CN102348807B - 利用体外蛋白合成体系将非天然氨基酸引入蛋白的单装载体系 - Google Patents

Abstract

本发明提供了利用无细胞合成体系将非天然氨基酸并入蛋白的预选位置的新方法。该方法涉及使用由遗传密码编码的非正交天然同功有义tRNA。这类方法允许通过使用有义密码子将多个非天然氨基酸并入，而不必依赖正交tRNA-合成酶对。

Description

利用体外蛋白合成体系将非天然氨基酸引入蛋白的单装载体系

相关申请的交叉引用

依据35U.S.C.§1.119(e)，本申请要求均于2009年1月12日提交的美国申请第61/144,097号、第61/144,083号以及第61/144,030号的权益，出于所有目的将每一申请通过援引整体并入。

关于在联邦资助研究和发展下产生的发明的权利的有关声明

不适用

涉及以光盘提交的“序列表”、表格或计算机程序清单附录

不适用

发明背景

蛋白合成是基本生物过程，该过程是多肽治疗剂、疫苗、诊断学以及工业酶的研发基础。随着重组DNA(rDNA)技术的出现，利用细胞的催化机制以产生期望的蛋白已成为可能。这能够在细胞环境内或利用来自细胞的裂解物在体外实现。

因为仅20种氨基酸天然存在于蛋白中，因此对产生期望的蛋白存在局限。例如，由于患者体内存在蛋白酶，有潜力用作治疗剂的肽在给予患者后可能很快降解或失活。同样，诸如细菌或病毒的感染物更可能发展出针对仅含有天然存在的氨基酸的肽的抗性。之所以发生这种情况是因为，与含有非天然氨基酸的肽相比，细菌或病毒所产生的能使肽药物失活的酶更可能使含有天然氨基酸的肽失活。与能够进行任何结构变化来影响化合物的功能性质的小有机分子合成相比，这类局限变得更为明显。因此，对于治疗用途而言，含有非天然氨基酸的蛋白变得更为有利。此外，含有非天然氨基酸的肽非常有益于非治疗性研究目的，例如与蛋白的结构和功能探索、用于组合化学的肽文库的构建以及蛋白质组学研究有关的用途。

尽管能够通过翻译后修饰来修饰20种天然存在的氨基酸，但是扩展遗传密码使其包括具有新的生物学、化学或物理性质的其它非天然氨基酸会增加含有此类新非天然氨基酸的蛋白的效用。蛋白性质可以包括蛋白的大小、酸度、亲核性、氢键结合能力或疏水性。

已经利用不同的策略来合成含有非天然氨基酸的肽。出于这一目的，已常规使用合成肽化学。参阅例如Eckert et al，Cell 99：103-15(1999)。然而，常规固相肽合成通常限于小于100个残基的小肽。随着肽片段的酶学连接和天然化学连接的最新发展，制备更大的蛋白已经成为可能。然而，这些方法难以规模化制备。参阅例如Dawson and Kent，Annu.Rev.Biochem.69：923(2000)。

利用活细胞的体内翻译被广泛用于来自遗传编码的天然或重组DNA序列的蛋白的有效合成和翻译后修饰。然而，如果蛋白表达于内含体中，则折叠可能是无效的。最重要的是，这类方法对于选择性并入多个非天然氨基酸或控制翻译后修饰过程是比较困难的。

相对于常规体内蛋白表达方法，体外或无细胞蛋白合成提供了若干优势。无细胞体系能将大部分(如果不是全部)细胞代谢资源集中于一种蛋白的独自产生。此外，在体外缺少细胞壁和细胞膜组分是有利的，因为这允许控制合成环境。例如，能够改变tRNA水平以反映正在表达的基因的密码子使用。由于不需要考虑细胞生长或活力，因此也能够比体内蛋白合成更灵活地改变氧化还原电势、pH或离子强度。此外，能容易地实现直接回收纯化的、正确折叠的蛋白产物。

近几年，已经将无细胞体系的生产率已经提高了2个数量级，从5μg/ml-小时提高到约500μg/ml-小时。这种提高已使体外蛋白合成成为实验室规模研究的实用技术，并为高通量蛋白表达提供了技术平台。其还表明了利用无细胞技术作为体内大规模商业化蛋白药物生产的备选手段的可行性。

就体内和体外蛋白合成体系而言，将非天然氨基酸并入蛋白仍然是一项挑战。在该领域的尝试中的主要障碍是促进氨酰tRNA合成酶与非天然氨基酸的识别。氨酰tRNA合成酶是催化特定氨基酸与其同源tRNA分子结合的酶。在大多数情况下，每一种天然存在的氨基酸都具有一特异性氨酰tRNA合成酶，该酶会使该氨基酸氨酰化到其正确的tRNA分子，这称为tRNA装载(tRNA charging)。鉴于遗传密码的简并性允许氨基酸被装载到多种同功有义tRNA分子，因此存在相对较少的氨酰tRNA合成酶。因此，能否将非天然氨基酸成功地并入蛋白取决于氨酰tRNA合成酶对非天然氨基酸的识别，这通常需要高选择性，以确保蛋白翻译的保真度。在底物区分水平和非同源中间产物和蛋白产物的校正水平上保持氨酰化的保真度。

一种策略是，利用氨酰tRNA合成酶将非天然氨基酸并入蛋白，所述氨酰tRNA合成酶由于缺少校正机制而不能区分在结构上与非天然氨基酸的天然对应物相似的非天然氨基酸。因为氨酰tRNA合成酶已经丧失校正活性，已经被错误激活的天然氨基酸结构类似物可以逃脱合成酶的编辑功能并且按照所需地被并入延长的肽。参阅例如Doring et al，Science 292：501(2001)。

上述策略的主要局限在于，整个蛋白中对应于特定天然氨基酸的所有位点都被替换。天然氨基酸和非天然氨基酸的并入程度也可以改变，这是因为难以完全去除细胞内的同源天然氨基酸。另一局限在于，这些策略使得难以研究活细胞内的突变蛋白，这是因为类似物的多位点并入通常导致毒性。最后，该方法通常仅适用于常见氨基酸的结构相近类似物，这还是因为基因组的所有位点必须能接受取代。

最近，已经将正交tRNA(orthogonal tRNA)和向正交tRNA装载期望的非天然氨基酸的相应正交氨酰tRNA合成酶用作克服前述局限的策略。正交tRNA是与通常与氨基酸无关的密码子(例如终止密码子或4碱基对密码子等)进行碱基配对的tRNA。重要的是，正交组分不与宿主生物内任何内源tRNA、氨酰tRNA合成酶、氨基酸或密码子发生交叉反应。

用于并入非天然氨基酸的常用正交体系(orthogonal system)是琥珀抑制基因正交tRNA(amber suppressor orthogonal tRNA)。利用这种体系，制备出识别终止密码子UAG并被非天然氨基酸化学氨酰化的抑制型tRNA。常规定点诱变用于在蛋白基因的目的位点引入终止密码子TAG。当将氨酰化的抑制型tRNA和突变基因在体外转录/翻译体系中组合时，非天然氨基酸响应于UAG密码子而被并入，使得蛋白在指定位置含有非天然氨基酸。参阅例如Sayers et al.，Nucleic Acids Res.16：791-802(1988)。有证据表明，在蛋白中，所需非天然氨基酸在由UAG密码子决定的位置被并入，并且在任何其它位点不并入非天然氨基酸。参阅例如Noren et al.，Science 244：182-88(1989)；Ellman et al.，Science 255：197-200(1992)。有关并入非天然氨基酸的正交翻译体系和其制备方法及用途的其它讨论，还可参阅Wang and Schultz，Chem.Commun.1：1-11(2002)；Xie and Schultz，Methods 36：227-38(2005)；Xie and Schultz，Curr.Opinion in ChemicalBiology 9：548-554(2005)；Wang et al.，Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.35：225-49(2006)；以及Xie and Schultz，Nat.Rev.MoI.Cell Biol.7：775-82(2006)。

然而，利用正交组分并入非天然氨基酸的产率非常低，因为其依赖于与终止因子竞争的效率固有性低下的抑制型tRNA。此外，由于在氨基酸有义密码子处来自20种不同氨酰tRNA合成酶的tRNA装载和校正活性所催化的天然氨基酸的竞争，以及由于利用第二终止密码子(UGA)的努力因核糖体的通读往往失败，所以利用正交组分并入非天然氨基酸局限于在每一蛋白中3个无义终止密码子中的一个(UAG琥珀终止密码子)处选择性并入仅单一非天然氨基酸。参阅例如Cload et al.，Chem.and Biol.3：1033-38(1996)。

尽管为利用识别有义密码子的tRNA将非天然氨基酸并入蛋白已经进行了一些尝试，但是这些尝试是利用纯重建的体外翻译体系而进行的。参阅Tan et al.，Methods 36：279-90(2005)；Forster et al.，美国专利第6,977,150号。然而，这些纯重建的翻译体系需要纯化的翻译组分，除了研究目的之外，其可行性差、费用昂贵且未经证实是高效的。

本领域存在将非天然氨基酸并入延长的多肽链中的需要，其中能够避免正交tRNA/氨酰tRNA合成酶对，用非天然氨基酸氨酰化的天然同功tRNA识别有义密码子并随后在有义密码子限定的位置将非天然氨基酸并入延长的多肽链中，能在限定的位置并入许多非天然氨基酸，并且能够使用天然无细胞蛋白合成体系，这样能够避免纯重建的体外翻译体系的可行性差、费用昂贵以及效率低下。本文所述的发明满足了这些需要以及其它需要，这在阅读下述公开内容后会变得更加清楚。

发明概述

本发明公开了利用无细胞合成体系将非天然氨基酸引入蛋白的预选位置的方法，包括以下步骤：1)获得包含简并有义密码子的核酸模板，2)裂解细胞群以产生天然氨酰tRNA合成酶去除的细胞裂解物，3)向裂解物添加外源氨酰tRNA合成酶，该氨酰tRNA合成酶选择性地氨酰化第一同功有义tRNA，4)在单独的tRNA装载反应中，氨酰化第二同功有义tRNA，所述第二同功有义tRNA装载有非天然氨基酸，5)向细胞裂解物添加装载有各自的非天然氨基酸的第二同功有义tRNA和核酸模板，并允许进行反应，以产生在对应于模板的第二有义密码子的位置处携带非天然氨基酸的蛋白。

更具体而言，本发明是利用无细胞合成体系将非天然氨基酸引入蛋白的预选位置的体外方法，所述方法包括以下步骤：

a)获得包含简并有义密码子的核酸模板，其中第一有义密码子和第二有义密码子对应于相同的天然氨基酸，但是它们各自的核苷酸序列不同；

b)裂解细胞群以产生细胞裂解物，其中所述裂解物中的能氨酰化所述天然氨基酸的天然氨酰tRNA合成酶已去除；

c)向裂解物添加第一外源氨酰tRNA合成酶，所述氨酰tRNA合成酶选择性地氨酰化对应于核酸模板的第一有义密码子的第一同功有义tRNA；

d)向含有装载反应混合物的反应容器添加氨酰化催化试剂，所述装载反应混合物包括非天然氨基酸和对应于核酸模板的第二有义密码子的第二同功有义tRNA；

e)用非天然氨基酸将第二同功有义tRNA氨酰化，以产生tRNA：非天然氨基酸装载部分；

f)在适合从模板产生蛋白的条件下，使步骤2的细胞裂解物与以下混合：

1)tRNA：非天然氨基酸装载部分，和

2)包含第一和第二有义密码子的核酸模板；以及

g)允许进行反应，从而产生在对应于核酸模板的第二有义密码子的那些位置处携带非天然氨基酸的蛋白。

上文所述的方法任选地进行，其中通过在裂解前改变细胞群来改变天然氨酰tRNA合成酶，其中所述改变将编码天然氨酰tRNA合成酶的基因替换为编码与捕获部分融合的天然氨酰tRNA合成酶的基因。该方法能够用添加捕获部分标签的天然氨酰tRNA合成酶进行，其中所述合成酶对于形成细胞裂解物的细胞而言是异源的。能够通过亲和色谱、免疫亲和色谱或免疫沉淀去除添加标签的天然氨酰tRNA合成酶。任选地，能够通过免疫沉淀而无需用捕获部分添加标签来去除天然氨酰tRNA合成酶。氨酰化第二同功有义tRNA分子的tRNA装载反应能够利用氨酰tRNA合成酶或核酶作为氨酰化催化试剂。可以合成第一外源氨酰tRNA合成酶并将其添加于裂解混合物中，或者在裂解前用编码第一外源氨酰tRNA合成酶的基因转化细胞，将得到物作为第一外源氨酰tRNA合成酶添加。

在相关方法中，本发明通过以下方式实施：

a)通过改变用于产生细胞裂解物的细胞来抑制天然氨酰tRNA合成酶的表达，从而去除细胞裂解物的天然氨酰tRNA合成酶；

b)用第一和第二基因转化所述细胞，其中所述第一基因表达第一外源氨酰tRNA合成酶，且所述第二基因表达第二外源氨酰tRNA合成酶，所述第二外源氨酰tRNA合成酶选择性地氨酰化第二同功有义tRNA；以及

c)去除细胞裂解物中的第二外源氨酰tRNA合成酶。

上文所述方法优选利用来自嗜酸氧化亚铁硫杆菌(A.ferrooxidans)的第一和第二氨酰tRNA合成酶。可以这样实施上文所述的方法，通过使所述天然氨酰tRNA合成酶基因突变而去除天然氨酰tRNA合成酶。任选地如下进行第二外源氨酰tRNA合成酶，通过使所述合成酶与捕获部分融合并通过亲和色谱、免疫亲和色谱或免疫沉淀去除所述合成酶。可以通过利用识别第二外源氨酰tRNA合成酶的抗体的免疫沉淀来去除第二外源氨酰tRNA合成酶。

能够利用来自细菌、优选来自大肠杆菌的细胞裂解物实施所述方法。细胞群可以由兔网状细胞组成。另外，所述方法可以发生于去除精氨酸脱羧酶的细胞中。

本发明还提供了用于体外蛋白合成的无细胞合成裂解物，其包含外源氨酰tRNA合成酶，所述外源氨酰tRNA合成酶仅选择性地氨酰化对应于氨基酸的单个同功有义tRNA，且去除了对应于所述氨基酸的天然氨酰tRNA合成酶。该裂解物可以来自细菌细胞，优选来自大肠杆菌。上文所述的裂解物可以来自兔网状细胞。上文所述的裂解物可以任选地不含精氨酸脱羧酶、具有功能性氧化磷酸化体系、含有防沫剂或含有核酸模板，所述核酸模板编码蛋白并包含氨基酸的简并有义密码子。

本发明还公开了利用无细胞合成体系将非天然氨基酸引入蛋白的预选位置的方法，包括以下步骤：1)获得包含简并有义密码子的核酸模板，2)裂解细胞群，以产生细胞裂解物，3)使识别第二有义密码子的同功tRNA失活，4)在单独的tRNA装载反应中，氨酰化第二同功有义tRNA，所述第二同功有义tRNA装载有非天然氨基酸，5)向细胞裂解物添加装载有各自的非天然氨基酸的第二同功有义tRNA和核酸模板，并允许反应进行，以产生在对应于模板的第二有义密码子的位置处携带非天然氨基酸的蛋白。

更具体而言，本发明还公开了：

a)获得包含简并有义密码子的核酸模板，其中第一有义密码子和第二有义密码子对应于相同的天然氨基酸但是它们各自的核苷酸序列不同；

b)产生含有天然氨酰tRNA合成酶的细胞裂解物，所述合成酶能氨酰化第一同功有义tRNA和第二同功有义tRNA，所述第一同功有义tRNA对应于核酸模板的第一有义密码子，所述第二同功有义tRNA对应于核酸模板的第二有义密码子；

c)使对应于核酸模板的第二有义密码子的天然第二同功有义tRNA失活；

d)向含有装载反应混合物的反应容器添加氨酰化催化试剂，所述装载反应混合物包括非天然氨基酸和对应于核酸模板的第二有义密码子的第二同功有义tRNA；

e)用非天然氨基酸将第二同功有义tRNA氨酰化，以产生tRNA：非天然氨基酸装载部分；

f)在适于从模板产生蛋白的条件下，使细胞裂解物与以下混合：

1)tRNA：非天然氨基酸装载部分，和

2)包含第一和第二有义密码子的核酸模板；以及

g)允许反应进行，从而产生在对应于核酸模板的第二有义密码子的那些位置处携带非天然氨基酸的多肽。

在使第二同功tRNA失活的一个实施方案中，通过添加与天然第二同功有义tRNA选择性地结合的反义DNA实施所述失活。在一些实施方案中，通过添加选择性地切割天然第二同功有义tRNA的特异性tRNA核糖核酸酶或其活性片段来使第二同功有义tRNA失活。在一些实施方案中，通过添加大肠杆菌素D或大肠杆菌素D的活性片段来使第二同功有义tRNA失活。

本发明还提供了已装载的tRNA的溶液，所述溶液包含细菌细胞裂解物，所述细菌细胞裂解物具有携带预选氨基酸的、识别有义密码子的已装载的tRNA，并且不具有显著的对于携带预选氨基酸的已装载的tRNA的合成酶活性，且已装载的tRNA的溶液不含特异性或非特异性合成酶抑制剂。

附图简要说明

图1显示了(a)用于体外转录的HDV核酶质粒DNA模板，(b)描述了T7启动子、与肝炎δ病毒(HDV)核酶序列融合的编码序列的方向的DNA模板的片段，以及(c)所得的大肠杆菌同功转录物二级结构，反密码子序列GAA为红色，其中下标表示相应的反密码子序列。

图2是显示了产生新的nnAA-tRNA所需步骤的流程图，包括(a)tRNA-HDV核酶DNA模板的体外转录(b)通过尺寸排阻色谱分离tRNA2，3′-环磷酸，(c)利用T4多核苷酸激酶(PNK)使tRNA 2，3′-环磷酸发生酶学水解，以及(d)由工程化的氨基酸tRNA合成酶(aaRS)催化的、用nnAA将工程化的同功tRNA氨酰化。

图3显示了用于优化两个不同的工程化大肠杆菌构建体的体外转录的流程1-4的TBE/UREA凝胶。两个构建体都在U34C发生突变，以产生CUC反密码子；最右边的构建体含有在理论上应当增加转录产量的其它注明的突变。

图4显示了分别来自大肠杆菌和幽门螺杆菌(H.pylori)的两个不同的工程化构建体的体外转录流程1-4的TBE/UREA凝胶。

图5显示了(a)用于产生3’同种tRNA的肝炎δ病毒(HDV)共有序列的图示。自动催化的核酶在tRNA的3′末端进行切割，从而留下2′，3′-环磷酸，2′，3′-环磷酸随后在氨酰化前被除去。(b)转录产物的尺寸排阻色谱分离，其说明73个核苷酸的tRNA 2′，3′-环磷酸产物与自我切割的HDV核酶的分离。

图6显示了各种添加剂对RNA稳定性的影响。

图7显示了通过PNK处理的tRNA 2′-3′环磷酸脱磷酸化的时间依赖性，通过以下方式测量：(a)利用酸/尿素凝胶电泳分离反应物和产物或(b)利用孔雀绿磷酸盐释放测定。

图8显示了以下的IMAC纯化图：(a)大肠杆菌GluRS 6×His和(b)用于用非天然氨基酸(nnAA)装载tRNA的幽门螺杆菌GluRS2(ND)酶。

图9显示了(a)同源嗜热栖热菌(T.thermophilus)PheRS的二聚体结构，其说明含有A294G的氨基酸识别位点和反密码子识别位点，(b)无细胞产生的PheRS(A294G)的IMAC纯化图，其显示了由添加6×His标签的PheS(A294G)结构域将二聚体复合物拉下(pull-down)。

图10显示了无细胞蛋白合成所产生的几种PheRS(A2 94G，A794X)变体的纯化。

图11显示了由PheRS(A294G)催化30分钟的[^30-32P]Phe-tRNA^Phe的Phe氨酰化百分比分析。(b) 或的(a)P1核酸酶消化产生[³²P]Phe-AMP，可在PEI纤维素TLC平板上从游离的[³²P]AMP分离[³²P]Phe-AMP并利用放射自显影将其成像。

图12显示了在各种条件下由PheRS(A294G)催化的pAF-tRNA^phe变体的对乙酰基Phe(pAF)氨酰化百分比分析，通过利用末端标记的[³²P]-3′tRNA的放射自显影进行测定。

图13显示了通过放射自显影测定的(a)和(b)形成的时间依赖性。

图14显示了(a)大肠杆菌GluRS可以用同源谷氨酸将高度氨酰化，利用[³²P]-3′tRNA末端标记测定、在优化的条件下进行测定。在这些色谱条件下，单荧光谷氨酸(F-Glu)AMP不与[³²P]-AMP分离。(b)幽门螺杆菌GluRS2(ND)能够用Glu和F-Glu氨酰化幽门螺杆菌但是在这些色谱条件下F-Glu AMP不与AMP分离。

图15显示了(a)利用疏水相互作用色谱，从分离氨酰化的以及(b)通过酸尿素凝胶电泳，氨酰化的 以及2′，3′环磷酸的色谱迁移。

图16显示了利用疏水相互作用色谱，(a)从分离氨酰化的和(b)从分离

图17显示了(a)野生型大肠杆菌tRNA^Glu和(b)体外转录的大肠杆菌能够有效装载单荧光谷氨酸，通过酸/尿素凝胶电泳测定。

图18显示了GMCSF的无细胞合成产率，将其表示为添加到提取物的赖氨酸、苯丙氨酸或谷氨酸的浓度的函数。

图19显示了(a)在无细胞合成反应中，参与非天然氨基酸并入荧光turboGFP的种类的图表，包括内源大肠杆菌PheRS将工程化同功tRNA的背景再装载，(b)PheRS的活性位点定向抑制剂的化学结构，即5′-O-[N-苯丙氨酰)氨磺酰]腺苷，Phe-SA，以及(c)测定turboGFP无细胞合成速率的抑制IC₅₀，将其表示为添加的抑制剂Phe-SA(IC₅₀＝0.8nM)或Glu-SA(IC₅₀＝54nM)的函数。

图20显示了描述所述添加的Phe氨基酸和[Phe-SA]抑制剂在turboGFP无细胞合成速率之间的关系的响应面(response surface)。

图21显示了说明单装载并入的示意图。

图22说明了用于在位置50建立对乙酰基苯丙氨酸(pAF)并入的turboGFP Y50TAG琥珀抑制基因蛋白的主要特征。

图23显示了在存在不同浓度的Phe-SA抑制剂的情况下，turboGFPY50TAG无细胞合成的时程，turboGFP Y50TAG作为位于GFP发色团上游的琥珀(UAG)密码子受到抑制的荧光报告基因。在0的时间点，向反应添加约20μM未装载的或约70％已装载的(·)turboGFPY50对照。

图24显示了(a)的结构，(b)在存在的情况下进行的无细胞反应的SDS PAGE分析，以及(c)荧光蛋白合成反应产物的反相HPLC纯化。

图25显示了在用于并入pAF的蛋白无细胞翻译中，氨基酸、tRNA合成酶以及同功tRNA之间的各种同源(粗黑线)、非同源(细灰线)或弱非同源(粗灰线)相互作用。如图23所示，向含有turboGFPY50TAG模板的无细胞合成反应中添加后，观察到蛋白合成的速率缓慢，这反映出或与PheRS和Phe的弱非同源相互作用。

图26显示了修饰的密码子交换的GM-CSF基因用于在TTT Phe 120位置处并入pAF。

图27显示了将对乙酰基Phe并入GM-CSF的反相HPLC分析的结果。

图28是显示本文所述的无细胞蛋白合成体系的示意图。在本实例中，在细胞裂解前去除天然氨酰tRNA合成酶，并用两种外源氨酰tRNA合成酶替换，每种外源氨酰tRNA合成酶识别不同的同功有义tRNA分子。天然aaRS是指天然氨酰tRNA合成酶。外源aaRS₁和aaRS₂是指外源氨酰tRNA合成酶。tRNA₂是指被第二外源氨酰tRNA合成酶特异性装载的第二同功有义tRNA。NAA表示天然氨基酸，而nnAA表示非天然氨基酸。

图29是显示本文所述的无细胞蛋白合成体系的示意图。在本实例中，在细胞裂解后，去除天然氨酰tRNA合成酶，且在宿主细胞群中表达第二外源氨酰tRNA合成酶。所用的缩写与图27中的相同。

发明的详细描述

I.引言

本发明提供了利用无细胞合成体系将非天然氨基酸并入蛋白的预选位置的新方法。所述方法涉及使用遗传密码所编码的非正交天然同功有义tRNA。这类方法允许通过利用有义密码子将多个非天然氨基酸并入，而无需依赖正交氨酰tRNA合成酶。

对本发明而言重要的是，利用同功有义tRNA差异性地将天然或非天然氨基酸并入蛋白，即使这类tRNA在自然情况下通常装载相同的氨基酸。本发明利用遗传密码的简并性基于mRNA有义密码子序列将非天然氨基酸并入延长的多肽链，而无需破坏将天然氨基酸并入蛋白的能力。在细胞裂解后，产生含有蛋白合成所需的所有细胞组分的裂解物。随后添加具有有义密码子的核酸模板，所述有义密码子决定并入非天然氨基酸的位置。因为天然氨酰tRNA合成酶通常具有装载两种同功有义tRNA的能力，因此，在一些实施方案中，在蛋白合成反应前，去除裂解物中的目的天然氨酰tRNA合成酶，以防止未装载的同功有义tRNA分子装载不期望的氨基酸。待用天然氨基酸装载的第一同功有义tRNA在裂解物中直接进行装载。在去除天然氨酰tRNA合成酶的那些实施方案中，需要向裂解物添加仅选择性装载第一同功有义tRNA的第一外源氨酰tRNA合成酶。第一外源氨酰tRNA合成酶可以在细胞裂解前在宿主细胞群中表达，或在细胞裂解后直接添加于裂解物中。在其它实施方案中，未去除天然氨酰tRNA合成酶。而是使第二同功tRNA失活，并留下天然氨酰tRNA合成酶装载第一同功tRNA。

在单独的tRNA装载反应中，第二同功tRNA被装载非天然氨基酸而被氨酰化。本发明的这一方面称为“单装载”，因为这是在与蛋白合成反应分开的反应中，仅将非天然氨基酸装载于一种同功有义tRNA。能氨酰化tRNA分子的任何方法都是可以的，无论是否将氨酰tRNA合成酶用于单独的装载反应。例如，纯化的核酶或任何功能性氨酰tRNA合成酶可以用于单独地装载第二同功有义tRNA分子。随后，从装载反应混合物中纯化装载有非天然氨基酸的第二同功有义tRNA，包括从能用于反应容器中的任何氨酰tRNA合成酶进行分离。随后将纯化的、用非天然氨基酸氨酰化的同功有义tRNA添加于裂解物，在裂解物中会发生蛋白合成反应，以产生在由同功有义tRNA所识别的不同序列决定的位置处含有天然和非天然氨基酸的所需蛋白。

含有非天然氨基酸的蛋白的用途包括在蛋白结构和/或功能中的期望的改变，包括改变大小、酸度、亲核性、氢键结合、疏水性或蛋白酶靶位点的可及性。包含非天然氨基酸的蛋白能够具有增强的或甚至完全新的催化性质或物理性质，例如改变的毒性、生物分布、结构性质、光谱性质、化学和/或光化学性质、催化能力、血清半衰期以及与其它分子共价反应或非共价反应的能力。包含至少一非天然氨基酸的蛋白可以用于新的疗法、诊断学、催化酶、结合蛋白以及蛋白结构和功能研究，但不限于此。

本发明的无细胞非天然氨基酸并入方法不同于本领域之前所用的非天然氨基酸并入方法。最明显的是，本发明使用识别有义密码子的同功tRNA，这避免了为了并入非天然氨基酸而必须使用正交tRNA和正交氨酰tRNA合成酶。使用正交tRNA依赖于固有性效率低下的抑制型tRNA。除了与终止因子竞争的固有性效率低下的抑制型tRNA外，这种效率低下是由于来自由20种不同氨酰基tRNA合成酶的tRNA装载和校正活性所催化的天然氨基酸在非正交有义密码子处的竞争。这导致在每一蛋白中3个终止密码子中的仅一个密码子处(即UAG“琥珀”密码子)选择性并入仅单一非天然氨基酸。另外，利用琥珀终止密码子并入非天然氨基酸的正交蛋白合成体系通常由于核糖体的通读而不能在第二终止密码子处终止。参阅例如Cloud et al.，Chem.and Biol.3：1033-38(1996)。尽管已经试图利用有义密码子识别来并入非天然氨基酸(参阅例如，Tan et al.，Methods 36：279-90(2005)；Forster et al.，美国专利第6,977,150号)，但是这类纯重建的翻译体系需要纯化的翻译组分，除了研究目的之外，其可行性差、费用昂贵且未经证实是高效的。

通过以下方式实施蛋白合成反应：如上文所述，获得编码期望的蛋白的核酸，获得裂解物，所述裂解物缺少天然氨酰tRNA合成酶但含有能装载同功有义tRNA并允许该同功有义tRNA直接在裂解物中装载天然氨基酸的氨酰tRNA合成酶，获得在单独的tRNA装载反应中已经装载有非天然氨基酸的另一同功有义tRNA，以及使核酸和装载有非天然氨基酸的同功有义tRNA与细胞裂解物混合，以形成蛋白合成反应混合物。

修饰的蛋白也可以称为期望的蛋白、选择的蛋白或靶蛋白。本文所用的修饰的蛋白通常指具有多于约5个氨基酸的任何肽或蛋白。修饰的蛋白在预定位点包含至少一个非天然氨基酸，且可以含有多个非天然氨基酸。如果在多肽的两个或更多个位点处存在非天然氨基酸，则非天然氨基酸可以是相同的或不同的。如果非天然氨基酸不同，则每个非天然氨基酸的tRNA密码子也是不同的。

对于无细胞裂解物所来源于的细胞而言，修饰的蛋白可以是同源的，或可以是外源的，外源的表示它们异源的(即外来的)，例如在细菌无细胞提取物中产生的人蛋白、病毒蛋白、酵母蛋白等。修饰的蛋白可以包括但不限于，诸如肾素、生长激素的分子，包括人生长激素；牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A链；胰岛素B链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；黄体生成素；胰高血糖素；凝血因子，例如因子VIIIC、因子IX、组织因子以及血管性血友病因子(von Willebrands factor)；抗凝血因子，例如蛋白C；心房利钠因子；肺表面活性物质；纤溶酶原激活物，例如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活物(t-PA)；铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子α和β；脑啡肽酶；RANTES(受激活调节正常T细胞表达和分泌因子)；人巨噬细胞炎症蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白，如人血清白蛋白；苗勒抑制物(mullerian-inhibiting substance)；松弛素A链；松弛素B链；松弛素原；小鼠促性腺素关联肽；微生物蛋白，如β-内酰胺酶；DNA酶；抑制素；活化素；血管内皮生长因子(VEGF)；激素或生长因子受体；整联蛋白；蛋白A或D；类风湿因子；神经营养因子，如骨来源神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)或神经生长因子，如NGF-(3；血小板来源生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子，如aFGF和bFGF；表皮生长因子(EOF)；转化生长因子(TGF)，如TGF-α和TGF-β，包括TGF-(31、TGF-(32，TGF-(33，TGF-(34，或TGF-(35；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)、胰岛素样生长因子结合蛋白；CD蛋白，如CD-3、CD-4、CD-8以及CD-I 9；红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素，如干扰素-α、-β以及-γ；集落刺激因子(CSF)，如M-CSF、GM-CSF以及G-CSF；白细胞介素(IL)，如IL-1至IL-10；过氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原，如AIDS包膜的一部分；转运蛋白；归巢受体；地址素(addressin)；调节蛋白；抗体；以及任何上文所列多肽的片段。

II.定义

“氨酰化(aminoacylation)”或“氨酰化(aminoacylate)”指用正确的氨基酸“装载”tRNA的全过程，其结果是将氨酰基添加于化合物。正如本发明所涉及的，经历氨酰化或已经被氨酰化的tRNA是已经装载有氨基酸的tRNA，经历氨酰化或已经被氨酰化的氨基酸是已经被装载到tRNA分子的氨基酸。

“氨酰tRNA合成酶”或“tRNA合成酶”或“合成酶”或“aaRS”或“RS”指催化氨基酸和tRNA分子间共价连接的酶。这产生“已装载的”或“氨酰化的”tRNA分子，该tRNA分子是具有通过酯键而连接的各自氨基酸的tRNA分子。

“结合部分”指基因工程于蛋白上的标签。此类标签可以包括但不限于His标签、GFP标签、GST标签、FLAG标签等。

“捕获部分”指作为负责从反应混合物中除去不想要的氨酰tRNA合成酶分子联合的一部分的任何底物或配体。这类配体或底物部分可以包括但不限于抗体、亲和载体、基质、树脂、柱、包被的珠。

“氨酰化催化试剂”指能装载tRNA分子的酶或分子。此类氨酰化试剂可以指但不限于氨酰tRNA合成酶或核酶柱。

“无细胞合成体系”指在包含生物提取物和/或限定试剂的反应混合物中多肽的体外合成。反应混合物包含用于产生大分子的模板，如DNA、mRNA等；待合成的大分子的单体，如氨基酸、核苷酸等；以及辅因子、酶和合成所需的其它试剂，如核糖体、未装载的tRNA、装载有非天然氨基酸的tRNA、聚合酶、转录因子等。

“已装载的tRNA”或“氨酰化的tRNA”指在具有结合在氨基酸连接位点的氨基酸的tRNA分子。在蛋白合成过程中，氨基酸被转移到延长的肽链，释放tRNA，其称为“释放的tRNA”。

“装载反应混合物”指体外反应混合物，其中同功有义tRNA被装载其各自的氨基酸。该混合物含有具有待装载的具体密码子序列的同功tRNA。用天然、非天然和/或任意氨基酸装载天然、非天然和/或任意tRNA的方法是本领域内已知的，并且包括但不限于化学氨酰化、生物氨酰化、用修饰的氨酰tRNA合成酶进行酰化、基于核酶的方法和蛋白核酸介导的方法。

“简并密码子”指遗传密码的简并性，使得一个氨基酸可以被多个密码子编码。密码子是决定该氨基酸的三核苷酸序列。简并性是由于存在64个可能的密码子但所有蛋白仅由20种氨基酸组成。

“DNA”是指两个或更多个共价结合的、天然存在或修饰的脱氧核苷核苷酸的序列。

“外源氨酰tRNA合成酶”指不是由产生细胞裂解物的细胞内源产生的任何氨酰tRNA合成酶。正如本发明所涉及的，可以在宿主细胞内表达外源氨酰tRNA合成酶。如果在宿主细胞内表达外源合成酶，则外源合成酶可以与内源氨酰tRNA合成酶协同发挥功能，或者如果通过本文所述的任何方法使得内源氨酰tRNA合成酶失去功能，则外源合成酶可以在功能上替代内源氨酰tRNA合成酶。另外，可以表达并纯化内源氨酰tRNA合成酶，并将其随后添加于tRNA装载反应或无细胞蛋白合成反应中。可以从蛋白合成提取物所来源于的宿主细胞或能表达此类合成酶的任何其它细胞中纯化外源氨酰tRNA合成酶。外源氨酰tRNA合成酶可以是重组天然氨酰tRNA合成酶或重组非天然氨酰tRNA合成酶。

“基因”指具有特定染色体位置的由DNA序列组成的遗传单位。表达基因以产生蛋白产物。

本发明涉及的“异源的”指这样的氨酰tRNA合成酶，其来源于与表达它的宿主细胞不同的种类。

“同功有义tRNA”是指与相同氨基酸的可选密码子结合的不同tRNA种类。

“裂解物”是包含蛋白合成机制所需组分的任何细胞来源制备品，其中所述细胞组分能表达编码期望的蛋白的核酸，其中大多数生物组分存在的浓度是由细胞裂解产生的而不是已进行重建。可以进一步改变裂解物，以使裂解物补充其它细胞组分，例如氨基酸、核酸、酶等。还可以改变裂解物，以便在裂解后除去其它细胞组分。

“天然氨基酸”指由遗传密码编码的一种或多种天然存在的氨基酸。“内源天然氨基酸”指由用于产生裂解物的宿主细胞产生的天然氨基酸。

“天然氨酰tRNA合成酶”指在自然界中存在的宿主细胞氨酰tRNA合成酶。可以合成天然氨酰tRNA合成酶，并如本文所述将其外源地添加于裂解物或tRNA反应容器中。天然氨酰tRNA合成酶包括但不限于来自植物、微生物、原核生物、真核生物、原生动物、细菌、哺乳动物、酵母、大肠杆菌或人中的一种或多种的天然氨酰tRNA合成酶。

“天然同功有义tRNA”指用于产生无细胞蛋白合成反应所用的裂解物的宿主细胞群所产生的第一或第二同功有义tRNA。

“非天然氨基酸”或“nnAA”指这样的氨基酸，其不是所有蛋白组建体的20种天然存在的氨基酸中的一种，尽管如此，可以将它们生物工程化，从而并入蛋白中。非天然氨基酸可以包括20种天然存在的氨基酸之一的D-肽对映异构体或任何翻译后修饰物。多种非天然氨基酸可以用于本发明的方法中。可以基于对非天然氨基酸所期望的特性来选择非天然氨基酸，例如非天然氨基酸的功能，诸如修饰蛋白生物性质，如毒性、生物分布或半衰期、结构性质、光谱性质、化学和/或光化学性质、催化性质、与其它分子(共价或非共价)反应的能力等。能够用于本发明方法中的非天然氨基酸包括但不限于酪氨酸的非天然类似物；谷氨酰胺的非天然类似物；苯丙氨酸的非天然类似物；丝氨酸的非天然类似物；苏氨酸的非天然类似物；烷基、芳基、酰基、叠氮基、氰基、卤、肼、酰肼、羟基、烯基、炔基、醚、硫醇、磺酰基、硒、酯、硫代酸、硼酸、硼酸盐、磷、膦酰、磷化氢、杂环、烯酮、亚胺、醛、羟胺、酮或氨基取代的氨基酸，或以上的任何组合；具有光活化交联剂的氨基酸；自旋标记的氨基酸；荧光氨基酸；具有新官能团的氨基酸；与另一分子共价或非共价相互作用的氨基酸；金属结合氨基酸；含有金属的氨基酸；放射性氨基酸；光笼(photocaged)和/或光敏异构化氨基酸；含有生物素或生物素类似物的氨基酸；糖基化或碳水化合物修饰的氨基酸；含酮的氨基酸；包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸；重原子取代的氨基酸；可化学切割或可光切割的氨基酸；具有延长的侧链的氨基酸；含有毒性基团的氨基酸；糖取代的氨基酸，如糖取代的丝氨酸等；碳连接的含糖氨基酸，如糖取代的丝氨酸等；碳连接的含糖氨基酸；氧化还原活性氨基酸；含α-羟基的氨基酸；含有氨基硫代酸的氨基酸；α，α双取代的氨基酸；β-氨基酸；除脯氨酸以外的环状氨基酸；等等。

“多肽”或“肽”或“蛋白”指通过一个或多个肽键连接的两个或更多个天然存在的氨基酸。

“反应容器”指tRNA装载反应发生的容器。

“核酶”指能催化化学反应的RNA分子。本发明所涉及的核酶具有氨酰化活性，以致其能不依靠氨酰tRNA合成酶而装载tRNA分子。

“RNA”指两个或多个共价键合的、天然存在的或修饰的核糖核苷酸的序列。

“有义密码子”指蛋白编码序列中决定氨基酸的一组三个核苷酸。本文所用的有义密码子不包括终止信号或终止密码子。

“tRNA”或“转运RNA”指在翻译过程中，将特定氨基酸在蛋白合成的核糖体位点转运至延长的多肽的小RNA分子。tRNA含有与相应mRNA密码子配对的三个碱基密码子。由于遗传密码具有简并性，一个氨基酸能够与多个tRNA结合，而每一种tRNA分子仅能够与一种氨基酸结合。

“tRNA装载反应”指单独于蛋白合成反应之外的、合成的天然tRNA装载各自氨基酸的反应，无论所述氨基酸是天然的或非天然的。

“tRNA：非天然氨基酸装载部分”通常指这样的tRNA分子：其对于同功第一tRNA分子是同功tRNA分子，但是其已装载了代替天然氨基酸的非天然氨基酸。

“转化”细胞或细胞群指改变裂解物所来源于的宿主细胞的基因表达。本文所用的转化细胞指改变细胞以致引入表达重组蛋白的外源核酸序列的过程。

III.模板

为了产生本发明的蛋白，需要核酸模板。无细胞蛋白合成的模板可以是mRNA或DNA。模板能够编码任何具体的目的基因，并且可以编码全长多肽或其任何长度的片段。充当测序模板的核酸任选地来源于天然来源，或它们可以是合成的或重组的。例如，DNA可以是重组DNA，如质粒、病毒等。本发明的实质是利用有义密码子来并入非天然氨基酸，并避免本领域通常存在的对于正交组分的需要。因此，本发明优选的实施方案使用能翻译完整的功能性蛋白的模板，不管是否选择并入非天然氨基酸。

将包含目的基因的DNA模板可操作地连接于至少一个启动子和一个或多个其它调节序列，所述调节序列包括但不限于阻抑物、激活物、转录和翻译增强子、DNA结合蛋白等。通过在公知的克隆载体和宿主中扩增DNA或通过聚合酶链式反应(PCR)能够产生本文所用的合适量的DNA模板。

优选的实施方案使用细菌裂解物。通过将期望的编码蛋白的DNA可操作地连接于启动子序列和细菌核糖体结合位点(Shine-Delgarno序列)，能够构建用于细菌表达的DNA模板。适于与DNA模板一起用于本发明的无细胞转录翻译方法的启动子包括能启动细菌提取物所来源于的细菌中的体内转录的任何DNA序列。优选的启动子是能在宿主细胞中有效启动转录的启动子。能够通过本领域已知的多种方法制备编码期望的蛋白的DNA和含有期望的启动子和Shine-Dalgarno(SD)序列的DNA。可选地，能够从现有的克隆获得期望的DNA序列，或如果没有现有的克隆，则能够通过筛选DNA文库并从文库克隆构建期望的DNA序列来获得期望的DNA序列。

能够方便地由用载体转化的重组宿主细胞产生编码目的蛋白的RNA模板，所述载体经构建而表达mRNA，所述mRNA具有与期望的基因的编码序列可操作地连接的细菌核糖体结合位点(SD序列)，使得反应混合物中的核糖体能结合并翻译该mRNA。因此，载体携带能在用于RNA模板合成的特定宿主细胞中启动DNA转录的任何启动子。

因为难以从细菌中提取未降解的RNA，因此优选高等真核细胞培养物用于产生RNA模板。原则上，任何高等真核细胞培养物都是可用的，包括脊椎动物细胞培养物和无脊椎动物细胞培养物。能够方便地在从宿主细胞培养物提取的总细胞RNA组分中分离RNA模板。通过本领域已知的任何方法能够从宿主细胞培养物分离总细胞RNA。如果RNA模板被设计为在其3′末端含有真核宿主细胞所识别的聚腺苷酸化信号，则可以连同大部分细胞mRNA一起分离期望的RNA模板。因此，宿主细胞会产生具有聚腺苷酸(聚(A))尾的RNA模板。利用本领域已知的任何方法，通过寡聚脱氧胸苷酸(oligo(dT))-纤维素柱上的亲和色谱，能够从大量细胞RNA分离聚腺苷酸化的mRNA。如果编码期望的蛋白的mRNA的大小是已知的，则能够通过RNA的琼脂糖凝胶电泳进一步纯化mRNA制备品中特定大小的mRNA分子。

用于产生重组核酸的合适分子学技术的实例和足以指导本领域技术人员进行相关实践的说明见于Berger and Kimmel，Guide to MolecularCloning Techniques(分子克隆技术指南)，Methods in Enzymology(酶学方法)(Volume 152 Academic Press，Inc.，San Diego，Calif.1987)；PCRProtocols：A Guide to Methods and Applications(PCR方案：方法和应用指南)(Academic Press，San Diego，Calif.1990)中。来自生物试剂和实验设备制造商的产品信息也提供了可用于已知的生物方法的信息。这类制造商包括SIGMA(Saint Louis，Mo.)、R&D systems(Minneapolis，Minn.)、Pharmacia LKB Biotechnology(Piscataway，N.J.)、Clontech Laboratories，Inc.(Palo Alto，Calif)、Aldrich Chemical Company(Milwaukee，Wis.)、Invitrogen(San Diego，Calif)、Applied Biosystems(Fosters City，Calif)，以及本领域技术人员已知的许多其它商业来源。

IV.产生裂解物

本发明将细胞裂解物用于靶蛋白的体外翻译。出于方便，用作裂解物来源的生物可以称为来源生物或宿主细胞。宿主细胞可以是细菌、酵母、哺乳动物或植物细胞，或能合成蛋白的任何其它类型细胞。裂解物包含能翻译编码期望的蛋白的信使核糖核酸(mRNA)的组分，并任选地包含能转录编码期望的蛋白的DNA的组分。例如，这些组分包括DNA定向的RNA聚合酶(RNA聚合酶)、启动编码期望的蛋白的DNA的转录所需的任何转录激活物、转运核糖核酸(tRNA)、氨酰tRNA合成酶、70S核糖体、N¹⁰-甲酰四氢叶酸、甲酰甲硫氨酸-tRNAf^Met合成酶、肽基转移酶、诸如IF-1、IF-2以及IF-3的起始因子、诸如EF-Tu、EF-Ts和EF-G的延伸因子、诸如RF-1、RF-2以及RF-3的释放因子等。

在一个实施方案中，制备裂解物，其中在裂解前，宿主细胞中不表达装载第一同功tRNA的第一外源氨酰tRNA合成酶。在另一实施方案中，制备裂解物，其中在裂解前，宿主细胞细胞中表达分别装载第一和第二同功tRNA的第一和第二外源氨酰tRNA合成酶。在本详细描述的下部分，将讨论在tRNA装载反应之前所需氨酰tRNA合成酶的保留或去除。

实施方案利用细菌细胞，裂解物来源于所述细菌细胞。来自任何细菌菌株的细菌裂解物可以用于本发明的方法中。能够按如下获得细菌裂解物。在多种生长培养基中和本领域公知的且易于被技术人员优化而用于具体细菌生长的生长条件下，使所选细菌生长过夜。例如，用于合成的天然环境利用来源于生长在含葡萄糖和磷酸盐的培养基中的细菌细胞的细胞裂解物，其中葡萄糖的浓度为至少约0.25％(重量/体积)、更通常为至少约1％，且通常不多于约4％，更通常不多于约2％。这类培养基的实例是2YTPG培养基，然而，本领域技术人员应当理解，许多培养基能够适合于该目的，因为存在许多公开的、利用限定和非限定的营养来源的、适合诸如大肠杆菌的细菌生长的培养基。能够通过以下方式裂解过夜收获的细胞：将细胞团悬浮于合适的细胞悬浮缓冲液中，通过超声处理破坏悬浮的细胞，用法压器(French press)、连续流动高压均浆或本领域已知的用于有效裂解细胞的任何其它方法来破碎悬浮的细胞。随后将细胞裂解物离心或过滤，以除去大DNA片段。

另一实施方案利用兔网状细胞，裂解物来源于所述兔网状细胞。在用苯肼注射兔后，制备网状细胞裂解物，苯肼能确保在每一批中产生可靠且一致的网状细胞。纯化网状细胞，以除去可能改变最终裂解物的翻译性质的污染细胞。随后能够通过以下方式裂解细胞：将细胞团悬浮于合适的细胞悬浮缓冲液中，通过超声处理破坏悬浮的细胞，用法压器或本领域已知的用于有效裂解细胞的任何其它方法来破碎悬浮的细胞。在将网状细胞裂解后，用微球菌核酸酶和CaCl₂处理裂解物，以破坏内源mRNA并因此减少背景翻译。然后添加EGTA以螯合CaCl₂，由此使核酸酶失活。也可以向网状细胞裂解物添加血晶素，因为血晶素是起始因子eIF2α的抑制剂的阻抑物。在缺少血晶素的情况下，网状细胞裂解物中的蛋白合成在短期孵育后停止(Jackson，R.and Hunt，T.1983 Meth.InEnzymol.96，50)。以推荐用于翻译大多数mRNA种类的水平添加乙酸钾和乙酸镁。有关制备兔网状细胞裂解物的进一步细节，本领域技术人员可以参考例如Sambrook，et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition(分子克隆：实验手册，第二版)(Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.1989)。

实施方案可以使用诸如小麦胚芽裂解物的植物裂解物。通常，通过以下方式制备小麦胚芽裂解物，在提取缓冲液中研磨小麦胚芽，随后离心以除去细胞碎片。然后通过色谱从上清液分离抑制翻译的外源氨基酸和植物色素。也用微球菌核酸酶处理裂解物，以破坏内源mRNA，将背景翻译将至最低。裂解物含有蛋白合成所需的细胞组分，如tRNA、rRNA以及起始因子、延伸因子和终止因子。通过添加由磷酸肌酸激酶和磷酸肌酸组成的能量产生体系进一步优化裂解物，并以推荐用于翻译大多数mRNA种类的浓度添加乙酸镁。有关制备小麦胚芽裂解物的更多细节，参阅例如Roberts，B.E.and Paterson，B.M.(1973)，Proc.Natl.Acad.ScLU.S.A.Vol.70，No.8，pp.2330-2334)，遵循Anderson，C.W.，et al.，Meth.Enzymol.(Vol.101，p.635；1983)所述的改良。

也可由制造商商购获得裂解物，如Promega Corp.，Madison，Wis.；Stratagene，La Jolla，Calif；Amersham，Arlington Heights，I11.；以及GIBCO，Grand Island，N.Y.。

在本发明的一些实施方案中，必须将第一外源氨酰tRNA合成酶添加于裂解物。该要求存在于这样的实施方案中：在裂解后去除天然氨酰tRNA合成酶，以及天然氨酰tRNA合成酶在宿主细胞中没有被各自识别特异性同功有义tRNA的两种氨酰tRNA合成酶替换。该要求还存在于这样的实施方案中：使第二同功tRNA失活。在这些实施方案中，被直接添加于裂解物的第一氨酰tRNA合成酶仅识别第一同功有义tRNA是极其重要的。这需要将第一同功tRNA特异性氨酰tRNA合成酶工程化。在裂解之前，也可以在宿主细胞中表达识别同功tRNA的工程化氨酰tRNA合成酶。

可以利用通常用于蛋白定向进化的多种方法将氨酰tRNA合成酶工程化，使其识别同功tRNA。用于产生能在裂解物中直接装载第一同功有义tRNA的新氨酰tRNA合成酶的各种诱变是本领域公知的。参阅例如Liu et al，Proc.Natl.Acad.Sci.94：10092-7(1997)。Liu et al.利用DNA改组(随机点突变以及体外同源重组)以及寡核苷酸定向诱变来产生突变的氨酰tRNA合成酶的文库。随后选择能选择性装载期望的tRNA的合成酶。这些以及其它氨酰tRNA合成酶工程化技术在本领域中是公知的。其它合适的工程化氨酰tRNA合成酶的方法在下文进一步讨论，其中描述了体外tRNA氨酰化。

V.天然氨酰tRNA合成酶的去除

本发明需要用天然或非天然氨基酸差异性地装载同功有义tRNA。因此，本发明的一些实施方案包括去除天然氨酰tRNA合成酶，以防止未装载的同功有义tRNA分子被可能在裂解物中与非天然氨基酸竞争第二有义密码子的错误的天然氨基酸装载。可以在裂解宿主细胞群之前，从细胞裂解物中去除天然氨酰tRNA合成酶，或在裂解宿主细胞群后直接从裂解物中去除天然氨酰tRNA合成酶。本发明的一些实施方案还提供了在裂解后从裂解物中去除第二外源氨酰tRNA合成酶的方法。

A.在裂解前去除天然氨酰tRNA合成酶

在于裂解前从细胞裂解物中去除天然氨酰tRNA合成酶的实施方案中，可以改变宿主细胞群，使得天然氨酰tRNA合成酶被替换为与称为捕获部分的标签融合的氨酰tRNA合成酶。天然氨酰tRNA合成酶还可以被替换为不稳定的氨酰tRNA合成酶。通过用基因转化所述细胞来替换天然氨酰tRNA合成酶，其中所述基因表达能在功能上替换天然氨酰tRNA合成酶的所选的重组氨酰tRNA合成酶。用添加标签的氨酰tRNA合成酶或不稳定的氨酰tRNA合成酶替换天然氨酰tRNA合成酶的目的是提供简单的方式来清除裂解物中能装载两种同功有义tRNA的氨酰tRNA合成酶，同时在缺少天然氨酰tRNA合成酶的情况下，使宿主细胞群保持存活。去除天然氨酰tRNA合成酶或与捕获部分融合的天然氨酰tRNA合成酶的方式在下文进行了更详细的讨论。

在于裂解前从细胞裂解物中去除天然氨酰tRNA合成酶的其它实施方案中，可以改变宿主细胞群，使得天然氨酰tRNA合成酶被替换为第一和第二外源氨酰tRNA合成酶。第一和第二外源氨酰tRNA合成酶中的每一个都分别特异性地氨酰化第一和第二同功有义tRNA。通过用两种基因转化所述细胞来替换天然氨酰tRNA合成酶，其中一种基因表达第一外源氨酰tRNA合成酶，而第二种基因表达第二外源氨酰tRNA合成酶。能够实现这一目的的一种方式是：通过使用对同功有义tRNA特异性的天然发现的区别性氨酰tRNA合成酶。此类氨酰tRNA合成酶存在于例如嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)中。参阅例如Salazaret al.，Proc.Natl.Acad.Sci.100：13863-68(2003)。

用选择性装载不同同功有义tRNA的两种氨酰tRNA合成酶替换天然氨酰tRNA合成酶的目的是提供这样一种机制，在该机制中，第一有义密码子在细胞裂解物中直接被天然氨基酸氨酰化。该情况的发生无需稍后除去天然氨酰tRNA合成酶或向裂解物直接添加纯化的第一氨酰tRNA合成酶。在这些实施方案中，必须从裂解物中去除第二外源氨酰tRNA合成酶，以防止第二同功有义tRNA装载天然氨基酸。下文讨论了在这些实施方案中从裂解物中去除第二氨酰tRNA合成酶。

当在裂解前利用在功能上替代天然氨酰tRNA合成酶的重组氨酰tRNA合成酶时，需要改变宿主细胞，使得天然氨酰tRNA合成酶的表达受到抑制。可以通过本领域已知的任何方法实现这点，包括但不限于产生编码合成酶mRNA的全部DNA序列缺失的宿主细胞系；将编码合成酶mRNA的DNA序列的一部分缺失，使得任何产生的合成酶蛋白无功能，其中缺失的部分可以包括外显子、内含子、启动子或增强子序列；将任何类型的外源干扰序列引入内源氨酰tRNA合成酶的编码或调节序列，所述外源干扰序列例如转座子，其功能是破坏或完全抑制合成酶的功能。破坏内源基因功能的方法在本领域内是公知的，并且不仅限于所讨论的这些。这类方法在本领域内是公知的，并且对于分子生物学实践而言是普通的。有关此类技术的更多详情，参阅例如Sambrook et al，Molecular Cloning-A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，第三版.(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.2000)。

在裂解前将氨酰tRNA合成酶与捕获部分融合以便在功能上替代天然氨酰tRNA合成酶的实施方案中，与捕获部分融合的氨酰tRNA合成酶自身必须在裂解后从裂解物中去除，从而防止可能用相同氨基酸氨酰化两种同功有义tRNA的任何交叉反应性。可以通过本领域已知的允许从裂解物中除去添加标签的蛋白的任何方法从裂解物中去除与捕获部分融合的氨酰tRNA合成酶，包括但不限于亲和色谱、免疫亲和色谱或免疫沉淀。

在通过亲和色谱从细胞裂解物中去除与捕获部分融合的氨酰tRNA合成酶的实施方案中，可以利用本领域已知的多种标签。例如，常见的标签是组氨酸标签(His-标签)，其对镍或钴离子具有亲和性。在此，可以将待去除的添加标签的氨酰tRNA合成酶进行工程化，使其成为能表达将His标签作为表达的蛋白的一部分的期望的合成酶的重组蛋白。如果将镍或钴离子固定于树脂柱上，则可以产生特异性结合添加组氨酸标签的蛋白的亲和载体。正如本发明所涉及的，固定有镍或钴离子的树脂是结合部分。因为仅裂解物中具有His标签的蛋白是与His标签融合的氨酰tRNA合成酶，因此，该合成酶是唯一与树脂结合的蛋白，从而使所有其它蛋白都能通过柱。此类技术在本领域中是公知的，并且His标签载体可从制造商商购获得，如Qiagen(Valencia，Calif)、Roche Applied Science(Rotkreuz，Switzerland)、Biosciences Clontech(Palo Alto，Calif.)、Promega(San Luis Obispo，Calif.)以及Thermo Scientific(Rockford，I11.)。

免疫亲和色谱也可以用于从裂解物中去除与捕获部分融合的氨酰tRNA合成酶。免疫亲和色谱是通过用抗体识别的捕获部分为氨酰tRNA合成酶添加标签而实现的亲和色谱法。捕获部分可以是可商购获得的以及被商购获得的抗体识别的任何标签。此类标签包括但不限于绿色荧光蛋白(GFP)标签、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标签以及FLAG标签。免疫亲和色谱法在本领域中是公知的。有关亲和色谱或免疫亲和色谱的更多细节，参阅例如Affinity Chromatography：Principles & Methods(亲和色谱：原理和方法)(Pharmacia LKB Biotechnology 1988)和Doonan，ProteinPurification Protocols(蛋白纯化方法)(The Humana Press 1996)。

在本发明的另一实施方案中，可以通过免疫沉淀从裂解物中去除与捕获部分融合的氨酰tRNA合成酶。在本实施方案中，产生针对捕获部分的抗体，但此类体系通常提供使用针对商购可获得的重组标签而产生的商业抗体。随后将抗体固定于固相基质结合部分，所述固相基质结合部分包括但不限于微型超顺磁性珠或微型琼脂糖珠。所述珠与所选的基质结合，并且当添加于细胞裂解物时，抗体所靶向的蛋白结合于基质上。可选地，也可以将抗体直接添加于裂解物，并允许与待去除的靶向氨酰tRNA合成酶结合。然后将在蛋白A/G中包被的珠添加于抗体/氨酰tRNA合成酶混合物，此时，抗体和结合的合成酶与蛋白A/G珠结合。随后可以从裂解物中除去基质，例如，对于超顺磁性基质使用磁场，或对于微型琼脂糖基质使用离心。免疫沉淀方法在本领域中是公知的。参阅例如E.Harlow，Antibodies：A Laboratory Manual(抗体：实验室手册)(ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.1988)。

在本发明的一些实施方案中，在裂解之前去除天然氨酰tRNA合成酶，并通过用产生热不稳定的氨酰tRNA合成酶的重组氨酰tRNA基因转化宿主细胞群在功能上替代天然氨酰tRNA合成酶。细胞裂解后，可以进行加热使热不稳定的氨酰tRNA合成酶变性，从而防止裂解物中同功tRNA分子的不希望的装载。同样，能够用表达在离子、物理或化学条件下不稳定的氨酰tRNA合成酶的重组氨酰tRNA合成酶基因替代宿主细胞群。

B.裂解后去除天然氨酰tRNA合成酶

在裂解后从细胞裂解物中去除天然氨酰tRNA合成酶的实施方案中，不需要用添加捕获部分标签的氨酰tRNA合成酶或不稳定的重组合成酶替代氨酰tRNA合成酶。在这些实施方案中，可以用免疫亲和色谱或免疫沉淀去除内源天然氨酰tRNA合成酶。本实施方案要求产生针对天然氨酰tRNA合成酶的抗体。一旦产生充分识别天然氨酰tRNA合成酶的抗体，可以用上文所述的免疫亲和色谱或免疫沉淀去除裂解物中的天然氨酰tRNA合成酶。

在细胞裂解后去除天然氨酰tRNA合成酶的其它实施方案中，也可以利用对期望去除的天然氨酰tRNA合成酶具有特异性的氨酰tRNA合成酶抑制剂，在功能上去除天然氨酰tRNA合成酶。许多氨酰tRNA合成酶抑制剂是抑制具体氨酰tRNA合成酶的氨基酸类似物，但是具体抑制剂有时可以抑制与多于一种氨基酸结合的氨酰tRNA合成酶。也可以在诸如BioInfoBank(http://ia.bioinfo.pl/)的数据库中检索氨酰tRNA合成酶特异性抑制剂。本领域技术人员应当很容易地认识到，可以基于氨酰tRNA合成酶的可用结构模式来设计、筛选以及检测特异性抑制剂。

氨酰tRNA合成酶抑制剂的实例包括S-三苯甲基-L-半胱氨酸；L-天冬酰胺；4-氮杂-DL-亮氨酸；DL-丝氨酸异羟肟氨酸；硫酸原黄素(半硫酸盐)；L-异亮氨醇；N-苯甘氨酸；L-亮氨醇；L-蛋氨醇；phe-leu-酰胺；酪胺；L-异亮氨醇；3，4-脱氢-DL-脯氨酸；S-氨甲酰-L-半胱氨酸；α-甲基-DL-蛋氨酸；氯-L-丙氨酸；顺式-羟基脯氨酸；L-脯氨醇；L-组氨醇；L-色氨酸异羟肟氨酸；DL-4-硫代异亮氨酸；DL-氨基-ζ-己内酰胺；L-天冬氨酸酰胺；DL-β-羟基正缬氨酸；顺式-4-氟-L-脯氨酸；反式-4-氟-L-羧酸；α-甲基-DL-组氨酸；N-甲酰-L-组氨酸；L-2-氨基-3-氨基黄酰基丙酸；L-天冬氨酸-β-异羟肟氨酸；β-氰基-L-丙氨酸；硒代胱胺；4-氨基-n-丁酸酰胺；DL-5-羟赖氨酸；L-赖氨酸异羟肟氨酸；3-(N-苯乙酰基)氨基-2，6-二哌啶酮(抗瘤酮A10)；4-氨基-4膦酰基丁酸；乙硫异烟胺；1，2-二氨基-3(4-咪唑基)丙烷(组氨酸胺(histidinamine))；α-甲基组氨酸；(S)-2-甲基丁胺；L-O-甲基苏氨酸；DL-畜群霉素(2-氨基-4，4-二氯丁酸)；DL-3-脱氢畜群霉素；DL-3-羟基亮氨酸；5，5，5-三氟-DL-亮氨酸；β-(3-氨基环己基)-DL-丙氨酸；DL-p-氯苯丙胺；反式-2，6-己二胺-4-烯酸；DL-2，6-二苯二酰亚氨基己酸甲酯；DL-5-羟基赖氨酸；L-赖氨酸异羟肟氨酸；DL-4-氧代赖氨酸；DL-4-硒赖氨酸(selenalysine)；L-蛋氨酸；2-氨基-4-甲基-4-己烯酸；(1S，2S)-2-氨基-1-苯基-1，3-丙二醇；N-苯甲基-D-苯丙胺；N-苯甲基-L-苯丙氨酸；N-苯甲基-D-苯乙胺；1，3-二(乙酰氧基)-2-硝基-1-苯丙烷(种衣酯(fenitropan))；1，2-二氨基-3-(2，6-二氯苯基)丙烷；1，2-二氨基-3-羟基-5-苯基戊烷；1，2-二氨基-3-苯丙烷；N-(2，6-二氯亚苄基)-2-苯乙胺；N-(2，6-二氯苯甲基)-2-苯乙胺；N-(4-氟苯甲基)-L-苯丙氨酸；DL-2-氟苯丙氨酸；2-羟乙基-2-苯磺酸铵(phenylammonium sulfate)；α-和β-甲基-DL-苯丙氨酸；L-苯丙氨醇；L-α-苯甘氨酸；DL-苏型-β-苯基苏氨酸；β-2-噻吩基-DL-丙氨酸；N-三氟乙酰基-L-苯丙氨酸环己基酯；2-氨甲基-4-异丙基氧吡咯烷草酸盐；2-氨基-甲基吡咯烷；L-4-硫代脯氨酸；N-苯甲基乙醇胺；N-(2，6-二氯苯甲基)乙醇胺；N-(2，6-二氯亚苄基)乙醇胺；DL-β-羟基亮氨酸；1，2-二氨基-5-苯基-3-戊醇；DL-7-氮杂色氨酸；DL-4-和DL-6-氟代色氨酸；5-羟基色胺；L-5-羟基色氨酸；DL-α-甲基色胺；α-和β-甲基-DL-色氨酸；色胺；DL-2-氨基-1-(4-羟苯基)-1-丙醇；DL-3-氟代酪氨酸；3-碘代-L-酪氨酸；3-硝基-L-酪氨酸；L-酪氨醇HCl；L-苏型-2-氨基-3-氯丁酸；六氟-DL-缬氨酸；DL-正缬氨酸；L-4-thialysine；DL-乙硫氨基酪酸；N，N′-二-CBZ-L-赖氨酸；DL-3-氟苯丙氨酸；DL-4-氟苯丙氨酸；以及DL-3，4-二羟基苯丙氨酸。这些化合物在本领域中是已知的。

C.裂解后去除外源氨酰tRNA合成酶

在宿主细胞内由两种外源氨酰tRNA合成酶在功能上替代天然氨酰tRNA合成酶的实施方案中，如上文所述，必须在裂解后从裂解物中去除第二外源氨酰tRNA合成酶。

可以通过以下方式从细胞裂解物中去除第二外源氨酰tRNA合成酶：将第二外源氨酰tRNA合成酶与捕获部分融合，并通过亲和色谱、利用识别捕获部分的抗体的免疫色谱或利用识别捕获部分的抗体的免疫沉淀，从裂解物中去除所述第二外源氨酰tRNA合成酶。如果所述合成酶是不稳定的，例如热不稳定的，也可以除去第二外源氨酰tRNA合成酶。在宿主细胞群表达两种外源氨酰tRNA合成酶的实施方案中，还可以通过以下方式从裂解物中除去第二外源氨酰tRNA合成酶：利用特异性识别第二外源氨酰tRNA合成酶的抗体的免疫亲和色谱或免疫沉淀，或利用对第二外源氨酰tRNA合成酶具有特异性的竞争性抑制剂。关于去除天然氨酰tRNA合成酶，上文更详细地讨论了这些技术。

尽管上文所列的用于去除蛋白的方法在本领域中最为常用，但是不应将本发明的方法仅限于上文所述的那些方法。去除天然氨酰tRNA合成酶的任何可用手段都符合本发明请求保护的并入非天然氨基酸的方法。

在提供无细胞裂解物的实施方案中，裂解物可以来自多种细胞。某些实施方案利用兔网状细胞。优选的实施方案利用细菌细胞，特别是大肠杆菌细胞。使用细菌细胞的实施方案利用表现出功能性氧化磷酸化体系的裂解物。某些实施方案还提供了缺乏精氨酸脱羧酶的裂解物。

VI.使tRNA分子失活

可以实施本发明的一种方式是使天然第二同功tRNA失活。在这些实施方案中，并未去除天然氨酰tRNA合成酶，而是将其保留于裂解物内，从而作为用天然氨基酸装载第一同功tRNA所需的氨酰化合成酶而发挥功能，所述天然氨基酸通常被氨酰化于所述第一同功tRNA。天然氨基酸的来源是宿主细胞群所产生的那些来源，并且因此存在于刚刚裂解后的裂解物中。

本发明中使第二同功tRNA失活的实施方案使用反义DNA。在此，反义DNA识别其靶tRNA的反密码子序列，因此防止天然同功tRNA与其mRNA密码子序列结合。

使tRNA分子失活和去除tRNA分子在本领域中是公知的。参阅例如Lindsley and Guarneros，Mol.Microbiology 48：1267-74(2003)；Jackson et al.RNA 7：765-73(2001)；Kanda et al，Biochem.Biophys.Res.Commun.，270：1136-9(2000)；Kanda et al.，FEBS Letters 440：273-76(1998)；Kanda et al.，Bioorganic & Medicinal Chemistry 8：675-79；Schmidt and Schimmel，PNAS90：6919-23(1993)。

特异性tRNA核糖核酸酶(tRNAse)能够用于通过选择性切割特定tRNA而使特定tRNA失活。特异性tRNAse的实例包括大肠杆菌素D、大肠杆菌素E5以及PrrC。参阅例如Tomita et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.97：8278-83(2000)；Morad et al.，J.Biol.Chem.268：26842-9(1993)；Ogawaet al.，283：2097-2100(1999)；de Zamarozy et al.，Mol.Cell 8：159-168(2001)。这些特异性tRNA核糖核酸酶的活性片段能够用于本发明，例如大肠杆菌素D或大肠杆菌素E5的C末端结构域。可以将特异性tRNA核糖核酸酶进一步工程化，从而使其一亚类靶tRNA失活，或可以改变特异性tRNA核糖核酸酶，从而使不同的tRNA靶标失活。当不再需要核糖核酸酶活性时，可以通过诸如ImmD蛋白的抑制剂来抑制tRNAse(参阅例如de Zamarozy et al.)。

VII.体外tRNA氨酰化

本文所用tRNA装载反应指体外tRNA氨酰化反应，其中装载将用非天然氨基酸氨酰化的第二同功有义tRNA。tRNA装载反应包括装载反应混合物、同功有义tRNA和非天然氨基酸。

本发明是单装载体系，因为用非天然氨基酸装载第二同功有义tRNA所发生的tRNA装载反应与蛋白合成反应是分离的。第一同功有义tRNA不是在tRNA装载反应中进行装载的，而是直接在细胞裂解物中或裂解之前的宿主细胞中装载天然氨基酸。在本发明中在细胞裂解后去除天然氨酰tRNA合成酶的一个实施方案中，将仅识别第一同功有义tRNA的第一外源氨酰tRNA合成酶在细胞裂解后添加于裂解物中。在用两种外源氨酰tRNA合成酶替代天然氨酰tRNA合成酶的另一实施方案中，在细胞裂解前，在宿主细胞中表达第一外源氨酰tRNA合成酶，因此在裂解后，第一外源氨酰tRNA合成酶已经存在于裂解物中。在使第二同功tRNA失活的另一实施方案中，在裂解物中天然氨酰tRNA合成酶直接用内源天然氨基酸装载第一同功tRNA。在本段提到的所有实施方案中，在与蛋白合成反应分离的tRNA装载反应中，用非天然氨基酸装载第二同功有义tRNA。

单独的tRNA装载反应可以是与蛋白合成反应分离的、用期望的氨基酸氨酰化tRNA分子的任何反应。该反应可以发生于提取物中、人工反应混合物中或两者的组合中。

合适的tRNA氨酰化反应条件是本领域技术人员公知的。通常，在pH值为6.5-8.5、具有0.5-10mM高能磷酸盐(例如ATP)、5-200mMMgCl₂、20-200mM KCl的生理缓冲液中进行tRNA氨酰化。优选地，在存在还原剂(如0-10mM二硫苏糖醇)的情况下进行反应。如果外源添加氨酰tRNA合成酶，则合成酶的浓度通常为1-100nM。本领域技术人员应当很容易地认识到，能够改变这些条件以优化tRNA氨酰化，例如对预选氨基酸的高特异性、高收率以及最低交叉反应性。

该反应能够在4-40℃，更优选20-37℃的温度下进行。如果细胞裂解物来源于嗜热细菌，则反应可以在更高的温度(如70℃)下进行。如果使用热不稳定氨酰tRNA合成酶，则反应优选在较低的温度(如4℃)下进行。也可以改变反应温度以优化tRNA氨酰化。在tRNA装载反应中用氨基酸装载同功有义tRNA的确切反应条件在本文所提供的实施例中进行了说明。

在本发明优选的实施方案中，由氨酰tRNA合成酶装载第二同功有义tRNA。在该实施方案中，与第一同功有义tRNA结合相同氨基酸的不同密码子序列的第二同功tRNA会在tRNA装载反应中装载非天然氨基酸，该tRNA装载反应中与进行蛋白合成反应的裂解物是分离的。因为第二同功tRNA装载反应发生于单独的反应中，因此对什么类型的氨酰tRNA合成酶能够用于装载第二同功tRNA的限制很小。

因此第二同功有义tRNA装载反应能够利用对待装载的tRNA具有特异性的天然氨酰tRNA合成酶、在本发明所讨论的某些实施方案的宿主细胞中表达的第二外源氨酰tRNA合成酶、经工程化而能识别非天然氨基酸的氨酰tRNA合成酶，或能用多种氨基酸装载tRNA的“混杂”氨酰tRNA合成酶。混杂氨酰tRNA合成酶可以包括有时在自然界中发现的内源产生的氨酰tRNA合成酶。

利用多种常用于蛋白定向进化的方法，可以将可用于用非天然氨基酸装载第二同功tRNA的工程氨酰tRNA合成酶工程化。在上文有关裂解物制备中，讨论了此类诱变方法，此外还可以包括而不限于定点诱变、随机点诱变、同源重组(DNA改组)、利用含有尿嘧啶的模板的诱变、寡核苷酸定向诱变、硫代磷酸酯修饰的DNA诱变、利用有缺口的双链DNA的诱变等。其它合适的方法包括点错配修复、利用修复缺陷宿主菌株的诱变、限制性选择和限制性纯化、缺失诱变、通过总基因合成的诱变、双链断裂修复等。然后利用功能测定筛选突变体的期望的活性。例如，可以除去氨酰tRNA合成酶的编辑功能。例如，也可以使用与嵌合构建体有关的诱变。将氨酰tRNA合成酶工程化，使其识别非天然氨基酸，在本领域中是公知的。参阅例如Liu et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.94：10092-7(1997)；Furter，Protein ScL，7：419(1998)；Zhang et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.94：4504-09(1997)；Ohno et al.，J.Biochem.130：417-23(2001)；Kiga et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.99：9715-9723(2002)。

为了有效装载修饰的tRNA和/或非天然氨基酸，可以将氨酰tRNA合成酶工程化，使其在与天然反应条件相似的条件下用非天然氨基酸氨酰化修饰的tRNA。上文讨论了工程化tRNA/氨酰tRNA合成酶对。工程化合成酶的实例是Ala294→Gly Phe-RS，其在合成酶的活性位点具有Ala294→Gly突变。在一些实施方案中，工程化合成酶允许修饰的tRNA和/或非天然氨基酸在与正常反应条件相似的条件下进行氨酰化。

可选地，在轻度变性反应条件下，例如pH升高、MgCl₂浓度增加、添加去污剂、DMSO或亚精胺的条件下，能够装载修饰的tRNA和/或非天然氨基酸。此类反应条件的实例包括：100mM Hepes pH 8.1、75mMMgCl₂、5mM ATP、40mM KCl、1.4M DMSO、0.1％Triton X-100、10-100μM tRNAphe、5-20mM对乙酰基-苯丙氨酸以及1-10μM Ala294→GlyPhe-RS。在一些实施方案中，在轻度变性反应条件下，天然氨酰tRNA合成酶能够装载修饰的tRNA和/或非天然氨基酸。

在一些生物体系中，相同tRNA天然提供同功密码子，第一密码子优选被tRNA匹配，而第二密码子通过摆动碱基配对(wobble base-paring)而错配。在这些体系中，可以引入在热力学上偏爱第二密码子(即优选与第二密码子匹配)的修饰的tRNA。

因此，可用于装载反应的工程化tRNA/氨酰tRNA合成酶对还包括利用来自天然tRNA的修饰的tRNA的体系。天然tRNA与编码天然氨基酸的第一有义密码子形成Watson-Crick碱基配对，并与一个或多个编码相同天然氨基酸的摆动简并有义密码子形成摆动碱基配对。本发明修饰的tRNA包含与摆动简并有义密码子之一形成完美Watson-Crick碱基配对的修饰的反密码子序列。

可用于例如细菌体系或其它体系的工程化tRNA的实例包括天冬酰胺tRNA，其中已经将反密码子GUU修饰为反密码子AUU(GUU→AUU)；GCA→ACA半胱氨酸tRNA；UUC→CUC谷氨酰胺tRNA；GUG→AUG组氨酸tRNA；UUU→CUU赖氨酸tRNA；CGU→AGU苏氨酸tRNA。待装载的非天然氨基酸的实例还包括例如荧光谷氨酰胺和对乙酰基苯丙氨酸。

在一些实施方案中，工程化氨酰tRNA合成酶用非天然氨基酸装载修饰的tRNA。工程化tRNA的实例是工程化大肠杆菌苯丙氨酸tRNA，其中已经将反密码子GAA修饰为反密码子AAA(参阅Kwon et al.，JACS125：7512-7513，2003)。工程化氨酰tRNA合成酶的实例是修饰的苯丙氨酸tRNA合成酶，例如Thr415Gly突变体。待用工程化tRNA/氨酰tRNA合成酶装载的非天然氨基酸的实例是L-3-(2-萘基)丙氨酸(Nal)。

在单独的装载反应中氨酰化同功有义tRNA后，必须纯化已装载的同功有义tRNA，以便将其添加于无细胞蛋白合成反应中。本发明的这一方面需要从tRNA装载反应所用的氨酰tRNA合成酶中分离同功有义tRNA，以确保装载反应所用的合成酶在蛋白合成反应中不与tRNA和/或氨基酸发生交叉反应。

利用固定于Sepharose 4B(GE Healthcare)上的来自大肠杆菌或嗜热栖热菌的延伸因子-Tu(Ef-Tu)，可以从未反应的tRNA和任何氨酰tRNA合成酶纯化氨酰化的tRNA，参阅Derwnskus，Fischer，& Sprinzl，Anal.Biochem.，136，161(1984)。简而言之，在存在GTP、丙酮酸激酶以及磷酸烯醇丙酮酸羧的情况下，活化固定的蛋白，以产生与氨酰化的tRNA特异性结合的固定的Ef-Tu-GDP。在低离子强度缓冲液(10mM KCl；50mM HEPES；pH 7.4)中洗涤柱，并在高盐缓冲液中洗脱，以产生纯化的氨酰化的tRNA。

另一实施方案利用核酶柱以非天然氨基酸装载第二同功有义tRNA，所述核酶柱能将氨酰基从核酶的5′-OH(在被寡核苷酸供体装载后)转移到tRNA分子的3′-OH。本领域目前所用的核酶具有催化广谱tRNA与非天然氨基酸之间反应的能力，当利用体外翻译反应时，这可特别用于制备用非天然氨基酸氨酰化的tRNA。本领域目前已知的核酶还能实现氨酰化的产物的有效亲和纯化，合适的底物的实例包括琼脂糖、sepharose以及磁珠。这类方法不需要氨酰tRNA合成酶来进行正确的tRNA装载。能够以多种方式获得利用核酶氨酰化的同功tRNA。一种合适的方法是用诸如EDTA的缓冲液从柱洗脱氨酰化的同功tRNA。参阅例如Bessho et al.，Nature Biotechnology 20：723-28(2002)；Lee et al.，Nat.Struct.Biol.20：1797-806(2001)。

在存在合适的5′和3′引物的情况下，通过PCR扩增，可以从用于任何所选tRNA的合成DNA模板来合成用于tRNA装载反应中的tRNA分子。所得的双链DNA模板含有T7启动子序列，随后能够利用T7RNA聚合酶将其体外转录，以产生tRNA分子，随后将该tRNA分子添加于tRNA装载反应中，参阅Sherlin et al.RNA 20017：1671-1678。

本发明还提供了与本文所述的体外tRNA氨酰化相关的新的装载的tRNA溶液，其包含细胞裂解物，所述细胞裂解物具有携带预选氨基酸、识别有义密码子的装载的tRNA。本发明涉及添加于无细胞体系的体外tRNA装载溶液的用途。在一些实施方案中，装载tRNA溶液缺少显著的合成酶活性。合适的细胞裂解物的实例包括细菌细胞裂解物。预选氨基酸的实例包括非天然氨基酸。

利用本发明所述的方法或用本领域已知的其它方法能够制备携带预选氨基酸的装载的tRNA。例如，能够通过tRNA的化学修饰制备携带预选氨基酸的装载的tRNA(参阅例如Sando et al.，JACS 127：7998-7999，2005)。

本发明的装载的tRNA溶液可以不具有显著的对于携带预选氨基酸的装载的tRNA的合成酶活性。能够通过第V部分所述的方法去除对于携带预选氨基酸的装载的tRNA的合成酶或合成酶活性。例如，通过免疫亲和色谱、免疫沉淀或通过添加氨酰tRNA合成酶抑制剂可以从tRNA溶液去除显著的对于携带预选氨基酸的装载的tRNA的合成酶活性。

在一些实施方案中，利用除了使用抑制剂的合成酶抑制外的方法，去除对于携带预选氨基酸的装载的tRNA的合成酶活性。例如，装载的tRNA溶液包含细菌细胞裂解物，所述裂解物具有携带预选氨基酸、识别有义密码子的装载的tRNA并不具有显著的对于携带预选氨基酸的装载的tRNA的合成酶活性，且装载的tRNA溶液不含合成酶抑制剂或特异性合成酶抑制剂。

VIII.无细胞蛋白合成反应

将上文所述的与第一和第二密码子结合的装载的同功有义tRNA与细胞裂解物以及核酸模板混合，用于合成在预选位置具有非天然氨基酸的期望的蛋白。

反应混合物还包含待合成的大分子的单体，如氨基酸、核苷酸等，并且反应混合物还包含辅因子、酶和合成所需的其它试剂，如核糖体、tRNA、聚合酶、转录因子等。除了上文中诸如无细胞提取物、基因模板和氨基酸的组分外，可以将蛋白合成特别所需的材料添加于反应中。所述材料包括盐、亚叶酸、环式AMP、蛋白或核酸降解酶抑制剂、蛋白合成抑制剂或调节剂、氧化/还原势能调节剂、非变性表面活性剂、缓冲液组分、亚精胺、精胺、腐胺等。可以将不期望的酶活性的代谢抑制剂添加于反应混合物中。可选地，可以从提取物中直接除去负责不期望的活性的酶或因子，或使编码不期望的酶的基因失活或从染色体缺失。

无细胞合成反应可以利用大规模反应器、小规模反应器或可以多路进行多个同时合成。连续反应使用补料机制(feed mechanism)引入试剂流，并且可以将终产物作为过程的一部分而分离。批处理体系也是有利的，其中可以引入其它试剂以延长有效合成期。可以用任何模式运行反应器，如批处理模式、扩展批处理模式、半分批(semi-batch)模式、半连续模式、补料分批模式以及连续模式，根据应用目的来选择使用何种方式。

在用DNA模板驱动体外蛋白合成的实施方案中，可以以任何方便的顺序将蛋白合成反应混合物的个体组分混合在一起。将RNA聚合酶添加于反应混合物中，以提供增强的DNA模板转录。适合用于本文的RNA聚合酶包括在细菌提取物所来源于的细菌中发挥功能的任何RNA聚合酶。在用RNA模板驱动体外蛋白合成的实施方案中，可以以任何方便的顺序将反应混合物的组分混合在一起，但是优选以最后添加RNA模板的顺序混合。

可以在适合转录和/或翻译反应的任何温度下孵育反应混合物。在孵育过程中，可以搅拌或不搅拌反应混合物。利用搅拌可以通过使反应组分的浓度始终保持均一并避免一种或多种关键组分的耗竭所引起的低合成速率的口袋形成而增强蛋白合成的效率。可以允许反应继续进行，同时蛋白合成以可接受的具体速率或容量速率发生，或如果需要，直到蛋白合成停止。通过在冰上孵育反应混合物或用水或适当的缓冲液快速稀释能方便地终止反应。通过限制性和非重复使用的转录和反应组分的连续补料，可以使反应维持所期望的时间。

各种无细胞合成反应体系在本领域中是公知的。参阅例如Kim，D.M.and Swartz，J.R.Biotechnol.Bioeng.66：180-8(1999)；Kim，D.M.and Swartz，J.R.Biotechnol.Prog.16：385-90(2000)；Kim，D.M.and Swartz，J.R.Biotechnol.Bioeng.74：309-16(2001)；Swartz et al，Methods Mol Biol.267：169-82(2004)；Kim，D.M.and Swartz，J.R.Biotechnol.Bioeng.85：122-29(2004)；Jewett，M.C.and Swartz，J.R.，Biotechnol.Bioeng.86：19-26(2004)；Yin，G.and Swartz，J.R.，Biotechnol.Bioeng.86：188-95(2004)；Jewett，M.C.and Swartz，J.R.，Biotechnol.Bioeng.87：465-72(2004)；Voloshin，A.M.and Swartz，J.R.，Biotechnol.Bioeng.91：516-21(2005)。

无细胞蛋白合成可以利用细胞机制的催化能力。在体外获得最大蛋白收率需要足量的诸如三磷酸核苷和氨基酸的底物供给、稳态环境、催化剂稳定性以及除去或避免抑制性副产物。体外合成反应的优化受益于快速生长的生物的体内状态的再造。在本发明的一些实施方案中，在氧化磷酸化活化的反应(即CYTOMIM^TM体系)中进行无细胞合成。利用缺少聚乙二醇并具有优化的镁浓度的反应条件来限定CYTOMIM^TM体系。CYTOMIM^TM体系不积累磷酸盐，因为已知磷酸盐能抑制蛋白合成，而常规次级能源导致磷酸盐积累。

反应混合物中镁的浓度影响总的合成。细胞裂解物中通常存在镁，随后可以用另外的镁调节细胞裂解物来优化浓度。CYTOMIM^TM体系利用镁的优选浓度为至少约5mM、通常至少约10mM、优选至少约12mM，但浓度不超过约20mM，且通常不超过约15mM。可以增强CYTOMIM^TM体系合成的其它改变是从反应混合物中除去HEPES缓冲液和磷酸烯醇丙酮酸盐。CYTOMIM^TM体系描述于美国专利第7,338,789号中，在此通过援引将其并入。

在本发明的一些实施方案中，在对反应混合物中的氧化还原条件进行了优化的反应中进行无细胞合成。这可以包括向反应混合物添加氧化还原缓冲液，从而为形成合适的二硫键而维持合适的氧化环境。可以进一步改动反应混合物来降低具有还原活性的内源分子的活性。优选地，在无细胞蛋白合成之前，通过用使游离的巯基不可逆地失活的化合物进行处理来使分子化学失活。通过使用从遗传修饰的细胞制备的提取物，可以进一步减少具有还原活性的内源酶的存在，所述遗传修饰的细胞具有此类酶的失活突变，所述酶例如硫氧还蛋白还原酶、谷胱甘肽还原酶等。可选地，通过在细胞提取物制备过程中从细胞提取物中选择性除去，可以除去此类酶。氧化还原条件的最大化描述于美国专利第6,548,276号和第7,041,479号中，在此通过援引将其并入。

在本发明的一些实施方案中，在通过对作用为不期望地代谢特定氨基酸的酶进行抑制而维持最佳氨基酸浓度的反应中进行无细胞合成。可以通过以下方式实现催化氨基酸代谢的酶的抑制：向反应混合物中添加抑制性化合物、修饰反应混合物以降低或消除负责的酶活性或两者的组合。优选的实施方案消除精氨酸脱羧酶。待从蛋白合成反应混合物中消除的其它抑制性化合物可以包括但不限于色氨酸酶、丙氨酸-谷氨酸转氨酶或丙酮酸氧化酶。消除酶活性从而优化无细胞蛋白合成过程中的氨基酸代谢描述于美国专利第6,994,986号，在此通过援引将其并入。

在体外合成反应后，可以按照本领域的标准纯化含有非天然氨基酸的合成的蛋白。回收和纯化本发明的蛋白的方法包括但不限于，硫酸铵或乙醇沉淀、酸或碱提取、柱色谱、亲和柱色谱、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水相互作用色谱、羟磷灰石色谱、凝集素色谱、凝胶电泳等。含有非天然氨基酸的新合成的蛋白必须正确地折叠。可以利用高效液相色谱(HPLC)、亲和色谱或能实现高纯度的其它合适的方法实现正确的折叠。多种纯化/蛋白折叠的方法在本领域中是已知的，例如Deutscher，Methods in Enzymology Vol.182：Guide to ProteinPurification(Academic Press，Inc.N.Y.1990)；Bollag et al.，Protein Methods(蛋白方法)，第二版，(Wiley-Liss，N.Y.1996)。

纯化后，含有非天然氨基酸的蛋白具有的构象可以不同于相关多肽的期望的构象。通常，有时使表达的多肽变性和还原、然后使多肽再折叠成优选的构象是可取的。例如，可以将胍、尿素、DTT、DTE和/或伴侣添加于目的翻译产物，使蛋白还原、变性和复性的方法对本领域技术人员而言是熟知的。参阅例如Debinski et al，J.Biol.Chem.268：14065-70(1993)；Buchner et al，Anal.Biochem.205：263-70(1992)。

本发明的方法提供了含有非天然氨基酸的修饰的蛋白，其具有与天然蛋白相当的生物活性。可以通过以下方式测定组合物中蛋白的特异性活性：测定功能性测定中的活性水平，定量非功能性测定中存在的蛋白的量(例如免疫染色、ELISA、考马斯亮蓝或银染凝胶定量等)，以及测定生物活性蛋白与总蛋白的比。通常，如此定义的特异性活性为天然蛋白的至少约5％，通常为天然蛋白的至少约10％，且可以为约25％、约50％、约90％或更高。参阅例如Sambrook et al.，Molecular Cloning：A LaboratoryManual(分子克隆：实验手册)(Cold Spring Harbor Press，Cold SpringHarbor，N.Y.1989)。

在体外合成反应和后续纯化之后，可以将含有非天然氨基酸的期望的蛋白任选地用作例如测定组分、治疗剂或产生抗体的免疫原。

在此通过援引并入本说明书所引用的所有出版物和专利申请，如同特别且单独指出通过援引并入每篇单独的出版物或专利申请。

尽管出于清楚理解的目的，已经通过说明和举例的方式对前述发明进行了相当详细的描述，但根据本发明的教导，对本领域技术人员显而易见的是，在不偏离所附权利要求的精神和范围的情况下，可以对其进行某些变化和更改。

实施例

仅以说明而非限制的方式，提供下列实施例。本领域技术人员会很容易地认识到许多可以改变或更改而能产生实质相似的结果的非关键参数。

实施例1.一般方法

分子生物学的标准方法已有描述(Maniatis et al.(1982)MolecularCloning，A Laboratory Manual(分子克隆：实验手册)，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.；Sambrook and Russell(2001)Molecular Cloning(分子克隆)，3yd ed.，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.；Wu(1993)Recombinant DNA(重组DNA)，Vol.217，Academic Press，San Diego，Calif)。标准方法还发表于Bindereif，& Westhof(2005)Handbook of RNA Biochemistry(RNA生物化学手册)，Wiley-VCH，Weinheim，Germany中，其描述了RNA操作和分析的详细方法。

蛋白纯化、色谱、电泳、离心以及结晶的方法已有描述(Coligan et al.(2000)Current Protocols in Protein Science(最新蛋白科学实验技术)，Vol.1，John Wiley and Sons，Inc.，New York)。无细胞合成的方法描述于Spirin& Swartz(2008)Cell-free Protein Synthesis(无细胞蛋白合成)，Wiley-VCH，Weinheim，Germany。利用无细胞合成将非天然氨基酸并入蛋白的方法描述于Shimizu et al(2006)FEBS Journal，273，4133-4140。

实施例2.tRNA 2′，3′-环磷酸的体外转录和分离

可以通过体外转录从图1中的实例所示的设计的tRNA-HDV核酶模板DNA产生用非天然氨基酸氨酰化的同功tRNA，随后通过尺寸排阻色谱(SEC)纯化，酶学方法除去2′，3′-环磷酸，并利用工程化tRNA合成酶以非天然氨基酸(nnAA)装载tRNA，该过程如图2所示。为了优化转录产量，测试了4种不同的体外转录方案中图3和图4所示的tRNA转录物。所有4种不同的体外转录方案给出了相似的tRNA产量。转录优化通常于37℃、50μL反应中进行2-3h。反应条件如下：(1)40mM HEPES(pH 7.9)、10mM DTT、10mM MgCl₂、2.5mM亚精胺、4U/ml焦磷酸酶、0.4U/mlsupeRNAse-in(Ambion)、20mM NaCl、4mM NTP、0.024mg/ml T7 RNA聚合酶、0.028mg/ml质粒DNA模板。(2)80mM HEPES(pH 7.5)、5mMDTT、22mM MgCl₂、1mM亚精胺、0.12mg/ml牛血清白蛋白(BSA)、1U/ml焦磷酸酶、0.4U/ml SupeRNAse-in、3.75mM NTP、0.024mg/ml T7RNA聚合酶、0.028mg/ml质粒DNA模板。(3)30mM HEPES(pH 7.9)、10mM DTT、MgCl₂、2mM亚精胺、1U/ml焦磷酸酶、0.4U/mlsupeRNAse-in、4mM NTP、0.024mg/ml T7 RNA聚合酶、0.028mg/ml质粒DNA模板。(4)40mM HEPES(pH 8.0)、10mM DTT、46mM MgCl₂、2mM亚精胺、0.4U/ml supeRNAse-in、10mM NaCl、3mM NTP、0.024mg/ml T7 RNA聚合酶、0.028mg/ml质粒DNA模板。与先前的发现相反(Bindereif，Schon，& Westhof(2005))，我们发现编码tRNA的1位或2位的尿嘧啶的模板(例如构建体1和4)对于通过T7 RNA聚合酶的转录并不是严重缺陷的。因此，优选构建体1利用方案1所产生的tRNA产物是最一致的，因此，该方案用于大规模转录，下文中指出例外情况。

为了产生大量 或构建体1，在经鉴定无RNA酶的50ml圆锥管中准备100mL转录反应。例如，构建体1的大规模反应含有0.4U/μL焦磷酸酶并使用0.04U/μL superRNAse-in。将转录反应物37℃下孵育2小时，再补充0.024mg/ml T7 RNA聚合酶，并于37℃下再孵育2小时，随后通过0.20μm PES过滤器(VWR货号87006-062)进行过滤。

通常，利用含50mM Tris(pH 6.5)、250mM NaCl、0.1mM EDTA的AKTA，将50mL转录物部分上样到XK50/100柱中的2L Sephacryl S-100或S-300尺寸排阻树脂上，从而从前体RNA转录物和切割的HDV核酶RNA中分离tRNA-2，3′环磷酸(图5)。收集25mL流分，并通过TBE/UREAPAGE凝胶电泳测定tRNA峰流分。通过添加1/10体积的3M乙酸钠(pH5.2)和等体积的异丙醇来沉淀tRNA-2，3′环二磷酸，随后在-80℃孵育30分钟，并通过离心(在FiberLite F-13转子中，20,000×g离心30分钟)沉淀tRNA。用70％乙醇洗涤沉淀，短暂空气干燥，随后重悬于1mM柠檬酸钠缓冲液(pH 6.4)中。

利用方案1产生幽门螺杆菌用26/60 Sephacryl S-200尺寸排阻柱进行tRNA纯化(图2a和2b)。从尺寸分级柱缓冲液(sizingcolumn buffer)中除去EDTA。将幽门螺杆菌tRNAGln重悬于50mM Tris(pH 8.5)中。

在这些实验过程中，我们发现：在转录反应中(1)添加0.1mM EDTA和(2)添加RNA酶抑制剂能阻止RNA降解(比较图6A的泳道1和2)，推测这是由NTP(Sigma Aldrich货号：U6625；G8877，C1506，A7600)中显著的RNA酶污染造成的。如图6B所示，在37℃与NTP孵育过夜的完整的纯化的tRNA^Glu完全降解(泳道2)，然而，添加RNA酶抑制剂消除了这种降解(泳道3)。这种降解不太可能是由简单的金属依赖性切割造成的，因为添加EDTA并未影响降解泳道(泳道4)。(单独与EDTA孵育不产生tRNA降解(泳道5))。其次，我们发现：在有些情况下，在尺寸分级柱缓冲液中无EDTA和重悬缓冲液中无螯合剂的情况下纯化的tRNA在存在还原剂的情况下易于破坏/降解(图6C；比较泳道1和2)，这可能是由tRNA的重金属污染造成的，因为通过加入EDTA能消除破坏/降解(泳道3)。

实施例3.tRNA 2′，3′-环磷酸的去磷酸化以释放活性tRNA

按如下产生T4多核苷酸激酶(PNK)，其是从HDV核酶切割的tRNA中除去2′，3′-环磷酸所需要的(比较图2和5)。基因合成具有N末端6组氨酸标签的PNK基因(DNA 2.0，Menlo Park.，CA)，并将其克隆到质粒pYD317中。用质粒T4PNK_pYD317转化BL21(DE3)细胞。使这些细胞在Braun 10L发酵罐中的自诱导培养基(Studier F.W.(2005)Protein Expr.Purif.，41：207-234)上生长18个小时，至终OD为21。通过离心收获细胞并获得240g细胞团。将40g细胞团重悬于500ml缓冲液A(50mM Tris(pH 7.8)、300mM KCl、10mM咪唑)中，匀浆裂解，通过离心澄清，并上样到35mL Ni-IMAC柱。用5倍柱体积的缓冲液A洗涤柱。缓冲液A加0.5mM BME、300mM咪唑、0.1μM ATP以及10％甘油(v/v)用于洗脱。为了防止聚集，用含有20％甘油的缓冲液A立即将含有PNK的流分稀释4倍。收集含有PNK的流分，并缓冲交换至PNK贮存缓冲液(20mM Tris(pH 7.6)、100mM KCl、0.2mM EDTA、2mM DTT、50％甘油)，终浓度1.2mg/mL。

于37℃下，将tRNA-2′，3′环磷酸(40μM)与50μg/ml PNK在50mMMES(pH 5.5)、10mM MgCl₂、300mM NaCl以及0.1mM EDTA中孵育1小时，从而将2′，3′-OH基团留在tRNA的3’末端，随后进行苯酚∶氯仿∶异戊醇提取，并用在0.3M乙酸钠(pH 5.2)中预平衡的PD10(GE healthsciences)尺寸排阻柱进行缓冲交换，以除去无机磷酸盐和过量苯酚。通过添加等体积的异丙醇来沉淀tRNA，-80℃孵育30分钟，于20,000×g下离心30分钟，用70％乙醇洗涤，20,000×g下离心10分钟，空气干燥并重悬于0.1mM柠檬钠(pH 6.4)中。通过以下过程使tRNA再折叠：加热至70℃、添加10mM MgCl₂，随后缓慢冷却至室温。利用1A₂₆₀＝40μg/mL的NanoDrop 1000分光光度计(Thermo Scientific)测定tRNA浓度，并通过TBE/尿素凝胶电泳来确认。从100mL转录反应可获得约2-10mg有活性的、可装载的tRNA产量。利用该方案的早期改进以相似的方式制备幽门螺杆菌tRNA^Gln，其中的区别在于：tRNA浓度为8.6μM；在PNK反应中，PNK浓度为0.020mg/ml，无EDTA，添加1mMβ-巯基乙醇。在纯化后，将tRNA重悬于DEPC处理的无菌水中。

通过酸/尿素凝胶电泳和利用孔雀绿磷酸盐检测法(Malachite Greenphosphate detection assay，R&D Systems，Inc)的磷酸盐释放来测定去磷酸化的程度。图7表明，去磷酸化的tRNA在酸/尿素凝胶电泳(Bindereif，Schon，& Westhof(2005))中迁移率降低。将含有3μg去磷酸化的tRNA的小份样品在上样缓冲液(100mM乙酸钠(pH 5.2)、7M尿素、1mg/ml溴酚蓝染料)中稀释2倍，并上样于6.5％19∶1丙烯酰胺、100mM乙酸钠(pH5.2)、7M尿素凝胶(40cm×34cm)上，并以40W电泳过夜。利用0.06％亚甲基蓝、0.5M乙酸钠(pH 5.2)将凝胶染色30分钟，并用去离子水脱色。两个测定表明在1小时后基本上完全且定量去磷酸化。

实施例4.氨酰tRNA合成酶的重组表达：载体、酶表达及纯化

图2中最后一步所示的单独的tRNA氨酰化(装载)反应需要使用工程化氨酰tRNA合成酶来氨酰化同功tRNA分子。可以如下文实施例所述，通过表达重组工程化合成酶而获得该合成酶。

克隆和表达大肠杆菌谷氨酰tRNA合成酶(GluRS)，并通过IMAC色谱进行纯化。将大肠杆菌GluRS表达构建体转化于BL21(DE3)细胞中。将菌落接种于补充了100μg/ml氨苄青霉素(LB-AMP)的2ml LB培养液中，并于37℃生长至饱和。将该培养物稀释于100ml LB-AMP，并于37℃生长至饱和。用全部培养物接种在Bioflo 3000发酵罐中补充了100μg/ml氨苄青霉素的10L自诱导培养基(Studier(2005)，Protein Expr Purif.；41，207-34)。使该培养物在37℃生长18小时，直到其OD达到约12。在Sharpies离心机中收获细胞，并于-80℃冷冻。将30g细胞团重悬于500mlGluRS裂解缓冲液(50mM磷酸钠(pH 8.0)、300mM NaCl、10mM咪唑、10％甘油)中，并使其通过Avestin C55A匀浆器进行裂解。通过在JA-17(Beckman)转子中以40,000×g离心30分钟澄清裂解物。使上清液通过在GluRS裂解缓冲液中平衡的30ml Ni²⁺ Sepharose 6 Fast Flow(GEHealthcare)柱。随后用15倍柱体积的GluRS洗涤缓冲液(50mM磷酸钠(pH8.0)、300mM氯化钠、20mM咪唑、10％甘油)洗涤柱，并用5倍柱体积的GluRS洗脱缓冲液(50mM磷酸钠(pH 8.0)、300mM氯化钠、300mM咪唑、10％甘油)洗脱，以上如图8a所示。收集峰流分，在2L的2×GluRS贮存缓冲液(100mM HEPES(pH 8.0)、40mM氯化钠、1mM二硫苏糖醇(DTT)、2mM EDTA)中透析2次，并用100％甘油稀释2倍。从30g细胞团中回收了约945mg GluRS。在-80℃将蛋白长时间贮存，并于解冻后保存在-20℃。

按照下述，克隆和表达幽门螺杆菌GluRS2(ND)(也称为非区别(ND)合成酶)，并通过IMAC进行纯化。将幽门螺杆菌GluRS2(ND)表达构建体转化于BL21(DE3)细胞中，在37℃下接种于两个LB-AMP平板上。第二天早上，将10ml LB添加于平板中，并随后用无菌移液管进行吹打，重悬所有菌落。将重悬液添加于2L LB-AMP中，并使其于37℃生长。与以前的工作(Skouloubris，Ribas de Pouplana et al.(2003)Proc Natl AcadSci USA，100，11297-302)一致，为了避免由于GluRS2(ND)自身表达而将谷氨酸并入GluRS2(ND)的谷氨酰胺密码子中，用1mM异丙基β-D-硫代半乳糖苷在OD₆₀₀为约0.9时仅诱导过表达30分钟。利用Sorvall RC-3B离心机，通过4500rpm离心30分钟，收获细胞，并于-80℃冷冻。将来自2L培养物的细胞团重悬于补充了250μL细菌蛋白酶抑制剂混合物(Sigma)的25ml裂解缓冲液(20mM Tris(pH 8.5)、300mM NaCl、10％甘油、10mM咪唑)中。通过添加溶菌酶(至1mg/ml)裂解细胞，并通过22号钝针10倍传代。通过35,000×g离心30分钟来澄清总裂解物。将裂解物3倍稀释于裂解缓冲液中，随后分批与装载NiSO₄并在裂解缓冲液中平衡的1ml IMAC高效琼脂糖(High Performance Sepharose)结合10分钟。用10倍柱体积的补充了0.5mM DTT的裂解缓冲液洗涤树脂，然后用1mlGluRS2(ND)洗脱缓冲液(补充了300mM咪唑和0.5mM DTT的裂解缓冲液)洗脱5次，如图8b所示。用Vivaspin 10kD MWCO超滤将峰流分浓缩。浓缩的蛋白在40mM HEPES(pH 7.2)、0.2mM EDTA、1mM DTT的初级透析得到GluRS2(ND)沉淀。添加氯化钠再溶解，并且改为将蛋白透析到GluRS2(ND)贮存缓冲液(20mM Tris(pH 8.5)、300mM NaCl、10％甘油、0.5mM DTT、0.1mM EDTA)。将蛋白以小份贮存于-80℃。纯化回收了约0.6mg GluRS2(ND)。

大肠杆菌苯丙氨酰tRNA合成酶(PheRS)是由两个亚基PheS和PheT组成的转性二聚体(obligate dimmer)，如图9a所示是来自嗜热栖热菌的同源酶。利用QuickChange诱变试剂盒(Stratagene)和重叠引物，将突变A294G引入大肠杆菌PheS，从而增加非天然对位取代的苯丙氨酸类似物的装载百分比(Datta，Wang et al.(2002)J Am Chem Soc，124，5652-3)。利用NdeI-SalI限制性位点，将所得的6×HisPheS(A294G)基因亚克隆至pET21(a)。用该质粒转化BL21(DE3)感受态细胞。使细胞在自诱导培养基中过夜生长，从而在内含体中产生PheS(A294G)亚基。通过匀浆裂解细胞，并通过离心沉淀内含体，将内含体完全重悬于6M胍中，随后用PBS稀释至终浓度2M胍-HCl。利用含NdeI和XhoI限制性位点的引物，从大肠杆菌基因组DNA扩增PheT基因。将PCR片段亚克隆至pET24(b)，并利用与PheS(A294G)相同的自诱导培养基进行表达。与PheS(A294G)相反，表达的PheT亚基是可溶的。将细胞在Ni亲和纯化上样缓冲液中裂解：50mM NaPO₄缓冲液(pH 7.5)、300mM NaCl以及5mM咪唑。澄清裂解物，随后缓慢添加配制于2M胍-HCl中的PheS(A294G)，同时搅拌。通过Ni亲和色谱和随后利用S100尺寸排阻树脂的尺寸排阻色谱来分离再折叠的PheRS。

可选地且更有效地，通过无细胞合成、从克隆于pYD317的独立的PheS和PheT基因产生PheRS(A294G)和PheT结构域的反密码子识别位点的变体，正如表1总结：

将pYD317 PheS(A294G)和pYD317 PheT变体的质粒以μg/mL的浓度同时添加于无细胞反应中，并使无细胞合成进行小时。通过IMAC纯化的异二聚体蛋白变体显示于图10中，并可以随后用于装载同功tRNA。

实施例5.监测利用nnAA的tRNA氨酰化的放射学方法

利用Ledoux & Uhlenbeck(2008)，Methods，44，74-80所述的大肠杆菌CCA核苷酸转移酶，用α-³²P-AMP交换tRNA的3’末端腺苷核苷酸。利用过量PPi使反应条件趋向除去3′-AMP，随后利用PPi酶使反应条件趋向添加AMP。将活性tRNA与CCA酶于37℃在50mM甘氨酸(pH 9.0)、10mM MgCl₂、0.3μMα-³²P-ATP、0.05mM PPi中孵育5分钟。添加1μl10μM CTP和10U/ml(1单位)的无机焦磷酸酶(酵母-Sigma)，并孵育大于2分钟，随后向每份添加1/10体积的3M NaOAc(pH 5.2)。用水将所得的3′末端放射性标记的tRNA进行1∶5稀释，并在使用前使其再折叠。

利用优化的条件，将nnAA氨酰化于tRNA^Phe上。野生型氨酰化的条件为50mM Hepes(pH 7.5)、40mM KCl、10mM MgCl₂、5mMATP、10mM DTT、10-100mM氨基酸(Phe或对乙酰基苯丙氨酸(pAF))以及1-100μM PheRS或PheRS A294G。在室温下用P1核酸酶将末端标记的tRNA反应物消化20-60分钟，并将1μl点样于预洗涤(水)的PEI纤维素TLC平板上，并允许其空气干燥。通过利用Storm 840Phosphoimager的Molecular Dynamics储存磷光质屏的放射自显影监测到在乙酸/1M NH₄Cl/ddH₂O(5∶10∶85)中AMP从aa-AMP解离(图11和12)。与图11所示的结果相反，Peterson和Uhlenbeck(Peterson and Uhlenbeck(1992)Biochemistry，31，10380-9)证明在限制下，苯丙氨酸装载效率非常低下。

监测了在50mM Hepes(pH 8.1)、40mM KCl、75mM MgCl₂、5mMATP、0.1％Triton X-100、1.4M DMSO、0.025U/μl无机焦磷酸酶、8-40μM或10mM DTT、10-100mM pAF以及1-100μMPheRS或PheRS(A294G)中利用pAF的和氨酰化的动力学。图13表明pAF被高效装载，从而在该反应条件下形成和

在装载反应中，我们使用了高浓度：大肠杆菌GluRS和均为18μM。正常的装载条件为：10μL反应、37℃下在50mM HEPES(pH7.5)、10mM MgCl₂、10mM DTT、10mM ATP、10mM谷氨酸(pH 7.5)、10U/ml焦磷酸酶，以及1μL[³²P]末端标记的中孵育30分钟。用1μL 3M乙酸钠使反应终止。令人高兴的是，在如此高浓度的tRNA和GluRS下，我们发现，即使用正常的缓冲条件突变体也能被同源谷氨酸装载至75％(图14a，泳道2)。通过将反应pH改变至8.1并将Mg²⁺浓度增加至70mM，装载稍微增加至77％。进一步添加二甲基亚砜(DMSO)至2.5M并添加Tween-20至0.25％导致达装载再增加至84％(图14a，泳道4)。在该测定条件下检测不到氟取代的谷氨酸装载至野生型tRNA^Glu(图14a，泳道5)，这是由于氟取代的谷氨酸AMP和AMP在薄层色谱中的分离较差(Hartman，Josephson et al.(2007)PLoS ONE，2，e972)。

我们还证实了纯化的幽门螺杆菌GluRS2(ND)(1.9μM)的活性，其中在每个反应中使用幽门螺杆菌tRNA^Gln 3.4μM、焦磷酸酶50U/ml和0.5μL[³²P]末端标记的幽门螺杆菌tRNA^Gln。同样，利用该测定，没有观察到单氟取代的谷氨酸的装载(图14b)。

实施例6.监测利用nnAA的tRNA氨酰化的非放射学方法

在50mM Hepes(pH 7.5)、40mM KCl、10mM MgCl₂、5mM ATP、8-40μM10mM DTT、10-100mM氨基酸(Phe或pAF)和1-100μM PheRS或PheRS A294G中，氨酰化非放射性标记的 以及 和氨酰化的条件为50mM Hepes(pH 8.1)、40mM KCl、75mM MgCl₂、5mM ATP、0.1％Triton X-100、1.4M DMSO、8-40μM或10mM DTT、10-100mM pAF以及1-100μMPheRS或PheRS A294G。将反应在37℃孵育15分钟，并用2.5倍体积的300mM乙酸钠(pH 5.5)终止。用25∶24∶1的苯酚∶氯仿∶异戊醇(pH 5.2)(Ambion)提取终止的样品，涡旋2分钟，随后4℃、14,000×g离心10-30分钟，以分离水相(tRNA)和有机相(蛋白)。取出水相(含有装载的tRNA)，并将其添加于预平衡(300mM NaOAc)的G25交联葡聚糖树脂尺寸排阻柱，所述尺寸排阻柱是基于分子的大小进行分离。将洗脱液与2.5倍体积的100％乙醇混合，并于-80℃孵育15-30分钟，并以约14,000×g离心30-45分钟。将沉淀的氨酰化tRNA贮存于-80℃或重悬于微酸性的缓冲液中，用于上样到HPLC和/或用于无细胞合成反应。

如图15和图16所示，通过HPLC疏水相互作用色谱(HIC)监测非放射性标记的 以及的氨酰化，疏水相互作用色谱解离tRNA的氨酰化和非氨酰化部分。在缓冲液A(50mM磷酸钾和1.5M硫酸铵(pH 5.7))中平衡HPLC C5柱，随后将100μl 2×缓冲液A与1-10μg沉淀的氨酰化tRNA的混合物上样，用50分钟以从缓冲液A至缓冲液B(50mM磷酸钾和5％异丙醇)的梯度进行分离。峰面积所测定的氨酰化tRNA的流分表现出与图13所示的利用[³²P]末端标记的tRNA测定的流分的良好一致性，其中两个反应运行的条件是相同的。

可选地，利用酸/尿素聚丙烯酰胺40cm×34em凝胶电泳，分离利用大肠杆菌GluRS以单氟谷氨酸装载的或和(图15)。为了装载反应条件为：12.5μL反应，于37℃在50mMHEPES(pH 8.1)、70mM MgCl₂、10mM DTT、10mM ATP、10mM氨基酸(pH 8.1)、16.6U/ml焦磷酸酶中孵育30分钟。为了确保在装载反应中无RNA酶，在添加tRNA前，将缓冲液超滤通过3000道尔顿的分子量截留膜(Microsep 3K Omega；Pall lifesciences)。用1.25μL 3M乙酸钠使反应终止，在上样缓冲液(100mM乙酸钠(pH 5.2)、7M尿素、1mg/ml溴酚蓝染料)中稀释2倍，上样到6.5％19∶1丙烯酰胺、100mM乙酸钠(pH5.2)、7M尿素凝胶上，并于40W电泳过夜。利用0.18％亚甲基蓝、0.5M乙酸钠(pH 5.2)，使凝胶染色30分钟，并用去离子水脱色。可观察到用同源谷氨酸或非天然氟谷氨酸对野生型tRNA^Glu(Chemical Block，Moscow，Russia)或体外转录的的装载高达70％(图17)。

实施例7.无细胞蛋白合成操控nnAA并入

利用大肠杆菌菌株KGK10高细胞密度发酵物的快速生长(Rnapp，Goerke et al.(2007)Biotechnol Bioeng，97，901-8)，基本上如Liu et al.(Liu，Zawada et al.(2005)Biotechnol Prog，21，460-5)所述，产生无细胞提取物或裂解物而使核糖体产量最大化。匀浆后，不向细胞裂解物中添加DL-二硫苏糖醇。用改良的“失控程序(run-off procedure)”制备无细胞提取物。产生足量无细胞提取物的发酵体积通常为期望的无细胞反应体积的2.5倍。为了使细胞提取物的还原活性失活，如先前所述(Yang，Kanter et al.(2004)Biotechnol Prog，20，1689-96)，添加各种浓度的碘乙酰胺(IAM)。基因表达受T7启动子的控制。为了促进翻译启动，合成的基因(DNA 2.0，MenloPark，CA)中同义密码子位于基因的5’末端，ATG起始密码子(N-末端蛋氨酸残基)针对mRNA不稳定性进行了优化，这可通过位置-6至+37的mRNAΔG_fold测量(Kudla，Murray et al.(2009)Science，324，255-258)，并替换了稀有密码子。在30℃运行无细胞反应，该反应含有8mM谷氨酸镁、10mM谷氨酸铵、130mM谷氨酸钾、35mM丙酮酸钠、GMP、UMP和CMP每种各0.86mM、1.2mM AMP、2mM氨基酸(酪氨酸为1mM)、4mM草酸钠、1mM腐胺、1.5mM亚精胺、15mM磷酸钾、100nM T7 RNA聚合酶、2-50nM DNA模板、1-10μM大肠杆菌DsbC以及24-30％(v/v)IAM处理的无细胞提取物。通过添加还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型(GSSG)谷胱甘肽至总浓度为约5mM来控制氧化还原电势。利用能斯特方程(Nernst equation)(其中E⁰＝-205mV)计算最初的氧化还原电势，将其作为在30℃和pH 7下GSH/GSSG偶联的标准电势(Wunderlich andGlockshuber(1993)Protein Science，2，717-726)。于30℃在无细胞蛋白合成体系中表达GMCSF 6个小时。图18说明如何在无细胞反应中控制添加的氨基酸(即Lys和Phe而非Glu)的浓度来影响蛋白合成。

实施例8.内源氨酰tRNA合成酶的去除

用C末端FLAG-标签为谷氨酸tRNA合成酶(gltX)基因组拷贝添加标签，从而利用FLAG标签亲和色谱除去合成酶活性，同时保持由大肠杆菌KGK10制备的细胞提取物制品的酶活性。利用GENE BRIDGES(Heidelberg，Germany)的Quick & Easy大肠杆菌基因缺失试剂盒(货号K006)，根据制造商建议的方案进行基因插入。用708-FLPecm^R表达质粒(A105，GENE BRIDGES)从大肠杆菌染色体中消除选择标记。利用AccuPrime pfx SuperMix(Invitrogen)，根据制造商建议的方案，通过PCR延伸来扩增DNA插入盒。DNA模板为来自Quick & Easy大肠杆菌基因缺失试剂盒的FTR-PGK-gb2-neo-FRT模板DNA。引物包括：

5′GCGTATCAACAAAGCGCTGGATTTTATTGCTGAACGCGAAAATCAGCAGGGTGGCGACTACAAAGATGACGATGACAAATAAAATTAAC CCTCACTAAAGGGCGG3′和

5′AGGGATTATCGGATTGTTACAACGCTTAGGGATTCGCGATAGCAAATAATTAATACGACTCACTAT AGGGCTCG3′

在通过电穿孔转化大肠杆菌KGK10之前，用QIAGEN DNA纯化试剂盒纯化PCR片段。从KGK10ΔgltX::gltX-Flag的染色体DNA扩增包括gltX的3′末端和下游的DNA片段，所用引物为5′GTTCAACACCGACAAGCTGCTGTGGCTG 3′和5′GCGGGAAGGGATTATCGGATTGTTACAACGC 3′。利用以下引物验证Flag标签编码序列：5′GATTACTGACTGGACCGCTG 3′。

首先，设计在gltX的3’末端含有Flag标签编码序列的DNA片段的PCR扩增引物。将Flag标签序列DYKDDDDK通过二肽GG连接于谷氨酸tRNA合成酶的C末端。将标签肽序列回译到DNA序列，5′GGGTGGCGACTAC AAAGATGACGATGACAAA 3′。FLAG标签编码序列之后紧接着添加终止密码子TAA。正向引物包括50Nt同源序列，其编码位于5’末端的谷氨酸tRNA合成酶(GluRS)的C末端、位于中间的Flag标签序列以及位于3’末端的扩增序列AATTAACCCTCACTAAAGGGCGG。通过将扩增序列TAATACGACTCACTATAGGGCTCG连接于位于gltX基因下游的50Nt同源序列来设计反向引物。其次，扩增用于FLAG标签序列插入的线性片段，并将其转化至KGK10来替换gltX下游的441bp序列。通过插入KGK10的基因组DNA的卡那霉素抗性标记来选择Flag标签插入突变体。接着，利用708-FLPecm^R表达质粒去除用于选择的卡那霉素抗性标记。最后，通过对从突变体KGK10ΔgltX::gltX-Flag扩增的PCR片段进行测序来验证FLAG标签编码序列。将DNA序列5′GGGTGGCGACTACAAAGATGACGATGACAAA 3′连接于KGK10染色体中gltX基因的3’末端。该片段编码氨基酸序列GGDYKDDDDK、两个Gly残基以及FLAG标签。通过使提取物通过抗FLAG M2磁珠(Sigma cat#M8823)并除去珠来实现从无细胞提取物中除去添加FLAG标签的GluRS蛋白。

实施例9.利用活性位点定向抑制剂Phe-氨磺酰腺苷和Glu-氨磺酰腺苷(Phe-SA和GIu-SA)去除内源aaRS活性

图19说明如何利用活性位点定向抑制剂来限制添加的同功tRNA的背景再装载，从而调节添加于无细胞反应中的装载的同功nnAA-tRNA的反应性。

如下合成5′-O-[N-(氨酰基)氨磺酰]腺苷抑制剂Phe-SA(图19b)：向0℃的配制于DMAC(70mL)中的醇(7g，17.03mmol，1.0eq)溶液添加DIEA(10.62mL，59.61mmol，4.0eq)和氨基磺酰氯(4eq)，并在室温下将反应混合物搅拌15小时。用乙酸乙酯(300mL)稀释反应混合物，并用水洗涤(4×50mL)。在MgSO₄上干燥有机层，蒸发，并通过柱色谱(DCM至配制于DCM中的20％MeOH)进行纯化，以产生活化氨基磺酸盐(4.5g，9.18mmol，54％产率)。向配制于DCM(45mL)中的氨基磺酸盐(2.0g，4.07mmole，1eq)、DCC(0.841g，4.07mmol，1eq)、DMAP(050g，4.07mmol，1.0eq)溶液添加Boc-Phe-OH(1.1g，4.07mmol，1eq)，并将反应混合物在室温下搅拌10小时。用乙酸乙酯(450mL)稀释反应混合物，并用饱和的水性NaHCO₃、水、盐水洗涤，在MgSO₄上干燥，并蒸发。将粗产物溶解于MeOH/正丁胺(30mL/30mL)，并在室温下搅拌3小时。蒸发溶剂，并通过快速色谱(EtOAc至10％MeOH/EtOAc)纯化粗产物，以产生Phe-SA抑制剂(0.90g，1.4mmol，35％产率)。

5′-O-[N-(氨酰基)氨磺酰]腺苷抑制剂(Phe-SA和Glu-SA)在GFP报告蛋白turboGFP的无细胞合成中的作用如图19c所示。在Molecular DevicesSpectraMaxM5酶标仪中，用粘性盖(VWR，9503130)，通过荧光(λ_Ex＝476nm和λ_Em＝490nm)，监测30℃下的无细胞合成反应5小时。将氨酰合成酶抑制剂Phe-SA和Glu-SA(Integrated DNA Technologies，Iowa)从TE缓冲液(Invitrogen，12090)中的母液在DEPC水中连续稀释3倍，并将其转移至96孔V形底聚丙烯平板(Greiner Bio-One，651207)。立即将无细胞反应混合物添加于具有抑制剂的微量板，终反应体积为25μL。测定荧光变化的最大速率(V₀(RFU/秒)＝无抑制剂，V＝存在抑制剂)，并将相对活性百分比测定为所示的添加的抑制剂浓度的函数。重要的是，这些抑制剂对于其各自氨酰tRNA合成酶(PheRS和GluRS)是竞争特异性的，因为如图20所示，存在1nM Phe-SA抑制剂时(约50％活性)添加＞10μMPheRS(A294G)使turboGFP荧光活性完全恢复。以变化的[Phe-SA]和添加的L-苯丙氨酸的函数表示的GFP活性的表面反应分析符合Phe-SA抑制的竞争性和特异性本质。

实施例10.将对乙酰基苯丙氨酸(pAF)并入turboGFP Y50TAG：

为了控制和优化含有非天然氨基酸(nnAA)的蛋白的无细胞合成(图21)，我们企图建立描述总过程中各个步骤的动力学和热力学的定量框架(参阅图19a)。这样的框架为该过程中每个参与者的功能和机制提供见解，并充当nnAA无细胞并入蛋白的深度分析和优化的基础。

基于来自节肢动物(Anthropoda)的绿色荧光蛋白turboGFP(Evdokimov，Pokross et al.(2006)EMBO Rep，7，1006-12)的无细胞合成，我们构建并分析了极小动力学模型(参阅图19)。在蛋白序列的位置50处引入琥珀(UAG)密码子，从而产生质粒turboGFP Y50TAG(图22)。在缺少添加的抑制基因tRNA的情况下，仅合成预期的6kD截短的蛋白。

在Molecular Devices SpectraMax M5酶标仪中，用粘性盖(VWR，9503130)，通过荧光(λ_Ex＝476nm和λ_Em＝490nm)，监测微量滴定板中荧光turboGFP无细胞合成的动力学5小时。将利用turboGFP质粒(无UAG终止密码子)的阳性对照反应作为阳性对照。还在不添加tRNA的情况下运行含有turboGFP Y50TAG质粒的反应，以确保在缺少外源添加的tRNA的情况下检测不到荧光(阴性对照)。荧光信号的缺乏与之前所观察的约6kD截短的产物一致(参阅图22)。在缺少添加的Phe-SA抑制的情况下，未装载的抑制turboGFPY50TAG中的琥珀密码子，但效率比添加的低，这表明其被无细胞提取物中内源aaRS之一识别并氨酰化。为了确定PheRS是否负责再装载外源添加的在存在各种浓度的Phe-SA抑制剂的情况下，测定利用装载有对乙酰基苯丙氨酸(pAF)的UAG特异性抑制基因大肠杆菌苯丙氨酸tRNA(即)对琥珀密码子的抑制，以调节PheRS的内源活性(图23)。在接近以前测定的Phe-SA的IC₅₀的抑制剂浓度下，观察到pAF向turboGFPY50TAG的最大并入，比仅添加大10倍(图19c)。在7-8小时后，抑制剂开始丧失其效力。

我们的结论是将pAF并入turboGFP实现相对高的蛋白产率，同时如图19a所示，的再装载大大降低。这些结果表明，通过添加外源装载的nnAA-tRNA部分同时控制内源合成酶活性，无细胞合成能够用于含有位点特异性nnAA的蛋白的高效合成(参阅图21)。

实施例11.通过将荧光标签并入蛋白

为了证明将荧光标签并入蛋白的可行性，将ε-标记的BODIPY-FLlysl-tRNA(即)添加于含有rhGM-CSF的质粒的无细胞反应中，所述质粒在位置111具有单个AAA密码子(图24)。在每50μL无细胞反应物中，无细胞反应物含有8mM谷氨酸镁、10mM谷氨酸铵、130mM谷氨酸钾、35mM丙酮酸钠、GMP、UMP和CMP每种各0.86mM、1.2mM AMP、2mM氨基酸(酪氨酸1mM)、4mM草酸钠、1mM腐胺、1.5mM亚精胺、15mM磷酸钾、100nM T7RNA聚合酶、2-50nM DNA模板、1-10μM大肠杆菌DsbC以及24％(v/v)IAM处理的无细胞提取物，所述提取物含有2μL(Flu oroTect GreenLysPromega)。作为对照，在存在和不存在的情况下，平行进行无质粒的无细胞反应。通过测定TCA可沉淀的可溶性蛋白和总蛋白，监测1-[U-¹⁴C]-亮氨酸(300μCi/μmole；GE Life Sciences，NJ)的并入所产生的蛋白。于30℃，在96孔V形底聚苯乙烯微量滴定板(Greiner，Germany)中孵育无细胞反应物，伴随振荡。将来自样品的总蛋白或可溶性蛋白的小份(5μL)在4℃下以6100×g离心10分钟而除去了不溶性蛋白聚积物，然后点样于预润湿的聚偏氟乙烯(PVDF)过滤板(Millipore，Billerica，MA)上。用200μL 5％TCA洗涤干燥的平板三次，随后用100μL无水乙醇洗涤。将Optiphase闪烁混合物(Perkin-Elmer，Waltham，MA)添加至50μL体积，并在Wallac 1450Microbeta Plus计数器(Perkin-Elmer)中测定¹⁴C放射活性。将每一可溶性无细胞反应物的3μL小份上样到12％Bis-Tris SDS-PAGE上，在电泳后，利用Storm 840成像仪(GE healthcare)扫描凝胶，以监测表示nnAA并入的放射性计数和荧光。如图24所示，来自荧光tRNA结合物的背景荧光在11kD和21kD之间移动。标记的GMCSF的荧光与对照放射性标记的GM-CSF共迁移，这表明通过向无细胞反应添加将荧光BODIPY引入了蛋白。利用反向HPLC(ZORBAX 300SB-C8，5μm，4.6×250mm，Agilent)以及梯度洗脱(缓冲液A：100mM三乙基乙酸铵(pH 7.0)；缓冲液B：70％乙腈、100mM三乙基乙酸铵(pH 7.0))，纯化存在的250μL体系的无细胞反应的产物，并如图24所示，在214nm和480nm(为了检测荧光BODIPY并入)下进行监测。

实施例12.将pAF并入rhGM-CSF

诱变和互补研究已经表明氨酰化需要单个同功大肠杆菌中的G34。G34A或G34C A35U的突变在正常的k_cat/K_M反应条件下(Peterson，E.C.T.& Uhlenbeck，O.C.(1992)Biochemistry 31：10380-10389)分别导致tRNA氨酰化降低640倍和＞1000倍。如图25中的粗灰线所示，应当使内源Phe tRNA合成酶(PheRS)在正常无细胞条件下的或的交叉装载最小。此外，通过添加活性位点定向抑制剂或从无细胞提取物除去添加标签的PheRS，可以将内源PheRS活性控制到一定程度。

通过扩展，该方法还可能用于用其它摆动性密码子并入其它nnAA。选择哪种摆动密码子“劫持(hijack)”取决于优选的相互作用自由能。同时，对一些反密码子碱基进行翻译后修饰，从而不利于摆动密码子识别(参阅例如Sylvers，L.A.，Rogers，K.C，Shimizu，M.，Ohtsuka，E.and，D.(1993)Biochemistry，32：3836-3841)。因此，如果修饰的tRNA是体外合成而无翻译后修饰，则“劫持的”有义密码子的选择性可能是高的。

GM-CSF含有5个Phe残基：Phe48、Phe104、Phe107、Phe114以及Phe120。构建仅具有TTT编码的Phe120的基因(图26)，并将其克隆至pYD317。利用该TTC至TTT密码子交换的GM-CSF质粒DNA，并入实验含有8mM谷氨酸镁、10mM谷氨酸铵、130mM谷氨酸钾、35mM丙酮酸钠、GMP、UMP和CMP每种各0.86mM、1.2mM AMP、2mM氨基酸(酪氨酸1mM，并且苯丙氨酸除外)、4mM草酸钠、1mM腐胺、1.5mM亚精胺、15mM磷酸钾、100nM T7 RNA聚合酶、20nM DNA模板、10μM大肠杆菌DsbC以及24％(v/v)IAM处理的无细胞提取物，所述提取物含有约80％装载的20μM将其添加于无细胞反应中，浓度应当能提供足够过量的以确保在位置120特异性并入pAF。除了改变添加于无细胞反应中的的浓度和反应时间外，不将苯丙氨酸添加于无细胞反应中，以便降低去乙酰化的再装载，如图25中的粗灰线所示。还检测了添加0.5nM Phe-SA抑制剂对交叉装载的限制。将无细胞反应物在30℃孵育至4小时。利用反相HPLC(ZORBAX 300SB-C8 5μm，4.6×250mm，Agilent)以及梯度洗脱(缓冲液A：100mM三乙基乙酸铵(pH 7.0)；缓冲液B：70％乙腈、100mM三乙基乙酸铵(pH 7.0))，纯化存在时无细胞反应的产物，并如图27所示在280nm下进行监测。通过质谱仪分析样品。未修饰的GM-CSF的质量为14604Da。

实施例13.获得模板

本发明需要使用用于无细胞蛋白合成反应的核酸模板。下文提供了产生模板的实例，所述模板具有基于期望的多肽内的非天然氨基酸置入而构建的密码子序列。

人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(hGMCSF)的氨基酸序列从ResearchCollaboratory for Structural Bioinformatics(RCSB)的蛋白数据库(PDB)获得。从头合成编码hGMCSF蛋白的结构DNA基因(DNA 2.0，Menlo Park，CA)，其中除第二个谷氨酰胺残基外所有谷氨酰胺残基都由第一密码子CAA编码。来自蛋白N末端的第二谷氨酰胺由密码子CAG编码。该基因的侧翼为T7启动子和终止子，并且该基因被插入含有大肠杆菌复制起点和卡那霉素抗性基因的质粒载体。按照以下制备环状质粒DNA模板：转化大肠杆菌的XLl Blue(Stratagene，La Jolla，CA)菌株，使培养物于37℃过夜生长，并利用纯化试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化DNA。

实施例14.产生用于体外蛋白合成的裂解物

必须产生能用于表达含有非天然氨基酸的蛋白的裂解物。本实施例说明从大肠杆菌产生裂解物，所述大肠杆菌是经过修饰的，其表达的天然氨酰tRNA合成酶具有6×his标签，如随后的实施例所述，该标签是用于去除所述合成酶的。

首先修饰大肠杆菌A19ΔendAΔtonAΔspeAΔtnaAΔsdaAΔsdaBΔgshAΔgorTrxBHAmet⁺，使得编码6×his标签的DNA片段被添加于大肠杆菌染色体中Gln-RS的C末端。另外，将适当工程化Gln-RS在组成型启动子的控制下插入染色体，所述Gln-RS仅能装载第一同功Gln-tRNA，而不装载第二同功Gln-tRNA。

然后使大肠杆菌细胞在10L Braun Biostat C发酵罐中生长。使细胞在2YPTG培养基上分批生长，pH控制在pH 7.0。在生长速率大于3.2OD(595)下每小时0.7时，收获细胞。通过于4℃、6000g离心25分钟使细胞与培养基分离，并将所得细胞团贮存于-80℃。于4℃下、S30缓冲液(10mM TRIS乙酸(pH 8.2)(Sigma-Aldrich Corp.St.Louis，MO)、14mM乙酸镁(Sigma-Aldrich)以及60mM乙酸钾(Sigma-Aldrich))中以每1g湿细胞团1mL缓冲液的比例，使细胞团解冻。使重悬的细胞通过高压匀浆器(Emulsiflex C-50，Avestin Inc.，Ottawa，Ontario，Canada)。将压力降设置为20000psi。随后将匀浆的混合物于4℃、30000g离心30分钟。该程序重复2次，并且保留两次的上清液。于37℃将混合物在旋转振荡器中孵育80分钟。孵育后，利用切线流过滤、于4℃下、用10倍体积的S30缓冲液使提取物透析穿过5000MWCO膜(Millipore，Billerica，MA)。

实施例15.内源氨酰tRNA合成酶的去除

本发明需要将内源氨酰tRNA合成酶失活。失活的目的是防止本应正常装载非天然氨基酸的未装载的同功tRNA被天然氨基酸错误地氨酰化。

通过利用基因组DNA的靶向同源重组，失活或“敲除”tRNA合成酶核酸序列或其启动子(例如，参阅Smithies et al.，Nature 317：230-234(1985)；Thomas and Capecchi，Cell 51：503-512(1987)；Zhang et al，NatureBiotech 18：1314-1318(2000))，能够减少内源tRNA合成酶表达。例如，可以使用突变体转化表达内源tRNA合成酶的细胞，所述突变体是非功能性tRNA合成酶(或完全无关的DNA序列)，其侧翼是与内源tRNA合成酶同源的DNA(丝氨酰tRNA合成酶的编码区或调节区)，所述突变体可以具有或不具有选择标记和/或阴性选择标记。通过靶向同源重组插入DNA构建体会导致tRNA合成酶的失活。

如上文所述，靶向同源重组可用于将包含突变标记tRNA合成酶的DNA构建体插入细胞。在另一实施方案中，靶向同源重组可用于插入包含编码tRNA合成酶多肽变体的核酸的DNA构建体，所述tRNA合成酶多肽变体不同于细胞中存在的tRNA合成酶多肽。

可选地，通过靶向于与tRNA合成酶基因的调节区(即启动子和/或增强子)互补的脱氧核糖核苷酸序列来形成防止tRNA合成酶在靶细胞中转录的三螺旋结构，能够减少内源tRNA合成酶表达。

如上文所述，在添加模板DNA之前，在用碘乙酰胺预处理过程中添加微摩尔浓度的5’-O-[N-(苯丙氨酰)氨磺酰]腺苷，可以使上文的大肠杆菌提取物中的内源氨酰tRNA合成酶失活。

为了除去实施例2所述的染色体整合的天然6×his标签tRNA合成酶，在使用将一定体积的适当工程化的S30提取物与不同体积的预平衡的Ni-NTA磁珠(20mM Tris-HCl、0.1M NaCl、pH 7.5)前于4℃孵育30分钟。在借助于磁选仪除去珠后，将剩余的提取物用于蛋白合成。

实施例16.氨酰tRNA合成酶的重组表达：载体、酶表达和纯化

单独的tRNA装载反应需要使用氨酰tRNA合成酶来氨酰化同功tRNA分子。可以如本实施例所述通过表达重组合成酶而获得该合成酶。

利用表2所示的正向和反向引物，从大肠杆菌基因组DNA(ATCC#10798D-5)PCR扩增大肠杆菌gln-tRNA合成酶的结构基因。接着，在用NdeI和HindIII双消化后，将PCR产物克隆到pET23b载体(Novagen，Gibbstown，NJ)而产生质粒pET23b-GlnRSH(添加组氨酸标签)和pET23b-GlnRS。所得的质粒含有带有或不带有6×组氨酸标签的、受T7启动子控制的Gln-RS序列，用于过表达。

表2.用于构建每种表达载体的引物

限制性位点的序列标有下划线。终止密码子以粗体字母表示。

将GlnRS超生产质粒(pET23b-GlnRSH)转化至化学感受态BL-21细胞(Promega；Madison，WI)，并接种于LB/羧苄青霉素平板上。使单个菌落在TB/100μg/mL羧苄青霉素中生长过夜，并以1∶50稀释接种大培养物。使细胞在富集培养基中、于37℃下生长至对数中期，然后用1mM IPTG诱导5小时。在4℃下进行所有随后的纯化步骤。如下制备粗细胞提取物：5000g离心，随后高压下进行细胞裂解。将提取物与5mL已经在裂解缓冲液中预平衡的Ni-NTA树脂混合。将蛋白在冰上孵育1小时以允许蛋白与树脂结合后，将该混合物倒入10mL柱。用洗涤缓冲液(50mM磷酸钾(pH 6.0)、300mM NaCl、10mMβ-巯基乙醇、10％甘油)除去弱结合的蛋白，直到洗脱液的A₂₈₀降至0.1以下。用洗涤缓冲液中0-0.5M咪唑的梯度洗脱蛋白。将通过活性或SDS-PAGE鉴定出的峰流分收集在一起，并于4℃下用缓冲液透析过夜，所述缓冲液含有50mM磷酸钾(pH7.0)、100mM KCl以及10mMβ-巯基乙醇。随后将蛋白浓缩成40％甘油中10mg/mL的终浓度，然后贮存于-20℃。

实施例17.工程化氨酰tRNA合成酶变体

非天然氨基酸通常不能由天然存在的氨酰tRNA合成酶装载于同功有义tRNA分子。在某些情况下，之前可能存在“混杂”氨酰tRNA合成酶，其能用非天然氨基酸装载同功tRNA。在不存在具有该能力的氨酰tRNA合成酶的其它的情况下，必须工程化新的氨酰tRNA合成酶，使得在单独的tRNA装载反应中，能将期望的非天然氨基酸装载到tRNA分子。

利用Pymol分子检查软件鉴定出了已知参与底物识别的热稳定tRNA合成酶的活性位点残基。鉴定出氨基酸侧链内的残基。如下构建对应于鉴定的残基的定点变体的2×20个氨基酸＝400个成员的“文库”。利用NNK(其中N＝G、A、T、C，且K＝G或T三磷酸核苷)，合成35聚体寡核苷酸的盒文库，所述寡核苷酸表示编码密码子每侧的氨基酸的有义或反义链(Operon，Huntsville，AL)。利用速变多点诱变方案(QuickchangeMultisite mutagenesis protocol，Stratagene，La Jolla，CA)，使收集的寡聚体退火至模板DNA，通过DNA聚合酶进行扩增，用Dpn1降解质粒模板，转化并接种文库。对96个克隆进行测序，以证实文库的多样性。

实施例18.筛选用于非天然tRNA装载的氨酰tRNA合成酶变体

按照下述，以96孔模式进行实施例5所述工程化变体的高通量表达。用无菌牙签将接种的菌落转移至96孔深孔板，使其在富集培养基中生长至OD₆₀₀＝0.5，随后用1mM IPTG诱导并过夜生长。利用MilliporeMultiscreen过滤板(Millipore Corp.)，以96孔模式进行纯化。收获并裂解细胞，将裂解物用4倍体积的PBS缓冲液稀释裂解物，并取200μL上样至Multiscreen平板中的螯合Ni的琼脂糖培养基。利用浓度渐增的咪唑优化酶洗脱液。通过真空过滤将滤出液进行过滤，产生高产量的纯重组蛋白。

利用放射性标记的非天然氨基酸，通过不连续稳态测定来检测每种变体的酶活性，该测定监测37℃下、50mM Tris-HCl(或Hepes)(pH 7.5)、20mM KCl、4mM DTT、10mM MgCl₂、0.2mg/ml牛血清白蛋白以及一系列氨基酸、ATP和tRNA浓度中的[³H]标记的nnAA-tRNA^nnAA的形成。用酶浓度将所述活性标准化，所述酶浓度是通过利用测量释放的焦磷酸的酶偶联测定的荧光独立测定的。

实施例19.非天然氨基酸的合成

GalNAc L-苏氨酸是非天然氨基酸的实例，其合成自商购获得的GalNAc L-苏氨酸(N-Fmoc-O-(2-乙酰氨基-3，4，6-三-O-乙酰基-2-脱氧-α-D-半乳吡喃糖基)-L-苏氨酸)(V-Labs，Inc.，Covington，LA)。如下进行合成：用二氯甲烷中的哌啶使Fmoc基团选择性去保护而产生游离的氨基酸，随后用脂酶WG将碳水化合物乙酸酯选择性酶水解(利用反相HPLC纯化样品)。

实施例20.tRNA装载反应

本发明需要在单独于蛋白合成反应的装载反应中，用天然氨基酸或非天然氨基酸装载同功有义tRNA。

设计tRNA合成DNA寡核苷酸(Integrated DNA Technologies，Inc.，Coralville，IA)，使得对应于序列5′末端的有义链具有与3’反义链的10-bp重叠。用于构建大肠杆菌tRNA2 Gln基因的寡核苷酸是：

5′-AATTCCTGCAGGGGGGTATCGCCAAGCGGTAAGGCACCGG-3′(SEQ ID NO：5)；

5′-mTmGGCTGGGGTACGAGATTCGAACCTCGGAATGCCGGAATCAGAATCCGGTGCCTT-3′(SEQ ID NO：6)，其中mT和mG表示5′-O-甲基核苷酸，有下划线的部分表示重叠区，粗体表示T7 RNA聚合酶启动子。在反应溶液中将寡核苷酸混合至4mM的等摩尔浓度，所述反应溶液含有400mM dNTP、10mM Tris-HCl(pH 7.5)、10mM MgSO₄、7.5mM DTT以及50U/mL Klenow片段聚合酶(Promega)。使混合物在10℃和37℃间、以30秒为间隔、循环8个循环，之后，使DNA在65％乙醇/0.3M乙酸钠中沉淀，成团，并重悬于100mL PMS缓冲液(5mM PIPES(pH7.5)/10mM MgSO₄)中。在含有以下的溶液中进行转录：250mMHEPES-KOH(pH 7.5)、30mM MgCl₂、2mM亚精胺、40mM DTT、0.1mg/mL牛血清白蛋白、5mM dNTP、5mg无机焦磷酸酶(BoeringerMannheim)、50U RNasin(Amersham)、40mg/mL T7 RNA聚合酶以及来自Klenow延伸反应的1mM DNA模板。将2mL反应混合物在37℃下孵育8-10小时，然后添加10U/mL的无RQ1 RNA酶的DNA酶(Promega)，继续孵育2-3小时。然后将反应物上样于5mL的DE-52柱上(Whatman)，该柱用100mM HEPES-KOH(pH 7.5)、12mM MgCl₂以及200mM NaCl进行了预平衡。用30mL平衡缓冲液洗涤柱，并用含100mM HEPES-KOH(pH 7.5)、12mM MgCl₂、600mM NaCl的溶液洗脱RNA。将含有tRNA的流分透析到PMS缓冲液中，并通过加热至70℃随后缓慢冷却至室温进行再折叠。

GalNAc L-Gln-tRNA2：按下述，由重组aaRS催化装载的GalNAcL-Gln-tRNA2的形成。典型的反应混合物含有50mM Tris-HCl(或Hepes)(pH 7.5)、20mM KCl、4mM DTT、10mM MgCl₂、0.2mg/ml牛血清白蛋白、1-5nM aaRS以及一系列氨基酸、ATP和tRNA浓度。通过之前所述的固定的Ef-Tu色谱可以纯化已装载的tRNA。用于该装载反应的重组aaRS描述于Ran et al，J.Am.Chem.Soc.126：15654-55(2004)。

实施例21.体外蛋白合成反应

无细胞蛋白合成反应含有表3所总结的试剂，以及如实施例2所述产生的并随后如实施例3所述去除天然氨酰tRNA合成酶的大肠杆菌裂解物。

表3.添加于无细胞蛋白表达体系的试剂总结

试剂	浓度
		谷氨酸镁	8mM
谷氨酸铵	10mM
		谷氨酸钾	130mM
AMP	1.20mM
		GMP	0.86mM
UMP	0.86mM
		CMP	0.86mM
20AA	2mM
		GalNAc L-Gln-tRNA2	2mM
丙酮酸	30mM
		NAD	3.3mM
CoA	2.7mM
		草酸	4mM
亚精胺	1.5mM
		腐胺	1mM
T7 RNA聚合酶	0.10mg/ml
		质粒	0.0133mg/ml
大肠杆菌DsbC	75μg/ml
		大肠杆菌提取物	6/25总反应体积

用100μM碘乙酰胺于21℃将提取物预处理30分钟。质粒含有编码靶蛋白的结构基因，并如上文所述进行构建。GalNAc L-Gln-tRNA2是如上文所述装载的tRNA。将1mL反应混合物铺于皮式培养皿(ThermoFisher Scientific，Rochester，NY)的底部，并于30℃在密封的湿润培养箱中孵育4小时。

Claims (35)

1.利用无细胞合成体系，将非天然氨基酸引入多肽的预选位置的体外方法，所述方法包括：

a)获得包含简并有义密码子的核酸模板，其中第一有义密码子和第二有义密码子对应于相同的天然氨基酸，但它们各自的核苷酸序列不同；

b)产生细胞裂解物；

c)去除氨酰化所述天然氨基酸的天然氨酰tRNA合成酶；

d)向所述裂解物添加第一外源氨酰tRNA合成酶，所述第一外源氨酰tRNA合成酶选择性地氨酰化第一同功有义tRNA，所述第一同功有义tRNA对应于所述核酸模板的第一有义密码子；

e)向含有装载反应混合物的反应容器添加氨酰化催化试剂，所述装载反应混合物包含非天然氨基酸和第二同功有义tRNA，所述第二同功有义tRNA对应于所述核酸模板的第二有义密码子；

f)用所述非天然氨基酸氨酰化所述第二同功有义tRNA，从而产生tRNA:非天然氨基酸装载部分；

g)在适合从所述模板产生蛋白的条件下，使所述细胞裂解物与以下混合：

1)所述tRNA:非天然氨基酸装载部分，和

2)包含所述第一和第二有义密码子的核酸模板；以及

h)允许反应进行，从而产生在对应于所述核酸模板的第二有义密码子的那些位置处携带非天然氨基酸的多肽。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述氨酰化催化试剂是氨酰tRNA合成酶。

3.如权利要求2所述的方法，其中在将所述tRNA:非天然氨基酸装载部分与所述细胞裂解物混合之前，从所述装载反应混合物中除去所述氨酰tRNA合成酶。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述氨酰化催化试剂是核酶。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞提取物的氧化磷酸化体系在蛋白合成过程中发挥功能。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞裂解物来自细菌。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞裂解物来自大肠杆菌(Escherichia coli)。

8.如权利要求1所述的方法，其中所述非天然氨基酸选自乙二醇修饰的氨基酸、金属结合的氨基酸、含有芳基叠氮化物的氨基酸以及含有酮的氨基酸。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞裂解物来自兔网状细胞。

10.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞裂解物中去除了精氨酸脱羧酶。

11.如权利要求1所述的方法，还包括以下步骤：

a)用基因转化产生所述细胞裂解物的细胞，其中所述基因可表达与捕获部分融合的氨酰tRNA合成酶，所述氨酰tRNA合成酶能在功能上替代所述天然氨酰tRNA合成酶；

b)改变所述细胞来抑制所述天然氨酰tRNA合成酶基因的表达；以及

c)去除所述细胞裂解物中的与所述捕获部分融合的氨酰tRNA合成酶。

12.如权利要求11所述的方法，其中与捕获部分融合的氨酰tRNA合成酶对于形成所述细胞裂解物的细胞而言是异源的。

13.如权利要求11所述的方法，还包括以下步骤：通过亲和色谱去除与捕获部分融合的氨酰tRNA合成酶。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述亲和色谱是免疫亲和色谱。

15.如权利要求11所述的方法，其中通过免疫沉淀去除与捕获部分融合的氨酰tRNA合成酶，所述免疫沉淀利用识别所述捕获部分的抗体。

16.如权利要求1所述的方法，还包括以下步骤：

a)用基因转化用于产生所述细胞裂解物的细胞，其中所述基因表达能在功能上替代所述天然氨酰tRNA合成酶的、不稳定的重组氨酰tRNA合成酶；

b)改变所述细胞来抑制所述天然氨酰tRNA合成酶基因的表达；以及

c)去除所述细胞裂解物中的不稳定的重组氨酰tRNA合成酶。

17.如权利要求16所述方法，其中所述重组氨酰tRNA合成酶是热不稳定的。

18.如权利要求1所述的方法，还包括以下步骤：

a)用第一和第二基因转化用于产生所述细胞裂解物的细胞，其中所述第一基因表达第一外源氨酰tRNA合成酶，所述第二基因表达第二外源氨酰tRNA合成酶；

b)改变所述细胞来抑制所述天然氨酰tRNA合成酶的表达；以及

c)去除所述细胞裂解物中的所述第二外源氨酰tRNA合成酶。

19.如权利要求18所述的方法，其中所述第一外源氨酰tRNA合成酶和所述第二外源氨酰tRNA合成酶来自嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)。

20.如权利要求18所述的方法，其中所述第二外源氨酰tRNA合成酶是不稳定的。

21.如权利要求20所述的方法，其中所述第二外源氨酰tRNA合成酶是热不稳定的。

22.如权利要求18所述的方法，其中所述第二外源氨酰tRNA合成酶与捕获部分融合，并通过亲和色谱去除所述第二外源氨酰tRNA合成酶。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述亲和色谱是免疫亲和色谱。

24.如权利要求18所述的方法，其中所述第二外源氨酰tRNA合成酶与捕获部分融合，并通过免疫沉淀去除所述第二外源氨酰tRNA合成酶，所述免疫沉淀利用特异性识别所述捕获部分的抗体。

25.如权利要求18所述的方法，其中通过免疫亲和色谱去除所述第二外源氨酰tRNA合成酶，所述免疫亲和色谱利用特异性识别所述第二外源氨酰tRNA合成酶的抗体。

26.如权利要求18所述的方法，其中通过免疫沉淀去除所述第二外源氨酰tRNA合成酶，所述免疫沉淀利用特异性识别所述第二外源氨酰tRNA合成酶的抗体。

27.如权利要求18所述的方法，其中通过引入对所述第二外源氨酰tRNA合成酶具有特异性的氨酰tRNA合成酶抑制剂来去除所述细胞裂解物中的所述第二外源氨酰tRNA合成酶。

28.如权利要求1所述的方法，其中通过免疫沉淀去除所述细胞裂解物中的所述天然氨酰tRNA合成酶，所述免疫沉淀利用特异性识别所述天然氨酰tRNA合成酶的抗体。

29.如权利要求1所述的方法，其中通过免疫亲和色谱去除所述细胞裂解物中的所述天然氨酰tRNA合成酶，所述免疫亲和色谱利用特异性识别所述天然氨酰tRNA合成酶的抗体。

30.如权利要求1所述的方法，其中通过引入对所述天然氨酰tRNA合成酶具有特异性的氨酰tRNA合成酶抑制剂来去除所述细胞裂解物中的天然氨酰tRNA合成酶。

31.如权利要求1所述的方法，其中在裂解前，用编码所述第一外源氨酰tRNA合成酶的基因转化所述细胞，从而将选择性地识别所述第一同功有义tRNA的所述第一外源氨酰tRNA合成酶添加于所述裂解物。

32.利用无细胞合成体系，将非天然氨基酸引入多肽的预选位置的体外方法，所述方法包括：

a)获得包含简并有义密码子的核酸模板，其中第一有义密码子和第二有义密码子对应于相同的天然氨基酸但是它们各自的核苷酸序列不同；

b)产生含有天然氨酰tRNA合成酶的细胞裂解物，所述合成酶能氨酰化第一同功有义tRNA和第二同功有义tRNA，所述第一同功有义tRNA对应于核酸模板的第一有义密码子，所述第二同功有义tRNA对应于核酸模板的第二有义密码子；

c)使对应于核酸模板的第二有义密码子的天然第二同功有义tRNA失活；

d)向含有装载反应混合物的反应容器添加氨酰化催化试剂，所述装载反应混合物包含非天然氨基酸和对应于核酸模板的第二有义密码子的第二同功有义tRNA；

e)用非天然氨基酸氨酰化第二同功有义tRNA，从而产生tRNA:非天然氨基酸装载部分；

f)在适于从模板产生蛋白的条件下，使细胞裂解物与以下混合：

1)tRNA:非天然氨基酸装载部分，和

2)包含第一和第二有义密码子的核酸模板；以及

g)允许反应进行，从而产生在对应于核酸模板的第二有义密码子的那些位置处携带非天然氨基酸的多肽。

33.如权利要求32所述的方法，其中通过添加与所述天然第二同功有义tRNA选择性地结合的反义DNA而使所述天然第二同功有义tRNA失活。

34.如权利要求32所述的方法，其中通过添加选择性地切割所述天然第二同功有义tRNA的特异性tRNA核糖核酸酶或其活性片段而使所述天然第二同功有义tRNA失活。

35.如权利要求32所述的方法，其中通过添加大肠杆菌素D或大肠杆菌素D的活性片段而使所述天然第二同功有义tRNA失活。