KR100916169B1 - ＯｍｐＴ 프로테아제에 의한 절단 제어 방법 - Google Patents

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Abstract

OmpT 프로테아제의 특성을 해명하여 프로테아제로서의 새로운 용도 및 목적하는 폴리펩티드의 새로운 제조방법을 제공한다. 좀더 구체적으로는, 폴리펩티드내 임의의 두개의 연속 아미노산 및/또는 이 부위 주변에 아미노산(들)로 구성된 서열 부위를 다른 아미노산으로 전환시키는 것으로 구성되는 OmpT 프로테아제에 의한 폴리펩티드의 절단을 제어하는 방법으로서, 이 방법은 (1) 상기 부위와 관련된 -1-위치의 아미노산이 리신 또는 아르기닌이고, +1-위치의 아미노산은 특정 아미노산으로 전환시키고; 및/또는 (2) 상기 부위로부터 -4-위치 및/또는 -6-위치의 아미노산(들)은 특정 아미노산(들)으로 전환시켜, 폴리펩티드의 원하지 않는 부분을 OmpT 프로테아제에 의한 절단으로부터 방지하는 것을 특징으로 한다.
OmpT 프로테아제

Description

ＯｍｐＴ 프로테아제에 의한 절단 제어 방법{METHOD FOR CONTROLLING CLEAVAGE BY OmpT PROTEASE}
본 발명은 대장균 OmpT 프로테아제의 기질 특이성을 조사하여 발견된 신규의 절단 및 인식 부위에 대한 발견을 이용한 OmpT 프로테아제에 의한 폴리펩티드의 절단 제어 방법에 관한 것이다.
한 양태로서, 본 발명은 OmpT 프로테아제를 이용하여 폴리펩티드를 절단하는 방법에 관한 것이다. 좀더 구체적으로는, 이것은 OmpT 프로테아제의 신규의 절단 및 인식 부위를 이용하여 폴리펩티드를 절단하는 방법에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 OmpT 프로테아제를 이용하여 융합 단백질로부터 생리학적 활성 펩티드, 단백질 및 이의 유도체를 절단하는 방법에 관한 것이다. 좀더 구체적으로는, 본 발명은 OmpT 프로테아제의 기질 특이성 조사로 새로운 절단 방법 및 절단 및 인식 부위를 발견하여 이러한 특성을 이용하여, 생리학적 활성 펩티드, 단백질 및 이의 유도체를 융합된 단백질로부터 효과적으로 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 원하지 않는 부위에서 OmpT 프로테아제에 의한 폴리펩티드의 절단을 우회하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 숙주세포에 의해 생산되는 경우에서 OmpT 프로테아제에 의한 생리학적 활성 펩티드, 단백질 및 이의 유도 체의 절단을 우회하는 방법에 관한 것이다. 즉, 본 발명은 OmpT 프로테아제 절단 부위 또는 이의 부근에서 아미노산 서열을 전환시켜 OmpT 프로테아제에 의해 생리학적 활성 펩티드, 단백질 또는 이의 유도체가 절단되지 않게(거의 절단되지 않게) 만드는 방법을 제공한다.
대장균 OmpT 프로테아제는 대장균 외막에 존재하고, 염기성 아미노산 쌍사이의 결합을 주로 선택적으로 절단하는 프로테아제이다 (Sugimura, K. and Nishihara, T.J.Bacteriol.170:5625-5632,1988). 이 효소의 분자량은 36,000 이며, 겉보기에는 세린 프로테아제의 범주에 포함된다. 수기무라등은 이 OmpT 프로테아제의 기질 특이성을 조사하였고, 이 효소는 아르기닌-아르기닌, 리신-리신, 아르기닌-리신 및 리신-아르기닌의 염기성 아미노산 쌍의 중앙에서 펩티드 결합을 특이적으로 절단함을 보고하였다. 또한, 상기 쌍들외의 아미노산 서열에서 절단 부위가 발견되었다. 즉, OmpT 프로테아제에 의한 절단은 아르기닌-메티오닌 (Zhao, G-P, and Somerville,R.L.J.Biol.Chem.268, 14912-14920, 1993), 아르기닌-알라닌 (Lassen, S.F. et al. Biochem.Int.27:601-611, 1992) 및 아르기닌-발린 (Maurer,J.J.Bacteriol.179:794-804, 1997) 에서 발생함이 보고되어 있다. 이러한 프로테아제는 이러한 서열을 포함한 단백질 및 펩티드 모두가 아니라 특정 부위에서 배타적으로 특정 단백질 및 펩티드만을 절단하는 것을 특징으로 한다. 예컨대, γ-인터페론은 상술한 바와 같이 10 개의 서열을 포함하지만, 이들중 2 개의 서열만이 OmpT 프로테아제에 의해서 절단될 수 있다 (Sugimura, K. and Higashi,N.J.Bacteriol.170:3650-3654,1988). T7 RNA 폴리머라아제는 전술한 바와 같이 17 개의 서열을 포함하나 이들중 2 개의 서열만이 OmpT 프로테아제에 의해서 절단될 수 있다 (Grodberg, J. 및 Dunn, J.J.J. Bacteriol.170:1245-1253, 1988). 이러한 사실은 OmpT 프로테아제의 절단 부위에 대한 전술한 데이타는 단백질의 펩티드 맵핑에서 통상적으로 사용되고, 그의 절단부위는 공지된 데이타에 기초하여 판단할 수 있는 AP-1 및 트립신 효소와는 상이한, OmpT 프로테아제의 절단부위의 판단에 적용할 수 없음을 보여준다. OmpT 프로테아제에 의한 절단이 단백질 및 펩티드의 특정 부위에서 발생하기 때문에, 전술한 바와 같은 아미노산 서열이외의 아미노산 서열(즉, 절단부위의 N-말단 및 C-말단 아미노산 서열)이 절단에 관여할 수 있을 것으로 예견된다. 그러나, 어떤 아미노산 서열이 절단을 허용하는지 (또는 허용치 못하는지)는 지금까지 여전히 미궁으로 남아있다.
그러나, OmpT 프로테아제는 유전자 재조합 기술에 의해 구축된 융합단백질로부터 표적 폴리펩티드를 절단하는데 있어 그 용도를 발견하였으며, 이는 이것이 절단부위에 대하여 높은 특이성을 갖고, 대장균의 내인성 프로테아제중 하나이기 때문이다. 대장균을 이용하여 콜레스테롤 에스테라아제를 방출 및 생산하기 위하여, 한케등은 에스테라아제를 대장균 헤모리신 A 단백질과 융합시키고, 이 융합 단백질을 세포로부터 방출시킨후, 단백질을 외막상의 OmpT 프로테아제로 처리하여 성공적으로 융합 단백질로부터 활성 콜레스테롤 에스테라아제를 수득하는 것을 성공하였다. 한케등은 아르기닌-리신 서열을 갖는 링커를 이용하였고, 이 서열을 OmpT 프로테아제로 절단하였다 (Hanke, C et. al. Mol.Gen Genet.233:42-48,1992).
본 발명자는 OmpT 프로테아제가 변성제에 대해 내성적임을 발견하였고, 봉입체로서 발현되는 융합 단백질은 상기의 특성의 이용으로 변성제의 존재하에서 절단될 수 있음을 해명하였다. 즉, 본 발명자는 대장균 발현 시스템에서 봉입체로서 S. aureus V8 프로테아제 유도체 융합 단백질을 발현시키고, 이것을 우레아로 용해시킨후, 우레아의 존재하에서 OmpT 프로테아제를 이용하여 융합 단백질로부터 V8 프로테아제 유도체 부분을 방출시켜 최종적으로 리폴딩시켜 효소활성을 갖는 V8 프로테아제 유도체를 성공적으로 생산하였다 (Yabuta, M., Ochi, N. and Ohsuye, K.Appl. Microbiol. Biotechnol.44:118-125, 1995).
융합 단백질로부터 표적 펩티드 또는 표적 단백질을 방출시키기 위하여, 아미노산 서열에 고 특이성을 갖는 효소를 사용하는 것이 관례가 되었다. 이러한 목적을 위하여 사용하는 프로테아제의 공지된 예에는 포유류 기원의 효소이고, 단지 고가로 소량으로만 제공되는 Xa 인자, 트롬빈, 엔테로키나아제등이 포함된다. 그러므로, 이러한 효소는 대규모로 융합 단백질 방법으로 펩티드 및 단백질을 산업적으로 처리하는 데에는 부적합하다. 표적 펩티드 또는 단백질이 약제로서 사용되는 경우, 효소에서 발생하는 바이러스 오염을 고려하는 것이 필요하다. 이와는 달리, OmpT 프로테아제는 대장균으로부터 발생되기 때문에 공급, 가격 및 안정성에서 상기 효소보다 월등히 우수하다.
그러나, 이러한 프로테아제의 기질 특이성은 아직까지 충분하게 연구되지 않아, 현 단계에서 절단하고자 하는 목적 부분에서 절단 부위를 임의적으로 디자인 하는 것은 어렵다. 더욱이, OmpT 프로테아제는 전술된 서열(예, 아르기닌-아르 기닌, 리신-리신, 아르기닌-리신, 리신-아르기닌, 아르기닌-메티오닌, 아르기닌-알라닌 및 아르기닌-발린)의 모두를 절단하는 것이 아니라 단백질에서 배타적으로 특정 부위만을 절단한다. 이러한 두 아미노산으로 구성된 서열들중 하나가 단지 융합단백질의 링커 부위에 위치하는 경우, 이 부위는 항상 OmpT 프로테아제에 의해서 절단될 수는 없다. 설사 이것이 절단될 수 있다 하더라도, OmpT 프로테아제는 두개의 아미노산으로 구성된 절단 부위의 중앙에서 펩티드 결합을 절단한다. 그러므로, 절단 부위의 +1 위치에 위치한 아미노산은, 상기 효소가 보호 펩티드, OmpT 프로테아제의 절단부위의 아미노산 서열 및 표적 폴리펩티드 순서로 구성된 융합단백질을 절단하는 경우 표적 폴리펩티드의 N-말단에 부가될 것이다. 더욱이, 이 첨가된 아미노산은 임의적으로 선택될 수 없고, 단지 여기에 보고된 OmpT 프로테아제의 인식 서열에 기초하여 아르기닌, 리신, 발린, 알라닌 또는 메티오닌으로 제한된다. OmpT 프로테아제의 이러한 특성은 절단 융합 단백질에서 사용하는 프로테아제로서는 바람직하지 못하다.
한편, 프로테아제인 파파인의 절단 효율은 기질내 절단 부위의 서열뿐만아니라 이의 부근의 아미노산 서열에 의해서도 영향을 받음이 공지되어 있다 (Schechter, I. and Berger, A. Biochem.Biophys.Res.Commun.27:157-162 1967). 최근에 염기성 아미노산 쌍의 C-말단 측면을 절단하는 프로테아제인 Kex2 (Rockwell, N.C., Wang,G.T., Krafft,G.A. 및 Fuller, R.S. Biochemistry 36, 1912-1917 1997) 및 푸린 (Krysan, D.J., Rockwell,N.C., and Fuller, R.S.J.Biol.Chem.274, 23229-23234 1999)에 대하여 상세히 연구되었다. Kex2 및 푸린에서, 절단부위에서 컨센서스 서열 및 이의 부근의 아미노산 서열은 기질의 아미노산 서열을 비교하여 해명되었다. OmpT 프로테아제의 경우에서, 지금까지 알려진 기질의 비교를 기초하여, 아르기닌 또는 리신은 절단 부위의 N-말단 측면내 1-위치의 아미노산으로서 필수적으로 요구될 것으로 생각되나, 다른 분명한 컨센서스 서열은 지금까지 발견되지 않았다. OmpT 프로테아제의 절단부위의 인식 및 절단 효율은 또한 기질내 절단 부위뿐만아니라 이의 부근내 아미노산 서열에 의해서 영향받을 수 있음이 추정되나, 현단계에서는 이러한 특성을 이용하여 OmpT 프로테아제로 절단을 제어하는 것은 불가능하다.
본 발명에 있어서, 폴리펩티드내 각 아미노산의 위치는 다음과 같이 나타낸다. 폴리펩티드내에서 두개의 임의의 컨센서스 아미노산으로 구성된 서열 부위는 절단 부위 또는 OmpT 프로테아제로 절단시킬 부위로 칭한다. 이러한 부위와 관련된 아미노산사이에서, N-말단 측면내 아미노산은 -1-위치로 칭하는 반면 C-말단 측면내 아미노산은 +1-위치로 칭한다. 이러한 부위의 N-말단 측면내 제 1,2,3 번째 등의 아미노산은 각각 -1-,-2-,-3- 위치등의 아미노산으로 칭하는 반면, 상기 부위의 C-말단 측면에서는 각각 +1, +2, +3 위치등의 아미노산으로 칭한다. 아미노산 치환이 이 부위 또는 이의 부근에 도입되어 부위가 절단되지 않거나 혹은 절단되는 경우, 서열내 대응하는 아미노산은 전술한 넘버링으로 나타낸다.
아미노산 서열 루이신-티로신-리신-아르기닌-히스티딘이 리신 및 아르기닌(즉, 두개의 임의의 연속 아미노산) 사이의 결합에서 절단되는 경우, 예컨대, 루이신, 티로신, 리신, 아르기닌 및 히스티딘은 각각 -3-,-2-,-1-,+1- 및 +2- 위치에서 아미노산으로서 작용한다.
전술한 바와 같이, OmpT 프로테아제는 매우 유용하다. 그러나, OmpT 프로테아제가 융합 단백질 절단 효소로 사용되는 경우, 현단계에서는 특이적 절단을 가능케하는 절단부위의 아미노산의 디자인 방법이 공지되어 있지 않고, 절단에 의해 수득한 표적 펩티드가 표적 펩티드의 N-말단 아미노산에 대한 제약으로 인해 제한되며, 절단이 효과적으로 실행될 수 없는 것과 같은 몇몇 문제점이 발생한다. 그러나, 이러한 문제점은 절단 부위 및 이의 부근에서 아미노산 서열을 추가로 연구하고 새로은 절단 방법 또는 새로운 인식/절단 서열을 확립하여, OmpT 프로테아제를 융합 단백질 절단시 더욱더 유용하도록 만듬으로해서 해결될 수 있을 것으로 기대된다.
반대로, 대장균을 이용한 펩티드 또는 단백질의 제조에서는 OmpT 프로테아제에 의한 문제점이 가끔 발생한다. OmpT 프로테아제에 의한 절단은, 예컨대, 숙주로서 OmpT 프로테아제-결핍 대장균주를 이용하거나 또는 인큐베이션 및 정제의 단계에서 OmpT 프로테아제 억제제를 첨가하여 우회할 수 있다. 그러나, 이러한 방법은 통상적으로 전자의 방법에서 사용하는 것과 같은 돌연변이주가 일부 경우에서 숙주로서 부적합하고, 후자 방법에서 효소 억제제의 첨가는 생산경비의 증가를 유발하거나, 억제제가 산물내 잔존할 우려가 있기 때문에 사용되지 않는다. 이런 경우에서, 더욱이, OmpT 프로테아제를 융합 단백질 절단용 효소로소 사용하는 것은 불가능하다.
만일 OmpT 프로테아제에 의한 원하지 않는 절단 부위 또는 이의 부근의 아미 노산 서열을 전환시켜 절단을 우회할 수 있다면, OmpT 프로테아제는 절단 효소로서 사용할 수 있을 것이다. 그러므로, 만일 가능하다면, OmpT 프로테아제의 인식/절단 서열의 특징을 해명하여 아미노산 서열의 전환을 최소화시키면서, 절단을 효과적으로 하는 것을 기대할 수 있다.
도 1 은 pG117S4HR6GLP-1 의 구축도이고, 여기에서 β-gal117S4H 는 대장균 β-갈락토시다아제의 N-말단 117 아미노산으로부터 유래한 보호 단백질을 코딩하는 영역을 나타내고; PSRHKR 은 아미노산 서열 PSRHKR (서열번호:60) 을 코딩하는 영역을 나타내고; GLP-1[G] 는 인간 글루카곤 유사 펩티드-1을 코딩하는 영역을 나타내고; R6 은 아미노산 서열 QMHGYDAELRLYRRHHRWGRSGS (서열번호:61)을 나타내고; Tcr 은 테트라사이클린 내성 유전자를 나타내고; lac PO 는 대장균 락토오스 프로모터 오퍼레이터 유전자를 나타낸다. pG117S4HGP 에 관해서는, 일본공개특허공보 제 9-296000 및 EP 794255 참조요.
도 2 는 pG117S4HompRHKR 의 구축도이고, 여기에서 β-gal117S4H 는 대장균 β-갈락토시다아제의 N-말단 117 아미노산으로부터 유래한 보호 단백질을 코딩하는 영역을 나타내고; PSRHKR 은 아미노산 서열 PSRHKR 을 코딩하는 영역을 나타내고; GLP-1[G] 는 인간 글루카곤 유사 펩티드-1을 코딩하는 영역을 나타내고; R6 은 아미노산 서열 QMHGYDAELRLYRRHHRWGRSGS을 나타내고; Tcr 은 테트라사이클린 내성 유전자를 나타내고; L1 아미노산 서열 QMHGYDAELRLYRRHHGSGS (서열번호 : 62)를 나타 내고; lac PO 는 대장균 락토오스 프로모터 오퍼레이터 유전자를 나타낸다.
도 3 은 pG117S4HompRHPR 의 구축도이고, 여기에서 β-gal117S4H 는 대장균 β-갈락토시다아제의 N-말단 117 아미노산으로부터 유래한 보호 단백질을 코딩하는 영역을 나타내고; PSRHKR 은 아미노산 서열 PSRHKR 을 코딩하는 영역을 나타내고; GLP-1[G] 는 인간 글루카곤 유사 펩티드-1을 코딩하는 영역을 나타내고; R6 은 아미노산 서열 QMHGYDAELRLYRRHHRWGRSGS을 나타내고; Tcr 은 테트라사이클린 내성 유전자를 나타내고; L1 아미노산 서열 QMHGYDAELRLYRRHHGSGS 를 나타내고; PSRHPR 는 아미노산 서열 PSRHPR (서열번호 : 63)을 코딩하는 영역을 나타내고; 링커 펩티드는 아미노산 서열 QMHGYDAELRLYRRHHGSGSPSRHPR (서열번호:64) 을 코딩하는 영역을 나타내고, 여기에서 L1 은 PSRHPR 에 라이게이션된 합성 DNA이고; lac PO 는 대장균 락토오스 프로모터 오퍼레이터 유전자를 나타낸다.
도 4 는 pG117S4HompRHPR 에 의해 코딩되는 융합 단백질 PR 의 전체 아미노산 서열을 나타내고, 여기에서 밑줄친 부분은 인간 글루카곤 유사 펩티드-1 (GLP-1[G]) 의 아미노산 서열에 해당하고; 이중으로 밑줄친 부분은 다른 아미노산으로 전환된 아르기닌에 해당하고; 화살표는 OmpT 프로테아제에 의한 절단 부위를 나타낸다. 숫자는 N-말단으로부터 계수된 아미노산 수를 나타낸다. 대장균 β-갈락토시다아제의 N-말단 117 아미노산으로부터 유래한 보호 단백질 (β-gal117S4H)는 1 위치의 메티오닌으로부터 127-위치의 아르기닌까지의 아미노산 서열을 함유한다. 링커 펩티드는 128 위치의 글루타민으로부터 153 위치의 아르기닌까지의 아미노산 서열을 포함한다. Pre-GLP-1[G] 는 +1-위치(OmpT 프로테아제 에 의한 절단부위와 관련된)의 아르기닌으로부터 184-위치의 글리신까지의 아미노산 서열을 포함한다.
도 5 는 pG117ompPRX 의 구축도이고, 여기에서 β-gal117S4H 는 대장균의 β-갈락토시다아제의 N-말단 117 아미노산으로부터 유래한 보호 단백질을 코딩하는 영역을 나타내고; GLP-1[G] 는 인간 글루카곤 유사 펩티드-1을 코딩하는 영역을 나타내고; Tcr 은 테트라사이클린 내성 유전자를 나타내고; 링커 펩티드는 128-위치의 글루타민으로부터 위치 153 위치의 아르기닌 까지의 아미노산 서열을 코딩하는 영역을 나타내고; lac PO 는 대장균 락토오스 프로모터 오퍼레이터 유전자를 나타낸다.
도 6 은 pG117ompPRX 에 의해 코딩되는 융합 단백질 PRX 의 구조를 보여주는 도면이고, 여기에서 숫자는 융합단백질 PRX의 N-말단으로부터 계수된 아미노산 수를 나타낸다. β-gal117S4H 는 대장균 β-갈락토시다아제의 N-말단 117 아미노산으로부터 유래한 보호 단백질을 나타내고; GLP-1[G] 는 인간 글루카곤 유사 펩티드-1을 나타내고; Pre GLP-1[G] 는 GLP-1[G]를 함유하는 141- 내지 184 위치의 아미노산 서열을 포함하는 표적 펩티드를 나타내고; 링커 펩티드는 128-위치의 글루타민으로부터 위치 153 위치의 아르기닌 까지의 아미노산 서열을 나타낸다. 융합 단백질 PR 내 OmpT 프로테아제 절단 부위에 해당하는 부위 (아르기닌 140-X141) 는 상기 도면에 나타내었다.
도 7 은 pOmpTTc 의 구축도이고, 여기에서 β-gal117S4H 는 대장균 β-갈락토시다아제의 N-말단 117 아미노산 유래의 보호 단백질을 코딩하는 영역을 나타내 고; GLP-1[G] 는 인간 글루카곤 유사 펩티드-1 를 코딩하는 영역을 나타내고; Tcr 는 테트라사이클린 내성 유전자를 나타내고; Apr 은 암피실린 내성 유전자를 나타내고; 링커 펩티드는 아미노산 서열 QMHGYDAELRLYRRHHGSGSPSRHPR 을 코딩하는 영역을 나타내고; OmpT 는 OmpT 프로테아제 유전자를 나타내고; lac PO 는 대장균 락토오스 프로모터 오퍼레이터 유전자를 나타내고; trpP 는 대장균 트립토판 프로모터 유전자를 나타낸다.
전사 개시 부위에서 OmpT 프로테아제 번역 개시뒤의 5 번째 아미노산의 코돈까지의 뉴클레오티드 서열은 5'AATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAGAATTCATGCGGGCGAAACTT3' (서열번호 : 65) 이고, 여기에서 밑줄친 부분은 EcoRI 인식 부위에 해당한다.
pGP501 과 관련하여서는, K.Sugimura, Biochem. Biophys. Res.Commun. 153:753-759, 1988 참조요.
도 8 은 pOmpTTcB 의 구축도이고, 여기에서 OmpT 는 OmpT 프로테아제 유전자를 나타내고; Tcr 는 테트라사이클린 내성 유전자를 나타내고; lac PO 는 대장균 락토오스 프로모터 오퍼레이터 유전자를 나타낸다.
전사 개시 부위로부터 OmpT 프로테아제 번역 개시뒤 5 번째 아미노산의 코돈까지의 뉴클레오티드 서열은 5'AATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAGAATTCAAAATGCGGGCGAAACTG3' (서열번호:66) 이고, 여기에서 밑줄친 부분은 EcoRI 인식 부위에 해당한다.
도 9 는 pOmpTTcC 의 구축도이고, 여기에서 OmpT 는 OmpT 프로테아제 유전자를 나타내고; Tcr 는 테트라사이클린 내성 유전자를 나타내고; lac PO 는 대장균 락토오스 프로모터 오퍼레이터 유전자를 나타낸다.
전사 개시 부위로부터 OmpT 프로테아제 번역 개시뒤 5 번째 아미노산의 코돈까지의 뉴클레오티드 서열은 5'AATTGTGAGCGGATAAAAATTACAGACAGGAAGAATTCATGCGGGCGAAACTT3' (서열번호:67) 이고, 여기에서 밑줄친 부분은 EcoRI 인식 부위에 해당한다.
도 10 는 pOmpTTcE 의 구축도이고, 여기에서 OmpT 는 OmpT 프로테아제 유전자를 나타내고; Tcr 는 테트라사이클린 내성 유전자를 나타내고; lac PO 는 대장균 락토오스 프로모터 오퍼레이터 유전자를 나타낸다.
전사 개시 부위로부터 OmpT 프로테아제 번역 개시뒤 5 번째 아미노산의 코돈까지의 뉴클레오티드 서열은 5'AATTGTGAGCGGATAAAAATTACAGACAGGAAGAATTCAAAATGCGGGCGAAACTG3' (서열번호:68) 이고, 여기에서 밑줄친 부분은 EcoRI 인식 부위에 해당한다.
도 11 은 OmpT 프로테아제에 의한 융합 단백질 PRX 의 절단과 관련된 SDS-PAGE (16%) 사진이다.
상기 사진에서, Mr 은 분자량 마커 단백질을 나타내고; O 는 정제된 OmpT 프로테아제를 위한 레인을 나타내고; - 는 OmpT 프로테아제가 없는 레인을 나타내고; + 는 OmpT 프로테아제가 첨가된 레인을 나타낸다.
A:PRA, V:PRV, L:PRL, I:PRI, P:PRP, F:PRF, W:PRW, M:PRM, G:PRG, S:PRS, T:PRT, C:PRC, Y:PRY, N: PRN, Q:PRQ, D:PRD, E: PRE, K:PRK, R:PRR, H:PRH.
4.9kDa 펩티드 단편은 OmpT 프로테아제로 절단된 GLP-1[G] 를 함유하는 펩티드 단편을 의미한다.
도 12 는 pG117ompPKK 의 구축도이고, 여기에서 β-gal117S4H 는 대장균 β-갈락토시다아제의 N-말단 117 아미노산 유래의 보호 단백질을 코딩하는 영역을 나타내고; GLP-1[G] 는 인간 글루카곤 유사 펩티드-1 를 코딩하는 영역을 나타내고; Tcr 는 테트라사이클린 내성 유전자를 나타내고; 링커 펩티드는 128 위치의 글루타민에서 153 위치의 아르기닌까지의 아미노산 서열을 코딩하는 영역을 나타내고; lac PO 는 대장균 락토오스 프로모터 오퍼레이터 유전자를 나타낸다.
도 13 는 pG117ompPKX 에 의해 코딩되는 융합 단백질 PKX 의 구조를 보여주는 설명도이고, 여기에서 숫자는 융합단배질 PKX의 N-말단으로부터 계수된 아미노산 번호를 나타낸다. β-gal117S4H 는 대장균 β-갈락토시다아제의 N-말단 117 아미노산으로부터 유래한 보호 단백질을 나타내고; GLP-1[G] 는 인간 글루카곤 유사 펩티드-1을 나타내고; Pre GLP-1[G] 는 GLP-1[G]를 함유하는 141- 내지 184 위치의 아미노산 서열을 포함하는 표적 펩티드를 나타내고; 링커 펩티드는 128-위치의 글루타민으로부터 153 위치의 아르기닌 까지의 아미노산 서열을 나타낸다. 융합 단백질 PRR 내 OmpT 프로테아제 절단 부위에 해당하는 부위 (리신 140-X141) 는 상기 도면에 나타내었다.
도 14 는 OmpT 프로테아제에 의한 융합 단백질 PKX 의 절단과 관련된 SDS- PAGE (16%) 사진이다. 이 도면에서, Mr 은 분자량 마커 단백질을 나타내고; O 는 정제된 OmpT 프로테아제를 나타내고; - 는 OmpT 프로테아제가 없는 레인을 나타내고; + 는 OmpT 프로테아제가 첨가된 레인을 나타낸다.
KA, KS, KK, KR, KD 및 KE 는 각각 PKA, PKS, PKK, PKR, PKD 및 PKE 를 나타낸다.
4.9kDa 펩티드 단편은 OmpT 프로테아제로 절단된 GLP-1[G] 를 함유하는 펩티드 단편을 의미한다.
도 15 는 pG117ompPRhANP 의 구축도이고, 여기에서 β-gal117S4H 는 대장균 β-갈락토시다아제의 N-말단 117 아미노산으로부터 유래한 보호 단백질을 코딩하는 영역을 나타내고; GLP-1[G] 는 인간 글루카곤 유사 펩티드-1을 코딩하는 영역을 나타내고; α-hANP 는 α형 인간 심방 나트륨이뇨 펩티드를 코딩하는 영역을 나타내고; Tcr 는 테트라사이클린 내성 유전자를 나타내고; 링커 펩티드 1 은 아미노산 서열 QFK (서열번호 : 69) 를 코딩하는 영역을 나타내고; 링커 펩티드 2 는 아미노산 서열 QMHGYDAELRLYRRHHGSGSPYRHPR (서열번호 : 70) 을 코딩하는 영역을 나타내고; 링커 펩티드 3 는 아미노산 서열 QMHGYDAELRLYR (서열번호 : 71) 을 코딩하는 영역을 나타내고; lac PO 는 대장균 락토오스 프로모터 오퍼레이터 유전자를 나타낸다. pGH α97SII 와 관련하여서는, "Daichokino shukushu toshita seirikassei peputido seisankei nikansuru kenkyu (Study on Physiologically Active Peptide Production System with the Use of E.coli as Host)", Koji Magota, Doctoral Dissertation, Kyushu University, 1991 참조.
도 16 은 pG117ompPRhANP 에 의해 코딩되는 융합 단백질의 구조를 보여주는 도면이고, 여기에서 숫자는 융합 단백질 PRhANP 의 N-말단으로부터 계수된 아미노산 수를 보여준다. β -gal117S4H 는 대장균 β-갈락토시다아제의 N-말단 117 아미노산 유래의 보호 단백질을 나타내고; α-hANP 는 심방 나트륨이뇨 펩티드를 나타내고; 링커 펩티드는 128-위치의 글루타민에서 140-위치의 아르기닌 까지의 아미노산 서열을 나타낸다. 융합 단백질 PRR 내 OmpT 프로테아제 절단부위에 해당하는 부위 (아르기닌 140-세린 141)은 상기 도면에 나타내었다.
도 17 은 pG117ompPRhCT 의 구축도이고, 여기에서 β -gal117S4H 는 대장균 β-갈락토시다아제의 N-말단 117 아미노산유래의 보호 단백질을 코딩하는 영역을 나타내고; β -gal197S4D 는 대장균 β-갈락토시다아제의 N-말단으로부터 97 아미노산에서 시발하는 보호 단백질을 코딩하는 영역을 나타내고; GLP-1[G] 는 인간 글루카곤 유사 펩티드-1을 코딩하는 영역을 나타내고; Tcr 는 테트라사이클린 내성 유전자를 나타내고; 링커 펩티드 1 은 아미노산 서열 EFRHHRRHRLE (서열번호 : 72) 를 코딩하는 영역을 나타내고; 링커 펩티드 2 는 아미노산 서열 QMHGYDAELRLYRRHHGSGSPYRHPR 을 코딩하는 영역을 나타내고; 링커 펩티드 3은 아미노산 서열 QMHGYDAELRLYR 을 코딩하는 영역을 나타내고; lac PO 는 대장균 락토오스 프로모터 오퍼레이터 유전자를 나타낸다. pG97S4DhCT[G]R4 와 관련하여서는, Yubuta, M., Suzuki, Y. and Ohsuye, K. Appl. Microbiol. Biotechnol.42:703-708, 1995 참조요.
도 18 은 pGll7ompPRhCT 에 의해 코딩되는 융합 단백질 PRhCT의 구조를 보여 주는 도면이고, 여기에서 숫자는 융합 단백질 PRhCT의 N-말단으로부터 계수된 아미노산 번호를 보여준다. β-gal117S4H 는 대장균 β-갈락토시다아제의 N-말단 117 아미노산에서 유래하는 보호 단백질을 나타내고; hCT[G] 는 인간 칼시토닌 전구체를 나타내고; 링커 펩티드는 128-위치의 글루타민에서 140-위치의 아르기닌까지의 아미노산서열을 나타낸다. 융합 단백질 PRR 내 OmpT 프로테아제 절단부위에 해당하는 부위 (아르기닌 140-시스테인 141)를 상기 도면에 나타내었다.
도 19 는 OmpT 프로테아제에 의한 융합 단백질 PRhANP 및 PRhCT의 절단과 관련된 SDS-PAGE (16%) 사진이다. 이 도면에서, Mr 는 분자량 마커 단백질을 나타내고; 0 는 정제된 OmpT 프로테아제를 나타내고; - 는 OmpT 프로테아제가 없는 레인을 나타내고; + 는 OmpT 프로테아제가 첨가된 레인을 나타낸다.
hANP 및 hCT 는 각각 PRhANP 및 PRhCT을 나타낸다.
도 20 는 pGRShANP 의 구축도이고, 여기에서 P-gall97S 는 대장균 β-갈락토시다아제의 N-말단 97 아미노산로부터 유래한 보호 단백질을 코딩하는 영역을 나타내고; α-hANP 는 α-형 인간 심방 나트륨이뇨 펩티드를 코딩하는 영역을 나타내고; Tcr 는 테트라사이클린 내성 유전자를 나타내고; 링커 펩티드 1 은 아미노산 서열 QFK 를 코딩하는 영역을 나타내고; 링커 펩티드 2 는 아미노산 서열 QFR (서열번호:73)을 코딩하는 영역을 나타내고; lac PO 는 대장균 락토오스 프로모터 오퍼레이터 유전자를 나타낸다.
도 21 은 pGRShANP 에 의해 코딩되는 융합 단백질 RShANP 의 전 아미노산 서열을 보여주는 도면이고, 여기에서 밑줄친 부분은 α-hANP (α-형 인간 심방 나트륨이뇨 펩티드)의 아미노산서열을 나타내고; 이중으로 밑줄친 부분은 다른 아미노산으로 전환된 세린을 나타내고; 화살표는 OmpT 프로테아제에 의한 절단부위를 나타낸다. 숫자는 N-말단으로부터 계수된 아미노산 수를 나타낸다. 대장균 β-갈락토시다아제의 N-말단 97 아미노산으로부터 유래하는 보호 단백질 (P-gal97S)는 1-위치의 메티오닌에서 98-위치의 알라닌까지의 아미노산 서열을 포함한다. 링커 펩티드는 99-위치의 글루타민에서 101-위치의 아르기닌까지의 아미노산 서열을 포함한다.
도 22 는 pGRXhANP의 구축도이고, 여기에서 β-gal97S 는 대장균 β-갈락토시다아제의 N-말단 97 아미노산으로부터 유래한 보호 단백질을 코딩하는 영역을 나타내고; 변경된 α-hANP 는 N-말단 아미노산이 아르기닌, 알라닌 또는 시스테인으로 치환된 α-형 인간 심방 나트륨이뇨 펩티드 유도체를 코딩하는 영역을 나타내고; Tcr 은 테트라사이클린 내성 유전자를 나타내고; 링커 펩티드는 아미노산 서열 QFK를 코딩하는 영역을 나타내고; lac PO 는 대장균 락토오스 프로모터 오퍼레이터 유전자를 나타낸다.
도 23 은 융합 단백질 RXhANP의 구조를 보여주는 도면이고, 여기에서 숫자는 융합 단백질 PRhANP의 N-말단으로부터 계수된 아미노산 수를 보여준다. β-gal97S 는 대장균 β-갈락토시다아제의 N-말단 97 아미노산으로부터 유래한 보호 단백질을 나타내고; 변경된 α-hANP 는 N-말단 아미노산이 아르기닌, 알라닌 또는 시스테인으로 치환된 α-형 인간 심방 나트륨이뇨 펩티드 유도체를 나타내고; 링커 펩티드는 99-위치의 글루타민에서 101-위치의 아르기닌까지의 아미노산 서열을 나타낸다. 융합 단백질 RShANP 내 OmpT 프로테아제 절단 부위에 해당하는 부위 (아르기닌 101-XlO2)를 상기 도면에 나타내었다.
도 24 는 OmpT 프로테아제에 의한 융합 단백질 RShANP 및 RXhANP 의 절단과 관련된 SDS-PAGE (16%) 사진이다.
상기 도면에서, Mr 는 분자량 마커 단백질을 나타내고; - 는 OmpT 프로테아제가 없는 레인을 나타내고; + 는 OmpT 프로테아제가 첨가된 레인을 나타낸다. RS, RR, RA 및 RC 은 각각 RShANP, RRhANP, RAhANP 및 RChANP 를 나타낸다.
도 25 는 pGll7ompPRRXA 에 의해 코딩되는 융합 단백질 PRRXA 의 구조를 보여주는 도면이고, 여기에서 -10, -5, -1, +1 및 +4 는 각각 융합 단백질 PRR 의 OmpT 프로테아제 절단 부위와 관련된 -10, -5, -1, +1 및 +4-위치를 보여준다. 융합 단백질 PRR 및 PRRXA의 아미노산 서열 (-10- 에서 +4-위치까지)는 도면에 나타내었다. β-gal117S4H 는 대장균 β-갈락토시다아제의 N-말단 117 아미노산에서 시발하는 보호 단백질을 나타내고; GLP-1[G] 는 인간 글루카곤-유사 펩티드-1 을 나타내고; 링커 펩티드는 도 6 에 나타낸 아미노산 서열내 128-위치의 글루타민에서 153-위치의 아르기닌까지의 아미노산 서열에 해당한다. 융합 단백질 PRR 내 OmpT 프로테아제 절단 부위는 상기 도면에 나타내었다. 융합 단백질은 진한 그림으로 나타내었고, 치환된 알라닌은 밑줄 그었다.
도 26 는 pGll7ompPRR-2A, -3A 및 -4A 의 구축도이다. β-gal117S4H 는 대장균 β-갈락토시다아제의 N-말단 117 아미노산으로부터 유래하는 보호 단백질을 코딩하는 영역을 나타내고; GLP-1[G] 는 인간 글루카곤-유사 펩티드-1 을 코딩하는 영역을 나타내고; Tcr 는 테트라사이클린 내성 유전자를 나타내고; 링커 펩티드는 도 6 에 나타낸 아미노산 서열내 128-위치의 글루타민에서 153-위치의 아르기닌의 아미노산을 코딩하는 영역에 해당하고; lac PO 는 대장균 락토오스 프로모터 오퍼레이터 유전자를 나타낸다.
도 27 는 pG117ompPRR-5A 및 -6A 의 구축도이고, 여기에서 β-gal117S4H 는 대장균 β-갈락토시다아제의 N-말단 117 아미노산으로부터 유래한 보호 단백질을 코딩하는 영역을 나타내고; GLP-1[G] 는 인간 글루카곤-유사 펩티드-1 을 코딩하는 영역을 나타내고; Tcr 는 테트라사이클린 내성 유전자를 나타내고; 링커 펩티드는 도 6 에 나타낸 아미노산 서열내 128-위치의 글루타민에서 153-위치의 아르기닌까지의 아미노산 서열을 코딩하는 영역에 해당하고; lac PO 는 대장균 락토오스 프로모터 오퍼레이터 유전자를 나타낸다.
도 28 는 pGll7ompPRR-8A, -9A 및 -10A의 구축도이고, 여기에서 β-gal117S4H 는 대장균 β-갈락토시다아제의 N-말단 117 아미노산의 보호 단백질을 코딩하는 영역을 나타내고; GLP-1[G] 는 인간 글루카곤-유사 펩티드-1 을 코딩하는 영역을 나타내고; Tcr 는 테트라사이클린 내성 유전자를 나타내고; 링커 펩티드는 도 6 에 나타낸 아미노산 서열내 128-위치의 글루타민에서 153-위치의 아르기닌까지의 아미노산 서열을 코딩하는 영역에 해당하고; lac PO 는 대장균 락토오스 프로모터 오퍼레이터 유전자를 나타낸다.
도 29 는 pGll7ompPRR-lA 의 구축도이고, 여기에서 β-gal117S4H 는 대장균 β-갈락토시다아제의 N-말단 117 아미노산의 보호 단백질을 코딩하는 영역을 나타내고; GLP-1[G] 는 인간 글루카곤-유사 펩티드-1 을 코딩하는 영역을 나타내고; Tcr 는 테트라사이클린 내성 유전자를 나타내고; 링커 펩티드는 도 6 에 나타낸 아미노산 서열내 128-위치의 글루타민에서 153-위치의 아르기닌까지의 아미노산 서열을 코딩하는 영역에 해당하고; lac PO 는 대장균 락토오스 프로모터 오퍼레이터 유전자를 나타낸다.
도 30 는 OmpT 프로테아제에 의한 융합 단백질 PRR 및 PRRXA의 절단과 관련된 SDS-PAGE (16%) 사진이다. 이 도면에서, Mr 는 단백질 분자량 마커를 나타내고; 0 는 정제된 OmpT 프로테아제를 나타내고; - 는 OmpT 프로테아제가 없는 레인을 나타내고; + 는 OmpT 프로테아제가 첨가된 레인을 나타낸다.
-1A: PRR-1A, -2A: PRR-2A, -3A: PRR-3A, -4A: PRR-4A, -5A: PRR-5A
-6A: PRR-6A, -8A: PRR-8A, -9A: PRR-9A, -10A: PRR-10A.
4.9kDa 펩티드 단편은 OmpT 프로테아제로 절단된 GLP-1[G] 를 함유하는 펩티드 단편을 의미한다.
도 31 은 pGll7ompPRR-4X에 의해 코딩되는 융합 단백질 PRR-4X 의 구축도이고, 여기에서 -10, -5, -1, +1 및 +4 는 각각 융합 단백질 PRR의 OmpT 프로테아제 절단 부위와 관련된 -10, -5, -1, +1 및 +4-위치를 나타낸다. 융합 단백질 PRR 의 아미노산 서열 (-10- 에서 +4-위치까지) 및 융합 단백질 PRR-4X 의 -4-위치의 치환된 아미노산은 상기 도면에 나타내었다. β-gal117S4H 는 대장균 β-갈락토시다아제의 N-말단 117 아미노산으로부터 유래된 보호 단백질을 나타내고; GLP-1[G] 는 인간 글루카곤-유사 펩티드-1를 나타내고; 링커 펩티드는 도 6 에 나타낸 아미노산 서열내 128-위치의 글루타민에서 153-위치의 아르기닌까지의 아미노산 서열을 코딩하는 영역에 해당한다. 융합 단백질 PRR 내 OmpT 프로테아제 절단 부위는 상기 도면에 나타내었다. 융합 단백질은 굵은 그림으로 나타내었다.
도 32 는 pGll7ompPRR-6X 에 의해 코딩되는 융합 단백질 PRR-6X 의 구조를 보여주는 도면이고, 여기에서 -10, -5, -1, +1 및 +4 각각은 융합 단백질 PRR 의 OmpT 프로테아제 절단 부위와 관련된 -10, -5, -1, +1 및 +4-위치를 보여준다. 융합 단백질 PRR 의 아미노산 서열 (-10- 에서 +4-위치까지) 및 융합 단백질 PRR-6X 의 -6-위치의 치환된 아미노산은 도면에 나타내었다. β-gal117S4H 는 대장균 β-갈락토시다아제의 N-말단 117 아미노산으로부터 유래된 보호 단백질을 나타내고; GLP-1[G] 는 인간 글루카곤-유사 펩티드-1를 나타내고; 링커 펩티드는 도 6 에 나타낸 아미노산 서열내 128-위치의 글루타민에서 153-위치의 아르기닌까지의 아미노산 서열을 코딩하는 영역에 해당한다. 융합 단백질 PRR 내 OmpT 프로테아제 절단 부위는 상기 도면에 나타내었다. 융합 단백질은 굵은 그림으로 나타내었다.
도 33 은 pGll7ompPRR-4X (여기에서 X 는 K, D, E, N 또는 Q이다)의 구축도이다. 이 도면에서, β-gal117S4H 는 대장균 β-갈락토시다아제의 N-말단 117 아미노산으로부터 유래한 보호 단백질을 코딩하는 영역을 나타내고; GLP-1[G] 는 인간 글루카곤-유사 펩티드-1 를 코딩하는 영역을 나타내고; Tcr 는 테트라사이클린 내성 유전자를 나타내고; 링커 펩티드는 도 6 에 나타낸 아미노산 서열내 128-위치의 글루타민에서 153-위치의 아르기닌까지의 아미노산 서열을 코딩하는 영역에 해당하고; lac PO 는 대장균 락토오스 프로모터 오퍼레이터 유전자를 나타낸다.
도 34 는 pGll7ompPRR-6X (여기에서 X 는 K, D, E, N 또는 Q 이다)의 구축도이다. 이 도면에서, β-gal117S4H 는 대장균 β-갈락토시다아제의 N-말단 117 아미노산으로부터 유래한 보호 단백질을 코딩하는 영역을 나타내고; GLP-1[G] 는 인간 글루카곤-유사 펩티드-1 을 코딩하는 영역을 나타내고; Tcr 은 테트라사이클린 내성 유전자를 나타내고; 링커 펩티드는 도 6 에 나타낸 아미노산 서열내 128-위치의 글루타민에서 153-위치의 아르기닌까지의 아미노산 서열을 코딩하는 영역에 해당하고; lac PO 는 대장균 락토오스 프로모터 오퍼레이터 유전자를 나타낸다.
도 35 에서, A 는 OmpT 프로테아제에 의한 융합 단백질 PRR 및 PRR-4X 의 절단과 관련된 SDS-PAGE (16%) 사진이다. 이 도면에서, Mr 는 단백질 분자량 마커를 나타내고; - 는 OmpT 프로테아제가 없는 레인을 나타내고; + 는 OmpT 프로테아제가 첨가된 레인을 나타낸다.
-4K: PRR-4K, -4A: PRR-4A, -4N: PRR-4N, -4Q: PRR-4Q, -4D: PRR-4D, -4E: PRR-4E
4.9kDa 펩티드 단편은 OmpT 프로테아제로 절단된 GLP-1[G] 를 함유하는 펩티드 단편을 의미한다.
도 35 에서, B 는 OmpT 프로테아제에 의한 융합 단백질 PRR 및 PRR-4X 의 절단과 관련된 SDS-PAGE (16%) 사진이다. 이 도면에서, Mr 는 단백질 분자량 마커를 나타내고; - 는 OmpT 프로테아제가 없는 레인을 나타내고; + 는 OmpT 프로테아제가 첨가된 레인을 나타낸다.
-6R: PRR-6R, -6K: PRR-6K, -6A: PRR-6A, -6N: PRR-6N, -6Q: PRR-6Q, -6D: PRR-6D.
4.9kDa 펩티드 단편은 OmpT 프로테아제로 절단된 GLP-1[G] 를 함유하는 펩티드 단편을 의미한다.
도 36 은 pRShANPR 에 의해 코딩되는 융합 단백질 RShANPR의 구조를 보여주는 도면이고, 여기에서 -10, -5, -1, +1 및 +4 은 각각 융합 단백질 RShANP 의 OmpT 프로테아제 절단 부위와 관련된 -10, -5, -1, +1 및 +4-위치를 보여준다. 융합 단백질 RShANP 및 RShANPR 의 아미노산 서열 (-10-에서 +4-위치까지) 은 도면에 나타내었다. β-gal97S4H 는 대장균 β-갈락토시다아제의 N-말단 97 아미노산으로부터 유래한 보호 단백질을 나타내고; α-hANP 는 α-형 인간 심방 나트륨이뇨 펩티드를 나타내고; 링커 펩티드는 도 23 에 나타낸 아미노산 서열내 99-위치의 글루타민에서 101-위치의 아르기닌까지의 아미노산 서열을 나타낸다. 융합 단백질 RShANP 내 OmpT 프로테아제 절단 부위는 상기 도면에 나타내었다.
융합 단백질은 굵은 그림으로 나타내었고, -6- 및 -4-위치에서 치환된 아르기닌은 밑줄 그었다.
도 37 은 pGRShANPR 의 구축도이고, 여기에서 β-gal97S4H 는 대장균 β-갈락토시다아제의 N-말단 97 아미노산 유래의 보호 단백질을 코딩하는 영역을 나타내고 ; α-hANP 는 α-형 인간 심방 나트륨이뇨 펩티드를 코딩하는 영역을 나타내고; Tcr 은 테트라사이클린 내성 유전자를 나타내고; 링커 펩티드는 아미노산 서열 QFR (서열번호:73)을 코딩하는 영역을 나타내고; lac PO 은 대장균 락토오스 프로모터 오퍼레이터 유전자를 나타낸다.
이러한 상황하에서, 본 발명자는 절단부위주위의 아미노산 서열은 OmpT 프로테아제에 의한 기질 인식 및 절단에서 중요하다는 관점에서 공지된 절단 부위를 이용하여 절단부위 및 그 부근에서 아미노산 서열을 조사하여 새로운 기질 특이성 프로필을 발견하였다. 이러한 새로운 기질 특이성 프로필을 융합 단백질의 절단에 적용하기 위하여, 본 발명자는 집중적인 연구를 하여, 본 발명을 완성시켰다. 좀더 구체적으로는, 본 발명에 따른 방법에서, 공지된 절단 부위를 포함한 특이적 아미노산 서열에 존재하는 아르기닌-X 결합 또는 리신-X 결합 (여기에서 X 는 글루탐산, 아스파르트산 또는 프롤린외의 아미노산이다)을 배타적으로 절단하도록 매우 특이적으로 작용하는 OmpT 프로테아제의 특성을 이용하며, 절단 효율은 절단부위의 -6- 및 -4-위치에서의 아미노산에 대한 전하에 의해 영향을 받는다.
따라서, 본 발명은 전술한 바와 같은 특성을 이용하여 OmpT 프로테아제에 의한 폴리펩티드의 절단의 제어 방법을 제공하며, 이는 상기 폴리펩티드내 상기 부위 부근내 두개의 임의의 연속 아미노산 및/또는 아미노산(들)로 구성된 서열 부위의 아미노산(들)을 다른 하나 또는 다른 아미노산(들)로 전환시키는 것으로 구성되며, 이는 (1) 상기 부위의 -1- 위치의 아미노산으로 리신 또는 아르기닌을 설정 및 +1 위치의 아미노산으로 특정 아미노산을 설정; 및/또는 (2) 상기 부위로부터 -4- 위치 및/또는 -6-위치의 아미노산(들)로 특정 아미노산(들)을 설정하여; 상기 폴리펩티드의 목적하는 부분이 OmpT 프로테아제에 의해 절단되고/거나 상기 폴리펩티드 의 원하지 않는 부분은 OmpT 프로테아제에 의해 절단되지 않도록 하는 것을 특징으로 한다.
그러므로, 한 양태로서, 본 발명은 OmpT 프로테아제에 의해 절단될 수 있는, 표적 폴리펩티드를 함유하는 융합 단백질의 아미노산 서열내 절단부위의 -1-위치의 아미노산으로 리신 또는 아르기닌을 설정 및 대응하는 아미노산 서열 (이후 대응서열로 칭함)의 +1 위치의 아미노산으로 아미노산 X(여기에서 X 는 글루탐산, 아스파르트산 또는 프롤린외의 아미노산이다)을 설정하는 것으로 구성된 OmpT 프로테아제에 의한 표적 폴리펩티드의 제어방법을 제공한다.
다른 양태로서, 본 발명은 OmpT 프로테아제에 의해 절단 가능한 아미노산 서열의 절단 부위의 -6- 및/또는 -4- 위치에서 아미노산(들)로서 산성 아미노산(들)외의 아미노산(들)(바람직하게는 염기성 아미노산(들), 좀더 바람직하게는 리신 또는 아르기닌)을 설정하면서 표적 폴리펩티드를 절단하여 절단 효율을 증가시키는 방법을 제공한다.
융합 단백질을 유전공학기술을 이용하여 발현시킨후, 본 발명에 따른 방법으로 절단시키는 경우, 예컨대, 융합 단백질은 융합단백질의 일부로서 적어도 "대응 서열"을 함유하는 방식으로 발현되며, 후자는 OmpT 프로테아제에 의해 처리된다. 따라서, 표적 폴리펩티드는 방출될 수 있다. 더욱이, 본 발명에 따라, 표적 폴리펩티드는 절단 부위의 -6- 및 -4- 위치의 아미노산으로 염기성 아미노산을 설정하여 좀더 효율적으로 절단시킬 수 있다. 여기에서 사용하는 용어"표적 폴리펩티드"는 융합 단백질로서 발현되는 임의의 폴리펩티드 또는 분비 발현, 직접적 발 현등으로 수득되는 폴리펩티드를 의미한다. OmpT 프로테아제에 의해 절단되는 융합 단백질의 경우에는, 예컨대, OmpT 프로테아제에 의한 절단직후 또는 후번역 변경의 결과로서 생리학적 활성을 발휘하는 폴리펩티드를 사용할 수 있다. 이와는 달리, 생리학적으로 활성인 펩티드가 전술한 반응후 추가의 절단후에 형성되는 생산 중간체(즉, 소위 전구체 펩티드)를 사용할 수 있다.
OmpT 프로테아제에 의해 절단되는 아미노산 서열은 절단부위에 대해 약 -20 내지 +20-위치의 서열로 한정되는 것으로 생각된다. 따라서, 여기에서 사용하는 "대응 서열"은 이미 공지되거나 또는 OmpT 프로테아제에 의해 절단가능한 것으로 실험적으로 확인된 아미노산 서열의 절단부위에 대해 약 -20- 내지 +20-위치 범위의 서열들중에서 선택할 수 있다. 예컨대, "대응 서열"은 -20- 내지 -1- 위치, -20- 내지 +1-위치, -1- 내지 +20-위치 또는 +1- 내지 +20-위치에서 선택할 수 있다.
OmpT 프로테아제에 의해 절단가능한 아미노산서열이 존재하는 경우, 절단은 절단부위의 +1-위치의 아미노산을 글루탐산, 아스파르트산 또는 프롤린으로 전환시킴으로써 본 발명의 방법에서 +1-위치의 아미노산의 이러한 전환이 불가능한 경우, 절단 효율은 -6- 및 -4-위치의 아미노산중 하나 또는 양쪽을 산성 아미노산(들)로 전환시켜 낮출수 있다.
상기의 방법을 결합시켜, OmpT 프로테아제에 의한 절단은 제어할 수 있다.
이것은 특히 표적 폴리펩티드를 함유하는 융합 단백질을 숙주세포로서 사용하는 대장균에서 생산한후, 표적 폴리펩티드를 대장균이 내생적으로 갖고있는 OmpT 프로테아제를 이용하여 융합 단백질로부터 절단하는 경우 편리하다.
따라서, 본 발명은 하기의 방법에 관한 것이다.
a) 폴리펩티드내 두개의 임의의 연속 아미노산으로 구성된 서열부위의 아미노산(들) 및/또는 상기 부위 부근의 아미노산(들)을 다른 아미노산(들)로 전환시키는 것으로 구성된 OmpT 프로테아제에 의한 폴리펩티드의 절단 제어 방법으로써, (1) 상기 부위에 대해 -1- 위치의 아미노산으로 리신 또는 아르기닌을 설정 및 +1 위치의 아미노산으로 특정 아미노산을 설정; 및/또는 (2) 상기 부위에 대해 -4- 위치 및/또는 -6-위치의 아미노산(들)로 특정 아미노산(들)을 설정하여; 상기 폴리펩티드의 목적하는 부분이 OmpT 프로테아제에 의해 절단되고/거나 상기 폴리펩티드의 비목적 부분이 OmpT 프로테아제에 의해 절단되지 않도록 하는 것을 특징으로 하는 방법, .
b) 폴리펩티드내 두개의 임의의 연속 아미노산으로 구성된 서열부위의 아미노산(들) 및/또는 상기 부위 부근의 아미노산을 다른 아미노산으로 전환시키는 것으로 구성된 OmpT 프로테아제에 의한 폴리펩티드의 절단을 제어하는 상기 a) 에 기재된 방법으로써. (1) 상기 부위에 대해 -1-위치의 아미노산으로 리신 또는 아르기닌을 설정 및 +1 위치의 아미노산으로 특정 아미노산을 설정; 및/또는 (2) 상기 부위에 대해 -4- 위치 및/또는 -6-위치의 아미노산(들)로 특정 아미노산(들)을 설정하여; 상기 폴리펩티드의 목적한 부분을 OmpT 프로테아제로 절단시키는 것을 특징으로하는 방법,
c) (1) +1-위치의 아미노산으로서 글루탐산, 아스파르트산 또는 프롤린이외 의 아미노산을 설정; 및/또는 (2) 상기 부위에 대해 -4-위치 및/또는 -6-위치의 아미노산(들)로서 산성 아미노산외의 아미노산(들) (바람직하게는, 염기성 아미노산, 바람직하게는 리신 또는 아르기닌) 을 설정하는 것을 특징으로하는, 상기 b) 에 기재된 바와 같은 방법.
d) 상기 폴리펩티드내 두개의 임의의 연속 아미노산으로 구성된 서열 부위의 -1-위치의 아미노산이 리신 및 아르기닌이 아닌 경우, 상기 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 전환시키고, +1-위치의 아미노산으로 아미노산 X (여기에서 X 는 글루탐산, 아스파르트산, 프롤린, 아르기닌, 리신, 알라닌, 메티오닌 또는 발린이외의 아미노산이다)을 설정하여 상기 폴리펩티드내의 목적하는 부분을 OmpT 프로테아제로 절단하는 것을 특징으로 하는 임의의 상기 a) 내지 c) 에 기재된 바와 같은 방법.
e) 폴리펩티드내 두개의 임의의 연속 아미노산으로 구성된 서열부위의 아미노산(들) 및/또는 상기 부위 부근의 아미노산(들)을 다른 아미노산으로 전환시키는 것으로 구성된 OmpT 프로테아제에 의한 폴리펩티드의 절단을 제어하기 위한 상기 a) 에 기재된 방법으로서, (1) 상기 부위에 대해 -1- 위치의 아미노산으로 리신 또는 아르기닌을 설정 및 +1 위치의 아미노산으로 특정 아미노산을 설정; 및/또는 (2) 상기 부위에 대해 -4- 위치 및/또는 -6-위치의 아미노산(들)로 특정 아미노산(들)을 설정하여; 상기 폴리펩티드내 비목적 부분은 OmpT 프로테아제에 의해 절단되지 않도록 하는 것을 특징으로 하는 방법, .
f) (1) +1 위치의 아미노산으로 글루탐산, 아스파르트산 또는 프롤린을 설정; 및/또는 (2) -4-위치 및/또는 -6-위치의 아미노산(들)로 산성 아미노산(들)을 설정하는 것을 특징으로하는, 상기 e) 에 기재된 방법.
g) 상기 e) 또는 f) 에 기재된 방법을 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 숙주세포에서 발현되나, 상기 폴리펩티드는 비목적 부분에서 OmpT 프로테아제에 의해 절단된 경우에 적용하는 방법.
h) 숙주세포에서 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 발현시켜 폴리펩티드를 발현시키는 방법에 있어서, 비목적 부분에서 OmpT 프로테아제에 의해 상기 폴리펩티드가 절단되는 경우에서 상기 a) 내지 g) 에 기재된 아미노산(들)을 전환시키는 것을 특징으로 하는 방법.
i) 숙주세포에서 절단부위(임의적으로는 링커 펩티드에 존재하는)를 통해 보호 펩티드와 융합된 표적 펩티드로 구성되고 상기 절단부위에서 OmpT 프로테아제에 의해 절단 가능한 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 발현시키고, OmpT 프로테아제로 상기 절단부위에서 단백질을 절단분리시켜 융합 단백질로부터 표적 폴리펩티드를 수득하는 것으로 구성된 임의의 상기 a) 내지 f) 에 기재된 방법.
j) OmpT 프로테아제에 의해 절단가능한 아미노산 서열이 상기 융합 단백질을 구성하는 보호 펩티드, 링커 펩티드 및/또는 표적 폴리펩티드의 아미노산 서열에 존재하는 상기 i) 에 기재된 것과 같은 방법.
k) 절단 부위 및/또는 이의 부근의 아미노산의 전환시 임의의 상기 a) 내지 f)에 기재된 것과 같은 방법을 이용하는 것을 특징으로 하는, 절단 부위를 통해 (임의적으로는 링커 펩티드에 위치하는) 보호 펩티드와 융합된 표적 폴리펩티 드로 구성되고, 상기 절단 부위에서 OmpT 프로테아제에 의해 절단가능한 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 숙주세포에서 발현시키고, OmpT 프로테아제로 상기 절단 부위에서 단백질을 절단 분리시켜 상기 융합 단백질로부터 표적 폴리펩티드를 수득하는 것으로 구성된 표적 폴리펩티드의 제조방법.
l) OmpT 프로테아제에 의해 절단가능한 아미노산 서열은 상기 융합 단백질을 구성하는 보호 펩티드, 링커 펩티드 및/또는 표적 폴리펩티드의 아미노산 서열에 존재하는 상기 k) 에 기재된 방법.
m) 숙주 세포가 대장균인 임의의 상기 g) 내지 1) 에 기재된 방법.
n) 표적 폴리펩티드는 나트륨이뇨 펩티드인 임의의 상기 g) 내지 m)에 기재된 방법.
본 발명에 따른 방법을 적용가능한 단백질 및 펩티드는 다음과 같다 :: 아드레노코르티코트로픽 호르몬, 아드레노메둘린, 아밀린, 안지오텐신 I, 안지오텐신 II, 안지오텐신 III, A-형-나트륨이뇨 펩티드, B-형 나트륨이뇨 펩티드, 브라디키닌, 칼시토닌, 칼시토닌 유전자 관련 펩티드, 콜레시스토키닌, 코르티코트로핀 방출인자, 코르티스타틴, C-형 나트륨이뇨 펩티드, α-데페신 1, β-데페신 1, β-데페신 2, 델타 슬립(Delta Sleep)-유도 펩티드, 디노르핀 A, 엘라핀, α-엔도르핀, β-엔도르핀, γ-엔도르핀, 엔도텔린-1, 엔도텔린-2, 엔도텔린-3, 빅 엔도텔린-1, 빅 엔도텔린-2, 빅 엔도텔린-3, 엔케팔린, 갈라닌, 빅 가스트린, 가스트린, 가스트릭 억제 폴리펩티드, 가스트린 방출 펩티드, 그레린, 글루카곤, 글루카곤-유사 펩티드 1, 글루카곤-유사 펩티드 2, 성장 호르몬 방출 인자, 성장 호르몬, 구아닐린, 우로구아닐린, 히스타틴 5, 인슐린, 죠이닝 펩티드, 황체화 호르몬 방출 호르몬, 멜라노사이트 자극 호르몬, 미드킨, 모틸린, 뉴로키닌 A, 뉴로키닌 B, 뉴로메딘 B, 뉴로메딘 C, 뉴로펩티드 Y, 뉴로텐신, 옥시토신, 프로아드레노메둘린 N-말단 20 펩티드, 파라티로이드 호르몬, 파라티로이드 호르몬-관련 단백질, 뇌하수체 아데닐레이트 시클라아제 활성 폴리펩티드 38, 혈소판인자-4, 펩티드 T, 세크레틴, 혈청 흉선 인자, 소마토스타틴, 물질 P, 티로트로핀 방출 호르몬, 우로코르틴, 혈관작용성 장 펩티드, 바소프레신 등 및 이의 유도체 (상기 펩티드들중 ANP 의 경우, 예컨대, 28 아미노산으로 구성된 천연 ANP (즉, ANP(1-28))뿐만아니라 ANP(3-28) 및 ANP(4-28)와 같은 아미노산 서열내 아미노산이 결실된 유도체를 사용할 수 있다).
본 발명은 좀더 상술될 것이다.
pG117S4HompRHPR 는 글루카곤-유사 펩티드-1 (GLP-1[GI])을 함유하는 융합 단백질 (PR)을 발현시키는 발현 플라스미드이다. 이런 융합 단백질의 보호 단백질은 대장균 β-갈락토시다아제의 N-말단으로부터 117 아미노산에서 시발하는 보호 단백질, 아르기닌-아르기닌 서열을 포함하는 35 아미노산으로 구성된 링커 서열, 및 인간 글루카곤-유사 펩티드-1 (GLP-1[G])로 구성된다. 본 발명자는 이미 대장균 OmpT 프로테아제는 링커서열내 아르기닌-아르기닌 서열내 중앙 펩티드 결합을 절단하여 GLP-1[G]을 함유하는 44 아미노산으로 구성된 표적 펩티드를 방출시킴을 발견하였다. 본 발명자는 PCR 에 기초한 부위-특이적 돌연변이로 pGll7S4HompRHPR에 의해 코딩되는 융합단백질의 아르기닌-아르기닌 서열을 아르기닌-X (여기에서 X 는 절단부위의 +1 위치의 아미노산을 나타낸다)로 전환시키고 이렇게 치환된 융합 단백질 PRX (여기에서 X 는 아미노산의 1 문자 코드를 나타내고 (총 20 아미노산로부터 선택); 예컨대, 알라닌으로의 치환을 갖는 융합 단백질는 PRA 로 나타낸다) 이 상기 부위에서 OmpT 프로테아제에 의해 절단되는지 여부에 대하여 조사하였다. 각각의 융합 단백질을 발현시키기 위해서는, OmpT 프로테아제-결핍 대장균주 W3110 M25 을 이용하였다. 이러한 융합 단백질은 봉입체로서 세포내 축적되기 때문에, 세포를 파열시켜 봉입체를 원심분리로 수거하였다. 이어서 이 봉입체는 우레아를 이용하여 용해시키고 OmpT 프로테아제 반응에서 사용하였다. 이 반응은 20 mU 의 OmpT 프로테아제를 4 M의 우레아, 50 mM 의 소듐 포스페이트 (pH 7.0), 2 mM 의 EDTA 및 각 융합 단백질 봉입체를 함유하는 반응용액에 첨가하여 수행하였다. 융합 단백질의 절단은 SDS-PAGE (16%)으로 분석하고, 이렇게 절단된 표적 펩티드의 N-말단 아미노산 서열는 단백질 서열기를 이용하여 결정하였다.
그 결과, 처음으로 본 발명자에 의해 OmpT 프로테아제는 아르기닌-X 서열 (여기에서, X 는 아스파르트산, 글루탐산 또는 프롤린이외의 아미노산이다)내 중앙 펩티드 결합을 절단하는 활성이 있음이 해명되었다. 즉, 본 발명자는 OmpT 프로테아제는 지금까지 보고된 아미노산 서열(즉, 아르기닌-아르기닌, 아르기닌-리신, 리신-아르기닌, 리신-리신, 아르기닌-알라닌, 아르기닌-메티오닌 및 아르기닌-발린)뿐만아니라 아르기닌-X 로 나타낸 아미노산 서열 (여기에서 X 는 아스파르트산, 글루탐산 및 프롤린이외의 아미노산이다)을 절단하는 활성을 가짐을 해명하였다.
이러한 융합 단백질을 사용하여, 리신-X (여기에서 X 는 절단부위의 +1-위치에 위치하고, 알라닌, 세린, 리신, 아르기닌, 아스파르트산 또는 글루탐산을 나타낸다)이 절단되는지의 여부 및 유사한 결과가 얻어지는지에 대해 추가로 조사하였다. OmpT 프로테아제는 절단부위 부근의 아미노산 서열에 의해 상당히 영향을 받음이 예견된다. 따라서, 융합 단백질 PRhANP 및 PRhCT (여기에서 융합 단백질 PR의 표적 펩티드 영역은 각각 α-hANP (α-형 인간 심방 나트륨이뇨 펩티드) 및 hCT[G] (인간 칼시토닌 전구체)에 의해 각각 치환된다)이 OmpT 프로테아제에 의해 절단될 수 있는지에 대한 여부에 대한 연구를 추가로 실시하였다. 그 결과, PRhANP 는 아르기닌과 세린사이에서 OmpT 프로테아제에 의해 절단되어 α-hANP 가 이로부터 절단됨이 발견되었다. 한편, PRhCT 는 OmpT 프로테아제에 의해 절단되지 않는다. PRhCT의 아르기닌-시스테인 서열은 OmpT 프로테아제에 의해 절단되지 않는다는 사실은 OmpT 프로테아제에 의한 기질의 인식 및 절단이 절단부위 부근의 아미노산서열에 의해 영향을 받음을 나타내며, 이는 본 발명자에 의해 제안된 바와 같이 OmpT 프로테아제에 의해 절단되는 공지의 아미노산 서열의 사용의 중요함을 시사한다.
전술한 결과는 공지된 절단부위의 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질 PR 을 사용한 일련의 연구에 의해 수득되었다. 더욱이, 유사한 결과가 다른 융합 단백질 RShANP (즉, 절단부위 주변에서 PR 과 상이한 아미노산 서열을 갖는 α-hANP 융합 단백질)의 +1-위치에서 아미노산을 치환시켜 수득할 수 있는지에 대해 조사하였다. 이 조사에서 사용된 융합 단백질 RShANP 는, 보호단백질로서, 대장균 β-갈락토시다아제의 N-말단으로부터 97 아미노산에서 시발하는 β-gal197S 및 여기에 세개 의 아미노산(글루타민-페닐알라닌-아르기닌)으로 구성된 링커를 통해 결합된 α-hANP 로 구성된다. OmpT 프로테아제로 융합단백질을 절단하고자 하는 시도가 있었으며, 여기에서 상기 융합 단백질의 +1-위치의 아미노산은 아르기닌, 알라닌 및 시스테인으로 치환되었다. 그 결과, +1-위치에서 아미노산이 치환된 이러한 융합 단백질은 또한 OmpT 프로테아제에 의해 절단되어 α-hANP의 N-말단 유도체를 생성시킴이 발견되었다.
이 결과는 공지된 OmpT 프로테아제-절단 서열 (여기에서, 절단부위의 -1- 및 +1-위치는 아르기닌-X 또는 리신-X로 나타내었다)을 갖는 영역을 사용하고, 상기 X 가 아스파르트산, 글루탐산 또는 프롤린 외의 아미노산에 의해 치환되는 경우, 이렇게 치환된 융합 단백질은 여전히 OmpT 프로테아제에 의해 절단됨을 나타낸다. 그러므로, 보호 펩티드, OmpT 프로테아제-절단 부위의 아미노산 서열 및 표적 펩티드순으로 구성된 융합 단백질을 상기 효소로 절단하고자 하는 경우, 아스파르트산, 글루탐산 및 프롤린외의 아미노산들로부터 표적 펩티드의 N-말단에 첨가되는 아미노산을 선택하는 것이 가능하다. 이 방법을 이용하여, 표적 펩티드의 N-말단에서 상이한 아미노산을 갖는 유도체를 구축할 수 있다. 또한 N-말단 아미노산을 치환시켜 분리/정제 효율을 높이는 것이 가능하다. 또한 절단되지 않은 서열을 절단가능한 서열로 전환시키는 것이 가능하다.
더욱이, 아스파르트산, 글루탐산 또는 프롤린로서 X 를 갖는 펩티드는 OmpT 프로테아제에 의해 절단되지 않는다는 결과를 이용하여, 융합 단백질 또는 단백질은 OmpT 프로테아제에 의해 절단될 수 없는 융합단백질 또는 단백질로 전환시키는 것이 가능하다. 좀더 구체적으로는, 종종 대장균에서 발현되는 단백질의 제조공정에서, 표적 단백질은 OmpT 프로테아제에 의한 절단으로 인해 거의 단리될 수 없음이 관찰된다. 이러한 경우에서, 단백질은 절단부위의 +1-위치의 인식 아미노산을 아스파르트산, 글루탐산 또는 프롤린으로 치환하여 융합 단백질 또는 단백질로 전환시킬 수 있으며, 이는 생산을 명백히 촉진시킨다.
본 발명자는 추가로 융합 단백질 PRR 의 OmpT 프로테아제 절단 부위의 -10- 내지 -1-위치의 아미노산을 치환시키고, OmpT 프로테아제에 의한 이러한 융합 단백질의 절단을 조사하였다. 그 결과, 본 발명자는 절단부위의 N-말단 아미노산 서열은 절단 효율에 영향을 미침을 발견하였다. 특히, 절단 효율은 -4-위치의 아미노산으로서 아르기닌 또는 리신과같은 염기성 아미노산의 설정에 의해 상승되나, 아스파르트산 또는 글루탐산과 같은 산성 아미노산의 설정으로는 저하된다. 유사한 결과가 -6-위치의 아미노산과 관련하여 수득되었다. 이러한 결과에 기초하여, OmpT 프로테아제는 상기위치에서 아미노산의 전하를 인식하는 것으로 생각된다. -1-위치의 아르기닌이 알라닌에 의해 치환되는 경우, 절단은 발생하지 않는다. 이 사실은 다시 상기 위치의 아미노산은 절단에서 중요한 역할을 함을 나타낸다.
또한, 절단부위 주위에 상이한 아미노산 서열을 갖는 α-hANP 융합 단백질 형태 PRR 인 RShANP 를 사용하였고, 절단 효율에서의 증가는 절단부위내의 각각 -6- 및 -4-위치의 티로신 및 알라닌이 아르기닌에 의해 모두 치환된 융합 단백질 RShANPR 에서 관찰되었다.
따라서, 절단 효율은 -6-및 -4-위치의 아미노산중 하나 또는 모두를 염기성 아미노산으로 전환시켜 향상시킬 수 있는 반면, 절단 효율은 이러한 아미노산을 산성 아미노산으로 전환시켜 저하시킬 수 있다. 즉, 절단 효율은 절단 부위 (즉 -1- 또는 +1-위치)의 아미노산을 치환시키지 않고 어느 정도까지 제어할 수 있다.
더욱이, 실시예에 기재되어 있지 않은 실험작업이 먼저 상술될 것이다.
(1) 재료 및 방법
실시예에서 다른 언급이 없는 경우, 실험 작업은 하기와 같이 실행하였다.
DNA 프라이머의 합성은 Pharmacia 에 위탁하였다. 뉴클레오티드 서열은 7-deaze dGTP (Amersham사제) 를 갖는 써머 시퀀스 형광 표식 프라이머 사이클 시퀀싱 키트를 이용하여 A.L.F. DNA 서열기 (Pharmacia사제)로 결정하였다. 플라스미드 DNA 는 PI-100∑ (Kurabo사제)를 이용하여 대장균으로부터 단리시켰다. 제한 효소로 DNA 를 절단하기 위하여, 반응은 500 내지 2000 U/ml 에서 2 시간동안 실행하였다. 플라스미드의 구조는 0.5 내지 10㎍ 의 DNA를 이용하여 액체 반응 혼합물 10㎕에서 분석하였다. DNA 단편은 5 내지 10㎍ 의 DNA를 이용하여 액체 반응 혼합물 30㎕에서 제조하였다. 반응 조건(온도, 버퍼등)는 제조자의 지시에 따라 결정하였다. 아가로오스 겔 전기영동용 시료는 1/10 부피의 시료 버퍼를 액체 반응 혼합물에 첨가하여 제조하였다. 아가로오스 겔 전기영동용 버퍼로서, TAE 버퍼 (40 mM Tris-아세트산, 1 mM EDTA)을 사용하였다. 전기영동은 100 V에서 30 분간 1 시간동안 실시하였다. 에티듐 브로마이드 수용액으로 염색시킨후, 겔은 UV-조사시켜 DNA 밴드를 검출시켰다. 아가로오스 겔의 농도는 분획시키고자 하는 DNA 단편의 크기에 따라 0.8 또는 2.0%(w/v) 으로 조정시켰다. 아가로오스 겔 전기영동후, 표적 DNA 밴드는 절단하고, DNA 는 SUPREC-01 (Takara Shuzo사제)를 이용하여 겔로부터 추출하였다. 이 DNA 용액은 페놀/클로로포름으로 처리한후, 에탄올로부터 침전시켜 TE 버퍼 (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA)에 용해시켰다. 라이게이션 반응은 16℃ 에서 30 분간 또는 밤새워 소정의 반응 혼합물 조성에서 Ligation high (Toyobo사제)를 이용하여 실행하였다. PCR 는 KOD Dash 또는 KOD DNA 폴리마라아제 (Toyobo사제)를 이용하여 수행하였다. PCR 조건 (온도, 버퍼 등) 및 액체 반응 혼합물의 조성은 제조자의 지시에 따라 각각 결정하였다.
플라스미드에 의한 대장균의 형질전환은 컴피턴트 세포로서 Takara Shuzo 사제의 JM109 균주를 이용하여 염화칼슘법으로 수행하였다. 형질전환체는 테트라사이클린 (10㎍/ml)을 이용하여 선별하였다. 실시예에서 다른 언급이 없는 한, JM109 은 대장균의 형질전환을 위하여 사용하였다.
(2) OmpT 프로테아제의 효소 활성의 측정
OmpT 프로테아제의 활성은 기질로서 Dynorphine A (Peptide Institute Inc 사제)를 이용하여 측정하였다.
5㎍ 분량의 1 mg/ml Dynorphine A 를 0.1% Triton X-100를 함유하는 40㎕ 의 50 mM 소듐 포스페이트 (pH 6.0)에 첨가하였다. 이어서 5 ㎕ 의 OmpT 프로테아제 활성 측정용 시료를 여기에 첨가하고, 반응을 개시시켰다. 이 반응은 25℃ 에서 10 분간 실행시키고, 이어서 5 ㎕ 의 1N HCl 을 첨가하여 종결시켰다. 이 액체 반응 혼합물은 원심분리시켰다 (10000 x g, 2 분). 상층액은 수거하고, 이의 20 ㎕ 분량을 HPLC로 분석하였다. HPLC 분석은 40℃ 의 컬럼 온도 및 1 ml/min 의 유동속도에서 YMC PROTEIN RP 컬럼을 이용하여 실시하였다. 0.1% 의 트리플루오로아세트산을 함유하는 10% 아세토니트릴로 3 분간 세정시킨후, 이 혼합물을 0.1% 트리플루오로아세트산을 함유하는 10-15% 아세토니트릴로 10 분간 선형 농도구배 용출시켰다. 220 nm 에서의 흡광도를 모니터하고, 이어서 절단 산물 펩티드 YGGFLR 를 검출하였다. OmpT 프로테아제 활성의 단위는 상기 조건하 분당 25℃ 에서의 1 μmol Dynorphine A의 절단으로 정의하였다.
(3) SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동
SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동은 겔로서 16% Wide-PAGEmini (Tefco사제), 전기 영동 버퍼로서 트리신 전기영동 버퍼 (Tefco사제), 및 분자량 마커로서 분자량 마커 단백질 (Tefco사제)을 이용하여 실시하였다. 4 M 우레아 (단, OmpT 프로테아제 단백질의 분석의 경우에는 우레아는 함유되지 않는다)를 함유하는 동량의 2 x SDS-PAGE 샘플 버퍼를 샘플에 첨가하고, 이 혼합물을 100℃ 로 2 분간 가열시켰다. 이어서 이의 10 ㎕ 분량을 Tefco사의 지시에 따른 조건하 전기영동시켰다. 전기영동 종결후, 겔은 Coomassie Brilliant Blue R-250 을 함유하는 염색용액으로 염색시켰다.
(4) 봉입체의 제조
융합 단백질 PRX, PKX, PRhANP, PRhCT, RShANP, RXhANP, PRRXA, PRR-4X, PRR-6X 및 RShANPR 각각을 하기의 방식에 따라 봉입체로서 제조하였다.
PRX, PKX, PRhANP, PRhCT, RShANP, RXhANP, PRRXA, PRR-4X, PRR-6X 및 RShANPR의 각각을 발현시키는 대장균을 10 mg/l 테트라사이클린를 함유하는 400 ml의 LB 액체배지 (0.5% (w/v) 이스트 추출물, 1% (w/v) 트립톤, 0.5% 염화나트륨)을 함유하는 2 l Erlenmeyer 플라스크에서 150 rpm 으로 회전시키면서, 37℃에서 밤새워 배양시켰다. 다음날, 세포를 원심분리 (4℃, 6000 x g, 10 분)로 수거하고, 초음파로 파열시켰다. 탈이온수를 이 파열된 세포 용액에 첨가하여 총부피를 30 ml로 만들었다. 이어서 이 혼합물을 원심분리 (4℃, 25000 x g, 15 분)시키고, 상층액을 버렸다. 침전물 분획 (봉입체)은 회수하여 추가로 30 ml의 50 mM Tris HCl (pH 8.0)(5 mM EDTA 및 1% Triton X-100를 함유)에 현탁시켰다. 현탁액은 원심분리시켰다 (4℃, 25000 x g, 15 분). 이렇게 수득한 침전물은 탈이온수에 현탁시켜 원심분리시켰다(4℃, 25000 x g, 15 분). 이어서 이 침전물을 회수하고, 탈이온수를 여기에 첨가하여 총부피 1.5 ml로 만들었다. 침전물을 현탁시킨후, 이 현탁액을 원심분리 (4℃, 10000 x g, 30 분)시켜 침전물을 수득하였다. 이어서 상기 절차를 반복하여 OD660 = 100 또는 OD660 = 200 의 탈이온수중 침전물의 현탁액을 수득하였다. 이렇게 제조된 봉입체를 OmpT 프로테아제 반응에서 기질로서 사용하였다.
(5) OmpT 프로테아제 반응
기질로서 PRX, PKX, PRhANP, PRhCT, PRRXA, PRR-4X 및 PRR-6X를 사용하여, OmpT 프로테아제 반응을 다음의 방식으로 실행하였다. 20 ㎕ 의 10 M 우레아에 2.5 ㎕의 1 M 소듐 포스페이트 (pH 7.0) 및 2 ㎕ 의 50 mM EDTA를 첨가하였다. 이어서 10 ㎕의 융합 단백질 봉입체 (OD660 = 100) 를 여기에 첨가하고, 봉입체를 용해 시켰다. 10.5 ㎕ 의 물, 5 ㎕ 의 4 U/ml ( PRR-4X의 경우 20 U/ml, PRR-6X의 경우 1 U/ml)의 OmpT 프로테아제를 여기에 첨가하고, 반응을 50 ㎕ 의 액체 반응 혼합물 부피에서 개시시켰다 . 반응은 25℃에서 30 또는 60 분간 실시하였다.
PRX, PKX, PRRXA, PRR-4X 및 PRR-6X을 기질로 이용하여 OmpT 프로테아제 반응으로 수득한 펩티드는 각각 단리시키고 하기에서 상술되는 바와 같은 조건하에서 HPLC 로 정량화시켰다. OmpT 프로테아제 반응 혼합물에, 동량의 12% 아세트산 및 4 M 우레아를 첨가하여 반응 종결시켰다. 이어서 액체 반응 혼합물을 원심분리시키고(10000 x g, 2 분), 20 ㎕ 분량 또는 50 ㎕ 분량의 상층액을 YMC PROTEIN RP 컬럼으로 처리하였다. HPLC 를 1 ml/min의 유동속도로 40℃ 의 컬럼온도에서 실행하였다. 0.1% 트리플루오로아세트산을 함유하는 30-50% 아세토니트릴로 16 분간 선형 농도구배 용출을 실시한후, 214 nm 에서의 흡광도를 모니터한후, 펩티드를 단리 및 정량화하였다.
기질 RShANP 및 RXhANP을 사용하여, OmpT 프로테아제 반응을 다음의 방식으로 실시하였다. 20 ㎕의 10 M 우레아에 2.5 ㎕의 1 M 소듐 포스페이트 (pH 7.0) 및 2 ㎕의 50 mM EDTA를 첨가하였다. 이어서 5 ㎕의 융합 단백질 봉입체 (OD660 = 200)를 여기에 첨가하고, 봉입체를 용해시켰다. 15.5 ㎕의 물, 5 ㎕의 10 U/ml의 OmpT 프로테아제를 여기에 첨가하고, 반응을 50 ㎕의 액체 반응 혼합물 부피에서 개시하였다. 반응은 37℃에서 120 분간 실시하였다.
기질 RShANP 및 RShANPR를 사용하여, OmpT 프로테아제 반응을 하기의 방식으로 실시하였다. 8 ㎕의 10 M 우레아에 1.0 ㎕의 1 M 소듐 포스페이트 (pH 7.0) 및 0.8 ㎕의 50 mM EDTA를 첨가하였다. 이어서 4 ㎕ 의 융합 단백질 봉입체 (OD660 = 100)를 여기에 첨가하고, 봉입체는 용해시켰다. 4.2 ㎕의 물, 2 ㎕의 20 U/ml OmpT 프로테아제를 여기에 첨가하고, 반응을 20 ㎕ 의 액체 반응 혼합물 부피에서 개시하였다. 반응은 25℃에서 90 분간 실시하였다. PRhANP, RShANP, RXhANP 및 RShANPR 을 기질로 사용하여 OmpT 프로테아제 반응으로 수득한 펩티드 각각을 단리시키고, 후술되는 조건하에서 HPLC 로 정량화시켰다. OmpT 프로테아제 반응 혼합물에, 동량의 12% 아세트산 및 4 M 우레아를 첨가하여 반응을 종결시켰다. 이어서 액체 반응 혼합물을 원심분리시키고 (10000 x g, 2 분), 20 ㎕ 분량 또는 50 ㎕ 분량의 상층액을 YMC A-302 ODS 컬럼으로 처리하였다. HPLC 는 40℃ 의 컬럼온도 및 1ml/min의 유동속도에서 실시하였다. 0.1% 트리플루오로아세트산을 함유하는 21.5-32% 아세토니트릴로 15 분간 선형 농도구배 용출을 실시한후, 214 nm에서의 흡광도를 모니터한후 펩티드를 단리 및 정량화시켰다.
(6) 펩티드의 N-말단 아미노산 서열의 분석
이렇게 수득한 각 펩티드의 N-말단 아미노산 서열은 단백질 서열기 477A-120A 또는 PROCISE 492 (ABI사제)를 이용하여 5 아미노산 잔기에 대하여 결정하였다.
본 발명은 하기의 실시예들을 참고로하여 좀더 상세하게 기술될 것이다.
실시예 1: 융합 단백질 PRX의 제조
OmpT 프로테아제는 대장균외막에 존재하는 엔도프로테아제이다. 비록 이러 한 효소는 높은 기질 특이성을 갖지만, 효소에 의해 인식되는 기질내 아미노산의 특징은 아직까지는 충분하게 해명되지 않았다. OmpT 프로테아제 는 염기성 아미노산 쌍 (아르기닌-아르기닌, 아르기닌-리신, 리신-아르기닌 및 리신-리신)의 중앙 결합을 절단하는 것으로 공지되어 있다. 또한, OmpT 프로테아제는 염기성 아미노산 (아르기닌-메티오닌, 아르기닌-알라닌 및 아르기닌-발린)의 C-말단 펩티드 결합을 절단하는 것으로 보고되어 있다. 그러나, OmpT 프로테아제는 항상 단백질 및 펩티드의 아미노산 서열내 상기 부위를 절단하지는 않고, 이러한 효소에 의한 절단은 절단부위 부근내 아미노산 서열에 의해 상당히 영향을 받는다. 그러므로 효소는 높은 기질 특이성을 갖고, 특정 부위를 배타적으로 절단하는 것으로 판단된다. 본 발명자는 이러한 효소의 새로운 기질 특이성은 이러한 효소의 공지된 절단 부위를 이용하여 절단부위의 +1-위치의 아미노산을 서열을 조사함으로써 발견되리라 기대하였다. 이러한 관점에서, 본 발명자는 다음의 실험을 실시하였다.
OmpT 프로테아제로 절단가능한 도 4 에 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 융합 단백질 PR (즉, 대장균 β-갈락토시다아제의 N-말단내 117 아미노산으로부터 유래한 보호 단백질 (β-gal117S4H) 및 인간 글루카곤-유사 펩티드-1 (GLP-1[G])로 구성된 융합 단백질)의 +1 위치에서, 아미노산 치환을 실시하여 융합 단백질 PRX (도 6: 여기에서 X 는 치환된 아미노산의 1 문자 코드를 나타낸다 (총 20 유형); 즉, 알라닌으로의 치환을 갖는 융합단백질은 PRA로 나타낸다)를 형성시켰다. 융합 단백질 PRX에서, 원래의 융합단백질 PR 의 OmpT 프로테아제 절단 부위 -RLYR↓RHHG- (서열번호: 1)는 -RLYRXHHG- (서열번호: 2)으로 전환시켰다. 이어서 OmpT 프로테아제에 의한 절단을 조사하였다.
융합 단백질 PRX는 다음의 5 단계로 제조하였다.
(1) 단계 1: pGll7S4HR6GLP-1의 구축 (도 1)
처음에, 플라스미드 pGll7S4HR6GLP-1를 구축하였다. 이 플라스미드는 OmpT 프로테아제 인식/절단 부위로서 융합 단백질의 링커부분에 삽입된 서열 아르기닌-아르기닌을 운반한다. 구축물에서, R6 합성 DNA 서열 (참조 도1)를 pGll7S4HGP의 StuI 부위에 삽입하여(참조 일본 공개 특허 공보 No. 9-296000 및 EP 794255) pG117S4HR6GLP-1를 수득하였다. 도 1 에서, β-gal117S4H 는 대장균 β-갈락토시다아제의 N-말단내 117 아미노산으로부터 유래한 보호 단백질을 나타내고, GLP-1[G] 는 인간 글루카곤-유사 펩티드-1을 나타낸다.
(2) 단계 2: pGll7S4HompRHKR의 구축 (도 2)
추가로 OmpT 프로테아제에 의한 절단 효율을 높이기 위해, R6 부분내 서열을 다음의 방식으로 변경시켰다. NsiI 및 HindIII 로 pGll7S4HR6GLP-1을 절단시켜 수득한 3.2 kbp 단편 (단편 1), BamHI 및 HindIII로 pGll7S4HR6GLP-1을 절단하여 수득한 0.2 kbp 단편 (단편 2), 및 아르기닌-아르기닌 서열 (즉, OmpT 프로테아제의 인식/절단 부위)를 갖는 아미노산 서열 L1 (참조 도 2)를 코딩하는 L1 합성 DNA (참조 도2)를 함께 라이게이션시켜 pGll7S4HompRHKR 를 구축하였다.
(3) 단계 3: pGll7S4HompRHPR의 구축 (도 3)
pGll7S4HompRHKR 에 의해 발현되는 융합 단백질 GLP-1[G] 의 N-말단의 직전에 위치한 리신-아르기닌 (KR) 서열 (도 4 의 152- 및 153-위치에 해당)이 OmpT 프로테아제에 의해 절단되기 때문에, 상기 융합 단백질은 OmpT 프로테아제로 처리시 두개의 부위에서 절단됨이 선행의 실험에 의해 공지되어 있다. 따라서, 분석을 용이하게 하기 위하여, 이 서열은 프롤린-아르기닌 (PR) 으로 치환시켜 OmpT 프로테아제에 의한 절단을 방지시켰다. 프라이머 P1:5'-GACTCAGATCTTCCTGAGGCCGAT-3' (서열번호 :3) 및 P2:5'-AAAGGTACCTTCCGCATGCCGCGGATGTCGAGAAGG-3' (서열번호 : 4) 를 합성하고, 주형으로 pG117S4HompRHKR 을 사용하여 PCR 를 실시하여 0.1 kbp DNA 단편을 수득하였다. 수득된 단편은 BglII 및 SphI (단편 3)으로 처리한후, BglII 및 HindIII로 pG117S4HompRHKR을 절단하여 수득한 3.2 kbp 단편 (단편 4) 및 SphI 및 HindIII 으로 pG117S4HompRHKR 을 절단하여 수득한 0.2 kbp 단편 (단편 5)에 라이게이션시켜 pG117S4HompRHPR를 구축하였다. 도 4 는 pG117S4HompRHPR 에 의해 코딩되는 융합 단백질 PR 의 전 아미노산 서열을 나타낸다.
(4) 단계 4: pG117ompPRX의 구축 (도 5)
pG117S4HompRHPR에 의해 코딩되는 융합 단백질 PR 의 OmpT 프로테아제 절단 부위 -RLYR↓RHHG- 를 -RLYRXHHG- (여기에서 X 는 20 유형으로부터 선택된 아미노산을 나타낸다)으로 전환시켰다. 이 전환은 pG117S4HompRHPR 에 돌연변이를 도입시켜 수행하였다.
돌연변이는 주형으로 pG117S4HompRHPR 을 이용하여 PCR 로 도입시켰다. 프라이머로서, P3:5'-ACCCCAGGCTTTACACTTTA-3' 및 P4X:5'-CCGGATCCGTGATGNNNGCGATACAGGCG-3' 을 사용하였다 (여기에서 X 는 아미노산의 1 문자 코드를 나타내고(총 20 유형); 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 메티오닌, 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 글루타민, 아스파르트산, 글루탐산, 리신, 아르기닌 또는 히스티딘으로 전환을 각각 원하는 경우, NNN 는 AGC, AAC, CAG, GAT, CGG, GAA, CCA, CAT, GCC, AGA, GGT, GCA, GTA, GTT, CTG, GTC, TTC, TTT, ACG 또는 ATG 를 나타낸다). 이렇게 수득한 PCR 산물은 PvuI 및 BamHI로 절단시켜 0.3 kb 단편 (단편 6)을 수득하였다. 더욱이, PCR 은 주형으로 pG117S4HompRHPR 및 프라이머로 P5:5'-ACGGATCCGGTTCCCCTTATCGACATCCG-3' 및 P6:5'-TTGCGCATTCACAGTTCTCC-3' 를 이용하여 수행하였다. 이렇게 수득한 PCR 산물은 BamHI 및 HIndIII 로 절단시켜 0.2 kbp 단편 (단편 7)을 수득하였다. 이러한 단편 6 및 7 및 PvuI 및 HindIII로 pG117S4HompRHPR를 절단시켜 수득한 3.0 kbp 단편 (단편 8)을 라이게이션시켜 형질전환을 실시하였다. 플라스미드는 이렇게 수득한 각 클론으로부터 단리시키고, 제한효소 분석 및 돌연변이된 부위에서의 뉴클레오티드 시퀀싱을 실시한 결과, 표적 융합 단백질 PRX 의 발현 플라스미드로서 동정되었다. 이 플라스미드는 총괄적으로 pGll7ompPRX 로 명명하였다 (여기에서 X 는 아미노산의 1 문자 코드를 나타낸다 (총 20 유형); 즉, 알라닌으로의 치환을 갖는 융합 단백질은 pG117ompPRA에 의해 발현된다) (도 5).
(5) 단계 5: 융합 단백질 PRX의 제조
pG117ompPRX 를 대장균에서 발현시키는 경우, 융합 단백질 PRX (도 6) 는 봉입체로서 발현된다. OmpT 프로테아제가 대장균에서 발현되는 경우, 봉입체는 단지 우레아로 용해시킴으로 해서 OmpT 프로테아제에 의해 절단된다. 따라, 이러한 절단를 피하기 위하여, pG117ompPRX를 W3110 M25 (즉, OmpT 프로테아제-결핍 대장균주)로 트랜스펙션시켜 융합 단백질 PRX를 봉입체 형태로 제조하였다.
실시예 2: 정제된 OmpT 프로테아제 표본의 제조
정제된 OmpT 프로테아제를 제조하기 위하여, OmpT 프로테아제 발현 플라스미드를 대장균 W3110 주로 트랜스펙션시켜 OmpT 프로테아제 고-발현 대장균 주를 구축하였다. 이러한 균주의 막분획으로부터, OmpT 프로테아제를 하기의 5 단계로 정제하였다.
(1) 단계 1: pOmpTTc 의 구축 (도 7)
OmpT 프로테아제의 발현 수준을 증가시키 위하여, OmpT 프로테아제 발현 플라스미드 pOmpTTc 를 구축하였다. EcoRI- 및 SalI-제한 효소 부위를 부위 특이적 돌연변이로 각각 OmpT 프로테아제 유전자를 함유하는 플라스미드 pGP501 내 OmpT 유전자의 3'-말단 및 번역개시 부위 직전에 도입시켰다 (Sugimura, K. Biochem. Biophys. Res. Commun.153: 753-759, 1988). 이러한 제한 효소로 플라스미드를 절단시켜, 1.3 kbp 단편 (단편 9)을 수득하였다.
EcoRI 제한 효소 부위를 lac 프로모터의 하류에 도입시키기 위하여, 주형으로 pG117S4HompRHPR 및 프라이머로 P7:5'-GCGGGTGTTGGCGGGTGTCG-3' 및 P8:5'-
TGAATTCTTCCTGTGTGAAATTGTTAT-3' 를 이용하여 PCR 을 실시하였다. 이렇게 수득한 PCR 산물은 EcoRI 및 AlwNI 으로 절단시켜 0.5 kbp 단편 (단편 10)을 수득하였다. 이 단편 9 및 10 및 AlwNI 및 SalI 에 의해 pG117S4HompRHPR으로부터 수득한 2.3 kbp 단편 (단편 11) 을 라이게이션시켜 pOmpTTc 를 구축하였다.
(2) 단계 2: pOmpTTcB 의 구축(도 8)
대장균에서 고수준으로 단백질의 발현을 보이는 플라스미드를 구축하는 방법에 있어서 (Shunji Natori, Yoshinobu Nakanishi, Zoku Iyakuhinn no Kaihatsu (Sequel To Development of Drugs), vol. 7, 29-61, 1991, Hirokawa Shoten), 다음의 두 부분에서 pOmpTTc 를 향상시키고자 하였다
① OmpT 프로테아제 번역개시 부위 9 염기를 SD 서열의 하류에 위치시키기. ② 전사 개시부위와 OmpT 프로테아제 번역의 개시로부터 5 번째 아미노산사이의 mRNA 의 이차 구조내 스템 또는 루프의 형성을 최소화시키기 위한 뉴클레오티드의 변경.
상기 ①이 향상된 pOmpTTcB 의 구축 (도 8) 및 ② 가 향상된 oPmpTTcC (도 9)의 구축후, ① 및 ② 양쪽 모두 향상된 pOmpTTcE (도 10) 를 구축하였다.
① 이 향상된 pOmpTTcB 는 하기의 방식으로 구축하였다 (도 8).
pOmpTTc 는 HincII 및 MfeI 로 절단시켜 1.0 kbp 단편 (단편 12)를 수득하고, pOmpTTc 는 EcoRI 및 MfeI 로 절단시켜 2.9 kbp 단편 (단편 13)을 수득하였다.
향상 포인트 ①을 실시하기 위하여, 주형으로 pOmpTTc 및 프라이머로 P9:551-TGAATTCAAAATGCGGGCGAAACTGCTGGG-3' 및 P10:5'-TGCCGAGGATGACGATGAGC-3' 을 이용하여 PCR 을 실시하였다. 이렇게 수득한 PCR 산물은 EcoRI 및 HincII 로 절단시키고, 생성된 0.2 kbp 단편 (단편 14)를 단편 12 및 13 에 라이게이션시켜 pOmpTTcB 를 구축하였다.
(3) 단계 3: pOmpTTcC 의 구축 (도 9)
②가 향상된 pOmpTTcC 는 하기의 방식으로 구축하였다.
pOmpTTc 를 EcoRI 및 SalI 로 절단시켜 1.3 kbp 단편 (단편 15)을 수득하고, AlwNI 및 SalI 로 절단시켜 다른 2.3 kbp 단편 (단편 16)을 수득하였다.
향상 포인트 ② 를 실시하기 위하여, 주형으로 pOmpTTc 및 프라이머로 P11:5'-CTATCGTCGCCGCACTTATG-3' 및 P12:5'-TGAATTCTTCCTGTCTGTAATTTTTATCCGCTCACAATT-3' 을 이용하여 PCR 를 실시하였다. 이렇게 수득한 PCR 산물은 EcoRI 및 AlwNI로 절단시켰다. 생성된 0.5 kbp 단편 (단편 17)은 단편 15 및 16 에 라이게이션 시켜 pOmpTTcC 을 구축하였다.
(4) 단계 4: pOmpTTcE 의 구축(도 10)
OmpT 프로테아제의 발현 수준을 향상시키기 위하여, ① 및 ② 가 향상된 pOmpTTcE 는 하기의 방식으로 구축하였다.
EcoRI 및 SalI 으로 pOmpTTcB을 절단시켜 수득한 1.3 kbp 단편 (단편 18) 을 EcoRI 및 SalI 으로 pOmpTTcC을 절단시켜 수득한 2.8 kbp 단편 (단편 19)에 라이게이션시켜 pOmpTTcE 를 구축시켰다.
(5) 단계 5: 정제된 OmpT 프로테아제 표본의 제조
정제된 OmpT 프로테아제 표본을 수득하기 위하여, pOmpTTcE 를 대장균 W3110 주로 트랜스펙션시켜 OmpT 프로테아제 고 발현 대장균주를 수득하였다. 이어서, OmpT 프로테아제 고 발현 대장균주를 하기의 방식으로 배양하고, OmpT 프로테아제 를 정제하였다.
W3110/pOmpTTcE 주는 10mg/l의 테트라사이클린를 함유하는 100ml의 액체 LB 배지를 이용하여 500 ml Erlenmeyer 플라스크에서 37℃ 에서 밤새워 회전시켜 인큐베인션시켰다. 다음날, 이것을 4 g/l K2HP04 , 4 g/l KH2PO4, 2.7 g/l Na2HP04, 0.2 g/l NH4Cl, 1.2 g/l (NH4)2SO4 , 4 g/l 이스트 추출물, 2 g/l MgSO4ㆍ7H20, 40 mg/l CaCl2ㆍ2H20, 40 mg/l FeSO4ㆍ7H20, 10 mg/l MnSO4 ㆍ nH20, 10 mg/l AlCl3ㆍ 6H20, 4 mg/l CoCl2 ㆍ6H20, 2 mg/l ZnSO4 ㆍ 7H20, 2 mg/ l Na2 MoO4ㆍ 2H20, 1 mg g/l CUCl2 ㆍ2H20, 0.5 mg/l H3BO4, 1g/l 글루코오스, 10 g/l 글리세릴 및 10 mg/l 테트라사이클린을 함유하는 배지 21 를 함유하는 교반기가 장착된 배양용기로 옮겨 37℃ 에서 12 시간동안 배양시켰다. 배양의 종결후, 배양배지를 원심분리하여 (4℃, 6000 x g, 10 분) 80 g 의 압축된 세포를 수득하였다. 이 세포를 600 ml의 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) 에 현탁시키고, 이 현탁액을 원심분리하여 (4℃, 6000 x g, 10 분)세포를 수거하였다. 이 절차를 반복한후, 이 세포를 600 ml의 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)에 현탁시키고, Manton-Gorlin 으로 파열시켰다. 파열된 세포의 현탁액은 원심분리시키고 (4℃, 1000 x g, 10 분), 침전물은 버리고, 상층액은 회수하였다. 이 상층액은 추가로 원심분리시켰다 (4℃, 36000 x g, 40 분). 침전물은 회수하고, 150 ml의 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)에 현탁시키고 다시 원심분리시켰다 (4℃, 36000 x g, 40 분). 이렇게 수득한 침전물의 1/6 분량에 0.1% 살리코실을 함유하는 120 ml 의 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)을 첨가하였다. 현탁후, 혼합물을 10℃에서 1 시간동안 진탕시켰다. 1 시간후, 이것을 원심분리시키고 (4℃, 36000 x g, 40 분), 침전물은 회수하였다. 또한, 이것은0.1% 의 Triton X-100 및 5 mM 의 EDTA 를 함유하는 120 ml의 50 mM Tris-HCl에 현탁시켜 실온에서 1 시간동안 진탕시켰다. 이어서, 이것을 원심분리시키고 (4℃, 36000 x g, 40 분),상층액은 회수하여 조 효소 표본을 회수하였다.
120 ml 의 상기 조 효소 표본을 0.1% Triton X-100 (이후 버퍼 A로 칭함) 를 함유하는 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)로 평형화된 Benzamidine Sepharose 6B 컬럼 (직경 12 mm x 70 mm, 8 ml)에 4 ml/min 의 유동속도로 적용한후 80 ml 의 버퍼 A 로 세정시켰다. 이어서 이 컬럼을 0.3 M NaCl을 함유하는 버퍼A 로 용출시키고, 이 용출물을 10 ml 분량으로 취하여 총 8 개의 분획을 수득하였다.
16% SDS-PAGE에 의해 균질한 것으로 입증된 5 번째 분획을 정제된 OmpT 프로테아제 표본으로 정하였다. Coomassie Plus Protein Assay Reagent (PIERCE사제)및 표준으로 소혈청알부민을 이용하여 결정하는 경우, 정제된 OmpT 프로테아제 표본의 단백질 농도는 120 ㎍/ml 이었다. 기질로서 Dynorphine A 를 이용하여 측정한 OmpT 프로테아제 활성은 40 U/ml 이었다.
실시예 3: OmpT 프로테아제에 의한 PRX 의 절단
OmpT 프로테아제 (도 4)에 의해 절단가능한 구조를 갖는 융합 단백질 PR의 +1-위치 (N-말단으로부터 141-위치)에서 아미노산을 치환시켜 구축된 융합 단백질 PRX (도 6)의 OmpT 프로테아제에 의한 절단의 여부에 대하여 조사하였다. PRX 를 정제된 OmpT 프로테아제 표본과 pH 7.0, 25℃에서 30분간 반응시켰다. 효소 반응후, SDS-PAGE 분석을 실시하였다. 도 11 는 그 결과를 보여주며, 여기에서 - 은 OmpT 프로테아제가 없는 레인을 나타내고, + 는 OmpT 프로테아제로 처리한 융합 단 백질의 레인을 나타낸다.
PRD 및 PRE에서, OmpT 프로테아제에 의한 절단은 관찰되지 않는다 (도 11, 레인 D 및 E). 반대로, OmpT 프로테아제에 의한 절단은 PRD 및 PRE 외의 단백질에서 관찰된다.
절단 부위를 확인하기 위하여, OmpT 프로테아제 처리후 수득한 펩티드 절단 산물을 HPLC 로 단리시키고 N-말단 아미노산 서열을 결정하였다. 이렇게 동정된 OmpT 프로테아제 절단 부위는 표 1 에 열거하였다.
융합 단백질 PRX의 OmpT 프로테아제 절단 부위
PRX 절단 부위
PRA LYR↓AHHGSG (서열번호:16)
PRV LYR↓VHHGSG (서열번호:17)
PRL LYR↓LHHGSG (서열번호:18)
PRI LYR↓IHHGSG (서열번호:19)
PRP LYRPHHGSG (서열번호:20)
PRF LYR↓FHHGSG (서열번호:21)
PRW LYR↓WHHGSG (서열번호:22)
PRM LYR↓MHHGSG (서열번호:23)
PRG LYR↓GHHGSG (서열번호:24)
PRS LYR↓SHHGSG (서열번호:25)
PRT LYR↓THHGSG (서열번호:26)
PRC LYR↓CHHGSG (서열번호:27)
PRY LYR↓YHHGSG (서열번호:28)
PRN LYR↓NHHGSG (서열번호:29)
PRQ LYR↓QHHGSG (서열번호:30)
PRD LYRDHHGSG (서열번호:31)
PRE LYREHHGSG (서열번호:32)
PRK LYR↓KHHGSG (서열번호:33)
PRR LYR↓RHHGSG (서열번호:34)
PRH LYR↓HHHGSG (서열번호:35)
↓는 OmpT 프로테아제 절단 부위를 가리킨다. 융합단백질 PRX 내의 138-위치 (N-말단으로부터)의 루이신으로부터의 146-위치의 글리신까지의 영역이 절단 부위에서의 아미노산 서열로 제시된다.
PRP에서, -RX-가 아니라 -ELR↓LYRPHHG-에서만 절단이 관찰되었다. 그러나, PRD, PRE 및 PRP 이외의 모든 단백질에서, R↓X에서 절단이 관찰되었다 (표 1). 이러한 결과를 기초로 하여, +1-위치에 17 개의 아미노산 (즉, 아스파르트산 및 글루탐산 (산성 아미노산) 및 프롤린 (이미노산)] 중 하나를 갖는 아미노산 서열이 OmpT 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 것으로 추측된다.
실시예 4: 융합 단백질 PKX의 제조
유사하게, OmpT 프로테아제 절단 부위가 -1-위치에 염기성 아미노산으로서 리신을 갖는 경우에도 +1-위치의 아미노산이 아스파르트산 및 글루탐산 (산성 아미노산) 및 프롤린 이외의 아미노산 중 하나로 치환된 후 OmpT 프로테아제에 의한 절단이 수행될 수 있는지 여부를 시험하기 위해, 융합 단백질 PRX의 -RLYRXHHG-가 -RLYKXHHG-로 전환된 PKX를 구축하였다 (도 13). 하기 실시예에서, X는 알라닌, 세린, 리신, 아르기닌, 아스파르트산 및 글루탐산 (각 아미노산의 1문자 코드로 나타내어짐)으로부터 선택된다. 이러한 아미노산들 중에서, 염기성 아미노산 쌍을 형성하는 리신 및 아르기닌을 양성 대조군으로서 사용하였다. 알라닌 및 세린은 실시예 3에서 상대적으로 높은 절단 효율을 나타내므로 사용하였다. 아스파르트산 및 글루탐산은 이들을 함유하는 PRD 및 PRE가 절단될 수 없기 때문에 PKD 및 PKE가 절단될 수 있는지 여부를 시험하기 위해 사용하였다.
융합 단백질 PKX를 하기의 2 단계에 의해 제조하였다:
1) 단계 1: pG117ompPKX (도 12)의 구축
융합 단백질 PKX (X는 A, S, K, R, D 또는 E이다)를 코딩하는 플라스미드 pG117ompPKX (X는 A, S, K, R, D 또는 E이다) (도 12)를 하기 방식으로 형성시켰다.
-RLYRXHHG-의 -RLYKXHHG- (X는 A, S, K, R, D 또는 E이다)로의 전환을 PCR에 의해 수행하였다.
pG117ompPRA, pG117ompPRS, pG117ompPRK, pG117ompPRR, pG117ompPRD 및 pG117ompPRE를 주형으로 사용하고 P3:5'-ACCCCAGGCTTTACACTTTA-3' 및 P13X:5'-CCGGATCCGTGATGNNNTTTATACAGGCG-3' (NNN: pG117ompPRA를 주형으로 사용하는 경우 AGC; pG117ompPRS를 주형으로 사용하는 경우 AGA; pG117ompPRK를 주형으로 사용하는 경우 TTT; pG117ompPRR을 주형으로 사용하는 경우 ACG; pG117ompPRD를 주형으로 사용하는 경우 GTC; pG117ompPRE를 주형으로 사용하는 경우 TTC)을 프라이머로 사용함으로써 PCR을 수행하였다. 상기 수득된 PCR 산물을 PvuI 및 BamI로 절단하여 수득된 0.3 kbp 단편 (단편 20)을 pG117ompPRR을 BamI 및 SalI로 절단하여 수득된 0.1 kbp 단편 (단편 21) 및 pG117ompPRR을 PvuI 및 SalI로 절단하여 수득된 3.1 kbp 단편 (단편 22)에 라이게이션시키고, 형질전환을 수행하였다. 이렇게 수득된 각 클론으로부터 플라스미드를 분리하고 돌연변이된 부위에서의 제한효소 분석 및 뉴클레오티드 시퀀싱을 수행하여 플라스미드가 표적 융합 단백질을 발현시키는지를 확인하였다. 이러한 플라스미드들을 총체적으로 pG117ompPKX (X는 치환된 아미노산의 1문자 코드를 나타낸다. 예를 들어, pG117ompPKA는 알라닌으로 치환된 플라스미드를 나타낸다)로 가리킨다. (도 12).
(2) 단계 2: 융합 단백질 PKX의 제조
pG117ompPKX가 대장균 내에서 발현될 때, 융합 단백질 PKX (도 13)는 봉입체로서 발현된다. OmpT 프로테아제가 대장균 내에서 발현되는 경우, 융합체는 단지 우레아로 가용화시킴으로써 OmpT 프로테아제에 의해 절단된다. 이러한 현상을 피하기 위해, pG117ompPKX를 OmpT 프로테아제-결핍 대장균 균주 W3110 M25 내로 형질전환시키고 이렇게 융합 단백질 PKX를 봉입체로서 제조하였다.
실시예 5: OmpT 프로테아제에 의한 PKX의 절단
융합 단백질 PKX (도 13)이 OmpT 프로테아제에 의해 절단되는지 여부를 시험하였다.
PKX를 정제된 OmpT 프로테아제 표본과 25 ℃에서 30 분 동안 반응시켰다. 도 14는 -는 OmpT 프로테아제가 없는 레인을 나타내고; +는 OmpT 프로테아제로 처리된 융합 단백질의 레인을 나타내는 이들의 SDS-PAGE 분석의 결과를 제시한다.
양성 대조군으로서 사용된 PKK 및 PKR은 OmpT 프로테아제에 의해 절단되는 것이 확인되었다 (도 14, 레인 KK 및 KR). 또한, 염기성 아미노산 쌍을 형성하지 않는 PKA 및 PKS가 OmpT 프로테아제에 의해 절단되었다 (도 14, 레인 KA 및 KS). 반면에, PKD 및 PKE는 OmpT 프로테아제에 의해 절단되지 않았다 (도 14, 레인 KD 및 KE).
절단 부위를 확인하기 위해, OmpT 프로테아제 처리 후 펩티드 절단 생성물을 HPLC에 의해 분리하고, 이어서 N-말단 아미노산 서열을 결정하였다. 이렇게 확인된 OmpT 프로테아제 절단 부위가 표 2에 목록으로 나타난다.
OmpT 프로테아제에 의해 절단된 PKK, PKR, PKA 및 PKS는 -K↓X-에서 절단을 나타냈다 (표 2)
융합 단백질 PKX의 OmpT 프로테아제 절단 부위
PKX 절단 부위
PKA LYK↓AHHGSG (서열번호: 38)
PKS LYK↓SHHGSG (서열번호: 39)
PKK LYK↓KHHGSG (서열번호: 40)
PKR LYK↓RHHGSG (서열번호: 41)
PKD LYKDHHGSG (서열번호: 42)
PKE LYKEHHGSG (서열번호: 43)
↓는 OmpT 프로테아제 절단 부위를 가리킨다. 융합 단백질 PKX 내의 138-위치 (N-말단으로부터)의 루이신으로부터 146-위치의 글리신까지의 영역이 절단 부위에서의 아미노산 서열로 제시된다.
따라서, 실시예 3 및 5의 결과는 염기성 아미노산 쌍 (-RR-, -RK-, -KR- 및 -KK-)의 경우뿐만 아니라 염기성 아미노산 하나를 함유하는 쌍 (-RX-, -KX-)의 경우에도 OmpT 프로테아제 절단 부위가 존재한다는 것을 가리킨다. 그러나, X가 아스파르트산 또는 글루탐산 (산성 아미노산) 또는 프롤린 (이미노산)일 때는, 이러한 부위 내에서 절단이 일어나지 않는다.
실시예 6: 융합 단백질 PRhANP 및 PRhCT의 제조
실시예 3의 결과는 OmpT 프로테아제가 실시예 3에 나타난 OmpT 프로테아제 절단 부위에 인접한 아미노산 서열 내의 -R↓X- (X는 아스파르트산, 글루탐산 (산성 아미노산) 및 프롤린 이외의 아미노산 (총 17 유형)을 나타낸다)를 절단할 수 있다는 것을 가리켰다. 또한, 실시예 5에서 -K↓X-에서의 절단에 대해 유사한 결과가 수득되었다.
그러나, 이러한 효소에 의한 기질의 인식에 대해, 현재까지 보고된 아미노산 서열 상에서 단지 시험하는 것은 불충분한 것으로 보이고, 절단 부위에 인접한 아미노산 서열 (즉 N- 및 C-말단 쪽) 또한 중요하다. 상기 실시예들에서, 본 발명가들은 이러한 효소에 의한 절단 부위의 +1-위치의 아미노산을 치환시켰다. 절단 부위에 인접한 아미노산 서열이 기질 인식 및 절단에 중요할 수 있다는 사실의 관점에서, 본 발명가들은 실시예 3 및 5에서 사용된 융합 단백질의 표적 펩티드 부분이 다른 펩티드로 치환된 경우 (즉 +1-위치의 아미노산으로부터 C-말단 쪽 내의 아미노산 서열을 변화시킴) OmpT 프로테아제에 의한 절단이 어떻게 일어나는지를 더 시험하였다.
α-hANP (α-유형 인간 심방성 나트륨이뇨 펩티드)가 융합 단백질 PR (도 4)의 N-말단으로부터 140-위치의 아르기닌 다음에 오도록 배열된 융합 단백질 PRhANP (도 16), 및 hCT[G] (인간 칼시토닌 전구체)가 제공되는 또다른 융합 단백질 PRhCT (도 18)을 구축하고 OmpT 프로테아제와 반응시켜 α-hANP 및 hCT[G]가 절단될 수 있는지 여부를 시험하였다.
pG118ompPRR (도 5)을 사용하여 융합 단백질 PRhANP의 발현 플라스미드 pG117ompPRhANP 및 융합 단백질 PRhCT의 발현 플라스미드 pG117ompPRhCT를 구축하였다. 융합 단백질 PRhANP 및 PRhCT를 하기의 3 단계로 제조하였다:
(1) 단계 1: pG117ompPRhANP (도 15)의 구축
α-hANP가 융합 단백질 PR (도 4)의 N-말단의 140-위치의 아르기닌 다음에 오도록 배열된 융합 단백질 PRhANP (도 16)의 발현 플라스미드 pG117ompPRhANP를 구축하였다. pGHα97SII ("Daichokin o shukushu toshita seirikassei peputido seisankei ni kansuru kenkyu (Study on Physiologically Active Peptide Production System with the Use of E. coli as Host)", Koji Magota, Doctoral Dissertation, Kyushu University, 1991)을 주형으로 사용하고, P14:5'-GCGGAGCTCCGCCTGTATCGCAGCCTGCGGAGATCCAGCTG-3' 및 P15:5'-CTGAGTCGACTCAGTACCGG-3'을 프라이머로 사용하여 PCR을 수행하였다. 이렇게 수득된 PCR 산물을 분리하고 SacI 및 SalI로 절단하였다. 이렇게 수득된 0.1 kbp 단편 (단편 23)을 pG117ompPRR을 SacI 및 SalI로 절단하여 수득된 3.4 kbp 단편 (단편 24)에 라이게이션시키고, 형질전환을 수행하였다. 이렇게 수득된 각 클론으로부터 플라스미드를 분리하고 돌연변이된 부위에서의 제한효소 분석 및 뉴클레오티드 시퀀싱을 수행하여 표적 융합 단백질의 발현 플라스미드로서 확인하였다. 이러한 플라스미드를 pG117ompPRhANP로 가리켰다.
(2) 단계 2: pG117ompPRhCT (도 17)의 구축
hCT[G]가 융합 단백질 PR (도 4)의 N-말단으로부터 140-위치의 아르기닌 다음에 오도록 배열된, 융합 단백질 PRhCT (도 18)의 발현 플라스미드 pG117ompPRhCT를 구축하였다. pG97S4DhCT[G]R4 (Yabuta, M., Suzuki, Y. and Ohsuye, K. Apppl. Microbiol. Biothechnol. 42: 703-708, 1995)를 주형으로서 사용하고, P16:5'-GCGGAGCTCCGCCTGTATCGCTGTGGTAACCTGAGCACCTG-3' 및 P17:5'-CTGAGTCGACTTAGCCCGGG-3'을 프라이머로 사용하여 PCR을 수행하였다. 이렇게 수득된 PCR 산물을 분리하고 SacI 및 SalI로 절단하였다. 이렇게 수득된 0.1 kbp 단 편 (단편 25)을 pG117ompPRR을 SacI 및 SalI를 사용하여 절단함으로써 수득된 3.4 kbp 단편 (단편 26)에 라이게이션시키고, 형질전환을 수행하였다. 이렇게 수득된 각 클론으로부터 플라스미드를 분리하고 돌연변이된 부위에서의 제한효소 분석 및 뉴클레오티드 시퀀싱을 수행하여 표적 융합 단백질의 발현 플라스미드로서 확인하였다. 이러한 플라스미드를 pG117ompPRhCT로 나타내었다.
(3) 단계 3: 융합 단백질 PRhANP 및 PRhCT의 제조
상기 제조된 pG117ompPRhANP 및 pG117ompPRhCT를 OmpT 프로테아제-결핍 대장균 균주 W3110 M25 내로 형질전환시킴으로써 융합 단백질-생산 균주를 수득하였다. 이러한 균주를 배양함으로써, 융합 단백질 PRhANP (도 16) 및 PRhCT (도 18)를 봉입체로서 제조하였다.
실시예 7: OmpT 프로테아제에 의한 PRhANP 및 PRhCT의 절단
융합 단백질 PRhANP (도 16) 및 PRhCT (도 18)가 OmpT 프로테아제에 의해 절단될 수 있는지 여부를 시험하였다.
PRhANP 및 PRhCT를 정제된 OmpT 프로테아제 표본과 25 ℃에서 30 분 동안 pH 7.0에서 반응시켰다. 도 19는 -는 OmpT 프로테아제가 없는 레인을 나타내고; +는 OmpT 프로테아제가 첨가된 레인을 나타내는 SDS-PAGE 분석의 결과를 제시한다. 그 결과, PRhANP는 OmpT 프로테아제에 의해 절단된 반면 (도 19, 레인 α-hANP), PRhCT는 OmpT 프로테아제에 의해 절단되지 않았다 (도 19, 레인 hCT).
또한, PRhANP의 절단 부위를 확인하기 위해, OmpT 프로테아제 처리 후 펩티드 절단 생성물을 HPLC에 의해 분리하고, N-말단 아미노산 서열을 결정하였다. 따라서, α-hANP가 절단되었다는 것을 확인하였다.
이러한 실시예들의 결과를 고려하여, N-말단 아미노산으로서 세린을 갖는 α-hANP는 사용된 융합 단백질로부터 절단된 반면, N-말단 아미노산으로서 시스테인을 갖는 hCT[G]는 절단되지 않았다는 것이 명백하다. 실시예 3의 결과에서, +1-위치에 시스테인을 갖는 PRC는 OmpT 프로테아제에 의해 절단될 수 있었지만, hCT[G]는 절단되지 않았다. 따라서, 이러한 효소에 의해 절단은 절단 부위의 -1- 및 +1-위치의 아미노산 서열뿐만 아니라 절단 부위에 인접한 아미노산 서열에 의해서 크게 영향을 받는다는 것이 확인되었다.
실시예 8: 융합 단백질 RShANP의 제조
발현 플라스미드 pGRShANP (도 20)가 코딩하는 융합 단백질 RShANP (도 21)은 보호 단백질로서 작용하는 대장균 β-갈락토시다아제의 N-말단으로부터의 97 아미노산들에서 생기는 β-gal97S가 세 개의 아미노산 (글루타민-페닐알라닌-아르기닌)으로 구성되는 링커를 통해 α-hANP에 라이게이션된 융합 단백질이다. OmpT 프로테아제의 연구 과정 중에, 본 발명가들은 융합 단백질 RShANP가 링커 서열 내의 아르기닌과 α-hANP의 N-말단의 세린 사이의 결합에서 OmpT 프로테아제에 의해 절단된다는 것을 발견하였다. 하기 두 단계에 의해 융합 단백질 RShANP를 제조하였다.
(1) pGRShANP의 구축 (도 20)
pGHα97SII는 β-gal97S/α-hANP 융합 단백질 발현 플라스미드이다. pGHα97SII에 의해 발현되는 융합 단백질 α-hANP의 N-말단 세린의 바로 전에 위치 한 리신이 아르기닌으로 전환된 융합 단백질 RShANP를 발현하는 플라스미드 pGRShANP를 하기와 같은 방식으로 구축하였다.
주형으로 pGHα97SII를 사용하고,
프라이머로
Figure 112000023250376-pct00001
,및
Figure 112000023250376-pct00002
을 사용하여 PCR을 수행하여, α-hANP의 N-말단 세린 바로 전에 위치한 아미노산 코돈으로서 리신이 아르기닌으로 전환된 0.2 kbp의 PCR 산물 (P20)을 얻었다.
이어서, 상기와 같이 얻은 PCR 산물 (P20) 및
Figure 112000023250376-pct00003
을 프라이머로 사용하고, pGHα97SII를 주형으로 사용하여 PCR을 다시 수행함으로써 아르기닌으로 치환된 링커 DNA 서열을 포함하는 1.0 kbp PCR 산물을 얻었다. 상기 1.0 kbp PCR 산물을 BglII 및 EcoRI으로 절단하여 0.2 kbp의 DNA 단편 (단편 27)을 단리하였다. α-hANP 발현 플라스미드 pGHα97SII를 BglII 및 EcoRI 으로 절단하고, 이렇게 얻은 3.0 kbp의 단편 (단편 28)을 단편 27에 라이게이션하여 pGRShANP를 구축하였다.
(2) 단계 2: 융합 단백질 RShANP의 제조
pGRShANP를 대장균에서 발현시킬 경우, 융합 단백질 RShANP (도 21)은 봉입체로 발현된다. OmpT 프로테아제가 대장균에서 발현되는 경우, 봉입체는 단순히 우레아로 용해시킴으로써 OmpT 프로테아제에 의해 절단된다. 이러한 현상을 피하기 위하여, pGRShANP로 OmpT 프로테아제-결핍 대장균 균주 W3110M25 를 형질전환시켜, 융합 단백질 RShANP를 봉입체로 제조하였다.
실시예 9: OmpT 프로테아제에 의한 RShANP의 절단
생리학적 활성의 펩티드 α-hANP를 하기와 같은 방식으로 융합 단백질 RShANP (도 21)로부터 절단하였다. pH 7.0, 37℃에서 RShANP와 OmpT 프로테아제를 2시간 동안 반응시키고, 이어서 SDS-PAGE로 분석하였다. 결과를 도 24 (레인 RS)에 나타내었는데, 여기서, -는 OmpT 프로테아제가 없는 레인을 나타내고; +는 OmpT 프로테아제가 첨가된 레인을 나타낸다. 상기 결과를 기초로, RShANP가 OmpT 프로테아제에 의해 절단될 수 있음을 확인하였다. 절단 부위를 동정하기 위하여, OmpT 프로테아제 반응 후 얻어지는 펩티드 절단 생성물을 HPLC로 단리하여, N-말단 아미노산 서열을 결정하였다. 이렇게 동정된 OmpT 프로테아제 절단 부위를 표 3에 열거하였다 (RShANP). 표 3에 나타낸 바와 같이, RShANP는 -AQFR↓SLRR- 에서 OmpT에 의해 절단되어, 생리학적 활성의 펩티드 α-hANP가 직접 절단되어 나왔다. 또한, -AQFRSLR↓R에서의 절단이 부분적으로 검출되었으며, α-hANP (3-28)의 적출이 또한 확인되었다.
Figure 112000023250376-pct00004
↓는 OmpT 프로테아제 절단 부위를 나타낸다. 융합 단백질 RShANP 또는 RXhANP에 있어서, N-말단으로부터 99-위치의 글루타민부터 106 위치의 세린까지의 영역이 절단 부위의 아미노산 서열로 나타난다.
실시예 10: 융합 단백질 RXhANP의 제조
기질로 융합 단백질 PRX를 사용할 경우, X로서 아스파르트산 및 글루탐산 (즉, 산성 아미노산)과 프롤린 (즉, 아미노산) 이외의 아미노산을 가지는 아미노산 서열 -RLYRXHHG- (여기서, X는 20개의 아미노산으로부터 선택되는 아미노산을 나타냄)를 OmpT 프로테아제로 절단하였다. 이와 같이 하여, PRX와 유사한 절단이 다른 아미노산 서열의 OmpT 프로테아제 절단 부위에서도 일어나는지의 여부를 조사하였다. 먼저, 발현 플라스미드 pGRShANP (도 20)에 돌연변이를 도입하여 OmpT 프로테아제 절단 부위를 -AQFR↓SLRR-에서 -AQFRXLRR- (여기서, X는 아르기닌, 알라닌 또는 시스테인임)로 전환시킴으로써 구축한 융합 단백질 RXhANP (여기서, X는 R, A 또는 C임)의 발현 플라스미드 pGRXhANP (여기서, X는 R, A 또는 C임)를 구축하였다 (도 22). X와 관련하여, 아르기닌을 양성 대조로 선택하여 염기성 아미노산 쌍을 형성하였다. 알라닌 및 시스테인은, 이들이 실시예 3에서 비교적 큰 절단 효율을 제공하였기 때문에 선택하였다. RXhANP (도 23)을 하기 2 단계로 구축하였다.
(1) 단계 1: pGRXhANP의 구축 (도 22)
pGRShANP에 돌연변이를 도입함으로써 pGRXhANP를 구축하였다. pGRShANP를 주형으로 사용하였고,
Figure 112000023250376-pct00005
,
Figure 112000023250376-pct00006
(NNN은 알라닌으로 전환하는 경우, AGC이고; 레신을 시스테인으로 전환하는 경우는 GCA이고; 아르기닌으로 전환하 는 경우는 ACG임)을 프라이머로 사용하였다. 이렇게 얻어진 PCR 산물로부터 표적 PCR 산물을 단리하였다 (PCR 산물 29). 이와 유사하게, 주형으로 pGRShANP를 사용하고, 프라이머로서
Figure 112000023250376-pct00007
(NNN은 알라닌으로 전환하는 경우, GCT이고; 시스테인으로 전환하는 경우 TGC이고; 아르기닌으로 전환하는 경우 CGT임), 및
Figure 112000023250376-pct00008
를 사용하여 PCR을 수행하여, 표적 PCR 산물 (PCR 산물 30)을 단리하였다. 상기에서 얻어진 PCR 산물 29 및 30을 주형으로 사용하고,
Figure 112000023250376-pct00009
및
Figure 112000023250376-pct00010
를 프라이머로 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 산물을 수집하여 EcoRI 및 BglII로 절단함으로써 0.2 kbp의 DNA 단편 (단편 31)을 단리하였다. 상기 단편 31을, pGRShANP를 EcoRI 및 BglII로 절단하여 얻은 3.0 kbp의 단편 (단편 32)에 라이게이션시키고, 형질전환을 수행하였다. 이렇게 얻은 각각의 클론으로부터 플라스미드를 단리하고, 돌연변이된 부위에서 제한효소 분석 및 뉴클레오티드 서열결정을 수행하여 표적 융합 단백질의 발현 플라스미드로 동정하였다. 상기 플라스미드를 pGRXhANP (여기서, X는 전환된 아미노산의 1문자 코드를 나타낸다 (즉, 알라닌으로 치환된 융합 단백질은 pGRAhANP로 표현됨))로 지칭하였다.
(2) 단계 2: 융합 단백질 RXhANP의 제조
pGRXhANP를 대장균에서 발현시킬 경우, 융합 단백질 RXhANP (도 23)은 봉입체로 발현된다. 대장균에서 OmpT 프로테아제가 발현되는 경우, 봉입체는 단지 우 레아에 용해됨으로써 OmpT 프로테아제에 의해 절단된다. 따라서, 이러한 현상을 피하기 위하여, pGRXhANP로 OmpT 프로테아제 결핍 대장균 균주 W3110 M25를 형질전환시켰으며, 이와 같이 하여 융합 단백질 RXhANP를 봉입체의 형태로 제조하였다.
실시예 11: OmpT 프로테아제에 의한 RXhANP의 절단
융합 단백질 RShANP (도 21)의 OmpT 프로테아제 -AQFR↓SLRR-이 -AQFRXLRR (여기서, X는 아르기닌, 알라닌 또는 시스테인임)로 전환된 융합 단백질 RXhANP (도 23)을, pH 7.0, 37℃에서 2시간 동안 OmpT 프로테아제로 처리하였다. 도 24는 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸다.
기질로서 PRR, PRA 및 PRC를 사용하는 경우와 유사하게, OmpT 프로테아제에 의한 절단이 RRhANP, RAhANP 및 RChANP에서 관찰되었다. 절단 부위를 동정하기 위하여, OmpT 프로테아제 처리 후 펩티드 절단 생성물을 HPLC로 단리하고, N-말단 아미노산 서열을 결정하였다. 이렇게 동정된 OmpT 프로테아제 절단 부위를 표 3에 열거하였다. 표 3에 나타낸 바와 같이, RRhANP, RAhANP 및 RChANP를 -AQFRK↓XLRR- 에서 OmpT 프로테아제로 각각 절단하였다. 또한, 융합 단백질 PRX에서의 결과를 또한 고려하면, OmpT 프로테아제 절단 부위 부근의 아미노산 서열이 변경된 경우에 하나의 염기성 아미노산을 포함하는 OmpT 프로테아제 절단 부위가 존재한다는 것이 암시된다.
본 실시예에 있어서, 28개의 아미노산으로 구성된 α-hANP 분자에 존재하는 4개의 부위 (아르기닌-아르기닌, 아르기닌-메티오닌, 아르기닌-이소루이신 및 아르기닌-티로신) 중, 아르기닌-아르기닌만이 조금 절단되었으며, 반면, 다른 결합은 거의 절단되지 않았다. 이러한 사실은, 지금까지 보고된 절단 서열 및 본 발명자들에 의해 제안된 절단 서열 (즉, 아르기닌-X 또는 리신-X (여기서, X는 아스파르트산 및 글루탐산 (산성 아미노산) 및 프롤린 (이미노산) 이외의 17개의 아미노산 중 하나임) 단독으로는 OmpT 프로테아제에 의해 충분히 절단되지 않음을 암시하는 것이다. 즉, 본 발명자들에 의해 수행된 바와 같이, 상기 효소의 공지된 절단 부위를 포함하는 영역을 사용하여 신규한 절단 부위를 만드는 방법이 공업적으로 유용하다는 것이 나타났다.
실시예 12: 융합 단백질 PRRXA의 제조
상기한 바와 같이, OmpT 프로테아제는 아르기닌-X 또는 리신-X (여기서, X는 아스파르트산 및 글루탐산 (산성 아미노산) 및 프롤린 (이미노산) 이외의 17개의 아미노산 중 하나임)의 중심 부위를 절단한다는 것이 지적되었다. 그러나, OmpT 프로테아제는 단백질 및 펩티드에 있어서, 상기 결합 모두를 항상 절단하는 것은 아니다. OmpT 프로테아제에 의한 절단은 절단 부위 근처의 아미노산 서열에 의해 크게 영향을 받는 것으로 측정되었다. 차라리, 상기 효소는, 예외적으로 특정 부위를 절단하기 때문에, 큰 기질 특이성을 갖는 것으로 여겨진다. 본 발명자들은, 상기 효소의 기질 특이성이 상기 효소의 공지된 절단 부위의 N-말단 부위의 아미노산 서열의 효과를 조사함으로써 더 명확해질 수 있을 것으로 기대하여, 하기 실험을 수행하였다.
OmpT 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 구조를 가지는 융합 단백질 PRR (도 25에 예시됨)은 대장균 β-갈락토시다아제 및 사람 글루카곤 유사 펩티드 -1 (GLP-1[G])로부터 117개의 아미노산에서 시작하는 보호 단백질 (β-gal117S4H)로 구성된다. 도 25에 예시한 바와 같이, 융합 단백질 PRR의 링커 펩티드에 존재하는 OmpT 프로테아제 절단 부위 -QMHGYDAELRLYR↓RHHG-의 -10- 내지 -1- 위치 (즉, GYDAELRLYR)의 아미노산 서열의 아미노산이 하나씩 알라닌으로 전환된 융합 단백질 PRRXA (여기서, X는 절단 부위의 아미노산의 위치에 해당하며, -7을 제외하고, -1, -2 ----- -10으로 나타내어짐)을 제조하여, OmpT 프로테아제에 의한 상기 융합 단백질의 절단을 조사하였다.
융합 단백질 PRRXA를 하기 2단계로 제조하였다.
(단계 1) pG117ompPRRXA의 구축 (도 26, 27, 28, 29)
융합 단백질 PRRXA의 발현 플라스미드를 pG117ompPRRXA로 칭하였다 (융합 단백질 PRRXA에 상응). 그러나, -7 위치의 알라닌은 치환하지 않았다. 상기 치환은 pG117ompPRR 내로 DNA 돌연변이를 도입함으로써 수행하였다.
돌연변이를 유발하기 위하여 PCR 방법을 사용하였다. 도 26에 나타낸 바와 같이, pG117ompPRR-3A를 주형으로 사용하고,
Figure 112000023250376-pct00011
,
Figure 112000023250376-pct00012
,
Figure 112000023250376-pct00013
,및
Figure 112000023250376-pct00014
를 프라이머로 사용하여 플라스미드 pG117ompPRR-2A, pG117ompPRR-3A 및 pG117ompPRR-4A를 구축하였다. 프라이머 P10/P25, P10/P26 및 P10/P27의 조합을 사용하여 얻은 PCR 산물을 SacI 및 KpnI으 로 절단하여 각각의 조합의 각각의 0.1 kbp의 단편 (단편 33)을 얻었다. 이와는 별도로, pG117omoPRR을 BglII 및 SacI으로 절단하여 0.2 kbp의 단편 (단편 34)를 얻었다. Pg117ompPRR을 BglII 및 KpnI으로 절단하여 얻은 3.2 kbp 단편 (단편 35)에 상기 단편 33 및 34를 라이게이션시키고, 형질전환을 수행하였다. 이렇게 얻은 각각의 클론으로부터 플라스미드를 단리하였다.
도 27에 나타낸 바와 같이, 주형으로 pG117ompPRR을 사용하고, 프라이머로 P10,
Figure 112000023250376-pct00015
,및
Figure 112000023250376-pct00016
를 사용하여 발현 플라스미드 pG117ompPRR-5A 및 pG117ompPRR-6A를 구축하였다. 프라이머 P10/P28 및 P10/P29의 조합을 사용하여 얻은 PCR 산물을 NsiI 및 KpnI으로 절단하여 각각의 조합의 0.1 kbp 단편 (단편 36)을 얻었다. 이와는 별도로, pG117ompPRR을 NsiI 및 KpnI으로 절단하여 3.4 kbp 단편 (단편 37)을 얻었다. 상기 단편 36 및 37을 함께 라이게이션하여 형질전환을 수행하였다. 이렇게 얻은 각각의 클론으로부터 플라스미드를 단리하였다.
또한, 발현 플라스미드 pG117ompPRR-8A, pG117ompPRR-9A, 및 pG117ompPRR-10A를 도 28에 나타낸 바와 같이 구축하였다. pG117ompPRR을 주형으로 사용하고,
Figure 112000023250376-pct00017
를 프라이머로 사용하였다. 프라이머 P3/P30, P3/P31 및 P3/P32의 조합에 의해 얻 은 PCR 산물을 SacI 및 BglII로 절단하여 0.2 kbp의 단편 (단편 38)을 각각의 조합에서 얻었다. 이와는 별도로, pG117ompPRR을 KpnI 및 SacI으로 절단하여 0.1 kbp의 단편 (단편 39)를 얻었다. pG117ompPRR을 BglII 및 KpnI으로 절단함으로써 얻은 3.2 kbp의 단편 (단편 40)에 상기 단편 38 및 39를 라이게이션시키고, 형질전환을 수행하였다. 이렇게 얻은 각각의 클론으로부터 플라스미드를 단리하였다.
도 29에 나타낸 바와 같이, pG117ompPRR을 주형으로 사용하고, P10 및
Figure 112000023250376-pct00018
를 프라이머로 사용하여 pG117ompPRR-1A를 구축하였다. 프라이머 P10/P33의 조합으로 얻은 PCR 산물을 SacI으로 절단하여 0.1 kbp의 단편 (단편 41)을 얻었다. 이와는 별도로, pG117ompPRR을 SacI으로 절단하여 3.4 kbp의 단편 (단편 42)를 얻었다. 상기 단편 41 및 42를 함께 라이게이션하고, 형질전환을 수행하였다. 이렇게 얻은 각각의 클론으로부터 플라스미드를 단리하였다.
이렇게 구축한 상기 발현 플라스미드 모두에 대하여 제한효소 분석 및 돌연변이 부위에서의 뉴클레오티드 서열결정을 수행하여 표적 융합 단백질 PRRXA의 발현 플라스미드임을 확인하였다.
(단계 2) 융합 단백질 PRR 및 PRRXA의 제조
대장균에서 pG117ompPRR 및 pG117ompPRR를 발현시킬 경우, 융합 단백질 PRR 및 PRRXA는 봉입체로 발현된다. 대장균에서 OmpT 프로테아제가 발현되는 경우, 봉입체는 단지 우레아에 용해됨으로써 OmpT 프로테아제에 의해 절단된다. 따라서, 이러한 절단을 피하기 위하여, pG117ompPRR 및 pG117ompPRRXA로, OmpT 프로테아제 결핍 대장균 균주 W3110 M25를 형질전환시켰으며, 이와 같이 하여 융합 단백질 PRR 및 PRRXA를 봉입체의 형태로 제조하였다.
실시예 13: OmpT 프로테아제에 의한 융합 단백질 PRR 및 PRRXA의 절단
pH 7.0, 25℃에서, PRR 및 PRRXA를 정제 OmpT 프로테아제 시료와 60분 동안 반응시켰다. 효소 반응의 완료 후, SDS-PAGE 분석을 수행하였다. 결과를 도 30에 나타낸다.
PRR-1A는 OmpT 프로테아제에 의해 절단되지 않았다 (도 30, 레인 1A). PRR-1A 이외의 융합 단백질에서 OmpT 프로테아제에 의한 절단이 확인되었지만, 상기 절단에 의해 형성된 4.9 kDa의 펩티드 단편의 양은 단백질마다 달랐다.
4.9 kDa의 펩티드 단편을 정량화하기 위하여, 상기 OmpT 프로테아제 반응의 액체 반응 혼합물에 대하여 HPLC를 수행하였다. PRR-1A 이외의 융합 단백질 각각의 OmpT 프로테아제 반응물에 있어서, 8.8분의 체류 시간에서 피크가 검출되었다. PRR에서 검출된 8.8분에서의 상기 피크의 N-말단 아미노산 서열을 결정하였으며, -QMHGYDAELRLYR↓RHHG-에서의 절단에 의해 형성된 4.9 kDa의 펩티드 단편으로 확인되었다 (표 4). 따라서, 각각의 융합 단백질을 OmpT 프로테아제와 반응시킴으로써 형성된 8.8분에서의 피크는 4.9 kDa 펩티드 단편에 상응한다고 생각된다.
8.8분의 체류 시간에서의 피크의 상대적인 면적은, 절단에 의해 형성된 4.9 kDa의 펩티드 단편의 양을 나타낸다. 표 4는 PRR의 경우의 양을 100으로 하여 계산된 4.9 kDa의 펩티드 단편의 상대적인 양의 데이터를 나타낸다. PRR-1A를 제외하고, PRR-4A에서는 4.9 kDa 펩티드 단편이 가장 적은 양으로 나타났고, PRR-6A에 서는 가장 크게 나타났다. 상기 결과에 기초하여, -4- 및 -6-위치 (-1- 위치 제외)가 OmpT 프로테아제에 의한 절단에 가장 크게 영향을 주는 것으로 여겨진다.
Figure 112000023250376-pct00019
4.9 kDa 펩티드는 OmpT 프로테아제에 의한 융합 단백질 절단에 의해 형성된다. PRR의 4.9 kDa 펩티드의 양은 100으로 한다. ND는 검출할 수 없음을 의미한다.
실시예 14: 융합 단백질 PRR-4X 및 PRR-6X의 제조
OmpT 프로테아제는 주로 염기성 아미노산 페어를 인식하여 절단하는 엔도프로테아제이다. 염기성 아미노산 페어를 인식하여 절단 (염기성 아미노산 페어의 C-말단 측을 절단함)하는 엔도프로테아제인 포유류 푸린의 기질 특이성은 상세하게 연구되었으며, 푸린이 절단 부위와 관련하여 -1- 위치의 아르기닌 및 -2-, -4- 및 -6-위치의 염기성 아미노산을 인식한다고 보고되어 있다.
실시예 13의 결과에 의하면, -4-위치의 염기성 아미노산인 아르기닌을 알라닌으로 치환하면, OmpT 프로테아제에 의한 절단이 어려워지며, 반면, -6-위치의 산성 아미노산인 글루탐산을 알라닌으로 치환하면 OmpT 프로테아제에 의한 절단이 촉진된다는 것이 나타났다.
이러한 사실을 기초로하여, OmpT 프로테아제에 의한 절단이 절단 부위의 -6- 및 -4-위치의 아미노산 상의 전하에 의해 영향을 받을 수 있다고 가정하였다. 따라서, 상기 위치의 아미노산을 아르기닌 및 리신 (염기성 아미노산), 아스파르트산 및 글루탐산 (산성 아미노산) 및 아스파라긴 및 글루타민 (산성 아미노산과 구조가 유사한 중성 아미노산)으로 치환된 융합 단백질을 형성함으로써 OmpT 프로테아제에 의한 절단을 조사하였다.
-4- 위치에서 치환된 융합 단백질을 PRR-4X (도 31)로 칭하고, 반면, -6- 위치에서 치환된 융합 단백질을 PRR-6X (도 32)로 칭하였다 (여기서, X는 -4- 및 -6-위치의 1문자 아미노산을 나타냄). 융합 단백질 PRR-4X 및 PRR-6X를 하기 2단계로 제조하였다.
(단계 1) pG117ompPRR-4X 및 pG117ompPRR-6X의 구축 (도 33 및 34)
융합 단백질 PRR의 OmpT 프로테아제 절단 부위 -QMHGYDAELRLYR↓RHHG-의 -4-위치의 아르기닌이 리신 (염기성 아미노산), 아스파르트산 또는 글루탐산 (산성 아미노산) 또는 아스파라긴 또는 글루타민 (산성 아미노산과 구조 면에서 유사한 중 성 아미노산)으로 치환된 융합 단백질 PRR-4X의 발현 플라스미드를 pG117ompPRR-4X로 지칭하고, 반면, -6-위치의 글루탐산이 동일한 방식으로 치환된 융합 단백질 PRR-6X의 발현 플라스미드를 pG117ompPRR-6X로 지칭하였다. 상기 치환은 pG117ompPRR 내로 DNA 돌연변이를 도입함으로써 수행하였다.
돌연변이를 PCR로 도입하였다. 발현 플라스미드 pG117ompPRR-4K, pG117ompPRR-4D, pG117ompPRR-4E, pG117ompPRR-4N, 및 pG117ompPRR-4Q를 도 33에 나타낸 방법으로 구축하였다. pG117ompPRR을 주형으로 사용하고, 반면 P10,
Figure 112000023250376-pct00020
,
Figure 112000023250376-pct00021
,
Figure 112000023250376-pct00022
,
Figure 112000023250376-pct00023
,및
Figure 112000023250376-pct00024
을 프라어머로 사용하였다. 프라이머 P10/P34, P10/P35, P10/P36, P10/P37 및 P10/P38의 조합을 사용한 PCR 산물로서, 0.3 kbp 단편 (단편 43)을 얻었다. pG117ompPRR을 주형으로 사용하고, P3 및 단편 43을 프라이머로 사용하여 PCR을 다시 수행하여 0.8 kbp 단편 (단편 44)를 얻었다. 단편 44를 NsiI 및 KpnI으로 절단함으로써 얻은 0.1 kbp 단편 (단편 45)를, pG117ompPRR을 NsiI 및 KpnI으로 절단함으로써 얻은 3.4 kbp 단편 (단편 46)에 라이게이션시키고, 형질전환을 수행하였다. 이렇게 얻은 각각의 클론으로부터 플라스미드를 단리하였다.
도 34에 나타낸 바와 같이, pG117ompPRR을 주형으로 사용하고, P10,
Figure 112000023250376-pct00025
,
Figure 112000023250376-pct00026
,
Figure 112000023250376-pct00027
,
Figure 112000023250376-pct00028
,및
Figure 112000023250376-pct00029
을 프라이머로 사용하여, 발현 플라스미드 pG117ompPRR-6R, pG117ompPRR-6K, pG117ompPRR-6D, pG117ompPRR-6N 및 pG117ompPRR-6Q를 구축하였다. 프라이머 P10/P39, P10/P40, P10/P41, P10/P42 및 P10/P43의 조합을 사용하여 얻은 PCR 산물을 NsiI 및 KpnI으로 절단하여 0.1 kbp의 단편 (단편 46)을 얻었다. 또한, pG117ompPRR을 NsiI 및 KpnI으로 절단하여 3.4 kbp의 단편 (단편 47)을 얻었다. 상기 단편 46 및 47을 함께 라이게이션시키고, 형질전환을 수행하였다. 이렇게 얻은 각각의 클론으로부터 플라스미드를 단리하고, 돌연변이 부위에서 제한효소 분석 및 뉴클레오티드 서열결정을 수행하였다. 이와 같이 하여, 상기 플라스미드를 표적 융합 단백질 PRR-4X 및 PRR-6XX의 발현 플라스미드 pG117ompPRR-4X 및 pG117ompPRR-6X로 동정하였다.
(단계 2) 융합 단백질 PRR-4X 및 PRR-6X의 제조
pG117ompPRR-4X 및 pG117ompPRR-6X를 대장균에서 발현시킬 경우, 융합 단백질 PRR-4X 및 PRR-6X (도 31 및 32)는 봉입체로 발현된다. OmpT 프로테아제를 대장균에서 발현시키는 경우, 상기 봉입체는 단순히 우레아로 용해시킴으로써 OmpT 프로테아제에 의해 절단된다. 따라서, 이러한 절단을 피하기 위하여, pG117ompPRR-4X 및 pG117ompPRR-6X로 OmpT 프로테아제-결핍 대장균 균주 W3110M25 를 형질전환시켜, 융합 단백질 PRR-4X 및 PRR-6X를 봉입체의 형태로 제조하였다.
실시예 15: OmpT 프로테아제에 의한 융합 단백질 PRR-4X 및 PRR-6X의 절단
25℃, pH 7.0에서, PRR-4X를 정제 OmpT 프로테아제와 60분 동안 반응시켰다. 효소 반응 후, SDS-PAGE 분석을 수행하였다. - 가 OmpT 프로테아제가 없는 레인을 나타내고, + 가 OmpT 프로테아제 (2.0 U/ml)가 첨가된 레인을 나타내는 결과를 도 35A에 예시하였다.
OmpT 프로테아제에 의한 절단이 모든 융합 단백질에서 관찰되었지만, 절단에 의해 형성된 4.9 kDa 펩티드 단편의 양은 단백질마다 달랐다.
이어서, 4.9 kDa 펩티드 단편을 HPLC를 사용하여 정량화하였다. OmpT 프로테아제를 첨가하는 경우, 피크는 8.8분의 체류 시간에서 검출되었다. 실시예 13에 기술된 바와 같이, 상기 피크는 4.9 kDa 펩티드 단편에 해당하는 것이었다.
표 5는 PRR의 경우의 양을 100으로 하여 계산한 4.9 kDa 펩티드 단편의 상대적인 양의 데이터를 나타낸다. 절단에 의해 형성된 펩티드 단편의 상대적인 양은 PRR의 2 내지 3% (PRR-4D 및 PRR-4E), 또는 20 내지 50% (PRR-4A, PRR-4N 및 PRR-4Q) 또는 PRR과 거의 비견할 만하였다 (PRR-4K). 상기 결과에 기초하여, OmpT 프로테아제는 -4-위치의 아미노산의 전하를 인식한다고 생각된다.
Figure 112000023250376-pct00030
4.9 kDa 펩티드는 OmpT 프로테아제에 의한 융합 단백질의 절단에 의해 형성된다. PRR의 4.9 kDa 펩티드의 양은 100으로 한다. PRR은 -4-위치에서 Arg를 보유한다.
도 32에 나타낸 바와 같이, 융합 단백질 PRR의 -6-위치에서 글루탐산이 치환된 융합 단백질 PRR-6X를 사용하여 OmpT 프로테아제에 의한 절단을 더 조사하였다. 25℃, pH 7.0에서 PRR-6X를 정제 OmpT 프로테아제와 60분 동안 반응시켰다. 효소 반응 후에, SDS-PAGE 분석을 수행하였다. - 가 OmpT 프로테아제가 없는 레인을 나타내고, + 가 OmpT 프로테아제 (0.1 U/ml)가 첨가된 레인을 나타내는 결과를 도 35B에 예시하였다.
OmpT 프로테아제에 의한 절단이 모든 융합 단백질에서 관찰되었지만, 절단에 의해 형성된 4.9 kDa 펩티드 단편의 양은 PRR-4X의 경우와 유사하게 단백질마다 달랐다.
이어서, 4.9 kDa 펩티드 단편을 HPLC를 사용하여 정량화하였다. 표 6은 PRR의 경우의 양을 100으로 하여 계산한 4.9 kDa 펩티드 단편의 상대적인 양의 데이터를 나타낸다. 절단에 의해 형성된 펩티드 단편의 상대적인 양은 PRR과 거의 비견할만하거나 (PRR-6D), PRR의 약 3 내지 4배 (PRR-6A, PRR-6N 및 PRR-6Q) 또는 PRR의 약 10배 (PRR-6R 및 PRR-6K)였다. 상기 결과에 기초하여, OmpT 프로테아제는 또한 -6-위치의 아미노산의 전하도 인식한다고 생각된다.
Figure 112000023250376-pct00031
4.9 kDa 펩티드는 OmpT 프로테아제에 의한 융합 단백질의 절단에 의해 형성된다. PRR의 4.9 kDa 펩티드의 양은 100으로 한다. PRR은 -6-위치에서 Glu를 보유한다.
상기 결과는, 기질의 절단 부위에 있어서, OmpT 프로테아제가 -4- 및 -6-위치의 아미노산을 인식하며, 상기 위치의 아미노산이 염기성 아미노산일 경우에는 절단 비가 상승하지만, 상기 위치의 아미노산이 산성 아미노산일 경우에는 저하된다는 것을 암시한다.
실시예 16: OmpT 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 서열에의 적용
실시예 15의 결과에 기초하여, OmpT 프로테아제의 절단 효율은, 공지된 OmpT 프로테아제 절단 부위의 -4- 및 -6-위치의 아미노산을 염기성 아미노산으로 전환시킴으로써 상승시킬 수 있다고 가정하였다. 이러한 견지에서, OmpT 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 구조를 가지며 따라서 α-hANP를 방출하는 융합 단백질 RShANP (도 21)의 OmpT 프로테아제 절단 부위의 -4- 및 -6-위치의 아미노산을 아르기닌 (염기성 아미노산)으로 치환함으로써 융합 단백질 RShANPR (도 36)을 형성하고, 이어서, OmpT 프로테아제에 의한 절단에 있어서, 상기 융합 단백질이 서로 다른지의 여부를 하기 3단계로 조사하였다.
(단계 1) pGRShANPR의 구축 (도 37)
융합 단백질 RShANP의 OmpT 프로테아제 절단 부위 -QMHGYDAQFR↓SLRR-의 -4-위치의 알라닌 및 -6-위치의 티로신을 각각 아르기닌으로 치환한 융합 단백질 RShANPR의 발현 플라스미드를 pGRShANPR로 지칭하였다. 상기 전환은, DNA 돌연변이를 pGRShANP로 도입함으로써 수행하였다.
DNA 돌연변이를 PCR로 도입하였다. 도 37에 나타낸 바와 같이, pGRShANP를 주형으로 사용하고, P10 및
Figure 112000023250376-pct00032
를 프라이머로 사용하였다. 프라이머 P10/P44의 조합을 사용한 PCR 산물로서, 0.3 kbp의 단편 (단편 48)을 얻었다. 이어서, pGRShANP를 주형으로 사용하고, P3 및 단편 48을 프라이머로 사용하여 PCR을 다시 수행함으로써 0.6 kbp의 단편 (단편 49)를 얻었다. 단편 49를 BglII 및 EcoRI으로 절단하여 얻은 0.2 kbp의 단편 (단편 50)과, pGRShANP를 BglII 및 EcoRI으로 절단하여 얻은 3.0 kbp의 단편 (단편 51)을 라이게이션시키고, 형질전환을 수행하였다. 이와 같이 얻은 각각의 클론으로부터 플라스미드를 단리하고, 돌연변이 부위에서 제한효소 분석 및 뉴클레오티드 서열결정을 수행하여, 표적 융합 단백질 RShANPR의 발현 플라스미드 pGRShANPR로서 동정하였다.
(단계 2) 융합 단백질 RShANP 및 RShANPR의 제조
pGRShANP 및 pGRShANPR을 대장균에서 발현시킬 경우, 융합 단백질 RShANP 및 RShANPR (도 36)은 봉입체로 발현된다. 대장균에서 OmpT 프로테아제가 발현되는 경우, 상기 봉입체는 단지 우레아에 의한 용해에 의해 OmpT 프로테아제에 의해 절단된다. 따라서, 절단을 피하기 위하여, OmpT 프로테아제 결핍 대장균 균주 W3110 M25를 pGRShANP 및 pGRShANPR로 형질전환시켰으며, 이와 같이 하여 융합 단백질 RShANP 및 RShANPR을 봉입체의 형태로 제조하였다.
(단계 3) OmpT 프로테아제에 의한 융합 단백질 RShANP 및 RShANPR의 절단
25℃, pH 7.0에서 RShANP 및 RShANPR을 정제 OmpT 프로테아제와 90분 동안 반응시켰다. 효소 반응의 완료 후, 이와 같이 방출된 펩티드 단편을 HPLC로 정량화하였다. OmpT 프로테아제 (2.0 U/ml)을 첨가하는 경우, 피크는 4.7분의 체류 시 간에서 검출되었다. 상기 피크를 단리하여 N-말단 아미노산 서열을 결정하였더니, α-hANP로 동정되었다.
RShANPR의 4.7분의 체류 시간에서의 상대적인 피크 면적 (즉, 방출된 α-hANP의 상대적인 양)은 RShANP의 양의 2.2배였다. 상기 결과에 기초하여, 효율적인 OmpT 프로테아제에 의한 절단은, 공지된 OmpT 프로테아제 절단 부위의 -6- 및 -4-위치의 아미노산을 염기성 아미노산 (상기의 경우, 아르기닌)으로 전환시킴으로써 상승될 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명에 따른 방법의 한 측면에 있어서, 특정 아미노산 서열에 위치한 아르기닌-X 및 리신-X (여기서, X는 글루탐산, 아스파르트산 또는 프롤린 이외의 아미노산을 나타냄) 사이의 결합을 배타적으로 절단하는 고도로 특이적인 효과를 나타내는 OmpT 프로테아제의 특성을 이용한다. 따라서, OmpT 프로테아제를 사용하면, 예를 들어 유전공학적 기술에 의해 발현되는 융합 단백질로부터 표적 펩티드를 적출하는 경우에 있어서, N-말단 아미노산으로서 글루탐산, 아스파르트산 또는 프롤린 이외의 아미노산으로부터 구축하는 펩티드를 선발하고, +1-위치의 아미노산을 글루탐산, 아스파르트산 또는 프롤린으로 전환시킴으로써 원하지 않는 펩티드 결합의 절단을 피하는 것이 가능해진다.
본 발명에 따른 방법의 다른 측면에 있어서, -6- 및 -4-위치의 아미노산의 전하를 인식하는 OmpT 프로테아제의 다른 특성을 이용한다. 상기 경우와 유사하게 유전공학적 기술에 의해 발현되는 융합 단백질로부터 표적 펩티드를 적출해 내는 경우, 절단 비는 -6- 및 -4-위치의 아미노산을 염기성 아미노산으로 전환시킴으로써 상승시킬 수 있으며, 원하지 않는 펩티드 결합에서의 절단은 -6- 및 -4-위치의 아미노산을 산성 아미노산으로 전환시킴으로써 최소화할 수 있다. 융합 단백질을 봉입체로 발현시킬 경우, OmpT 프로테아제는 봉입체와 함께 회수된다. 따라서, 본 발명은 대장균을 숙주로 사용하는 경우, 특히 효과적이다.
<110> SUNTORY LIMITED <120> METHOD FOR CONTROLLING CLEAVAGE BY OmpT PROTEASE <150> JP Hei 11-057731 <151> 1999-03-04 <160> 124 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OmpT protease cleavage site <400> 1 Arg Leu Tyr Arg Arg His His Gly 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Xaa represents one of the 20 amino acids <400> 2 Arg Leu Tyr Arg Xaa His His Gly 1 5 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (Pl) <400> 3 gactcagatc ttcctgaggc cgat 24 <210> 4 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (P2) <400> 4 aaaggtacct tccgcatgcc gcggatgtcg agaagg 36 <210> 5 <211> 184 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion protein <400> 5 Met Thr Met Ile Thr Asp Ser Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Lys Asp 1 5 10 15 Trp Glu Asn Pro Gly Val Thr Gln Leu Asn Arg Leu Ala Ala His Pro 20 25 30 Pro Phe Ala Ser Trp Arg Asn Ser Asp Asp Ala Arg Thr Asp Arg Pro 35 40 45 Ser Gln Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gly Glu Trp Arg Phe Ala Trp Phe 50 55 60 Pro Ala Pro Glu Ala Val Pro Glu Ser Leu Leu Asp Leu Pro Glu Ala 65 70 75 80 Asp Thr Val Val Val Pro Asp Ser Ser Asn Trp Gln Met His Gly Tyr 85 90 95 Asp Ala Pro Ile Tyr Thr Asn Val Thr Tyr Pro Ile Thr Val Asn Pro 100 105 110 Pro Phe Val Pro Thr Glu Pro His His His His Pro Gly Gly Arg Gln 115 120 125 Met His Gly Tyr Asp Ala Glu Leu Arg Leu Tyr Arg Arg His His Gly 130 135 140 Ser Gly Ser Pro Ser Arg His Pro Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr 145 150 155 160 Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile 165 170 175 Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 180 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (P3) <400> 6 accccaggct ttacacttta 20 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (P4X) nnn:AGC for Ala,AAC for Val,CAG for Leu GAT forIle,CGG for Pro,GAA for Phe,CCA for Trp,CAT for Met,GCC for Gly,AGA for Ser,GGT for Thr,GCA for Cys,GTA for Tyr,GTT for Asn,CTG for Gln,GTC for Asp,TTC for Glu,TTT for Lys,ATG for His, ACG for Arg <400> 7 ccggatccgt gatgnnngcg atacaggcg 29 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (P5) <400> 8 acggatccgg ttccccttat cgacatccg 29 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (P6) <400> 9 ttgcgcattc acagttctcc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (P7) <400> 10 gcgggtgttg gcgggtgtcg 20 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (P8) <400> 11 tgaattcttc ctgtgtgaaa ttgttat 27 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (P9) <400> 12 tgaattcaaa atgcgggcga aactgctggg 30 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (P10) <400> 13 tgccgaggat gacgatgagc 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (Pll) <400> 14 ctatcgtcgc cgcacttatg 20 <210> 15 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (Pl2) <400> 15 tgaattcttc ctgtctgtaa tttttatccg ctcacaatt 39 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OmpT protease cleavage site of fusion protein PRA <400> 16 Leu Tyr Arg Ala His His Gly Ser Gly 1 5 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OmpT protease cleavage site of fusion protein PRV <400> 17 Leu Tyr Arg Val His His Gly Ser Gly 1 5 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OmpT protease cleavage site of fusion protein PRL <400> 18 Leu Tyr Arg Leu His His Gly Ser Gly 1 5 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OmpT protease cleavage site of fusion protein PRI <400> 19 Leu Tyr Arg Ile His His Gly Ser Gly 1 5 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mpT protease non-cleavage site of fusion protein PRP <400> 20 Leu Tyr Arg Pro His His Gly Ser Gly 1 5 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OmpT protease cleavage site of fusion protein PRF <400> 21 Leu Tyr Arg Phe His His Gly Ser Gly 1 5 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OmpT protease cleavage site of fusion protein PRW <400> 22 Leu Tyr Arg Trp His His Gly Ser Gly 1 5 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OmpT protease cleavage site of fusion protein PRM <400> 23 Leu Tyr Arg Met His His Gly Ser Gly 1 5 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OmpT protease cleavage site of fusion protein PRG <400> 24 Leu Tyr Arg Gly His His Gly Ser Gly 1 5 <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OmpT protease cleavage site of fusion protein PRS <400> 25 Leu Tyr Arg Ser His His Gly Ser Gly 1 5 <210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OmpT protease cleavage site of fusion protein PRT <400> 26 Leu Tyr Arg Thr His His Gly Ser Gly 1 5 <210> 27 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OmpT protease cleavage site of fusion protein PRC <400> 27 Leu Tyr Arg Cys His His Gly Ser Gly 1 5 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OmpT protease cleavage site of fusion protein PRY <400> 28 Leu Tyr Arg Tyr His His Gly Ser Gly 1 5 <210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OmpT protease cleavage site of fusion protein PRN <400> 29 Leu Tyr Arg Asn His His Gly Ser Gly 1 5 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OmpT protease cleavage site of fusion protein PRQ <400> 30 Leu Tyr Arg Gln His His Gly Ser Gly 1 5 <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OmpT protease non-cleavage site of fusion protein PRD <400> 31 Leu Tyr Arg Asp His His Gly Ser Gly 1 5 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OmpT protease non-cleavage site of fusion protein PRE <400> 32 Leu Tyr Arg Glu His His Gly Ser Gly 1 5 <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OmpT protease cleavage site of fusion protein PRK <400> 33 Leu Tyr Arg Lys His His Gly Ser Gly 1 5 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OmpT protease cleavage site of fusion protein PRR <400> 34 Leu Tyr Arg Arg His His Gly Ser Gly 1 5 <210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OmpT protease cleavage site of fusion protein PRH <400> 35 Leu Tyr Arg His His His Gly Ser Gly 1 5 <210> 36 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Xaa represents alanine, serine, lysine, arginine, aspartic acid, and glutamic acid <400> 36 Arg Leu Tyr Lys Xaa His His Gly 1 5 <210> 37 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (Pl3X) nnn : agc when template is PG117ompPRA,aga when template is pGll7ompPRS, ttt when template is PGI17ompPRK, acg when template is pGll7ompPRR, gtc when template is pGll7ompPRD, and ttc when template is PG117ompPRE <400> 37 ccggatccgt gatgnnnttt atacaggcg 29 <210> 38 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OmpT protease cleavage site of fusion protein PKA <400> 38 Leu Tyr Lys Ala His His Gly Ser Gly 1 5 <210> 39 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OmpT protease cleavage site of fusion protein PKS <400> 39 Leu Tyr Lys Ser His His Gly Ser Gly 1 5 <210> 40 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OmpT protease cleavage site of fusion protein PKK <400> 40 Leu Tyr Lys Lys His His Gly Ser Gly 1 5 <210> 41 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OmpT protease cleavage site of fusion protein PKR <400> 41 Leu Tyr Lys Arg His His Gly Ser Gly 1 5 <210> 42 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OmpT protease non-cleavage site of fusion protein PKD <400> 42 Leu Tyr Lys Asp His His Gly Ser Gly 1 5 <210> 43 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OmpT protease non-cleavage site of fusion protein PKE <400> 43 Leu Tyr Lys Glu His His Gly Ser Gly 1 5 <210> 44 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (Pl4) <400> 44 gcggagctcc gcctgtatcg cagcctgcgg agatccagct g 41 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (Pl5) <400> 45 ctgagtcgac tcagtaccgg 20 <210> 46 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (Pl6) <400> 46 gcggagctcc gcctgtatcg ctgtggtaac ctgagcacct g 41 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (Pl7) <400> 47 ctgagtcgac ttagcccggg 20 <210> 48 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (Pl8) <400> 48 tacgatgcgc aattccgtag cctgcgg 27 <210> 49 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (Pl9) <400> 49 tgcctgactg cgttagcaat ttaactgtga t 31 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (P21) <400> 50 ttatcgccac tggcagcagc 20 <210> 51 <211> 129 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion protei <400> 51 Met Thr Met Ile Thr Asp Ser Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Arg Asp 1 5 10 15 Trp Glu Asn Pro Gly Val Thr Gln Leu Asn Arg Leu Ala Ala His Pro 20 25 30 Pro Phe Ala Ser Trp Arg Asn Ser Glu Glu Ala Arg Thr Asp Arg Pro 35 40 45 Ser Gln Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gly Glu Trp Arg Phe Ala Trp Phe 50 55 60 Pro Ala Pro Glu Ala Val Pro Glu Ser Leu Leu Glu Leu Pro Glu Ala 65 70 75 80 Asp Thr Val Val Val Pro Asp Ser Ser Asn Trp Gln Met His Gly Tyr 85 90 95 Asp Ala Gln Phe Arg Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg 100 105 110 Met Asp Arg Ile Gly Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg 115 120 125 Tyr <210> 52 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OmpT protease cleavage site of fusion protein RShANP <400> 52 Gln Phe Arg Ser Leu Arg Arg Ser 1 5 <210> 53 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OmpT protease cleavage site of fusion protein RRhANP <400> 53 Gln Phe Arg Arg Leu Arg Arg Ser 1 5 <210> 54 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OmpT protease cleavage site of fusion protein RAhANP <400> 54 Gln Phe Arg Ala Leu Arg Arg Ser 1 5 <210> 55 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OmpT protease cleavage site of fusion protein RChANP <400> 55 Gln Phe Arg Cys Leu Arg Arg Ser 1 5 <210> 56 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Xaa represents arginine, alanine or cystein <400> 56 Ala Gln Phe Arg Xaa Leu Arg Arg 1 5 <210> 57 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (P22X) nnn agc in case of converting into alanine,gca in case of converting into cysteine, acg in case of converting into arginine <400> 57 tctccgcagn nnacggaatt gcgcatcgta 30 <210> 58 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (P23X) nnn gct in case of converting into alanine,tgc in case of converting into cysteine, cgt in case of converting into arginine <400> 58 caattccgtn nnctgcggag atccagctgc 30 <210> 59 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (P24) <400> 59 gcctgactgc gttagcaatt taactgtgat 30 <210> 60 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 60 Pro Ser Arg His Lys Arg 1 5 <210> 61 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 61 Gln Met His Gly Tyr Asp Ala Glu Leu Arg Leu Tyr Arg Arg His His 1 5 10 15 Arg Trp Gly Arg Ser Gly Ser 20 <210> 62 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 62 Gln Met His Gly Tyr Asp Ala Glu Leu Arg Leu Tyr Arg Arg His 1 5 10 15 <210> 63 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 63 Pro Ser Arg His Pro Arg 1 5 <210> 64 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 64 Gln Met His Gly Tyr Asp Ala Glu Leu Arg Leu Tyr Arg Arg His His 1 5 10 15 Gly Ser Gly Ser Pro Ser Arg His Pro Arg 20 25 <210> 65 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 65 aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aagaattcat gcgggcgaaa ctt 53 <210> 66 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 66 aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aagaattcaa aatgcgggcg aaactg 56 <210> 67 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 67 aattgtgagc ggataaaaat tacagacagg aagaattcat gcgggcgaaa ctt 53 <210> 68 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 68 aattgtgagc ggataaaaat tacagacagg aagaattcaa aatgcgggcg aaactg 56 <210> 69 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 69 Gln Phe Lys 1 <210> 70 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 70 Gln Met His Gly Tyr Asp Ala Glu Leu Arg Leu Tyr Arg Arg His His 1 5 10 15 Gly Ser Gly Ser Pro Tyr Arg His Pro Arg 20 25 <210> 71 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 71 Gln Met His Gly Tyr Asp Ala Glu Leu Arg Leu Tyr Arg 1 5 10 <210> 72 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 72 Glu Phe Arg His His Arg Arg His Arg Leu Glu 1 5 10 <210> 73 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 73 Gln Phe Arg 1 <210> 74 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 74 cagatgcatg gttatgacgc ggagctccgg ctgtatcgcc gtcatcaccg gtggggtcgt 60 tccggatcc 69 <210> 75 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 75 ggatccggaa cgaccccacc ggtgatgacg gcgatacagc cggagctccg cgtcataacc 60 atgcatctg 69 <210> 76 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 76 tggttatgac gcggagctcc gcctgtatcg ccgtcatcac ggttccg 47 <210> 77 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 77 gatccggaac cgtgatgacg gcgatacagg cggagctccg cgtcataacc atgca 55 <210> 78 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OmpT protease cleavage site in the linker peptide of PRR <400> 78 Gln Met His Gly Tyr Asp Ala Glu Leu Arg Leu Tyr Arg Arg His His 1 5 10 15 Gly <210> 79 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence from -10- to -1-positions of the OmpT protease cleavage site in the linker peptide of PRR which was modified in Example 12 for the preparation of fusion protein PRRXA <400> 79 Gly Tyr Asp Ala Glu Leu Arg Leu Tyr Arg 1 5 10 <210> 80 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (P25) <400> 80 gcggagctcc gcctggctcg ccgtcatcac 30 <210> 81 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (P26) <400> 81 gcggagctcc gcgcttatcg ccgtcatcac 30 <210> 82 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (P27) <400> 82 gcggagctcg ctctgtatcg ccgtcatcac 30 <210> 83 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (P28) <400> 83 cagatgcatg gttatgacgc ggaggctcgc 30 <210> 84 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (P29) <400> 84 cagatgcatg gttatgacgc ggctctgcgc 30 <210> 85 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (P30) <400> 85 gcggagctcc gcagcataac catgcatctg 30 <210> 86 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (P31) <400> 86 gcggagctcc gcgtcagcac catgcatctg 30 <210> 87 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (P32) <400> 87 gcggagctcc gcgtcataag catgcatctg 30 <210> 88 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (P33) <400> 88 gcggagctcc gcctgtatgc tcgtcatcac 30 <210> 89 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (P34) <400> 89 gcggagctca aactgtatcg ccgtcatcac 30 <210> 90 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (P35) <400> 90 gcggagctcg acctgtatcg ccgtcatcac 30 <210> 91 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (P36) <400> 91 gcggagctcg aactgtatcg ccgtcatcac 30 <210> 92 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (P37) <400> 92 gcggagctca acctgtatcg ccgtcatcac 30 <210> 93 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (P38) <400> 93 gcggagctcc agctgtatcg ccgtcatcac 30 <210> 94 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (P39) <400> 94 cagatgcatg gttatgacgc gcgtctccgc 30 <210> 95 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (P40) <400> 95 cagatgcatg gttatgacgc gaaactccgc 30 <210> 96 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (P41) <400> 96 cagatgcatg gttatgacgc ggacctccgc 30 <210> 97 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (P42) <400> 97 cagatgcatg gttatgacgc gaacctccgc 30 <210> 98 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (P43) <400> 98 cagatgcatg gttatgacgc gcagctccgc 30 <210> 99 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OMPT protease cleavage site of RShANP <400> 99 Gln Met His Gly Tyr Asp Ala Gln Phe Arg Ser Leu Arg Arg 1 5 10 <210> 100 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (P44) <400> 100 atgcacggtc gtgatcgtca attccgtagc 30 <210> 101 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Partial sequence of PRR (Figs. 25, 31 and 32) <400> 101 Gly Tyr Asp Ala Glu Leu Arg Leu Tyr Arg Arg His His Gly 1 5 10 <210> 102 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Partial sequence of PRR-1A (Fig. 25) <400> 102 Gly Tyr Asp Ala Glu Leu Arg Leu Tyr Ala Arg His His Gly 1 5 10 <210> 103 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Partial sequence of PRR-2A (Fig. 25) <400> 103 Gly Tyr Asp Ala Glu Leu Arg Leu Ala Arg Arg His His Gly 1 5 10 <210> 104 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Partial sequence of PRR-3A (Fig. 25) <400> 104 Gly Tyr Asp Ala Glu Leu Arg Ala Tyr Arg Arg His His Gly 1 5 10 <210> 105 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Partial sequence of PRR-4A (Fig. 25) <400> 105 Gly Tyr Asp Ala Glu Leu Ala Leu Tyr Arg Arg His His Gly 1 5 10 <210> 106 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Partial sequence of PRR-5A (Fig. 25) <400> 106 Gly Tyr Asp Ala Glu Ala Arg Leu Tyr Arg Arg His His Gly 1 5 10 <210> 107 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Partial sequence of PRR-6A (Fig. 25) <400> 107 Gly Tyr Asp Ala Ala Leu Arg Leu Tyr Arg Arg His His Gly 1 5 10 <210> 108 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Partial sequence of PRR-8A (Fig. 25) <400> 108 Gly Tyr Ala Ala Glu Leu Arg Leu Tyr Arg Arg His His Gly 1 5 10 <210> 109 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Partial sequence of PRR-9A (Fig. 25) <400> 109 Gly Ala Asp Ala Glu Leu Arg Leu Tyr Arg Arg His His Gly 1 5 10 <210> 110 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Partial sequence of PRR-10A (Fig. 25) <400> 110 Ala Tyr Asp Ala Glu Leu Arg Leu Tyr Arg Arg His His Gly 1 5 10 <210> 111 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Partial sequence of PRR-4K (Fig. 31) <400> 111 Gly Tyr Asp Ala Glu Leu Lys Leu Tyr Arg Arg His His Gly 1 5 10 <210> 112 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Partial sequence of PRR-4A (Fig. 31) <400> 112 Gly Tyr Asp Ala Glu Leu Ala Leu Tyr Arg Arg His His Gly 1 5 10 <210> 113 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Partial sequence of PRR-4N (Fig. 31) <400> 113 Gly Tyr Asp Ala Glu Leu Asn Leu Tyr Arg Arg His His Gly 1 5 10 <210> 114 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Partial sequence of PRR-4Q (Fig. 31) <400> 114 Gly Tyr Asp Ala Glu Leu Gln Leu Tyr Arg Arg His His Gly 1 5 10 <210> 115 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Partial sequence of PRR-4D (Fig. 31) <400> 115 Gly Tyr Asp Ala Glu Leu Asp Leu Tyr Arg Arg His His Gly 1 5 10 <210> 116 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Partial sequence of PRR-4E (Fig. 31) <400> 116 Gly Tyr Asp Ala Glu Leu Glu Leu Tyr Arg Arg His His Gly 1 5 10 <210> 117 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Partial sequence of PRR-6R (Fig. 32) <400> 117 Gly Tyr Asp Ala Arg Leu Arg Leu Tyr Arg Arg His His Gly 1 5 10 <210> 118 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Partial sequence of PRR-6K (Fig. 32) <400> 118 Gly Tyr Asp Ala Lys Leu Arg Leu Tyr Arg Arg His His Gly 1 5 10 <210> 119 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Partial sequence of PRR-6A (Fig. 32) <400> 119 Gly Tyr Asp Ala Ala Leu Arg Leu Tyr Arg Arg His His Gly 1 5 10 <210> 120 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Partial sequence of PRR-6N (Fig. 32) <400> 120 Gly Tyr Asp Ala Asn Leu Arg Leu Tyr Arg Arg His His Gly 1 5 10 <210> 121 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Partial sequence of PRR-6Q (Fig. 32) <400> 121 Gly Tyr Asp Ala Gln Leu Arg Leu Tyr Arg Arg His His Gly 1 5 10 <210> 122 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Partial sequence of PRR-6D (Fig. 32) <400> 122 Gly Tyr Asp Ala Asp Leu Arg Leu Tyr Arg Arg His His Gly 1 5 10 <210> 123 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Partial sequence of RShANP (Fig. 36) <400> 123 Gln Met His Gly Tyr Asp Ala Gln Phe Arg Ser Leu Arg Arg 1 5 10 <210> 124 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Partial sequence of RShANPR (Fig. 36) <400> 124 Gln Met His Gly Arg Asp Arg Gln Phe Arg Ser Leu Arg Arg 1 5 10

Claims (69)

  1. 폴리펩티드 상에서 대장균 OmpT 프로테아제의 절단 효율을 상승시키기 위한 방법으로서, 두개의 임의의 연속 아미노산으로 이루어진 서열부위, 상기 폴리펩티드내 상기 서열부위 부근의 아미노산, 또는 상기 서열부위 및 이의 부근의 아미노산을,
    (1) 상기 서열부위에 대해 -1-위치의 아미노산으로서 리신 또는 아르기닌을 설정함 및 +1 위치의 아미노산으로서 글루탐산, 아스파르트산 또는 프롤린 외의 아미노산을 설정함; 또는 (2) 상기 서열부위에 대해 -4-위치 및 -6-위치 중 하나 또는 양자 모두의 아미노산으로서 산성 아미노산 외의 아미노산을 설정함; 또는 단계 (1) 및 (2)의 양자 모두
    로써 다른 아미노산으로 전환시키는 것을 포함하는 방법.
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  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 방법이 폴리펩티드 상의 -1 및 +1 위치의 상기 서열부위에서의 대장균 OmpT 프로테아제의 절단 효율을 상승시키기 위한 것이고, 상기 서열부위의 아미노산 및 이의 부근의 아미노산을,
    (1) 상기 서열부위의 -1-위치의 아미노산으로서 리신 또는 아르기닌을 설정함 및 +1-위치의 아미노산으로서 글루탐산, 아스파르트산 또는 프롤린 외의 아미노산을 설정함; 및 (2) 상기 서열부위에 대해 -4-위치 및 -6-위치 중 하나 또는 양자 모두의 아미노산으로서 산성 아미노산 외의 아미노산을 설정함
    으로써 다른 아미노산으로 전환시키는 것을 포함하는 방법.
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  18. 제 4 항에 있어서, -4-위치 및 -6-위치 중 하나 또는 양자 모두의 아미노산으로서 염기성 아미노산이 설정되는 방법.
  19. 삭제
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  21. 제 18 항에 있어서, 염기성 아미노산이 리신 또는 아르기닌인 방법.
  22. 폴리펩티드 상의 -1 및 +1 위치의 두개의 임의의 연속 아미노산으로 이루어진 서열부위에서의 대장균 OmpT 프로테아제의 절단 효율을 낮추기 위한 방법으로서, 상기 서열부위가 대장균 OmpT 프로테아제에 의하여 절단가능하고, 상기 방법이 상기 서열부위의 아미노산을,
    상기 서열부위의 -1-위치의 아미노산으로서 리신 또는 아르기닌을 설정함, 및 +1-위치의 아미노산으로서 글루탐산, 아스파르트산 또는 프롤린을 설정함
    으로써 다른 아미노산으로 전환시키는 것을 포함하는 방법.
  23. 삭제
  24. 절단 부위를 통해 또는 절단 부위를 포함하는 링커 펩티드를 통해 보호 펩티드와 융합된 표적 폴리펩티드로 이루어지고 대장균 OmpT 프로테아제에 의해 상기 절단 부위에서 절단가능한 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 숙주세포에서 발현시키는 것, 및 대장균 OmpT 프로테아제로 상기 절단 부위에서 단백질을 절단 분리시켜 상기 융합 단백질로부터 표적 폴리펩티드를 수득하는 것을 포함하는, 제 1 항, 제 4 항, 제 18 항, 제 21 항 또는 제 22 항 중 어느 한 항에 따른 대장균 OmpT 프로테아제의 절단 효율을 상승시키거나 낮추기 위한 방법.
  25. 제 24 항에 있어서, 대장균 OmpT 프로테아제에 의해 절단가능한 아미노산 서열이 상기 융합 단백질을 구성하는 보호 펩티드, 링커 펩티드 및 표적 폴리펩티드 중 하나 이상의 아미노산 서열에 존재하는 방법.
  26. 표적 폴리펩티드의 제조방법으로서, 절단 부위를 통해 또는 절단 부위를 포함하는 링커 펩티드를 통해 보호 펩티드와 융합된 표적 폴리펩티드로 이루어지고 대장균 OmpT 프로테아제에 의해 상기 절단 부위에서 절단가능한 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 숙주세포에서 발현시키는 것, 및 대장균 OmpT 프로테아제로 상기 절단 부위에서 단백질을 절단시켜 상기 융합 단백질로부터 표적 폴리펩티드를 수득하는 것을 포함하고, 상기 절단 부위의 아미노산, 상기 부위 부근의 아미노산, 또는 양자 모두가 제 1 항, 제 4 항, 제 18 항, 제 21 항 또는 제 22 항 중 어느 한 항에 기재된 바와 같이 전환되는 방법.
  27. 제 26 항에 있어서, 대장균 OmpT 프로테아제에 의해 절단가능한 아미노산 서열이 상기 융합 단백질을 구성하는 보호 펩티드, 링커 펩티드 및 표적 폴리펩티드 중 하나 이상의 아미노산 서열에 존재하는 방법.
  28. 제 1 항 또는 제 22 항에 있어서, 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 숙주세포에서 발현됨으로써, 상기 폴리펩티드가 대장균 OmpT 프로테아제에 의해 비목적 부분에서 절단가능한 방법.
  29. 폴리펩티드 제조 방법으로서, 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 숙주세포에서 발현시키는 것을 포함하고, 상기 폴리펩티드를 대장균 OmpT 프로테아제로 비목적 부분에서 절단하는 경우 아미노산이 제 1 항, 제 4 항, 제 18 항, 제 21 항 또는 제 22 항 중 어느 한 항에 기재된 바와 같이 전환되는 방법.
  30. 제 24 항에 있어서, 숙주 세포가 대장균인 방법.
  31. 제 24 항에 있어서, 상기 표적 폴리펩티드가 나트륨이뇨(natriuretic) 펩티드인 방법.
  32. 제 26 항에 있어서, 숙주 세포가 대장균인 방법.
  33. 제 26 항에 있어서, 상기 표적 폴리펩티드가 나트륨이뇨 펩티드인 방법.
  34. 제 24 항에 있어서, 숙주 세포가 대장균이고, 상기 표적 폴리펩티드가 나트륨이뇨 펩티드인 방법.
  35. 제 26 항에 있어서, 숙주 세포가 대장균이고, 상기 표적 폴리펩티드가 나트륨이뇨 펩티드인 방법.
  36. 제 1 항에 있어서, 상기 방법이 폴리펩티드 상의 상기 -1 및 +1 위치의 서열부위에서의 대장균 OmpT 프로테아제의 절단 효율을 상승시키기 위한 것이고, +1-위치의 아미노산으로서 글루탐산, 아스파르트산 또는 프롤린 외의 아미노산을 설정함에 의한 아미노산 전환을 포함하는 방법.
  37. 제 36 항에 있어서, 상기 폴리펩티드내 두개의 임의의 연속 아미노산으로 이루어진 상기 서열 부위의 -1-위치의 아미노산이 리신도 아르기닌도 아닌 경우, 상기 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 전환시키는 것, 및 +1-위치의 아미노산으로서 글루탐산, 아스파르트산, 프롤린, 아르기닌, 리신, 알라닌, 메티오닌 또는 발린 외의 아미노산을 설정하여 폴리펩티드의 목적하는 부분이 대장균 OmpT 프로테아제에 의해 절단되도록 하는 것을 포함하는 방법.
  38. 제 1 항에 있어서, 상기 방법이 폴리펩티드 상의 상기 -1 및 +1 위치의 서열부위에서의 대장균 OmpT 프로테아제의 절단 효율을 상승시키기 위한 것이고, 상기 서열부위 부근의 아미노산을,
    (1) 상기 서열부위에 대해 -1-위치의 아미노산으로서 리신 또는 아르기닌을 설정함 및 +1 위치의 아미노산으로서 글루탐산, 아스파르트산 또는 프롤린 외의 아미노산을 설정함; 및 (2) 상기 서열부위에 대해 -4-위치 및 -6-위치 중 하나 또는 양자 모두의 아미노산으로서 산성 아미노산 외의 아미노산을 설정함
    으로써 전환시키는 것을 포함하는 방법.
  39. 폴리펩티드 상의 -1 및 +1 위치의 두개의 임의의 연속 아미노산으로 이루어진 서열부위에서의 대장균 OmpT 프로테아제의 절단 효율을 낮추기 위한 방법으로서, 상기 서열부위가 대장균 OmpT 프로테아제에 의하여 절단가능하고, 상기 방법이 상기 서열부위의 부근의 아미노산을,
    (1) 상기 서열부위에 대해 -1-위치의 아미노산으로서 리신 또는 아르기닌을 설정함 및 +1 위치의 아미노산으로서 글루탐산, 아스파르트산 또는 프롤린 외의 아미노산을 설정함; 및 (2) 상기 서열부위에 대해 -4-위치 및 -6-위치 중 하나 또는 양자 모두의 아미노산으로서 중성 아미노산 또는 산성 아미노산을 설정함
    으로써 전환시키는 것을 포함하는 방법.
  40. 제 39 항에 있어서, -4 위치 및 -6 위치 중 하나 또는 양자 모두의 아미노산으로서 산성 아미노산이 설정되는 방법.
  41. 제 38 항에 있어서, -4-위치 및 -6-위치 중 하나 또는 양자 모두의 아미노산으로서 염기성 아미노산이 설정되는 방법.
  42. 제 41 항에 있어서, 염기성 아미노산이 리신 또는 아르기닌인 방법.
  43. 절단 부위를 통해 또는 절단 부위를 포함하는 링커 펩티드를 통해 보호 펩티드와 융합된 표적 폴리펩티드로 이루어지고 대장균 OmpT 프로테아제에 의해 상기 절단 부위에서 절단가능한 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 숙주세포에서 발현시키는 것, 및 대장균 OmpT 프로테아제로 상기 절단 부위에서 단백질을 절단 분리시켜 상기 융합 단백질로부터 표적 폴리펩티드를 수득하는 것을 포함하는, 제 36 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항에 따른 대장균 OmpT 프로테아제의 절단 효율을 상승시키거나 낮추기 위한 방법.
  44. 제 43 항에 있어서, 대장균 OmpT 프로테아제에 의해 절단가능한 아미노산 서열이 상기 융합 단백질을 구성하는 보호 펩티드, 링커 펩티드 및 표적 폴리펩티드 중 하나 이상의 아미노산 서열에 존재하는 방법.
  45. 표적 폴리펩티드의 제조방법으로서, 절단 부위를 통해 또는 절단 부위를 포함하는 링커 펩티드를 통해 보호 펩티드와 융합된 표적 폴리펩티드로 이루어지고 대장균 OmpT 프로테아제에 의해 상기 절단 부위에서 절단가능한 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 숙주세포에서 발현시키는 것, 및 대장균 OmpT 프로테아제로 상기 절단 부위에서 단백질을 절단시켜 상기 융합 단백질로부터 표적 폴리펩티드를 수득하는 것을 포함하고, 상기 절단 부위의 아미노산, 상기 부위 부근의 아미노산, 또는 양자 모두가 제 36 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항에 기재된 바와 같이 전환되는 방법.
  46. 제 45 항에 있어서, 대장균 OmpT 프로테아제에 의해 절단가능한 아미노산 서열이 상기 융합 단백질을 구성하는 보호 펩티드, 링커 펩티드 및 표적 폴리펩티드 중 하나 이상의 아미노산 서열에 존재하는 방법.
  47. 제 39 항 또는 제 40 항에 있어서, 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 숙주세포에서 발현됨으로써, 상기 폴리펩티드가 대장균 OmpT 프로테아제에 의해 비목적 부분에서 절단가능한 방법.
  48. 폴리펩티드 제조 방법으로서, 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 숙주세포에서 발현시키는 것을 포함하고, 상기 폴리펩티드를 대장균 OmpT 프로테아제로 비목적 부분에서 절단하는 경우 아미노산이 제 36 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항에 기재된 바와 같이 전환되는 방법.
  49. 제 43 항에 있어서, 숙주 세포가 대장균인 방법.
  50. 제 43 항에 있어서, 상기 표적 폴리펩티드가 나트륨이뇨 펩티드인 방법.
  51. 제 45 항에 있어서, 숙주 세포가 대장균인 방법.
  52. 제 45 항에 있어서, 상기 표적 폴리펩티드가 나트륨이뇨 펩티드인 방법.
  53. 제 43 항에 있어서, 숙주 세포가 대장균이고, 상기 표적 폴리펩티드가 나트륨이뇨 펩티드인 방법.
  54. 제 45 항에 있어서, 숙주 세포가 대장균이고, 상기 표적 폴리펩티드가 나트륨이뇨 펩티드인 방법.
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