蛋白酶所切割。

PKX与纯化的OmpT蛋白酶样品在25℃反应30分钟。图14显示了它的SDS-PAGE分析结果，其中-代表无OmpT蛋白酶的泳道；而+代表用OmpT蛋白酶处理的融合蛋白质的泳道。

已证实用作阳性对照的PKK和PKR被OmpT蛋白酶切割(图14，泳道KK和KR)。此外，不形成碱性氨基酸对的PKA和PKS被OmpT蛋白酶切割(图14，泳道KA和KS)。相反，PKD和PKE不被OmpT蛋白酶切割(图14，泳道KD和KE)。

为了鉴定切割位点，在OmpT蛋白酶处理后用HPLC分离肽消化产物并随后测定N-末端氨基酸序列。由此确定的OmpT蛋白酶切割位点列于表2中。

可被OmpT蛋白酶切割的PKK、PKR、PKA和PKS显示切割于-K↓X-处(表2)。

表2：融合蛋白PKX的OmpT蛋白酶切割位点

PKX 切割位点

↓表示OmpT蛋白酶切割位点。融合蛋白PKX中从138位亮氨酸(从N-端数)至146位甘氨酸的区域显示为切割位点处的氨基酸序列。

因此，实施例3和5的结果表明，不只在碱性氨基酸对(-RR-、-RK-、-KR-和-KK-)处存在OmpT蛋白酶切割位点，在包括一个碱性氨基酸的碱基对(-RX-、-KX-)处也存在。不过，当X为天冬氨酸或谷氨酸(酸性氨基酸)或脯氨酸(亚氨基酸)时，在此位点不发生切割。

实施例6：融合蛋白质PRhANP和PRhCT的制备

实施例3的结果表明OmpT蛋白酶可切割实施例3中所示OmpT蛋白酶切割位点附近氨基酸序列中的-R↓X-(其中X代表除天冬氨酸、谷氨酸(酸性氨基酸)和脯氨酸之外的氨基酸(共17种))。此外，在实施例5中得到有关于-K↓X-处的切割的相似结果。

不过，关于此酶底物的识别，仅检查迄今报道的氨基酸序列看起来是不够的，切割位点附近的氨基酸序列(即N-和C-端侧)也是重要的。在以上实施例中，本发明发明者取代了此酶切割位点+1位置处的氨基酸。基于切割位点附近的氨基酸序列在底物识别和切割中可能是重要的这一点，本发明的发明者进一步检查了当实施例3和5中所用的融合蛋白质靶肽部分被其它肽取代时(即，改变+1位置处氨基酸C-端侧的氨基酸序列)OmpT蛋白酶怎样产生切割。

构建融合蛋白质PRhANP(图16)，其中α-hANP(α-型人心房肽)安排在融合蛋白质PR(图4)N-端140位精氨酸之后，还构建另一融合蛋白质PRhCT(图18)，其中提供了hCT[G](人降钙素前体)，并将它们与OmpT蛋白酶反应以便检查α-hANP和hCT[G]是否可被切除。

用pG118ompPRR(图5)构建融合蛋白质PRhANP的表达质粒pG117ompPRhANP和融合蛋白质PRhCT的表达质粒pG117ompPRhCT。用以下3步制备融合蛋白质PRhANP和PRhCT。

(1)步骤1：pG117ompPRhANP的构建(图15)

构建融合蛋白质PRhANP(图16)的表达质粒pG117ompPRhANP，其中α-hANP安排在融合蛋白质PR(图4)N-端140位精氨酸之后。以pGHα97SII(“Daichokin o shukushu toshita seirikassei peputidoseisankei ni kansuru kenkyu(关于用大肠杆菌为宿主之生理活性肽生产系统的研究)”，Koji Magota，Doctoral Dissertation，KyushuUniversity，1991)为模板，P14：5’-GCGGAGCTCCGCCTGTATCGCAGCCTGCGGAGATCCAGCTG-3’和P15：5’-CTGAGTCGACTCAGTACCGG-3’为引物进行PCR。分离由此获得的PCR产物并用SacI和SalI消化。将由此获得的0.1kbp片段(片段23)与用SacI和SalI消化pG117ompPRR获得的3.4kbp片段(片段24)连接并进行转化。从由此获得的各克隆中分离质粒并进行限制酶分析和突变位点的核苷酸测序以便鉴定靶融合蛋白质的表达质粒。此质粒被称为pG117ompPRhANP。

(2)步骤2：pG117ompPRhCT的构建(图17)

构建融合蛋白质PRhCT(图18)的表达质粒pG117ompPRhCT，其中hCT[G]安排在融合蛋白质PR(图4)N-端140位精氨酸之后。以pG97S4DhCT[G]R4(Yabuta，M.，Suzuki，Y.和Ohsuye，K.，应用微生物工程(Appl.Microbiol.Biotechnol.42：703-708，1995)为模板，P16：5’-GCGGAGCTCCGCCTGTATCGCTGTGGTAACCTGAGCACCTG-3’和P17：5’-CTGACTCGACTTAGCCCGGG-3’为引物进行PCR。分离由此获得的PCR产物并用SacI和SalI消化。将由此获得的0.1kbp片段(片段25)与用SacI和SalI消化pG117ompPRR获得的3.4kbp片段(片段26)连接并进行转化。从由此获得的各克隆中分离质粒并进行限制酶分析和突变位点的核苷酸测序以便鉴定靶融合蛋白质的表达质粒。此质粒被称为pG117ompPRhCT。

(3)步骤3：融合蛋白质PRhANP和PRhCT的制备

将以上制备的pG117ompPRhANP和pG117ompPRhCT转化入OmpT蛋白酶缺陷大肠杆菌菌株W3110M25中，从而得到融合蛋白质生产菌株。通过培养这些菌株，融合蛋白质PRhANP(图16)和PRhCT(图18)被制备成包涵体。

实施例7：用OmpT蛋白酶切割PRhANP和PRhCT

检测融合蛋白质PRhANP(图16)和PRhCT(图18)是否可被OmpT蛋白酶切割。

将PRhANP和PRhCT与纯化的OmpT蛋白酶样品在pH7.0于25℃反应30分钟。图19显示了SDS-PAGE分析的结果，其中-代表了无OmpT蛋白酶的泳道，+代表添加了OmpT蛋白酶的泳道。结果发现PRhANP被OmpT蛋白酶切割(图19，泳道α-hANP)，而PRhCT不被切割(图19，泳道hCT)。

此外，为了确定PRhANP的切割位点，用HPLC分离OmpT蛋白酶处理后的肽消化产物并测定N-末端氨基酸序列。这样证实了α-hANP已被切除。

从此实施例的结果看，显而易见以丝氨酸为N-末端氨基酸的α-hANP被从所用的融合蛋白质中切下，而以半胱氨酸为N-末端氨基酸的hCT[G]则未被切割。在实施例3的结果中，+1位置处具半胱氨酸的PRC可被OmpT蛋白酶切割，而hCT[G]则不被切割。因此，已证实此酶的切割不仅仅取决于切割位点-1和+1位置处的氨基酸序列，而还很大程度上受切割位点附近的氨基酸序列影响。

实施例8：融合蛋白质RShANP的制备

由表达质粒pGRShANP(图20)编码的融合蛋白质RShANP(图21)是这样一种融合蛋白质，其中将来源于大肠杆菌β-半乳糖苷酶N-末端97个氨基酸的β-gal97S作为保护蛋白质，通过由3个氨基酸(谷氨酰胺-苯丙氨酸-精氨酸)组成的接头与α-hANP连接。在OmpT蛋白酶的研究过程中，本发明的发明者发现融合蛋白质RShANP被OmpT蛋白酶切割于接头序列中的精氨酸和α-hANP的N-末端丝氨酸之间的键。用以下两步骤制备融合蛋白质RShANP。

(1)pGRShANP的构建(图20)

pGHα97SII是构建为β-gal97S/α-hANP融合蛋白质表达质粒的质粒。以如下方式构建表达融合蛋白质RShANP的质粒pGRShANP，其中位于pGHα97SII所表达之融合蛋白质α-hANP N-末端丝氨酸之前紧邻处的赖氨酸被转换为精氨酸。

以pGHα97SII为模板，P18：5’-TACGATGCGCAATTCCGTAGCCTGCGG-3’和P19：5’-TGCCTGACTGCGTTAGCAATTTAACTGTGAT-3’为引物进行PCR，获得位于α-hANP N-末端丝氨酸之前紧邻处的赖氨酸密码子已被转换为精氨酸密码子的0.2kbpPCR产物(P20)。

然后，以由此获得的PCR产物(P20)和P21：5’-TTATCGCCACTGGCAGCAGC-3’为引物，pGHα97SII为模板再次进行PCR，从而得到含具精氨酸取代之接头DNA序列的1.0kbp PCR产物。用BglII和EcoRI消化此1.0kbp PCR产物并分离这样得到的0.2kbp DNA片段(片段27)。用BglII和EcoRI消化α-hANP表达质粒pGHα97SII，并将由此得到的3.0kbp片段(片段28)与片段27连接，从而构建pGRShANP。

(2)步骤2：融合蛋白质RShANP的制备

当pGRShANP表达于大肠杆菌中时，融合蛋白质RShANP(图21)表达为包涵体。在大肠杆菌中表达OmpT蛋白酶的情况下，包涵体在用尿素溶解时即被OmpT蛋白酶切割。为了避免此现象，将pGRShANP转化入OmpT蛋白酶缺陷的大肠杆菌菌株W3110M25，并由此将融合蛋白质RShANP制备为包涵体。

实施例9：用OmpT蛋白酶切割RShANP

以如下方式从融合蛋白质RShANP(图21)中切下生理活性肽α-hANP。将RShANP与OmpT蛋白酶在pH7.0于37℃反应2小时，随后进行SDS-PAGE分析。结果显示于图24中(泳道RS)，其中-代表无OmpT蛋白酶的泳道；而+代表添加OmpT蛋白酶的泳道。基于此结果，证实了RShANP可被OmpT蛋白酶切割。为了确定切割位点，用HPLC分离OmpT蛋白酶反应后获得的肽消化产物并测定N-末端的氨基酸序列。由此确定的OmpT蛋白酶切割位点列于表3中(RShANP)。如表3所示，RShANP被OmpT蛋白酶切割于-AQFR↓SLRR-，且生理活性肽α-hANP由此被直接切下。此外，部分检测到-AQFRSLR↓R-处的切割并证实了α-hANP(3-28)的切除。

表3：融合蛋白RShANP和RXhANP的OmpT蛋白酶切割位点

RXhANP 切割位点
RXhANP 切割位点	RShANP QFR↓SLRRS(SEQ ID NO：52)RRhANP QFR↓RLRRS(SEQ ID NO：53)RAhANP QFR↓ALRRS(SEQ ID NO：54)RChANP QFR↓CLRRS(SEQ ID NO：55)

↓代表OmpT蛋白酶切割位点。融合蛋白RShANP和RXhANP中从99位谷氨酰胺(从N-端数)至106位丝氨酸的区域显示为切割位点处的氨基酸序列。

实施例10：融合蛋白质RXhANP的制备

在使用融合蛋白质PRX为底物的情况下，证实了X是除天冬氨酸和谷氨酸(即，酸性氨基酸)和脯氨酸(即，亚氨基酸)之外的氨基酸的氨基酸序列-RLYRXHHG-(其中X表示选自20种类型的氨基酸)是OmpT蛋白酶可切割的。由此，检测与PRX类似的切割是否发生于其它氨基酸序列的OmpT蛋白酶切割位点中。首先，构建融合蛋白质RXhANP(其中X是R、A或C)的表达质粒pGRXhANP(其中X是R、A或C)(图22)，它通过将突变转移入表达质粒pGRShANP(图20)中从而转换OmpT蛋白酶切割位点-AQFR↓SLRR-为-AQFRXLRR-(其中X是精氨酸、丙氨酸或半胱氨酸)而完成构建。有关X，选择精氨酸作为形成碱性氨基酸对的阳性对照。选择丙氨酸和半胱氨酸是因为在实施例3中它们提供了相对高的切割效率。通过以下两步骤构建RXhANP(图23)。

(1)步骤1：pGRXhANP的构建(图22)

通过在pGRShANP中引入突变构建pGRXhANP。pGRShANP为模板，

P3：5’-ACCCCAGGCTTTACACTTTA-3’和P22X：5’-TCTCCGCAGNNNACGGAATTGCGCATCGTA-3’(NNN：转换成丙氨酸时是AGC；转换成半胱氨酸时GCA；转换成精氨酸时是ACG)为引物。从由此获得的PCR产物中分离靶PCR产物(PCR产物29)。同样地，以pGRShANP为模板，P23X：5’-CAATTCCGTNNNCTGCGGAGATCCAGCTGC-3”(NNN：转换成丙氨酸时是GCT；转换成半胱氨酸时TGC；转换成精氨酸时是CGT)和P24：5’-GCCTGACTGCGTTAGCAATTTAACTGTGAT-3’为引物进行PCR，并分离靶PCR产物(PCR产物30)。用以上获得的PCR产物29和30为模板，P3：5’-ACCCCAGGCTTTACACTTTA-3’和P24：5’-GCCTGACTGCGTTAGCAATTTAACTGTGAT-3’为引物进行PCR。收集PCR产物并用EcoRI和BglII切割，从中分离0.2kbp的DNA片段(片段31)。将此片段31与用EcoRI和BglII消化pGRShANP已获得的3.0kbp DNA片段(片段32)连接并进行转化。从由此获得的各克隆中分离质粒并进行限制酶分析和突变位点的核苷酸测序，以便鉴定靶融合蛋白质的表达质粒。此质粒被称为pGRXhANP(其中X代表所转换氨基酸的单字母密码；即，具丙氨酸取代的融合蛋白质表示为pGRAhANP)。

(2)步骤2：融合蛋白质RXhANP的制备

当pGRXhANP表达于大肠杆菌中时，融合蛋白质RXhANP(图23)表达为包涵体。在大肠杆菌中表达OmpT蛋白酶的情况下，包涵体在用尿素溶解时即被OmpT蛋白酶切割。为了避免此现象，将pGRXhANP转化入OmpT蛋白酶缺陷的大肠杆菌菌株W3110 M25，由此融合蛋白质RXhANP被制备为包涵体。

实施例11：用OmpT蛋白酶切割RXhANP

用OmpT蛋白酶在pH7.0于37℃切割融合蛋白质RXhANP(图23)2小时，该融合蛋白质中融合蛋白质RShANP(图21)的OmpT蛋白酶切割位点-AQFR↓SLRR-被转换为-AQFRXLRR-(其中X是精氨酸、丙氨酸或半胱氨酸)。图24显示了SDS-PAGE分析的结果。

与以PRR、PRA和PRC为底物的情况相似，在RRhANP、RAhANP和RChANP中观察到OmpT蛋白酶的切割。为了确定切割位点，在OmpT蛋白酶切割后用HPLC分离肽消化产物并测定N-末端氨基酸序列。由此确定的OmpT蛋白酶的切割位点列于表3中。如表3所示，RRhANP、RAhANP和RChANP分别被OmpT蛋白酶切割于-AQFRK↓XLRR-。此外，综合融合蛋白质PRX的结果，提示当其中OmpT蛋白酶切割位点附近的氨基酸被改变时，存在含一个碱性氨基酸的OmpT蛋白酶切割位点。

此实施例里，由28个氨基酸组成的α-hANP分子内存在的4个位点(精氨酸-精氨酸、精氨酸-甲硫氨酸、精氨酸-异亮氨酸和精氨酸-酪氨酸)中只有精氨酸-精氨酸稍微被切割，其它键几乎不被切割。这些事实表明只有迄今报道的切割序列和本发明发明者建议的序列(即，精氨酸-X或赖氨酸-X，其中X是除天冬氨酸和谷氨酸(酸性氨基酸)和脯氨酸(亚氨基酸)之外的17种氨基酸之一)不足以被OmpT蛋白酶所切割。也就是说，正如本发明的发明者所完成的，这表明利用含此酶已知切割位点的区域创建新切割位点的方法在工业上是有用的。

实施例12：融合蛋白质PRRXA的制备

如上所述，已指出OmpT蛋白酶切割精氨酸-X或赖氨酸-X的中心键，其中X是除天冬氨酸和谷氨酸(酸性氨基酸)和脯氨酸(亚氨基酸)之外的17种氨基酸之一。不过，OmpT蛋白酶不总能切割蛋白质和肽中所有的这些键。估计OmpT蛋白酶的切割很大程度上受切割位点附近的氨基酸序列影响。值得重视的是此酶具有高底物特异性，因为它专门切割特异位点。因此，本发明的发明者预期通过检测此酶已知切割位点N-端侧的氨基酸序列的作用，可进一步阐明此酶的底物特异性，因此进行了以下实验。

具OmpT蛋白酶可切割结构的融合蛋白质PRR(图25中所示)由来源于大肠杆菌β-半乳糖苷酶N-端117个氨基酸的保护蛋白质(β-gal117S4H)和人胰高血糖素样肽-1(GLP-1[G])组成。如图25中所示，制备融合蛋白质PRRXA(其中X相应于切割位点的氨基酸位置并表示除-7之外的-1-2---- -10)，其中融合蛋白质PRR的连接肽中存在的OmpT蛋白酶切割位点-QMHGYDAELRLYR↓RHHG-的-10至-1位置处氨基酸序列(即，GYDAELRLYR)中的氨基酸已逐个被转换为丙氨酸，并检测OmpT蛋白酶对这些融合蛋白质的切割。

用以下两步骤制备融合蛋白质PRRXA。

(步骤1)pG117ompPRRXA的构建(图26、27、28、29)

融合蛋白质PRRXA的表达质粒被称为pG117ompPRRXA(相应于融合蛋白质PRRXA)。不过，-7位置的丙氨酸不被取代。通过将DNA突变引入pG117ompPRR中进行这些取代。

为了诱发突变应用了PCR方法。如图26所示，以pG117ompPRR为模板，P10：5’-TGCCGAGGATGACGATGAGC-3’、P25：5’-GCGGAGCTCCGCCTGGCTCGCCGTCATCAC-3’、P26：5’-GCGGAGCTCCGCGCTTATCGCCGTCATCAC-3’和P27：5’-GCGGAGCTCGCTCTGTATCGCCGTCATCAC-3’为引物构建质粒pG117ompPRR-2A、pG117ompPRR-3A和pG117ompPRR-4A。以SacI和KpnI消化用引物组合P10/P25、P10/P26和P10/P27获得的PCR产物，各组合分别得到0.1kbp片段(片段33)。另外用SacI和BglI消化pG117omoPRR得到0.2kbp片段(片段34)。将这些片段33和34与用BglI和KpnI消化pG117ompPRR获得的3.2kbp片段(片段35)连接并进行转化。从由此获得的各克隆中分离质粒。

如图27中所示，以pG117ompPRR为模板，P10、P28：5’-CAGATGCATGGTTATGACGCGGAGGCTCGC-3’和P29：5’-CAGAT GCATGGTTATGACGCGGCTCTCCGC-3’为引物构建表达质粒pG117ompPRR-5A和pG117ompPRR-6A。以NsiI和KpnI消化用引物组合P10/P28和P10/P29获得的PCR产物，各组合分别得到0.1kbp片段(片段36)。分别地，用NsiI和KpnI消化pG117ompRR得到3.4kbp片段(片段37)。将这些片段36和37连接起来并进行转化。从由此获得的各克隆中分离质粒。

进一步，如图28所示构建表达质粒pG117ompPRR-8A、pG117ompPRR-9和pG117ompPRR-10A。以pG117ompPRR为模板，P3：5’-ACCCCAGGCTTTACACTTTA-3’、P30：5’-GCGGAGCTCCGCAGCATAACCATGCATCTG-3’、P31：5’-GCGGAGCTCCGCGTCAGCACCATGCATCTG-3’和P32：5’-GCGGAGCTCCGCGTCATAAGCAATGCATCTG-3’为引物。以SacI和BglII消化用引物组合P3/P30、P3/P31和P3/P32获得的PCR产物，各组合分别得到0.2kbp片段(片段38)。分别地，用KpnI和SacI消化pG117ompPRR得到0.1kbp片段(片段39)。将这些片段38和39与用BglII和KpnI消化pG117ompPRR获得的3.2kbp片段(片段40)连接并进行转化。从由此获得的各克隆中分离质粒。

如图29所示以pG117ompPRR为模板，P10和P33：5’-GCGGAGCTCCGCCTGTATGCTCGTCATCAC-3’为引物构建pG117ompPRR-1A。以SacI消化用引物组合P10/P33获得的PCR产物得到0.1kbp片段(片段41)。分别地，用SacI消化pG117ompPRR得到3.4kbp片段(片段42)。将这些片段41和42连接起来并进行转化。从由此获得的各克隆中分离质粒。

将由此构建的表达质粒pG117ompPRRXA均进行限制酶分析和突变位点处的核苷酸测序，从而证实为靶融合蛋白质PRRXA的表达质粒。

(步骤2)融合蛋白质PRR和PRRXA的制备

当pG117ompPRR和pG117ompPRRXA表达于大肠杆菌中时，融合蛋白质PRR和PRRXA表达为包涵体。在大肠杆菌中表达OmpT蛋白酶的情况下，包涵体在仅用尿素溶解时即被OmpT蛋白酶切割。因此，为了避免此现象，将pG117ompPRR和pG117ompPRRXA转化入OmpT蛋白酶缺陷的大肠杆菌菌株W3110M25，由此融合蛋白质PRR和PRRXA被制备为包涵体。

实施例13：用OmpT蛋白酶切割融合蛋白质PRR和PRRXA

PRR和PRRXA与纯化的OmpT蛋白酶样品在pH7.0于25℃反应60分钟。酶促反应完成后，进行SDS-PAGE分析。结果如图30所示。

PRR-1A不被OmpT蛋白酶切割(图30，泳道1A)。尽管在除PRR-1A之外的融合蛋白质中证实了可被OmpT蛋白酶所切割，但切割形成的4.9kDa肽片段的量在蛋白质和蛋白质之间是不同的。

为了对4.9kDa肽片段定量，将上述OmpT蛋白酶反应混合液进行HPLC。在除PRR-1A之外的各融合蛋白质的OmpT蛋白酶反应中，在保留时间8.8分钟时检测到一个峰。8.8分钟时PRR中检测到的此峰的N-末端氨基酸序列已被测定，并已阐明为切割于-QMHGYDAELRLYR↓RHHG-的4.9kDa肽片段(表4)。因此，推测各融合蛋白质与OmpT蛋白酶反应形成的8.8分钟时的峰相应于4.9kDa肽片段。

8.8分钟保留时间处的相对峰面积表明了由切割的4.9kDa肽片段的量。表4显示了以PRR时的量为100参照计算的4.9kDa肽片段相对量的数据。除PRR-1A外，PRR-4A显示了最小量的4.9kDa肽片段，而PRR-6A显示了最大量。基于这些结果，认为-4和-6位置(除-1位置外)很大程度地影响OmpT蛋白酶的切割。

表4：融合蛋白质PRRXA的切割(X从-10至-1，-7除外)

PRRXA 4.9kDa肽片段相对量
PRRXA 4.9kDa肽片段相对量	PRR 100PRR-1A NDPRR-2A 150PRR-3A 44PRR-4A 24PRR-5A 89PRR-6A 330PRR-8A 200PRR-9A 160PRR-10A 160

4.9kDa肽片段是用OmpT蛋白酶切割融合蛋白质形成的。PRR的4.9kDa肽片段量被当作100。ND表示未检测到。

实施例14：融合蛋白质PRR-4X和PRR-6X的制备

OmpT蛋白酶是主要识别和切割碱性氨基酸对的内切蛋白酶。同为识别和切割碱性氨基酸对之内切蛋白酶的哺乳动物弗林蛋白酶(切割碱性氨基酸对的C-端侧)的底物特异性已被详细研究，据报道弗林蛋白酶识别切割位点-1位置处的精氨酸和-2、-4和-6位置的碱性氨基酸。

实施例13的结果表明，将-4位置的碱性氨基酸精氨酸取代成丙氨酸使OmpT蛋白酶的切割变困难，而-6位置的酸性氨基酸谷氨酸取代成丙氨酸则促进了OmpT蛋白酶的切割。

基于这些结果，推测OmpT蛋白酶的切割可受切割位点-6和-4位置的氨基酸电荷影响。这样，通过形成其中这些位置的氨基酸被精氨酸和赖氨酸(碱性氨基酸)、天冬氨基酸和谷氨酸(酸性氨基酸)及天冬酰胺和谷氨酰胺(与酸性氨基酸结构相似的中性氨基酸)取代的融合蛋白质，检测OmpT蛋白酶的切割。

具-4位置取代的融合蛋白质被称为PRR-4X(图31)，而在-6位置有取代的融合蛋白质称为PRR-6X(图32)，其中X表示-4或-6位置的氨基酸单字母。用以下两步骤制备融合蛋白质PRR-4X和PRR-6X。

(步骤1)pG117ompPRR-4X和pG117ompPRR-6X的构建(图33和34)

融合蛋白质PRR-4X的表达质粒被称为pG117ompPRR-4X，其中PRR-4X中，融合蛋白质PRR之OmpT蛋白酶切割位点-QMHGYDAELRLYR↓RHHG- -4位置的精氨酸已被赖氨酸(碱性氨基酸)、天冬氨基酸或谷氨酸(酸性氨基酸)或者天冬酰胺或谷氨酰胺(与酸性氨基酸结构类似的中性氨基酸)取代，而融合蛋白质PRR-6X(其中-6位置的谷氨酸已以同样的方式被取代)的表达质粒被称为pG117ompPRR-6X。通过将DNA突变引入pG117ompPRR中进行这些取代。

通过PCR引入突变。用图33中所示步骤构建表达质粒pG117ompPRR-4K、pG117ompPRR-4D、pG117ompPRR-4E、pG117ompPRR-4N和pG117ompPRR-4Q。pG117ompPRR被用作模板，而P10、P34：5’-GCGGAGCTCAAACTGTATCGCCGTCATCAC-3’、P35：5’-GCGGA GCTCGACCTGTATCGCCGTCATCAC-3’、P36：5’-GCGGAGCTCGAACTGTATCGCCGTCATCAC-3’、P37：5’-GCGGAGCTCAACCTGTATCGCCGTCATCAC-3’和P38：5’-GCGGAGCTCCAGCTGTATCGCCGTCATCAC-3’用作引物。以P10/P34、P10/P35、P10/P36、P10/P37和P10/P38引物组合获得0.3kbp片段(片段43)的PCR产物。以pG117ompPRR为模板，P3和片段43为引物再次进行PCR，得到0.8kbp的片段(片段44)。将用NsiI和KpnI消化片段44得到的0.1kbp片段(片段45)和用NsiI和KpnI消化pG117ompPRR得到的3.4kbp片段(片段46)连接，并进行转化。从由此获得的各克隆中分离质粒。

如图34所示，以pG117ompPRR为模板，P10、P39：5’-CAGATGCATGGTTATGACGCGCGTCTCCGC-3’、P40：5’-CAGATGCATGGTTATGACGCGAAACTCCGC-3’、P41：5’-CAGATGCATGGTTATGACGCGGACCTCCGC-3’、P42：5’-CAGATGCATGGTTATGACGCGAACCTCCGC-3’和P43：5’-CAGATGCATGGTTATGACGCGCAGCTCCGC-3’为引物，构建表达质粒pG117ompPRR-6R、pG117ompPRR-6K、pG117ompPRR-6D、pG117ompPRR-6N和pG117ompPRR-6Q。以引物组合P10/P39、P10/P40、P10/P41、P10/P42和P10/P43获得的PCR产物。用NsiI和KpnI消化得到0.1kbp的片段(片段46)。用NsiI和KpnI消化pG117ompPRR得到3.4kbp片段(片段47)。将片段46和47连接，并进行转化。从由此获得的各克隆中分离质粒并进行限制酶分析和突变位点的核苷酸测序。这样，这些质粒被鉴定为靶融合蛋白质PRR-4X和PRR-6X的表达质粒pG117ompPRR-4X和pG117ompPRR-6X。

(步骤2)融合蛋白质PRR-4X和PRR-6X的制备

当pG117ompPRR-4X和pG117ompPRR-6X表达于大肠杆菌中时，融合蛋白质PRR-4X和PRR-6X表达为包涵体(图31和32)。在大肠杆菌中表达OmpT蛋白酶的情况下，包涵体在仅用尿素溶解时即被OmpT蛋白酶切割。因此，为了避免此现象，将pG117ompPRR-4X和pG117ompPRR-6X转化入OmpT蛋白酶缺陷的大肠杆菌菌株W3110M25，由此融合蛋白质PRR-4X和PRR-6X被制备为包涵体的形式。

实施例15：用OmpT蛋白酶切割融合蛋白质PRR-4X和PRR-6X

将PRR-4X与纯化的OmpT蛋白酶样品在pH7.0于25℃反应60分钟。酶促反应完成后，进行SDS-PAGE分析。图35A显示了结果，其中-代表无OmpT蛋白酶的泳道；而+代表添加OmpT蛋白酶(2.0U/ml)的泳道。

尽管在所有的融合蛋白质中可观察到OmpT蛋白酶的切割，但切割形成的4.9kDa肽片段的量在蛋白质和蛋白质之间是不同的。

然后用HPLC对4.9kDa肽片段进行定量。添加OmpT蛋白酶时，在8.8分钟的保留时间检测到峰。如实施例13所述，这些峰看起来可能属于4.9kDa肽片段。

表5显示了以PRR时量为100参照计算的4.9kDa肽片段相对量的数据。切割形成的肽片段的相对量为2-3％(PRR-4D和PRR-4E)或20-50％(PRR-4A、PRR-4N和PRR-4Q)或几乎可与PRR相比(PRR-4K)。基于这些结果，认为OmpT蛋白酶识别-4位置的氨基酸电荷。

表5：融合蛋白质PRR-4X(X是K、A、N、Q、D或E)的切割

PRR-4X 4.9kDa肽片段相对量
PRR-4X 4.9kDa肽片段相对量	PRR 100PRR-4K 96PRR-4A 49PRR-4N 48PRR-4Q 23PRR-4D 2.8PRR-4E 2.0

4.9kDa肽片段是用OmpT蛋白酶切割融合蛋白质形成的。PRR的4.9kDa肽片段量被当作100。PRR在-4位置具有精氨酸。

如图32所示，用融合蛋白质PRR-6X(其中融合蛋白质PRR-6位置的谷氨酸已被取代)进一步检查OmpT蛋白酶的切割。PRR-6X与纯化的OmpT蛋白酶样品在pH7.0于25℃反应60分钟。酶促反应完成后，进行SDS-PAGE分析。图35B显示了结果，其中-代表无OmpT蛋白酶的泳道；而+代表添加OmpT蛋白酶(0.1U/ml)的泳道。

尽管在所有的融合蛋白质中可观察到OmpT蛋白酶的切割，但与PRR-4X的情况相似，切割形成的4.9kDa肽片段的量在蛋白质和蛋白质之间是不同的。

然后用HPLC对4.9kDa肽片段进行定量。表6显示了以PRR时量为100参照计算的4.9kDa肽片段相对量的数据。切割形成的肽片段的相对量几乎可与PRR相比(PRR-6D)，约为PRR的3-4倍(PRR-6A、PRR-6N和PRR-6Q)或约为PRR的10倍(PRR-6R和PRR-6K)。基于这些结果，认为OmpT蛋白酶还识别-6位置的氨基酸电荷。

表6：融合蛋白质PRR-6X(X是R、K、A、N、Q或D)的切割

PRR-6X 4.9kDa肽片段相对量
PRR-6X 4.9kDa肽片段相对量	PRR 100PRR-6R 1000PRR-6K 1400PRR-6A 310PRR-6N 430PRR-6Q 390PRR-6D 110

用OmpT蛋白酶切割融合蛋白质形成该4.9kDa肽片段。PRR的4.9kDa肽片段量被当作100。PRR在-6位置具有谷氨酸。

这些结果显示OmpT蛋白酶识别底物消化位点中-4和-6位置的氨基酸，当这些位置的氨基酸是碱性氨基酸时切割率提高，而当这些位置的氨基酸是酸性氨基酸时切割率降低。

实施例16：OmpT蛋白酶可切割序列的应用

基于实施例15的结果，推测通过将已知OmpT蛋白酶切割位点-4和-6位置的氨基酸转换成碱性氨基酸可提高OmpT蛋白酶的切割效率。从这点出发，通过用精氨酸(碱性氨基酸)取代融合蛋白质RShANP(图21)OmpT蛋白酶切割位点-4和-6位置的氨基酸形成融合蛋白质RShANPR(图36)(它具有OmpT蛋白酶可切割结构并因而释放α-hANP)，然后用以下3步检查这些融合蛋白质在OmpT蛋白酶切割中相互间是否不同。

(步骤1)pGRShANPR的构建(图37)

融合蛋白质RShANPR的表达质粒(其中融合蛋白质RShANP之OmpT蛋白酶切割位点-QMHGYDAQFR↓SLRR-中-4位置的丙氨酸和-6位置的酪氨酸已分别被精氨酸所取代)被称为pGRShANPR。通过将DNA突变引入pGRShANP中进行这些转换。

通过PCR引入DNA突变。如图37所示，pGRShANP被用作模板，P10和P44：5’-ATGCACGGTCGTGATCGTCAATTCCGTAGC-3’用作引物。使用引物P10/P44组合得到0.3kbp片段(片段48)的PCR产物。然后以pGRShANP为模板，P3和片段48为引物再次进行PCR得到0.6kbp的片段(片段49)。将用BglII和EcoRI消化片段49获得的0.2kbp片段(片段50)与用BglII和EcoRI消化pGRShANP获得的3.0kbp片段(片段51)连接并进行转化。从由此获得的各克隆中分离质粒并进行限制酶分析和突变位点的核苷酸测序，以便鉴定靶融合蛋白质RShANPR的表达质粒pGRShANPR。

(步骤2)融合蛋白质RShANP和RShANPR的制备

当pGRShANP和pGRShANPR表达于大肠杆菌中时，融合蛋白质RShANP和RShANPR(图36)表达为包涵体。在大肠杆菌中表达OmpT蛋白酶的情况下，包涵体在仅用尿素溶解时即被OmpT蛋白酶切割。因此，为了避免此现象，将pG1RShANP和pGRShANPR转化入OmpT蛋白酶缺陷的大肠杆菌菌株W3110M25，由此融合蛋白质RShANP和RShANPR被制备为包涵体的形式。

(步骤3)用OmpT蛋白酶切割融合蛋白质RShANP和RShANPR

RShANP和RShANPR与纯化的OmpT蛋白酶样品在pH7.0于25℃反应90分钟。酶促反应完成后，用HPLC定量由此释放的肽片段。在添加OmpT蛋白酶(2.0U/ml)情况下，于4.7分钟的保留时间点检测到了峰。分离此峰并测定N-末端氨基酸序列，它被鉴定为α-hANP。

RShANPR在4.7分钟保留时间的相对峰面积(即，所释放α-hANP的相对量)是RShANP的2.2倍。基于这些结果，预期通过将已知OmpT蛋白酶切割位点的-6和-4位置的氨基酸转换为碱性氨基酸(在以上例子中是精氨酸)可促进OmpT蛋白酶的有效切割。

发明效果

在本发明方法的一方面，利用了OmpT蛋白酶显示出专门切割位于特异氨基酸序列中精氨酸-X和赖氨酸-X之间键(其中X代表除谷氨酸、天冬氨酸或脯氨酸之外的氨基酸)的高特异作用的性质。因此，例如，OmpT蛋白酶的用途使其可能在从遗传工程技术表达之融合蛋白质中切下靶肽时选择自以除谷氨酸、天冬氨酸或脯氨酸之外的氨基酸作为N-末端氨基酸构建的肽，并可能通过将+1位置的氨基酸转换成谷氨酸、天冬氨酸或脯氨酸而避免在不合乎需要的肽键处切割。

本发明方法的另一方面，种用了OmpT蛋白酶的另外的特性，即它识别-6和-4位置处的氨基酸电荷。如果类似于上述情况，从遗传工程技术表达之融合蛋白质中切下靶肽，则通过将-6和-4位置处的氨基酸转换成碱性氨基酸可提高切割率，而通过将-6和-4位置的氨基酸转换成酸性氨基酸可使在不合乎需要肽键处的切割最小化。当融合蛋白质以包涵体表达时，OmpT蛋白酶与包涵体一起被回收。因此，本发明在使用大肠杆菌为宿主时尤其有效。

序列表

<110>SUNTORY LIMITED

<120>控制OmpT蛋白酶切割的方法

<130>YCT-482

<150>JP Hei 11-057731

<151>1999-3-4

<160>124

<210>1

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>OmpT

<400>1

Arg Leu Tyr Arg Arg His His Gly

1 5

<210>2

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>Xaa代表20种氨基酸之一

<400>2

Arg Leu Tyr Arg Xaa His His Gly

1 5

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物(P1)

<400>3

gactcagatc ttcctgaggc cgat 24

<210>4

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物(P2)

<400>4

aaaggtacct tccgcatgcc gcggatgtcg agaagg 36

<210>5

<211>184

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白

<400>5

Met Thr Met Ile Thr Asp Ser Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Lys

1 5 10 15

Asp Trp Glu Asn Pro Gly Val Thr Gln Leu Asn Arg Leu Ala Ala

20 25 30

His Pro Pro Phe Ala Ser Trp Arg Asn Ser Asp Asp Ala Arg Thr

35 40 45

Asp Arg Pro Ser Gln Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gly Glu Trp Arg

50 55 60

Phe Ala Trp Phe Pro Ala Pro Glu Ala Val Pro Glu Ser Leu Leu

65 70 75

Asp Leu Pro Glu Ala Asp Thr Val Val Val Pro Asp Ser Ser Asn

80 85 90

Trp Gln Met His Gly Tyr Asp Ala Pro Ile Tyr Thr Asn Val Thr

95 100 105

Tyr Pro Ile Thr Val Asn Pro Pro Phe Val Pro Thr Glu Pro His

110 115 120

His His His Pro Gly Gly Arg Gln Met His Gly Tyr Asp Ala Glu

125 130 135

Leu Arg Leu Tyr Arg Arg His His Gly Ser Gly Ser Pro Ser Arg

140 145 150

His Pro Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser

155 160 165

Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val

170 175 180

Lys Gly Arg Gly

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物(P3)

<400>6

accccaggct ttacacttta 20

<210>7

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物(P4X)

nnn：丙氨酸时为AGC，缬氨酸时为AAC，亮氨酸时为CAG，

异亮氨酸时为GAT，脯氨酸时为CGG，

苯丙氨酸时为GAA，色氨酸时为CCA，

甲硫氨酸时为CAT，甘氨酸时为GCC，

丝氨酸时为AGA，苏氨酸时为GGT，

半胱氨酸时为GCA，酪氨酸时为GTA，

天冬酰胺时为GTT，谷氨酰胺时为CTG，

天冬氨酸时为GTC，谷氨酸时为TTC，

赖氨酸时为TTT，组氨酸时为ATG，精氨酸时为ACG

<400>7

ccggatccgt gatgnnngcg atacaggcg 29

<210>8

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物(P5)

<400>8

acggatccgg ttccccttat cgacatccg 29

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物(P6)

<400>9

ttgcgcattc acagttctcc 20

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物(P7)

<400>10

gcgggtgttg gcgggtgtcg 20

<210>11

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物(P7)

<400>11

tgaattcttc ctgtgtgaaa ttgttat 27

<210>12

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物(P9)

<400>12

tgaattcaaa atgcgggcga aactgctggg 30

<210>13

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物(P10)

<400>13

tgccgaggat gacgatgagc 20

<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物(P11)

<400>14

ctatcgtcgc cgcacttatg 20

<210>15

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物(P12)

<400>15

tgaattcttc ctgtctgtaa tttttatccg ctcacaatt 39

<210>16

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白PRA的OmpT蛋白酶切割位点

<400>16

Leu Tyr Arg Ala His His Gly Ser Gly

1 5

<210>17

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白PRV的OmpT蛋白酶切割位点

<400>17

Leu Tyr Arg Val His His Gly Ser Gly

1 5

<210>18

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白PRL的OmpT蛋白酶切割位点

<400>18

Leu Tyr Arg Leu His His Gly Ser Gly

1 5

<210>19

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白PRI的OmpT蛋白酶切割位点

<400>19

Leu Tyr Arg Ile His His Gly Ser Gly

1 5

<210>20

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白PRP的OmpT蛋白酶不切割位点

<400>20

Leu Tyr Arg Pro His His Gly Ser Gly

1 5

<210>221

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白PRF的OmpT蛋白酶切割位点

<400>21

Leu Tyr Arg Phe His His Gly Ser Gly

1 5

<210>22

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白PRW的OmpT蛋白酶切割位点

<400>22

Leu Tyr Arg Trp His His Gly Ser Gly

1 5

<210>23

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白PRM的OmpT蛋白酶切割位点

<400>23

Leu Tyr Arg Met His His Gly Ser Gly

1 5

<210>24

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白PRG的OmpT蛋白酶切割位点

<400>24

Leu Tyr Arg Gly His His Gly Ser Gly

1 5

<210>25

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白PRS的OmpT蛋白酶切割位点

<400>25

Leu Tyr Arg Ser His His Gly Ser Gly

1 5

<210>26

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白PRT的OmpT蛋白酶切割位点

<400>26

Leu Tyr Arg Thr His His Gly Ser Gly

1 5

<210>27

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白PRC的OmpT蛋白酶切割位点

<400>27

Leu Tyr Arg Cys His His Gly Ser Gly

1 5

<210>28

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白PRY的OmpT蛋白酶切割位点

<400>28

Leu Tyr Arg Tyr His His Gly Ser Gly

1 5

<210>29

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白PRN的OmpT蛋白酶切割位点

<400>29

Leu Tyr Arg Asn His His Gly Ser Gly

1 5

<210>30

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白PRQ的OmpT蛋白酶切割位点

<400>30

Leu Tyr Arg Gln His His Gly Ser Gly

1 5

<210>31

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白PRD的OmpT蛋白酶切割位点

<400>31

Leu Tyr Arg Asp His His Gly Ser Gly

1 5

<210>32

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白PRE的OmpT蛋白酶不切割位点

<400>32

Leu Tyr Arg Glu His His Gly Ser Gly

1 5

<210>33

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白PRK的OmpT蛋白酶切割位点

<400>33

Leu Tyr Arg Lys His His Gly Ser Gly

1 5

<210>34

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白PRR的OmpT蛋白酶切割位点

<400>34

Leu Tyr Arg Arg His His Gly Ser Gly

1 5

<210>35

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白PRH的OmpT蛋白酶切割位点

<400>35

Leu Tyr Arg His His His Gly Ser Gly

1 5

<210>36

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<223>Xaa代表丙氨酸、丝氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸和

谷氨酸。

<400>36

Arg Leu Tyr Lys Xaa His His Gly

1 5

<210>37

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物(P13X)

nnn：当模板是pG117ompPRA时是agc

当模板是pG117ompPRS时是aga

当模板是pG117ompPRK时是ttt

当模板是pG117ompPRR时是acg

当模板是pG117ompPRD时是gtc

当模板是pG117ompPRE时是ttc

<400>37

ccggatccgt gatgnnnttt atacaggcg 29

<210>38

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白PKA的OmpT蛋白酶切割位点

<400>38

Leu Tyr Lys Ala His His Gly Ser Gly

1 5

<210>39

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白PKS的OmpT蛋白酶切割位点

<400>39

Leu Tyr Lys Ser His His Gly Ser Gly

1 5

<210>40

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白PKK的OmpT蛋白酶切割位点

<400>40

Leu Tyr Lys Lys His His Gly Ser Gly

1 5

<210>41

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白PKR的OmpT蛋白酶切割位点

<400>41

Leu Tyr Lys Arg His His Gly Ser Gly

1 5

<210>42

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白PKD的OmpT蛋白酶切不切割位点

<400>42

Leu Tyr Lys Asp His His Gly Ser Gly

1 5

<210>43

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白PKE的OmpT蛋白酶不切割位点

<400>43

Leu Tyr Lys Glu His His Gly Ser Gly

1 5

<210>44

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物(P14)

<400>44

gcggagctcc gcctgtatcg cagcctgcgg agatccagct g 41

<210>45

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物(P15)

<400>45

ctgagtcgac tcagtaccgg 20

<210>46

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物(P16)

<400>46

gcggagctcc gcctgtatcg ctgtggtaac ctgagcacct g 41

<210>47

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物(P17)

<400>47

ctgagtcgac ttagcccggg 20

<210>48

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物(P18)

<400>48

tacgatgcgc aattccgtag cctgcgg 27

<210>49

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物(P19)

<400>49

tgcctgactg cgttagcaat ttaactgtga t 31

<210>50

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物(P21)

<400>50

ttatcgccac tggcagcagc 20

<210>51

<211>129

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白

<400>51

Met Thr Met Ile Thr Asp Ser Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Arg

1 5 10 15

Asp Trp Glu Asn Pro Gly Val Thr Gln Leu Asn Arg Leu Ala Ala

20 25 30

His Pro Pro Phe Ala Ser Trp Arg Asn Ser Glu Glu Ala Arg Thr

35 40 45

Asp Arg Pro Ser Gln Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gly Glu Trp Arg

50 55 60

Phe Ala Trp Phe Pro Ala Pro Glu Ala Val Pro Glu Ser Leu Leu

65 70 75

Glu Leu Pro Glu Ala Asp Thr Val Val Val Pro Asp Ser Ser Asn

80 85 90

Trp Gln Met His Gly Tyr Asp Ala Gln Phe Arg Ser Leu Arg Arg

95 100 105

Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile Gly Ala Gln Ser

110 115 120

Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr

125

<210>52

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白RShANP的OmpT蛋白酶切割位点

<400>52

Gln Phe Arg Ser Leu Arg Arg Ser

1 5

<210>53

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白RRhANP的OmpT蛋白酶切割位点

<400>53

Gln Phe Arg Arg Leu Arg Arg Ser

1 5

<210>54

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白RAhANP的OmpT蛋白酶切割位点

<400>54

Gln Phe Arg Ala Leu Arg Arg Ser

1 5

<210>55

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白RChANP的OmpT蛋白酶切割位点

<400>55

Gln Phe Arg Cys Leu Arg Arg Ser

1 5

<210>56

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>Xaa代表精氨酸、丙氨酸或半胱氨酸。

<400>56

Ala Gln Phe Arg Xaa Leu Arg Arg

1 5

<210>57

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物(P22X)

nnn：转换成丙氨酸时是agc，

转换成半胱氨酸时是gca，

转换成精氨酸时是acg

<400>57

tctccgcagn nnacggaatt gcgcatcgta 30

<210>58

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物(P23X)

nnn：转换成丙氨酸时是gct，

转换成半胱氨酸时是tgc，

转换成精氨酸时是cgt

<400>58

caattccgtn nnctgcggag atccagctgc 20

<210>59

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物(P24)

<400>59

gcctgactgc gttagcaatt taactgtgat 30

<210>60

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>60

Pro Ser Arg His Lys Arg

1 5

<210>61

<211>23

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>61

Gln Met His Gly Tyr Asp Ala Glu Leu Arg Leu Tyr Arg Arg His

1 5 10 15

His Arg Trp Gly Arg Ser Gly Ser

20

<210>62

<211>20

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>62

Gln Met His Gly Tyr Asp Ala Glu Leu Arg Leu Tyr Arg Arg His

1 5 10 15

His Gly Ser Gly Ser

20

<210>63

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>63

Pro Ser Arg His Pro Arg

1 5

<210>64

<211>26

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>64

Gln Met His Gly Tyr Asp Ala Glu Leu Arg Leu Tyr Arg Arg His

1 5 10 15

His Gly Ser Gly Ser Pro Ser Arg His Pro Arg

20 25

<210>65

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>65

aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aagaattcat gcgggcgaaa ctt 53

<210>66

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>66

aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aagaattcaa aatgcgggcg aaactg 56

<210>67

<211>53

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>67

aattgtgagc ggataaaaat tacagacagg aagaattcat gcgggcgaaa ctt 53

<210>68

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>68

aattgtgagc ggataaaaat tacagacagg aagaattcaa aatgcgggcg aaactg 56

<210>69

<211>3

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>69

Gln Phe Lys

1

<210>70

<211>26

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>70

Gln Met His Gly Tyr Asp Ala Glu Leu Arg Leu Tyr Arg Arg His

1 5 10 15

His Gly Ser Gly Ser Pro Tyr Arg His Pro Arg

20 25

<210>71

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>71

Gln Met His Gly Tyr Asp Ala Glu Leu Arg Leu Tyr Arg

1 5 10

<210>72

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>72

Glu Phe Arg His His Arg Arg His Arg Leu Glu

1 5 10

<210>73

<211>3

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>73

Gln Phe Arg

1

<210>74

<211>69

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>74

cagatgcatg gttatgacgc ggagctccgg ctgtatcgcc gtcatcaccg gtggggtcgt 60

tccggatcc 69

<210>75

<211>69

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>75

ggatccggaa cgaccccacc ggtgatgacg gcgatacagc cggagctccg cgtcataacc 60

atgcatctg 69

<210>76

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>76

tggttatgac gcggagctcc gcctgtatcg ccgtcatcac ggttccg 47

<210>77

<211>55

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>77

gatccggaac cgtgatgacg gcgatacagg cggagctccg cgtcataacc atgca 55

<210>78

<211>17

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PRR连接肽内的OmpT蛋白酶切割位点

<400>78

Gln Met His Gly Tyr Asp Ala Glu Leu Arg Leu Tyr Arg Arg His

5 10 15

His Gly

<210>79

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>实施例12中被修饰的PRR连接肽内OmpT蛋白酶切割位点从

-10至-1位置的氨基酸序列用于制备融合蛋白PRRXA

<400>79

Gly Tyr Asp Ala Glu Leu Arg Leu Tyr Arg

5 10

<210>80

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物(P25)

<400>80

GCGGAGCTCC GCCTGGCTCG CCGTCATCAC 30

<210>81

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物(P26)

<400>81

GCGGAGCTCC GCGCTTATCG CCGTCATCAC 30

<210>82

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物(P27)

<400>82

GCGGAGCTCG CTCTGTATCG CCGTCATCAC 30

<210>83

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物(P28)

<400>83

CAGATGCATG GTTATGACGC GGAGGCTCGC 30

<210>84

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物(P29)

<400>84

CAGATGCATG GTTATGACGC GGCTCTCCGC 30

<210>85

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物(P30)

<400>85

GCGGAGCTCC GCAGCATAAC CATGCATCTG 30

<210>86

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物(P31)

<400>86

GCGGAGCTCC GCGTCAGCAC CATGCATCTG 30

<210>87

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物(P32)

<400>87

GCGGAGCTCC GCGTCATAAG CATGCATCTG 30

<210>88

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物(P33)

<400>88

GCGGAGCTCC GCCTGTATGC TCGTCATCAC 30

<210>89

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物(P34)

<400>89

GCGGAGCTCA AACTGTATCG CCGTCATCAC 30

<210>90

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物(P35)

<400>90

GCGGAGCTCG ACCTGTATCG CCGTCATCAC 30

<210>91

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物(P36)

<400>91

GCGGAGCTCG AACTGTATCG CCGTCATCAC 30

<210>92

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物(P37)

<400>92

GCGGAGCTCA ACCTGTATCG CCGTCATCAC 30

<210>93

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物(P38)

<400>93

GCGGAGCTCC AGCTGTATCG CCGTCATCAC 30

<210>94

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物(P39)

<400>94

CAGATGCATG GTTATGACGC GCGTCTCCGC 30

<210>95

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物(P40)

<400>95

CAGATGCATG GTTATGACGC GAAACTCCGC 30

<210>96

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物(P41)

<400>96

CAGATGCATG GTTATGACGC GGACCTCCGC 30

<210>97

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物(P42)

<400>97

CAGATGCATG GTTATGACGC GAACCTCCGC 30

<210>98

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物(P43)

<400>98

CAGATGCATG GTTATGACGC GCAGCTCCGC 30

<210>99

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>RShANP的OmpT蛋白酶切割位点

<400>99

Gln Met His Gly Tyr Asp Ala Gln Phe Arg Ser Leu Arg Arg

5 10

<210>100

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物(P44)

<400>100

ATGCACGGTC GTGATCGTCA ATTCCGTAGC 30

<210>101

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PRR的部分序列(图25、31和32)

<400>101

Gly Tyr Asp Ala Glu Leu Arg Leu Tyr Arg Arg His His Gly

1 5 10

<210>102

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PRR-1A的部分序列(图25)

<400>102

Gly Tyr Asp Ala Glu Leu Arg Leu Tyr Ala Arg His His Gly

1 5 10

<210>103

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PRR-2A的部分序列(图25)

<400>103

Gly Tyr Asp Ala Glu Leu Arg Leu Ala Arg Arg His His Gly

1 5 10

<210>104

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PRR-3A的部分序列(图25)

<400>104

Gly Tyr Asp Ala Glu Leu Arg Ala Tyr Arg Arg His His Gly

1 5 10

<210>105

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PRR-4A的部分序列(图25)

<400>105

Gly Tyr Asp Ala Glu Leu Ala Leu Tyr Arg Arg His His Gly

1 5 10

<210>106

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PRR-5A的部分序列(图25)

<400>106

Gly Tyr Asp Ala Glu Ala Arg Leu Tyr Arg Arg His His Gly

1 5 10

<210>107

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PRR-6A的部分序列(图25)

<400>107

Gly Tyr Asp Ala Ala Leu Arg Leu Tyr Arg Arg His His Gly

1 5 10

<210>108

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PRR-8A的部分序列(图25)

<400>108

Gly Tyr Ala Ala Glu Leu Arg Leu Tyr Arg Arg His His Gly

1 5 10

<210>109

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PRR-9A的部分序列(图25)

<400>109

Gly Ala Asp Ala Glu Leu Arg Leu Tyr Arg Arg His His Gly

1 5 10

<210>110

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PRR-10A的部分序列(图25)

<400>110

Ala Tyr Asp Ala Glu Leu Arg Leu Tyr Arg Arg His His Gly

1 5 10

<210>111

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PRR-4K的部分序列(图31)

<400>111

Gly Tyr Asp Ala Glu Leu Lys Leu Tyr Arg Arg His His Gly

1 5 10

<210>112

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PRR-4A的部分序列(图31)

<400>112

Gly Tyr Asp Ala Glu Leu Ala Leu Tyr Arg Arg His His Gly

1 5 10

<210>113

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PRR-4N的部分序列(图31)

<400>113

Gly Tyr Asp Ala Glu Leu Asn Leu Tyr Arg Arg His His Gly

1 5 10

<210>114

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PRR-4Q的部分序列(图31)

<400>114

Gly Tyr Asp Ala Glu Leu Gln Leu Tyr Arg Arg His His Gly

1 5 10

<210>115

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PRR-4D的部分序列(图31)

<400>115

Gly Tyr Asp Ala Glu Leu Asp Leu Tyr Arg Arg His His Gly

1 5 10

<210>116

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PRR-4E的部分序列(图31)

<400>116

Gly Tyr Asp Ala Glu Leu Glu Leu Tyr Arg Arg His His Gly

1 5 10

<210>117

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PRR-6R的部分序列(图32)

<400>117

Gly Tyr Asp Ala Arg Leu Arg Leu Tyr Arg Arg His His Gly

1 5 10

<210>118

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PRR-6K的部分序列(图32)

<400>118

Gly Tyr Asp Ala Lys Leu Arg Leu Tyr Arg Arg His His Gly

1 5 10

<210>119

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PRR-6A的部分序列(图32)

<400>119

Gly Tyr Asp Ala Ala Leu Arg Leu Tyr Arg Arg His His Gly

1 5 10

<210>120

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PRR-6N的部分序列(图32)

<400>120

Gly Tyr Asp Ala Asn Leu Arg Leu Tyr Arg Arg His His Gly

1 5 10

<210>121

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PRR-6Q的部分序列(图32)

<400>121

Gly Tyr Asp Ala Gln Leu Arg Leu Tyr Arg Arg His His Gly

1 5 10

<210>122

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PRR-6D的部分序列(图32)

<400>122

Gly Tyr Asp Ala Asp Leu Arg Leu Tyr Arg Arg His His Gly

1 5 10

<210>123

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>RShANP的部分序列(图36)

<400>123

Gln Met His Gly Tyr Asp Ala Gln Phe Arg Ser Leu Arg Arg

1 5 10

<210>124

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>RShANPR的部分序列(图36)

<400>124

Gln Met His Gly Arg Asp Arg Gln Phe Arg Ser Leu Arg Arg

1 5 10

Claims

1.一种控制OmpT蛋白酶在由-1和+1位置的两个任意连续氨基酸组成的、待被OmpT蛋白酶所靶向切割的序列位点处对多肽进行切割的方法，该方法包括将所述多肽内的氨基酸改变成其它氨基酸，所述方法包括：

(a)若所述序列位点的-1位置处的氨基酸既非赖氨酸也非精氨酸，则将赖氨酸或精氨酸设置为-1位置处的氨基酸，并且若所述序列位点的+1位置处的氨基酸是谷氨酸、天冬氨酸或脯氨酸，则将除谷氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、精氨酸、赖氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸和谷氨酰胺外的氨基酸设置为+1位置处的氨基酸；或者

(b)(1)若所述序列位点的-1位置处的氨基酸既非赖氨酸也非精氨酸，则将赖氨酸或精氨酸设置为-1位置处的氨基酸，并且若所述序列位点的+1位置处的氨基酸是谷氨酸、天冬氨酸或脯氨酸，则将除谷氨酸、天冬氨酸和脯氨酸外的氨基酸设置为+1位置处的氨基酸；并且

(2)将除酸性氨基酸外的氨基酸设置为相对于所述序列位点而言处于-4或-6位置处的氨基酸；

从而所述多肽的合乎需要部分被OmpT蛋白酶切割；

前提条件是，在(a)中未改变+1位置处的氨基酸时切割受到控制的情形下，

x)若赖氨酸被设置为-1位置处的氨基酸，则不将精氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺和丙氨酸选作+1位置处的氨基酸，并且

y)若精氨酸被设置为-1位置处的氨基酸，则不将精氨酸、赖氨酸、丙氨酸和甲硫氨酸选作+1位置处的氨基酸。

2.权利要求1的方法，其中所述多肽最初并不能在由-1和+1位置的两个任意连续氨基酸组成的序列位点处被OmpT蛋白酶所切割，所述方法包括：

若所述序列位点的-1位置处的氨基酸既非赖氨酸也非精氨酸，则将该氨基酸设置为赖氨酸或精氨酸；并且若所述序列位点的+1位置处的氨基酸是谷氨酸、天冬氨酸或脯氨酸，则将除谷氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、精氨酸、赖氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸和谷氨酰胺外的氨基酸设置为+1位置处的氨基酸；

从而使所述多肽内的所述序列位点变得可被OmpT蛋白酶所切割；

前提条件是，在未改变+1位置处的氨基酸时切割受到控制的情形下，

3.权利要求1的方法，其中所述多肽最初并不能在由-1和+1位置的两个任意连续氨基酸组成的序列位点处被OmpT蛋白酶所切割，所述方法包括：

(1)若所述序列位点的-1位置处的氨基酸既非赖氨酸也非精氨酸，则将赖氨酸或精氨酸设置为-1位置处的氨基酸，并且若所述序列位点的+1位置处的氨基酸是谷氨酸、天冬氨酸或脯氨酸，则将除谷氨酸、天冬氨酸和脯氨酸外的氨基酸设置为+1位置处的氨基酸；以及

(2)若相对于所述序列位点而言处于-4或-6位置处的氨基酸是酸性氨基酸，则将除酸性氨基酸外的氨基酸设置为该-4或-6位置处的氨基酸；

从而使所述多肽内的所述序列位点变得可被OmpT蛋白酶所切割。

4.权利要求3的方法，其特征在于所述除酸性氨基酸外的氨基酸是碱性氨基酸。

5.权利要求1的方法，其中所述多肽最初并不能在由-1和+1位置的两个任意连续氨基酸组成的序列位点处被OmpT蛋白酶所切割，所述方法包括：

(1)若所述序列位点的-1位置处的氨基酸既非赖氨酸也非精氨酸，则将赖氨酸或精氨酸设置为-1位置处的氨基酸，若所述序列位点的+1位置处的氨基酸是谷氨酸、天冬氨酸或脯氨酸，则将除谷氨酸、天冬氨酸和脯氨酸外的氨基酸设置为+1位置处的氨基酸；并且

(2)若相对于所述序列位点而言处于-4或-6位置处的氨基酸是天冬酰胺、谷氨酰胺或丙氨酸，则将碱性氨基酸设置为该-4或-6位置处的氨基酸；

6.一种提高OmpT蛋白酶在多肽上由-1和+1位置的两个任意连续氨基酸组成的、能被OmpT蛋白酶所切割的序列位点处的切割效率的方法，该方法包括将所述多肽内的氨基酸改变成其它氨基酸，从而使切割效率相比于未进行所述氨基酸改变的情形而言有所提高，所述方法包括：

若相对于所述序列位点而言处于-4或-6位置处的氨基酸是酸性氨基酸，则将除酸性氨基酸外的氨基酸设置为该-4或-6位置处的氨基酸。

7.权利要求6的方法，其中所述除酸性氨基酸外的氨基酸是碱性氨基酸。

8.一种提高OmpT蛋白酶在多肽上由-1和+1位置的两个任意连续氨基酸组成的、能被OmpT蛋白酶所切割的序列位点处的切割效率的方法，该方法包括将所述多肽内的氨基酸改变成其它氨基酸，从而使切割效率相比于未进行所述氨基酸改变的情形而言有所提高，所述方法包括：

若相对于所述序列位点而言处于-4或-6位置处的氨基酸是天冬酰胺、谷氨酰胺或丙氨酸，则将碱性氨基酸设置为该-4或-6位置处的氨基酸。

9.一种控制OmpT蛋白酶在由-1和+1位置的两个任意连续氨基酸组成的、最初能被OmpT蛋白酶所切割的序列位点处对多肽进行切割的方法，该方法包括将所述多肽内的氨基酸改变成其它氨基酸，所述方法包括：

(1)若所述序列位点的+1位置处的氨基酸既非谷氨酸、天冬氨酸，也非脯氨酸，则将谷氨酸、天冬氨酸或脯氨酸设置为+1位置处的氨基酸；从而所述多肽的不合乎需要部分不被OmpT蛋白酶切割；或者

(2)若相对于所述序列位点而言处于-4或-6位置处的氨基酸是碱性氨基酸，则将天冬酰胺、谷氨酰胺、丙氨酸或酸性氨基酸设置为相对于所述序列位点而言处于-4或-6位置处的氨基酸，或者若相对于所述序列位点而言处于-4或-6位置处的氨基酸是天冬酰胺、谷氨酰胺或丙氨酸，则将酸性氨基酸设置为相对于所述序列位点而言处于-4或-6位置处的氨基酸；由此使得OmpT蛋白酶的切割效率与未进行所述氨基酸改变的情形相比有所降低。

10.权利要求9的方法，其中所述多肽最初能被OmpT蛋白酶在由-1和+1位置的两个任意连续氨基酸组成的序列位点处所切割，该方法包括：

若所述序列位点的+1位置处的氨基酸既非谷氨酸、天冬氨酸，也非脯氨酸，则将谷氨酸、天冬氨酸或脯氨酸设置为+1位置处的氨基酸；

从而所述多肽的不合乎需要部分不被OmpT蛋白酶切割。

11.权利要求9的方法，其中所述多肽最初能被OmpT蛋白酶在由-1和+1位置的两个任意连续氨基酸组成的序列位点处所切割，该方法包括：

若相对于所述序列位点而言处于-4或-6位置处的氨基酸是碱性氨基酸，则将天冬酰胺、谷氨酰胺、丙氨酸或酸性氨基酸设置为该-4或-6位置处的氨基酸。

12.权利要求9的方法，其中所述多肽最初能被OmpT蛋白酶在由-1和+1位置的两个任意连续氨基酸组成的序列位点处所切割，该方法包括：

若相对于所述序列位点而言处于-4或-6位置处的氨基酸是天冬酰胺、谷氨酰胺或丙氨酸，则将酸性氨基酸设置为该-4或-6位置处的氨基酸。

13.如权利要求1的方法，包括在宿主细胞中表达基因，该基因编码由通过切割位点与保护肽融合的靶多肽组成、并在所述切割位点处可被OmpT蛋白酶切割的融合蛋白质，和用OmpT蛋白酶在所述切割位点处切下蛋白质，从而从所述融合蛋白质中获得靶多肽。

14.如权利要求13的方法，其中OmpT蛋白酶可切割的氨基酸序列存在于组成所述融合蛋白质的保护肽、连接肽或靶多肽的氨基酸序列中。

15.生产靶多肽的方法，包括在宿主细胞中表达基因，该基因编码由通过切割位点与保护肽融合的靶多肽组成、并在所述切割位点处可被OmpT蛋白酶切割的融合蛋白质，以及通过OmpT蛋白酶在所述切割位点处切割蛋白质，从而从所述融合蛋白质获得靶多肽，其中如权利要求1-8中任一项所述改变在所述切割位点处或在该位点附近的氨基酸。

16.如权利要求15的方法，其中OmpT蛋白酶可切割的氨基酸序列存在于组成所述融合蛋白质的保护肽、连接肽或靶多肽的氨基酸序列中。

17.权利要求9-12中任一项的方法，其用于在宿主细胞中表达编码多肽的基因的情形，包括改变多肽中的氨基酸，从而使得所述多肽在不被靶向切割的位点处不被OmpT蛋白酶切割，或使得OmpT蛋白酶在未被靶向的位点处的切割效率与未进行所述氨基酸改变的情形相比有所降低。

18.通过在宿主细胞中表达编码多肽的基因而生产多肽的方法，其中所述多肽最初在并非靶向切割的序列位点处以及被靶向切割的另一序列位点处可被OmpT蛋白酶所切割，该方法包括如权利要求9-12中任一项所述改变氨基酸，从而使得所述多肽在未被靶向的位点处不被OmpT蛋白酶切割，或使得OmpT蛋白酶在未被靶向的序列位点处的切割效率与未进行所述氨基酸改变的情形相比有所降低。

19.按权利要求13的方法，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。

20.按权利要求13的方法，其中所说的靶多肽是钠尿肽。