CN112739823A

CN112739823A - 吡咯赖氨酰-tRNA合成酶

Info

Publication number: CN112739823A
Application number: CN201980056281.3A
Authority: CN
Inventors: 坂本健作; 山口纯; 木村史枝; 横山茂之; 柳泽达男; 关英子; 仓谷光央
Original assignee: NATIONAL RESEARCH AND DEVELOPMENT CORP
Current assignee: NATIONAL RESEARCH AND DEVELOPMENT CORP; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 2018-08-31
Filing date: 2019-08-30
Publication date: 2021-04-30
Also published as: EP3845661A1; JPWO2020045656A1; TW202024332A; US20210324363A1; WO2020045656A1; EP3845661A4

Abstract

提供有效的含非天然氨基酸的多肽的制作方法、向多肽引入非天然氨基酸的方法、结合了非天然氨基酸的tRNA的制作方法、非天然氨基酸引入系统、或使用于此类的材料。一种含非天然氨基酸的多肽的制作方法,其包括使Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS和非天然氨基酸接触的工序,且包括选自以下工序(a)和工序(b)的引入工序,工序(a)：与利用使用了马氏甲烷八叠球菌的PylRS(MmPylRS)的无细胞蛋白质合成系统的情况相比,以更高的效率向多肽引入非天然氨基酸；工序(b)：与利用使用了具有受glmS启动子控制的所述PylRS基因的载体的大肠杆菌蛋白质合成系统的情况,以及,使用了具有受glnS启动子控制的所述PylRS基因的载体的大肠杆菌蛋白质合成系统的情况相比,以更高的效率向多肽引入非天然氨基酸。

Description

吡咯赖氨酰-tRNA合成酶

技术领域

本发明涉及一种使用了吡咯赖氨酰(pyrrolysyl)-tRNA合成酶的含非天然氨基酸的多肽的制作方法。

背景技术

氨基酰tRNA合成酶(aaRS)是参与蛋白质合成的酶。具体而言,已知可使氨基酸与tRNA形成酯键从而具有合成氨基酰tRNA的活性。氨基酰tRNA是一种分子参与在核糖体构成蛋白质的肽链的伸长。使用吡咯赖氨酰-tRNA合成酶(PylRS),一种氨基酰tRNA合成酶进行将非天然氨基酸引入蛋白质的研究。例如,专利文献1公开了通过使用马氏甲烷八叠球菌(M.mazei)的PylRS(MmPylRS),将赖氨酸衍生物的α-羟酸衍生物引入蛋白质。专利文献2公开了通过使用MmPylRS的变异体,将赖氨酸衍生物引入蛋白质。专利文献3公开了通过使用MmPylRS的变异体,将抗体引入ZLys衍生物。并且在该文献还公开了利用点击化学制作了ZLys衍生物引入抗体的化学修饰体。

非专利文献1公开了PylRS的N末端结构域是in vivo活性所必须的。非专利文献2公开了PylRS的N末端结构域与tRNA的结合。非专利文献3公开了PylRS的N末端结构域和tRNA的相互作用。

非专利文献4公开了MmPylRS具有N末端结构域,相反,Methanomethylophilusalvus(M.alvus)的PylRS(MaPylRS)不具有N末端结构域。且公开了通过使用了MaPylRS的大肠杆菌蛋白质合成系统将非天然氨基酸引入蛋白质。

现有技术文献

专利文献

【专利文献1】国际公开2009/066761

【专利文献2】国际公开2009/038195

【专利文献3】国际公开2017/030156

【非专利文献】

【非专利文献1】"The amino-terminal domain of pyrrolysyl-tRNA synthetaseis dispensable in vitro but required for in vivo activity."Herring et al.,FEBS Lett.2007Jul10；581(17):3197-203.

【非专利文献2】"PylSn and the Homologous N-terminal Domain ofPyrrolysyl-tRNA Synthetase Bind the tRNA That Is Essential for the GeneticEncoding of Pyrrolysine"Jiang et al.,J Biol Chem.2012Sep 21；287(39):32738-32746.

【非专利文献3】"Crystal structures reveal an elusive functional domainof pyrrolysyl-tRNA synthetase."Suzuki et al.,Nat Chem Biol.2017Dec；13(12):1261-1266.

【非专利文献4】"Mutually orthogonal pyrrolysyl-tRNA synthetase/tRNApairs."Willis et al.,Nat Chem.2018May 28.doi:10.1038/s41557-018-0052-5.[Epubahead of print]

发明内容

发明要解决的课题上述非专利文献4公开了即使使用不具有N末端结构域的MaPylRS时也可引入非天然氨基酸,但非专利文献4的大肠杆菌蛋白质合成系统中,非天然氨基酸的引入效率的高度并不充分。

上述非专利文献4公开了有无引入非天然氨基酸的正交性实验、非天然氨基酸的选择性实验、引入1个多肽不同的非天然氨基酸的实验。相反,与MmPylRS相比较,并没有公开能显著提高引入效率的方法。应予说明,作为表达MmPylRS的启动子使用了glmS启动子(非高表达启动子)。

另一方面,本发明人尝试了使用MmPylRS通过无细胞蛋白质合成系统将非天然氨基酸引入蛋白质。然而得知,为了使用于无细胞蛋白质合成系统而提取了MmPylRS的结果,其浓缩极限为4mg/mL以下,无法使用比此更高浓度使用MmPylRS(实验例1、实施例2、3)。其结果为,无法提高非天然氨基酸的引入效率。

本发明人还尝试了使用MmPylRS通过大肠杆菌蛋白质合成系统将非天然氨基酸引入蛋白质。此时,使用高表达启动子使MmPylRS实现了高表达。然而得知,非天然氨基酸的引入效率低(实施例9)。还得知大肠杆菌的增值恶化。由此可知,在使用MmPylRS的大肠杆菌蛋白质合成系统中,不适合使PylRS高表达。

本发明鉴于这种情况,以提供有效的含非天然氨基酸的多肽的制作方法、向多肽引入非天然氨基酸的方法、结合了非天然氨基酸的tRNA的制作方法、非天然氨基酸引入系统、或使用于此类的材料为目的。

解决课题的手段如后述的实施例,本发明人首次提取纯化了MaPylRS。进一步,浓缩了MaPylRS溶液时,MaPylRS的浓缩极限显著得高,从而得知可制备高浓度的MaPylRS溶液(实施例1、3)。此MaPylRS的浓缩极限为MmPylRS的浓缩极限的5倍以上,超出了预期。

还尝试使用高浓度的MaPylRS溶液,通过无细胞蛋白质合成系统将非天然氨基酸引入蛋白质(实施例3、6)。其结果为,非天然氨基酸的引入效率显著高于MmPylRS而超出了预期。

还尝试以点击化学使引入至Fab抗体的TCO*-Lys和荧光基板进行反应(实施例8)。其结果为,出人意料的是,结合反应仅在10分钟内几乎完成。由于蛋白质具有不稳定的性质,在短时间内完成反应的能力是一个划时代的结果。

还尝试通过使用具有受控于强启动子的MaPylRS基因的载体的大肠杆菌蛋白质合成系统,将非天然氨基酸引入于蛋白质(实施例9～12)。其结果为,非天然氨基酸的引入效率显著高于MmPylRS而超出了预期。

即,根据本发明的一个实施方式,可提供一种制作方法,其为包括了使Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS和非天然氨基酸接触的工序的含非天然氨基酸的多肽的制作方法,且包括选自以下工序(a)和工序(b)的引入工序:工序(a)：与利用使用了MmPylRS的无细胞蛋白质合成系统的情况相比,,以更高的效率向多肽引入非天然氨基酸；工序(b)：与利用使用了具有受glmS启动子控制的所述PylRS基因的载体的大肠杆菌蛋白质合成系统的情况,以及,使用了具有受glnS启动子控制的所述PylRS基因的载体的大肠杆菌蛋白质合成系统的情况相比,以更高的效率向多肽引入非天然氨基酸。使用该制作方法可有效制作含非天然氨基酸的多肽。应予说明,glmS启动子以及glnS启动子(Plumbridge and Soll,Biochimie.1987May；69(5):539-41.)为不适用于高表达启动子的启动子(非高表达启动子)。

根据本发明的一个实施方式,可提供一种引入方法,其包括使Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS和非天然氨基酸接触的工序,向多肽引入非天然氨基酸,且包括选自以下工序(a)和工序(b)的引入工序:工序(a)：与利用使用了MmPylRS的无细胞蛋白质合成系统的情况相比,以更高的效率向多肽引入非天然氨基酸；工序(b)：与利用使用了具有受glmS启动子控制的所述PylRS基因的载体的大肠杆菌蛋白质合成系统的情况,以及,使用了具有受glnS启动子控制的所述PylRS基因的载体的大肠杆菌蛋白质合成系统的情况相比,以更高的效率向多肽引入非天然氨基酸。使用该引入方法可向多肽有效引入非天然氨基酸。

根据本发明的一个实施方式,可提供一种非天然氨基酸引入系统,其含有高浓度的Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS。使用该非天然氨基酸引入系统,可有效制作含非天然氨基酸的多肽。

根据本发明的一个实施方式,可提供一种无细胞蛋白质合成系统的反应溶液,其含有Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS。使用该反应溶液,可有效制作含非天然氨基酸的多肽。

根据本发明的一个实施方式,可提供一种含非天然氨基酸的多肽的制作方法,其包括使Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS和非天然氨基酸在细胞外接触的工序。使用该制作方法,可有效生产含非天然氨基酸的多肽。

根据本发明的一个实施方式,可提供一种向多肽引入非天然氨基酸的方法,其包括使Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS和非天然氨基酸在细胞外接触的工序。使用该引入方法,可向多肽有效引入非天然氨基酸。

根据本发明的一个实施方式,可提供一种结合了非天然氨基酸的tRNA的制作方法,其包括使Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS和非天然氨基酸、tRNA在细胞外接触的工序。使用该制作方法,可有效制作结合了非天然氨基酸的tRNA。

根据本发明的一个实施方式,可提供一种纯化的Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS。使用该PylRS,可有效制作含非天然氨基酸的多肽。

根据本发明的一个实施方式,可提供一种溶液,其含有5mg/mL以上的Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS。使用该溶液,可有效制作含非天然氨基酸的多肽。

根据本发明的一个实施方式,可提供一种多核苷酸,其编码Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS和高表达启动子。使用该多核苷酸,可有效制作含非天然氨基酸的多肽。

根据本发明的一个实施方式,可提供一种含非天然氨基酸的多肽的制作方法,其包括由活细胞高表达Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS的工序。使用该制作方法,可有效制作含非天然氨基酸的多肽。

附图说明

图1是例示Methanomethylophilus属或Methanomassiliicoccus属生物的系统发育树的图。

图2是表示使用Clustal Omega对M.alvus、M.barkeri、M.mazei的PylRS的氨基酸序列进行序列比对的结果的图。

图3是例示可引入于蛋白质的赖氨酸衍生物的图。

图4是表示在细胞蛋白质合成法中使用MaPylRS以及MmPylRS的非天然氨基酸引入蛋白质合成量的比较试验结果结果的图。

图5是表示在无细胞蛋白质合成法中MaPylRS的浓度依赖性的调查结果的图。

图6是表示晶体结构分析结果的图。

图7是表示MaPylRS变异体的活性的调查结果的图。

图8是表示引入了TCO*-Lys的PylRS浓度依赖性的调查结果的图。

图9是表示引入了pEtZLys或pAzZLys的PylRS浓度依赖性的调查结果的图。

图10是表示引入了ZLys的蛋白质的合成量的调查结果的图。

图11是表示引入了mAzZLys的蛋白质的合成量的调查结果的图。

图12是表示引入了TCO*-Lys的Fab抗体的合成量的图。

图13是表示通过点击化学使荧光基板结合于引入于Fab抗体的TCO*-Lys的结果的图。

图14是表示结合于TCO*-Lys的荧光基板的荧光强度的图。

图15是表示大肠杆菌表达系统中通过M.mazei、M.alvus、D.hafniense PylRS进行的非天然氨基酸的引入效率的比较试验结果的图。

图16是表示野生型GST-GFP融合蛋白质(3Ser)和琥珀变异GST-GFP融合蛋白质的分析结果的图。a:SDS-PAGE后进行CBB染色。b:胰蛋白酶消化生成物后进行MALDI-TOF MS分析。实测值和理论值所示于Table。

图17是表示大肠杆菌表达系统中使用MaPylRS将非天然氨基酸引入于蛋白质的特异位点的实验结果的图。

图18是表示大肠杆菌表达系统中使用MaPylRS变异体将ZLys系非天然氨基酸引入于蛋白质的特异位点的实验结果的图。

图19是表示小麦胚芽系无细胞蛋白质合成法中PylRS浓度依赖性的调查结果的图。

图20是表示人类系无细胞蛋白质合成法中PylRS浓度依赖性的图。

图21是表示AcLys的引入的调查结果的图。

图22是表示Phe衍生物的引入的调查结果的图。

图23是表示Tyr衍生物的引入的调查结果的图。

图24是表示无细胞蛋白质合成法中G1PylRS的活性的调查结果的图。

图25是表示使用G1PylRS、MaPylRS以及MaPylRS时蛋白质合成量的比较结果的图。

图26是表示无细胞蛋白质合成法中G1PylRS变异体的活性的调查结果的图。

图27是表示使用G1PylRS以及MaPylRS的变异体时蛋白质合成量的比较结果的图。

图28是表示无细胞蛋白质合成法中G1PylRS浓度依赖性的图。

图29是表示动物细胞中将mAzZLys引入于蛋白质的结果的图。

具体实施方式

以下,详细描述本发明的实施方式。应予说明,为了避免关于相同内容的重复,适当地省略了说明。

本发明的一个实施方式是新颖的含非天然氨基酸的多肽的制作方法。该制作方法包括一种工序,例如,使Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶(PylRS)和非天然氨基酸接触的工序。且优选包括选自以下工序(a)和工序(b)的引入工序:工序(a)：与利用使用了马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina mazeii)的PylRS(MmPylRS)的无细胞蛋白质合成系统的情况相比,以更高的效率向多肽引入非天然氨基酸；工序(b)：与利用使用了具有受glmS启动子控制的所述PylRS基因的载体的大肠杆菌蛋白质合成系统的情况,以及,使用了具有受glnS启动子控制的所述PylRS基因的载体的大肠杆菌蛋白质合成系统的情况相比,以更高的效率向多肽引入非天然氨基酸。此时,使用该制作方法可有效制作含非天然氨基酸的多肽。应予说明,glmS启动子以及glnS启动子为不适用于高表达启动子的启动子(非高表达启动子)。而且,相比于作为PylRS使用了MmPylRS的情况,本发明的一个实施方式中的引入工序包括高效率地向多肽引入非天然氨基酸的工序。相比于比较对象,本发明的一个实施方式中“高效率”的程度例如为1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2.0、5.0、10.0、20.0、30.0、或40.0倍,大于其中之一,或也可以是此处例示的任意2个数值之间的范围。

根据本发明的一个实施方式,可提供一种非天然氨基酸引入系统,其含有Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS。该非天然氨基酸引入系统从可向蛋白质有效引入非天然氨基酸的观点出发,优选含有高浓度的Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS。

根据本发明的一个实施方式,可提供一种无细胞蛋白质合成系统的反应溶液,其含有Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS。使用该反应溶液,可含有高浓度的PylRS,从而可有效制作含非天然氨基酸的多肽。

根据本发明的一个实施方式,可提供一种含非天然氨基酸的多肽的制作方法,其包括使Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS和非天然氨基酸在细胞外接触的工序。使用该制作方法,可通过使用无细胞蛋白质合成系统的反应溶液进行,该反应溶液可含有高浓度的PylRS,从而可有效生产含非天然氨基酸的多肽。

根据本发明的一个实施方式,可提供一种向多肽引入非天然氨基酸的方法,其包括使Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS和非天然氨基酸在细胞外接触的工序。使用该引入方法,可通过使用无细胞蛋白质合成系统的反应溶液进行,该反应溶液可含有高浓度的PylRS,从而可向多肽有效引入非天然氨基酸。

根据本发明的一个实施方式,可提供一种结合了非天然氨基酸的tRNA的制作方法,其包括使Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS和非天然氨基酸、tRNA在细胞外接触的工序。使用该制作方法,可通过使用无细胞蛋白质合成系统的反应溶液进行,从而可有效制作结合了非天然氨基酸的tRNA。

根据本发明的一个实施方式,可提供一种纯化的Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS。过浓缩含有该PylRS的溶液,可调节含有高浓度PylRS的溶液。将该溶液利用于无细胞蛋白质合成系统,从而可有效制作含非天然氨基酸的多肽。

根据本发明的一个实施方式,可提供一种溶液,其含有5mg/mL以上的Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS。该溶液优选含有5mg/mL以上的PylRS。此时,通过混合该溶液和含有非天然氨基酸或tRNA等的溶液,可制作无细胞蛋白质合成系统的反应溶液。通过将该溶液利用于无细胞蛋白质合成系统,可有效制作含非天然氨基酸的多肽。本发明的一个实施方式中的溶液可含有例如,缓冲液、NaCl、或还原剂。

本发明的一个实施方式,可提供一种向多肽引入非天然氨基酸的引入剂,其包括上述反应溶液或溶液。通过将该引入剂利用于无细胞蛋白质合成系统,可向多肽有效引入非天然氨基酸。

本发明的一个实施方式,可提供一种多核苷酸,其编码Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS。该多核苷酸优选编码高表达启动子。此时,通过将该多核苷酸利用于活细胞蛋白质合成系统,可有效制作含非天然氨基酸的多肽。多核苷酸含有载体。高表达启动子可位于PylRS的上游。高表达启动子连结为在多核苷酸内可控制PylRS的表达。

本发明的一个实施方式,是一种含非天然氨基酸的多肽的制作方法,其包括将上述多核苷酸引入于细胞的工序或从上述多核苷酸表达PylRS的工序。通过将该制作方法利用于活细胞蛋白质合成系统,可有效制作含非天然氨基酸的多肽。该制作方法可包括,例如,将多核苷酸连结于载体的工序、将编码tRNA的多核苷酸引入于细胞的工序、培养上述细胞的工序、评价PylRS的表达的工序、评价含非天然氨基酸的多肽的表达的工序、或纯化或提取含非天然氨基酸的多肽的工序。载体可以是例如,表达载体、环状载体、或质粒。

本发明的一个实施方式,是一种含有多核苷酸的细胞,该多核苷酸编码Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS和高表达启动子。通过将该细胞利用于活细胞蛋白质合成系统,可有效制作含非天然氨基酸的多肽。

本发明的一个实施方式,是一种向多肽引入非天然氨基酸的方法,其包括,向细胞引入上述多核苷酸的工序,或从上述多核苷酸表达PylRS的工序。通过将该制作方法利用于活细胞蛋白质合成系统,可向多肽有效引入非天然氨基酸。该引入方法可包括,例如,和上述制作方法包括的工序相同的工序。

本发明的一个实施方式,是一种向多肽引入非天然氨基酸的引入剂,其包括上述多核苷酸。通过将该引入剂利用于活细胞蛋白质合成系统,可向多肽有效引入非天然氨基酸。

本发明的一个实施方式,是一种结合了非天然氨基酸的tRNA的制作方法,其包括,向细胞引入请上述多核苷酸的工序,或从上述多核苷酸表达PylRS的工序。通过将该制作方法利用于活细胞蛋白质合成系统,可有效制作结合了非天然氨基酸的tRNA。该制作方法可包括,例如,将编码PylRS的多核苷酸引入于细胞的工序、培养上述细胞的工序、评价PylRS的表达的工序、评价tRNA的表达的工序、评价含非天然氨基酸的多肽的表达的工序、或纯化或提取含非天然氨基酸的多肽的工序。

本发明的一个实施方式,是一种含非天然氨基酸的多肽的制作方法,其包括由活细胞高表达Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS的工序。若将该制作方法利用于活细胞蛋白质合成系统,则可有效制作含非天然氨基酸的多肽。高表达工序可包括例如,通过高表达启动子使PylRS高表达的工序。

本发明的一个实施方式的制作方法或引入方法可以在含有PylRS的非天然氨基酸引入系统中实施。

本发明的一个实施方式的非天然氨基酸引入系统也可以是无细胞蛋白质合成系统的反应溶液。本发明的一个实施方式的反应溶液中的PylRS浓度例如为15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、或120μM、大于其中之一、或也可以是此处例示的任意2个数值之间的范围。从向蛋白质更有效引入非天然氨基酸的观点考虑,优选25μM以上、更优选50μM以上、最优选75μM以上。反应溶液可以是,编码与天然型的不同位点具有终止密码子的基因的多核苷酸、tRNA、或非天然氨基酸。编码与天然型在不同位点具有终止密码子的基因的多核苷酸的浓度可以是0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、或10.0mg/mL、大于其中之一、或也可以是此处例示的任意2个数值之间的范围。与天然型的不同位点包括对应于向多肽引入非天然氨基酸的引入位点的位置。与天然型的不同位点可以是对应于抗体的固定区域内的位置。tRNA的浓度可以是,1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、12.0、14.0、16.0、18.0、或20.0μM、大于其中之一、或也可以是此处例示的任意2个数值之间的范围。非天然氨基酸的浓度可以是,0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、或10.0mM、大于其中之一、或也可以是此处例示的任意2个数值之间的范围。反应溶液可包括LMCPY混合物-PEG-DTT、tRNA、醋酸镁、氨基酸混合物、肌酸激酶、RNA聚合酶、伴侣增强S30提取物、缓冲液、模板DNA、GSSG、DsbC、pH调节剂或水。这些的组分浓度可以是记载于后述表2的浓度±40、±30、±20、±10、或±5％以内。模板DNA可以是编码引入了氨基酸的目标蛋白质的碱基序列中包括无义密码子的核酸。本发明的一个实施方式中的无细胞蛋白质合成系统可利用,来源于大肠杆菌的无细胞蛋白质合成系统、来源于哺乳动物细胞的无细胞蛋白质合成系统、来源于昆虫细胞的无细胞蛋白质合成系统、来源于小麦胚芽的无细胞蛋白质合成系统、重构型无细胞蛋白质合成系统等。

本发明的一个实施方式的非天然氨基酸引入系统可以是活细胞蛋白质合成系统的细胞。本发明的一个实施方式的细胞可以含有编码PylRS和高表达启动子的多核苷酸。本发明的一个实施方式的高表达启动子包括高表达多肽(例如PylRS)的启动子。高表达启动子包括表达能力高于glmS启动子以及glmS启动子的启动子。控制PylRS的高表达启动子包括,T3、T5、T7、SP6等来源于噬菌体的高表达用启动子tac、trc、lac、lacUV5、araBAD、rhaBAD、SV40、CMV、CAG、SV40、EF-1α、TEF1、PGK1、HXT7、TPI1、TDH3、PYK1、ADH1、GAL1、GAL10、多角体、p10、金属硫蛋白(metallothionein)或Actin5C等高表达用启动子。高表达启动子,在大肠杆菌培养系中优选T3、T5、T7、SP6、tac、trc、lac、lacUV5、araBAD或rhaBAD,哺乳类细胞培养系中优选SV40、CMV、CAG、SV40或EF-1α,发芽酵母(S.cerevisiae)培养系中优选TEF1、PGK1、HXT7、TPI1、TDH3、PYK1、ADH1、GAL1或GAL10,裂变酵母(Schizosaccharomycespombe)培养系中优选CMV,昆虫细胞(例如,感染了杆状病毒的蛾的细胞)培养系中优选多角体或p10,昆虫细胞(例如,果蝇Drosophila S2细胞)培养系中优选金属硫蛋白或Actin 5C。控制tRNA高表达的启动子包括U6、H1、7SK、tRNA(Val)、tRNA(Arg)、tRNA(Tyr)、lpp或T5。该启动子,在哺乳类细胞培养系或昆虫细胞培养系中优选U6、H1、7SK、tRNA(Val)、tRNA(Arg)或tRNA(Tyr),在大肠杆菌培养系中优选pp或T5。本发明的一个实施方式的活细胞蛋白质合成系统可利用大肠杆菌等细菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母等。

本发明的一个实施方式的非天然氨基酸引入系统可适用于含有多个正交系的非天然氨基酸引入系统。

本发明的一个实施方式的反应溶液中PylRS浓度为高浓度是包括15μM以上的浓度。该浓度可以是15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、或120μM、大于其中之一、或也可以是此处例示的任意2个数值之间的范围。从向蛋白质更有效引入于非天然氨基酸的观点考虑,优选25μM以上、更优选50μM以上、最优选75μM以上。

本发明的一个实施方式的制作方法可以包括一种工序,该工序是通过混合含有5mg/mL以上的Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS的溶液和非天然氨基酸从而制备混合溶液。该混合溶液可含有高浓度的PylRS。通过将含有高浓度PylRS的混合溶液利用于无细胞蛋白质合成系统,可有效制作含非天然氨基酸的多肽。

本发明的一个实施方式的溶液中PylRS浓度为5mg/mL以上可以是5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、26、27、28、29、或30mg/mL、大于其中之一、或也可以是此处例示的任意2个数值之间的范围。上述5mg/mL以上在12.6mg/mL以上时,在高效率的无细胞蛋白质合成系统中的制备特别容易。从这个观点出发,优选12.6mg/mL以上、更优选15mg/mL以上、最优选20mg/mL以上。

本发明的一个实施方式中无细胞蛋白质合成系统包括:在含有为合成无细胞蛋白质而制备的大肠杆菌等细胞提取液的反应液,以高浓度添加表达了PylRS的细胞提取液、粗纯化的PylRS或纯化的PylRS的合成系统；由高浓度表达PylRS(为合成无细胞蛋白质而制作的)的大肠杆菌等制备的细胞提取液作为反应液使用的合成系统。

本发明的一个实施方式的含天然型氨基酸多肽包括与药物相结合的多肽。药物包括抗癌剂。

本发明的一个实施方式的PylRS包括具有将氨基酸结合于tRNA的活性的蛋白质。氨基酸包括吡咯赖氨酸或非天然氨基酸。本发明的一个实施方式的非天然氨基酸包括赖氨酸衍生物、酪氨酸衍生物、苯丙氨酸衍生物、色氨酸衍生物、精氨酸衍生物、蛋氨酸衍生物、亮氨酸衍生物、组氨酸衍生物、脯氨酸衍生物、半胱氨酸衍生物、苏氨酸衍生物、丝氨酸衍生物、丙氨酸衍生物、异亮氨酸衍生物、缬氨酸衍生物、谷氨酰胺衍生物、谷氨酸衍生物、天冬酰胺衍生物、天冬氨酸衍生物、甘氨酸衍生物、硒代半胱氨酸衍生物、吡咯烷衍生物、犬尿氨酸衍生物、鸟氨酸衍生物、瓜氨酸衍生物、刀豆氨酸衍生物、二氨基庚二酸、或其中之一的α-羟酸衍生物。PylRS没有特别指定时,包括天然型PylRS、变异型PylRS两者。

Methanomassiliicoccales目以及Thermoplasmatales目生物形成一个整体,且与M.mazei和M.barkeri等Methanosarcina属生物为远亲。序列比对Methanomassiliicoccales目以及Thermoplasmatales目生物的PylRS的氨基酸序列和M.barkeri或M.mazei的PylRS的氨基酸序列时,可具有N末端侧缺失氨基酸序列的结构。

本发明的一个实施方式的Methanomassiliicoccales目生物包括Methanomethylophilus属、Methanomassiliicoccus属、Methanoplasma属生物。而且Methanomassiliicoccales目生物可包括未分类属的生物。Methanomethylophilus属生物包括Methanomethylophilus alvus(M.

alvus)(WP_015505008)或Methanomethylophilus sp.1R26(WP_058747239)。

Methanomassiliicoccus属生物包括Methanomassiliicoccus luminyensis(WP_019176308)或Methanomassiliicoccus intestinalis(WP_020448777)。Methanoplasma属生物包括Methanoplasma termitum(WP_048111907)。未分类属的生物包括Methanomassiliicoccales archaeon RumEn M1(KQM11560)、Methanogenic archaeonISO4-H5(WP_066075773)或Methanogenic archaeon ISO4-G1(AMK13702)。应予说明,生物名称后的括号内表示PylRS的NCBI登录号。

本发明的一个实施方式的Thermoplasmatales目生物包括未分类的属的生物。作为未分类的属的生物，包括Thermoplasmatales archaeon BRNA1(WP_015492598)。

图1表示包括Methanomethylophilus属或Methanomassiliicoccus属生物的PylRS的系统发育树的一个例子。从向蛋白质更有效引入非天然氨基酸的观点考虑,生物优选M.alvus或Methanogenic archaeon ISO4-G1。Methanomethylophilus alvus通常标记为Candidatus Methanomethylophilus alvus。因此,本说明书中Methanomethylophilusalvus包括Candidatus Methanomethylophilus alvus。而且,关于其他生物(包括属、种),含有Candidatus的名称所对应的生物包括在未含有Candidatus的名称表示的生物。即,由Candidatus X表示的生物包括在由X表示的生物。

本发明的一个实施方式的MaPylRS,包括具有由序列号5表示的氨基酸序列的蛋白质。本发明的一个实施方式的G1PylRS,包括具有由序列号10表示的氨基酸序列的蛋白质。比对M.barkeri或M.mazei的古细菌具有的PylRS氨基酸序列时,MaPylRS以及G1PylRS具有N终端区域缺失的氨基酸序列。图2表示使用Clustal Omega进行序列比对的结果。封闭部分是推测为吡咯赖氨酸结合口袋的部分。本发明的一个实施方式的Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS的氨基酸序列可以是与MaPylRS的氨基酸序列相同性70％以上。该数值为70、75、80、85、90、95、97、98、99或100％、或也可以是此处例示的任意2个数值之间的范围。

本发明的一个实施方式的PylRS与M.barkeri或M.mazei的PylRS进行序列比对时,包括具有N末端侧至少缺失50个氨基酸的氨基酸序列的PylRS。该值为50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180或185、或也可以是此处例示的任意2个数值之间的范围。从向蛋白质有效引入非天然氨基酸的观点考虑,优选至少110氨基酸、更优选至少130氨基酸。序列比对可通过Clustal Omega或NCBI的BLAST实施。

本发明的一个实施方式的PylRS包括在氨基酸结合口袋中与非天然氨基酸结合的PylRS。与MaPylRS进行序列比对时,氨基酸结合口袋的氨基酸含有96、120、121、122、125、126、129、164、166、168、170、203、204、205、206、207、221、223、227、228、233、235、239、241或243位的氨基酸。与ISO4-G1 PylRS进行序列比对时,氨基酸结合口袋的氨基酸可以含有95、119、120、121、124、125、128、163、165、167、169、201、202、203、204、205、219、221、225、226、231、233、237、239或241位的氨基酸。本发明的一个实施方式的PylRS包括与氨基酸结合口袋的非天然氨基酸(例如,赖氨酸衍生物)结合的PylRS。

本发明的一个实施方式的纯化的PylRS包括提取的PylRS。PylRS包括,用无细胞蛋白质合成系统合成的PylRS、在活细胞表达的重组PylRS。本发明的一个实施方式的细胞包括,大肠杆菌或哺乳类细胞。本发明的一个实施方式的哺乳类包括,人、实验鼠、老鼠、兔、牛、猴。纯化的PylRS包括,通过HisTrap纯化、或凝胶过滤层析等纯化法纯化的PylRS。

相比于天然型PylRS的氨基酸序列,本发明的一个实施方式的变异型PylRS包括,具有70％以上相同性的氨基酸序列、具有吡咯赖氨酰-tRNA合成酶活性的变异型PylRS。相同性可以是70、75、80、85、90、95、97、98、99、99.5或99.9％以上、或也可以是此处例示的任意2个数值之间的范围。相同性可以是小于100％。相同性可以根据该技术领域众所周知的方法进行计算2个或多个氨基酸序列的相同氨基酸数的比率。计算比率之前,使进行比较的氨基酸序列组的氨基酸序列对齐,需要使相同氨基酸的比率成为最大时,在氨基酸序列的部分引入间隙。实现对齐的方法、比率的计算方法、比较方法以及与这些相关的计算机程序是本领域众所周知的(例如,BLAST、GENETYX等)。相同性可由NCBI的BLAST测定的值表示。氨基酸序列的比较可默认设置使用。应予说明,本说明书的变异型PylRS和PylRS变异体相同。

本发明的一个实施方式的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶活性包括,使非天然氨基酸和tRNA结合的活性。活性包括,使非天然氨基酸和阻抑tRNA结合的活性。活性包括,向蛋白质引入非天然氨基酸的活性。

本发明的一个实施方式的变异型PylRS包括变异型PylRS,该变异型PylRS是在由互补于编码天然型PylRS的氨基酸序列的碱基序列的碱基序列构成的多核苷酸上,具有在严格条件特异性杂交的多核苷酸所编码的氨基酸序列,其具有吡咯赖氨酰-tRNA合成酶活性。严格条件可采用以下条件。(1)清洗中使用低离子强度以及高温度(例如,在50℃、0.015M的氯化钠/0.0015M的柠檬酸钠/0.1％的十二烷基硫酸钠)、或(2)杂交中使用甲酰胺等变性剂(例如,在42℃、50％(v/v)甲酰胺和0.1％牛血清白蛋白/0.1％菲科尔/0.1％的聚乙烯吡咯烷酮/50mM且pH6.5的磷酸钠缓冲液、以及750mM的氯化钠、75mM柠檬酸钠)。应予说明,清洗时的温度可以是50、55、60或65℃、也可以是此处例示的任意2个数值之间的范围。清洗时间可以是5、15、30、60或120分或也可以是这些以上的。影响杂交反应严谨性的要素可考虑温度、盐浓度等,详细内容可参照Ausubel et al.,Current Protocols inMolecular Biology,Wiley Interscience Publishers,(1995)。

本发明的一个实施方式的变异型PylRS包括变异型PylRS,该变异型PylRS相对于天然型PylRS具有1个或几个氨基酸残基的缺失、添加、插入或取代的,具有吡咯赖氨酰-tRNA合成酶活性。几个为2、3、4、5、6、7、8、9、或10个、或也可以是此处例示的任意2个数值之间的范围。已知,接受了1个或几个氨基酸残基的缺失、添加、插入或取代的多肽可维持其生物活性(Mark et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.1984Sep；81(18):5662-5666.、Zolleret al.,Nucleic Acids Res.1982Oct25；10(20):6487-6500.、Wang et al.,Science.1984Jun 29；224(4656):1431-1433.)。发生缺失等的多肽可通过例如定点诱变法或随机诱变法制作。作为定点诱变法可使用例如PrimeSTAR mutagenesis kit(Takara BioInc.)。

本发明的一个实施方式的氨基酸包括具有氨基和羧基的有机化合物。本发明的实施方式所涉及的多肽包括特定氨基酸序列时,该氨基酸序列中任意氨基酸可形成盐或溶剂化物。而且,该氨基酸序列中任意氨基酸可以是L型或D型。即使在这些情况下,本发明的实施方式所涉及的多肽可以说含有特定的氨基酸序列。

本发明的一个实施方式的变异型PylRS包括在氨基酸结合口袋具有变异的PylRS。本发明的一个实施方式的变异型PylRS包括与氨基酸结合口袋的非天然氨基酸(例如,赖氨酸衍生物)结合的PylRS。

本发明的一个实施方式的变异型PylRS包括,与天然型PylRS进行序列比对时,在96、120、121、122、125、126、128、129、164、166、168、170、203、204、205、206、207、221、223、227、228、233、235、239、241或243位点具有变异的PylRS。从变异引入实验或晶体结构分析结果考虑,这些位点可认为是可变异的位点。该变异可以是对于A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、V的变异。该变异优选对于A、L、V、C或F的变异。变异前的126、129、168、206位点可以依次为Y、M、V、Y。

本发明的一个实施方式的变异型PylRS包括变异型PylRS,该变异型PylRS相比于天然型PylRS具有非天然氨基酸对于蛋白质的高引入效率。本发明的一个实施方式的变异型PylRS包括变异型PylRS,该变异型PylRS具有对于蛋白质的TCO*Lys引入活性、pEtZLys引入活性、或pAzZLys引入活性。

本发明的一个实施方式是包括Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS的非天然氨基酸和tRNA的结合用组合物。该结合用组合物优选含有5mg/mL以上的PylRS。此时,通过混合该结合用组合物和含有非天然氨基酸或tRNA等的溶液,从而有效结合非天然氨基酸和tRNA。将该结合用组合物使用于含非天然氨基酸的多肽的合成,可有效制作含非天然氨基酸的多肽。本发明的一个实施方式是使用Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS从而制作非天然氨基酸和tRNA的结合用组合物。本发明的一个实施方式是使用Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS的非天然氨基酸和tRNA的结合方法。

本发明的一个实施方式的向多肽引入非天然氨基酸的引入方法、含非天然氨基酸的多肽的制作方法、非天然氨基酸和tRNA的结合方法、或结合了非天然氨基酸的tRNA的制作方法可包括以下工序。(1)使PylRS和非天然氨基酸接触的工序、(2)使PylRS和tRNA接触的工序、(3)编码PylRS、PylRS的核酸、或将非天然氨基酸投入于溶液中的工序、(4)将编码tRNA或tRNA的核酸投入于溶液中的工序、(5)使编码与天然型在不同位点具有终止密码子的基因的多核苷酸和tRNA接触的工序、或(6)在非天然氨基酸存在下,使PylRS、tRNA或编码与天然型在不同位点具有终止密码子的基因的多核苷酸在活细胞或非细胞蛋白质合成系统中表达的工序。而且,也可包括浓缩含PylRS的溶液的工序、或混合已浓缩的PylRS溶液和非天然氨基酸的工序。tRNA包括例如,阻抑tRNA。阻抑tRNA包括例如,琥珀阻抑tRNA。tRNA包括例如,Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的tRNA。tRNA若无特别限定,可包括天然型tRNA、变异型tRNA两者。溶液可包括例如,缓冲液、tRNA、编码与天然型在不同位点具有终止密码子的基因的多核苷酸、氨基酸混合物、模板DNA或RNA聚合酶。向多肽引入非天然氨基酸的引入方法或含非天然氨基酸的多肽的制作方法可采用无细胞蛋白质合成法或细胞蛋白质合成法。

本发明的一个实施方式的蛋白质包括例如,功能蛋白质或结构蛋白质。功能蛋白质可包括例如,抗体或酶。蛋白质可含有天然型氨基酸或非天然型氨基酸。引入非天然氨基酸的位点可以是例如,抗体的固定区域内。

本发明的一个实施方式中,多肽包括例如,蛋白质。多肽包括多个氨基酸结合而构成的。多肽中的氨基酸的数量可以是例如,10、20、30、50、70、100、200、400、500、700、1000或1500、大于其中之一、或也可以是此处例示的任意2个数值之间的范围。

本发明的一个实施方式的赖氨酸衍生物包括例如,图3的化合物。非天然氨基酸包括例如,WO/2017/030156所记载的非天然氨基酸。非天然氨基酸包括例如,氨基酸衍生物。苯丙氨酸衍生物包括例如,3-iodo-L-苯丙氨酸。酪氨酸衍生物包括例如,o-propargyl-L-O-炔丙基-L-酪氨酸。本发明的一个实施方式是组合物。该组合物包括例如,含有Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS的组合物。组合物包括例如,用于向多肽引入非天然氨基酸的、或用于制作含非天然氨基酸的多肽的组合物。组合物可含有例如,非天然氨基酸。组合物可含有例如,缓冲液、tRNA、模板DNA、氨基酸混合物或RNA聚合酶。

本发明的一个实施方式是具有非天然氨基酸的多肽。该多肽可通过点击化学进行化学修饰。点击化学可利用例如,Hou J et al.,Expert Opin Drug Discov.2012Jun；7(6):489-501.、Bonnet Det al.,Bioconjug Chem.2006Nov-Dec；17(6):1618-23.等技术。本发明的一个实施方式是具有非天然氨基酸的多肽的化学修饰体。本发明的一个实施方式是包括具有非天然氨基酸的多肽或其化学修饰体的组合物。组合物包括一种医药组合物,该医药组合物包括一种以上药理学可接受的担体。

本发明的一个实施方式是制作变异型PylRS的模型组合物,其包括Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS、或编码该PylRS的核酸。本发明的一个实施方式是变异型PylRS的制作方法,其包括向Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS引入变异的工序。引入了变异的PylRS具有的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶活性可通过如后述实施例记载,由无细胞蛋白质合成法或活细胞蛋白质合成法评价。本发明的一个实施方式是多肽的制作方法,其包括使Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS和氨基酸接触的工序,以及选自以下工序(a)和工序(b)的引入工序:工序(a)：与利用使用了MmPylRS的无细胞蛋白质合成系统的情况相比,以更高的效率向多肽引入非天然氨基酸；工序(b)：与利用使用了具有受glmS启动子控制的上述PylRS基因的载体的大肠杆菌蛋白质合成系统的情况,以及,使用了具有受glnS启动子控制的上述PylRS基因的载体的大肠杆菌蛋白质合成系统的情况相比,以更高的效率向多肽引入非天然氨基酸。本发明的一个实施方式是含有高浓度的Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS的氨基酸引入系统。氨基酸引入系统可以是例如,无细胞蛋白质合成系统的反应溶液、或活细胞蛋白质合成系统的细胞。本发明的一个实施方式是多肽的制作方法,其包括使Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS和氨基酸在细胞外接触的工序。本发明的一个实施方式是多肽的制作方法,其包括使Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS高表达于活细胞的工序。

本说明书引用的所有出版物,公报类(专利或专利申请)均通过引用将其全文并入。

本说明书的“或”使用于可采用在本章列出的项目中“至少1个以上”时。“或者”也相同。明确记载为本说明书的“在两个值的范围内”时,其范围包括2个值自身。本说明书的“A～B”表示A以上B以下。

以上,对本发明的实施方式进行了说明,但这些是本发明的例示,也可以采用上述以外的各种结构。此外,也可以采用上述实施方式中描述的构成的组合。

【实施例】

以下,通过实施例进一步进行说明,但本发明不限于此。

<实验例1>

(1)M.mazei PylRS的表达、纯化

将His6-SUMO-M.mazei PylRS结构基因克隆于pET24后,转化于大肠杆菌BL21-Gold(DE3),在1L的LB培养基以37℃培养,OD600＝0.7时加入1mM IPTG,以20℃进行过夜培养(His6-SUMO-M.mazei PylRS的氨基酸序列为序列号1)。回收菌体、HisTrap纯化、SUMO蛋白酶处理后、进行HiTrap SP、Superdex 200HiLoad16/60纯化,从1L培养基回收了4.4mg的M.mazei PylRS(2.82mg/ml×1.56ml)。浓缩了含有该MmPylRS的溶液，结果浓缩极限为2.82mg/mL。

<实施例1>

1.1M.alvus PylRS的表达、纯化将Methanomethylophilus alvus的PylRS(MaPylRS)结构基因(序列号2)克隆于pET28后,转化于大肠杆菌BL21-Gold(DE3),在1L的LB培养基以37℃培养,OD₆₀₀＝0.6时加入1mM IPTG,以20℃进行过夜培养。进行回收菌体、HisTrap纯化、Thrombin处理、HiTrapQ、Hitrap Heparin、Superdex 200纯化,从1L培养基回收了约100mg的MaPylRS。该回收量高于现有古细菌的PylRS。将Methanosarcina属PylRS表达于大肠杆菌时,由于PylRS易沉淀难以纯化而导致回收量少。浓缩了含有该MaPylRS的溶液，结果浓缩极限为20mg/mL以上。

<实施例2>

2.1无细胞蛋白质合成法中使用了MaPylRS以及MmPylRS的非天然氨基酸引入蛋白质合成量的比较

反应液以及透析外液的组成符合表1。

【表1】

tRNA^Pyl各使用了来源于M.mazei的tRNA^Pyl以及来源于M.alvus的tRNA^Pyl(碱基序列为序列号3)。PylRS各使用了来源于M.mazei以及来源于M.alvus的天然型(MmPylRS的氨基酸序列为序列号4、MaPylRS的氨基酸序列为序列号5)。非天然氨基酸使用了N^ε-(叔丁氧羰基)-L-赖氨酸(BOCLys)(Bachem公司)以及N^ε-炔丙氧基羰基-L-赖氨酸(PocLys)(SciChem公司)。非天然氨基酸引入用模型DNA使用了pN11GFPS1sh-A17Amb、对照组合成用使用了pN11GFPS1sh。合成反应中,相对于透析外液1mL,将反应液30μL以25℃进行了过夜透析。将1μL当量的合成后的反应液稀释约200倍,以激发波长485nm、发射波长535nm测定了荧光值。以1mg/mL的标准GFPS1的荧光值为基准定量合成的GFPS1蛋白质量,以相对于对照组的一般合成的比率示出。

其结果为,如图4所示确认到使用了PylRS的非天然氨基酸的引入。BOCLys引入中,通过MaPylRS的蛋白质合成量成为了MmPylRS的2倍以上,合成到了与对照组的一般合成(WT)同等的蛋白质。PocLys引入中通过MaPylRS的蛋白质合成量非常多,合成到了与对照组几乎同等量。由此可知,通过使用MaPylRS可有效制备非天然型蛋白质。

<实施例3>

3.1无细胞蛋白质合成法中天然型PylRS浓度依赖性评价了在TCO*Lys引入中使用天然型PylRS时的浓度依赖性。反应液以及透析外液的组成符合表1。tRNA^Pyl使用了来源于M.alvus的tRNA^Pyl。PylRS使用了来源于M.alvus的天然型PylRS。

反应液中可添加的PylRS量的上限为,与水(Milli-Q超纯水)的液体量所对应的量。由于MaPylRS的浓缩极限为20mg/mL以上,作为最终浓度可添加80μM以上。本实验中使用了从10μM到75μM的范围。应予说明,MmPylRS时,由于浓缩极限为4mg/mL以下,可添加的浓度最大为约10μM。

非天然氨基酸使用了TCO*Lys。模型DNA使用了pN11GFPS1sh-A17Amb。合成反应是相对于透析外液(External solution)1mL,将反应液(Reaction solution)30μL以25℃进行了过夜透析。1μL当量的合成后的反应液稀释约200倍,以激发波长485nm、发射波长535nm测定了荧光值。以1mg/mL的标准GFPS1的荧光值为基准定量合成的GFPS1蛋白质量。

其结果为,如图5所示确认到在超过10μM的浓度蛋白质合成量增加,在75μM PylRS上升为10μMPylRS的约2.3倍以上。

<实施例4>

4.1MaPylRS的晶体结构分析对实施例1中回收的MaPylRS进行晶体筛选时,在使用PEG作为沉淀剂的条件下产生晶体。用中国台湾光束线(TPS05A)得到了分辨率为

(空间组C2)的衍射数据,并用MmPylRS结构取代了分子,从而进行了结构精密化(Rf/Rw＝28.8/22.8)。催化结构域在结构上与M.mazei相似,但是两个α-螺旋在N-末端的倾斜度与M.mazei不同。由于Tyr206(Phe384)未能进入口袋中而在Tyr206周围的几个残基处弯曲朝向内侧,因此活性位点口袋是敞开的。MaPylRS在活性位点口袋的形状上与MmPylRS略有不同,口袋的内部稍微狭窄。根据结构,进行了PylRS变异体的制作并进行了非天然氨基酸引入实验。

图6的左侧示出了MmPylRS催化结构域/吡咯烷基硅AMP复合物(MmPylRSc/Pyl-AMP,灰色)的单体和MaPylRS(载脂蛋白类型,绿色和蓝色)的二聚体重叠的结构。图6的右侧示出了MmPylRSc和MaPylRS(载脂蛋白类型)重叠结构的活性位点的放大图。另外,显示了引入变异的氨基酸残基和M.mazei中相应的氨基酸残基、识别吡咯赖氨酸的羰基所必需的Asn346/Asn166,这对于识别吡咯赖氨酸的羰基是必需的。

<实施例5>

5.1基于结构分析结果引入的MaPylRS变异体的评价基于结构分析结果使用已决定变异引入位点的PylRS评价了非天然氨基酸的引入。反应液以及透析外液的组成符合表1。tRNA^Pyl使用了10μM的来源于M.alvus的tRNA^Pyl。MaPylRS使用了在现有的PylRS(Y126A/M129A)变异体或PylRS(Y126A/M129L)变异体新增从结构分析结果得出的新变异(H227I/Y228P)的PylRS(Y126A/M129A/H227I/Y228P)和PylRS((Y126A/M129L/H227I/Y228P)。PylRS使用了10μM。非天然氨基酸使用了ZLys、mAzZLys、pEtZLys以及TCO*Lys。模型DNA使用了pN11GFPS1sh-A17Amb。合成反应中,相对于透析外液1mL,将反应液30μL以25℃进行了过夜透析。将1μL当量的合成后的反应液稀释约200倍,以激发波长485nm、发射波长535nm测定了荧光值。以1mg/mL的标准GFPS1的荧光值为基准定量合成的GFPS1蛋白质量。

其结果为,如图7所示通过向PylRS(Y126A/M129A)变异体引入(H227I/Y228P)变异,从而导致了所有非天然氨基酸的蛋白质合成量的大幅增加。特别是,达到了与ZLys、mAzZLys以及TCO*Lys中WT的合成同等的合成量。通过引入(H227I/Y228P)变异,确认到了ZLys约3倍、mAzZLys约1.5倍、pEtZLys约1.6倍、TCO*Lys约9倍的增加。

接下来,(H227I/Y228P)变异也被引入了由TCO*Lys引入获效的PylRS(Y126A/M129L)变异体。达到了与PylRS(Y126A/M129A)变异体相同,达到了与WT的合成同等合成量,增加了约4倍。由此表明了(H227I/Y228P)变异对各种变异体有效的可能性。

<实施例6>

6.1无细胞蛋白质合成法中使用了PylRS变异体的非天然氨基酸引入的PylRS浓度依赖性反应液以及透析外液的组成符合上述表1。此时,PylRS使用了PylRS变异体。在5μM到75μM之间确认了PylRS变异体的最终浓度。水(Milli-Q超纯水)根据伴随PylRS变异体浓度改变而产生的液量变化来变更。

tRNA^Pyl各使用了来源于M.mazei的tRNA^Pyl以及来源于M.alvus的tRNA^Pyl。PylRS变异体各使用了MmPylRS(Y306A/Y384F/R61K)以及MaPylRS(Y126A/M129L)。相对于在MaPylRS变异体中如ZLys衍生物等大的赖氨酸衍生物,MmPylRS(Y306A/Y384F/R61K)为活性高的变异体(Yanagisawa et al.,Chem Biol.2008Nov 24；15(11):1187-97.)。非天然氨基酸使用了N^ε-((((E)-环辛-2-烯-1-基)氧基)羰基)-L-赖氨酸(TCO*-Lys)(SciChem公司)、N^ε-(对乙炔基苄氧基羰基)-L-赖氨酸(pEtZLys)(Sundia/Namiki公司)、N^ε-(对叠氮基苄氧基羰基)-L-赖氨酸(pAzZLys)(Sundia/Namiki公司)。非天然氨基酸引入用模型DNA使用了pN11GFPS1sh-A17Amb、对照组用模型DNA使用了pN11GFPS1sh。合成反应中,相对于透析外液1mL,将反应液30μL以25℃进行了过夜透析。将1μL当量的合成后的反应液稀释约200倍,以激发波长485nm、发射波长535nm测定了荧光值。以1mg/mL的标准GFPS1的荧光值为基准定量合成的GFPS1蛋白质量。

反应液中可添加的PylRS变异体量的上限为,与水(Milli-Q超纯水)的液体量所对应的量。由于MmPylRS变异体的浓缩极限为4mg/mL以下,最多可添加约10μM。由于MaPylRS变异体的浓缩极限为20mg/mL以上,可添加80μM以上。

以上结果,如图8、9所示确认到通过使用高浓度的MaPylRS变异体提高了蛋白质合成量。将对于点击化学反应有希望的非天然氨基酸TCO*-Lys引入的结果示于图8。以PylRS变异体浓度10μM合成了M.mazei约为0.25mg/mL、M.alvus约为0.83mg/mL的GFPS1蛋白质。另一方面,以PylRS变异体浓度75μM可合成M.alvus,以50μM合成了与对照组的一般合成(WT)同等以上的3mg/mL的蛋白质。这是使用MmPylRS变异体合成的10倍以上。由此可知,通过使用高浓度的MaPylRS变异体,可有效制备引入了TCO*-Lys的蛋白质。

使用引入效率低于TCO*-Lys的pEtZLys和pAzZLys时的结果示于图9。PylRS浓度为10μM时,M.mazei和M.alvus的蛋白质合成量均低。另一方面,在MaPylRS变异体中,蛋白质合成量的增加依赖于浓度,若增加PylRS变异体浓度至75μM,则相比于添加10μM时,pEtZLys引入的蛋白质合成量增加至约2.5倍的约0.5mg/mL。pAzZLys引入中增加至约4.6倍的约2mg/mL而接近一般合成的WT合成量。由此可知,通过以高浓度使用MaPylRS变异体,可增加低引入效率的pEtZLys、pAzZLys的蛋白质合成量。

<实施例7>

7.1无细胞蛋白质合成法中使用MaPylRS变异体的ZLys非天然氨基酸引入反应液以及透析外液的组成符合上述表1。此时,PylRS使用了PylRS变异体。tRNA^Pyl使用了来源于M.alvus的tRNA^Pyl。PylRS变异体使用了来源于M.alvus的图10的变异体。非天然氨基酸使用了N^ε-苄氧羰基-L-赖氨酸(ZLys)(Bachem公司)。非天然氨基酸引入用模型DNA使用了pN11GFPS1sh-A17Amb,对照组用模型DNA使用了pN11GFPS1sh。合成反应中,相对于透析外液1mL,将反应液30μL以25℃进行了过夜透析。将1μL当量的合成后的反应液稀释约200倍,以激发波长485nm、发射波长535nm测定了荧光值。以1mg/mL的标准GFPS1的荧光值为基准定量合成的GFPS1蛋白质量,以相对于对照组的一般合成的比率示出。

ZLys引入蛋白质合成量的调查结果示于图10。表示了在MaPylRS的氨基酸口袋内的126位、129位、168位、206位引入变异的結果中,相对于对照组合成量为40％以上的。特别是Y126A/M129A和Y126A/V168C表示了高合成量。由以上结果可知,可制作适合ZLys引入的变异体。

7.2无细胞蛋白质合成法中使用MaPylRS变异体的mAzZLys非天然氨基酸引入反应液以及透析外液的组成符合上述表1。此时,PylRS使用了PylRS变异体。tRNA^Pyl使用了来源于M.alvus的tRNA^Pyl。PylRS变异体使用了来源于M.alvus的图11的变异体。非天然氨基酸使用了N^ε-(间叠氮基苄氧基羰基)-L-赖氨酸(mAzZLys)(Sundia/Namiki公司)。非天然氨基酸引入用模型DNA使用了pN11GFPS1sh-A17Amb、对照组用模型DNA使用了pN11GFPS1sh。合成反应中,相对于透析外液1mL,将反应液30μL以25℃进行了过夜透析。将1μL当量的合成后的反应液稀释约200倍,以激发波长485nm、发射波长535nm测定了荧光值。以1mg/mL的标准GFPS1的荧光值为基准定量合成的GFPS1蛋白质量,以相对于对照组的一般合成的比率示出。

mAzZLys引入蛋白质的调查结果示于图11。表示了在MaPylRS的氨基酸口袋内的126位、129位、168位引入变异的結果中,至少相对于对照组合成量至少为65％以上的。由以上结果可知,可制作适合mAzZLys引入的变异体。

<实施例8>

8.1使用了MaPylRS变异体的TCO*-Lys非天然氨基酸引入Fab抗体的制备按照以下表2的反应液以及透析外液的组成,合成了引入非天然氨基酸TCO*-Lys的无细胞蛋白质,非天然氨基酸TCO*-Lys在Herceptin Fab抗体的L链有可能进行点击化学反应。

【表2】

tRNA^Pyl各使用了来源于M.mazei的tRNA^Pyl以及来源于M.alvus的tRNA^Pyl。PylRS变异体各使用了MmPylRS(Y306A/Y384F/R61K)变异体以及MaPylRS(Y126A/M129L)变异体。由于此系中可添加的tRNA^Pyl和PylRS的最大液体量为460μL,各自的添加量是,M.mazei的tRNA^Pyl和PylRS变异体为6.5μM分、来源于M.alvus的tRNA^Pyl为10μM分、PylRS变异体为50μM分。模型DNA使用了在Herceptin Fab H链用的pN11TVGS_Her-H、Herceptin Fab L链用的氨基酸序号203位点具有非天然氨基酸引入位点用密码子的pN11TVGS_Her-L-S203Amb。合成反应中,相对于透析外液50mL,将反应液5mL以25℃进行了过夜透析。标签切割和纯化处理了合成后的反应液。与10倍量的TAMRA-四嗪混合以25℃反应10分钟以及30分钟进行了点击化学反应。

其结果为,如图12所示每1mL无细胞蛋白质合成反应液的TCO*-Lys引入HerceptinFab二聚体的合成量在使用M.alvus时为1.7mg。这是使用M.mazei时的20倍量。

以点击化学将荧光基板TAMRA结合于被引入的TCO*-Lys的结果示于图13、14。TCO*-Lys的反应性高,结合反应几乎在10分钟内结束。使用了M.alvus的合成中,点击化学后的L链的电泳图像向高分子侧移动显示了强的荧光强度。另一方面,使用了M.mazei的合成中向高分子侧移动的比率为M.alvus的1/2量,荧光强度为约1/3。由各电泳图像蛋白质量的荧光强度中M.alvus高出1.5倍并结合图12可知,通过使用M.alvus的合成,可制备引入了30倍量TCO*-Lys的Fab抗体。

也就是说,通过使用高浓度的MaPylRS变异体可比以往更有效制备引入了TCO*-Lys的Fab抗体。而且,通过引入TCO*-Lys,可进行反应性高的点击化学。

<实施例9>

9.1大肠杆菌表达系统中通过M.mazei、M.alvus、D.hafniense PylRS进行的非天然氨基酸的引入效率的比较非天然氨基酸(ncAA)使用了BocLys、AlocLys(Bachem)。PylRS基因(野生型)使用了MaPylS(M.alvus PylRS基因)、MmPylS(M.mazei PylRS基因)、DhPylS(D.hafniense PylRSc基因)。tRNA^Pyl基因使用了MaPylT(M.alvus tRNA^Pyl)、MmPylT(M.mazei tRNA^Pyl)、DhPylT(D.hafniense tRNA^Pyl)。此时,PylRS基因和tRNA^Pyl基因组合使用了来源于同一个菌的基因。大肠杆菌使用了BL21-Gold(DE3)。质粒使用了pBT5系列(T5/lacO-PylRS、T5/lacO-tRNA^Pyl)。蛋白质表达用质粒使用了pACYC-GST-GFP(amber3)(T7/lacO-3amb-His6-GST-GFP、将N末端第3个Ser变异为琥珀密码子)。

将pBT5系列、pACYC-GST-GFP(amber3)转化于大肠杆菌BL21-Gold(DE3)后,在含有1mM非天然氨基酸(BocLys、AlocLys)的2x YT自诱导培养基(autoinduction medium)2ml或0.2ml以25℃培养了24小时。此时,由pBT5系列的T5启动子(序列号6)实现了PylRS的高表达。在96孔微孔板上0.19ml的PBS接入大肠杆菌培养液10μl进行稀释,用SpectraMAX i3plate reader(molecular devices)以485/510nm蛍光测定,通过600nm的吸光进行换算比较了荧光值。

结果示于图15。图中,-ncAA意味着没有非天然氨基酸的条件。使用DhPylS时,没有检测到荧光。使用MmPylS时检测到了荧光,其引入效率在BocLys中为9％。另一方面,使用MaPylS时示出了最高荧光值,BocLys、AlocLys的引入效率各为57％、64％。PylRS的高表达系统中,使用M.alvus的PylRS时的BocLys的引入效率是M.mazei的6倍、AlocLys的引入效率是M.mazei的14倍。应予说明,观察到使MmPylRS高表达的大肠杆菌的增殖恶化,而没有观察到使MaPylRS高表达的大肠杆菌的增殖恶化。

<实施例10>

10.1野生型GST-GFP融合蛋白质(3Ser)和琥珀变异GST-GFP融合蛋白质的分析在1mM BocLys环境下以5ml培养基表达了野生型GST-GFP或GST-GFP(amber3)。回收菌体后用Bugbuster Master Mix reagent(Merck Millipore)粉碎,用GST SpinTrap(GEHealthcare)纯化了蛋白质,用SDS-PAGE、Simplyblue safe stain进行染色。切出凝胶片用Trypsin/Lys-C Mix,Mass Spec grade(Promega)以37℃消化一昼夜后,用His SpinTrapTALON纯化、用含有0.1％TFA的4％乙腈洗脱后,进行了MALDI-TOF MS分析。

结果示于图16。使用MaPylRS得到的GST-GFP生成物为59mg(野生型GST-GFP为106mg)时与荧光值成正比。通过胰蛋白酶消化后的MALDI-TOF分析,确认到1-12肽(MNXSSHHHHHHR)的第3残基引入了BocLys(2的峰)、野生型引入了Ser(1的峰)。(3的峰是由酸处理(TFA)进行的BocLys→Lys分解、*为开始Met脱离的来源于生成物的峰)。

<实施例11>

11.1大肠杆菌表达系统中使用MaPylRS的向非天然氨基酸的蛋白质的位点特异性引入非天然氨基酸(ncAA)使用了BocLys、AlocLys、DBocLys(Bachem)、PocLys(SynChem)。PylRS使用了MaPylRS、MmPylRS(R61K/G131E/Y384F)(BocLysRS2)。tRNA^Pyl各使用了来源于M.alvus、M.mazei的基因。此时,PylRS和tRNA^Pyl组合使用了来源于同一个菌的基因。大肠杆菌使用了BL21-Gold(DE3)。质粒使用了pBT5系列(T5/lacO-PylRS、T5/lacO-tRNA^Pyl)。蛋白质表达用质粒使用了pACYC-GST-GFP(amber3)(T7/lacO-3amb-His6-GST-GFP、将N末端第3个Ser变异为琥珀密码子)。将pBT5系列(作为对照组使用pBR322)、pACYC-GST-GFP(amber3)转化于大肠杆菌BL21-Gold(DE3)后,在含有1mM非天然氨基酸的2x YT自诱导培养基2ml或0.2ml以25℃培养了24小时。此时,由pBT5系列的T5启动子实现了PylRS的高表达。在96孔微孔板上0.19ml的PBS接入大肠杆菌培养液10μl进行稀释,用SpectraMAX i3 plate reader以485/510nm蛍光测定,通过600nm的吸光进行换算比较了荧光值。

结果示于图17。图中,-ncAA意味着没有非天然氨基酸的条件。在PylRS的高表达系统中,相比于使用BocLys、DBocLys、AlocLys、PocLys和MmPylRS(R61K/G131E/Y384F)时,使用MaPylRS时实现了更有效引入。应予说明,观察到使MmPylRS高表达的大肠杆菌的增殖恶化,而没有观察到使MaPylRS高表达的大肠杆菌的增殖恶化。

<实施例12>

12.1大肠杆菌表达系统中使用MaPylRS变异体的向ZLys系非天然氨基酸的蛋白质的位点特异性引入非天然氨基酸使用了ZLys(渡边化学)、oClZLys、pNO₂ZLys(Bachem)、pTmdZLys、oAzZLys、mAzZLys、oEtZLys、AmAzZLys、AzNO₂ZLys(新城化学)。MaPylRS变异体使用了Y126A/M129L、Y126A/M129L/Y206F。MmPylRS变异体使用了Y306A/Y384F。tRNA^Pyl各使用了来源于M.alvus、M.mazei的基因。此时,PylRS和tRNA^Pyl组合使用了来源于同一个菌的基因。大肠杆菌使用了BL21-Gold(DE3)。质粒使用了pBT5系列(T5/lacO-PylRS、T5/lacO-tRNA^Pyl)。蛋白质表达用质粒使用了pACYC-GST-GFP(amber3)(T7/lacO-3amb-His6-GST-GFP、将N末端第3个Ser变异为琥珀密码子)。

将pBT5系列(作为对照组使用pBR322)、pACYC-GST-GFP(amber3)转化于大肠杆菌BL21-Gold(DE3)后,在含有1mM非天然氨基酸的2x YT自诱导培养基2ml或0.2ml以25℃培养了24小时。此时,由pBT5系列的T5启动子实现了PylRS的高表达。在96孔微孔板上0.19ml的PBS加入大肠杆菌培养液10μl进行稀释,用SpectraMAX i3 plate reader以485/510nm蛍光测定,通过600nm的吸光进行换算后,将野生型GST-GFPwt的荧光作为1比较了荧光值。

结果示于图18。图中,-ncAA意味着没有非天然氨基酸的条件。在PylRS的高表达系统中,引入成功了所有ZLys衍生物。MaPylRS(Y126A/M129L)的引入效率最高。特别是,MaPylRS(Y126A/M129L)的引入效率高于MmPylRS(Y306A/Y384F)(3～18倍)。应予说明,观察到使MmPylRS变异体高表达的大肠杆菌的增殖恶化,而没有观察到使MaPylRS高表达的大肠杆菌的增殖恶化。

<实施例13>

13.1小麦胚芽系无细胞蛋白质合成法中PylRS浓度依赖性确认为了确认真核生物蛋白质合成系统中M.alvus PylRS高浓度化的有效性,使用了小麦胚芽系无细胞蛋白质合成法的Premium PLUS Expression Kit(Cellfree science公司)进行了TCO*Lys的引入试验。

tRNA^Pyl使用了来源于M.mazei的tRNA^Pyl以及来源于M.alvus的tRNA^Pyl。PylRS变异体使用了来源于M.mazei的PylRS(Y306A/Y384F/R61K)以及来源于M.alvus的PylRS(Y126A/M129L),以10μM到50μM的范围添加于反应液。非天然氨基酸以最终浓度1mM使用了TCO*Lys。非天然氨基酸引入用模型DNA使用了pEU-E01-GFPS1sh-A17Amb。将底物溶液206μL以重层于翻译反应液约20μL的方式以15℃进行了20小时合成反应。将合成后的混合液20μL稀释为约10倍,以激发波长485nm、发射波长535nm测定了荧光值。以1mg/mL的标准GFPS1的荧光值为基准定量合成的GFPS1蛋白质量。

其结果为,如图19所示,确认到在浓度超过10μM的PylRS中蛋白质合成量增加,在50μM PylRS中上升至约7.2倍。由此,确认到真核生物蛋白质合成系统中M.alvus PylRS的高浓度化的有效性。

<实施例14>

14.1人类系无细胞蛋白质合成法中PylRS浓度依赖性确认为了确认真核生物中特别有用的来源于人类细胞的蛋白质合成系统中M.alvus PylRS的有效性,使用了人类细胞系无细胞蛋白质合成法的Human Cell-Free Protein Expression Maxi System(TAKARA)进行了TCO*Lys的引入试验。

tRNA^Pyl使用了来源于M.alvus的tRNA^Pyl。PylRS变异体使用了来源于M.alvus的PylRS(Y126A/M129L),以10μM到50μM的范围添加于反应液。非天然氨基酸以最终浓度1mM使用了TCO*Lys。非天然氨基酸引入用模型DNA使用了pN11GFPS1sh-A17Amb。将反应溶液30μL透析于反应外液350μL的方法以32℃进行了20小时合成反应。将合成后的混合液20μL稀释为约10倍,以激发波长485nm、发射波长535nm测定了荧光值。以1mg/mL的标准GFPS1的荧光值为基准定量合成的GFPS1蛋白质量。

其结果为,如图20所示确认到,伴随PylRS浓度的上升蛋白质合成量增加,在50μMPylRS中上升至约1.8倍。由此确认到人细胞无细胞蛋白质合成系统中M.alvus PylRS的高浓度化的有效性。并且,通过无细胞蛋白质合成法示出的有效性,确认到使用相同转录翻译系的人细胞表达系统的有效性。

<实施例15>

15.1 AcLys引入确认试验使用M.alvus PylRS确认了非天然氨基酸N^ε-乙酰-L-赖氨酸(AcLys)的引入。

反应液以及透析外液的组成符合上述表1。此时,tRNA^Pyl使用了来源于M.alvus的tRNA^Pyl、PylRS变异体使用了来源于M.alvus的PylRS:AcLysRS3(121V/125I/126F/129A/168F)以及AcLysRS3-IP(121V/125I/126F/129A/168F/227I/228P),添加10μM于反应液,AcLys以最终浓度1mM使用。非天然氨基酸引入用模型DNA使用了pN11GFPS1sh-A17Amb、对照组用模型DNA使用了pN11GFPS1sh。相对于反应液30μL使用透析外液1mL以25℃过夜透析进行合成反应。将合成后的反应液1μL稀释为约200倍,以激发波长485nm、发射波长535nm测定了荧光值。以1mg/mL的标准GFPS1的荧光值为基准定量合成的GFPS1蛋白质量。

其结果为,如图21所示确认到使用M.alvus PylRS变异体可引入AcLys。

<实施例16>

16.1Phe衍生物的引入确认试验使用M.alvus PylRS确认了作为苯丙氨酸(Phe)衍生物的3-iodo-L-苯丙氨酸(IPhe)的引入。反应液以及透析外液的组成符合上述表1。此时,tRNA^Pyl使用了来源于M.alvus的tRNA^Pyl、PylRS变异体使用了来源于M.alvus的PylRS(166A/168A)以及PylRS(166A/168A/227I/228P),添加10μM于反应液,IPhe以最终浓度1mM使用。非天然氨基酸引入用模型DNA使用了pN11GFPS1sh-A17Amb、对照组用模型DNA使用了pN11GFPS1sh。并且,由于Phe衍生物用变异体有引入苯丙氨酸自身的报告例,确认到未添加IPhe时的合成。相对于反应液30μL使用透析外液1mL以25℃过夜透析进行合成反应。将合成后的反应液1μL稀释为约200倍,以激发波长485nm、发射波长535nm测定了荧光值。以1mg/mL的标准GFPS1的荧光值为基准定量合成的GFPS1蛋白质量。

其结果为,如图22所示确认到使用M.alvus PylRS变异体可引入IPhe。由此确认到M.alvus PylRS变异体有效于Phe衍生物。

<实施例17>

17.1Tyr衍生物的引入确认试验使用M.alvus PylRS确认了作为酪氨酸(Tyr)衍生物的O-炔丙基-L-酪氨酸(oPgTyr)的引入。

反应液以及透析外液的组成符合上述表1。此时,tRNA^Pyl使用了来源于M.alvus的tRNA^Pyl、PylRS变异体使用了来源于M.alvus的PylRS(166A/168A),添加10μM于反应液,oPgTyr以最终浓度1mM使用。非天然氨基酸引入用模型DNA使用了pN11GFPS1sh-A17Amb、对照组用模型DNA使用了pN11GFPS1sh。相对于反应液30μL使用透析外液1mL以25℃过夜透析进行合成反应。将合成后的反应液1μL稀释为约200倍,以激发波长485nm、发射波长535nm测定了荧光值。以1mg/mL的标准GFPS1的荧光值为基准定量合成的GFPS1蛋白质量。

其结果为,如图23所示确认到使用M.alvus PylRS变异体可引入oPgTyr。由此确认到M.alvus PylRS变异体有效于Tyr衍生物。

<实施例18>

18.1来源于Methanogenic archaeon ISO4-G1的PylRS的确认试验进行了作为产甲烷古细菌的Methanogenic archaeon ISO4-G1的PylRS(G1PylRS)评价。用于合成的DNA序列是,ISO4-G1的PylRS为

ATGGTAGTCAAATTCACTGACAGCCAAATCCAACATCTGATGGAGTATGGTGATAATGATTGGAGCGAGGCAGAATTTGAGGACGCTGCTGCTCGTGATAAAGAGTTTTCAAGCCAATTCTCCAAGTTGAAGAGTGCGAACGACAAAGGATTGAAAGACGTCATTGCGAACCCGCGTAATGACCTGACCGACCTTGAAAATAAGATTCGTGAGAAACTTGCTGCACGCGGTTTCATCGAAGTGCATACGCCTATTTTTGTATCTAAGAGTGCATTAGCCAAGATGACAATCACCGAGGATCATCCTTTATTCAAGCAGGTCTTCTGGATCGACGACAAACGTGCCTTGCGTCCAATGCATGCGATGAATCTTTATAAGGTAATGCGCGAGTTGCGCGATCACACAAAGGGACCAGTCAAGATCTTCGAGATTGGCTCGTGCTTCCGCAAGGAAAGCAAGTCATCGACGCATTTGGAAGAATTCACTATGCTGAACTTAGTTGAGATGGGACCCGATGGCGACCCTATGGAGCACCTTAAGATGTATATTGGAGACATCATGGACGCGGTTGGTGTAGAATACACCACCTCACGTGAGGAGTCTGATGTGTACGTAGAGACACTTGACGTGGAGATCAATGGAACTGAAGTTGCGTCAGGAGCAGTAGGTCCTCATAAGCTTGACCCTGCCCACGATGTGCATGAACCCTGGGCAGGAATCGGATTCGGACTGGAGCGTCTGTTGATGCTTAAGAACGGTAAATCGAATGCTCGTAAGACAGGCAAAAGTATCACCTATTTGAATGGTTACAAATTGGAT(序列号7)、tRNA^Pyl为GGAGGGCGCTCCGGCGAGCAAACGGGTCTCTAAAACCTGTAAGCGGGGTTCGACCCCCCGGCCTTTCGCCA(序列号8)。ISO4-G1的tRNA^Pyl的RNA序列为

GGAGGGCGCUCCGGCGAGCAAACGGGUCUCUAAAACCUGUAAGCGGGGUUCGACCCCCCGGCCUUUCGCCA(序列号9)。将ISO4-G1的tRNA^Pyl以及PylRS各10μM、1mM的BocLys或PocLys添加于大肠杆菌无细胞蛋白质合成系统的反应溶液。非天然氨基酸引入用模型DNA使用了pN11GFPS1sh-A17Amb、对照组用模型DNA使用了pN11GFPS1sh。相对于反应液30μL使用透析外液1mL以25℃过夜透析进行合成反应。将合成后的反应液1μL稀释为约200倍,以激发波长485nm、发射波长535nm测定了荧光值。以1mg/mL的标准GFPS1的荧光值为基准定量合成的GFPS1蛋白质量。

其结果为,如图24所示确认到使用ISO4-G1的PylRS可通过引入效率良好的非天然氨基酸合成蛋白质。并且,相对于对照组的合成量与M.mazei以及M.alvus的PylRS的比较结果示于图25。由此结果确认到ISO4-G1 PylRS有效。G1PylRS在无细胞蛋白质合成系统中显示如此良好的引入效率是惊人的结果。

<实施例19>

19.1Methanogenic archaeon ISO4-G1 PylRS变异体的确认试验

作为Methanogenic archaeon ISO4-G1 PylRS的变异体使用了PylRS(Y125A/M128A)以及PylRS(Y125A/M128L),进行了非天然氨基酸引入确认。非天然氨基酸确认了ZLys、TCO*Lys、BCNLys、pETZLys、pAzZLys。将ISO4-G1的tRNA^Pyl以及PylRS变异体各10μM、1mM的非天然氨基酸添加于大肠杆菌无细胞蛋白质合成系统的反应溶液。非天然氨基酸引入用模型DNA使用了pN11GFPS1sh-A17Amb、对照组用模型DNA使用了pN11GFPS1sh。相对于反应液30μL使用透析外液1mL以25℃过夜透析进行合成反应。将合成后的反应液1μL稀释为约200倍,以激发波长485nm、发射波长535nm测定了荧光值。以1mg/mL的标准GFPS1的荧光值为基准定量合成的GFPS1蛋白质量。

其结果为,如图26所示确认到使用ISO4-G1的PylRS变异体可通过引入效率良好的非天然氨基酸合成蛋白质。并且,相对于对照组的合成量与M.mazei的PylRS变异体的比较结果示于图27。由此结果确认到ISO4-G1 PylRS变异体有效。

<实施例20>

20.1无细胞蛋白质合成法中Methanogenic archaeon ISO4-G1浓度依赖性确认试验Methanogenic archaeon ISO4-G1 PylRS以及PylRS变异体与M.alvus PylRS同样浓缩极限高,可以高浓度使用。在此,图27确认到了对照组合成量未达到100％的pEtZLys中,使用Methanogenic archaeon ISO4-G1 PylRS变异体的PylRS(Y125A/M128L)时的浓度依赖性。

反应液以及透析外液的组成符合表1。

Methanogenic archaeon ISO4-G1 PylRS(Y125A/M128L)使用了10μM至75μM的范围。添加了10μM的ISO4-G1的tRNA^Pyl、10μM的非天然氨基酸pEtZLys。模型DNA使用了pN11GFPS1sh-A17Amb。相对于反应液(Reaction solution)30μL使用透析外液(Externalsolution)1mL以25℃过夜透析进行合成反应。将合成后的反应液1μL稀释为约200倍,以激发波长485nm、发射波长535nm测定了荧光值。以1mg/mL的标准GFPS1的荧光值为基准定量合成的GFPS1蛋白质量。

其结果为,如图28所示确认到浓度超过10μM时蛋白质合成量增加,75μM PylRS中上升约6.8倍。由此结果确认到ISO4-G1 PylRS变异体以高浓度使用更有效。

<实施例21>

21.1动物细胞中mAzZLys向蛋白质的引入为了在动物细胞(HEK293c18细胞)高表达M.alvus PylRS变异体(Y126A/M129L/H227I/Y228P)和M.alvus tRNA^Pyl,或Methanogenicarchaeon ISO4-G1 PylRS变异体(Y125A/M128L)和ISO4-G1tRNA^Pyl,使用了揭示于非专利文献(Mukai,et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.Vol.371,pp.818-822(2008))的系统。关于蛋白质使用了其基因的编码区域引入了琥珀·密码子(T137或N157)的变异基因以及其表达系统。

结果示于图29。不管在那种情况,都确认到了非天然氨基酸引入于蛋白质。本实验中尽管各tRNA基因以1份而非9份进行,仍然合成了非天然氨基酸引入的蛋白质。以上实验表示,相比于向动物细胞内的期待位点的mAzZLys的特异性引入,M.alvus PylRS变异体(Y126A/M129L/H227I/Y228P)或Methanogenic archaeon ISO4-G1 PylRS变异体(Y125A/M128L)的高表达系统有效。

以上,基于实施例对本发明进行了说明。本领域技术人员需理解,该实施例仅是示例,并且各种修改是可能的,并且这种修改在本发明的范围内。

序列表

<110> 国立研究开发法人理化学研究所(RIKEN)

<120> 吡咯赖氨酰-tRNA合成酶

<130> 6410RIK

<150> JP 18/163967

<151> 2018-08-31

<150> JP 19/080459

<151> 2019-04-19

<150> JP 19/134129

<151> 2019-07-19

<160> 10

<170> PatentIn 3.5 版本

<210> 1

<211> 558

<212> PRT

<213> 马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina mazeii)

<400> 1

Met His His His His His His Gly Ser Asp Ser Glu Val Asn Gln Glu

1 5 10 15

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20 25 30

Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys Lys

35 40 45

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

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Arg Val Ser Asp Glu Asp Leu Asn Lys Phe Leu Thr Lys Ala Asn Glu

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195 200 205

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210 215 220

Asn Thr Glu Ala Ala Gln Ala Gln Pro Ser Gly Ser Lys Phe Ser Pro

225 230 235 240

Ala Ile Pro Val Ser Thr Gln Glu Ser Val Ser Val Pro Ala Ser Val

245 250 255

Ser Thr Ser Ile Ser Ser Ile Ser Thr Gly Ala Thr Ala Ser Ala Leu

260 265 270

Val Lys Gly Asn Thr Asn Pro Ile Thr Ser Met Ser Ala Pro Val Gln

275 280 285

Ala Ser Ala Pro Ala Leu Thr Lys Ser Gln Thr Asp Arg Leu Glu Val

290 295 300

Leu Leu Asn Pro Lys Asp Glu Ile Ser Leu Asn Ser Gly Lys Pro Phe

305 310 315 320

Arg Glu Leu Glu Ser Glu Leu Leu Ser Arg Arg Lys Lys Asp Leu Gln

325 330 335

Gln Ile Tyr Ala Glu Glu Arg Glu Asn Tyr Leu Gly Lys Leu Glu Arg

340 345 350

Glu Ile Thr Arg Phe Phe Val Asp Arg Gly Phe Leu Glu Ile Lys Ser

355 360 365

Pro Ile Leu Ile Pro Leu Glu Tyr Ile Glu Arg Met Gly Ile Asp Asn

370 375 380

Asp Thr Glu Leu Ser Lys Gln Ile Phe Arg Val Asp Lys Asn Phe Cys

385 390 395 400

Leu Arg Pro Met Leu Ala Pro Asn Leu Tyr Asn Tyr Leu Arg Lys Leu

405 410 415

Asp Arg Ala Leu Pro Asp Pro Ile Lys Ile Phe Glu Ile Gly Pro Cys

420 425 430

Tyr Arg Lys Glu Ser Asp Gly Lys Glu His Leu Glu Glu Phe Thr Met

435 440 445

Leu Asn Phe Cys Gln Met Gly Ser Gly Cys Thr Arg Glu Asn Leu Glu

450 455 460

Ser Ile Ile Thr Asp Phe Leu Asn His Leu Gly Ile Asp Phe Lys Ile

465 470 475 480

Val Gly Asp Ser Cys Met Val Tyr Gly Asp Thr Leu Asp Val Met His

485 490 495

Gly Asp Leu Glu Leu Ser Ser Ala Val Val Gly Pro Ile Pro Leu Asp

500 505 510

Arg Glu Trp Gly Ile Asp Lys Pro Trp Ile Gly Ala Gly Phe Gly Leu

515 520 525

Glu Arg Leu Leu Lys Val Lys His Asp Phe Lys Asn Ile Lys Arg Ala

530 535 540

Ala Arg Ser Gly Ser Tyr Tyr Asn Gly Ile Ser Thr Asn Leu

545 550 555

<210> 2

<211> 828

<212> DNA

<213> Methanomethylophilus alvus

<400> 2

atgacggtca agtacaccga tgctcaaatt caacgtcttc gcgaatatgg aaacggaacc 60

tacgaacaaa aggttttcga ggacttagca tctcgtgacg cggctttcag taaagagatg 120

agcgtggcgt caactgacaa tgaaaaaaag attaaaggga tgattgcaaa tccatcacgt 180

catggtttaa cgcagttaat gaatgatatt gcagacgcat tagtggcaga gggctttatt 240

gaagtccgta cgccgatttt catctccaaa gatgctttgg cacgtatgac tatcaccgaa 300

gacaagcccc tgtttaagca agttttctgg atcgacgaaa agcgtgcact tcgccctatg 360

ttggcaccaa acctgtactc cgtaatgcgc gacttacgcg atcacaccga cggacccgtg 420

aagattttcg aaatgggatc atgttttcgc aaggaatcac attcagggat gcatctggag 480

gaattcacca tgttgaactt agttgatatg ggaccgcgcg gcgatgccac agaagtatta 540

aaaaactaca tcagtgtcgt aatgaaggct gctggtttgc ctgattatga tttagtacaa 600

gaagaaagtg atgtatacaa agaaacaatt gatgtggaaa tcaacgggca agaagtatgc 660

agtgccgcag tggggccgca ttacctggat gcggcccatg acgtgcatga gccttggtct 720

ggtgctggct tcgggttgga gcgtctttta acgattcgtg agaaatactc aacggtcaag 780

aaaggcggcg cttccatcag ttacttgaac ggcgccaaga ttaattaa 828

<210> 3

<211> 71

<212> RNA

<213> Methanomethylophilus alvus

<400> 3

gggggacggu ccggcgacca gcgggucucu aaaaccuagc cagcgggguu cgacgccccg 60

gucucucgcc a 71

<210> 4

<211> 454

<212> PRT

<213> 马氏甲烷八叠球菌( Methanosarcina mazeii)

<400> 4

Met Asp Lys Lys Pro Leu Asn Thr Leu Ile Ser Ala Thr Gly Leu Trp

1 5 10 15

Met Ser Arg Thr Gly Thr Ile His Lys Ile Lys His His Glu Val Ser

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Arg Ser Lys Ile Tyr Ile Glu Met Ala Cys Gly Asp His Leu Val Val

35 40 45

Asn Asn Ser Arg Ser Ser Arg Thr Ala Arg Ala Leu Arg His His Lys

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100 105 110

Ala Arg Ala Pro Lys Pro Leu Glu Asn Thr Glu Ala Ala Gln Ala Gln

115 120 125

Pro Ser Gly Ser Lys Phe Ser Pro Ala Ile Pro Val Ser Thr Gln Glu

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Ser Val Ser Val Pro Ala Ser Val Ser Thr Ser Ile Ser Ser Ile Ser

145 150 155 160

Thr Gly Ala Thr Ala Ser Ala Leu Val Lys Gly Asn Thr Asn Pro Ile

165 170 175

Thr Ser Met Ser Ala Pro Val Gln Ala Ser Ala Pro Ala Leu Thr Lys

180 185 190

Ser Gln Thr Asp Arg Leu Glu Val Leu Leu Asn Pro Lys Asp Glu Ile

195 200 205

Ser Leu Asn Ser Gly Lys Pro Phe Arg Glu Leu Glu Ser Glu Leu Leu

210 215 220

Ser Arg Arg Lys Lys Asp Leu Gln Gln Ile Tyr Ala Glu Glu Arg Glu

225 230 235 240

Asn Tyr Leu Gly Lys Leu Glu Arg Glu Ile Thr Arg Phe Phe Val Asp

245 250 255

Arg Gly Phe Leu Glu Ile Lys Ser Pro Ile Leu Ile Pro Leu Glu Tyr

260 265 270

Ile Glu Arg Met Gly Ile Asp Asn Asp Thr Glu Leu Ser Lys Gln Ile

275 280 285

Phe Arg Val Asp Lys Asn Phe Cys Leu Arg Pro Met Leu Ala Pro Asn

290 295 300

Leu Tyr Asn Tyr Leu Arg Lys Leu Asp Arg Ala Leu Pro Asp Pro Ile

305 310 315 320

Lys Ile Phe Glu Ile Gly Pro Cys Tyr Arg Lys Glu Ser Asp Gly Lys

325 330 335

Glu His Leu Glu Glu Phe Thr Met Leu Asn Phe Cys Gln Met Gly Ser

340 345 350

Gly Cys Thr Arg Glu Asn Leu Glu Ser Ile Ile Thr Asp Phe Leu Asn

355 360 365

His Leu Gly Ile Asp Phe Lys Ile Val Gly Asp Ser Cys Met Val Tyr

370 375 380

Gly Asp Thr Leu Asp Val Met His Gly Asp Leu Glu Leu Ser Ser Ala

385 390 395 400

Val Val Gly Pro Ile Pro Leu Asp Arg Glu Trp Gly Ile Asp Lys Pro

405 410 415

Trp Ile Gly Ala Gly Phe Gly Leu Glu Arg Leu Leu Lys Val Lys His

420 425 430

Asp Phe Lys Asn Ile Lys Arg Ala Ala Arg Ser Gly Ser Tyr Tyr Asn

435 440 445

Gly Ile Ser Thr Asn Leu

450

<210> 5

<211> 275

<212> PRT

<213> Methanomethylophilus alvus

<400> 5

Met Thr Val Lys Tyr Thr Asp Ala Gln Ile Gln Arg Leu Arg Glu Tyr

1 5 10 15

Gly Asn Gly Thr Tyr Glu Gln Lys Val Phe Glu Asp Leu Ala Ser Arg

20 25 30

Asp Ala Ala Phe Ser Lys Glu Met Ser Val Ala Ser Thr Asp Asn Glu

35 40 45

Lys Lys Ile Lys Gly Met Ile Ala Asn Pro Ser Arg His Gly Leu Thr

50 55 60

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65 70 75 80

Glu Val Arg Thr Pro Ile Phe Ile Ser Lys Asp Ala Leu Ala Arg Met

85 90 95

Thr Ile Thr Glu Asp Lys Pro Leu Phe Lys Gln Val Phe Trp Ile Asp

100 105 110

Glu Lys Arg Ala Leu Arg Pro Met Leu Ala Pro Asn Leu Tyr Ser Val

115 120 125

Met Arg Asp Leu Arg Asp His Thr Asp Gly Pro Val Lys Ile Phe Glu

130 135 140

Met Gly Ser Cys Phe Arg Lys Glu Ser His Ser Gly Met His Leu Glu

145 150 155 160

Glu Phe Thr Met Leu Asn Leu Val Asp Met Gly Pro Arg Gly Asp Ala

165 170 175

Thr Glu Val Leu Lys Asn Tyr Ile Ser Val Val Met Lys Ala Ala Gly

180 185 190

Leu Pro Asp Tyr Asp Leu Val Gln Glu Glu Ser Asp Val Tyr Lys Glu

195 200 205

Thr Ile Asp Val Glu Ile Asn Gly Gln Glu Val Cys Ser Ala Ala Val

210 215 220

Gly Pro His Tyr Leu Asp Ala Ala His Asp Val His Glu Pro Trp Ser

225 230 235 240

Gly Ala Gly Phe Gly Leu Glu Arg Leu Leu Thr Ile Arg Glu Lys Tyr

245 250 255

Ser Thr Val Lys Lys Gly Gly Ala Ser Ile Ser Tyr Leu Asn Gly Ala

260 265 270

Lys Ile Asn

275

<210> 6

<211> 99

<212> DNA

<213> 噬菌体T5(Bacteriophage T5)

<400> 6

aaatcataaa aaatttattt gctttgtgag cggataacaa ttataataga ttcaattgtg 60

agcggataac aatttcacac agaattcatt aaagaggag 99

<210> 7

<211> 819

<212> DNA

<213> Methanogenic archaeon ISO4-G1

<400> 7

atggtagtca aattcactga cagccaaatc caacatctga tggagtatgg tgataatgat 60

tggagcgagg cagaatttga ggacgctgct gctcgtgata aagagttttc aagccaattc 120

tccaagttga agagtgcgaa cgacaaagga ttgaaagacg tcattgcgaa cccgcgtaat 180

gacctgaccg accttgaaaa taagattcgt gagaaacttg ctgcacgcgg tttcatcgaa 240

gtgcatacgc ctatttttgt atctaagagt gcattagcca agatgacaat caccgaggat 300

catcctttat tcaagcaggt cttctggatc gacgacaaac gtgccttgcg tccaatgcat 360

gcgatgaatc tttataaggt aatgcgcgag ttgcgcgatc acacaaaggg accagtcaag 420

atcttcgaga ttggctcgtg cttccgcaag gaaagcaagt catcgacgca tttggaagaa 480

ttcactatgc tgaacttagt tgagatggga cccgatggcg accctatgga gcaccttaag 540

atgtatattg gagacatcat ggacgcggtt ggtgtagaat acaccacctc acgtgaggag 600

tctgatgtgt acgtagagac acttgacgtg gagatcaatg gaactgaagt tgcgtcagga 660

gcagtaggtc ctcataagct tgaccctgcc cacgatgtgc atgaaccctg ggcaggaatc 720

ggattcggac tggagcgtct gttgatgctt aagaacggta aatcgaatgc tcgtaagaca 780

ggcaaaagta tcacctattt gaatggttac aaattggat 819

<210> 8

<211> 71

<212> DNA

<213> Methanogenic archaeon ISO4-G1

<400> 8

ggagggcgct ccggcgagca aacgggtctc taaaacctgt aagcggggtt cgaccccccg 60

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<210> 9

<211> 71

<212> RNA

<213> Methanogenic archaeon ISO4-G1

<400> 9

ggagggcgcu ccggcgagca aacgggucuc uaaaaccugu aagcgggguu cgaccccccg 60

gccuuucgcc a 71

<210> 10

<211> 273

<212> PRT

<213> Methanogenic archaeon ISO4-G1

<400> 10

Met Val Val Lys Phe Thr Asp Ser Gln Ile Gln His Leu Met Glu Tyr

1 5 10 15

Gly Asp Asn Asp Trp Ser Glu Ala Glu Phe Glu Asp Ala Ala Ala Arg

20 25 30

Asp Lys Glu Phe Ser Ser Gln Phe Ser Lys Leu Lys Ser Ala Asn Asp

35 40 45

Lys Gly Leu Lys Asp Val Ile Ala Asn Pro Arg Asn Asp Leu Thr Asp

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Leu Glu Asn Lys Ile Arg Glu Lys Leu Ala Ala Arg Gly Phe Ile Glu

65 70 75 80

Val His Thr Pro Ile Phe Val Ser Lys Ser Ala Leu Ala Lys Met Thr

85 90 95

Ile Thr Glu Asp His Pro Leu Phe Lys Gln Val Phe Trp Ile Asp Asp

100 105 110

Lys Arg Ala Leu Arg Pro Met His Ala Met Asn Leu Tyr Lys Val Met

115 120 125

Arg Glu Leu Arg Asp His Thr Lys Gly Pro Val Lys Ile Phe Glu Ile

130 135 140

Gly Ser Cys Phe Arg Lys Glu Ser Lys Ser Ser Thr His Leu Glu Glu

145 150 155 160

Phe Thr Met Leu Asn Leu Val Glu Met Gly Pro Asp Gly Asp Pro Met

165 170 175

Glu His Leu Lys Met Tyr Ile Gly Asp Ile Met Asp Ala Val Gly Val

180 185 190

Glu Tyr Thr Thr Ser Arg Glu Glu Ser Asp Val Tyr Val Glu Thr Leu

195 200 205

Asp Val Glu Ile Asn Gly Thr Glu Val Ala Ser Gly Ala Val Gly Pro

210 215 220

His Lys Leu Asp Pro Ala His Asp Val His Glu Pro Trp Ala Gly Ile

225 230 235 240

Gly Phe Gly Leu Glu Arg Leu Leu Met Leu Lys Asn Gly Lys Ser Asn

245 250 255

Ala Arg Lys Thr Gly Lys Ser Ile Thr Tyr Leu Asn Gly Tyr Lys Leu

260 265 270

Asp

Claims

1.一种含非天然氨基酸的多肽的制作方法,其包括使Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶(PylRS)和非天然氨基酸接触的工序,且包括选自以下工序(a)和工序(b)的引入工序,

工序(a)：与利用使用了马氏甲烷八叠球菌的PylRS(MmPylRS)的无细胞蛋白质合成系统的情况相比,以更高的效率向多肽引入非天然氨基酸；

工序(b)：与利用使用了具有受glmS启动子控制的所述PylRS基因的载体的大肠杆菌蛋白质合成系统的情况、以及利用使用了具有受glnS启动子控制的所述PylRS基因的载体的大肠杆菌蛋白质合成系统的情况相比,以更高的效率向多肽引入非天然氨基酸。

2.根据权利要求1所述的制作方法,其中,

所述引入工序是与使用MmPylRS作为PylRS的情况相比以1.5倍以上的效率向多肽引入非天然氨基酸的工序。

3.根据权利要求1或2所述的制作方法,其中,

所述接触是在含有高浓度的所述PylRS的非天然氨基酸引入系统中进行的。

4.根据权利要求3所述的制作方法,其中,

所述非天然氨基酸引入系统为无细胞蛋白质合成系统的反应溶液,所述引入工序为所述工序(a)。

5.根据权利要求4所述的制作方法,其中,

所述反应溶液含有15μM以上的PylRS。

6.根据权利要求4或5所述的制作方法,其中,

所述反应溶液含有多核苷酸,所述多核苷酸编码与天然型在不同位点具有终止密码子的基因。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的制作方法,其包括混合含有5mg/mL以上的所述PylRS的溶液和非天然氨基酸从而制备混合溶液的工序，所述引入工序为所述工序(a)。

8.根据权利要求3所述的制作方法,其中,

所述非天然氨基酸引入系统为活细胞蛋白质合成系统的细胞,所述引入工序为所述工序(b)。

9.根据权利要求8所述的制作方法,其中,

所述细胞含有编码MaPylRS和高表达启动子的多核苷酸。

10.根据权利要求1～9中任一项所述的制作方法,其中,

所述PylRS为Methanomethylophilus属、Methanomassiliicoccus属或Methanoplasma属生物、或者Methanomassiliicoccales archaeon RumEn M1、Methanogenic archaeonISO4-H5、Methanogenic archaeon ISO4-G1或Thermoplasmatales archaeon BRNA1的PylRS。

11.根据权利要求1～9中任一项所述的制作方法,其中,

所述PylRS为Methanomethylophilus属生物的PylRS。

12.根据权利要求1～11中任一项所述的制作方法,其中,

所述PylRS与马氏甲烷八叠球菌的PylRS进行序列比对时,所述PylRS具有N末端侧的至少50个氨基酸缺失的氨基酸序列。

13.根据权利要求1～11中任一项所述的制作方法,其中,

所述PylRS为Methanomethylophilus alvus的PylRS(MaPylRS)。

14.根据权利要求1～10中任一项所述的制作方法,其中,

所述PylRS为Methanogenic archaeon ISO4-G1的PylRS(G1PylRS)。

15.根据权利要求1～14中任一项所述的制作方法,其中,

所述非天然氨基酸为赖氨酸衍生物、酪氨酸衍生物、苯丙氨酸衍生物、色氨酸衍生物、精氨酸衍生物、蛋氨酸衍生物、亮氨酸衍生物、组氨酸衍生物、脯氨酸衍生物、半胱氨酸衍生物、苏氨酸衍生物、丝氨酸衍生物、丙氨酸衍生物、异亮氨酸衍生物、缬氨酸衍生物、谷氨酰胺衍生物、谷氨酸衍生物、天冬酰胺衍生物、天冬氨酸衍生物、甘氨酸衍生物、硒代半胱氨酸衍生物、吡咯烷衍生物、犬尿氨酸衍生物、鸟氨酸衍生物、瓜氨酸衍生物、刀豆氨酸衍生物、二氨基庚二酸、或其中之一的α-羟酸衍生物。

16.根据权利要求1～15中任一项所述的制作方法,其中,

所述PylRS为天然型或变异型PylRS。

17.根据权利要求1～16中任一项所述的制作方法,其中,

所述含非天然氨基酸的多肽与药物结合。

18.一种向多肽引入非天然氨基酸的引入方法,其包括使Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS和非天然氨基酸接触的工序,且包括选自以下工序(a)和工序(b)的引入工序,

工序(a)：与利用使用了MmPylRS的无细胞蛋白质合成系统的情况相比,以更高的效率地向多肽引入非天然氨基酸；

工序(b)：与利用使用了具有受glmS启动子控制的所述PylRS基因的载体的大肠杆菌蛋白质合成系统的情况、以及利用使用了具有受glnS启动子控制的所述PylRS基因的载体的大肠杆菌蛋白质合成系统的情况相比，以更高的效率地向多肽引入非天然氨基酸。

19.一种非天然氨基酸引入系统,其含有高浓度的Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS。

20.根据权利要求19所述的非天然氨基酸引入系统,其为无细胞蛋白质合成系统的反应溶液。

21.根据权利要求20所述的非天然氨基酸引入系统,其中,

所述反应溶液含有15μM以上的PylRS。

22.根据权利要求20或21所述的非天然氨基酸引入系统,其中,

23.根据权利要求19所述的非天然氨基酸引入系统,其为活细胞蛋白质合成系统的细胞。

24.根据权利要求23所述的非天然氨基酸引入系统,其中,

所述细胞含有编码MaPylRS和高表达启动子的多核苷酸。

25.根据权利要求19～24中任一项所述的非天然氨基酸引入系统,其中,

所述PylRS为天然型或变异型PylRS。

26.一种无细胞蛋白质合成系统的反应溶液,其含有Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS。

27.根据权利要求26所述的反应溶液,其含有多核苷酸，所述多核苷酸编码与天然型在不同位点具有终止密码子的基因。

28.一种含非天然氨基酸的多肽的制作方法,其包括使Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS和非天然氨基酸在细胞外接触的工序。

29.根据权利要求28所述的制作方法,其与利用使用了MmPylRS的无细胞蛋白质合成系统的情况,非天然氨基酸引入效率更高。

30.根据权利要求28或29所述的制作方法,其中,

所述PylRS为天然型或变异型PylRS。

31.一种向多肽引入非天然氨基酸的方法,其包括使Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS和非天然氨基酸在细胞外接触的工序。

32.一种结合有非天然氨基酸的tRNA的制作方法,其包括使Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS、非天然氨基酸与tRNA在细胞外接触的工序。

33.一种纯化的Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS。

34.一种溶液,其含有5mg/mL以上的Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS。

35.根据权利要求34所述的溶液,其中,所述PylRS为天然型或变异型PylRS。

36.一种含非天然氨基酸的多肽的制作方法,其通过混合权利要求34或35所述的溶液和非天然氨基酸来制备混合溶液。

37.根据权利要求36所述的含非天然氨基酸的多肽的制作方法,其中,

所述混合溶液为无细胞蛋白质合成系统的反应溶液。

38.一种向多肽引入非天然氨基酸的方法,其包括向无细胞蛋白质合成系统的反应溶液添加权利要求34或35所述的溶液的工序。

39.一种向多肽引入非天然氨基酸的引入剂,其包括权利要求34或35所述的溶液。

40.一种结合了非天然氨基酸的tRNA的制作方法,其包括向无细胞蛋白质合成系统的反应溶液添加权利要求34或35所述的溶液的工序。

41.一种多核苷酸,其编码Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS和高表达启动子。

42.根据权利要求41所述的多核苷酸,其中,

所述PylRS为天然型或变异型PylRS。

43.一种细胞,其含有权利要求41或42所述的多核苷酸。

44.一种含非天然氨基酸的多肽的制作方法,其包括,

向细胞引入权利要求41或42所述的多核苷酸的工序,或

从权利要求40或41所述的多核苷酸表达PylRS的工序。

45.一种向多肽引入非天然氨基酸的方法,其包括,

向细胞引入权利要求41或42所述的多核苷酸的工序,或

从权利要求40或41所述的多核苷酸表达PylRS的工序。

46.一种向多肽引入非天然氨基酸的引入剂,其包括权利要求41或42所述的多核苷酸。

47.一种结合了非天然氨基酸的tRNA的制作方法,其包括,

向细胞引入权利要求41或42所述的多核苷酸的工序,或

从权利要求40或41所述的多核苷酸表达PylRS的工序。

48.一种含非天然氨基酸的多肽的制作方法,其包括由活细胞高表达Methanomassiliicoccales目或Thermoplasmatales目生物的PylRS的工序。