JP6421122B2 - 改善された発現のための、細菌抽出物中の選択タンパク質のタンパク質分解不活性化 - Google Patents

改善された発現のための、細菌抽出物中の選択タンパク質のタンパク質分解不活性化 Download PDF

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Description

関連出願の引用
本願は、２０１２年１０月１２日に出願した米国特許出願第６１／７１３，２４５号に対する優先権の利益を主張する。米国特許出願第６１／７１３，２４５号は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
発明の分野
本発明は、無細胞合成技術に、および詳細には細菌抽出物中の選択タンパク質のタンパク質分解不活性化に関する。好ましい使用は、被定義アミノ酸残基に非ネイティブアミノ酸が組み込まれたポリペプチドの収量を増加させることである。
発明の背景
インビトロタンパク質合成のための細菌無細胞抽出物の使用には、従来のインビボタンパク質発現法に勝るいくつかの利点がある。無細胞システムは、細菌の代謝資源のすべてではないが大部分を１つのタンパク質の排他的生産に向けることができる。さらに、インビトロで細胞壁および膜成分がないことは、合成環境の制御を可能にするので、有利である。しかし、無細胞抽出物の効率は、タンパク質合成を阻害する細菌タンパク質によって、直接または間接的に減少され得る。したがって、タンパク質合成効率を低下させる望ましくないタンパク質の不活性化は、無細胞抽出物における望ましいタンパク質の収量を増加させるはずである。例えば、タンパク質合成効率を低下させるタンパク質の不活性化は、被定義アミノ酸残基に非ネイティブアミノ酸が組み込まれたポリペプチドの収量を増加させるはずである。非ネイティブアミノ酸（ｎｎＡＡ）のポリペプチドへの導入は、タンパク質の生物学的多様性および機能を増加させるのに有用である。被定義アミノ酸残基にｎｎＡＡが組み込まれたポリペプチドを生産する１つの手法は、タンパク質翻訳中にｎｎＡＡを新生ポリペプチドのアンバー（終止）コドンに組み込むための、ｔＲＮＡを含有するｎｎＡＡ、アミノアシル化直交ＣＵＡの使用である。しかし、終止コドンを正常に認識し、翻訳を終結させるネイティブ細菌終結複合体によって、アンバーコドンへのｎｎＡＡの組み込みは阻害され得る。放出因子１（ＲＦ１）は、ｍＲＮＡ配列内のアンバーコドンを認識することにより翻訳の終結を助長する終結複合体タンパク質である。アンバー終止コドンのＲＦ１認識は、非ネイティブアミノ酸組み込み部位における未成熟短縮産物、およびしたがってタンパク質収量減少を促進し得る。それ故、ＲＦ１の活性の減弱は、組換えタンパク質へのｎｎＡＡ組み込み増加させるだろう。
次の３つの方法でＲＦ１活性を減弱させることによってｎｎＡＡ組み込みを増加させることができることは、以前に証明されている：１）ＲＦ１の中和抗体不活性化、２）（ＲＦ２強化株における）ＲＦ１のゲノムノックアウト、および３）アフィニティークロマトグラフィーによる除去のためのタンパク質タグ（キチン結合ドメインおよびＨｉｓタグ）を含有するＲＦ１を発現するように操作された株を使用するＲＦ１の部位特異的除去。本開示は、ＲＦ１アミノ酸配列にタンパク質分解性切断部位を導入することによるＲＦ１の新規不活性化方法を記載するものである。前記切断部位は、細菌細胞成長中はプロテアーゼが接近できないが、細菌細胞が溶解されて無細胞抽出物が生産されるとプロテアーゼによって切断される。したがって、アンバーコドンにｎｎＡＡが組み込まれた完全長ポリペプチドの収量は、本明細書に記載する改変ＲＦ１変異体を発現する細菌細胞抽出物では増加される。
発明の簡単な概要
本発明は、外膜タンパク質Ｔ１（ＯｍｐＴ１）プロテアーゼ切断部位を含むように改変される組換え標的タンパク質を提供する。前記ＯｍｐＴ１切断部位は、切断しやすいＯｍｐＴ１ペプチド結合を含む。いくつかの実施形態において、標的タンパク質は、その標的タンパク質の表面露出モチーフにＯｍｐＴ１切断部位を導入するように改変される。ＯｍｐＴ１は、高効率で二塩基性残基間の基質を切断するので、ネイティブ表面露出モチーフは、ｐＨ７．０で正に荷電する２つの隣接する塩基性アミノ酸を含むように改変される。前記標的タンパク質は、例えば正常な細胞成長および／または生存に必要とされる必須タンパク質であることができる。
いくつかの実施形態において、表面露出モチーフは、そのタンパク質のモチーフ領域が複合体を形成していないとき少なくとも５０Å２のＢ因子を有する。いくつかの実施形態において、表面露出モチーフは、約２５Å２と約２２５Å２の間の溶媒露出表面積合計を有する。いくつかの実施形態において、標的タンパク質は、切断しやすいＯｍｐＴ１ペプチド結合が、ラマチャンドランプロットにおいて０°から−１８０°のファイ角度または０°から＋１８０°のプサイ角度を示すそのタンパク質の位置にあるように改変される。
第一の態様において、本発明は、ＯｍｐＴ１と切断しやすいＯｍｐＴ１ペプチド結合を含むように組換え改変された必須標的タンパク質とを両方とも発現する細菌細胞を提供する。いくつかの実施形態において、切断しやすいＯｍｐＴ１ペプチド結合は、表面露出モチーフ内に位置し、そのネイティブモチーフは、ｐＨ７．０で正に荷電する２つの隣接する塩基性アミノ酸を含むように改変される。いくつかの実施形態では、前記細菌細胞は、切断しやすいＯｍｐＴ１ペプチド結合を含むように組換え改変された必須標的タンパク質を発現し、ここで、前記結合は、前記タンパク質が複合体を形成していないとき少なくとも５０Å２のＢ因子を有する表面露出モチーフ内にある前記タンパク質の位置にある。いくつかの実施形態では、前記細菌細胞は、切断しやすいＯｍｐＴ１ペプチド結合を含むように組換え改変された必須標的タンパク質を発現し、ここで、前記結合は、約２５Å２と約２２５Å２との間の溶媒露出表面積合計を有する表面露出モチーフ内にある前記タンパク質の位置にある。１つの実施形態では、前記細菌細胞は、切断しやすいＯｍｐＴ１ペプチド結合を含むように組換え改変された必須標的タンパク質を発現し、ここで、前記結合は、ラマチャンドランプロットにおいて０°から−１８０°のファイ角度または０°から＋１８０°のプサイ角度を示す前記タンパク質の位置にある。１つの実施形態では、前記細菌細胞は、大腸菌である。
いくつかの実施形態では、前記必須標的タンパク質は、ＲＦ１、ＲＦ２、ＲＮＡｓｅ、チオレドキシンレダクターゼ、グルタレドキシンレダクターゼ、グルタチオンレダクターゼ、アミノ酸分解酵素、ポリリン酸キナーゼ、または低温ショックタンパク質から選択される。
第二の態様において、本発明は、インビトロ無細胞合成システムにおける改変必須標的タンパク質の有害な活性を低減させるための方法を提供し、この方法は、
ｉ）前記改変必須標的タンパク質を発現するＯｍｐＴ１陽性細菌を培養するステップであって、前記タンパク質が、切断しやすいＯｍｐｔＴ１ペプチド結合を含むように改変され、該タンパク質が、ｐＨ７．０で正に荷電する２つの隣接する塩基性アミノ酸を含むように改変されるものであるステップ；
ｉｉ）前記細菌を溶解して、無細胞合成抽出物を生じさせるステップ；
ｉｉｉ）前記必須標的タンパク質を、インタクトタンパク質を５０％低減させるために十分な量のＯｍｐＴ１と接触させるステップ；
ｉｖ）目的のタンパク質をコードする核酸テンプレートを前記抽出物に添加するステップ；および
ｖ）前記無細胞合成システムに前記目的のタンパク質を生産させるステップ
を含む。
本方法のいくつかの実施形態では、前記切断しやすいＯｍｐｔＴ１ペプチド結合は、前記タンパク質が複合体を形成していないときに少なくとも５０Å２のＢ因子を有する表面露出モチーフ内に位置する。いくつかの実施形態では、前記切断しやすいＯｍｐＴ１ペプチド結合は、約２５Å２と約２２５Å２との間の溶媒露出表面積合計を有する表面露出モチーフ内に位置する。いくつかの実施形態では、前記切断しやすいＯｍｐＴ１ペプチド結合は、ラマチャンドランプロットにおいて０°から−１８０°のファイ角度または０°から＋１８０°のプサイ角度を示す前記タンパク質の位置にある。
本方法のいくつかの実施形態では、前記細菌の酸化的リン酸化システムは、細胞溶解後および目的のタンパク質の合成中に活性のままである。１つの実施形態では、前記無細胞合成システムは、非ネイティブアミノ酸を前記目的のタンパク質のアンバーコドンに配置する。
第三の態様において、本発明は、外膜タンパク質Ｔ１（ＯｍｐＴ１）によって切断可能である機能性放出因子１タンパク質（ＲＦ１）であって、切断しやすいＯｍｐＴ１ペプチドが、野生型ＲＦ１（配列番号１）のアミノ酸２８７〜３０４に対応するスイッチループ領域内に位置し、および前記スイッチループ領域が、ｐＨ７．０で正に荷電する２つの隣接する塩基性アミノ酸を含むように改変される、前記ＲＦ１を提供する。いくつかの実施形態において、２つの隣接する塩基性アミノ酸は、アルギニンおよびリジンから独立して選択される。他の実施形態において、スイッチループ領域は、３つの隣接する塩基性アミノ酸を有するように改変される。いくつかの実施形態では、位置２９６のネイティブアスパラギンが前記３つの隣接する塩基性アミノ酸のうちの１つの代わりとなる。前記機能性、改変ＲＦ１タンパク質は、野生型ＲＦ１より速い速度でＯｍｐＴ１によって切断される。例えば、１つの実施形態において、改変タンパク質および野生型タンパク質が、ＯｍｐＴ１を発現する細胞からの無細胞抽出物中に同様の濃度で存在するとき、ＯｍｐＴ１による改変ＲＦ１の切断活性は、３０℃で３０分後、野生型ＲＦ１（配列番号１）の５０％より大きい。
いくつかの実施形態において、ＯｍｐＴ１によって切断可能である機能性ＲＦ１は、そのスイッチループ領域内にＯｍｐＴ１切断ペプチドを含有する。
第四の態様において、本発明は、外膜タンパク質Ｔ１（ＯｍｐＴ１）によって切断可能である機能性放出因子１タンパク質（ＲＦ１）をコードする核酸を提供し、ここで、切断しやすいＯｍｐＴ１ペプチド結合が、野生型ＲＦ１（配列番号１）のアミノ酸２８７〜３０４に対応するＲＦ１のスイッチループ領域内に位置し、および前記スイッチループ領域が、ｐＨ７．０で正に荷電する２つの隣接する塩基性アミノ酸を含むように改変される。
第五の態様において、本発明は、インビトロ無細胞合成システムにおいてアンバーコドンでのＲＦ１競合を低減させるための方法を提供し、この方法は、
ｉ）外膜タンパク質Ｔ１（ＯｍｐＴ１）によって切断可能である機能性放出因子１タンパク質（ＲＦ１）を発現するＯｍｐＴ１陽性細菌を培養するステップ；
ｉｉ）前記細菌を溶解して、無細胞合成抽出物を生じさせるステップ；
ｉｉｉ）前記抽出物中の前記ＲＦ１タンパク質を、インタクトＲＦ１タンパク質を５０％低減させるために十分な量のＯｍｐＴ１と接触させるステップ；
ｉｖ）目的のタンパク質をコードし、かつアンバーコドンを含む核酸テンプレートを、前記抽出物に添加するステップ；および
ｖ）前記無細胞合成システムに前記目的のタンパク質を生産させるステップ
を含み、
前記ＲＦ１タンパク質が、野生型ＲＦ１（配列番号１）のアミノ酸２８７〜３０４に対応するスイッチループ領域内に位置する切断しやすいＯｍｐＴ１ペプチド結合を有し、および前記スイッチループ領域が、ｐＨ７．０で正に荷電する２つの隣接する塩基性アミノ酸を含むように改変される。
本発明の１つの実施形態では、前記ＯｍｐＴ１陽性細菌は、大腸菌由来である。いくつかの実施形態では、前記細菌の酸化的リン酸化システムは、細胞溶解後および前記目的のタンパク質の合成中に活性のままである。いくつかの実施形態では、前記無細胞合成システムは、非ネイティブアミノ酸を前記目的のタンパク質のアンバーコドンに配置する。
別の態様において、本発明は、無細胞合成システムを提供し、この無細胞合成システムは、単一反応混合物中に、
ｉ）タンパク質をコードする核酸テンプレートを翻訳するために十分な細菌溶解物からの成分と、
ｉｉ）目的のタンパク質をコードし、かつ少なくとも１つのアンバーコドンを有する、核酸テンプレートと、
ｉｉｉ）前記アンバーコドンに相補的なｔＲＮＡと、
ｉｖ）外膜タンパク質Ｔ１（ＯｍｐＴ１）によって切断可能な機能性放出因子１（ＲＦ１）タンパク質であって、切断しやすいＯｍｐＴ１ペプチド結合が、野生型ＲＦ１（配列番号１）のアミノ酸２８７〜３０４に対応するＲＦ１のスイッチループ領域内に位置し、および前記スイッチループ領域が、ｐＨ７．０で正に荷電する２つの隣接する塩基性アミノ酸を含むように改変される、ＲＦ１タンパク質と
を含む。
いくつかの実施形態では、前記無細胞合成システムの反応混合物は、非天然アミノ酸および対応するアミノ酸シンセターゼをさらに含み、前記シンセターゼが、前記アンバーコドンに相補的なｔＲＮＡに前記非天然アミノ酸をチャージすることができる。いくつかの実施形態では、前記無細胞合成システムは、活性酸化的リン酸化システムによりＡＴＰを生成する。
なお別の態様において、本発明は、無細胞合成システムにおいてタンパク質を発現させるための方法を提供し、この方法は、
ｉ．核酸テンプレートと細菌抽出物を、タンパク質合成を可能にする条件下であわせるステップであって、前記細菌抽出物が、野生型ＲＦ１（配列番号１）のアミノ酸２８７〜３０３に対応するスイッチループ領域内に位置する切断しやすいＯｍｐＴ１ペプチド結合においてＯｍｐＴ１によって切断されたＲＦ１タンパク質を含み、前記スイッチループ領域が、ｐＨ７．０で正に荷電する２つの隣接する塩基性アミノ酸を含むように改変されたものであるステップ；および
ｉｉ．前記核酸テンプレートからタンパク質を発現させるステップ
を含む。
別の態様において、本発明は、細菌細胞であって、ＯｍｐＴ１によって切断され得る機能性ＲＦ１をコードするゲノムに組み込まれた配列を含む細菌細胞を提供する。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
外膜タンパク質Ｔ１（ＯｍｐＴ１）によって切断可能である機能性放出因子１タンパク質（ＲＦ１）であって、切断しやすいＯｍｐＴ１ペプチド結合が、野生型ＲＦ１（配列番号１）のアミノ酸２８７〜３０４に対応するスイッチループ領域内に位置し、および前記スイッチループ領域が、ｐＨ７．０で正に荷電する３つの隣接する塩基性アミノ酸を含むように改変される、ＲＦ１タンパク質。
（項目２）
前記３つの隣接する塩基性アミノ酸が、アルギニンおよびリジンを含む群から独立して選択される、項目１に記載のＲＦ１タンパク質。
（項目３）
前記スイッチループ領域が、少なくとも２つのさらなる隣接する塩基性アミノ酸を有するように改変される、項目１に記載のＲＦ１タンパク質。
（項目４）
位置２９６のネイティブアスパラギンが、前記３つの隣接する塩基性アミノ酸のうちの１つの代わりとなる、項目１に記載のＲＦ１タンパク質。
（項目５）
前記改変タンパク質および野生型タンパク質がＯｍｐＴ１を発現する細菌からの無細胞抽出物中に同様の濃度で存在するとき、ＯｍｐＴ１による切断活性が、３０℃で３０分後、野生型ＲＦ１（配列番号１）の５０％より大きい、項目１に記載のＲＦ１タンパク質。
（項目６）
前記スイッチループ領域が、

から成る配列の群より選択されるアミノ酸配列を含む、項目１に記載のＲＦ１タンパク質。
（項目７）
外膜タンパク質Ｔ１（ＯｍｐＴ１）によって切断可能である機能性放出因子１タンパク質（ＲＦ１）であって、野生型ＲＦ１（配列番号１）のアミノ酸２８７〜３０４に対応するスイッチループ領域が、

から成る配列の群より選択されるアミノ酸配列を含む、ＲＦ１タンパク質。
（項目８）
前記スイッチループ領域が、

から成る配列の群より選択されるアミノ酸配列を含む、項目７に記載のＲＦ１タンパク質。
（項目９）
前記スイッチループ領域が、

から成る配列の群より選択されるアミノ酸配列を含む、項目７に記載のＲＦ１タンパク質。
（項目１０）
外膜タンパク質Ｔ１（ＯｍｐＴ１）と切断しやすいＯｍｐＴ１ペプチド結合を含むように組換え改変された必須標的タンパク質との両方を発現する細菌細胞であって、前記結合が、前記タンパク質が複合体を形成していないとき少なくとも５０Å ２ のＢ因子を有する表面露出モチーフ内にある前記タンパク質の位置にあり、およびそのネイティブモチーフが、ｐＨ７．０で正に荷電する２つの隣接する塩基性アミノ酸を含むように改変される、細
菌細胞。
（項目１１）
外膜タンパク質Ｔ１（ＯｍｐＴ１）と切断しやすいＯｍｐＴ１ペプチド結合を含むように組換え改変された必須標的タンパク質との両方を発現する細菌細胞であって、前記結合が、約２５Å ２ と約２２５Å ２ の間の溶媒露出表面積合計を有する表面露出モチーフ内にある前記タンパク質の位置にあり、およびそのネイティブモチーフが、ｐＨ７．０で正に荷電する２つの隣接する塩基性アミノ酸を含むように改変される、細菌細胞。
（項目１２）
外膜タンパク質Ｔ１（ＯｍｐＴ１）と切断しやすいＯｍｐＴ１ペプチド結合を含むように組換え改変された必須標的タンパク質との両方を発現する細菌細胞であって、前記結合が、ラマチャンドランプロットにおいて０°から−１８０°のファイ角度または０°から＋１８０°のプサイ角度を示す前記タンパク質の位置にあり、およびそのネイティブモチーフが、ｐＨ７．０で正に荷電する２つの隣接する塩基性アミノ酸を含むように改変される、細菌細胞。
（項目１３）
前記必須標的タンパク質が、ＲＦ１、ＲＦ２、ＲＮＡｓｅ、プロテアーゼ、チオレドキシンレダクターゼ、グルタレドキシンレダクターゼ、グルタチオンレダクターゼ、アミノ酸分解酵素、ポリリン酸キナーゼ、および低温ショックタンパク質から成る群より選択される、項目１０〜１２に記載の細菌細胞。
（項目１４）
前記細菌細胞が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、項目１０〜１２に記載の細菌細胞。
（項目１５）
インビトロ無細胞合成システムにおける改変必須標的タンパク質の有害な活性を低減させるための方法であって、
ｉ）前記改変必須標的タンパク質を発現するＯｍｐＴ１陽性細菌を培養するステップであって、前記タンパク質が、切断しやすいＯｍｐｔＴ１ペプチド結合を含むように改変され、該タンパク質が、ｐＨ７．０で正に荷電する２つの隣接する塩基性アミノ酸を含むように改変されるものであるステップ；
ｉｉ）前記細菌を溶解して、無細胞合成抽出物を生じさせるステップ；
ｉｉｉ）前記必須標的タンパク質を、インタクトタンパク質を５０％低減させるために十分な量のＯｍｐＴ１と接触させるステップ；
ｉｖ）目的のタンパク質をコードする核酸テンプレートを前記抽出物に添加するステップ；および
ｖ）前記無細胞合成システムに前記目的のタンパク質を生産させるステップ
を含む方法。
（項目１６）
前記切断しやすいＯｍｐｔＴ１ペプチド結合が、前記タンパク質が複合体を形成していないときに少なくとも５０Å ２ のＢ因子を有する表面露出モチーフ内に位置する、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記切断しやすいＯｍｐｔＴ１ペプチド結合が、約２５Å ２ と約２２５Å ２ との間の溶媒露出表面積合計を有する表面露出モチーフ内に位置する、項目１５に記載の方法。
（項目１８）
前記切断しやすいＯｍｐｔＴ１ペプチド結合が、ラマチャンドランプロットにおいて０°から−１８０°のファイ角度または０°から＋１８０°のプサイ角度を示す前記タンパク質の位置にある、項目１５に記載の方法。
（項目１９）
前記ＯｍｐＴ１陽性細菌が、大腸菌である、項目１５に記載の方法。
（項目２０）
前記細菌の酸化的リン酸化システムが、細胞溶解後および前記目的のタンパク質の合成中
に活性のままである、項目１５に記載の方法。
（項目２１）
前記無細胞合成システムが、非ネイティブアミノ酸を前記目的のタンパク質のアンバーコドンに配置する、項目１５に記載の方法。
（項目２２）
外膜タンパク質Ｔ１（ＯｍｐＴ１）によって切断可能である機能性放出因子１タンパク質（ＲＦ１）をコードする核酸であって、切断しやすいＯｍｐＴ１ペプチド結合が、野生型ＲＦ１（配列番号１）のアミノ酸２８７〜３０４に対応するＲＦ１のスイッチループ領域内に位置し、および前記スイッチループ領域が、ｐＨ７．０で正に荷電する３つの隣接する塩基性アミノ酸を含むように改変される、核酸。
（項目２３）
インビトロ無細胞合成システムにおいてアンバーコドンでのＲＦ１競合を低減させるための方法であって、
ｉ）外膜タンパク質Ｔ１（ＯｍｐＴ１）によって切断可能である機能性放出因子１タンパク質（ＲＦ１）を発現するＯｍｐＴ１陽性細菌を培養するステップ；
ｉｉ）前記細菌を溶解して、無細胞合成抽出物を生じさせるステップ；
ｉｉｉ）前記抽出物中の前記ＲＦ１タンパク質を、インタクトＲＦ１タンパク質を５０％低減させるために十分な量のＯｍｐＴ１と接触させるステップ；
ｉｖ）目的のタンパク質をコードし、かつアンバーコドンを含む核酸テンプレートを、前記抽出物に添加するステップ；および
ｖ）前記無細胞合成システムに前記目的のタンパク質を生産させるステップ
を含み、
前記ＲＦ１タンパク質が、野生型ＲＦ１（配列番号１）のアミノ酸２８７〜３０４に対応するスイッチループ領域内に位置する切断しやすいＯｍｐＴ１ペプチド結合を有し、および前記スイッチループ領域が、ｐＨ７．０で正に荷電する２つの隣接する塩基性アミノ酸を含むように改変される、方法。
（項目２４）
前記ＯｍｐＴ１陽性細菌が、大腸菌由来である、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記細菌の酸化的リン酸化システムが、細胞溶解後および前記目的のタンパク質の合成中に活性のままである、項目２３に記載の方法。
（項目２６）
前記無細胞合成システムが、非ネイティブアミノ酸を前記目的のタンパク質のアンバーコドンに配置する、項目２３に記載の方法。
（項目２７）
無細胞合成システムであって、単一反応混合物中に、
ｉ）タンパク質をコードする核酸テンプレートを翻訳するために十分な細菌溶解物からの成分と、
ｉｉ）目的のタンパク質をコードし、かつ少なくとも１つのアンバーコドンを有する、核酸テンプレートと、
ｉｉｉ）前記アンバーコドンに相補的なｔＲＮＡと、
ｉｖ）外膜タンパク質Ｔ１（ＯｍｐＴ１）によって切断可能な機能性放出因子１（ＲＦ１）タンパク質であって、切断しやすいＯｍｐＴ１ペプチド結合が、野生型ＲＦ１（配列番号１）のアミノ酸２８７〜３０４に対応するＲＦ１のスイッチループ領域内に位置し、および前記スイッチループ領域が、ｐＨ７．０で正に荷電する３つの隣接する塩基性アミノ酸を含むように改変される、ＲＦ１タンパク質と
を含む、無細胞合成システム。
（項目２８）
前記反応混合物が、非天然アミノ酸および対応するアミノ酸シンセターゼをさらに含み、前記シンセターゼが、前記アンバーコドンに相補的なｔＲＮＡに前記非天然アミノ酸をチ
ャージすることができる、項目２７に記載の無細胞合成システム。
（項目２９）
前記システムが活性酸化的リン酸化システムによりＡＴＰを生成する、項目２７に記載の無細胞合成システム。
（項目３０）
無細胞合成システムにおいてタンパク質を発現させるための方法であって、
ｉ．核酸テンプレートと細菌抽出物を、タンパク質合成を可能にする条件下であわせるステップであって、前記細菌抽出物が、野生型ＲＦ１（配列番号１）のアミノ酸２８７〜３０３に対応するスイッチループ領域内に位置する切断しやすいＯｍｐＴ１ペプチド結合においてＯｍｐＴ１によって切断されたＲＦ１タンパク質を含み、前記スイッチループ領域が、ｐＨ７．０で正に荷電する２つの隣接する塩基性アミノ酸を含むように改変されたものであるステップ；および
ｉｉ．前記核酸テンプレートからタンパク質を発現させるステップ
を含む方法。
（項目３１）
細菌細胞であって、前記細菌細胞のゲノムに組み込まれた項目１または項目７に記載の機能性ＲＦ１を含む細菌細胞。
図１は、ＯｍｐＴ切断部位を含有する改変ＲＦ１タンパク質変異体が、ＯｍｐＴ活性のない無細胞抽出物に添加されたときに野生型ＲＦ１活性を有することを示す。Ｆｃタンパク質の位置Ｓ３７８（Ｆｃ＿Ｓ３７８ＴＡＧ）に導入されたアンバーコドンに非ネイティブアミノ酸を付加させたとき抑制を低減させる（連鎖終結を増加させる）外因性ＲＦ−１変異体の能力を判定した。図１（Ａ）レーン１は、外因的に添加されたＲＦ１がない対照抽出物である。前記抽出物は、野生型ＲＦ１を含有し、これは、アンバー抑制低減をもたらし、それによって短縮型Ｆｃが生産される（ゲルにおける下方のバンド）。レーン２は、外因的に添加された野生型（ＷＴ）ＲＦ１を含有する対照抽出物である。野生型ＲＦ１の添加は、アンバー抑制のさらなる低減をもたらし、それによって相対的に多い短縮型Ｆｃが生産される。レーン３〜７は、本発明の異なるＲＦ１変異体を含有する無細胞抽出物を示す。５つすべての変異体がＲＦ１活性を有する。図１（Ｂ）は、ＲＦ１変異体の相対活性を示し、ここでは、ＷＴ ＲＦ１が添加された活性を１００パーセントに設定し、ＲＦ１添加なしをゼロパーセントに設定する。
図２は、改変ＲＦ１変異体（Ａ１８）を発現するように操作された細菌株からの無細胞抽出物が、重鎖の様々な位置にｎｎＡＡが導入されたとき、野生型ＲＦ１を発現する細菌株と比較して完全長ＩｇＧの収量の実質的増加を生じさせることを示す。２（Ａ）左パネル：インタクトＯｍｐＴおよび野生型ＲＦ１を含有する、ＳＢＪＹ００１抽出物。２（Ａ）右パネル：インタクトＯｍｐＴおよびＲＦ１変異体Ａ１８を含有する、ＳＢＨＳ０１６（株１６）抽出物。完全長（インタクト）ＩｇＧのバンド強度は、株１６抽出物においてより強く、これは、短縮型タンパク質の減少とともに、ｎｎＡＡの組み込みが実質的に増加されたことを示す。２（Ｂ）は、重鎖の示されている位置にｎｎＡＡを含有するタンパク質のＩｇＧ可溶性収量が、株１６抽出物において実質的に増加されることを示し、これは、ＲＦ１変異体Ａ１８のＯｍｐＴ切断の結果、短縮型重鎖がより少なくなることを示す。「ＲＦ１＋」（ＲＦ１陽性）抽出物は、ＯｍｐＴによって切断されない株００１からのＲＦ１を指す。「ＲＦ１−」（ＲＦ１陰性）抽出物は、ＯｍｐＴ切断部位を含むように改変される、したがってＯｍｐＴ活性によって分解される、株１６からのＲＦ１を指す。
図３は、は、改変ＲＦ１変異体（Ａ１８）を発現するように操作された細菌株からの無細胞抽出物が、重鎖の示されている位置でのｎｎＡＡの導入増加に対応してアンバー抑制の実質的増加を生じさせることを示す。３（Ａ）左パネル：インタクトＯｍｐＴおよび野生型ＲＦ１を含有する、ＳＢＪＹ００１抽出物。３（Ａ）右パネル：インタクトＯｍｐＴおよびＲＦ１変異体Ａ１８を含有する、ＳＢＨＳ０１６（株１６）抽出物。完全長（インタクト）重鎖（Ｈｃ）のバンド強度は、株１６抽出物においてより強く、これは、短縮型タンパク質の減少とともに、ｎｎＡＡの組み込みが実質的に増加されたことを示す。３（Ｂ）は、重鎖の示されている位置にｎｎＡＡを含有するタンパク質のアンバー抑制が、株１６抽出物において実質的に増加されることを示し、これは、ＲＦ１変異体Ａ１８のＯｍｐＴ切断の結果、アンバー抑制が増加されることを示す。「ＲＦ１＋」（ＲＦ１陽性）抽出物は、ＯｍｐＴによって切断されない株００１からのＲＦ１を指す。「ＲＦ１−」（ＲＦ１陰性）抽出物は、ＯｍｐＴ切断部位を含むように改変される、したがってＯｍｐＴ活性によって分解される、株１６からのＲＦ１を指す。
定義
「アミノアシル化」または「アミノアシル化する」は、化合物へのアミノアシル基の付加の結果である、ｔＲＮＡにその妥当なアミノ酸が「チャージされる」（charge）完全プロセスを指す。本発明に関する場合、アミノアシル化を受けるまたはアミノアシル化されたｔＲＮＡは、アミノ酸がチャージされたものであり、アミノアシル化を受けるまたはアミノアシル化されたアミノ酸は、ｔＲＮＡ分子にチャージされるものである。
「アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ」または「ｔＲＮＡシンセターゼ」または「シンセターゼ」または「ａａＲＳ」または「ＲＳ」は、アミノ酸とｔＲＮＡ分子間の共有結合を触媒する酵素を指す。これは、そのそれぞれのアミノ酸がエステル結合によって連結されたｔＲＮＡ分子である、「チャージされた」ｔＲＮＡ分子をもたらす。
「コドン」は、特定の天然起源アミノ酸、非ネイティブアミノ酸、または翻訳終止（ポリペプチド連鎖終結）シグナルを特定する核酸テンプレート内の３連続ヌクレオチドの群を指す。遺伝子コードの縮重のため、アミノ酸は、１個より多くのコドンによって特定されることがある。
アンバーコドンは、殆どの生物においてポリペプチド翻訳を終結させるように作用するＲＮＡにおけるポリペプチド連鎖終結配列（ＵＡＧ）（ＤＮＡにおけるＴＡＧ）である。アンバーコドンは、適切なｔＲＮＡにその同族アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼによってチャージされると、タンパク質新生アミノ酸ピロリジンもコードすることができる。
「アンバーコドンｔＲＮＡ」または「アンバーサプレッサーｔＲＮＡ」または「アンバーアンチコドンｔＲＮＡ」は、アンバーコドンに結合するｔＲＮＡを指す。
「隣接するアミノ酸」は、ポリペプチドのアミノ酸配列内で互いに直ぐ前または後にあるアミノ酸を指す。例えば、ポリペプチドの一次アミノ酸配列の位置２のアミノ酸は、位置１および３のアミノ酸に隣接している。「２つの隣接する塩基性アミノ酸」は、ポリペプチドの一次アミノ酸配列内の他方の塩基性アミノ酸の直ぐ前または後にある一方の塩基性アミノ酸を指す。例えば、ＲＦ１アミノ酸配列の位置２９５の塩基性アミノ酸Ａｒｇ（Ｒ）は、そのＲＦ１アミノ酸配列の位置２９６に導入された塩基性アミノ酸、例えばＫまたはＲ、に隣接することができる。
「細菌由来無細胞抽出物」は、ｍＲＮＡをポリペプチドに翻訳することができるインビトロ反応混合物の調製物を指す。前記混合物としては、リボソーム、ＡＴＰ、アミノ酸およびｔＲＮＡが挙げられる。それらは、溶解された細菌に直接由来することもあり、精製された成分に由来することもあり、または両方の組み合わせに由来することもある。
「塩基性アミノ酸」は、それらのｐＫａより下のｐＨ値で極性でありおよび正電荷を有し、ならびに非常に親水性である。中性ｐＨでの塩基性アミノ酸の例としては、アルギニン（Ａｒｇ＝Ｒ）、リジン（Ｌｙｓ＝Ｋ）およびヒスチジン（Ｈｉｓ＝Ｈ）が挙げられる。
「無細胞合成システム」は、生物学的抽出物および／または被定義試薬を含む反応ミックス中のポリペプチドのインビトロ合成を指す。前記反応ミックスは、高分子の生産のためのテンプレート、例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡなど；合成すべき高分子のためのモノマー、例えば、アミノ酸、ヌクレオチドなど；ならびに補因子、酵素、およびその合成に不可欠である他の試薬、例えば、リボソーム、チャージされていないｔＲＮＡ、非天然アミノ酸がチャージされたｔＲＮＡ、ポリメラーゼ、転写因子などを含むことになる。
用語「切断活性が野生型ＲＦ１の５０％より大きい」は、特定条件下で野生型タンパク質の切断速度の５０％より高い、本明細書に記載する改変タンパク質の切断速度を指す。例えば、前記切断速度は、ＯｍｐＴ１を発現する細菌からの無細胞抽出物中に改変タンパク質および野生型タンパク質が同様の濃度（例えば、０．１〜１．０マイクロモルの濃度）で存在するとき、３０℃で３０分後に野生型タンパク質の切断速度の５０％より高いことができる。
用語「有害な活性」は、無細胞抽出物におけるタンパク質合成中にタンパク質の収量を減少させる活性を指す。例えば、有害な活性は、無細胞合成システムにおいて細胞の転写および／または翻訳を阻害することができる。有害な活性としては、無細胞合成反応において生成されたジスルフィド結合タンパク質の効率的なタンパク質フォールディングに必要とされるＧＳＳＧの酵素的低減を挙げることができる。有害な活性としては、ポリペプチド伸長が、導入された終止コドンで時期尚早に終結されるような、放出因子による時期尚早の連鎖終結も挙げることができる。
「標的タンパク質」は、プロテアーゼ切断部位を含むように改変されたタンパク質、またはｎｎＡＡを含むように改変されるタンパク質である。「必須標的タンパク質」は、細胞、例えば細菌細胞または真核細胞、の正常な成長および／または生存に必要とされるタンパク質である。
「機能性放出因子１（ＲＦ１）タンパク質」は、野生型または非改変ＲＦ１タンパク質と等しいまたは実質的に同様の活性を保持するＲＦ１を指す。機能性ＲＦ１活性は、例えば、改変ＲＦ１タンパク質を発現する細菌の成長速度を測定し、野生型または非改変ＲＦ１を発現する細菌の成長速度と比較することにより、試験することができる。ＯｍｐＴ切断部位を含有するように改変された他のタンパク質の機能活性を、同様に、例えば、その改変タンパク質を発現する細菌の成長速度を測定し、野生型または非改変タンパク質を発現する細菌の成長速度と比較することにより、判定することができる。機能性ＲＦ１活性は、例えば、標的タンパク質をコードするｍＲＮＡの特定位置へのｎｎＡＡの直交ｔＲＮＡ組み込みを低減させ、それによって時期尚早の連鎖終結の量を増加させる（すなわち、短縮型タンパク質の量を増加させる）改変ＲＦ１タンパク質の能力によって、試験することもできる。
本発明に関して、用語「含むように改変された」は、タンパク質もしくはポリペプチド配列におけるアミノ酸の置換、付加または欠失、または改変タンパク質をコードする核酸配列における対応する置換、付加もしくは欠失を指す。改変タンパク質は、野生型タンパク質配列からの同数のアミノ酸を置き換えるアミノ酸置換、野生型配列に付加されたアミノ酸、または野生型配列から欠失されたアミノ酸を含むことができる。例えば、野生型アミノ酸（単数または複数）をアミノ酸配列の対応する位置で置き換える塩基性アミノ酸を含むようにタンパク質を改変することができる。ＯｍｐＴ切断配列などの既知プロテアーゼ切断配列であるアミノ酸配列を含むようにタンパク質を改変することもできる。
「非天然」または「非ネイティブ」アミノ酸は、すべてのタンパク質についての構成要素である２０の天然起源アミノ酸の１つではないアミノ酸であって、それにもかかわらず、それらをタンパク質に組み込むように生物学的に操作することが可能なアミノ酸を指す。非ネイティブアミノ酸は、２０の天然起源アミノ酸の１つのＤ−ペプチドエナンチオマーまたは任意の翻訳後修飾を含んでよい。多種多様な非ネイティブアミノ酸を本発明の方法において使用することができる。非ネイティブアミノ酸は、非ネイティブアミノ酸の所望の特性、例えば、非ネイティブアミノ酸の機能、例えば、タンパク質の生物学的特性、例えば毒性、生体内分布または半減期、構造的特性、分光特性、化学および／または光化学特性、触媒特性の改変、他の分子と（共有結合的にまたは非共有結合的に）反応する能力などに基づいて選択することができる。本発明の方法において使用することができる非ネイティブアミノ酸としては、チロシンアミノ酸の非ネイティブ類似体；グルタミンアミノ酸の非ネイティブアナログ；フェニルアラニンアミノ酸の非ネイティブアナログ；セリンアミノ酸の非ネイティブアナログ；トレオニンアミノ酸の非ネイティブアナログ；アルキル、アリール、アシル、アジド、シアノ、ハロ、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシル、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、スルホニル、セレノ、エステル、チオ酸、ボレート、ボロネート、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環式、エノン、イミン、アルデヒド、ヒドロキシルアミン、ケトもしくはアミノ置換アミノ酸、またはこれらの任意の組み合わせ；光励起性架橋剤を伴うアミノ酸；スピン標識アミノ酸；蛍光アミノ酸；新規官能基を有するアミノ酸；別の分子と共有結合的にまたは非共有結合的に相互作用するアミノ酸；金属結合アミノ酸；金属含有アミノ酸；放射性アミノ酸；光ケージドおよび／または光異性化性アミノ酸；ビオチンまたはビオチンアナログ含有アミノ酸；グリコシル化または炭水化物修飾アミノ酸；ケト含有アミノ酸；ポリエチレングリコールまたはポリエーテルを含むアミノ酸；重原子置換アミノ酸；化学的に切断可能なまたは光切断性アミノ酸；伸長側鎖を有するアミノ酸；毒性基を含有するアミノ酸；糖置換アミノ酸、例えば、糖置換セリンなど；炭素結合糖含有アミノ酸、例えば、糖置換セリンなど；炭素結合糖含有アミノ酸；レドックス活性アミノ酸；α−ヒドロキシ含有酸；アミノチオ酸含有アミノ酸；α，α−二置換アミノ酸；β−アミノ酸；プロリン（ｐｒａｌｉｎｅ）以外の環状アミノ酸などが挙げられるが、これらに限定されない。
「核酸テンプレート」は、ポリペプチドが翻訳されることになるＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドを含む。ＤＮＡ核酸テンプレートが、先ず、ＲＮＡに転写されなければならないこと、およびそのＲＮＡが、ポリペプチドに翻訳されることは、当業者には理解されるであろう。インビボでもインビトロでもＤＮＡをＲＮＡに転写することができる。ＤＮＡテンプレートのインビトロ転写方法は、当該技術分野において周知である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡテンプレートを同時インビトロ転写・翻訳に付す。
「外膜タンパク質Ｔ１」（ＯｍｐＴ１）は、表面膜セリンプロテアーゼであり、グラム陰性菌のｏｍｐｔｉｎファミリーに属する。ＯｍｐＴ１が抗微生物ペプチドを切断すること、ヒトプラスミノゲンを活性化すること、およびいくつかの異種組換えタンパク質を分解することは、公知である。ＯｍｐＴ１およびそのホモログは、二塩基性残基間の合成基質を高い触媒効率で切断する。二塩基性残基を含有する配列の切断は、抗生物ペプチドおよびコリシンの不活性化、トランスでの細菌膜タンパク質のタンパク質分解、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現組換えタンパク質の分解に重要であることが証明されている。本発明に関して、ＯｍｐＴ１は、細胞の外膜上にある点、およびそれ故、インタクト細菌細胞内に位置する潜在的基質タンパク質と接触していない点で、ある一定の利点を有する。
用語「細菌の酸化的リン酸化システムが活性のままである」は、タンパク質合成中に活性酸化的リン酸化を示す細菌溶解物を指す。例えば、細菌溶解物は、ＡＴＰシンターゼ酵素と酸素の還元とを用いてＡＴＰを生成することができる。当該技術分野において公知の他の翻訳システムもタンパク質合成中に活性酸化的リン酸化を用いることは、理解されるであろう。酸化的リン酸化の活性化は、特異的阻害剤、例えば電子伝達系阻害剤、を使用する経路の阻害によって実証することができる。
「翻訳」は、ＲＮＡテンプレートが、天然および／または非ネイティブアミノ酸を含有するポリペプチドに変換されるプロセスであり、当該技術分野において周知である。翻訳は、リボソームが、ＲＮＡテンプレートに、一般にはそのＦＭｅｔコドン（例えば、ＡＵＧ）に結合する開始段階、チャージされたｔＲＮＡ分子のアンチコドンがＲＮＡテンプレートのコドンと対合される伸長段階を含み、この伸長段階は、リボソームが下方のＲＮＡテンプレートに移動すると繰り返される。各ｔＲＮＡアンチコドンがその対応するコドンと対合されると、各ｔＲＮＡ分子にチャージされるアミノ酸のアミノ基は、ペプチド結合によって前のアミノ酸のカルボキシル基に供給結合で連結される。一般に、翻訳は、リボソームが翻訳終止コドンに遭遇し、かくしてリボソームからのポリペプチドの連鎖伸長および放出を終わらせる終結段階も含む。しかし、本明細書に記載する方法において、ＲＮＡテンプレートは、ｎｎＡＡがチャージされたｔＲＮＡのアンチコドンＣＵＡによって認識されるアンバー終止コドンＵＡＧを有するＯＲＦを含むことができる。したがって、本方法において、アンバーコドンは、翻訳を終結させるように必ずしも機能しない。
「翻訳システム」は、インビトロでｍＲＮＡをポリペプチドに翻訳することができる成分の混合物を指す。翻訳システムは、無細胞抽出物、再構成された細胞溶解物、またはインビトロでｍＲＮＡをポリペプチドに翻訳することができる成分の精製された混合物であることができる。例えば、本明細書に記載する方法で使用される無細胞抽出物または細胞溶解物は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ））から得ることができる。翻訳システムは、精製され再構成されたインビトロ翻訳システムも含むことができる。本明細書に記載する方法は、タンパク質合成中に活性酸化的リン酸化を示す翻訳システムも利用することができる。例えば、翻訳システムは、ＡＴＰシンセターゼ酵素を使用してＡＴＰを生成することができる。翻訳システムは、少なくとも１つの核酸テンプレートも含むことができる。その翻訳システムを用いて、核酸テンプレートをタンパク質に同時に転写・翻訳することができる。
「再構成リボソーム翻訳システム」は、Ｔａｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６、２７９−２９０（２００５）およびＦｏｒｓｔｅｒら、米国特許第６，９７７，１５０号明細書（これらの参考文献は、それら全体が参照により本明細書に援用されている）に記載されているような、ｍＲＮＡなどの核酸分子をインビトロ翻訳することができる精製された成分の混合物を指す。
「切断しやすいＯｍｐＴ１ペプチド結合」は、ＯｍｐＴ１による切断され得るペプチド結合である。
「表面露出モチーフ」は、タンパク質分子の外側に存在するドメインである。表面露出モチーフは、例えばＯｍｐＴ１などのセリンプロテアーゼによる、タンパク質分解性切断に、一般に、より利用されやすい。表面露出モチーフをいくつかの方法で定義できることは、当業者には理解されるだろう。例えば、表面露出モチーフには、二次構造、例えば、αヘリックスまたはβシートがない。さらに表面露出モチーフは、同種タンパク質配列間においてさえ、有意な量のアミノ酸配列相同性を共有しないことが多い。しかし、当業者は、ピモール分子モデリングソフトウェア（ｐｙｍｏｌｗｉｋｉ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ／Ｇｅｔ＿Ａｒｅａでインターネットを参照されたい）に組み込まれているＧｅｔＡｒｅａアルゴリズムを用いて、目的のタンパク質の領域についての相対露出表面積を算出することができる。
「少なくとも５０Å２のＢ因子を有する表面露出モチーフ」は、その表面露出モチーフにおける個々の原子の移動度を指す。表面露出モチーフにおける原子は、タンパク質のコアにおける原子より大きい移動度を有することができる。Ｂ因子は、一般に、タンパク質などの構造の異なる部分の相対振動運動を示す。低いＢ因子を有する原子は、秩序立ったタンパク質の部分の属し、したがって比較的に低い移動度を有する。大きいＢ因子を有する原子は、一般に、比較的柔軟性のあるタンパク質の部分に属し、したがって、比較的高い移動度を有する。Ｂ因子が高いほど、タンパク質構造内の個々の原子の位置誤差が観察される可能性が高い。例えば、４０と６０の間のＢ因子は、１．０オングストロームまでの位置誤差を観察できることを示唆する。６０より大きいＢ因子は、原子がその観察位置の１．０オングストローム以内にない可能性が高いことを示唆する。（例えば、ｗｉｋｉ．ｃｍｂｉ．ｒｕ．ｎｌ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ／Ｂ−ｆａｃｔｏｒでインターネットを参照されたい）。Ｂ因子は、
のように算出され、式中のＵｉ ２は、原子ｉの平均二乗変位量である。このＢ因子から、
によってフーリエ変換への原子ｉの寄与に対する重み因子が得られる。
Ｕが増加するにつれて、Ｂは、増加し、散乱への原子の寄与は減少される。例えば、ｐｌｄｓｅｒｖｅｒ１．ｂｉｏｃｈｅｍ．ｑｕｅｅｎｓｕ．ｃａ／〜ｒｌｃ／ｗｏｒｋ／ｔｅａｃｈｉｎｇ／ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎｓ．ｓｈｔｍｌでインターネットを参照されたい。Ｂ因子は、Å２の単位で測定される。
用語「ラマチャンドランプロット」は、タンパク質構造内の各アミノ酸残基についての主鎖二面角Ψ（プサイ）対φ（ファイ）を視覚化するための方法を指す。ファイおよびプサイ角度の算出方法は、例えば、Ｌｏｖｅｌｌ，Ｓ．Ｃ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、５０：４３７−４５０（２００３）、およびＣｈｅｎ，Ｖ．Ｂ．ら、ＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙ：ａｌｌ−ａｔｏｍ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ Ｄ６６：１２−２１（２０１０）に記載されている。上の参考文献を参照することによりラマチャンドランプロットにおけるファイおよびプサイ角度を決定することができ、または、便宜上、インターネット上の自由に利用できるソフトウェアプログラムを使用することができる。例えば、座標ファイルまたはＰＤＢファイルをｋｉｎｅｍａｇｅ．ｂｉｏｃｈｅｍ．ｄｕｋｅ．ｅｄｕのＭＯＬＰＲＯＢＩＴＹサーバーにアップロードすることができる（Ｃｈｅｎ，Ｖ．Ｂ．ら、上掲を参照されたい）。あるいは、インターネット上のｂｏｓｃｏｈ．ｃｏｍ／ｒａｍａｐｌｏｔで利用できるＲａｍａｃｈａｎｄｒａｎ Ｐｌｏｔ Ｅｘｐｌｏｒｅｒを使用することができる。
用語「溶媒露出表面積合計」（ＳＡＳＡ）は、溶媒が接触可能であるタンパク質またはポリペプチドの表面積を指す。溶媒露出表面積は、平方オングストロームの単位で記載することができ、ＳｈｒａｋｅおよびＲｕｐｌｅｙ（Ｓｈｒａｋｅ，Ａ；Ｒｕｐｌｅｙ，ＪＡ．（１９７３）、「Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ａｎｄ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｔｏ ｓｏｌｖｅｎｔ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｔｏｍｓ． Ｌｙｓｏｚｙｍｅ ａｎｄ ｉｎｓｕｌｉｎ」、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ７９（２）：３５１−７１）によって開発された「ローリングボール」アルゴリズムを用いて算出することができる。溶媒露出表面積は、Ｆｒａｃｚｋｉｅｗｉｃｚ，Ｒ．およびＢｒａｕｎ，Ｗ．、「Ｅｘａｃｔ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ ｓｕｒｆａｃｅ ａｒｅａｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｇｒａｄｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．、１９：３１９−３３３（１９９８）に記載されているように算出することもできる。便宜上、インターネット上の自由に利用できるソフトウェアプログラムを用いて溶媒露出表面積合計を算出することができる。例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｒａｎｃｈウェブサイトｃｕｒｉｅ．ｕｔｍｂ．ｅｄｕ／ｇｅｔａｒｅａ．ｈｔｍｌにおいて見つけられるソフトウェアルーチンＧＥＴＡＲＥＡを使用して、ＰＤＢ（タンパク質データベース）形式で原子座標を入力し、水プローブの所望の半径（パラメータ：水プローブの半径＝１．４）を指定することによって、Ｆｒａｃｚｋｉｅｗｉｃｚ，Ｒ．およびＢｒａｕｎ，Ｗ．（同上）に記載されているように、タンパク質分子の溶媒露出表面積（溶媒和エネルギー）を算出することができる。
用語「スイッチループ領域」は、ＲＦ１のドメイン３および４を連結する表面露出モチーフであって、ペプチジル−ｔＲＮＡエステル結合と接触しているドメイン３のＧＧＱモチーフを５０Ｓサブユニットのペプチジルトランスフェラーゼセンター（ＰＴＣ）内に配置する堅い結合を形成するモチーフを指す。終結複合体による終止コドンの認識は、ドメイン３をＰＴＣ内に指向させる、スイッチループ領域の転位配座を安定化させる。スイッチループの転位は、ヘリックスα７の再配向および拡張をもたらし、その結果、ＧＧＱモチーフはＰＴＣにドッキングする。Ｋｏｒｏｓｔｅｌｅｖ，Ａ．ら、「Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｍｂｅｒ ＵＡＧ ｓｔｏｐ ｃｏｄｏｎ ｂｙ ｒｅｌｅａｓｅ ｆａｃｔｏｒ ＲＦ１」、ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ（２０１０）２９、２５７７−２５８５を参照されたい。ＲＦ１のスイッチループ領域は、配列番号１のアミノ酸２８７から３０４に対応し、次のアミノ酸配列を含む：２８７−ＱＱＡＥＡＳＴＲＲＮＬＬＧＳＧＤＲＳ−３０４（配列番号４）。
「野生型」タンパク質は、ネイティブまたは天然起源タンパク質のアミノ酸配列および／または機能活性を有する非改変タンパク質である。例えば、野生型ＲＦ１タンパク質は、配列番号１の配列を有することができる。「対照タンパク質」は、野生型タンパク質または予め改変されているタンパク質であり得る。
「ネイティブアミノ酸」は、遺伝子コードによってコードされた１つ以上の天然起源アミノ酸を指す。「内因性ネイティブアミノ酸」は、溶解物を生成するために使用された宿主細胞によって生産されたネイティブアミノ酸を指す。
「非ネイティブアミノ酸」（「ｎｎＡＡ」）は、式ＮＨ３−（ＣＲ）−ＣＯＯＨを有する化学構造を指し、この式中のＲは、天然アミノ酸を定義する２０の最も一般的な置換基のいずれでもない。
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列に関して、用語「同一の」または「同一性」パーセントは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０，１９９０）およびＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２，１９９７）にそれぞれ記載されているＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて測定されるような、比較ウィンドウ、または指定領域、にわたって比較し、最大対応のためにアラインしたとき、同じであるか、または同じであるヌクレオチドまたはアミノ酸残基の特定百分率（例えば、特定領域にわたって６０％同一性、場合によっては６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一性）を有する、２つ以上の配列またはサブ配列を指す。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖでインターネットを参照されたい）を通して公的に利用することができる。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインしたときに何らかの正の値の閾スコアＴにマッチするかまたは前記スコアＴを満たすクエリ配列中の長さＷの短いワードを特定することにより高スコアリング配列対（ＨＳＰ）を最初に同定することを含む。Ｔは、隣接ワードスコア閾値（ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ ｗｏｒｄ ｓｃｏｒｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，上掲）。これらの最初の隣接ワードヒットは、これらを含有するより長いＨＳＰを見つけるための検索開始のシードとしての役割を果たす。ワードヒットは、累積アラインメントスコアを増加させることができる限界まで各配列に沿って両方向に伸長される。累積スコアは、例えば、ヌクレオチド配列については、パラメーターＭ（マッチする残基の対についてのリワードスコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基についてのペナルティースコア；常に＜０）を使用して算出される。アミノ酸配列については、スコアリング行列を使用して累積スコアが算出される。各方向のワードヒットの伸長は、累積アライメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ落ちると；累積スコアが、１つ以上の負のスコアを有する残基アライメントの累積に起因して、０以下になると；またはいずれかの配列の末端に達すると、中断される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、およびＸは、アライメントの感度および速度を左右する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、期待値（Ｅ）または１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列用のＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３のワード長、１０の期待値（Ｅ）、および５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５、１９８９を参照されたい）アライメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を使用する。
「配列同一性の百分率」は、比較ウィンドウにわたって最適にアラインされた２配列を比較することによって決定され、ここで、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、２配列の最適なアラインメントについて基準配列（付加または欠失を含まない）と比較して付加または欠失（すなわちギャップ）を含むことがある。前記百分率は、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両配列内に現れる位置の数を決定してマッチ位置数を得、そのマッチ位置数を、比較ウィンドウ内の位置の総数で割り、その結果に１００をかけて配列同一性の百分率を得ることによって算出される。
本明細書において用いる場合の「比較ウィンドウ」は、２０から６００、通常約５０から約２００、より通常は約１００から約１５０から成る群より選択される連続する位置の数のいずれか１つのセグメントへの言及を含み、ここで、配列と、同じ連続位置数の基準配列とを、それら２配列を最適にアラインした後に比較してよい。比較のための配列アラインメントの方法は、当該技術分野において周知である。
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２配列間の類似性の統計分析も行う（例えば、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−８７、１９９３を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小和確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のマッチが偶然に起こる確率の指標になる。例えば、核酸は、試験核酸と基準核酸の比較での最小和確率が、約０．２未満、典型的には約０．０１未満、およびさらに典型的には約０．００１未満である場合、基準配列に類似していると見なされる。
配列同一性の百分率をポリペプチドへの言及の際に用いるとき、別様に同一でない１つ以上の残基位置は、保存的アミノ酸置換が異なると認識され、保存的置換では、第１のアミノ酸残基で、類似した化学特性、例えば、類似した電荷または疎水性または親水性を有する別のアミノ酸残基が、置換され、したがって、第１のアミノ酸は、そのポリペプチドの機能特性を変化させない。ポリペプチド配列が、保存的置換の点で異なる場合、配列同一性パーセントを上方修正して、置換の保存的性質を補正することができる。かかる修正は、周知の方法、例えば、保存的置換を完全ミスマッチではなく部分ミスマッチとしてスコアリングし、それによって配列同一性百分率を増加させる方法を用いて行うことができる。したがって、例えば、同一アミノ酸に１のスコアが与えられ、非保存的置換に０のスコアが与えられると、保存的置換にはゼロと１の間のスコアが与えられる。保存的置換のスコアリングは、Ｐｅａｒｓｏｎら（Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３３１、１９９４）に記載されているアルゴリズムを用いて算出することができる。配列の単純目視および手動アラインメントによってアラインメントを行うこともできる。
特定のポリヌクレオチド配列に関して用いるときの用語「保存的改変変異」は、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする異なるポリヌクレオチド配列を指し、またはポリヌクレオチドがアミノ酸配列をコードしない場合には本質的に同一の配列を指す。遺伝子コードの縮重のため、多数の機能的に同一のポリヌクレオチドが、任意の所与のポリペプチドをコードする。例えば、コドンＣＧＵ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ、およびＡＧＧはすべて、アミノ酸アルギニンをコードする。したがって、アルギニンがコドンによって特定されるすべての位置において、コドンを、コードされたポリペプチドを改変することなく、記載の対応するコドンのいずれかに改変することができる。かかるヌクレオチド配列変異は、「サイレント変異」であり、これは「保存的改変変異」の一種と見なすことができる。それ故、タンパク質変異体（protein variant）をコードすると本明細書に開示する各ポリヌクレオチド配列が、あらゆる可能なサイレント変異も記述することは分かるであろう。元来メチオニンのための唯一のコドンであるＡＵＧ、および元来トリプトファンのための唯一のコドンであるＵＵＧを除き、ポリヌクレオチド中の各コドンを、標準的技法によって機能的に同一の分子を生じさせるように改変することができることも分かるであろう。したがって、コードされたポリペプチドの配列を変化させないポリヌクレオチドの各サイレント変異が暗黙のうちに本明細書に記載されている。
さらに、コードされた配列中の単一のアミノ酸または小率のアミノ酸（典型的には１０％未満、および一般に１％未満）を改変、付加または欠失させる個々の置換、欠失または付加は、改変が化学的に類似したアミノ酸でのアミノ酸の置換をもたらすことを条件に、保存的改変変異と見なすことができることは分かるであろう。機能的に類似したアミノ酸をもたらす保存的アミノ酸置換は当該技術分野において周知であり、それらは以下の６群を含み、これらの群の各々が、互いに保存的置換基と見なされるアミノ酸を含有する：
１）アラニン（Ａｌａ、Ａ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）；
２）アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）；
３）アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）；
４）アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）
５）イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、バリン（Ｖａｌ、Ｖ）；および
６）フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）。
２つ以上のアミノ酸配列または２つ以上のヌクレオチド配列は、それらのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列が、所与の比較ウィンドウにわたって互いにまたは基準配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の配列同一性を共有する場合、「実質的に類似している」と見なされる。２つ以上のタンパク質も、それらがそのアミノ酸配列に機能的に類似したアミノ酸を与える保存的アミノ酸置換を含む場合、実質的に類似していると見なされる。
「プロモーター」は、転写開始点から上流または下流に位置する核酸テンプレート内の配列要素を指す。プロモーター配列は、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写を開始させる他のタンパク質の認識および結合に関与する。プロモーターの例としては、Ｔ７、ＳＰ６およびＴ３バクテリオファージプロモーターが挙げられる。
「５’非翻訳領域」は、核酸テンプレート内のオープンリーディングフレームの上流または５’に位置する核酸配列を指す。ＲＮＡの場合、５’非翻訳領域は、核酸テンプレート内に存在する翻訳開始コドンより前にある。ＤＮＡの場合、５’非翻訳領域は、ＲＮＡに転写されるおよび翻訳開始コドンの５’に位置する核酸配列を指す。ＤＮＡの場合、翻訳開始コドンは、典型的にＡＴＧであり、ＲＮＡの場合、翻訳開始コドンは、典型的にＡＵＧである。
「一次アミノ酸配列」は、ペプチド結合によって互いに連結されてポリペプチドになるアミノ酸残基の順序を指す。アミノ酸残基の順序は、一般に、ポリペプチドのアミノ末端で開始し、そのポリペプチドのカルボキシ末端に進んで行くように参照される。一次アミノ酸配列は、核酸テンプレート内のＲＮＡコドンのヌクレオチド配列によって決定される。
「オープンリーディングフレーム」は、目的のポリペプチドに翻訳される核酸テンプレートのヌクレオチド配列を指す。本明細書において用いる場合、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ｎｎＡＡがチャージされたｔＲＮＡに結合する被定義アミノ酸残基に対応する少なくとも１つのコドンを含むことができる。前記少なくとも１つのコドンは、アンバーコドンであることができる。
「イソ受容センスｔＲＮＡ」は、同じアミノ酸の代替コドンに結合する異なるｔＲＮＡ種を指す。
「ｔＲＮＡ」または「転移ＲＮＡ」は、翻訳中にリボソームのタンパク質合成部位で成長ポリペプチド鎖に特定のアミノ酸を転移させる小ＲＮＡ分子を指す。ｔＲＮＡは、対応するｍＲＮＡコドンに対合する３塩基コドンを含有する。遺伝子コードの縮重の結果として、アミノ酸は、複数のｔＲＮＡと会合することができるが、各タイプのｔＲＮＡ分子は、１つのタイプのアミノ酸としか会合することができない。
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、交換可能に用いており、ペプチド結合によって連結された２つ以上のアミノ酸を含有する化合物を指す。タンパク質は、１つ以上のポリペプチド鎖を含有することができる。
用語「タンパク質が複合体を形成していないとき」は、溶液中のタンパク質の構造、または溶液中のタンパク質の構造の一部分、領域もしくはドメインを指し、別の分子、例えばタンパク質、リガンド、酵素基質または阻害剤複合体、リボソーム、結合抗体または抗体断片、ＲＮＡおよびＤＮＡとの複合体の一部であるときのタンパク質の構造、または前記タンパク質の構造の一部分、領域もしくはドメインを指さない。この用語は、溶液中にあるタンパク質ドメイン、例えば表面露出モチーフを含むアミノ酸、の構造も指す。
本明細書において用いる場合、任意の量を改変するときの用語「約」は、例えばタンパク質合成またはＸ線結晶学実験において、当業者が典型的に遭遇する量の変動を指す。例えば、用語「約」は、所与の分析法についての測定の際に遭遇する、バッチまたは試料内およびバッチまたは試料間両方の、通常の変動を指す。したがって、用語約は、測定値の１〜１０％の変動、例えば５％または１０％変動を含むことができる。本明細書に開示する量は、用語「約」によって改変されているまたは改変されていない量を含む、それらの量と等価である。
発明の詳細な説明
概論
本発明は、ＯｍｐＴ１により切断され得るＯｍｐＴ１プロテアーゼ切断部位を含むように組換え改変される標的タンパク質を提供する。前記ＯｍｐＴ１切断部位は、切断しやすいＯｍｐＴ１ペプチド結合を含む。１つの実施形態において、前記標的タンパク質は、ｐＨ７．０で正に荷電する２つの隣接する塩基性アミノ酸を含むように改変される。いくつかの実施形態では、前記標的タンパク質は、その標的タンパク質の表面露出モチーフにＯｍｐＴ１切断部位を導入するように改変される。いくつかの実施形態において、前記切断しやすいＯｍｐＴ１ペプチド結合は、そのタンパク質または表面露出モチーフが複合体を形成していない（すなわち、溶液中で遊離している、および／または他の分子を構成する高分子構造の一部でない）ときに少なくとも５０Å２のＢ因子を有する表面露出モチーフ内に位置する。いくつかの実施形態において、前記切断しやすいＯｍｐＴ１ペプチド結合は、約２５Å２と約２２５Å２の間の溶媒露出表面積合計（ＳＡＳＡ）を有する表面露出モチーフ内に位置する。いくつかの実施形態において、前記標的タンパク質は、前記切断しやすいＯｍｐＴ１ペプチド結合が、ラマチャンドランプロット（Ｒａｍａｃｈａｄｒａｎ Ｐｌｏｔ）において０°から−１８０°のファイ角度または０°から＋１８０°のプサイ角度を示すタンパク質の位置にあるように改変される。
当業者には理解されるように、上記実施形態は、目的のタンパク質ドメイン（単数または複数）についての構造情報を必要とする。しかし、表面ループは、多くの場合、無秩序であり、したがって、目的の標的タンパク質についての結晶構造を入手できないこともある。それ故、いくつかの実施形態では、類似した構造を使用して相同モデルを作成して、構造情報不在下で、約２５Å２と約２２５Å２の間ＳＡＳＡ、またはラマチャンドランプロット（Ｒａｍａｃｈａｄｒａｎ Ｐｌｏｔ）における０°から−１８０°のファイ角度もしくは０°から＋１８０°のプサイ角度を予測することができる。
本発明は、ＯｍｐＴ１と組換え改変された標的タンパク質の両方を発現する細菌細胞をさらに提供する。いくつかの実施形態において、前記組換え改変された標的タンパク質は、必須タンパク質、例えば、正常な細胞成長および／または生存に必要とされるタンパク質である。
本明細書に記載する標的タンパク質は、インビトロ無細胞合成システムにおいて有害な活性を有するので、選択される。例えば、標的タンパク質は、目的のタンパク質をコードする核酸テンプレートの転写および／または翻訳を阻害することができる。したがって、本発明は、インビトロ無細胞合成システムにおける改変必須標的タンパク質の有害な活性を、前記標的タンパク質をＯｍｐＴ１プロテアーゼで不活性化することによって低減させる方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記改変必須標的タンパク質を発現するＯｍｐＴ１陽性細菌を培養するステップであって、前記標的タンパク質が、切断しやすいＯｍｐＴ１ペプチド結合を含むＯｍｐＴ１切断部位を表面露出モチーフ内に含むように改変されるものであるステップ；前記細菌を溶解して、無細胞合成抽出物を生じさせるステップ；前記改変された必須標的タンパク質を、インタクト標的タンパク質の量を５０％低減させるために十分な量のＯｍｐＴ１と接触させるステップ；目的のタンパク質をコードする核酸テンプレートを前記抽出物に添加するステップ；および前記無細胞合成システムに前記目的のタンパク質を生産させるステップを含む。前記方法は、標的タンパク質が細胞成長および／または生存に重要であり得るときには細胞成長中に改変標的タンパク質とＯｍｐＴ１プロテアーゼの空間的分離をうまく利用するが、細菌細胞を破壊し、溶解して無細胞抽出物を生じさせるときには標的細胞をＯｍｐＴ１によって切断する。
前記方法のいくつかの実施形態において、切断しやすいＯｍｐｔＴ１ペプチド結合は、そのタンパク質または表面露出モチーフが複合体を形成していないときに少なくとも５０Å２のＢ因子を有する表面露出モチーフ内に位置する。例えば、表面露出モチーフは、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０ ，１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０もしくは２００Å２またはそれ以上のＢ因子を有することができ、または約５０Å２と約２００Å２の間、約５０Å２と約１５０Å２の間、約５０Å２と約１００Å２の間、約６０Å２と約２００Å２の間、約６０Å２と約１５０Å２の間、もしくは約６０Å２と約１００Å２の間の範囲であることができる。前記方法のいくつかの実施形態において、切断しやすいＯｍｐｔＴ１ペプチド結合は、約２５Å２と約２２５Å２の間の溶媒露出表面積合計を有する表面露出モチーフ内に位置する。例えば、いくつかの実施形態において、前記溶媒露出表面積合計は、約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、または２２５Å２（ここで、用語「約」は、前記値の各々を修飾する）である。前記方法の１つの実施形態において、切断しやすいＯｍｐｔＴ１ペプチド結合は、ラマチャンドランプロットにおいて０°から−１８０°のファイ角度または０°から＋１８０°のプサイ角度を示す前記タンパク質の位置にある。上に記載したように、構造情報の不在下で、類似した構造を使用して相同モデルを作成して、約２５Å２と約２２５Å２の間ＳＡＳＡ、またはラマチャンドランプロットにおける０°から−１８０°のファイ角度もしくは０°から＋１８０°のプサイ角度を予測することができる。
上で言及した目的のタンパク質は、アミノ酸配列の定義された場所に非ネイティブアミノ酸（ｎｎＡＡ）を組み込むように操作されるタンパク質を含む。ｎｎＡＡのタンパク質への導入は、好ましい特性を有するタンパク質をもたらすことができる。ｎｎＡＡを目的のタンパク質またはポリペプチドに導入するための１つの方法は、タンパク質翻訳中に新生ポリペプチド鎖にｎｎＡＡを導入するためにアンバー（終止）コドンを認識するアミノアシル化直交ｔＲＮＡを使用する。しかし、ｎｎＡＡがそこに導入されたタンパク質の収量は、ｍＲＮＡ配列内の終結または終止コドンを認識することにより翻訳の終結を助長する翻訳終結複合体のタンパク質によって減少され得る。放出因子１（ＲＦ１）は、前記終結複合体の一部であり、ＵＡＧ（アンバー）終止コドンを認識する。アンバーコドンのＲＦ１認識は、ｎｎＡＡ組み込み部位での時期尚早の連鎖終結を促進することができ、これは、所望のタンパク質の収量を低減させる。本明細書に記載する方法は、細菌細胞溶解物中のＲＦ１の機能活性を減少させることによりこの問題を解決する。したがって、いくつかの実施形態において、必須標的タンパク質は、ＲＦ１である。ＲＦ１の機能活性は、ＯｍｐＴ１プロテアーゼ切断部位をＲＦ１に導入することによって減少される。ＯｍｐＴ１は、インタクト細菌の外側細胞膜上に位置する酵素である。したがって、改変ＲＦ１は、インタクト細胞ではＯｍｐＴ１の基質として利用できない。細菌膜が、例えば細菌溶解物の場合のように破壊されると、ＯｍｐＴ１酵素は、導入された切断部位で改変ＲＦ１と接触してそれを切断することができ、それによってＲＦ１の機能活性を低下させることができる。前記方法は、ＵＧＡ終止コドンを認識する翻訳終結複合体中にある他の放出因子、例えばＲＦ２、に応用することができる。前記方法は、インビトロ翻訳中にｍＲＮＡを分解するタンパク質、例えばＲＮａｓｅ酵素にも応用することができる。さらに、前記方法は、一般に、目的のタンパク質の転写および／または翻訳を阻害する細菌抽出物中のいずれのタンパク質にも応用することができる。
一般法
別段の定義がない限り、本明細書において用いるすべての専門および科学用語は、本発明が属する技術分野の通常の当業者が一般に理解している意味を有する。実施者は、当該技術の定義および用語については、特に、Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．Ｒ．およびＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．編、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第４版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２０１２）、ならびにＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（別冊９９）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０１２）に導かれ、前記参考文献は参照により本明細書に援用されている。標準的方法は、Ｂｉｎｄｅｒｅｉｆ、ＳｃｈｏｎおよびＷｅｓｔｈｏｆ（２００５）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ＲＮＡ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙにも出ており、前記参考文献には、ＲＮＡ操作および分析のための詳細な方法が記載されており、前記参考文献は、参照により本明細書に援用されている。組換え核酸を生成するための適切な分子技術の例、および多くのクローニング実習による当業者への指導に十分な説示は、Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．Ｒ．およびＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、（同上）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、（同上）；ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（第１５２巻Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．１９８７）；ならびにＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．１９９０）において見つけられ、前記参考文献は、参照により本明細書に援用されている。
タンパク質精製、クロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離および結晶化のための方法は、Ｃｏｌｉｇａｎら（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されている。無細胞合成のための方法は、ＳｐｉｒｉｎおよびＳｗａｒｔｚ（２００８）Ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙに記載されている。無細胞合成を用いて非天然アミノ酸をタンパク質に組み込む方法は、Ｓｈｉｍｉｚｕら（２００６）ＦＥＢＳ Ｊｏｕｒｎａｌ、２７３、４１３３−４１４０に記載されている。
ＰＣＲ増幅法は、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｉｎｎｉｓら、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．、１９９０に記載されている。増幅反応は、典型的に、増幅すべきＤＮＡ、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、２つのオリゴヌクレオチドプライマー、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、反応バッファーおよびマグネシウムを含む。典型的に、望ましい熱サイクル数は、１と２５の間である。プライマー設計およびＰＣＲ条件の最適化のための方法は、当該技術分野において周知であり、標準的な分子生物学テキスト、例えばＡｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第５版、Ｗｉｌｅｙ，２００２、およびＩｎｎｉｓら、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９０において見つけることができる。コンピュータプログラムは、要求される特異性および最適な増幅特性を有するプライマーの設計に有用である（例えば、Ｏｌｉｇｏ Ｖｅｒｓｉｏｎ ５．０（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））。いくつかの実施形態において、ＰＣＲプライマーは、ベクター内の特定の制限酵素部位への増幅ＤＮＡ断片の挿入を助長するために、制限エンドヌクレアーゼのための認識部位をさらに含有することがある。制限部位をＰＣＲプライマーの５’末端に付加させるべき場合、酵素によるさらに効率的な切断を可能にするために少数（例えば、２または３）の余分な５’塩基を含めることが好ましい。いくつかの実施形態において、ＰＣＲプライマーは、後続のインビトロ転写を可能にするためにＲＮＡポリメラーゼプロモーター部位、例えば、Ｔ７またはＳＰ６も含有することがある。インビトロ転写のための方法は、当業者に周知である（例えば、Ｖａｎ Ｇｅｌｄｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：１６６３−１６６７，１９９０；Ｅｂｅｒｗｉｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：３０１０−３０１４、１９９２を参照されたい）。
ＯｍｐＴ１切断可能タンパク質
本発明は、ＯｍｐＴ１などのタンパク質分解酵素によって切断および不活性化され得る標的タンパク質を提供する。プロテアーゼによって切断されるために、タンパク質分解性切断部位をタンパク質に導入するように、タンパク質を改変する。いくつかの実施形態において、改変標的タンパク質に導入される切断部位は、切断しやすいＯｍｐＴ１ペプチド結合であり、その切断しやすいＯｍｐＴ１を標的タンパク質の表面露出モチーフに導入する。ＯｍｐＴ１によって認識される切断部位は、２つの隣接する塩基性残基を含む。したがって、本明細書に記載する標的タンパク質は、ｐＨ７．０で正に荷電する２つの隣接する塩基性残基を含むように改変される。
少なくとも５０Å２のＢ因子を有する表面露出モチーフ内にＯｍｐＴ１切断部位を導入するためのタンパク質の改変
いくつかの実施形態では、標的タンパク質またはモチーフ領域のアミノ酸配列が複合体を形成していないときに少なくとも５０Å２のＢ因子を有する表面露出モチーフに切断しやすいＯｍｐＴ１ペプチド結合を導入するように、標的タンパク質を改変する。少なくとも５０Å２のＢ因子を有する表面露出モチーフの場所は、いくつかの方法で決定することができる。各原子についてのＢ因子は、結晶学タンパク質データバンク（ＰＤＢ）ファイルに与えられている。表面露出モチーフのＢ因子は、ピモール分子モデリングソフトウェアに組み込まれているＧｅｔＡｒｅａアルゴリズムを用いて算出することができる（ｐｙｍｏｌｗｉｋｉ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ／Ｇｅｔ＿Ａｒｅａでインターネットを参照されたい）。あるいは、タンパク質のＸ線結晶構造を入手できないが、そのタンパク質のＮＭＲ構造を入手できる場合、ランダムコイルインデックス（ＲＣＩ）を大きいＢ因子の代わりに使用してもよい（Ｂｅｒｊａｎｓｋｉｉ，Ｍ．Ｖ．ら、Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒａｎｄｏｍ ｃｏｉｌ ｉｎｄｅｘ ｔｏ ｓｔｕｄｙｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ、Ｊ Ｂｉｏｍｏｌ ＮＭＲ．２００８ Ｊａｎ；４０（１）：３１−４８．Ｅｐｕｂ ２００７ Ｎｏｖ ６を参照されたい）。
少なくとも５０Å２のＢ因子を有する表面露出モチーフにＯｍｐＴ１切断部位を導入するように標的タンパク質を改変するために、そのタンパク質のＸ線結晶構造からのＢ因子をアミノ酸配列にマッピングし、その配列を、大きいＢ因子を有する部位（単数または複数）に切断しやすいＯｍｐｔＴ１ペプチド結合を含むように組換え改変する。その後、組換え改変された標的タンパク質を、ＯｍｐＴ１を含有する細胞抽出物中でのそのタンパク質の分解について試験することができる。いくつかの実施形態において、Ｂ因子は、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０または１００Å２である。いくつかの実施形態において、Ｂ因子は、約５０Å２と約２００Å２の間、または約５０Å２と約１５０Å２の間、または約５０Å２と１２０Å２の間である。本明細書に記載する範囲は、終点間のすべての値を含むと解される。
約２５Å２と約２２５Å２の間の溶媒露出表面積合計を有する表面露出モチーフ内にＯｍｐＴ１切断部位を導入するためのタンパク質の改変
いくつかの実施形態では、約２５Å２と約２２５Å２の間の溶媒露出表面積合計を有する表面露出モチーフに切断しやすいＯｍｐＴ１ペプチド結合を導入するように、標的タンパク質を改変する。約２５Å２と約２２５Å２の間の溶媒露出表面積合計を有する表面露出モチーフの場所は、当該技術分野において公知の方法を用いて決定することができる。例えば、Ｆｒａｃｚｋｉｅｗｉｃｚ，Ｒ．およびＢｒａｕｎ，Ｗ．、「Ｅｘａｃｔ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ ｓｕｒｆａｃｅ ａｒｅａｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｇｒａｄｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．、１９、３１９−３３３（１９９８）に記載されているように、ソフトウェアルーチンＧＥＴＡＲＥＡを使用して交差原子の溶媒露出頂点の位置を突き止めることができる。したがって、ＧＥＴＡＲＥＡソフトウェアを使用して、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｒａｎｃｈウェブサイトｃｕｒｉｅ．ｕｔｍｂ．ｅｄｕ／ｇｅｔａｒｅａ．ｈｔｍｌでインターネットに提供されている形式（パラメータ：水プローブの半径＝１．４）を用いて原子座標をＰＤＢ（タンパク質データベース）形式で入力し、水プローブの所望の半径を指定し、そして所望のアウトプットレベルを指定することによって、タンパク質分子の溶媒露出表面積（溶媒和エネルギー）を算出することができる。溶媒露出表面積合計を決定するための他の方法は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，Ｄ．およびＭｃＬａｃｈｌａｎ，Ａ．Ｄ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ、３１９、１９９；Ｍａｒｋｌｅｙ，Ｊ．Ｌ．ら（１９９８）Ｐｕｒｅ ＆ Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．、７０、１１７；ならびにＷｅｓｓｏｎ，Ｌ．およびＥｉｓｅｎｂｅｒｇ，Ｄ．（１９９２）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．、１、２２７に記載されている。
ラマチャンドランプロット（Ｒａｍａｃｈａｄｒａｎ Ｐｌｏｔ）において０°から−１８０°のファイ角度または０°から＋１８０°のプサイ角度を示すタンパク質の位置にＯｍｐＴ１切断部位を導入するためのタンパク質の改変
いくつかの実施形態では、ラマチャンドランプロット（Ｒａｍａｃｈａｄｒａｎ Ｐｌｏｔ）において０°から−１８０°のファイ角度または０°から＋１８０°のプサイ角度を示すタンパク質の位置に切断しやすいＯｍｐＴ１ペプチド結合を導入するように、標的タンパク質を改変する。ラマチャンドランプロット（Ｒａｍａｃｈａｄｒａｎ Ｐｌｏｔ）において０°から−１８０°のファイ角度または０°から＋１８０°のプサイ角度を示す前記タンパク質中の位置の場所は、当該技術分野において公知の方法を用いて決定することができる。ファイおよびプサイ角度を算出するための方法は、例えば、Ｌｏｖｅｌｌ，Ｓ．Ｃ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、５０：４３７−４５０ （２００３）に記載されている。座標ファイルまたはＰＤＢファイルをインターネット上のｋｉｎｅｍａｇｅ．ｂｉｏｃｈｅｍ．ｄｕｋｅ．ｅｄｕのＭＯＬＰＲＯＢＩＴＹサーバーにアップロードすることによって、ラマチャンドランプロットにおけるファイおよびプサイ角度を決定することができる（Ｃｈｅｎ，Ｖ．Ｂ．ら、（２０１０）ＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙ：ａｌｌ−ａｔｏｍ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ Ｄ６６：１２−２１を参照されたい）。あるいは、インターネット上のｂｏｓｃｏｈ．ｃｏｍ／ｒａｍａｐｌｏｔで利用できるＲａｍａｃｈａｎｄｒａｎ Ｐｌｏｔ Ｅｘｐｌｏｒｅｒを使用することができる。
本明細書に記載する改変タンパク質は、無細胞合成システムにおいてタンパク質の生産を阻害することができるので選択される。したがって、いくつかの実施形態において、本明細書に記載する改変タンパク質は、細菌無細胞抽出物における完全長タンパク質の生産を減少させる。例えば、タンパク質ＲＦ１およびＲＦ２は、ｍＲＮＡにおける終止コドンを認識してポリペプチド鎖の翻訳を終結させる終結複合体の一部である。本明細書に記載の無細胞翻訳システムを使用してタンパク質に非ネイティブアミノ酸を組み込むとき、翻訳の時期尚早の終結は、望ましくない。終結複合体による終止コドンの認識を低減させることで、ｎｎＡＡを含むタンパク質の収量を増加させることができる。したがって、いくつかの実施形態では、ＲＦ１および／またはＲＦ２タンパク質、またはそれらの機能ホモログが複合体を形成していないときに少なくとも５０Å２のＢ因子を有する表面露出モチーフ内にＯｍｐＴ１切断部位を含有するように、ＲＦ１および／またはＲＦ２タンパク質、またはそれらの機能ホモログを改変する。いくつかの実施形態では、約２５Å２と約２２５Å２の間の溶媒露出表面積合計を有する表面露出モチーフ内にＯｍｐＴ１切断部位を含有するように、ＲＦ１および／またはＲＦ２タンパク質、またはそれらの機能ホモログを改変する。いくつかの実施形態では、ラマチャンドランプロット（Ｒａｍａｃｈａｄｒａｎ Ｐｌｏｔ）において０°から−１８０°のファイ角度または０°から＋１８０°のプサイ角度を示すタンパク質の位置にＯｍｐＴ１切断部位を含有するように、ＲＦ１および／またはＲＦ２タンパク質、またはそれらの機能ホモログを改変する。いくつかの実施形態において、前記機能性改変タンパク質は、ＲＦ１（配列番号１）またはＲＦ２（配列番号２）と実質的に同様である。
ＲＦ１タンパク質は、大腸菌からのＲＦ１野生型原型タンパク質（配列番号１）、ならびに多型変異および組換えにより生じさせた突然変異タンパク質も含む。ＲＦ１タンパク質は、野生型と実質的に同じ生物活性また機能的能力（例えば、いずれかの少なくとも８０％）を有するものと定義され、原型タンパク質ＲＦ１との少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％の配列同一性を有し、および／または原型タンパク質配列番号１に対して産生されたポリクローナル抗体に結合する。
ポリクローナル抗体へのＲＦ１タンパク質の結合に関して、ＲＦ１タンパク質は、指定イムノアッセイ条件下でバックグラウンドの少なくとも２倍の特異性で特定抗体に結合することになり、ここでの抗体は、その試料中に存在する他のタンパク質に有意な量で実質的に結合しない。例えば、ＲＦ１（配列番号１）に対して産生されたポリクローナル抗体、またはそれらのアイソフォームもしくは部分を、ＲＦ１と特異的免疫反応性であり、かつＲＦ１の多型変異体を除いて他のタンパク質とは特異的免疫反応性でないポリクローナル抗体しか得られないように、選択することができる。特定のタンパク質と特異的免疫反応性の抗体を選択するために様々なイムノアッセイ形式を用いてよい。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイは、タンパク質と特異的免疫反応性の抗体を選択するために常例的に用いられる（例えば、特異的免疫性を判定するために用いることができるイムノアッセイ形式および条件の説明については、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８）を参照されたい）。典型的に、特異的または選択的反応は、バックグラウンドシグナルまたはノイズの少なくとも２倍であることになり、およびより典型的にはバックグランドの１０倍より大きく１００倍までであることになる。
実施例に記載するように、表面露出モチーフ内に機能性ＯｍｐＴ１切断部位を導入するようにＲＦ１を首尾よく改変した。しかし、推定二塩基性ＯｍｐＴ１切断部位のＲＦ１への導入は、ＯｍｐＴ１によって効率的に切断され得るタンパク質を必ずしももたらさなかった。例えば、単一アミノ酸置換Ｍ７４Ｒ、Ｅ７６Ｋ、Ｅ８４Ｋ、Ａ８５Ｒ、Ｅ８７Ｒ、Ｅ１０８Ｒ、Ｔ２９３ＲおよびＳ３０４Ｋを、ＲＦ１のループ領域内の既存のＡｒｇまたはＬｙｓのそばに導入し、それによって二塩基性切断部位を生じさせた。しかし、これらの変異体は、ＲＦ１変異体がＯｍｐＴ陽性細胞抽出物において発現されると、効率的に切断されなかった。それ故、本発明は、ＲＦ１などのタンパク質を、そのタンパク質がＯｍｐＴ１などのプロテアーゼによって切断され得るように改変することができるという予想外の結果を提供する。
当業者には理解されるであろうが、導入された切断部位は、ＯｍｐＴ１の機能性ホモログもしくは断片に由来するＯｍｐＴ１様酵素活性またはＯｍｐＴ１様活性を有するように改変されるタンパク質に由来するＯｍｐＴ１様酵素活性を有する酵素によって切断され得る。
ＯｍｐＴ１による非改変タンパク質の切断
本明細書に記載するタンパク質は、内因性ＯｍｐＴ１プロテアーゼ切断部位を含有することもできる。例えば、いくつかの実施形態において、非改変または野生型タンパク質は、ＯｍｐＴ１によって切断可能である切断しやすいＯｍｐＴ１ペプチド結合を含む二塩基性アミノ酸配列を含有する。ＯｍｐＴ１によるタンパク質の切断は、精製タンパク質を、ＯｍｐＴ１を発現する細菌無細胞抽出物とともにインキュベートし、その場合の切断量と、ＯｍｐＴ１を発現しない無細胞抽出物において検出された切断量とを比較することによって試験することができる。いくつかの実施形態において、内因性ＯｍｐＴ１切断部位を含有する非改変タンパク質は、正常な細胞成長または機能に不可欠であるまたは必要とされるが、無細胞抽出物中のタンパク質の翻訳を阻害する。したがって、本発明は、タンパク質が、細胞成長中に機能性であるが、ＯｍｐＴ１を発現する細胞抽出物中では不活性化されるように不活性化のタイミングを制御することができる、ＯｍｐＴ１での切断による非改変タンパク質の選択的不活性化方法を提供する。
テンプレート
本発明のタンパク質を生産するために、核酸テンプレートが必要である。本発明のテンプレートを使用して、切断しやすいＯｍｐＴ１切断部位を含むように改変されたタンパク質を生産することができる。本発明のテンプレートを使用して、無細胞システムにおいて発現される目的のタンパク質を生産することもできる。無細胞タンパク質合成のためのテンプレートは、ｍＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかであることができる。前記テンプレートは、目的の任意の特定の遺伝子についての配列を含むことができ、完全長ポリペプチドをコードすることもあり、またはその任意の長さの断片をコードすることもある。タンパク質合成テンプレートとして役立つ核酸は、場合によっては天然源から誘導され、またはそれらは、合成品または組換え体であることができる。例えば、ＤＮＡは、組換えＤＮＡ、例えば、プラスミド、ウイルスなどであることができる。
１つの実施形態において、ＤＮＡテンプレートは、ＯｍｐＴ１切断部位を含む標的タンパク質をコードするＯＲＦを含む。例えば、ＯＲＦは、正常な細胞成長および生存に必要とされる改変標的タンパク質をコードすることができるが、その活性は、無細胞抽出物におけるタンパク質の収量を直接または間接的に減少させる。したがって、ＯＲＦは、終結複合体のタンパク質成分、例えばＲＦ１もしくはＲＦ２またはそれらの改変変異体、をコードすることがある。ＯＲＦは、ＲＮＡテンプレートを分解するＲＮａｓｅをコードすることもある。
別の実施形態において、ＤＮＡテンプレートは、非ネイティブアミノ酸を含むように改変される目的のタンパク質をコードするＯＲＦを含む。したがって、ＯＲＦは、アミノ酸配列の被定義位置にｎｎＡＡを含む、生物学的重要性を有するいずれのタンパク質をコードしてもよい。目的のかかるタンパク質の非限定的な例としては、抗体、ホルモン、サイトカインおよびウイルスタンパク質が挙げられる。本発明は、非ネイティブアミノ酸の組み込みのためにセンスコドンを使用し、当該技術分野において一般に見いだされるような直交成分の必要を避ける。これらの実施形態において、ＯＲＦは、少なくとも１つのイソ受容センスコドンを含む。ＯＲＦは、非ネイティブアミノ酸がチャージされたｔＲＮＡを認識する被定義アミノ酸残基に対応する１つのコドンをさらに含む。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、非ネイティブアミノ酸がチャージされたｔＲＮＡを結合するアンバーコドン（ＵＡＧ）を含む。他の実施形態において、前記テンプレートは、非ネイティブアミノ酸を目的のタンパク質に組み込むために選択するか否かにかかわらず、完全な機能性のタンパク質を翻訳することができる。
目的のＯＲＦを含むＤＮＡテンプレートを、少なくとも１つのプロモーターに、ならびに限定ではないがレプレッサー、アクチベーター、転写および翻訳エンハンサー、ＤＮＡ結合タンパク質などを含む１つ以上の他の調節配列に、作動可能に連結することになる。ここでの使用に適する量のＤＮＡテンプレートは、周知のクローニングベクターおよび宿主におけるＤＮＡの増幅によって、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生産することができる。
ＤＮＡテンプレートは、発現されたタンパク質の単離および精製に有用なアミノ酸配列、例えばクロマトグラフィー媒体に高親和性で結合するポリアミノ酸タグ、をコードする核酸配列にインフレームで連結されたＯＲＦをさらに含むことができる。前記ポリアミノ酸タグをＯＲＦの５’末端または３’末端に配置して、発現されるタンパク質にアミノ末端またはカルボキシル末端タグをそれぞれもたらすことができる。１つの実施形態では、ポリヒスチジンタグをコードする配列にインフレームでＯＲＦを連結させる。
１つの実施形態は、細菌溶解物を使用する。所望のタンパク質エンコーディングＤＮＡをプロモーター配列および細菌リボソーム結合部位（シャイン・ダルガノ配列）の両方に作動可能に連結させることにより、細菌発現のためのＤＮＡテンプレートを構築することができる。本発明の無細胞転写−翻訳方法においてＤＮＡテンプレートとともに使用するのに適するプロモーターとしては、その細菌抽出物が由来する細菌においてインビボ転写を促進することができる任意のＤＮＡ配列が挙げられる。宿主細胞内での転写を効率的に開始させることができるプロモーターが好ましい。所望のタンパク質をコードするＤＮＡ、ならびに所望のプロモーターおよびシャイン・ダルガノ（ＳＤ）配列を含有するＤＮＡを、当該技術分野において公知の様々な方法によって調製することができる。あるいは、所望のＤＮＡ配列を既存のクローンから得ることができ、または入手できない場合は、ＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、ライブラリークローンから所望のＤＮＡ配列を構築することができる。
目的のタンパク質をコードするＲＮＡテンプレートは、細菌リボソーム結合部位（ＳＤ配列）を有するｍＲＮＡであって、反応混合物中のリボソームがかかるｍＲＮＡに結合し、かかるｍＲＮＡを翻訳することができるように前記ＳＤ配列が所望の遺伝子のコーディング配列に作動可能に連結されているものであるｍＲＮＡを発現するように構築されたベクターで形質転換された組換え宿主細胞から、適便に生産することができる。したがって、前記ベクターは、ＲＮＡテンプレート合成に使用される特定の宿主細胞においてＤＮＡの転写を促進することができる任意のプロモーターを担持する。
細菌から分解されていないＲＮＡを抽出することは困難であるので、より高等な真核細胞培養物がＲＮＡテンプレートの生産には好ましい。原則的には、脊椎動物細胞培養物と無脊椎動物細胞培養物の両方を含む、任意のより高等な真核細胞培養物が実行可能である。ＲＮＡテンプレートは、宿主細胞培養物から抽出された全細胞ＲＮＡ画分の中から適便に単離することができる。全細胞ＲＮＡは、当該技術分野において公知の任意の方法によって宿主細胞培養物から単離することができる。ＲＮＡテンプレートを、真核宿主細胞によって認識されるポリアデニル化シグナルをその３’末端に含有するように設計すると、細胞ｍＲＮＡの大部分とともに所望のＲＮＡテンプレートを単離することができる。かくしてその宿主細胞は、ポリアデニレート（ポリ（Ａ））テールを有するＲＮＡテンプレートを生産することになる。ポリアデニル化ｍＲＮＡは、当該技術分野において公知の任意の方法を用いてオリゴデオキシチミジレート（オリゴ（ｄＴ））−セルロースカラムでのアフィニティークロマトグラフィーによって大量の細胞ＲＮＡから分離することができる。所望のタンパク質をコードするｍＲＮＡのサイズが既知である場合、ｍＲＮＡ調製物を、そのＲＮＡのアガロースゲル電気泳動によって、特定のサイズのｍＲＮＡ分子についてさらに精製することができる。
ＯｍｐＴ１切断部位を有する改変タンパク質の発現
核酸テンプレートを生産したら、そのテンプレートを使用して、細胞においてＯｍｐＴ１切断部位を含む組換え標的タンパク質を発現させるか、または無細胞翻訳システムにおいて改変組換え標的タンパク質を合成する。例えば、テンプレートを溶解分解物に、そのテンプレートのタンパク質への翻訳に十分な条件下で、添加することができる。前記細胞溶解物は、細菌細胞または真核細胞からのものであることができる。その後、発現されたタンパク質を、下で説明するように、当該技術分野において公知の方法を用いて精製することができる。
活性について試験するためのタンパク質の精製
ＯｍｐＴ１切断部位を含有するタンパク質を、当該技術分野において標準的であるように精製することができる。本発明のタンパク質は、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸または塩基抽出、カラムクロマトグラフィー、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などをはじめとする（しかしこれらに限定されない）方法によって回収および精製することができる。例えば、Ｎ末端ヒスチジンタグを含むタンパク質を、金属イオン、例えばニッケルおよびコバルト、を含有するアフィニティー媒体を使用して精製することができる。その後、そのアフィニティー媒体を洗浄して未結合のタンパク質を除去し、結合したタンパク質を溶離し、回収する。いくつかの実施形態では、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を使用して、ポリヒスチジンタグ付きタンパク質を精製する。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）または高い純度が望まれる他の適する方法を用いて、改変タンパク質を精製することができる。好ましい精製方法を実施例１に提供する。
精製後、ＯｍｐＴ１切断部位を含有するタンパク質は、関連ポリペプチドの所望の高次構造とは異なる高次構造を有し得る。したがって、精製されタンパク質を、好ましいタンパク質高次構造をもたらす条件に付すことができる。様々な精製／タンパク質フォールディング方法が当該技術分野において公知である、例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 第１８２号：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．１９９０）； Ｂｏｌｌａｇら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ、第２版（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎ．Ｙ．１９９６）。一般に、発現されたポリペプチドを変性させ、還元し、そしてその後、それらのポリペプチドを好ましい高次構造に再びフォールディングさせることが望ましいこともある。例えば、グアニジン、尿素、ＤＴＴ、ＤＴＥおよび／またはシャペロンを目的の翻訳産物に付加させることができる。タンパク質の還元、変性および再生方法は、当業者には周知である。例えば、Ｄｅｂｉｎｓｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１４０６５−７０（１９９３）；Ｂｕｃｈｎｅｒら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０５：２６３−７０（１９９２）を参照されたい。
ＯｍｐＴ１切断部位を有する改変タンパク質の機能性生物活性の確認
本明細書に記載する改変タンパク質の所望の使用によっては、改変タンパク質が、改変されていない野生型タンパク質に匹敵する生物活性を有することが重要であり得る。例えば、改変すべきタンパク質が、細菌の正常な成長に重要である場合、細胞を溶解して翻訳のための無細胞溶解物を生じさせるまで、タンパク質の正常な活性レベルを保持することが望ましい。したがって、本発明の方法は、ネイティブまたは野生型タンパク質に匹敵する生物活性を有するＯｍｐＴ１切断部位を含有する改変タンパク質を提供する。野生型の活性レベルまたは野生型に匹敵する活性レベルを保持する改変タンパク質を本明細書では機能性タンパク質と呼ぶ。機能アッセイで活性レベルを判定することによってタンパク質の比活性を判定してもよい。あるいは、非機能アッセイ、例えば免疫染色、ＥＬＩＳＡ、クマシー（ｃｏｏｍａｓｉｅ）または銀染色ゲルでの定量などで、存在するタンパク質の量を定量し、生物活性タンパク質の全タンパク質に対する比を決定することによって、タンパク質の比活性を判定してもよい。一般に、かくして定義される比活性が、野生型タンパク質の少なくとも約５０％であるか、または野生型タンパク質のものに比べて少なくとも約６０％、約７０％、約８０％、約９０％以上である場合、改変タンパク質は、野生型タンパク質に匹敵する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．１９８９）を参照されたい。
改変タンパク質の機能活性を様々な方法で試験することができる。例えば、改変タンパク質を発現する細菌の成長速度を、野生型、対照または非改変タンパク質を発現する細菌の成長速度と比較することができる。改変タンパク質の機能活性を、ｍＲＮＡテンプレート内の終止コドンで翻訳を終結させるその改変タンパク質の能力を判定することによって試験することもできる。翻訳の終結は短縮型タンパク質をもたらすので、実施例において説明し、図１に示すように、短縮型タンパク質と完全長タンパク質の量を測定し、短縮型タンパク質の完全長タンパク質に対する比を野生型タンパク質から得られるものと比較することによって、改変タンパク質の相対活性を定量することができる。改変タンパク質は、短縮型タンパク質の完全長タンパク質に対する比が、野生型タンパク質を用いる短縮型タンパク質の完全長タンパク質に対する比に比べて少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％以上である場合、野生型タンパク質に匹敵する活性を有する。
改変タンパク質がＯｍｐＴ１によって切断可能であることの確認
改変タンパク質が、野生型または非改変タンパク質に匹敵する生物活性を有すると判定されたら、それらの改変タンパク質を試験して、それらがＯｍｐＴ１によって切断されることを判定する。本発明の改変タンパク質がＯｍｐＴ１によって切断されることを試験するための１つの方法は、機能性ＯｍｐＴ１を含有する無細胞抽出物に、ＯｍｐＴ１切断部位を含有する組換えタンパク質を添加することである。改変タンパク質が、ＯｍｐＴ１によって切断される場合、それは、ゲル電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）中にインタクトタンパク質より低い見かけの分子量で泳動することになる。改変タンパク質は、その改変タンパク質への放射性標識の組み込みに適する条件下で翻訳反応に１４Ｃなどの放射性標識を含めることによって検出することができる。放射性標識タンパク質の泳動は、例えばゲルのオートラジオグラフで、視覚化することができる。ＯｍｐＴ１による改変タンパク質の切断を、ウェスタンブロット分析によって、例えば、ゲルからタンパク質を固体支持体に転写し、インタクトおよび切断されたタンパク質に結合する抗体とその支持体を接触させ、検出可能な標識を使用して結合抗体を視覚化することによって、検出することもできる。
ＯｍｐＴ１による切断活性は、ＯｍｐＴ１による改変タンパク質の切断の量または速度を非改変タンパク質のものと比較することによって判定することができる。例えば、ＯｍｐＴ１による改変タンパク質の切断速度は、特定条件下で野生型タンパク質の切断速度の５０％より高いことができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載する改変タンパク質の切断速度は、その改変タンパク質および野生型タンパク質が、ＯｍｐＴ１を発現する細菌からの無細胞抽出物中に同様の濃度（例えば、０．１〜１．０マイクロモルの濃度）で存在するとき、３０℃で３０分後、野生型タンパク質の切断速度の５０％より高い。いくつかの実施形態において、前記改変タンパク質が、ＯｍｐＴ１を発現する細菌からの無細胞抽出物中に０．１〜１．０マイクロモルの濃度で存在するとき、３０℃で６０分後、前記改変タンパク質の９０％より多くがＯｍｐＴ１によって切断される。
本明細書に記載する改変タンパク質に導入されるＯｍｐＴ切断部位が、ＯｍｐＴ様酵素活性を有するいずれのタンパク質またはポリペプチドによっても切断可能であることは、理解されるであろう。必要なのは、ＯｍｐＴ１様酵素が、ＯｍｐＴ切断部位を含有するように改変されたタンパク質を切断できることだけである。例えば、ＯｍｐＴ様タンパク質分解活性は、野生型もしくはネイティブＯｍｐＴ１、またはその機能性ホモログもしくは断片によって提供され得る。ＯｍｐＴ様活性は、ＯｍｐＴ１と実質的に同一または実質的に同様であるタンパク質によっても提供され得る。例えば、ＯｍｐＴ様活性を有するタンパク質は、ＯｍｐＴ１との少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の配列同一性を有することができる。いくつかの実施形態において、ＯｍｐＴ様活性を有するタンパク質は、配列番号３と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％同一である。いくつかの実施形態において、ＯｍｐＴ１活性を有するタンパク質は、ＯｍｐＴ１に結合するポリクローナル抗体およびその変異体によって特異的に結合される。ＯｍｐＴ１に結合するポリクローナル抗体およびそれらの機能性変異体の選択は、ＲＦ１を結合するポリクローナル抗体を選択するために本明細書に記載するように行うことができる。
ＯｍｐＴ１切断可能タンパク質での細菌の形質転換
改変された必須標的タンパク質が、上記のように、野生型機能を保持するとおよびＯｍｐＴ１によって切断されやすいと判定されたら、それらの改変タンパク質をコードする核酸を細菌に形質転換させる。細菌ゲノムへの核酸の組み込みに適する条件下で細菌を核酸で形質転換させることができる。例えば、実施例において説明するようなオリゴヌクレオチド媒介対立遺伝子置換を用いて、本明細書に記載するＯｍｐＴ１切断部位をコードする配列を有するオリゴヌクレオチドで細菌を形質転換させることができる。細菌ゲノム内への所望の突然変異の組み込みは、例えば、実施例において説明するようなミスマッチ増幅突然変異アッセイ（ＭＡＭＡ）ＰＣＲを用いて、形質転換コロニーをスクリーニングすることによって、判定することができる。
無細胞翻訳システムにおけるタンパク質の収量を増加させるためのＯｍｐＴ１切断可能タンパク質の使用
ＯｍｐＴ１切断部位を有する改変標的タンパク質は、活性ＯｍｐＴ１プロテアーゼを含有する細菌細胞抽出物において発現されたとき、効率的に分解される。本発明の様々な使用の中でも、ＯｍｐＴ１によって切断可能であるように改変される阻害タンパク質の注意深い選択は、無細胞合成システムの生産性を向上させることができる。例えば、１つの好ましい使用では、ＯｍｐＴ１による選択標的タンパク質の切断は、無細胞抽出物において非ネイティブアミノ酸を含む完全長タンパク質の翻訳効率を向上させることができる。一定の実施形態では、非ネイティブアミノ酸を、ｍＲＮＡテンプレートに導入されたアンバーコドンに組み込む。上で説明したように、アンバーコドンへの非ネイティブアミノ酸の組み込みは、終結複合体タンパク質、例えばＲＦ１およびＲＦ２、によって阻害され得る。したがって、特に望ましい実施形態において、ＯｍｐＴ１によるＲＦ１および／またはＲＦ２の切断および不活性化は、非ネイティブアミノ酸をアンバーコドンに組み込むように操作されたタンパク質の収量を増加させることができる。
非ネイティブアミノ酸
上で説明したように、１つの好ましい使用では、ＯｍｐＴ１による改変標的タンパク質の分解は、無細胞合成システムにおける非ネイティブアミノ酸を含むタンパク質の収量を増加させる。本発明において使用する非ネイティブアミノ酸は、典型的に、アミノ酸の１つ以上の化学改変誘導体または類似体を含み、それらの化学構造は、式ＮＨ３−（ＣＲ）−ＣＯＯＨを有し、この式中のＲは、天然アミノ酸を定義する２０のカノニカル置換基のいずれでもない。適する非ネイティブアミノ酸誘導体は、ベンダー、例えば、Ｂａｃｈｅｍ Ｉｎｃ．（カリフォルニア州トランス）；Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（マサチューセッツ州ケンブリッジ）；Ｓｅｎｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（スイス国ディールスドルフ）；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州セントルイス）；Ｓｙｎｔｈｅｔｅｃ，Ｉｎｃ（オレゴン州オールバニー）から市販されている。好ましくは、非ネイティブアミノ酸としては、グリシン、チロシン、グルタミン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、プロリン、トリプトファン、ロイシン、メチオニン、リジン、アラニン、アルギニン、アスパラギン、バリン、イソロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、ヒスチジンの誘導体および／または類似体、ならびにβアミノ酸およびホモログ、ＢＯＣ保護アミノ酸、ならびにＦＭＯＣ保護アミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。
まだ市販されていない非ネイティブアミノ酸誘導体、アナログおよびミメティックの生成をいくつかの方法で遂行することができる。例えば、１つの方法は、当該技術分野において公知の有機化学法を用いる目的の非ネイティブアミノ酸の合成であるが、もう１つの方法は、当該技術分野において公知の化学的酵素的合成法の使用である。例えば、Kamphuisら, Ann. N. Y. Acad. Sci., 672:510-527, 1992; Ager DJおよびFotheringham IG, Curr. Opin. Drug Discov. Devel., 4:800-807, 2001;ならびにWeinerら, Chem. Soc. Rev., 39:1656-1691, 2010; Asymmetric Syntheses of Unnatural Amino Acids and Hydroxyethylene Peptide Isosteres, Wieslaw M. Kazmierski編, Peptidomimetics Protocols, Vol. 23, 1998;ならびにUnnatural Amino Acids, Kumar G. GadamasettiおよびTamim Braish編, Process Chemistry in the Pharmaceutical Industry, Vol. 2, 2008を参照されたい。
例えば、Ｗｉｅｓｌａｗ Ｍ． Ｋａｚｍｉｅｒｓｋｉ編、Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、第２３巻、１９９８；Ｗａｎｇ Ｌら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１６：３２３−３３６、２００９；ならびにＷａｎｇ Ｆ、Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｓ、Ｇｕｏ Ｊ、Ｓｈｅｎ ＷおよびＳｃｈｕｌｔｚ ＰＧ．、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、５：ｅ９３５４、２０１０に記載されているような、多くの手順およびプロトコルを、非ネイティブアミノ酸の合成に利用できることは、当業者には分かるであろう。
非ネイティブアミノ酸は、非ネイティブＬ−およびＤ−αアミノ酸を含むことがある。Ｌ−αアミノ酸は、当該技術分野において公知の方法、例えば、これに限定されないが、アルキンとイミノ酢酸エチルの水素化コンジュゲーションのロジウム触媒Ｃ−Ｃ結合形成による水素媒介還元カップリング（Ｋｏｎｇら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２７：１１２６９−１１２７６、２００５）によって、化学合成することができる。あるいは、代謝工学による半合成生産を利用することができる。例えば、発酵手順を用いて、再操作されたシステイン生合成経路を内部に持つ大腸菌からの非ネイティブアミノ酸を合成することができる。（Ｍａｉｅｒ ＴＨ、Ｎａｔｕｒｅ、２１：４２２−４２７、２００３を参照されたい）。αアミノ酸のラセミ混合物を、（Ｚｕｅｎｄら、Ｎａｔｕｒｅ、４６１；９６８−９７０（２００９）に記載されているような）不斉ストレッカー合成を用いて、または（Ｔａｙｌｏｒら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１６：４１２−４１９、１９９８において見つけることができるような）大規模合成のためのトランスアミナーゼ酵素を使用して、生産することができる。環状エーテル求電子試薬でのグリシン由来シッフ塩基またはニトロアセテートのアルキル化、続いて酸誘導開環、そしてＮＨ４ＯＨ中での環化によって二環式第三級αアミノ酸を生産してもよい（Ｓｔｒａｃｈａｎら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、７１：９９０９−９９１１（２００６）を参照されたい）。
非ネイティブアミノ酸は、βアミノ酸をさらに含むことがあり、βアミノ酸は、代謝に対して著しく安定性であり、遅い微生物分解を示し、ならびにプロテアーゼおよびペプチダーゼに対して本質的に安定性である。βアミノ酸の合成の例は、Ｔａｎ ＣＹＫおよびＷｅａｖｅｒ ＤＦ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、５８：７４４９−７４６１、２００２に記載されている。
場合によっては、非ネイティブアミノ酸は、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−（Ｂｏｃ）保護または（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル（Ｆｍｏｃ）保護アミノ酸を含む（しかしこれらに限定されない）、固相ペプチド合成に一般に使用される化学修飾アミノ酸を含む。例えば、ロイシン、メチオニン、トレオニン、トリプトファンおよびプロリンのＢｏｃ誘導体は、Ｓａｌａｄｉｎｏら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、６４：８４６８−８４７４、１９９９に記載されているような選択的３，３−ジメチルジオキシラン側鎖酸化によって生産することができる。αアミノ酸のＦｍｏｃ誘導体は、ニトロ酢酸エチルのアルキル化および誘導体への変換によって合成することができる（Ｆｕら、Ｊ．Ｏｒｇ Ｃｈｅｍ．、６６：７１１８−７１２４、２００１を参照されたい）。
本発明において使用することができる非ネイティブアミノ酸は、２０のカノニカルアミノ酸置換基の非ネイティブ類似体または誘導体を、これらに限定されないが、含むことがある。様々な非ネイティブアミノ酸の合成が、当該技術分野において公知の一連の化学的および化学的酵素的方法を必要とすることがあることは、当業者には理解されるであろう。いくつかの実施形態では、各非ネイティブアミノ酸の特定の誘導体に特異的な当該技術分野において公知の手順に従って、非ネイティブアミノ酸を合成してもよい。Ｓｙｃｈｅｖａら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、７６：７１２−７１８、２００７には、非ネイティブアミノ酸ノバリンおよびノルロイシンを合成するための手順が記載されている。実用的立体選択的合成によってジアリル化プロリン誘導体を生産することができる（Ｂｅｌｖｉｓｉら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、５７：６４６３−６４７３、２００１を参照されたい）。例えば、トリプトファン誘導体は、Ｊａｎｃｚｕｋら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、４３：４２７１−４２７４、２００２に記載されているように、インド（ｉｎｄｏ）のイッテルビウムトリフレート触媒求電子置換によって合成することができ、および５−アリールトリプトファン誘導体の合成は、Ｗａｎｇら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、５８：３１０１−３１１０、２００２に詳述されている。非ネイティブセリンアナログは、第１級アルコキシラジカルのβ−開裂によって生産することができる（Ｂｏｔｏら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、７２：７２６０−７２６９、２００７を参照されたい）。あるいは、フェニルセリン合成のための手順が、Ｋｏｓｋｉｎｅｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、３６：５６１９−５６２２、１９９５に記載されている。Ｌ−フェニルグリシンの合成のための手順は、Ｃｈｏら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ．Ｅｎｇ．、１１；２９９−３０５、２００６に記載されている。そしてＤ−４−ヒドロキシフェニルグリシンの化学的酵素的合成方法は、Ｙｕら、Ｆｏｌｉａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（Ｐｒａｈａ）、５４：５０９−１５；２００９に記載されている。２−ナフチルアラニンまたはＢｏｃ保護２−ナフチルアラニンの生産の非限定的な例は、Ｂｏａｚら、Ｏｒｇ．Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．、９：４７２−４７８；２００５に詳述されている。ヨード−Ｌ−チロシンおよびｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニンの合成は、Ｈｉｎｏ Ｎ、Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．、１：２９５７−２９６２、２００７に詳述されている。
チャージされたｔＲＮＡ（charged tRNA）
本明細書に記載する非ネイティブアミノ酸を所望のポリペプチドに組み込むために、上で説明したｎｎＡＡがイソ受容センスまたはアンバーコドンｔＲＮＡにチャージされる必要がある。本明細書において用いる場合のｔＲＮＡにチャージされる反応は、所望のイソ受容センスコドンまたはアンバーコドンｔＲＮＡを目的のそれらのそれぞれのアミノ酸でアミノアシル化させるインビトロｔＲＮＡアミノアシル化反応を指す。ｔＲＮＡにチャージする反応は、チャージする反応混合物、イソ受容体センスｔＲＮＡ、を含み、本発明において使用する場合、天然アミノ酸を含むこともあり、または非ネイティブアミノ酸を含むこともある。ｔＲＮＡにチャージする反応を、無細胞翻訳反応と同じ反応でインサイチューで行うことができ、または別の反応で行うことができ、この場合は、その後、そのチャージされたｔＲＮＡを無細胞翻訳反応に加える。
ｔＲＮＡにチャージする反応において使用されることになるｔＲＮＡ分子は、適切な５’および３’プライマーの存在下でのＰＣＲによる増幅後に選ばれた任意のｔＲＮＡのための合成ＤＮＡテンプレートから合成することができる。Ｔ７プロモーター配列を含有する、得られた二本鎖ＤＮＡテンプレートを、その後、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用してインビトロで転写してｔＲＮＡ分子を生産し、その後、それをｔＲＮＡにチャージする反応に加える。
ｔＲＮＡにチャージする反応は、タンパク質合成反応とは別の所望のアミノ酸でセンスコドンまたはアンバーコドンｔＲＮＡ分子をアミノアシル化する任意の反応であることができる。この反応は、抽出物、人工反応混合物、または両方の組み合わせで行うことができる。適するｔＲＮＡアミノアシル化反応条件は、当業者には周知である。典型的に、ｔＲＮＡアミノアシル化を、６．５から８．５の範囲のｐＨ値を有する生理的バッファー、０．５〜１０ｍＭ 高エネルギーリン酸（例えば、ＡＴＰ）、５〜２００ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０〜２００ｍＭ ＫＣｌ中で行う。好ましくは、前記反応を、還元剤（例えば、０〜１０ｍＭ ジチオトレイトール）の存在下で行う。アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼを外因的に添加する場合、そのシンセターゼの濃度は、典型的には１〜１００ｎＭである。これらの条件、例えば、ｔＲＮＡアミノアシル化を最適化（予備選択されたアミノ酸に対する高い特異性、高収率、および最低架橋反応）するように変更することができることは、当業者には容易に分かるであろう。
本発明の他の実施形態では、アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼによってイソ受容またはアンバーｔＲＮＡにチャージされる。ｔＲＮＡにチャージする反応は、チャージするべきイソ受容センスｔＲＮＡに特異的なネイティブアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ、操作されたアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ、または１タイプより多くのタイプのアミノ酸をｔＲＮＡ分子にチャージすることができる「無差別（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）」アミノアシルｔ−ＲＮＡシンセターゼのいずれかを利用することができる。無差別アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼは、それら自体が操作されていてもよいし、または自然界で見つけられることもある内因的に生産されたアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼを含んでもよい。アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼを使用してイソ受容ｔＲＮＡにネイティブおよび非ネイティブアミノ酸をチャージする方法は、国際公開第２０１０／０８１１１０号に記載されており、その内容は、参照により本明細書に援用されている。
翻訳システム
次に、上で説明したチャージされるイソ受容センスまたはアンバーｔＲＮＡを、予備選択（被定義）位置に非ネイティブアミノ酸を有する所望のポリペプチドまたはタンパク質の合成のための核酸テンプレートとともに無細胞抽出物、細胞溶解物または再構成翻訳システムを含むことができる翻訳システムと組み合わせる。前記反応混合物は、合成すべき高分子のためのモノマー、例えばアミノ酸、ヌクレオチドなど、ならびに合成に不可欠であるような補因子、酵素および他の試薬、例えばリボソーム、ｔＲＮＡ、ポリメラーゼ、転写因子などをさらに含むことになる。上記成分、例えば無細胞抽出物、核酸テンプレートおよびアミノ酸に加えて、タンパク質合成に特に必要とされる材料を反応に加えてもよい。前記材料としては、塩、フォリン酸、サイクリックＡＭＰ、タンパク質または核酸分解酵素の阻害剤、タンパク質合成の阻害剤または調節剤、酸化／還元電位の調整剤、非変性性界面活性剤、バッファー成分、スペルミン、スペルミジン、プトレッシンなどが挙げられる。様々な無細胞合成反応システムが当該技術分野において周知である。例えば、Kim, D.M.およびSwartz, J.R. Biotechnol. Bioeng. 66:180-8 (1999); Kim, D.M.およびSwartz, J.R. Biotechnol. Prog. 16:385-90 (2000); Kim, D.M.およびSwartz, J.R. Biotechnol. Bioeng. 74:309-16 (2001); Swartzら, Methods MoL Biol. 267:169-82 (2004); Kim, D.M.およびSwartz, J.R. Biotechnol. Bioeng. 85:122-29 (2004); Jewett, M.C.およびSwartz, J.R., Biotechnol. Bioeng. 86:19-26 (2004); Yin, G.およびSwartz, J.R., Biotechnol. Bioeng. 86:188-95 (2004); Jewett, M.C.およびSwartz, J.R., Biotechnol. Bioeng. 87:465-72 (2004); Voloshin, A.M.およびSwartz, J.R., Biotechnol. Bioeng. 91 :516-21 (2005)を参照されたい。所望のポリペプチドの無細胞合成のためのさらなる条件は、国際公開第２０１０／０８１１１０号に記載されており、この内容は、その全体が参照により本明細書に援用されている。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡテンプレートを使用してインビトロタンパク質合成を駆動し、ＲＮＡポリメラーゼをその反応混合物に添加して、ＤＮＡテンプレートの転写増進をもたらす。ここでの使用に適するＲＮＡポリメラーゼは、細菌抽出物が由来する細菌において機能する任意のＲＮＡポリメラーゼを含む。他の実施形態では、ＲＮＡテンプレートを使用してインビトロタンパク質合成を駆動し、その反応混合物の成分を任意の適便な順序で互いに混合することができるが、好ましくは、ＲＮＡテンプレートを最後に添加する順序で混合し、それによって、ヌクレアーゼによるＲＮＡテンプレートの潜在的分解を最小にする。
無細胞翻訳システム
無細胞タンパク質合成は、細胞機構の触媒力を活用することができる。インビトロでの最大タンパク質収量の獲得は、妥当な基質供給、例えば、ヌクレオシド三リン酸およびアミノ酸、ホメオスタシス環境、触媒安定性、および阻害性副産物の除去または回避を必要とする。インビトロ合成反応の最適化は、急速に成長する生物のインビボ状態の再現から恩恵を受ける。したがって、本発明のいくつかの実施形態では、酸化的リン酸化が活性化される反応、すなわち、ＣＹＴＯＭＩＭ（商標）システムにおいて、無細胞合成を行う。ＣＹＴＯＭＩＭ（商標）システムは、最適化されたマグネシウム濃度を有するポリエチレングリコール不在の反応条件を用いることによって規定される。ＣＹＴＯＭＩＭ（商標）システムは、タンパク質合成を阻害することが公知であるリン酸塩を蓄積しないが、従来の二次エネルギー源は、リン酸塩蓄積をもたらす。ＣＹＴＯＭＩＭ（商標）システムの様々な他の特徴は、米国特許第７，３３８，７８９号明細書に記載されており、この内容は、その全体が参照により本明細書に援用されている。
活性酸化的リン酸化経路の存在は、二次エネルギー源、例えば、ホスホエノールピルビン酸、クレアチンリン酸、アセチルリン酸、または解糖中間体、例えばグルコース、グルコース−６−リン酸およびピルビン酸の必要量を欠如させることによって実証することができる。活性酸化的リン酸化経路の存在は、電子伝達系阻害剤などの阻害剤に対する経路の感受性によって判定することもできる。電子輸送系阻害剤の例としては、２−ヘプチル−４−ヒドロキシキノリン−Ｎ−オキシド（ＨＱＮＯ）、２，４−ジニトロフェノール、シアニド、アジド、テノイルトリフルオロアセトン、およびカルボニル−シアニド−ｍ−クロロフェニルヒドラゾンが挙げられる。あるいは、１つの実施形態において、無細胞翻訳システムは、活性酸化的リン酸化経路を含まない。
インビトロ、すなわち無細胞、タンパク質合成には、従来のインビボタンパク質発現法に勝るいくつかの利点がある。無細胞システムは、細菌の代謝資源のすべてではないが大部分を１つのタンパク質の排他的生産に向けることができる。さらに、インビトロで細胞壁および膜成分がないことは、合成環境の制御を可能にするので、有利である。例えば、発現される遺伝子のコドン利用頻度を反映するようにｔＲＮＡレベルを変化させることができる。細胞成長または生存の懸念が存在しないので、レドックス電位、ｐＨ、またはイオン強度も、インビボタンパク質合成でより大きい自由度で改変することができる。さらに、精製され、正しくフォールディングされたタンパク質産物の直接回収を容易に果たすことができる。
無細胞システムの生産性は、近年、約５μｇ／ｍＬ・時から約５００μｇ／ｍＬ・時に、２桁を超えて向上された。かかる向上は、インビトロタンパク質合成を実験室規模研究のための実用技術にしたとともに、高スループットタンパク質発現のプラットフォーム技術をもたらす。さらに、かかる向上は、タンパク質医薬のインビボでの大規模な商業生産の代替手段のとしての無細胞技術の使用の実行可能性を示す。
溶解物の生成
本発明は、標的タンパク質のインビトロ翻訳に細胞溶解物を利用する。便宜上、溶解物源として使用する生物をソース生物または宿主細胞と呼ぶことがある。宿主細胞は、細菌、酵母、哺乳動物もしくは植物細胞、またはタンパク質合成が可能な任意の他のタイプの細胞であってよい。溶解物は、所望のタンパク質をコードするメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を翻訳することができる成分を含み、および場合により、所望のタンパク質をコードするＤＮＡを転写することができる成分を含む。かかる成分としては、例えば、ＤＮＡ指向型ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡポリメラーゼ）、所望のタンパク質をコードするＤＮＡの転写の開始に必要とされる任意の転写アクチベーター、転移リボ核酸（ｔＲＮＡ）、アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ、７０Ｓリボソーム、Ｎ１０−ホルミルテトラヒドロ葉酸、ホルミルメチオニン−ｔＲＮＡｆＭＥＴシンセターゼ、ペプチジルトランスフェラーゼ、開始因子、例えばＩＦ−１、ＩＦ−２およびＩＦ−３、伸長因子、例えばＥＦ−Ｔｕ、ＥＦ−ＴｓおよびＥＦ−Ｇ、放出因子、例えばＲＦ−１、ＲＦ−２およびＲＦ−３、などが挙げられる。
ある実施形態は、溶解物が由来する細菌細胞を使用する。任意の細菌株に由来する細菌溶解物を本発明の方法で使用することができる。細菌溶解物は、次のように得ることができる。選ばれた細菌を、一晩、多数の成長培地のいずれかにおいて、かつ当該技術分野において周知であり、特定の細菌の成長のために実施者により容易に最適化される成長条件下で、成長させる。例えば、合成のための天然環境は、グルコースおよびリン酸を含有する培地中で成長した細菌細胞に由来する細胞溶解物を利用し、この場合、前記グルコースは、少なくとも約０．２５％（重量／容量）、さらに通常は少なくとも約１％；および通常は約４％以下、さらに通常は約２％以下の濃度で存在する。かかる培地の例は、２ＹＴＰＧ培地であるが、被定義栄養源と未定義栄養源の両方を使用する大腸菌などの細菌の成長に適する培地が多く発表されているので多くの培地をこのために適応させることができることは、当業者には理解されるであろう。一晩、回収した細胞を、細胞ペレットを適する細胞浮遊バッファーに浮遊させること、そして前記浮遊細胞を超音波処理により粉砕すること、前記浮遊細胞をフレンチプレスにより破砕すること、連続流高圧ホモジネーション、または有効な細胞溶解に有用な当該技術分野において公知の任意の他の方法によって溶解することができる。その後、それらの細胞溶解物を遠心分離または濾過して、大きいＤＮＡ断片を除去する。
（実施例１）
この実施例は、ＯｍｐＴ１プロテアーゼによって切断可能であるアミノ酸配列を導入するためのＲＦ１タンパク質の改変を記載する。
方法：
ＲＦ１にＯＭＰＴ１切断部位を導入するためのテンプレートの構築
ＰＣＲに基づく戦略を用いて、本明細書に記載する改変ＲＦ１タンパク質をコードする核酸テンプレートに所望のヌクレオチド配列変化を導入した。ＰＣＲ反応は、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｆｌｅｘ ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＮＥＢ）をその製造業者が推奨するプロトコルに従って使用して行った。一般に、２ステップオーバーラッピングＰＣＲを、下でより詳細に説明するように行って、ＲＦ１エンコーディング遺伝子にＯｍｐＴ切断突然変異を導入した。ＰＣＲ生成ＤＮＡテンプレートを、無細胞発現に利用するためにＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して精製した。ＰＣＲ精製後、それらの変異体をＭｃｌａｂ（カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）がシークエンシングして、予想された突然変異の存在を確認した。
無細胞反応におけるＤＮＡテンプレートの分解を防止するためのＧａｍＳタンパク質の調製
ＤＮＡテンプレートからの転写効率は、無細胞抽出物中に存在する内因性細菌エンドヌクレアーゼによるそのテンプレートの分解のため減少され得る。ショートフォームのλファージＧａｍタンパク質（ＧａｍＳ）が、ＲｅｃＢＣＤ（エンドヌクレアーゼＶ）の活性を阻害することにより分解からＤＮＡテンプレートを保護することは公知である（Ｓｉｔａｒａｒｍａｎ，Ｋ．、Ｅｓｐｏｓｉｔｏ，Ｄ．、Ｋｌａｒｍａｎｎ，Ｇ．、Ｇｒｉｃｅ，Ｓ．Ｆ．Ｌ．、Ｈａｒｔｌｅｙ，Ｊ．Ｌ．およびＣｈａｔｔｅｒｊｅｅ，Ｄ．Ｋ．、２００４、Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１０：２５７−２６３を参照されたい）。したがって、この実施例ではＧａｍＳタンパク質を使用して、無細胞転写反応中にＰＣＲテンプレートを安定させた。組換えＧａｍＳタンパク質を生産するために、テンプレートとしてｐＫＤ４６（Ｄａｔｓｅｎｋｏ，Ｋ．Ａ．およびＷａｎｎｅｒ，Ｂ．、２０００、Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ Ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２ Ｕｓｉｎｇ ＰＣＲ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：６６４０−６６４５）を使用してプライマー5’-ATATATCATATGAACGCTTATTACATTCAGGATCGTCTTGAG-3’(配列番号51)および5’-ATATATGTCGACTTAATGATGATGATGATGATGAGAACCCCCTACCTCTGAATCAATATCAACCTGGTGGTG-3’(配列番号52)によって、Ｃ末端ポリヒスチジンタグ、ＧＧＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号５０）を含むようにＧａｍＳ遺伝子を増幅した。そのＧａｍＳ遺伝子を無細胞発現プラスミドｐＹＤ３１７のＮｄｅＩ／ＳａｌＩ制限部位にサブクローニングした。ＧａｍＳをインビトロで発現させ、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によって９０％より高い純度（データを示さない）で精製した。ＧａｍＳタンパク質を利用前は１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸バッファー（ｐＨ８．２）中、−７０℃で保管し、このバッファーは、１６０ｍＭ 酢酸カリウム、２００ｍＭ 塩化ナトリウムおよび１０％スクロースも含有した。
細菌株およびプラスミド
ＳＢＪＹ００１は、公開された無細胞タンパク質生産のために最適化された大腸菌Ｋ１２誘導体である。ファージλ Ｒｅｄリコンビナーゼ遺伝子を含有するプラスミドｐＫＤ４６（Ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ）を用いて誘導性アラビノースプロモーターの下でＳＢＪＹ００１を形質転換させた。
ＳＢＨＳ００２の構築
ＳＢＨＳ００２は、Ｐ１形質導入を用いて作られたｏｍｐＴ欠失大腸菌株である。ＦＲＴ部位に隣接するｏｍｐＴ：：ＫａｎＲ突然変異を含有するＫｅｉｏコレクション株であるＪＷ０５５４−１（ＣＧＳＣ＃８６８０）から、Ｐ１溶解物を作った。その後、そのＪＷ０５５４−１ Ｐ１溶解物を使用して、Ｐ１形質導入により突然変異をＳＢＪＹ００１に導入した。３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを有するＬＢでコロニーを成長させて、カナマイシン耐性について選択した。ＳＢＪＹ００１ｏｍｐＴ：：ＫａｎＲを７０８−ＦＬＰｅ ＣｍＲ発現プラスミド（Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ）で形質転換させた。ＦＬＰ合成を誘導し、コロニーをカナマイシン耐性の喪失についてスクリーニングした。カナマイシン耐性コロニーをシークエンシングして、ｏｍｐＴの欠失を確認した。このｏｍｐＴ欠失株をＳＢＨＳ００２と呼ぶ。
Ｎ末端Ｈｉｓタグ付きＲＦ１のクローニングおよび発現
Ｎ末端ＨｉｓタグおよびＮｄｅＩ／ＳａｌＩ制限部位を導入したプライマー５Ｈｉｓ−ＲＦ１：CATATGCATCACCATCACCATCACGGTGGTGGCTCTAAGCCTTCTATCGTTGCCAAACTGGAAGCC(配列番号138)および３ＲＦ１：GTCGACTTATTCCTGCTCGGACAACGCCGCCAG(配列番号139)を使用して、大腸菌Ａ１９株ゲノムＤＮＡからＲＦ１を増幅した。インサートを発現ベクターｐＹＤ３１７にライゲートし、シークエンシングによって確認した。プラスミドを使用してＲＦ１を２５ｍＬ無細胞反応で発現させ、ＩＭＡＣによって精製し、バッファーをＰＢＳに交換した。
無細胞抽出物を使用する組換えＲＦ１変異体の切断
本明細書に記載する改変ＲＦ１タンパク質が、ＯｍｐＴによって切断可能であるかどうかを試験するために、組換えＲＦ１変異体を、ＯｍｐＴを有するまたは有さない細胞抽出物とともにインキュベートした。外膜上にインタクトｏｍｐＴプロテアーゼを有するＳＢＪＹ００１細胞、およびｏｍｐＴが欠失されたＳＨＢＳ００２を、５ｍＬのＬＢ中、一晩、３７℃で成長させた。５０μＬの各培養物を８，０００ｒｐｍで２分間、遠沈し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２０ｍＭ 塩化アンモニウムおよび１０ｍＭ 塩化マグネシウムで２回洗浄した。その後、それらの細胞ペレットを５０μＬのバッファーに再浮遊させ、１０μｇの精製組換え大腸菌ＲＦ１タンパク質を添加した。それらの試料を３７℃でインキュベートした。試料を８，０００ｒｐｍで２分間、遠沈した。ＲＦ１タンパク質を含有する上清を除去し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動させた。
ＲＦ１変異体の無細胞発現
無細胞転写／翻訳反応を、６０μＬの容量で、３０℃で、２４深ウェルプレート（カタログ番号９５０４０４７０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において４．５時間行った。ＲＦ１変異体発現のためのＰＣＲテンプレート濃度は、１０μｇ／ｍＬであった。反応組成物は、８ｍＭ グルタミン酸マグネシウム、１３０ｍＭ グルタミン酸カリウム、３５ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、１．２ｍＭ ＡＭＰ、０．８６ｍＭ ＧＭＰ、ＵＭＰおよびＣＭＰの各々、４ｍＭ シュウ酸ナトリウム、１ｍＭ プトレッシン、１．５ｍＭ スペルミジン、１５ｍＭ リン酸カリウム、１ｍＭ チロシン、２ｍＭの他の１９のアミノ酸各々、１００ｎＭ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、３０％（Ｖ／Ｖ）Ｓ３０細胞抽出物も含んだ。ジスルフィド形成を助長するために、Ｓ３０細胞抽出物を、無細胞反応前に３０分間、室温で、５０μＭ ＩＡＭで処理した。２ｍＭ 酸化グルタチオン（ＧＳＳＧ）と１ｍＭ 還元グルタチオン（ＧＳＨ）の混合物も、４．３μＭ 大腸菌ジスルフィドイソメラーゼＤｓｂＣとともに添加した。無細胞発現ＲＦ１変異体をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラムで分析するために、微量の［１４Ｃ］−ロイシン（３００μＣｉ／モル；ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州）の存在下で反応を行った。ＲＦ１変異体を、細菌株ＳＢＪＹ００１から調製したＯｍｐＴ陽性（ＯｍｐＴ＋）細胞抽出物、または細菌株ＳＢＨＳ００２（ＳＢＪＹ００１ΔｏｍｐＴ）から調製したＯｍｐＴ陰性（ＯｍｐＴ−）細胞抽出物いずれかにおいて発現させた。無細胞反応においてＰＣＲテンプレートを安定させるために、１．４μＭ ＧａｍＳタンパク質も添加して、ＲｅｃＢＣＤの活性を阻害した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィー
改変ＲＦ１タンパク質がＯｍｐＴによって切断可能であるかどうかを判定するために、上で説明した無細胞反応において翻訳されたＲＦ１タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーによって分析した。１４Ｃで標識した無細胞反応試料を卓上遠心分離機において最大速度で遠心分離し、４μＬの上清をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルローディングバッファーおよび水と混合した。試料を４〜１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに負荷し、ＭＥＳランニングバッファーで約４５分間、泳動させた。その後、ゲルを乾かし、一晩、蛍光スクリーン（６３−００３４−８６、ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国）に曝露し、その後、Ｓｔｏｒｍ ４６０（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国）を使用してスキャンした。
ＲＦ１へのＯｍｐＴ切断部位の導入
ＲＦ１配列における潜在的ＯｍｐＴ切断部位を同定するために、単一ＡｒｇまたはＬｙｓ突然変異を、ＲＦ１の異なるループ領域内の既存ＡｒｇまたはＬｙｓのそばに導入した。それらのループ領域は、原核生物クラスＩ放出因子の配列アラインメントに基づいて予測した（Ｇｒａｉｌｌｅ，Ｍ．、Ｈｅｕｒｇｕｅ−Ｈａｍａｒｄ，Ｖ．、Ｃｈａｍｐ，Ｓ．、Ｍｏｒａ，Ｌ．、Ｓｃｒｉｍａ，Ｎ．、Ｕｌｒｙｃｋ，Ｎ．、Ｔｉｌｂｅｕｒｇｈ，Ｈ．およびＢｕｃｋｉｎｇｈａｍ，Ｒ．Ｈ．、２００５、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｃｌａｓｓ Ｉ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｆａｃｔｏｒ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｂｙ ＰｒｍＣ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ．２０：９１７−９２７を参照されたい）。所望の変異体を生成するために、突然変異配列を、フォワードオリゴプライマーとリバースオリゴプライマー（表１）の真ん中に設計した。第１ステップＰＣＲでは、５χＴ２ＰＴ７である５’−ＧＣＧＴＡＣＴＡＧＣＧＴＡＣＣＡＣＧＴＧＧＣＴＧＧＴＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＴＴＡＡＴＧＣＡＧＣＴＧＧＣＡＣＧＡＣＡＧＧ−３’（配列番号５３）およびリバースプライマー（表１）を使用してＰＣＲによって５’断片を増幅した。この５’断片は、Ｔ７プロモーター、Ｎ末端配列の定常領域、および突然変異部位を含んだ。フォワードプライマー（表１）および３χＴ２ＴＴ７である５’−ＧＣＧＴＡＣＴＡＧＣＧＴＡＣＣＡＣＧＴＧＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＧＴＧＡＧＴＴＴＴＣＴＣＣＴＴＣＡＴＴＡＣＡＧＡＡＡＣＧＧＣ−３’ （配列番号５４）を使用して第１ステップで３’断片も増幅した。この３’断片は、突然変異部位、定常Ｃ末端領域およびＴ７ターミネーター配列を含んだ。第２ステップＰＣＲでは、単一プライマー５χＴ２，５’−ＧＣＧＴＡＣＴＡＧＣＧＴＡＣＣＡＣＧＴＧＧＣＴＧＧＴＧＧ−３’（配列番号５５）を使用してオーバーラッピングＰＣＲによって５’断片および３’断片ＤＮＡを構築した。
先ず、９つの単一突然変異、Ｍ７４Ｒ、Ｅ７６Ｒ、Ｅ８４Ｒ、Ａ８５Ｒ、Ｅ８７Ｒ、Ｅ１０８Ｒ、Ｔ２９３Ｒ、Ｎ２９６ＫおよびＳ３０４Ｒ、をループ領域内の既存ＡｒｇまたはＬｙｓのそばに導入した（表２）。これらのＲＦ１変異体およびＷＴ ＲＦ１を、ＯｍｐＴを有するまたは有さない無細胞抽出物において、ＰＣＲテンプレートを使用して発現させた。ＲＦ１タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーによって分析した。ＯｍｐＴ陰性細胞抽出物において発現させたとき、１０個すべてのＲＦ１変異体がＳＤＳ−ＰＡＧＥで完全長タンパク質を示した。しかし、ＯｍｐＴを含有する細胞抽出物において発現させたとき、変異体Ｎ２９６Ｒは、部分的に消化されたが、他の変異体は、完全長未消化タンパク質について予想されるように泳動した。Ｎ２９６は、ＲＦ１のスイッチループ領域内に位置し、この領域は、柔軟であり、プロテアーゼ質消化に利用されやすい。
第１ラウンドスクリーニングでは、Ｎ２９６Ｋを細胞抽出物におけるＯｍｐＴによる部分的消化について選択した。第２ラウンドスクリーニングでは、二重突然変異型変異体および三重突然変異型変異体のＰＣＲテンプレートを、表１に収載するプライマーで、上記と同じ方法を用いて生成した。６つの二重突然変異体、Ｎ２９６Ｋ／Ｌ２９７Ｖ、Ｎ２９６Ｋ／Ｌ２９７Ｋ、Ｎ２９６Ｋ／Ｌ２９７Ｒ、Ｎ２９６Ｒ／Ｌ２９７Ｖ、Ｎ２９６Ｒ／Ｌ２９７Ｋ、Ｎ２９６Ｒ／Ｌ２９７Ｒ、ならびに２つの三重突然変異体、Ｎ２９６Ｋ／Ｌ２９７Ｒ／Ｌ２９８ＫおよびＮ２９６Ｋ／Ｌ２９７Ｒ／Ｌ２９８Ｒ（表２）を、ＯｍｐＴを伴うまたは伴わない無細胞発現で試験した。８つすべての二重および三重ＲＦ１突然変異型変異体がＯｍｐＴ１によって切断された（データを示さない）。これらの変異体の中で、Ｎ２９６Ｋ／Ｌ２９７Ｒ／Ｌ２９８Ｒは、ＯｍｐＴによる消化に対して最も感受性であった。
ＲＦ１のスイッチループ領域へのＯｍｐＴ切断ペプチドの挿入
上で説明したアミノ酸突然変異の導入に加えて、スイッチループ領域内の野生型配列を既知ＯｍｐＴプロテアーゼ感受性ペプチド配列で置換するようにもＲＦ１を改変した（Ｈｗａｎｇ，Ｂ．、Ｖａｒａｄａｒａｊａｎ，Ｎ．、Ｌｉ，Ｈ．，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｓ．、Ｉｖｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｌ．およびＧｅｏｒｇｉｏｕ，Ｇ．、２００７、Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏｕｔｅｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ＯｍｐＰ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８９：５２２−５３０；ＭｃＣａｒｔｅｒ，Ｊ．Ｄ．、Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，Ｄ．、Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ，Ｋ．、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．、Ｋｉｒｓｃｈ，Ｊ．Ｆ．およびＧｅｏｒｇｉｏｕ，Ｇ．、２００４、Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏｕｔｅｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ＯｍｐＴ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８６：５９１９−５９２５を参照されたい）。２２のＲＦ１変異体を構築した。それらを表３に収載する。変異体番号１から１４は、ＯｍｐＴ消化のためのＡＲＲＧ（配列番号４７）を含有した。変異体番号１５は、スイッチループの末端にあるので、ＡＲＲＧ（配列番号４７）ではなくＡＲＲを含有した。変異体番号１６は、単一突然変異Ｎ２９６Ｒを含有した。配列番号１７、１８および１９は、ＯｍｐＴ切断ペプチドＷＬＡＡＲＲＧＲＧ（配列番号４８）を含有した。変異体番号２０、２１および２２は、別のＯｍｐＴ切断ペプチドＷＧＧＲＷＡＲＫＫＧＴＩ（配列番号４９）を含有した。
突然変異配列を、表４に収載するフォワードおよびリバースオリゴプライマーで設計した。第１ステップＰＣＲでは、プライマー５χＴ２ＰＴ７およびリバースプライマー（表４）を使用してＰＣＲによって５’断片を増幅した。この５’断片は、Ｔ７プロモーター、Ｎ末端配列の定常領域、および突然変異部位を含んだ。フォワードプライマー（表３）および３χＴ２ＴＴ７を使用して第１ステップで３’断片も増幅した。この３’断片は、突然変異部位、定常Ｃ末端領域、およびＴ７ターミネーター配列を含んだ。第２ステップＰＣＲでは、上で説明したように単一プライマー５χＴ２を使用してオーバーラッピングＰＣＲにより５’断片および３’断片ＤＮＡを構築した。
２２個のＲＦ１変異体（表３）を、ＯｍｐＴを有するまたは有さない細胞抽出物においてＰＣＲテンプレートを使用して発現させた。ＡＲＲＧ（配列番号４７）挿入変異体の中で、番号９は、ＯｍｐＴ消化に対して最高の感受性を示した。ＯｍｐＴ切断ペプチドＷＬＡＡＲＲＧＲＧ（配列番号４８）を含有する変異体番号１７、１８および１９は、ＯｍｐＴによって部分的に消化された。しかし、それらは、ＯｍｐＴ切断ペプチドＷＧＧＲＷＡＲＫＫＧＴＩ（配列番号４９）を含有する変異体番号２０、２１および２２よりはるかに感受性が低かった。変異体番号９、２０、２１および２２を、これら２２の構築物の中でＯｍＴ消化に対して最も感受性の高いＲＦ１変異体として選択した。
（実施例２）
ＲＦ１がＯｍｐＴ１プロテアーゼによって切断可能になるように首尾よく改変されたことを実証されたので、この実施例は、改変ＲＦ１とインタクトＯｍｐＴ１の両方を発現する組換え細菌株の構築を記載する。この実施例の目的は、前記組換え株によって発現されたＲＦ１変異体が、ＯｍｐＴ１を発現する組換え株からの無細胞抽出物において切断されることを証明することである。
オリゴヌクレオチド媒介対立遺伝子置換
本明細書に記載する改変ＲＦ１タンパク質を発現する細菌株を産生するために、オリゴヌクレオチド媒介対立遺伝子置換（ＯＭＡＲ）を用いて細菌ゲノムにＲＦ１突然変異を挿入した。ＯＭＡＲプロトコルは、以前に報告されたプロトコル（ＷａｎｇおよびＣｈｕｒｃｈ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２０１１、４９８、４０９−４２６）から改造した。簡単に言うと、ｐＫＤ４６プラスミドを含有するＳＢＪＹ００１を３ｍＬ ＬＢおよび５０μｇ／ｍＬ アンピシリン中、３０℃でＯＤ６００ ０．３まで成長させた。その後、それらの細胞を１ｍＭ Ｌ−アラビノースで３７℃で４５分間、誘導した。細胞ペレットを冷１０％グリセロールで２回洗浄し、３０μＬ 冷１０％グリセロールに再浮遊させた。５μＭの各オリゴを再浮遊細胞に添加した。合成オリゴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、９０塩基対長であり、ＤＮＡ複製中にラギング鎖にアニールするように設計された（表５を参照されたい）。それらの細胞を１８００Ｖで５ミリ秒間、１ｍｍキュベットの中で電気穿孔した。その後、それらを３ｍＬ ＬＢおよび５０μｇ／ｍＬ Ａｍｐ中で回復させた。このプロセスを１３サイクル反復した。細胞を希釈し、ＬＢ寒天プレートに蒔き、３７℃で一晩成長させた。
所望の突然変異を有する細菌株を同定するためのＭＡＭＡ ＰＣＲ
ミスマッチ増幅突然変異アッセイ（ＭＡＭＡ）ＰＣＲを改造したものを用いて細菌コロニーをスクリーニングして、ＲＦ１に所望の突然変異がある株を同定した（Ｃｈａら、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１９９２、２、１４−２０）。簡単に言うと、ユニバーサル５’プライマーを、各突然変異に特異的である３’プライマーと併用して、突然変異体コロニーとＷＴコロニーとを区別した（表５を参照されたい）。オリゴは、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎから取り寄せた。Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｂｌｕｅ ＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＭＡＭＡ ＰＣＲを実行した。ＰＣＲを９５℃ ３分、３０×（９５℃ １５秒、５８℃ ２０秒、７２℃ １分）そして７２℃ ５分で実行した。ＰＣＲ産物を９６ウェルＥ−ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で泳動させて一切のバンドを視覚化した。
抽出物調製およびウェスタンブロット
改変ＲＦ１変異体を含有するように操作した株ＳＢＨＳ０１５、ＳＢＨＳ０１６およびＳＢＨＳ０１７をＴｕｎａｉｒ振盪フラスコの中の５００ｍＬ ＴＢにおいて３７℃で振盪しながら一晩成長させた。それらの細胞を６０００ｘｇで１５分間、ペレット化した。細胞ペレットを６ｍＬ Ｓ３０バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１４ｍＭ 酢酸マグネシウムおよび６０ｍＭ 酢酸カリウム）：１ｇ 細胞ペレットで、２回洗浄した。その後、細胞を２ｍＬ Ｓ３０バッファー：１ｇ 細胞ペレットに再浮遊させた。ホモジナイザーを使用して再浮遊細胞を溶解した。その後、その抽出物を１５，０００ｘｇで３０分間、２回、清澄化した。その抽出物を１、２または３時間、３０℃の水浴で活性化した。精製された組換え大腸菌ＲＦ１タンパク質をウサギに接種することによって抗ＲＦ１抗体を作製し、その後、アフィニティーマトリックス（ＹｅｎＺｙｍ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ＬＬＣ）を使用して精製した。その組換えタンパク質のＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットを用いて、抗体の特異性を確認した。細胞ペレット、溶解物および抽出物試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動させ、ｉＢｌｏｔ（登録商標）システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＰＶＤＦ膜に転写した。一次抗ＲＦ１抗体を使用し、続いて二次抗ウサギアルカリホスファターゼ結合抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−１−リン酸とニトロブルーテトラゾリウムとを含有するアルカリホスファターゼ発色基質溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してバンドを視覚化した。
それらのゲノムにＲＦ１の突然変異が首尾よく組み込まれた３つの組換え型細菌株を同定した。株ＳＢＨＳ０１５は、ＲＦ１のＮ２９６Ｋ／Ｌ２９７Ｒ二重突然変異型変異体を含有し、これを変異体Ａ１３と呼ぶ。株ＳＢＨＳ０１６は、ＲＦ１のＮ２９６Ｋ／Ｌ２９７Ｒ／Ｌ２９８Ｒ三重突然変異型変異体を含有し、これを変異体Ａ１８と呼ぶ。株ＳＢＨＳ０１７は、ＲＦ１のＮ２９６Ｋ／Ｌ２９７Ｒ／Ｌ２９８Ｋ三重突然変異型変異体を含有し、これを変異体Ａ１７と呼ぶ。３つすべての株は、親株ＳＢＪＹ００１から誘導したので、インタクトＯｍｐＴ１も発現する。それらの組換え株を溶解し、様々な期間（０、１、２および３時間）にわたってインキュベートしたとき、改変ＲＦ１タンパク質変異体は、ウェスタンブロット分析によって判定して、無細胞抽出物によって試験したすべての時点で効率的に切断された（データを示さない）。対照的に、株ＳＢＪＹ００１による非改変、野生型ＲＦ１の切断は、同じ期間にわたって検出されなかった。これは、野生型ＲＦ１が、インタクトＯｍｐＴ１を含有する無細胞抽出物において効率的に切断されないことを示す。
この実施例は、組換え細菌株が、改変ＲＦ１変異体を発現するように操作されたこと、および前記ＲＦ１変異体が、ＯｍｐＴ１陽性株からの無細胞抽出物によって切断されたことを実証する。
（実施例３）
実施例３は、スイッチループ領域内にＯｍｐＴ１切断部位を含むように改変されたインタクトＲＦ１タンパク質が野生型ＲＦ１機能を有することを実証する。
組換えＲＦ１変異体の機能試験
本明細書に記載する組換えＲＦ１変異体の機能を試験するために、アンバーコドンで翻訳を終結させるＲＦ１変異体の能力を判定した。ＴＡＧ突然変異を有するＦｃタンパク質は、ＳＢＨＳ００２抽出物（ＯｍｐＴ欠失株）において５００ｎＭの精製組換え大腸菌野生型または突然変異型ＲＦ１および２μＭ非天然アミノ酸の存在下で発現された。６０μＬ無細胞反応を３０℃で５時間、１４Ｃ−Ｌｅｕの存在下で実行した。最終反応物を遠心分離して可溶性画分を得、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動させ、ＰＶＤＦ膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に転写し、ホスホスクリーンに一晩曝露した。Ｓｔｏｒｍ Ｉｍａｇｅｒを使用してそのホスホスクリーンを視覚化し、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔを使用して相対バンド強度を判定した。短縮型Ｆｃタンパク質の量と陰性対照（外因性ＲＦ１添加なし）および陽性対照（ＷＴ ＲＦ１添加）と比較することにより、突然変異体の相対活性を判定した。式：（短縮型タンパク質カウント／全タンパク質カウント）×１００％を用いて、短縮型タンパク質パーセントを決定した。式：［（変異体短縮型タンパク質−陰性対照短縮型タンパク質）／（ＷＴ ＲＦ１短縮型タンパク質−陰性対照短縮型タンパク質）］×１００％を用いて、相対ＲＦ１活性を決定した。
図１に示すように、本明細書に記載するＲＦ１変異体は、Ｆｃタンパク質の位置Ｓ３７８に導入されたアンバーコドンに非ネイティブアミノ酸（ｐＡｚＦ）を組み込んだときの翻訳による短縮によって実証されるように、ＲＦ１活性を有する。特に、ＲＦ１変異体Ａ１３（Ｎ２９６Ｋ／Ｌ２９７Ｒ置換を有する）は、野生型ＲＦ１と同様の活性レベルを有した。
この実施例は、スイッチループ領域内にＯｍｐＴ切断部位を含むように改変されたインタクトＲＦ１タンパク質が機能性ＲＦ１活性（例えば、アンバー抑制の低減）を有することを実証する。
（実施例４）
実施例４は、スイッチループ領域内にＯｍｐＴ１切断部位を有するＲＦ１変異体を含む無細胞抽出物を使用するハーセプチンタンパク質のＩｇＧ重鎖への非天然アミノ酸の組み込み増加を実証する。前記無細胞抽出物は、実施例２に記載した細菌株からのものである。
方法
ハーセプチン重鎖の部位特異的突然変異誘発
ハーセプチンの重鎖にｎｎＡＡを導入するために、ハーセプチンをコードするＤＮＡテンプレートを、コーディング配列の異なる位置にアンバーコドンを導入するように突然変異させた。部位特異的突然変異誘発は、ハーセプチン６ｘＨｉｓのコーディング領域をＣ末端に含有するｐＹＤプラスミドをＤＮＡテンプレートとして使用し、かつセンスおよびアンチセンス両方向にアンバーコドンを含有する合成オリゴヌクレオチド（オペロン）（表６）を使用して行った。各突然変異のオリゴヌクレオチドを、ＤＮＡテンプレートおよびＰｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号Ｆ５３１ｓ）と、２０μＬの最終容量まで混合した。各成分の最終濃度は、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２と２００μＭ ｄＮＴＰとを含有するＨＦバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ）中、０．１６μＭの各オリゴヌクレオチド、０．５ｎｇ／μＬ テンプレートＤＮＡ、０．０２Ｕ／μＬ Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ポリメラーゼであった。混合物を９８℃で５分間インキュベートし、１８ＰＣＲサイクル（９８℃３０秒、５５℃１分、７２℃４分）、７２℃で１０分、そして１６時間まで４℃で保管した。ＤｐｎＩ（ＮＥＢ）をその混合物に０．６Ｕ／μＬの最終濃度まで添加し、３７℃１時間インキュベートした。５μＬの各混合物を５０μＬのケミカルコンピテント大腸菌細胞に、製造業者手順（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＭｕｌｔｉＳｈｏｔ（商標）９６ウェルプレートＴＯＰ１０）に従って形質転換させた。形質転換細胞を２００μＬ ＳＯＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、３７℃１時間、回復させ、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを補足したルリア・ベルターニ（ＬＢ）寒天（Ｔｅｋｎｏｖａ）に蒔いた。３７℃で２４時間後、Ｑｐｉｘ２（Ｇｅｎｅｔｉｘ）を使用してコロニーを、７．５％グリセロールと５０μｇ／ｍＬカナマイシンとを有する２００μＬのＬＢに採取し、３７℃で２４時間成長させ、２０μＬの培養物をローリングサークル増幅に使用し、そしてＴ７（５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ−３’；配列番号１４７）およびＴ７ ｔｅｒｍ（５’−ＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧＣＧ−３’；配列番号１４８）プライマー（Ｓｅｑｕｅｔｅｃｈ）を使用するプライマー伸長によってシークエンシングした。配列をシークエンサー（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ）によって分析した。
抽出物調製
改変ＲＦ１変異体Ａ１８を有する大腸菌株ＳＢＨＳ０１６を４０〜５５ＯＤの最終密度で回収し、Ｓｈａｒｐｌｅｓ Ｍｏｄｅｌ ＡＳ１４遠心分離機において１０分間、１４，０００ｇで遠心分離して使用済み培地を除去した。その細胞ペーストを６ｍＬ／ｇ細胞 Ｓ３０バッファー（１４ｍＭ ＭｇＡｃＯ、６０ｍＭ ＫＡｃＯ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ）の比で均質に再浮遊させ、使用済み培地のさらなる除去のために前記Ｓｈａｒｐｌｅｓ ＡＳ１４を使用して１４，０００ｇで１０分間、再び遠心分離した。得られた清澄細胞ペーストをＳ３０に２ｍＬ／ｇ細胞の比で再浮遊させ、１７，０００ｐｓｉでのＡｖｅｓｔｉｎ Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘ Ｃ−５５ホモジナイザーによるシングルパスによって細胞を溶解した。そのホモジネートを１４，０００ｇでの２回の各３０分間の遠心分離によって清澄化し、得られたペレットを廃棄した。得られた細胞抽出溶液を３０℃で２時間インキュベートし、その後、微粒子除去のために前記Ｓｈａｒｐｌｅｓ ＡＳ１４を使用して１４，０００ｇで再び遠心分離した。この最終溶液をＬＮ２で凍結させ、無細胞タンパク質合成に必要とされるまで−８０℃で保管した。
無細胞抽出物を室温に解凍し、５０μＭ ヨードアセトアミドとともに３０分間インキュベートした。３０％（ｖ／ｖ）ヨードアセトアミド処理抽出物とともに８ｍＭ グルタミン酸マグネシウム、１０ｍＭ グルタミン酸アンモニウム、１３０ｍＭ グルタミン酸カリウム、３５ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、１．２ｍＭ ＡＭＰ、０．８６ｍＭ ＧＭＰ、ＵＭＰおよびＣＭＰの各々、２ｍＭ アミノ酸（チロシンについては１ｍＭ）、４ｍＭ シュウ酸ナトリウム、１ｍＭ プトレッシン、１．５ｍＭ スペルミジン、１５ｍＭ リン酸カリウム、１００ｎＭ Ｔ７ ＲＮＡＰ、２．５μＭ 大腸菌ＤｓｂＣ、５μＭ 酵母ＰＤＩ、２ｍＭ 酸化（ＧＳＳＧ）グルタチオンならびに１５μＭ 酵母ｔＲＮＡ ｐＮ３ＦアミノアシルｔＲＮＡを含有する、無細胞反応を、３０Ｃで１０時間まで実行した。合成されたタンパク質を１４Ｃで標識するために、３．３３％（ｖ／ｖ）１−［Ｕ−１４Ｃ］−ロイシン（３００ｍＣｉ／ミリモル；ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）も反応に加えた。重鎖ＴＡＧ変異型プラスミドおよび野生型軽鎖プラスミドの濃度は、それぞれ、７．５ｕｇ／ｍＬおよび２．５ｕｇ／ｍＬであった。対照として、野生型軽鎖の無細胞発現をＴＡＧ変異型と並行して行った。
本発明者らの内部研究に基づいて、Ｎ２９７、Ｔ２９９、Ｋ３２０、Ｇ３４１、Ｑ３４２、Ｐ３４３、Ｙ３７３、Ｆ４０４、Ｆ４０５、Ｓ４１５、Ｑ４１８およびＶ４２２を含む１２の抑制困難な部位を、重鎖から選択した。相対的に高い抑制を有するＳ１３６を陽性対照として選択した。株ＳＢＪＹ００１（野生型ＲＦ１を発現する）およびＳＢＨＳ０１６（改変ＲＦ１を発現する）からの２つの細胞抽出物を使用して、これらの抑制困難な部位にｎｎＡＡを組み込む前記抽出物の能力を比較した。
６０μＬ 無細胞反応を２４ウェルプレートで実行した。無細胞反応が完了した後、ＴＣＡ沈殿を行って、合成された全および可溶性タンパク質を測定した。並行して、オートラジオグラフィーアッセイのために非還元および還元ゲルがあった。非還元ゲルについては、４μＬの試料、８μＬのＤＩ Ｈ２Ｏおよび４μＬの４Ｘ ＬＤＳバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）を、ゲルに負荷する前に混合した。還元ゲルについては、４μＬの試料、１μＬの１Ｍ ＤＴＴ、７μＬのＤＩ Ｈ２Ｏおよび４μＬの４Ｘ ＬＤＳバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）を混合し、７０Ｃのホットブロットで５分間加熱した。４〜１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）によりその製造業者の推奨に従って試料を分析した。ゲルを乾かし、約１６時間の曝露後にＳｔｏｒｍ ８４０ ＰｈｏｓｐｈｏＩｍａｇｅｒを使用してオートラジオグラフィーによって分析した。
この式中のバンド強度は、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（商標）ソフトウェアによって決定し、［可溶性タンパク質］は、ＴＣＡ沈殿法によって推定した。
重鎖の異なる部位のアンバーコドンの抑制を、還元ＳＤＳ−ＡＧＥゲルの［１４Ｃ］−オートラジオグラフィーによって判定した。完全長野生型重鎖および抑制重鎖ＴＡＧ変異体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて４９Ｋｄで泳動する。ＴＡＧ変異体の非抑制（短縮型）重鎖は、より低い分子量で泳動する。
重鎖におけるＴＡＧの抑制は、次の式によって予測される：
この式中のバンド強度は、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（商標）ソフトウェアによって決定する。
精製のための材料を生成するために、反応を同じ条件下、１０ｃｍペトリ皿中、１ｍＬに拡大した。
ｔＲＮＡの生産
すべてのｔＲＮＡｐｈｅ ＣＵＡ転写物の転写を次の条件下で行った：２０〜５０ｎｇ／μＬ ｐＹＤ３１８−ｔＲＮＡｐｈｅ ＡＡＡ−ＨＤＶ−Ｔ７ｔｒｍ、４０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＤＴＴ、４ｍＭ ｄＮＴＰ、２．５ｍＭ スペルミジン、１Ｕ／ｍＬ ＰＰｉａｓｅ、２．５ｍｇ／ｍＬ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、および４０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．９）。ＸＫ５０／１００カラムにおいてタンデムセファクリル１００または３００レジンを使用して、ゲル濾過クロマトグラフィーによって、ｔＲＮＡ分子を親ＲＮＡおよびＨＤＶリボザイムＲＮＡ産物から分離した。サイズ分離カラムを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．５）および２５０ｍＭ ＮａＣｌ中で展開した。ｔＲＮＡを含有する画分をプールし、１／１０容量の３Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）と混合し、等容量のイソプロパノールを添加してＲＮＡを沈殿させた。ｔＲＮＡをペレットとして保管するか、または１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．５）および０．１ｍＭ ＥＤＴＡに再懸濁させた。
アミノアシル化反応で使用するためのｔＲＮＡを、１００ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ５．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２および１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール中のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで１時間処理して、ｔＲＮＡの３’末端の２’，３’−環状リン酸を除去して２’，３’−ＯＨ基を遊離させる。Ｔ４ ＰＮＫ処理ｔＲＮＡをフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール抽出し、無機リン酸塩および過剰なフェノールを除去するＧ２５カラムを使用してバッファー交換した。ｔＲＮＡをイソプロパノールまたはエタノール沈殿させ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．５）および０．１ｍＭ ＥＤＴＡに再懸濁させた。ｔＲＮＡを２０分間、７０℃に加熱することによって、ｔＲＮＡをリフォールディングさせた。その後、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２を添加し、その混合物をゆっくりと室温に平衡させた。
ｔＲＮＡ転写物のＨＤＶリボザイム切断は、相同３’末端を生じさせながら、後続のアミノアシル化に干渉する２’−３’環状リン酸部分を遊離する。これを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）を使用して除去できることが判明した。４０μＭ ｔＲＮＡを、３７℃で、５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、３００ｍＭ ＮａＣｌおよび０．１ｍＭ ＥＤＴＡ中、０．０５０ｍｇ／ｍＬ ＰＮＫとともにインキュベートした。脱リン酸化を２つの異なる方法によってアッセイした。変性ゲル電気泳動を用いて脱リン酸化を確認した。報告されているように、脱リン酸化ｔＲＮＡは、酸／尿素ゲル電気泳動において低減された移動度を有する。３μｇの脱リン酸化ｔＲＮＡを含有するアリコートをローディングバッファー（１００ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）、７Ｍ 尿素、１ｍｇ／ｍＬ ブロモフェノールブルー染料）で２倍希釈し、６．５％ １９：１ アクリルアミド、１００ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）、７Ｍ 尿素ゲル（４０ｃｍ×３４ｃｍ）に負荷し、４０Ｗで一晩、電気泳動させた。０．０６％メチレンブルー、０．５Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）を使用して３０分間、ゲルを染色し、脱イオン水で脱染した。両方のアッセイが、ほんの５分後に有意な脱リン酸化を示した。脱リン酸化は、１時間後に本質的に完了し、７０℃への加熱および１０ｍＭ ＭｇＣｌ２の添加によってｔＲＮＡをリフォールディングさせ、その後、ゆっくりと室温に冷却した。Ｎａｎｏ−Ｄｒｏｐ １０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＲＮＡ濃度を測定し、ゲル電気泳動によって確認した。
アンバーサプレッサーｔＲＮＡアミノアシル化
非天然アミノアシル化についての条件は、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．１、４０ｍＭ ＫＣｌ、７５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＡＴＰ、８〜４０μＭ ｔＲＮＡｐｈｅ ＣＵＡ、１０ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭアミノ酸（ｐＮ３Ｆ）、および４０μＭ ＰｈｅＲＳ Ｔ４１５Ａ Ｄ２４３Ａである。ｔＲＮＡｐｈｅ ＣＵＡのアミノアシル化パーセントの決定を、ｔＲＮＡのアミノアシル化された部分とアミノアシル化されていない部分のＨＰＬＣ ＨＩＣ分割によって遂行した。この方法により、本発明者らは、本発明者らのｔＲＮＡのアミノアシル化度を、ｔＲＮＡを処理した後にタンパク質への組み込みの準備が整うと、モニターすることができる。反応を３７℃で１５分間インキュベートし、２．５容量の３００ｍＭ 酢酸ナトリウムｐＨ５．５で失活させる。失活した試料を２５：２４：１ フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール ｐＨ５．２（ａｍｂｉｏｎ）で抽出し、２分間、ボルテックスにかける。その後、これらを１４，０００ｒｃｆで１０〜３０分間、４℃で遠心分離して、水性相（ｔＲＮＡ）と有機相（タンパク質）を分離する。水性相（ｔＲＮＡを含有）を除去し、そして、分子サイズに基づいて分離する、前平衡（３００ｍＭ ＮａＯＡｃ）Ｇ２５セファデックスレジンサイズ排除カラムにそれを添加する。溶出物を２．５容量の１００％エタノールと混合し、−８０℃で１５〜３０分間インキュベートし、１２，０００〜１４，０００ｒｃｆで３０〜４５分間、遠心分離する。今やアミノアシル化ｔＲＮＡはペレット状態であり、それを−８０℃で保管するか、またはＨＰＬＣへの注入および／もしくはＯＣＦＳ反応での使用のためにわずかに酸性のバッファーに再懸濁させる。
ＨＰＬＣ Ｃ５ ＨＩＣカラムをバッファーＡ（５０ｍＭ リン酸カリウムおよび１．５Ｍ 硫酸アンモニウム ｐＨ５．７）中で、ＵＶトレースがゼロから変動しなくなるまで平衡させる。１〜１０μｇ ｔＲＮＡを１００μＬの２Ｘ バッファーＡ（１００ｍＭ リン酸カリウムおよび３Ｍ 硫酸アンモニウム）と混合する。その試料を注入し、５０分にわたってバッファーＡからバッファーＢ（５０ｍＭ リン酸カリウムおよび５％イソプロパノール）への勾配で実行する。
ｔｕｒｂｏＧＦＰ ＴＡＧ突然変異体へのｐＮ３Ｆの組み込み：
アンバーコドン（終止コドン）がある構築物中の緑色蛍光タンパク質の蛍光をモニターするために、ｔｕｒｂｏＧＦＰ（Ｅｖｒｏｇｅｎ、ロシア）をコードするＤＮＡを本発明者らのＯＣＦＳ発現ベクターｐＹＤ３１７にクローニングした。ｔｕｒｂｏＧＦＰ（ｐｄｂ２Ｇ６Ｘ）の結晶構造に従ってアミノ酸リジン３７、チロシン５０およびグルタメート２０５（および組み合わせ）に対応するヌクレオチドにオーバーラッピングＰＣＲ突然変異誘発によって終止コドン（ＴＡＧ）を挿入した。したがって、チャージされたｔＲＮＡでの終止コドンのいかなる抑制も蛍光をもたらすことになる。３０℃で、蛍光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＭ５）の中で、５時間、接着カバー（ＶＷＲ、９５０３１３０）をして反応物をインキュベートし、１０分間隔、λＥｘ＝４７６ｎｍおよびλＥｍ＝５１０で蛍光強度を測定した。ＤＥＰＣ処理水（Ｇ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、７８６−１０９）中の３０％ Ｓ３０抽出物、２４μｇ／ｍＬ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、１ｍＭ Ｌ−チロシン（Ｓｉｇｍａ、Ｔ８５６６）、プレミックス＊、１０〜６０μＭ ｐＮ３Ｆ−ｔＲＮＡｐｈｅ ＣＵＡまたはチャージされていないｔＲＮＡｐｈｅ、および３ｎＭ ｔｕｒｂｏＧＦＰプラスミドを含有する、２５μＬ 最終反応容量のための阻害剤とともに、ＯＣＦＳ反応ミックスを直ちにマイクロプレートに添加した。以前に観察された同様の速度で反応が確実に進行するように、終止コドンを有さないｔｕｒｂｏＧＦＰを使用する陽性対照反応を用いた一方で、蛍光が確実に検出されないように、ｔｕｒｂｏＧＦＰ Ｙ５０ＴＡＧを含有反応をｔＲＮＡなしも実行した（陰性対照）。陽性対照蛍光とアンバーコドン含有テンプレート蛍光との比較によって、抑制効率を算出した。
図２に示すように、ＯｍｐＴ１と野生型ＲＦ−１とを発現するＳＢＪＹ００１無細胞抽出物におけるＩｇＧ重鎖ＴＡＧ変異体の発現は、可溶性完全長ＩｇＧの相対的に不良な収率をもたらした。対照的に、ＯｍｐＴ１と三重置換Ｎ２９６Ｋ／Ｌ２９７Ｒ／Ｌ２９８Ｒを含有する改変ＲＦ−１タンパク質（変異体Ａ１８）とを発現するＳＢＨＳ０１６無細胞抽出物におけるＩｇＧ重鎖ＴＡＧ変異体の発現は、完全長ＩｇＧの相対的に高い収量をもたらした。さらに、図３に示すように、ＳＢＪＹ００１無細胞抽出物におけるＩｇＧ重鎖ＴＡＧ変異体の発現は、相対的に不良なアンバー抑制をもたらした（すなわち、重鎖タンパク質が短縮された）。対照的に、ＳＢＨＳ０１６無細胞抽出物におけるＩｇＧ重鎖ＴＡＧ変異体の発現は、図２において観察された完全長ＩｇＧの実質的に高い収量に対応する、相対的に高いアンバー抑制をもたらした（すなわち、はるかに少ない重鎖タンパク質が短縮された）。
この実施例は、ＲＦ１のＯｍｐＴ１切断が、ＯｍｐＴ１により切断可能でないインタクトＲＦ１と比較して、コーディング配列内のアンバーコドンに所望のｎｎＡＡを含む重鎖の収量の劇的な向上をもたらすことを実証する。
本明細書に記載する実施例および実施形態が単に例証のためのものであること、ならびにそれらの実施例および実施形態にかんがみて様々な改変形態または変更形態が当業者に示唆されることになり、およびそれらの改変形態または変更形態が本出願の精神および権限ならびに添付のクレームの範囲に含まれることは、理解される。本明細書において引用するすべての出版物、配列受託番号、特許および特許出願は、あらゆる目的でそれら全体が参照により本明細書に援用されている。
（配列表）
配列番号1
大腸菌（Escherichia coli）放出因子１(RF1)
MKPSIVAKLEALHERHEEVQALLGDAQTIADQERFRALSREYAQLSDVSRCFTDWQQVQEDIETAQMMLDDPEMREMAQDELREAKEKSEQLEQQLQVLLLPKDPDDERNAFLEVRAGTGGDEAALFAGDLFRMYSRYAEARRWRVEIMSASEGEHGGYKEIIAKISGDGVYGRLKFESGGHRVQRVPATESQGRIHTSACTVAVMPELPDAELPDINPADLRIDTFRSSGAGGQHVNTTDSAIRITHLPTGIVVECQDERSQHKNKAKALSVLGARIHAAEMAKRQQAEASTRRNLLGSGDRSDRNRTYNFPQGRVTDHRINLTLYRLDEVMEGKLDMLIEPIIQEHQADQLAALSEQE

配列番号2
大腸菌放出因子2(RF2)
MFEINPVNNRIQDLTERSDVLRGYLDYDAKKERLEEVNAELEQPDVWNEPERAQALGKERSSLEAVVDTLDQMKQGLEDVSGLLELAVEADDEETFNEAVAELDALEEKLAQLEFRRMFSGEYDSADCYLDIQAGSGGTEAQDWASMLERMYLRWAESRGFKTEIIEESEGEVAGIKSVTIKISGDYAYGWLRTETGVHRLVRKSPFDSGGRRHTSFSSAFVYPEVDDDIDIEINPADLRIDVYRTSGAGGQHVNRTESAVRITHIPTGIVTQCQNDRSQHKNKDQAMKQMKAKLYELEMQKKNAEKQAMEDNKSDIGWGSQIRSYVLDDSRIKDLRTGVETRNTQAVLDGSLDQFIEASLKAGL

配列番号3
大腸菌外膜タンパク質T1(OmpT)(シグナルペプチドに下線を引く)
MRAKLLGIVLTTPIAISSFASTETLSFTPDNINADISLGTLSGKTKERVYLAEEGGRKVSQLDWKFNNAAIIKGAINWDLMPQISIGAAGWTTLGSRGGNMVDQDWMDSSNPGTWTDESRHPDTQLNYANEFDLNIKGWLLNEPNYRLGLMAGYQESRYSFTARGGSYIYSSEEGFRDDIGSFPNGERAIGYKQRFKMPYIGLTGSYRYEDFELGGTFKYSGWVESSDNDEHYDPGKRITYRSKVKDQNYYSVAVNAGYYVTPNAKVYVEGAWNRVTNKKGNTSLYDHNNNTSDYSKNGAGIENYNFITTAGLKYTF

配列番号4
放出因子１（ＲＦ１）のスイッチループ領域であるアミノ酸２８７から３０４
QQAEASTRRNLLGSGDRS

配列番号26
放出因子１（ＲＦ１）のスイッチループであるアミノ酸２８７から３０４に挿入されたＯｍｐＴ切断ペプチド配列
QARRGSTRRNLLGSGDRS

配列番号27
放出因子１（ＲＦ１）のスイッチループであるアミノ酸２８７から３０４に挿入されたＯｍｐＴ切断ペプチド配列
QQARRGTRRNLLGSGDRS

配列番号28
放出因子１（ＲＦ１）のスイッチループであるアミノ酸２８７から３０４に挿入されたＯｍｐＴ切断ペプチド配列
QQAARRGRRNLLGSGDRS

配列番号29
放出因子１（ＲＦ１）のスイッチループであるアミノ酸２８７から３０４に挿入されたＯｍｐＴ切断ペプチド配列
QQAEARRGRNLLGSGDRS

配列番号30
放出因子１（ＲＦ１）のスイッチループであるアミノ酸２８７から３０４に挿入されたＯｍｐＴ切断ペプチド配列
QQAEAARRGNLLGSGDRS

配列番号31
放出因子１（ＲＦ１）のスイッチループであるアミノ酸２８７から３０４に挿入されたＯｍｐＴ切断ペプチド配列
QQAEASARRGLLGSGDRS

配列番号32
放出因子１（ＲＦ１）のスイッチループであるアミノ酸２８７から３０４に挿入されたＯｍｐＴ切断ペプチド配列
QQAEASTARRGLGSGDRS

配列番号33
放出因子１（ＲＦ１）のスイッチループであるアミノ酸２８７から３０４に挿入されたＯｍｐＴ切断ペプチド配列
QQAEASTRARRGGSGDRS

配列番号34
放出因子１（ＲＦ１）のスイッチループであるアミノ酸２８７から３０４に挿入されたＯｍｐＴ切断ペプチド配列
QQAEASTRRARRGSGDRS

配列番号35
放出因子１（ＲＦ１）のスイッチループであるアミノ酸２８７から３０４に挿入されたＯｍｐＴ切断ペプチド配列
QQAEASTRRNARRGGDRS

配列番号36
放出因子１（ＲＦ１）のスイッチループであるアミノ酸２８７から３０４に挿入されたＯｍｐＴ切断ペプチド配列
QQAEASTRRNLARRGDRS

配列番号37
放出因子１（ＲＦ１）のスイッチループであるアミノ酸２８７から３０４に挿入されたＯｍｐＴ切断ペプチド配列
QQAEASTRRNLLARRGRS

配列番号38
放出因子１（ＲＦ１）のスイッチループであるアミノ酸２８７から３０４に挿入されたＯｍｐＴ切断ペプチド配列
QQAEASTRRNLLGARRGS

配列番号39
放出因子１（ＲＦ１）のスイッチループであるアミノ酸２８７から３０４に挿入されたＯｍｐＴ切断ペプチド配列
QQAEASTRRNLLGSARRG

配列番号40
放出因子１（ＲＦ１）のスイッチループであるアミノ酸２８７から３０４に挿入されたＯｍｐＴ切断ペプチド配列
QQAEASTRRNLLGSGARR

配列番号41
放出因子１（ＲＦ１）のスイッチループであるアミノ酸２８７から３０４に挿入されたＯｍｐＴ切断ペプチド配列
QQAWLAARRGRGGSGDRS

配列番号42
放出因子１（ＲＦ１）のスイッチループであるアミノ酸２８７から３０４に挿入されたＯｍｐＴ切断ペプチド配列
QQAEWLAARRGRGSGDRS

配列番号43
放出因子１（ＲＦ１）のスイッチループであるアミノ酸２８７から３０４に挿入されたＯｍｐＴ切断ペプチド配列
QQAEAWLAARRGRGGDRS

配列番号44
放出因子１（ＲＦ１）のスイッチループであるアミノ酸２８７から３０４に挿入されたＯｍｐＴ切断ペプチド配列
QQWGGRWARKKGTIGDRS

配列番号45
放出因子１（ＲＦ１）のスイッチループであるアミノ酸２８７から３０４に挿入されたＯｍｐＴ切断ペプチド配列
QQAWGGRWARKKGTIDRS

配列番号46
放出因子１（ＲＦ１）のスイッチループであるアミノ酸２８７から３０４に挿入されたＯｍｐＴ切断ペプチド配列
QQAEWGGRWARKKGTIRS

配列番号47
ＯｍｐＴ切断ペプチド
ARRG

配列番号48
ＯｍｐＴ切断ペプチド
WLAARRGRG

配列番号49
ＯｍｐＴ切断ペプチド
WGGRWARKKGTI
配列番号50
ショートフォームのλファージＧａｍタンパク質（ＧａｍＳ）のＣ末端配列
GGSHHHHHH

配列番号51
ショートフォームのλファージＧａｍタンパク質（ＧａｍＳ）遺伝子増幅プライマー
ATATATCATATGAACGCTTATTACATTCAGGATCGTCTTGAG

配列番号52
ショートフォームのλファージＧａｍタンパク質（ＧａｍＳ）遺伝子増幅プライマー
ATATATGTCGACTTAATGATGATGATGATGATGAGAACCCCCTACCTCTGAATCAATATCAACCTGGTGGTG

配列番号53
Ｔ７プロモーターとＮ末端配列の定常領域と突然変異部位とを含む５’断片
第１ステップＰＣＲ増幅プライマー５χＴ２ＰＴ７
GCGTACTAGCGTACCACGTGGCTGGTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGG

配列番号54
突然変異部位、定常Ｃ末端領域、およびＴ７ターミネーター配列とを含む３’断片
第１ステップＰＣＲ増幅プライマー３χＴ２ＴＴ７
GCGTACTAGCGTACCACGTGGCTGGTGGCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGC

配列番号55
オーバーラッピングＰＣＲによる５’断片および３’断片構築のための単一プライマー５χＴ２
GCGTACTAGCGTACCACGTGGCTGGTGG

配列番号56
ＷＴ ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断部位スクリーニングフォワードプライマー
GCTCGATGATCCTGAAATGCGTGAGATGGCGCAGG

配列番号57
Ｍ７４Ｒ ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断部位スクリーニングフォワードプライマー
GCTCGATGATCCTGAACGCCGTGAGATGGCGCAGG

配列番号58
Ｅ７６Ｋ ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断部位スクリーニングフォワードプライマー
CGATGATCCTGAAATGCGTAAGATGGCGCAGGATGAAC

配列番号59
Ｅ８４Ｋ ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断部位スクリーニングフォワードプライマー
CAGGATGAACTGCGCAAAGCTAAAGAAAAAAGCGAGCAAC

配列番号60
Ａ８５Ｒ ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断部位スクリーニングフォワードプライマー
CAGGATGAACTGCGCGAACGTAAAGAAAAAAGCGAGCAAC

配列番号61
Ｅ８７Ｒ ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断部位スクリーニングフォワードプライマー
GGATGAACTGCGCGAAGCTAAACGTAAAAGCGAGCAACTGGAAC

配列番号62
Ｅ１０８Ｒ ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断部位スクリーニングフォワードプライマー
GCCAAAAGATCCTGATGACCGTCGTAACGCCTTCCTCG

配列番号63
Ｔ２９３Ｒ ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断部位スクリーニングフォワードプライマー
CAACAGGCCGAAGCGTCTCGCCGTCGTAACCTGC

配列番号64
Ｎ２９６Ｋ ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断部位スクリーニングフォワードプライマー
GCGTCTACCCGTCGTAAACTGCTGGGGAGTGGCG

配列番号65
Ｓ３０４Ｋ ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断部位スクリーニングフォワードプライマー
GGGAGTGGCGATCGCAAGGACCGTAACCGTACTTAC

配列番号66
Ｎ２９６Ｋ／Ｌ２９７Ｖ ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断部位スクリーニングフォワードプライマー
CGAAGCGTCTACCCGTCGTAAAGTTCTGGGGAGTGGCGATCGCAGC

配列番号67
Ｎ２９６Ｋ／Ｌ２９７Ｋ ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断部位スクリーニングフォワードプライマー
CGAAGCGTCTACCCGTCGTAAAAAGCTGGGGAGTGGCGATCGCAGC

配列番号68
Ｎ２９６Ｋ／Ｌ２９７Ｒ ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断部位スクリーニングフォワードプライマー
CGAAGCGTCTACCCGTCGTAAACGTCTGGGGAGTGGCGATCGCAGC

配列番号69
Ｎ２９６Ｒ／Ｌ２９７Ｖ ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断部位スクリーニングフォワードプライマー
CGAAGCGTCTACCCGTCGTCGCGTTCTGGGGAGTGGCGATCGCAGC

配列番号70
Ｎ２９６Ｒ／Ｌ２９７Ｋ ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断部位スクリーニングフォワードプライマー
CGAAGCGTCTACCCGTCGTCGCAAGCTGGGGAGTGGCGATCGCAGC

配列番号71
Ｎ２９６Ｒ／Ｌ２９７Ｒ ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断部位スクリーニングフォワードプライマー
CGAAGCGTCTACCCGTCGTCGCCGTCTGGGGAGTGGCGATCGCAGC

配列番号72
Ｎ２９６Ｋ／Ｌ２９７Ｒ／Ｌ２９８Ｋ ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断部位スクリーニングフォワードプライマー
CAGGCCGAAGCGTCTACCCGTCGTAAACGTAAGGGGAGTGGCGATCGCAGCGACC

配列番号73
Ｎ２９６Ｋ／Ｌ２９７Ｒ／Ｌ２９８Ｒ ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断部位スクリーニングフォワードプライマー
CAGGCCGAAGCGTCTACCCGTCGTAAACGTCGCGGGAGTGGCGATCGCAGCGACC

配列番号74
ＷＴ ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断部位スクリーニングリバースプライマー
CCTGCGCCATCTCACGCATTTCAGGATCATCGAGC

配列番号75
Ｍ７４Ｒ ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断部位スクリーニングリバースプライマー
CCTGCGCCATCTCACGGCGTTCAGGATCATCGAGC

配列番号76
Ｅ７６Ｋ ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断部位スクリーニングリバースプライマー
GTTCATCCTGCGCCATCTTACGCATTTCAGGATCATCG

配列番号77
Ｅ８４Ｋ ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断部位スクリーニングリバースプライマー
GTTGCTCGCTTTTTTCTTTAGCTTTGCGCAGTTCATCCTG

配列番号78
Ａ８５Ｒ ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断部位スクリーニングリバースプライマー
GTTGCTCGCTTTTTTCTTTACGTTCGCGCAGTTCATCCTG

配列番号79
Ｅ８７Ｒ ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断部位スクリーニングリバースプライマー
GTTCCAGTTGCTCGCTTTTACGTTTAGCTTCGCGCAGTTCATCC

配列番号80
Ｅ１０８Ｒ ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断部位スクリーニングリバースプライマー
CGAGGAAGGCGTTACGACGGTCATCAGGATCTTTTGGC

配列番号81
Ｔ２９３Ｒ ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断部位スクリーニングリバースプライマー
GCAGGTTACGACGGCGAGACGCTTCGGCCTGTTG

配列番号82
Ｎ２９６Ｋ ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断部位スクリーニングリバースプライマー
CGCCACTCCCCAGCAGTTTACGACGGGTAGACGC

配列番号83
Ｓ３０４Ｋ ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断部位スクリーニングリバースプライマー
GTAAGTACGGTTACGGTCCTTGCGATCGCCACTCCC

配列番号84
Ｎ２９６Ｋ／Ｌ２９７Ｖ ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断部位スクリーニングリバースプライマー
GCTGCGATCGCCACTCCCCAGAACTTTACGACGGGTAGACGCTTCG

配列番号85
Ｎ２９６Ｋ／Ｌ２９７Ｋ ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断部位スクリーニングリバースプライマー
GCTGCGATCGCCACTCCCCAGCTTTTTACGACGGGTAGACGCTTCG

配列番号86
Ｎ２９６Ｋ／Ｌ２９７Ｒ ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断部位スクリーニングリバースプライマー
GCTGCGATCGCCACTCCCCAGACGTTTACGACGGGTAGACGCTTCG

配列番号87
Ｎ２９６Ｒ／Ｌ２９７Ｖ ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断部位スクリーニングリバースプライマー
GCTGCGATCGCCACTCCCCAGAACGCGACGACGGGTAGACGCTTCG

配列番号88
Ｎ２９６Ｒ／Ｌ２９７Ｋ ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断部位スクリーニングリバースプライマー
GCTGCGATCGCCACTCCCCAGCTTGCGACGACGGGTAGACGCTTCG

配列番号89
Ｎ２９６Ｒ／Ｌ２９７Ｒ ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断部位スクリーニングリバースプライマー
GCTGCGATCGCCACTCCCCAGACGGCGACGACGGGTAGACGCTTCG

配列番号90
Ｎ２９６Ｋ／Ｌ２９７Ｒ／Ｌ２９８Ｋ ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断部位スクリーニングリバースプライマー
GGTCGCTGCGATCGCCACTCCCCTTACGTTTACGACGGGTAGACGCTTCGGCCTG

配列番号91
Ｎ２９６Ｋ／Ｌ２９７Ｒ／Ｌ２９８Ｒ ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断部位スクリーニングリバースプライマー
GGTCGCTGCGATCGCCACTCCCGCGACGTTTACGACGGGTAGACGCTTCGGCCTG

配列番号92
番号0 ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断ペプチド挿入フォワードオリゴプライマー
GCCGAAGCGTCTACCCGTCGTAACCTGCTGGGGAGTGGCGATCGCAGCGACCGTAACCGTACTTACAACTTCCCG

配列番号93
番号1 ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断ペプチド挿入フォワードオリゴプライマー
CGCCGTGGTTCTACCCGTCGTAACCTGCTGGGGAGTGGCGATCGCAGCGACCGTAACCGTACTTACAACTTCCCG

配列番号94
番号2 ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断ペプチド挿入フォワードオリゴプライマー
GCACGCCGTGGTACCCGTCGTAACCTGCTGGGGAGTGGCGATCGCAGCGACCGTAACCGTACTTACAACTTCCCG

配列番号95
番号3 ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断ペプチド挿入フォワードオリゴプライマー
GCCGCACGCCGTGGTCGTCGTAACCTGCTGGGGAGTGGCGATCGCAGCGACCGTAACCGTACTTACAACTTCCCG

配列番号96
番号4 ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断ペプチド挿入フォワードオリゴプライマー
GCCGAAGCACGCCGTGGTCGTAACCTGCTGGGGAGTGGCGATCGCAGCGACCGTAACCGTACTTACAACTTCCCG

配列番号97
番号5 ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断ペプチド挿入フォワードオリゴプライマー
GCCGAAGCGGCACGCCGTGGTAACCTGCTGGGGAGTGGCGATCGCAGCGACCGTAACCGTACTTACAACTTCCCG

配列番号98
番号6 ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断ペプチド挿入フォワードオリゴプライマー
GCCGAAGCGTCTGCACGCCGTGGTCTGCTGGGGAGTGGCGATCGCAGCGACCGTAACCGTACTTACAACTTCCCG

配列番号99
番号7 ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断ペプチド挿入フォワードオリゴプライマー
GCCGAAGCGTCTACCGCACGCCGTGGTCTGGGGAGTGGCGATCGCAGCGACCGTAACCGTACTTACAACTTCCCG

配列番号100
番号8 ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断ペプチド挿入フォワードオリゴプライマー
GCCGAAGCGTCTACCCGTGCACGCCGTGGTGGGAGTGGCGATCGCAGCGACCGTAACCGTACTTACAACTTCCCG

配列番号101
番号9 ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断ペプチド挿入フォワードオリゴプライマー
GCCGAAGCGTCTACCCGTCGTGCACGCCGTGGTAGTGGCGATCGCAGCGACCGTAACCGTACTTACAACTTCCCG

配列番号102
番号10 ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断ペプチド挿入フォワードオリゴプライマー
GCCGAAGCGTCTACCCGTCGTAACGCACGCCGTGGTGGCGATCGCAGCGACCGTAACCGTACTTACAACTTCCCG

配列番号103
番号11 ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断ペプチド挿入フォワードオリゴプライマー
GCCGAAGCGTCTACCCGTCGTAACCTGGCACGCCGTGGTGATCGCAGCGACCGTAACCGTACTTACAACTTCCCG

配列番号104
番号12 ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断ペプチド挿入フォワードオリゴプライマー
GCCGAAGCGTCTACCCGTCGTAACCTGCTGGCACGCCGTGGTCGCAGCGACCGTAACCGTACTTACAACTTCCCG

配列番号105
番号13 ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断ペプチド挿入フォワードオリゴプライマー
GCCGAAGCGTCTACCCGTCGTAACCTGCTGGGGGCACGCCGTGGTAGCGACCGTAACCGTACTTACAACTTCCCG

配列番号106
番号14 ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断ペプチド挿入フォワードオリゴプライマー
GCCGAAGCGTCTACCCGTCGTAACCTGCTGGGGAGTGCACGCCGTGGTGACCGTAACCGTACTTACAACTTCCCG

配列番号107
番号15 ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断ペプチド挿入フォワードオリゴプライマー
GCCGAAGCGTCTACCCGTCGTAACCTGCTGGGGAGTGGCGCACGCCGTGACCGTAACCGTACTTACAACTTCCCG

配列番号108
番号16 ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断ペプチド挿入フォワードオリゴプライマー
GCCGAAGCGTCTACCCGTCGTCGTCTGCTGGGGAGTGGCGATCGCAGCGACCGTAACCGTACTTACAACTTCCCG

配列番号109
番号17 ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断ペプチド挿入フォワードオリゴプライマー
GCCTGGCTGGCAGCGCGTCGCGGTCGTGGCGGGAGTGGCGATCGCAGCGACCGTAACCGTACTTACAACTTCCCG

配列番号110
番号18 ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断ペプチド挿入フォワードオリゴプライマー
GCCGAATGGCTGGCAGCGCGTCGCGGTCGTGGCAGTGGCGATCGCAGCGACCGTAACCGTACTTACAACTTCCCG

配列番号111
番号19 ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断ペプチド挿入フォワードオリゴプライマー
GCCGAAGCGTGGCTGGCAGCGCGTCGCGGTCGTGGCGGCGATCGCAGCGACCGTAACCGTACTTACAACTTCCCG

配列番号112
番号20 ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断ペプチド挿入フォワードオリゴプライマー
TGGGGTGGCCGTTGGGCTCGCAAGAAAGGTACTATTGGCGATCGCAGCGACCGTAACCGTACTTACAACTTCCCG

配列番号113
番号21 ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断ペプチド挿入フォワードオリゴプライマー
GCCTGGGGTGGCCGTTGGGCTCGCAAGAAAGGTACTATTGATCGCAGCGACCGTAACCGTACTTACAACTTCCCG

配列番号114
番号22 ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断ペプチド挿入フォワードオリゴプライマー
GCCGAATGGGGTGGCCGTTGGGCTCGCAAGAAAGGTACTATTCGCAGCGACCGTAACCGTACTTACAACTTCCCG

配列番号115
番号0 ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断ペプチド挿入リバースオリゴプライマー
GCTGCGATCGCCACTCCCCAGCAGGTTACGACGGGTAGACGCTTCGGCCTGTTGGCGTTTTGCCATTTCAGCAGC

配列番号116
番号1 ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断ペプチド挿入リバースオリゴプライマー
GCTGCGATCGCCACTCCCCAGCAGGTTACGACGGGTAGAACCACGGCGTGCTTGGCGTTTTGCCATTTCAGCAGC

配列番号117
番号2 ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断ペプチド挿入リバースオリゴプライマー
GCTGCGATCGCCACTCCCCAGCAGGTTACGACGGGTACCACGGCGTGCCTGTTGGCGTTTTGCCATTTCAGCAGC

配列番号118
番号3 ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断ペプチド挿入リバースオリゴプライマー
GCTGCGATCGCCACTCCCCAGCAGGTTACGACGACCACGGCGTGCGGCCTGTTGGCGTTTTGCCATTTCAGCAGC

配列番号119
番号4 ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断ペプチド挿入リバースオリゴプライマー
GCTGCGATCGCCACTCCCCAGCAGGTTACGACCACGGCGTGCTTCGGCCTGTTGGCGTTTTGCCATTTCAGCAGC

配列番号120
番号5 ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断ペプチド挿入リバースオリゴプライマー
GCTGCGATCGCCACTCCCCAGCAGGTTACCACGGCGTGCCGCTTCGGCCTGTTGGCGTTTTGCCATTTCAGCAGC

配列番号121
番号6 ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断ペプチド挿入リバースオリゴプライマー
GCTGCGATCGCCACTCCCCAGCAGACCACGGCGTGCAGACGCTTCGGCCTGTTGGCGTTTTGCCATTTCAGCAGC

配列番号122
番号7 ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断ペプチド挿入リバースオリゴプライマー
GCTGCGATCGCCACTCCCCAGACCACGGCGTGCGGTAGACGCTTCGGCCTGTTGGCGTTTTGCCATTTCAGCAGC

配列番号123
番号8 ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断ペプチド挿入リバースオリゴプライマー
GCTGCGATCGCCACTCCCACCACGGCGTGCACGGGTAGACGCTTCGGCCTGTTGGCGTTTTGCCATTTCAGCAGC

配列番号124
番号9 ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断ペプチド挿入リバースオリゴプライマー
GCTGCGATCGCCACTACCACGGCGTGCACGACGGGTAGACGCTTCGGCCTGTTGGCGTTTTGCCATTTCAGCAGC

配列番号125
番号10 ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断ペプチド挿入リバースオリゴプライマー
GCTGCGATCGCCACCACGGCGTGCGTTACGACGGGTAGACGCTTCGGCCTGTTGGCGTTTTGCCATTTCAGCAGC

配列番号126
番号11 ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断ペプチド挿入リバースオリゴプライマー
GCTGCGATCACCACGGCGTGCCAGGTTACGACGGGTAGACGCTTCGGCCTGTTGGCGTTTTGCCATTTCAGCAGC

配列番号127
番号12 ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断ペプチド挿入リバースオリゴプライマー
GCTGCGACCACGGCGTGCCAGCAGGTTACGACGGGTAGACGCTTCGGCCTGTTGGCGTTTTGCCATTTCAGCAGC

配列番号128
番号13 ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断ペプチド挿入リバースオリゴプライマー
GCTACCACGGCGTGCCCCCAGCAGGTTACGACGGGTAGACGCTTCGGCCTGTTGGCGTTTTGCCATTTCAGCAGC

配列番号129
番号14 ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断ペプチド挿入リバースオリゴプライマー
ACCACGGCGTGCACTCCCCAGCAGGTTACGACGGGTAGACGCTTCGGCCTGTTGGCGTTTTGCCATTTCAGCAGC

配列番号130
番号15 ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断ペプチド挿入リバースオリゴプライマー
ACGGCGTGCGCCACTCCCCAGCAGGTTACGACGGGTAGACGCTTCGGCCTGTTGGCGTTTTGCCATTTCAGCAGC

配列番号131
番号16 ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断ペプチド挿入リバースオリゴプライマー
GCTGCGATCGCCACTCCCCAGCAGACGACGACGGGTAGACGCTTCGGCCTGTTGGCGTTTTGCCATTTCAGCAGC

配列番号132
番号17 ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断ペプチド挿入リバースオリゴプライマー
GCTGCGATCGCCACTCCCGCCACGACCGCGACGCGCTGCCAGCCAGGCCTGTTGGCGTTTTGCCATTTCAGCAGC

配列番号133
番号18 ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断ペプチド挿入リバースオリゴプライマー
GCTGCGATCGCCACTGCCACGACCGCGACGCGCTGCCAGCCATTCGGCCTGTTGGCGTTTTGCCATTTCAGCAGC

配列番号134
番号19 ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断ペプチド挿入リバースオリゴプライマー
GCTGCGATCGCCGCCACGACCGCGACGCGCTGCCAGCCACGCTTCGGCCTGTTGGCGTTTTGCCATTTCAGCAGC

配列番号135
番号20 ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断ペプチド挿入リバースオリゴプライマー
GCTGCGATCGCCAATAGTACCTTTCTTGCGAGCCCAACGGCCACCCCACTGTTGGCGTTTTGCCATTTCAGCAGC

配列番号136
番号21 ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断ペプチド挿入リバースオリゴプライマー
GCTGCGATCAATAGTACCTTTCTTGCGAGCCCAACGGCCACCCCAGGCCTGTTGGCGTTTTGCCATTTCAGCAGC

配列番号137
番号22 ＲＦ１変異体ＯｍｐＴ切断ペプチド挿入リバースオリゴプライマー
GCTGCGAATAGTACCTTTCTTGCGAGCCCAACGGCCACCCCATTCGGCCTGTTGGCGTTTTGCCATTTCAGCAGC

配列番号138
ＲＦ１増幅プライマー５Ｈｉｓ−ＲＦ１
CATATGCATCACCATCACCATCACGGTGGTGGCTCTAAGCCTTCTATCGTTGCCAAACTGGAAGCC

配列番号139
ＲＦ１増幅プライマー３ＲＦ１
GTCGACTTATTCCTGCTCGGACAACGCCGCCAG

配列番号140
オリゴヌクレオチド媒介対立遺伝子置換（ＯＭＡＲ）ＰＣＲオリゴ１ｏｐＲＦ１ ＫＲ
GGGAAGTTGTAAGTACGGTTACGGTCGCTGCGATCcCCtgaaCCaAGacGcTTtCGACGGGTAGACGCTTCGGCCTGTTGGCGTTTTGCC

配列番号141
オリゴヌクレオチド媒介対立遺伝子置換（ＯＭＡＲ）ＰＣＲオリゴ１ｏｐＲＦ１ ＫＲＲ
GGGAAGTTGTAAGTACGGTTACGGTCGCTGCGATCcCCtgaaCCacgacGcTTtCGACGGGTAGACGCTTCGGCCTGTTGGCGTTTTGCC

配列番号142
オリゴヌクレオチド媒介対立遺伝子置換（ＯＭＡＲ）ＰＣＲオリゴ１ｏｐＲＦ１ ＫＲＫ
GGGAAGTTGTAAGTACGGTTACGGTCGCTGCGATCcCCtgaaCCcttacGcTTtCGACGGGTAGACGCTTCGGCCTGTTGGCGTTTTGCC

配列番号143
ミスマッチ増幅突然変異アッセイ（ＭＡＭＡ）ＰＣＲオリゴ３ＫＲ ｏｐ−ＰＣＲ
GCG ATC CCC TGA ACC AAG ACG C

配列番号144
ミスマッチ増幅突然変異アッセイ（ＭＡＭＡ）ＰＣＲオリゴ３ ＫＲＲ ｏｐ−ＰＣＲ
CGATCcCCtgaaCCacgacGc

配列番号145
ミスマッチ増幅突然変異アッセイ（ＭＡＭＡ）ＰＣＲオリゴ３ＫＲＫ ｏｐ−ＰＣＲ
TGCGATCcCCtgaaCCcttacGc

配列番号146
ミスマッチ増幅突然変異アッセイ（ＭＡＭＡ）ＰＣＲオリゴ５ ＲＦ１ ｏｐ−ＰＣＲ
CGTGACGGGGATAACGAACGCC

配列番号147
ローリングサークル増幅およびプライマー伸長シークエンシングプライマーＴ７
TAATACGACTCACTATAGG

配列番号148
ローリングサークル増幅およびプライマー伸長シークエンシングプライマーＴ７ ｔｅｒｍ
GCTAGTTATTGCTCAGCG

配列番号149
部位特異的突然変異誘発変異体ＳＰ−０００６７＿Ｖ４２２センスオリゴ
CGTTGGCAGCAGGGTAATTAGTTCAGCTGCAGCGTTATG

配列番号150
部位特異的突然変異誘発変異体ＳＰ−０００６７＿Ｖ４２２アンチセンスオリゴ
CATAACGCTGCAGCTGAACTAATTACCCTGCTGCCAACG

配列番号151
部位特異的突然変異誘発変異体ＳＰ−００１２７＿Ｓ４１５センスオリゴ
GCAAGCTGACCGTCGATAAATAGCGTTGGCAGCAGGGTAATG

配列番号152
部位特異的突然変異誘発変異体ＳＰ−００１２７＿Ｓ４１５アンチセンスオリゴ
CATTACCCTGCTGCCAACGCTATTTATCGACGGTCAGCTTGC

配列番号153
部位特異的突然変異誘発変異体ＳＰ−００１２８＿Ｑ４１８センスオリゴ
CGATAAAAGCCGTTGGTAGCAGGGTAATGTGTTCAG

配列番号154
部位特異的突然変異誘発変異体ＳＰ−００１２８＿Ｑ４１８アンチセンスオリゴ
CTGAACACATTACCCTGCTACCAACGGCTTTTATCG

配列番号155
部位特異的突然変異誘発変異体ＳＰ−００１１４＿Ｐ３４３センスオリゴ
GCAAAGCGAAAGGCCAATAGCGTGAACCGCAGGTC

配列番号156
部位特異的突然変異誘発変異体ＳＰ−００１１４＿Ｐ３４３アンチセンスオリゴ
GACCTGCGGTTCACGCTATTGGCCTTTCGCTTTGC

配列番号157
部位特異的突然変異誘発変異体ＳＰ−００１１２＿Ｇ３４１センスオリゴ
GACGATCAGCAAAGCGAAATAGCAACCGCGTGAACCGCAG

配列番号158
部位特異的突然変異誘発変異体ＳＰ−００１１２＿Ｇ３４１アンチセンスオリゴ
CTGCGGTTCACGCGGTTGCTATTTCGCTTTGCTGATCGTC

配列番号159
部位特異的突然変異誘発変異体ＳＰ−００１０２＿Ｋ３２０センスオリゴ
GCTGAATGGTAAAGAATACTAGTGCAAAGTGAGCAACAAGG

配列番号160
部位特異的突然変異誘発変異体ＳＰ−００１０２＿Ｋ３２０アンチセンスオリゴ
CCTTGTTGCTCACTTTGCACTAGTATTCTTTACCATTCAGC

配列番号161
部位特異的突然変異誘発変異体ＳＰ−０００６６＿Ｆ４０４センスオリゴ
CTGGACAGCGACGGTAGCTAGTTTCTGTATAGCAAGCTG

配列番号162
部位特異的突然変異誘発変異体ＳＰ−０００６６＿Ｆ４０４アンチセンスオリゴ
CAGCTTGCTATACAGAAACTAGCTACCGTCGCTGTCCAG

配列番号163
部位特異的突然変異誘発変異体ＳＰ−００１１３＿Ｑ３４２センスオリゴ
GCAAAGCGAAAGGCTAGCCGCGTGAACCGCAG

配列番号164
部位特異的突然変異誘発変異体ＳＰ−００１１３＿Ｑ３４２アンチセンスオリゴ
CTGCGGTTCACGCGGCTAGCCTTTCGCTTTGC

配列番号165
部位特異的突然変異誘発変異体ＳＰ−０００９６＿Ｔ２９９センスオリゴ
GTGAGGAACAATACAATAGCTAGTATCGCGTAGTGAGCGTGC

配列番号166
部位特異的突然変異誘発変異体ＳＰ−０００９６＿Ｔ２９９アンチセンスオリゴ
GCACGCTCACTACGCGATACTAGCTATTGTATTGTTCCTCAC

配列番号167
部位特異的突然変異誘発変異体ＳＰ−００１２０＿Ｙ３７３センスオリゴ
GGTGAAGGGCTTTTAGCCGAGCGACATCGC

配列番号168
部位特異的突然変異誘発変異体ＳＰ−００１２０＿Ｙ３７３アンチセンスオリゴ
GCGATGTCGCTCGGCTAAAAGCCCTTCACC

配列番号169
部位特異的突然変異誘発変異体ＳＰ−０００９４＿Ｎ２９７センスオリゴ
CGCGTGAGGAACAATACTAGAGCACGTATCGCGTAGTG

配列番号170
部位特異的突然変異誘発変異体ＳＰ−０００９４＿Ｎ２９７アンチセンスオリゴ
CACTACGCGATACGTGCTCTAGTATTGTTCCTCACGCG

配列番号171
部位特異的突然変異誘発変異体ＳＰ−００１２５＿Ｆ４０５センスオリゴ
GACAGCGACGGTAGCTTCTAGCTGTATAGCAAGCTGAC

配列番号172
部位特異的突然変異誘発変異体ＳＰ−００１２５＿Ｆ４０５アンチセンスオリゴ
GTCAGCTTGCTATACAGCTAGAAGCTACCGTCGCTGTC
（項目１） 外膜タンパク質Ｔ１（ＯｍｐＴ１）によって切断可能である機能性放出因子１タンパク質（ＲＦ１）であって、切断しやすいＯｍｐＴ１ペプチド結合が、野生型ＲＦ１（配列番号１）のアミノ酸２８７〜３０４に対応するスイッチループ領域内に位置し、および前記スイッチループ領域が、ｐＨ７．０で正に荷電する２つの隣接する塩基性アミノ酸を含むように改変される、ＲＦ１タンパク質。
（項目２） 前記２つの隣接する塩基性アミノ酸が、アルギニンおよびリジンを含む群から独立して選択される、項目１に記載のＲＦ１タンパク質。
（項目３） 前記スイッチループ領域が、３つの隣接する塩基性アミノ酸を有するように改変される、項目１に記載のＲＦ１タンパク質。
（項目４） 位置２９６のネイティブアスパラギンが、前記３つの隣接する塩基性アミノ酸のうちの１つの代わりとなる、項目３に記載のＲＦ１タンパク質。
（項目５） 前記改変タンパク質および野生型タンパク質がＯｍｐＴ１を発現する細菌からの無細胞抽出物中に同様の濃度で存在するとき、ＯｍｐＴ１による切断活性が、３０℃で３０分後、野生型ＲＦ１（配列番号１）の５０％より大きい、項目１に記載のＲＦ１タンパク質。
（項目６） 前記スイッチループ領域が、
から成る配列の群より選択されるアミノ酸配列を含む、項目１に記載のＲＦ１タンパク質。
（項目７） 前記スイッチループ領域が、
から成る配列の群より選択されるアミノ酸配列を含む、項目１に記載のＲＦ１タンパク質。
（項目８） 前記スイッチループ領域が、
から成る配列の群より選択されるアミノ酸配列を含む、項目１に記載のＲＦ１タンパク質。
（項目９） 前記スイッチループ領域が、
から成る配列の群より選択されるアミノ酸配列を含む、項目１に記載のＲＦ１タンパク質。
（項目１０） 外膜タンパク質Ｔ１（ＯｍｐＴ１）と切断しやすいＯｍｐＴ１ペプチド結合を含むように組換え改変された必須標的タンパク質との両方を発現する細菌細胞であって、前記結合が、前記タンパク質が複合体を形成していないとき少なくとも５０Å２のＢ因子を有する表面露出モチーフ内にある前記タンパク質の位置にあり、およびそのネイティブモチーフが、ｐＨ７．０で正に荷電する２つの隣接する塩基性アミノ酸を含むように改変される、細菌細胞。
（項目１１） 外膜タンパク質Ｔ１（ＯｍｐＴ１）と切断しやすいＯｍｐＴ１ペプチド結合を含むように組換え改変された必須標的タンパク質との両方を発現する細菌細胞であって、前記結合が、約２５Å２と約２２５Å２の間の溶媒露出表面積合計を有する表面露出モチーフ内にある前記タンパク質の位置にあり、およびそのネイティブモチーフが、ｐＨ７．０で正に荷電する２つの隣接する塩基性アミノ酸を含むように改変される、細菌細胞。
（項目１２） 外膜タンパク質Ｔ１（ＯｍｐＴ１）と切断しやすいＯｍｐＴ１ペプチド結合を含むように組換え改変された必須標的タンパク質との両方を発現する細菌細胞であって、前記結合が、ラマチャンドランプロットにおいて０°から−１８０°のファイ角度または０°から＋１８０°のプサイ角度を示す前記タンパク質の位置にあり、およびそのネイティブモチーフが、ｐＨ７．０で正に荷電する２つの隣接する塩基性アミノ酸を含むように改変される、細菌細胞。
（項目１３） 前記必須標的タンパク質が、ＲＦ１、ＲＦ２、ＲＮＡｓｅ、プロテアーゼ、チオレドキシンレダクターゼ、グルタレドキシンレダクターゼ、グルタチオンレダクターゼ、アミノ酸分解酵素、ポリリン酸キナーゼ、および低温ショックタンパク質から成る群より選択される、項目１０〜１２に記載の細菌細胞。
（項目１４） 前記細菌細胞が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、項目１０〜１２に記載の細菌細胞。
（項目１５） インビトロ無細胞合成システムにおける改変必須標的タンパク質の有害な活性を低減させるための方法であって、
ｉ）前記改変必須標的タンパク質を発現するＯｍｐＴ１陽性細菌を培養するステップであって、前記タンパク質が、切断しやすいＯｍｐｔＴ１ペプチド結合を含むように改変され、該タンパク質が、ｐＨ７．０で正に荷電する２つの隣接する塩基性アミノ酸を含むように改変されるものであるステップ；
ｉｉ）前記細菌を溶解して、無細胞合成抽出物を生じさせるステップ；
ｉｉｉ）前記必須標的タンパク質を、インタクトタンパク質を５０％低減させるために十分な量のＯｍｐＴ１と接触させるステップ；
ｉｖ）目的のタンパク質をコードする核酸テンプレートを前記抽出物に添加するステップ；および
ｖ）前記無細胞合成システムに前記目的のタンパク質を生産させるステップ
を含む方法。
（項目１６） 前記切断しやすいＯｍｐｔＴ１ペプチド結合が、前記タンパク質が複合体を形成していないときに少なくとも５０Å２のＢ因子を有する表面露出モチーフ内に位置する、項目１５に記載の方法。
（項目１７） 前記切断しやすいＯｍｐｔＴ１ペプチド結合が、約２５Å２と約２２５Å２との間の溶媒露出表面積合計を有する表面露出モチーフ内に位置する、項目１５に記載の方法。
（項目１８） 前記切断しやすいＯｍｐｔＴ１ペプチド結合が、ラマチャンドランプロットにおいて０°から−１８０°のファイ角度または０°から＋１８０°のプサイ角度を示す前記タンパク質の位置にある、項目１５に記載の方法。
（項目１９） 前記ＯｍｐＴ１陽性細菌が、大腸菌である、項目１５に記載の方法。
（項目２０） 前記細菌の酸化的リン酸化システムが、細胞溶解後および前記目的のタンパク質の合成中に活性のままである、項目１５に記載の方法。
（項目２１） 前記無細胞合成システムが、非ネイティブアミノ酸を前記目的のタンパク質のアンバーコドンに配置する、項目１５に記載の方法。
（項目２２） 外膜タンパク質Ｔ１（ＯｍｐＴ１）によって切断可能である機能性放出因子１タンパク質（ＲＦ１）をコードする核酸であって、切断しやすいＯｍｐＴ１ペプチド結合が、野生型ＲＦ１（配列番号１）のアミノ酸２８７〜３０４に対応するＲＦ１のスイッチループ領域内に位置し、および前記スイッチループ領域が、ｐＨ７．０で正に荷電する２つの隣接する塩基性アミノ酸を含むように改変される、核酸。
（項目２３） インビトロ無細胞合成システムにおいてアンバーコドンでのＲＦ１競合を低減させるための方法であって、
ｉ）外膜タンパク質Ｔ１（ＯｍｐＴ１）によって切断可能である機能性放出因子１タンパク質（ＲＦ１）を発現するＯｍｐＴ１陽性細菌を培養するステップ；
ｉｉ）前記細菌を溶解して、無細胞合成抽出物を生じさせるステップ；
ｉｉｉ）前記抽出物中の前記ＲＦ１タンパク質を、インタクトＲＦ１タンパク質を５０％低減させるために十分な量のＯｍｐＴ１と接触させるステップ；
ｉｖ）目的のタンパク質をコードし、かつアンバーコドンを含む核酸テンプレートを、前記抽出物に添加するステップ；および
ｖ）前記無細胞合成システムに前記目的のタンパク質を生産させるステップ
を含み、
前記ＲＦ１タンパク質が、野生型ＲＦ１（配列番号１）のアミノ酸２８７〜３０４に対応するスイッチループ領域内に位置する切断しやすいＯｍｐＴ１ペプチド結合を有し、および前記スイッチループ領域が、ｐＨ７．０で正に荷電する２つの隣接する塩基性アミノ酸を含むように改変される、方法。
（項目２４） 前記ＯｍｐＴ１陽性細菌が、大腸菌由来である、項目２３に記載の方法。
（項目２５） 前記細菌の酸化的リン酸化システムが、細胞溶解後および前記目的のタンパク質の合成中に活性のままである、項目２３に記載の方法。
（項目２６） 前記無細胞合成システムが、非ネイティブアミノ酸を前記目的のタンパク質のアンバーコドンに配置する、項目２３に記載の方法。
（項目２７） 無細胞合成システムであって、単一反応混合物中に、
ｉ）タンパク質をコードする核酸テンプレートを翻訳するために十分な細菌溶解物からの成分と、
ｉｉ）目的のタンパク質をコードし、かつ少なくとも１つのアンバーコドンを有する、核酸テンプレートと、
ｉｉｉ）前記アンバーコドンに相補的なｔＲＮＡと、
ｉｖ）外膜タンパク質Ｔ１（ＯｍｐＴ１）によって切断可能な機能性放出因子１（ＲＦ１）タンパク質であって、切断しやすいＯｍｐＴ１ペプチド結合が、野生型ＲＦ１（配列番号１）のアミノ酸２８７〜３０４に対応するＲＦ１のスイッチループ領域内に位置し、および前記スイッチループ領域が、ｐＨ７．０で正に荷電する２つの隣接する塩基性アミノ酸を含むように改変される、ＲＦ１タンパク質と
を含む、無細胞合成システム。
（項目２８） 前記反応混合物が、非天然アミノ酸および対応するアミノ酸シンセターゼをさらに含み、前記シンセターゼが、前記アンバーコドンに相補的なｔＲＮＡに前記非天然アミノ酸をチャージすることができる、項目２７に記載の無細胞合成システム。
（項目２９） 前記システムが活性酸化的リン酸化システムによりＡＴＰを生成する、項目２７に記載の無細胞合成システム。
（項目３０） 無細胞合成システムにおいてタンパク質を発現させるための方法であって、
ｉ．核酸テンプレートと細菌抽出物を、タンパク質合成を可能にする条件下であわせるステップであって、前記細菌抽出物が、野生型ＲＦ１（配列番号１）のアミノ酸２８７〜３０３に対応するスイッチループ領域内に位置する切断しやすいＯｍｐＴ１ペプチド結合においてＯｍｐＴ１によって切断されたＲＦ１タンパク質を含み、前記スイッチループ領域が、ｐＨ７．０で正に荷電する２つの隣接する塩基性アミノ酸を含むように改変されたものであるステップ；および
ｉｉ．前記核酸テンプレートからタンパク質を発現させるステップ
を含む方法。
（項目３１） 細菌細胞であって、前記細菌細胞のゲノムに組み込まれた項目１に記載の機能性ＲＦ１を含む細菌細胞。

Claims (25)

  1. 野生型ＲＦ１（配列番号１）のアミノ酸２８７〜３０４に対応するスイッチループ領域内に位置する外膜タンパク質Ｔ１（ＯｍｐＴ１）切断部位を含む変異体機能性放出因子１（ＲＦ１）タンパク質であって、前記スイッチループ領域内に位置するＯｍｐＴ１切断部位が、ｐＨ７．０で正に荷電する２つの隣接する塩基性アミノ酸を含む、変異体機能性ＲＦ１タンパク質。
  2. 前記２つの隣接する塩基性アミノ酸が、アルギニンおよびリジンを含む群から独立して選択される、請求項１に記載の変異体機能性ＲＦ１タンパク質。
  3. 前記スイッチループ領域が、３つの隣接する塩基性アミノ酸を含む、請求項１に記載の変異体機能性ＲＦ１タンパク質。
  4. 前記スイッチループ領域が、少なくとも２つのさらなる隣接する塩基性アミノ酸を含む、請求項１に記載の変異体機能性ＲＦ１タンパク質。
  5. 位置２９６のネイティブアスパラギンが、前記３つの隣接する塩基性アミノ酸のうちの１つの代わりとなる、請求項３に記載の変異体機能性ＲＦ１タンパク質。
  6. 前記変異体タンパク質および野生型タンパク質がＯｍｐＴ１を発現する細菌からの無細胞抽出物中に同様の濃度で存在するとき、ＯｍｐＴ１による切断活性が、３０℃で３０分後、野生型ＲＦ１（配列番号１）の５０％より大きい、請求項１に記載の変異体機能性ＲＦ１タンパク質。
  7. 前記スイッチループ領域が、
    から成る配列の群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の変異体機能性ＲＦ１タンパク質。
  8. 変異体機能性放出因子１（ＲＦ１）タンパク質であって、野生型ＲＦ１（配列番号１）のアミノ酸２８７〜３０４に対応するスイッチループ領域が、
    から成る配列の群より選択されるアミノ酸配列を含む、変異体機能性ＲＦ１タンパク質。
  9. 前記スイッチループ領域が、
    から成る配列の群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の変異体機能性ＲＦ１タンパク質。
  10. 前記スイッチループ領域が、
    から成る配列の群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の変異体機能性ＲＦ１タンパク質。
  11. 外膜タンパク質Ｔ１（ＯｍｐＴ１）と、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＲＦ１タンパク質との両方を発現する細菌細胞。
  12. 前記細菌細胞が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、請求項１１に記載の細菌細胞。
  13. 請求項１〜１０のいずれか一項に記載の変異体機能性放出因子１（ＲＦ１）タンパク質をコードする核酸。
  14. 無細胞合成抽出物を調製する方法であって、
    ｉ）請求項１〜１０のいずれか一項に記載の変異体機能性放出因子１（ＲＦ１）タンパク質を発現するＯｍｐＴ１陽性細菌を培養するステップ；
    ｉｉ）前記細菌を溶解して、無細胞合成抽出物を生じさせるステップ
    を含む、方法。
  15. 前記ＯｍｐＴ１陽性細菌が、大腸菌由来である、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記細菌の酸化的リン酸化システムが、細胞溶解後および前記目的のタンパク質の合成中に活性のままである、請求項１４に記載の方法。
  17. 前記無細胞合成システムが、非ネイティブアミノ酸を前記目的のタンパク質のアンバーコドンに配置する、請求項１４に記載の方法。
  18. 無細胞合成システムであって、単一反応混合物中に、
    ｉ）タンパク質をコードする核酸テンプレートを翻訳するために十分な細菌溶解物からの成分と、
    ｉｉ）目的のタンパク質をコードし、かつ少なくとも１つのアンバーコドンを有する、核酸テンプレートと、
    ｉｉｉ）前記アンバーコドンに相補的なｔＲＮＡと、
    ｉｖ）請求項１〜１０のいずれか一項に記載の変異体機能性放出因子１（ＲＦ１）タンパク質と
    を含む、無細胞合成システム。
  19. 前記反応混合物が、非天然アミノ酸および対応するアミノ酸シンセターゼをさらに含み、前記シンセターゼが、前記アンバーコドンに相補的なｔＲＮＡに前記非天然アミノ酸をチャージすることができる、請求項１８に記載の無細胞合成システム。
  20. 前記システムが活性酸化的リン酸化システムによりＡＴＰを生成する、請求項１８に記載の無細胞合成システム。
  21. 無細胞合成システムにおいてタンパク質を発現させるための方法であって、
    ｉ．核酸テンプレートと、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の変異体ＲＦ１タンパク質を含む細菌抽出物をあわせるステップ；および
    ｉｉ．前記核酸テンプレートからタンパク質を発現させるステップ
    を含む方法。
  22. 細菌細胞であって、前記細菌細胞のゲノムに組み込まれた請求項１３に記載の核酸を含む細菌細胞。
  23. 請求項１〜１０のいずれか一項に記載の変異体機能性ＲＦ１タンパク質を含む、細菌抽出物。
  24. 被定義アミノ酸残基において組み込まれた非ネイティブアミノ酸を有するポリペプチドの無細胞合成システムにおける収率を増加させるための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の変異体機能性ＲＦ１タンパク質の使用。
  25. 被定義アミノ酸残基において組み込まれた非ネイティブアミノ酸を有するポリペプチドの無細胞合成システムにおける収率を増加させるための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の変異体機能性ＲＦ１タンパク質を含む組成物。
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