JP5798489B2 - インビトロタンパク質合成システムを用いて非天然アミノ酸をタンパク質に選択的に導入するためのモノチャージシステム - Google Patents
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Description
本願は、米国特許法第1.119(e)項の下、2009年1月12日に出願された米国仮特許出願61/144,097号、61/144,083号、および61/144,03号の利益を主張し、これらは各々あらゆる目的のために、その全体が本明細書中に参考として援用される。
該当せず
コンパクトディスクにて提出する「配列表」、表またはコンピュータプログラム一覧の補遺への言及
該当せず
タンパク質合成は、ポリペプチド治療学、ワクチン、診断学および工業用酵素の開発の基礎をなす基本的な生物学的プロセスである。組換えDNA(rDNA)技術の登場により、所望のタンパク質を生成するために細胞の触媒機構を利用することが可能になった。これは、細胞に由来する溶解産物を用いて細胞環境内またはインビトロにおいて達成することができる。
本発明は、無細胞合成システムを用いて、タンパク質の事前に選択された位置に非天然アミノ酸を導入するための方法を開示し、この方法は、1)縮重センスコドンを含む核酸鋳型を得る工程、2)細胞集団を溶解することにより、天然アミノアシル−tRNA合成酵素が枯渇した細胞溶解産物を得る工程、3)第1イソ受容センスtRNAを選択的にアミノアシル化する外因性アミノアシル−tRNA合成酵素を溶解産物に加える工程、4)別個のtRNAチャージ反応において第2イソ受容センスtRNAをアミノアシル化する工程(前記第2イソ受容センスtRNAは、非天然アミノ酸でチャージされる)、5)それぞれの非天然アミノ酸でチャージされた第2イソ受容センスtRNAおよび核酸鋳型を細胞溶解産物に加え、その反応物が、鋳型の第2センスコドンに対応する位置に非天然アミノ酸を有するタンパク質を生成することを可能にする工程を包含する。
a)縮重センスコドンを含む核酸鋳型を得る工程(第1センスコドンおよび第2センスコドンは、同じ天然アミノ酸に対応するが、それぞれのヌクレオチド配列が異なる);
b)細胞集団を溶解することにより、細胞溶解産物を得る工程(前記溶解産物は、前記天然アミノ酸をアミノアシル化する天然アミノアシル−tRNA合成酵素が枯渇されている);
c)核酸鋳型の第1センスコドンに対応する第1イソ受容センスtRNAを選択的にアミノアシル化する第1外因性アミノアシル−tRNA合成酵素を溶解産物に加える工程;
d)非天然アミノ酸および核酸鋳型の第2センスコドンに対応する第2イソ受容センスtRNAを含むチャージ反応混合物(charging reaction mixture)を含む反応容器に触媒性アミノアシル化剤を加える工程;
e)第2イソ受容センスtRNAを非天然アミノ酸でアミノアシル化することにより、tRNA:非天然アミノ酸をチャージした部分(non−native amino acid charged moiety)を得る工程;
f)工程2の細胞溶解産物を:
1)tRNA:非天然アミノ酸をチャージした部分;および
2)第1および第2センスコドンを含む核酸鋳型
と、鋳型からタンパク質を生成するのに適切な条件下で混合する工程;および
g)その反応物が、核酸鋳型の第2センスコドンに対応する位置に非天然アミノ酸を有するタンパク質を生成することを可能にする工程
を包含する。
a)細胞溶解産物を生成するために使用される細胞を、天然アミノアシル−tRNA合成酵素の発現を阻害するように変化させることによって、細胞溶解産物から天然アミノアシル−tRNA合成酵素を枯渇させる工程;
b)第1遺伝子および第2遺伝子で前記細胞を形質転換する工程(前記第1遺伝子は、第1外因性アミノアシル−tRNA合成酵素を発現し、前記第2遺伝子は、第2イソ受容センスtRNAを選択的にアミノアシル化する第2外因性アミノアシル−tRNA合成酵素を発現する);および
c)細胞溶解産物から第2外因性アミノアシル−tRNA合成酵素を枯渇させる工程
によって実施される。
a)縮重センスコドンを含む核酸鋳型を得る工程(第1センスコドンおよび第2センスコドンは、同じ天然アミノ酸に対応するが、それぞれのヌクレオチド配列が異なる);
b)天然アミノアシル−tRNA合成酵素を含む細胞溶解産物を生成する工程(前記合成酵素は、核酸鋳型の第1センスコドンに対応する第1イソ受容センスtRNAと、核酸鋳型の第2センスコドンに対応する第2イソ受容センスtRNAの両方をアミノアシル化する能力を有する);
c)核酸鋳型の第2センスコドンに対応する天然の第2イソ受容センスtRNAを不活性化する工程;
d)非天然アミノ酸および核酸鋳型の第2センスコドンに対応する第2イソ受容センスtRNAを含むチャージ反応混合物を含む反応容器に触媒性アミノアシル化剤を加える工程;
e)第2イソ受容センスtRNAを非天然アミノ酸でアミノアシル化することにより、tRNA:非天然アミノ酸をチャージした部分を得る工程;
f)細胞溶解産物を:
1)tRNA:非天然アミノ酸をチャージした部分;および
2)第1および第2センスコドンを含む核酸鋳型
と、鋳型からタンパク質を生成するのに適切な条件下で混合する工程;および
g)反応物が、核酸鋳型の第2センスコドンに対応する位置に非天然アミノ酸を有するポリペプチドを生成することを可能にする工程
を開示する。
(項目1)
無細胞合成システムを用いて、ポリペプチドの事前に選択された位置に非天然アミノ酸を導入するためのインビトロにおける方法であって、前記方法は:
a)縮重センスコドンを含む核酸鋳型を得る工程であって、第1センスコドンおよび第2センスコドンは、同じ天然アミノ酸に対応するが、それぞれのヌクレオチド配列が異なる、工程;
b)細胞溶解産物を生成する工程;
c)該天然アミノ酸をアミノアシル化する天然アミノアシル−tRNA合成酵素を枯渇させる工程;
c)該核酸鋳型の該第1センスコドンに対応する第1イソ受容センスtRNAを選択的にアミノアシル化する第1外因性アミノアシル−tRNA合成酵素を該溶解産物に加える工程;
d)非天然アミノ酸および該核酸鋳型の該第2センスコドンに対応する第2イソ受容センスtRNAを含むチャージ反応混合物を含む反応容器に触媒性アミノアシル化剤を加える工程;
e)該第2イソ受容センスtRNAを該非天然アミノ酸でアミノアシル化することにより、tRNA:非天然アミノ酸をチャージした部分を得る工程;
f)該細胞溶解産物を:
1)該tRNA:非天然アミノ酸をチャージした部分;および
2)該第1センスコドンおよび該第2センスコドンを含む核酸鋳型
と、該鋳型からタンパク質を生成するのに適切な条件下で混合する工程;および
g)該反応物が、該核酸鋳型の該第2センスコドンに対応する位置に非天然アミノ酸を有する該ポリペプチドを生成することを可能にする工程
を包含する、方法。
(項目2)
前記触媒性アミノアシル化剤が、アミノアシル−tRNA合成酵素である、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記アミノアシル−tRNA合成酵素が、前記tRNA:非天然アミノ酸をチャージした部分を前記細胞溶解産物と混合する前に前記チャージ反応混合物から除去される、項目2に記載の方法。
(項目4)
前記触媒性アミノアシル化剤が、リボザイムである、項目1に記載の方法。
(項目5)
前記細胞抽出物の酸化的(oxidation)リン酸化システムが、タンパク質合成中に機能している、項目1に記載の方法。
(項目6)
前記細胞溶解産物が、細菌由来である、項目1に記載の方法。
(項目7)
前記細胞溶解産物が、大腸菌由来である、項目1に記載の方法。
(項目8)
前記非天然アミノ酸が、グリコールで修飾されたアミノ酸、金属キレート基、アリール−アジド含有アミノ酸およびケトン含有アミノ酸からなる群から選択される、項目1に記載の方法。
(項目9)
前記細胞が、ウサギ網状赤血球である、項目1に記載の方法。
(項目10)
前記細胞のアルギニンデカルボキシラーゼが枯渇している、項目1に記載の方法。
(項目11)
a)前記細胞溶解産物を生成するために使用される前記細胞を1つの遺伝子で形質転換する工程であって、該遺伝子は、前記天然アミノアシル−tRNA合成酵素を機能的に置き換えることができる、捕捉部分に融合されたアミノアシル−tRNA合成酵素を発現する、工程;
b)該天然アミノアシル−tRNA合成酵素遺伝子の発現を阻害するように該細胞を変化させる工程;および
c)該細胞溶解産物から、該捕捉部分に融合されたアミノアシル−tRNA合成酵素を枯渇させる工程
をさらに包含する、項目1に記載の方法。
(項目12)
前記捕捉部分に融合されたアミノアシル−tRNA合成酵素が、前記細胞溶解産物を形成する前記細胞と異種である、項目11に記載の方法。
(項目13)
アフィニティークロマトグラフィーによって、前記捕捉部分に融合されたアミノアシル−tRNA合成酵素を枯渇させる工程をさらに包含する、項目11に記載の方法。
(項目14)
前記アフィニティークロマトグラフィーが、イムノアフィニティークロマトグラフィーである、項目13に記載の方法。
(項目15)
前記捕捉部分に融合されたアミノアシル−tRNA合成酵素が、該捕捉部分を認識する抗体を使用する免疫沈降によって枯渇される、項目11に記載の方法。
(項目16)
a)前記細胞溶解産物を生成するために使用される前記細胞を1つの遺伝子で形質転換する工程であって、該遺伝子は、前記天然アミノアシル−tRNA合成酵素を機能的に置き換えることができる不安定な組換えアミノアシル−tRNA合成酵素を発現する、工程;b)該天然アミノアシル−tRNA合成酵素遺伝子の発現を阻害するように該細胞を変化させる工程;および
c)該細胞溶解産物から該不安定な組換えアミノアシル−tRNA合成酵素を枯渇させる工程
をさらに包含する、項目1に記載の方法。
(項目17)
前記組換えアミノアシル−tRNA合成酵素が、熱的に不安定である、項目16に記載の方法。
(項目18)
a)前記細胞溶解産物を生成するために使用される前記細胞を第1遺伝子および第2遺伝子で形質転換する工程であって、該第1遺伝子は、前記第1外因性アミノアシル−tRNA合成酵素を発現し、該第2遺伝子は、第2外因性アミノアシル−tRNA合成酵素を発現する、工程;
b)前記天然アミノアシル−tRNA合成酵素の発現を阻害するように該細胞を変化させる工程;および
c)該細胞溶解産物から該第2外因性アミノアシル−tRNA合成酵素を枯渇させる工程をさらに包含する、項目1に記載の方法。
(項目19)
前記第1アミノアシル−tRNA合成酵素および前記第2アミノアシル−tRNA合成酵素が、Acidithiobacillus ferrooxidans由来である、項目18に記載の方法。
(項目20)
前記第2外因性アミノアシル−tRNA合成酵素が、不安定である、項目18に記載の方法。
(項目21)
前記第2外因性アミノアシル−tRNA合成酵素が、熱的に不安定である、項目20に記載の方法。
(項目22)
前記第2外因性アミノアシル−tRNA合成酵素が、捕捉部分に融合されており、アフィニティークロマトグラフィーによって枯渇される、項目18に記載の方法。
(項目23)
前記アフィニティークロマトグラフィーが、イムノアフィニティークロマトグラフィーである、項目22に記載の方法。
(項目24)
前記第2外因性アミノアシル−tRNA合成酵素が、捕捉部分に融合されており、該捕捉部分を認識する抗体を使用する免疫沈降によって枯渇される、項目18に記載の方法。
(項目25)
前記第2外因性アミノアシル−tRNA合成酵素が、該第2外因性アミノアシル−tRNA合成酵素を特異的に認識する抗体を使用するイムノアフィニティークロマトグラフィーによって枯渇される、項目18に記載の方法。
(項目26)
前記第2外因性アミノアシル−tRNA合成酵素が、該第2外因性アミノアシル−tRNA合成酵素を特異的に認識する抗体を使用する免疫沈降によって枯渇される、項目18に記載の方法。
(項目27)
前記第2外因性アミノアシル−tRNA合成酵素に特異的なアミノアシル−tRNA合成酵素インヒビターを導入することによって、前記細胞溶解産物から該第2外因性アミノアシル−tRNA合成酵素が枯渇される、項目18に記載の方法。
(項目28)
前記天然アミノアシル−tRNA合成酵素を特異的に認識する抗体を使用する免疫沈降によって、前記細胞溶解産物から前記天然アミノアシル−tRNA合成酵素が枯渇される、項目1に記載の方法。
(項目29)
前記天然アミノアシル−tRNA合成酵素を特異的に認識する抗体を使用するイムノアフィニティークロマトグラフィーによって、前記細胞溶解産物から前記天然アミノアシル−tRNA合成酵素が枯渇される、項目1に記載の方法。
(項目30)
前記天然アミノアシル−tRNA合成酵素に特異的なアミノアシル−tRNA合成酵素インヒビターを導入することによって、前記細胞溶解産物から該天然アミノアシル−tRNA合成酵素が枯渇される、項目1に記載の方法。
(項目31)
溶解前に前記第1外因性アミノアシル−tRNA合成酵素をコードする遺伝子で前記細胞を形質転換した結果として、前記第1イソ受容センスtRNAを選択的に認識する該第1外因性アミノアシル−tRNA合成酵素が、前記溶解産物に加えられる、項目1に記載の方法。
(項目32)
1つのアミノ酸に対応する単一のイソ受容センスtRNAだけを選択的にアミノアシル化する外因性アミノアシル−tRNA合成酵素を含み、該アミノ酸に対応する天然アミノアシル−tRNA合成酵素が枯渇されている、インビトロタンパク質合成用の無細胞合成溶解産物。
(項目33)
前記溶解産物が、細菌細胞由来である、項目32に記載の無細胞合成溶解産物。
(項目34)
前記溶解産物が、大腸菌由来である、項目33に記載の無細胞合成溶解産物。
(項目35)
前記溶解産物が、アルギニンデカルボキシラーゼを含んでいない、項目33に記載の無細胞合成溶解産物。
(項目36)
前記溶解産物が、ウサギ網状赤血球由来である、項目32に記載の無細胞合成溶解産物。
(項目37)
前記溶解産物が、消泡剤を含む、項目32に記載の無細胞合成溶解産物。
(項目38)
前記溶解産物が、機能的な酸化的リン酸化システムを示す細菌抽出物である、項目32に記載の無細胞合成溶解産物。
(項目39)
前記溶解産物が、ポリペプチドをコードし、かつ前記アミノ酸に対する縮重センスコドンを含む核酸鋳型を含む、項目32に記載の無細胞合成溶解産物。
(項目40)
無細胞合成システムを用いて、ポリペプチドの事前に選択された位置に非天然アミノ酸を導入するためのインビトロにおける方法であって、前記方法は:
a)縮重センスコドンを含む核酸鋳型を得る工程であって、第1センスコドンおよび第2センスコドンは、同じ天然アミノ酸に対応するが、それぞれのヌクレオチド配列が異なる、工程;
b)天然アミノアシル−tRNA合成酵素を含む細胞溶解産物を生成する工程であって、該合成酵素は、該核酸鋳型の該第1センスコドンに対応する第1イソ受容センスtRNAと、該核酸鋳型の該第2センスコドンに対応する第2イソ受容センスtRNAとの両方をアミノアシル化する能力を有する、工程;
c)該核酸鋳型の該第2センスコドンに対応する天然の第2イソ受容センスtRNAを不活性化する工程;
d)非天然アミノ酸および該核酸鋳型の該第2センスコドンに対応する第2イソ受容センスtRNAを含むチャージ反応混合物を含む反応容器に触媒性アミノアシル化剤を加える工程;
e)該第2イソ受容センスtRNAを該非天然アミノ酸でアミノアシル化することにより、tRNA:非天然アミノ酸をチャージした部分を得る工程;
f)該細胞溶解産物を:
1)該tRNA:非天然アミノ酸をチャージした部分;および
2)該第1センスコドンおよび該第2センスコドンを含む核酸鋳型
と、該鋳型からタンパク質を生成するのに適切な条件下で混合する工程;および
g)該反応物が、該核酸鋳型の該第2センスコドンに対応する位置に非天然アミノ酸を有する該ポリペプチドを生成することを可能にする工程
を包含する、方法。
(項目41)
前記天然の第2イソ受容センスtRNAが、該天然の第2イソ受容センスtRNAに選択的に結合するアンチセンスDNAを加えることによって不活性化される、項目40に記載の方法。
(項目42)
前記天然の第2イソ受容センスtRNAが、該天然の第2イソ受容センスtRNAを選択的に切断する特異的なtRNAリボヌクレアーゼまたはその活性なフラグメントを加えることによって不活性化される、項目40に記載の方法。
(項目43)
前記天然の第2イソ受容センスtRNAが、コリシンDまたはコリシンDの活性なフラグメントを加えることによって不活性化される、項目42に記載の方法。
(項目44)
事前に選択されたアミノ酸を有するチャージしたtRNAを有する細菌細胞溶解産物を含み、センスコドンを認識し、かつ該事前に選択されたアミノ酸を有する該チャージしたtRNAに対して著しい合成酵素活性を有しない、チャージしたtRNA溶液であって、
ここで、該チャージしたtRNA溶液は、特異的な合成酵素インヒビターを含まない、チャージしたtRNA溶液。
I.緒言
本発明は、無細胞合成システムを用いて、タンパク質の事前に選択された位置に非天然アミノ酸を組み込む新規手段を提供する。本方法は、遺伝暗号によってコードされる非直交性で天然のイソ受容センスtRNAの使用を含む。このような方法は、直交アミノアシル−tRNA合成酵素に頼らずに、センスコドンを使用することによって数多くの非天然アミノ酸を組み込むことを可能にする。
「アミノアシル化」または「アミノアシル化する」とは、tRNAがその正しいアミノ酸で「チャージされる」完全なプロセス(アミノアシル基を化合物に付加する結果であるプロセス)のことを指す。「アミノアシル化」または「アミノアシル化する」が本発明に関係するとき、アミノアシル化を受けるtRNAまたはアミノアシル化されたtRNAは、アミノ酸でチャージされたtRNAであり、アミノアシル化を受けるアミノ酸またはアミノアシル化されたアミノ酸は、tRNA分子にチャージされたアミノ酸である。
本発明のタンパク質を生成するためには、核酸鋳型が必要である。無細胞タンパク質合成用の鋳型は、mRNAまたはDNAであり得る。その鋳型は、任意の特定の目的の遺伝子をコードすることができ、完全長ポリペプチドまたはその任意の長さのフラグメントをコードし得る。鋳型の配列決定に役立つ核酸は、必要に応じて自然の起源に由来するか、または合成もしくは組換えのものであり得る。例えば、DNAは、組換えDNA、例えば、プラスミド、ウイルスなどであり得る。本発明の性質は、非天然アミノ酸を組み込むためにセンスコドンを使用し、当該分野で通常見られるような直交性の成分の必要性を回避する。結果として、本発明の好ましい実施形態は、非天然アミノ酸が組み込まれるために選択されるか否かに関係なく、完全かつ機能的なタンパク質を翻訳することができる鋳型を使用する。
本発明は、標的タンパク質のインビトロ翻訳のために細胞溶解産物を利用する。便宜のため、溶解産物の起源として使用される生物は、起源生物または宿主細胞と呼ばれることがある。宿主細胞は、細菌、酵母、哺乳動物もしくは植物の細胞、またはタンパク質合成が可能な他の任意のタイプの細胞であり得る。溶解産物は、所望のタンパク質をコードするメッセンジャーリボ核酸(mRNA)を翻訳することができる成分を含み、必要に応じて、所望のタンパク質をコードするDNAを転写することできる成分を含む。そのような成分としては、例えば、DNA指向性RNAポリメラーゼ(RNAポリメラーゼ)、所望のタンパク質をコードするDNAの転写を開始するために必要な任意の転写アクチベーター、転移リボ核酸(tRNA)、アミノアシル−tRNA合成酵素、70Sリボソーム、N10−ホルミルテトラヒドロ葉酸、ホルミルメチオニン−tRNAfMet合成酵素、ペプチジルトランスフェラーゼ、開始因子(例えば、IF−1、IF−2およびIF−3)、伸長因子(例えば、EF−Tu、EF−TsおよびEF−G)、終結因子(例えば、RF−1、RF−2およびRF−3)などが挙げられる。
本発明は、イソ受容センスtRNAを天然または非天然のアミノ酸で差次的にチャージすることを必要とする。それゆえ、本発明のいくつかの実施形態は、チャージされていないイソ受容センスtRNA分子が、溶解産物内で第2センスコドンに対する非天然アミノ酸と競合し得る間違った天然アミノ酸でチャージされることを防ぐための、天然アミノアシル−tRNA合成酵素の枯渇を含む。天然アミノアシル−tRNA合成酵素は、宿主細胞集団を溶解する前に細胞溶解産物から、または宿主細胞集団を溶解した後に溶解産物から直接、枯渇され得る。本発明のいくつかの実施形態はさらに、溶解後に溶解産物から第2外因性アミノアシル−tRNA合成酵素を枯渇するための方法を提供する。
天然アミノアシル−tRNA合成酵素が溶解前に細胞溶解産物から枯渇される実施形態において、その天然アミノアシル−tRNA合成酵素が、捕捉部分と呼ばれるタグに融合されたアミノアシル−tRNA合成酵素で置き換えられるように、宿主細胞集団が変更され得る。その天然アミノアシル−tRNA合成酵素は、不安定であるアミノアシル−tRNA合成酵素でも置き換えられ得る。その天然アミノアシル−tRNA合成酵素は、前記細胞をある遺伝子で形質転換することによって置き換えられ、ここで、前記遺伝子は、天然アミノアシル−tRNA合成酵素を機能的に置き換えることができる最適な組換えアミノアシル−tRNA合成酵素を発現する。天然アミノアシル−tRNA合成酵素を、タグ化されたアミノアシル−tRNA合成酵素または不安定であるアミノアシル−tRNA合成酵素で置き換える目的は、天然アミノアシル−tRNA合成酵素の非存在下における宿主細胞集団の生存を保ちつつ、両方のイソ受容センスtRNAをチャージすることができるアミノアシル−tRNA合成酵素を溶解産物から除く単純な様式を提供することである。天然アミノアシル−tRNA合成酵素または捕捉部分に融合された天然アミノアシル−tRNA合成酵素を枯渇させる方法は、以下でさらに詳細に論じられる。
溶解後に天然アミノアシル−tRNA合成酵素が細胞溶解産物から枯渇される実施形態では、捕捉部分でタグ化されたアミノアシル−tRNA合成酵素または不安定な組換え合成酵素でアミノアシル−tRNA合成酵素を置き換えることは、不要である。これらの実施形態では、イムノアフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降を用いることにより、内因性天然アミノアシル−tRNA合成酵素が枯渇され得る。この実施形態には、天然アミノアシル−tRNA合成酵素に対する抗体を産生することが必要である。いったん天然アミノアシル−tRNA合成酵素を十分に認識する抗体が産生されると、上に記載したようなイムノアフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降を用いることにより、天然アミノアシル−tRNA合成酵素が溶解産物から枯渇され得る。
天然アミノアシル−tRNA合成酵素が、宿主細胞内で2種類の外因性アミノアシル−tRNA合成酵素によって機能的に置き換えられる実施形態では、第2外因性アミノアシル−tRNA合成酵素は、上で述べたように、溶解後に溶解産物から除去されなければならない。
本発明が実施され得る1つの様式は、天然の第2イソ受容tRNAを不活性化することによるものである。これらの実施形態では、天然アミノアシル−tRNA合成酵素は、通常は第1イソ受容tRNAにアシル化される天然アミノ酸で前記第1イソ受容tRNAをチャージするために必要なアミノアシル化合成酵素として機能するために、枯渇されずに、溶解産物内で保存される。天然アミノ酸の起源は、宿主細胞集団によって産生されるものであるので、溶解の直後に溶解産物内に存在する。
tRNAチャージ反応は、本明細書中で使用されるとき、非天然アミノ酸でアミノアシル化される第2イソ受容センスtRNAがチャージされるインビトロでのtRNAのアミノアシル化反応のことを指す。tRNAチャージ反応物は、チャージ反応混合物、イソ受容センスtRNAおよび非天然アミノ酸を含む。
repair)、修復欠損宿主株を用いる突然変異誘発、制限−選択および制限−精製、欠失突然変異誘発、全遺伝子合成による突然変異誘発、二本鎖切断修復などが挙げられる。次いで、所望の活性に対する機能的アッセイを用いて変異体がスクリーニングされる。例えば、アミノアシル−tRNA合成酵素の校正機能が、削除され得る。突然変異誘発、例えば、キメラ構築物を必要とする突然変異誘発もまた用いられ得る。非天然アミノ酸を認識するようにアミノアシル−tRNA合成酵素を操作することは、当該分野で周知になっている。例えば、Liuら、Proc.Natl.Acad.Sci.94:10092−7(1997);Furter,Protein Sci.,7:419(1998);Zhangら、Proc.Natl.Acad.Sci.94:4504−09(1997);Ohnoら、J.Biochem.130:417−23(2001);Kigaら、Proc.Natl.Acad.Sci.99:9715−9723(2002)を参照のこと。
第1および第2コドンと会合した、上に記載されたチャージしたイソ受容センスtRNAは、ここで、事前に選択された位置に非天然アミノ酸を有する所望のタンパク質の合成用の核酸鋳型とともに、細胞溶解産物と混合される。
一般法
分子生物学における標準的な方法は、報告されている(Maniatisら(1982)Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.;Sambrook and Russell(2001)Molecular Cloning,3yd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.;Wu(1993)Recombinant DNA,Vol.217,Academic Press,San Diego,Calif.)。標準的な方法は、RNAの取扱いおよび解析についての詳細な方法を記載しているBindereif,Schoen,& Westhof(2005)Handbook of RNA
Biochemistry,Wiley−VCH,Weinheim,Germanyにも見られる。
tRNA2’,3’−環状リン酸のインビトロにおける転写および単離
非天然アミノ酸でアミノアシル化されたイソ受容tRNAは、図1における例によって図示される設計されたtRNA−HDVリボザイム鋳型DNAから、図2に図示されるように、インビトロ転写の後、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)による精製、2’,3’−環状リン酸の酵素的除去、および操作されたtRNA合成酵素を用いた非天然アミノ酸(nnAA)でのtRNAのチャージによって、生成され得る。転写収量を最適化するために、異なる4つのインビトロ転写プロトコルを、図3および図4に図示されるtRNA転写物について試験した。4つの異なるインビトロ転写プロトコルのすべてによって、同様のtRNA収量がもたらされた。転写の最適化は、通常、50μLの反応物において37℃で2〜3時間にわたって行われた。反応条件は、以下のとおりだった:(1)40mM HEPES(pH7.9)、10mM DTT、10mM MgCl2、2.5mMスペルミジン、4U/mlピロホスファターゼ、0.4U/ml supeRNAse−in(Ambion)、20mM NaCl、4mM NTP、0.024mg/ml T7RNAポリメラーゼ、0.028mg/mlプラスミドDNA鋳型、(2)80mM HEPES(pH7.5)、5mM DTT、22mM MgCl2、1mMスペルミジン、0.12mg/mlウシ血清アルブミン(BSA)、1U/mlピロホスファターゼ、0.4U/ml SupeRNAse−in、3.75mM NTPs、0.024mg/ml T7RNAポリメラーゼ、0.028mg/mlプラスミドDNA鋳型、(3)30mM HEPES(pH7.9)10mM DTT、MgCl2、2mMスペルミジン、1U/mlピロホスファターゼ、0.4U/ml supeRNAse−in、4mM NTPs、0.024mg/ml T7RNAポリメラーゼ、0.028mg/mlプラスミドDNA鋳型、(4)40mM HEPES(pH8.0)、10mM DTT、46mM MgCl2;2mMスペルミジン、0.4U/ml supeRNAse−in、10mM NaCl、3mM NTP、0.024mg/ml T7RNAポリメラーゼ、0.028mg/mlプラスミドDNA鋳型。以前の知見(Bindereif,Schon,& Westhof(2005))とは対照的に、本発明者らは、tRNAの1位または2位にウラシルをコードする鋳型(例えば、構築物1および4)がT7RNAポリメラーゼによる転写にとって深刻な欠陥はないことを見出した。結果として、構築物1
活性なtRNAを放出するためのtRNA2’,3’−環状リン酸の脱リン酸化
HDVリボザイムによって切断されたtRNAからの2’−3’環状リン酸の除去に必要とされるT4ポリヌクレオチドキナーゼ(PNK)(図2および5を参照のこと)を以下のとおり生成した:N末端の6−ヒスチジンタグ(配列番号13)を有するPNK遺伝子を、遺伝子合成し(DNA2.0,Menlo Park.,CA)、プラスミドpYD317にクローニングした。そのプラスミドT4PNK_pYD317を用いて、BL21(DE3)細胞を形質転換した。これらの細胞をBraun10L発酵槽内の自己誘導培地(Studier F.W.(2005)Protein Expr.Purif.,41:207−234)において、最終ODが21になるまで18時間生育した。遠心分離によって細胞を回収したところ、240gの細胞ペレットが得られた。40gの細胞ペレットを500mlの緩衝液A(50mM Tris(pH7.8)、300mM KCl、10mMイミダゾール)に再懸濁し、均質化によって溶解し、遠心分離によって不純物を除去し、35mLのNi−IMACカラムに充填した。そのカラムを5カラム体積の緩衝液Aで洗浄した。緩衝液A+0.5mM BME、300mMイミダゾール、0.1μM ATPおよび10%グリセロール(v/v)を溶出のために使用した。凝集を防ぐために、PNK含有画分を直ちに、20%グリセロールを含む緩衝液Aで4×希釈した。PNK含有画分をプールし、緩衝液を、1.2mg/mLの最終濃度でPNK貯蔵緩衝液(20mM Tris(pH7.6)、100mM KCl、0.2mM EDTA、2mM DTT、50%グリセロール)に交換した。
Westhof(2005))において、脱リン酸化されたtRNAの移動度が低下したことを示している。3μgの脱リン酸化されたtRNAを含むアリコートを、ローティング緩衝液(100mM酢酸ナトリウム(pH5.2)、7M尿素、1mg/mlブロモフェノールブルー色素)で2倍希釈し、6.5%19:1アクリルアミド、100mM酢酸ナトリウム(pH5.2)、7M尿素のゲル(40cm×34cm)に充填し、40Wで一晩電気泳動した。0.06%メチレンブルー、0.5M酢酸ナトリウム(pH5.2)を使用してゲルを30分間染色し、脱イオン水で脱染した。両方のアッセイが、1時間後の本質的に完全かつ定量的な脱リン酸化を示唆した。
アミノアシル−tRNA合成酵素の組換え発現:ベクター、酵素発現および精製
図2の最後の工程に図示されている別個のtRNAアミノアシル化(チャージ)反応には、イソ受容tRNA分子をアミノアシル化する、操作されたアミノアシル−tRNA合成酵素の使用が必要である。この合成酵素は、以下の実施例に記載されるような組換え操作された合成酵素を発現させることによって得ることができる。
Flow(GE Healthcare)カラムに通した。次いで、図8aに図示されるように、そのカラムを15カラム体積のGluRS洗浄緩衝液(50mMリン酸ナトリウムpH8.0;300mM塩化ナトリウム;20mMイミダゾール;10%グリセロール)で洗浄し、5カラム体積のGluRS溶出緩衝液(50mMリン酸ナトリウムpH8.0;300mM塩化ナトリウム;300mMイミダゾール;10%グリセロール)で溶出した。ピーク画分をプールし、2Lの2×GluRS貯蔵緩衝液(100mM HEPES,pH8.0;40mM塩化ナトリウム;1mMジチオトレイトール(DTT);.2mM EDTA)に2回透析し、100%グリセロールで2倍希釈した。約945mgのGluRSが、30gの細胞ペレットから回収された。長期間の場合は−80℃でタンパク質を保存し、いったん解凍したら−20℃で保存した。
Soc,124,5652−3)のチャージパーセントを上げるために、QuickChange Mutagenesisキット(Stratagene)および重複プライマーを用いて変異A294Gを大腸菌PheSに導入した。得られた6×HisPheS(A294G)遺伝子を、NdeIからSalIまでの制限酵素認識部位を用いてpET21(a)にサブクローニングした。このプラスミドを使用することにより、BL21(DE3)コンピテントセルを形質転換した。細胞を自己誘導培地中で一晩生育して、封入体に入ったPheS(A294G)サブユニットを得た。細胞を均質化によって溶解し、封入体を遠心分離によってペレットにし、6Mグアニジンに完全に再懸濁し、次いで、最終濃度2Mグアニジン−HClになるようにPBSで希釈した。PheT遺伝子を、NdeIおよびXhoIの制限酵素認識部位を含むプライマーを用いて大腸菌ゲノムDNAから増幅した。そのPCRフラグメントをpET24(b)にサブクローニングし、PheS(A294G)と同一の自己誘導培地を用いて発現させた。PheS(A294G)とは対照的に、発現されたPheTサブユニットは、可溶性だった。細胞をNi親和性精製充填緩衝液:50mM NaPO4緩衝液(pH7.5)、300mM NaClおよび5mMイミダゾール中で溶解した。その溶解産物から不純物を除去し、次いで、2Mグアニジン−HCl中のPheS(A294G)を、撹拌しながらゆっくり加えた。リフォールディングされたPheRSを、Niアフィニティークロマトグラフィーの後にS100サイズ排除樹脂を用いるサイズ排除クロマトグラフィーによって単離した。
nnAAによるtRNAアミノアシル化をモニターするための放射性の方法
tRNAの3’末端のアデノシンヌクレオチドを、報告されているように(Ledoux & Uhlenbeck(2008),Methods,44,74−80)大腸菌CCAヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素を用いてα−32P−AMPと交換した。過剰のPPiを用いて3’−AMPを除去するように、次いでPPiaseを用いてAMPを付加するように、反応条件を駆動させる。活性なtRNAを、50mMグリシンpH9.0、10mM MgCl2、0.3μM α−32P−ATP、0.05mM PPi中のCCA酵素とともに37℃で5分間インキュベートした。1μlの10μM CTPおよび10U/ml(1単位)の無機ピロホスファターゼ(酵母−Sigma)を加え、2分間以上インキュベートし、次いで、1/10の体積の3M NaOAc pH5.2を各アリコートに加えた。得られた3’末端が放射標識されたtRNAを水で1:5希釈し、使用する前にリフォールディングさせた。
nnAAによるtRNAアミノアシル化をモニターするための非放射性の方法
放射標識されていない(Non−radiolabled)
nnAAの組み込みを操るための無細胞タンパク質合成
本質的にはLiuらによって報告されているように(Liu,Zawadaら(2005)Biotechnol Prog,21,460−5)、高細胞密度発酵の大腸菌KGK10株の急成長(Knapp,Goerkeら(2007)Biotechnol Bioeng,97,901−8)を用いてリボソーム収率を最大にするために、無細胞の抽出物または溶解産物を生成した。均質化の後、細胞溶解産物にDL−ジチオトレイトールを加えなかった。改変された「流出(run−off)手順」を用いて無細胞抽出物を調製した。十分な無細胞抽出物を生成するための発酵体積は、代表的には、所望の無細胞反応物の体積の2.5×だった。細胞抽出物の還元活性を不活性化するために、様々な濃度のヨードアセトアミド(IAM)を、以前に報告されているように(Yang,Kanterら(2004)Biotechnol Prog,20,1689−96)加えた。遺伝子発現は、T7プロモーターの支配下にあった。翻訳の開始を促進するために、−6から+37位におけるmRNAのΔGfoldによって測定される、mRNAの不安定性について最適化されたATG開始コドン(N末端のメチオニン残基)を有する遺伝子の5’末端において同義語コドンを用いて遺伝子を合成し(DNA2.0,Menlo Park,CA)(Kudla,Murrayら(2009)Science,324,255−258)、稀なコドンを置き換えた。8mMグルタミン酸マグネシウム、10mMグルタミン酸アンモニウム、130mMグルタミン酸カリウム、35mMピルビン酸ナトリウム、1.2mM AMP、0.86mMのGMP、UMPおよびCMPの各々、2mMアミノ酸(チロシンについては1mM)、4mMシュウ酸ナトリウム、1mMプトレシン、1.5mMスペルミジン、15mMリン酸カリウム、100nM T7RNAポリメラーゼ、2〜50nM DNA鋳型、1〜10μM大腸菌DsbC、ならびにIAMで処理された24〜30%(v/v)の無細胞抽出物を含む無細胞反応を、30℃において行った。約5mMの総濃度まで還元型(GSH)および酸化型(GSSG)のグルタチオンを加えることによって、レドックス電位を操った。30℃およびpH7におけるGSH/GSSG対の標準的な電位としてE0=−205mVを用い(Wunderlich and Glockshuber(1993)Protein Science,2,717−726)、Nernst方程式を使用して、開始時のレドックス電位を計算した。その無細胞タンパク質合成システム中で30℃において6時間、GMCSFを発現させた。図18は、加えられたアミノ酸であるLysおよびPhe(Gluではない)の濃度を、無細胞反応物中で操ることにより、タンパク質合成がどのように影響され得るかを図示している。
内因性アミノアシル−tRNA合成酵素の枯渇
大腸菌KGK10から調製される細胞抽出物を調製するためにグルタメート−tRNA合成酵素(gltX)の活性を維持しつつ、FLAG−タグアフィニティークロマトグラフィーを使用してその合成酵素活性を無くすために、その合成酵素のゲノムコピーをC末端のFLAG−タグでタグ化した。GENE BRIDGES(Heidelberg,Germany)製のQuick&Easy E.coli Gene Deletion Kit(Cat.No.K006)をその製造者が提案するプロトコルに従って使用して、遺伝子挿入を行った。708−FLPecmR発現プラスミド(A105,GENE BRIDGES)を使用することにより、大腸菌染色体から選択マーカーを排除した。AccuPrime pfx SuperMix(Invitrogen)をその製造者が提案するプロトコルに従って使用するPCR伸長によって、DNA挿入カセットを増幅した。DNA鋳型は、Quick&Easy E.coli Gene Deletion KitのFTR−PGK−gb2−neo−FRT鋳型DNAだった。プライマーは:
活性部位特異的インヒビターPhe−およびGlu−スルファモイルアデノシン(Phe−SAおよびGlu−SA)を用いた内因性aaRS活性の枯渇
図19は、無細胞反応物に加えられたイソ受容チャージした(isoaccepting charged)nnAA−tRNAの反応性が、活性部位特異的インヒビターを用いて調節されることにより、加えられたイソ受容tRNAのバックグラウンドリチャージをどのように制限し得るかを図示している。
TurboGFP Y50TAGへのパラ−アセチルフェニルアラニン(pAF)の組み込み:
非天然アミノ酸(nnAA)を含むタンパク質の無細胞合成を制御するためおよび最適化するために(図21)、本発明者らは、プロセス全体の個別の工程の動態および熱力学を説明する定量的フレームワークを確立することを目指した(図19aを参照のこと)。そのようなフレームワークは、そのプロセスにおける各関与物の機能および機構を理解する上での手掛かりとなり、タンパク質へのnnAAの無細胞組み込みの徹底的な解析および最適化のための基礎として役立つ。
タンパク質に蛍光タグを組み込む実行可能性を証明するために、イプシロン標識されたBODIPY−FL lysl−tRNAである
rhGM−CSFへのpAFの組み込み
突然変異誘発および相補性研究は、単一のイソ受容大腸菌
5μm,4.6×250mm,Agilent)を使用して精製し、図27に示されるように280nmでモニターした。サンプルを質量分析による解析にまわした。未改変のGM−CSFは、14604Daの質量を有した。
鋳型の入手
本発明には、無細胞タンパク質合成反応のために核酸鋳型の使用が必要である。以下は、所望のポリペプチド内に非天然アミノ酸を配置することに基づいて構築されたコドン配列を有する鋳型を生成する実施例を提供する。
Jolla,CA)株を形質転換し、その培養物を37℃で一晩生育し、精製キット(Qiagen,Valencia,CA)を使用してDNAを精製することによって、環状プラスミドDNA鋳型を調製する。
インビトロでのタンパク質合成に有用な溶解産物の生成
非天然アミノ酸を含むタンパク質を発現するために有用な溶解産物を生成しなければならない。この実施例では、後の実施例に記載されるように前記合成酵素を枯渇させるために有用な6×His−タグ(配列番号13)とともに天然アミノアシル−tRNA合成酵素が発現されるように改変された大腸菌から溶解産物を生成することを示す。
内因性アミノアシル−tRNA合成酵素の枯渇
本発明には、内因性アミノアシル−tRNA合成酵素の不活性化が必要である。この不活性化の目的は、通常、非天然アミノ酸でチャージされ得る未チャージのイソ受容tRNAが、天然アミノ酸で誤ってアミノアシル化されることを防ぐことである。
アミノアシル−tRNA合成酵素の組換え発現:ベクター、酵素発現および精製
別個のtRNAチャージ反応には、イソ受容tRNA分子をアミノアシル化するアミノアシル−tRNA合成酵素の使用が必要である。この合成酵素は、この実施例に記載されるように組換え合成酵素を発現させることによって得ることができる。
各タイプの発現ベクターを構築するために使用されるプライマー
アミノアシル−tRNA合成酵素バリアントの操作
非天然アミノ酸は、通常、天然に存在するアミノアシル−tRNA合成酵素によってイソ受容センスtRNA分子にチャージされるはずがない。場合によっては、イソ受容tRNAを非天然アミノ酸でチャージする能力を有する「ごたまぜ」アミノアシル−tRNA合成酵素が、あらかじめ存在することがある。そのような能力を有するアミノアシル−tRNA合成酵素が存在しない他の場合では、所望の非天然アミノ酸が、別個のtRNAチャージ反応においてtRNA分子にチャージされ得るように、新しいアミノアシル−tRNA合成酵素を操作しなければならない。
非天然tRNAをチャージするためのアミノアシル−tRNA合成酵素バリアントのスクリーニング
実施例5に記載したように操作されたバリアントのハイスループット発現を、以下のとおり96ウェル形式で行う。プレーティングされたコロニーを、滅菌つまようじで96ウェル深ウェルプレートに移し、OD600=0.5まで富栄養培地中で生育した後、1mM IPTGで誘導し、一晩生育する。精製は、Millipore Multiscreen濾過プレート(Millipore Corp.)を使用する96ウェル形式で行われる。細胞を回収して溶解し、その溶解産物を4×体積のPBS緩衝液で希釈し、200μLを、MultiscreenプレートにおけるNi−キレート化セファロース媒体上に充填する。イミダゾールの濃度を上げることによって、酵素の溶出を最適化する。その濾液を真空濾過によって濾過し、高収量の純粋な組換えタンパク質が得られる。
非天然アミノ酸の合成:
GalNAc L−トレオニンは、非天然アミノ酸の例であり、商業的に入手可能なGalNAc L−トレオニン(N−Fmoc−O−(2−アセトアミド−3,4,6−トリ−O−アセチル−2−デオキシ−α−D−ガラクトピラノシル)−L−トレオニン(V−Labs,Inc.,Covington,LA)から合成される。この合成は、ジクロロメタン中のピペリジンによるFmoc基の選択的な脱保護により、遊離アミノ酸を得た後、リパーゼWGを用いるその炭水化物の酢酸塩の選択的な酵素的加水分解によって起きる(このサンプルは、逆相HPLCを用いて精製される)。
tRNAチャージ反応
本発明には、タンパク質合成反応とは別のチャージ反応において、イソ受容センスtRNAを天然または非天然アミノ酸でチャージすることが必要である。
インビトロでのタンパク質合成反応
実施例2に記載したように生成され、続いて実施例3に記載したように天然アミノアシル−tRNA合成酵素が枯渇された、大腸菌溶解産物とともに、表3に要約されている試薬を、無細胞タンパク質合成反応物は含む。
Claims (28)
- 無細胞合成システムを用いて、ポリペプチドの事前に選択された位置に非天然アミノ酸を導入するためのインビトロにおける方法であって、前記方法は:
a)第1センスコドンおよび第2センスコドンを含む核酸鋳型を得る工程であって、該第1センスコドンおよび該第2センスコドンは、同じ天然アミノ酸に対応するが、それぞれのヌクレオチド配列が異なる、工程;
b)細胞溶解産物を生成する工程;
c)該天然アミノ酸をアミノアシル化する天然アミノアシル−tRNA合成酵素を該細胞溶解産物から枯渇させる工程;
d)該核酸鋳型の該第1センスコドンに対応する第1イソ受容センスtRNAを選択的にアミノアシル化する第1外因性アミノアシル−tRNA合成酵素を該溶解産物に加える工程;
e)非天然アミノ酸および該核酸鋳型の該第2センスコドンに対応する第2イソ受容センスtRNAを含むチャージ反応混合物を含む反応容器に触媒性アミノアシル化剤を加える工程;
f)該第2イソ受容センスtRNAを該非天然アミノ酸でアミノアシル化することにより、tRNA:非天然アミノ酸をチャージした部分を得る工程;
g)該細胞溶解産物を:
1)該tRNA:非天然アミノ酸をチャージした部分;および
2)該第1センスコドンおよび該第2センスコドンを含む核酸鋳型
と、該鋳型からタンパク質を生成するのに適切な条件下で混合する工程;および
h)該反応物が、該核酸鋳型の該第2センスコドンに対応する位置に非天然アミノ酸を有する該ポリペプチドを生成することを可能にする工程
を包含する、方法。 - 前記触媒性アミノアシル化剤が、アミノアシル−tRNA合成酵素である、請求項1に記載の方法。
- 前記アミノアシル−tRNA合成酵素が、前記tRNA:非天然アミノ酸をチャージした部分を前記細胞溶解産物と混合する前に前記チャージ反応混合物から除去される、請求項2に記載の方法。
- 前記触媒性アミノアシル化剤が、リボザイムである、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞抽出物の酸化的(oxidation)リン酸化システムが、タンパク質合成中に機能している、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞溶解産物が、細菌由来である、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞溶解産物が、大腸菌由来である、請求項1に記載の方法。
- 前記非天然アミノ酸が、グリコールで修飾されたアミノ酸、金属含有アミノ酸、アリール−アジド含有アミノ酸およびケトン含有アミノ酸からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞が、ウサギ網状赤血球である、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞のアルギニンデカルボキシラーゼが枯渇している、請求項1に記載の方法。
- 前記工程b)〜c)が、以下の工程:
b’)細胞溶解産物を生成するために使用される前記細胞を1つの遺伝子で形質転換する工程であって、該遺伝子は、該細胞溶解産物からの前記天然アミノ酸をアミノアシル化する天然アミノアシル−tRNA合成酵素を置き換えることができる、捕捉部分に融合されたアミノアシル−tRNA合成酵素を発現する、工程;
c’)該天然アミノアシル−tRNA合成酵素遺伝子の発現を阻害するように該細胞を変化させる工程;
d’)該細胞溶解産物を生成し、該細胞溶解産物から、該捕捉部分に融合されたアミノアシル−tRNA合成酵素を枯渇させる工程
によって置き換えられ、ここで、該捕捉部分は、タグ、抗体、親和性支持体、マトリックス、樹脂、カラムおよびコーティングされたビーズからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。 - 前記捕捉部分に融合されたアミノアシル−tRNA合成酵素が、前記細胞溶解産物を形成する前記細胞と異種である、請求項11に記載の方法。
- アフィニティークロマトグラフィーによって、前記捕捉部分に融合されたアミノアシル−tRNA合成酵素を枯渇させる工程をさらに包含する、請求項11に記載の方法。
- 前記アフィニティークロマトグラフィーが、イムノアフィニティークロマトグラフィーである、請求項13に記載の方法。
- 前記捕捉部分に融合されたアミノアシル−tRNA合成酵素が、該捕捉部分を認識する抗体を使用する免疫沈降によって枯渇される、請求項11に記載の方法。
- 前記工程b)〜d)が、以下の工程:
b”)細胞溶解産物を生成するために使用される前記細胞を第1遺伝子および第2遺伝子で形質転換する工程であって、該第1遺伝子は、前記第1外因性アミノアシル−tRNA合成酵素を発現し、該第2遺伝子は、第2外因性アミノアシル−tRNA合成酵素を発現し、該第1および第2外因性アミノアシル−tRNA合成酵素の各々が、それぞれ前記第1および第2イソ受容センスtRNAを特異的にアミノアシル化する、工程;
c”)前記天然アミノアシル−tRNA合成酵素の発現を阻害するように該細胞を変化させる工程;
d”)該細胞溶解産物を生成し、該細胞溶解産物から該第2外因性アミノアシル−tRNA合成酵素を枯渇させる工程
によって置き換えられる、請求項1に記載の方法。 - 前記第1外因性アミノアシル−tRNA合成酵素および前記第2外因性アミノアシル−tRNA合成酵素が、Acidithiobacillus ferrooxidans由来である、請求項16に記載の方法。
- 前記第2外因性アミノアシル−tRNA合成酵素が、捕捉部分に融合されており、アフィニティークロマトグラフィーによって枯渇され、該捕捉部分はタグである、請求項16に記載の方法。
- 前記アフィニティークロマトグラフィーが、イムノアフィニティークロマトグラフィーである、請求項18に記載の方法。
- 前記第2外因性アミノアシル−tRNA合成酵素が、捕捉部分に融合されており、該捕捉部分を認識する抗体を使用する免疫沈降によって枯渇される、請求項16に記載の方法。
- 前記第2外因性アミノアシル−tRNA合成酵素が、該第2外因性アミノアシル−tRNA合成酵素を特異的に認識する抗体を使用するイムノアフィニティークロマトグラフィーによって枯渇される、請求項16に記載の方法。
- 前記第2外因性アミノアシル−tRNA合成酵素が、該第2外因性アミノアシル−tRNA合成酵素を特異的に認識する抗体を使用する免疫沈降によって枯渇される、請求項16に記載の方法。
- 前記第2外因性アミノアシル−tRNA合成酵素に特異的なアミノアシル−tRNA合成酵素インヒビターを導入することによって、前記細胞溶解産物から該第2外因性アミノアシル−tRNA合成酵素が機能的に枯渇される、請求項16に記載の方法。
- 前記天然アミノアシル−tRNA合成酵素を特異的に認識する抗体を使用する免疫沈降によって、前記細胞溶解産物から該天然アミノアシル−tRNA合成酵素が枯渇される、請求項1に記載の方法。
- 前記天然アミノアシル−tRNA合成酵素を特異的に認識する抗体を使用するイムノアフィニティークロマトグラフィーによって、前記細胞溶解産物から該天然アミノアシル−tRNA合成酵素が枯渇される、請求項1に記載の方法。
- 前記天然アミノアシル−tRNA合成酵素に特異的なアミノアシル−tRNA合成酵素インヒビターを導入することによって、前記細胞溶解産物から該天然アミノアシル−tRNA合成酵素が機能的に枯渇される、請求項1に記載の方法。
- 溶解前に前記第1外因性アミノアシル−tRNA合成酵素をコードする遺伝子で前記細胞を形質転換した結果として、前記第1イソ受容センスtRNAを選択的に認識する該第1外因性アミノアシル−tRNA合成酵素が、前記溶解産物に加えられる、請求項1に記載の方法。
- 無細胞合成システムを用いて、ポリペプチドの事前に選択された位置に非天然アミノ酸を導入するためのインビトロにおける方法であって、前記方法は:
a)第1センスコドンおよび第2センスコドンを含む核酸鋳型を得る工程であって、該第1センスコドンおよび該第2センスコドンは、同じ天然アミノ酸に対応するが、それぞれのヌクレオチド配列が異なる、工程;
b)天然アミノアシル−tRNA合成酵素を含む細胞溶解産物を生成する工程であって、該合成酵素は、該核酸鋳型の該第1センスコドンに対応する第1イソ受容センスtRNAと、該核酸鋳型の該第2センスコドンに対応する第2イソ受容センスtRNAとの両方をアミノアシル化する能力を有する、工程;
c)該核酸鋳型の該第2センスコドンに対応する天然の第2イソ受容センスtRNAを不活性化する工程であって、該天然の第2イソ受容センスtRNAは、該天然の第2イソ受容センスtRNAに選択的に結合するアンチセンスDNAを加えることによって不活性化される、工程;
d)非天然アミノ酸および該核酸鋳型の該第2センスコドンに対応する第2イソ受容センスtRNAを含むチャージ反応混合物を含む反応容器に触媒性アミノアシル化剤を加える工程;
e)該第2イソ受容センスtRNAを該非天然アミノ酸でアミノアシル化することにより、tRNA:非天然アミノ酸をチャージした部分を得る工程;
f)該細胞溶解産物を:
1)該tRNA:非天然アミノ酸をチャージした部分;および
2)該第1センスコドンおよび該第2センスコドンを含む核酸鋳型
と、該鋳型からタンパク質を生成するのに適切な条件下で混合する工程;および
g)該反応物が、該核酸鋳型の該第2センスコドンに対応する位置に非天然アミノ酸を有する該ポリペプチドを生成することを可能にする工程
を包含する、方法。
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