KR102089516B1

KR102089516B1 - Co 수화효소 및 이를 이용한 개미산의 제조방법

Info

Publication number: KR102089516B1
Application number: KR1020177037367A
Authority: KR
Inventors: 김용환; 민경선; 연영주; 조대행; 장민지; 최은규; 황호원
Original assignee: 주식회사 씨원켐
Priority date: 2016-01-06
Filing date: 2017-01-05
Publication date: 2020-03-16
Also published as: EP3216862A4; WO2017119731A1; EP3216862B1; EP3216862A1; US20180073042A1; US10240170B2; KR20180005712A; CN108603178A

Abstract

본 발명은 CO 수화효소 및 이를 이용한 개미산의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 CO 탈수소효소(CO dehydrogenase, CODH)와 CO₂ 환원효소(CO₂ reductase)를 결합시킨 CO를 개미산으로 직접 전환시킬 수 있는 새로운 효소인 CO 수화 효소(CO Hydratase) 및 그 용도에 관한 것이다.

Description

CO 수화효소 및 이를 이용한 개미산의 제조방법

본 발명은 CO 수화효소 및 이를 이용한 개미산의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 CO 탈수소효소(CO dehydrogenase, CODH)와 CO₂ 환원효소(CO₂ reductase)를 결합시킨 CO를 개미산으로 직접 전환시킬 수 있는 새로운 효소인 CO 수화효소(CO Hydratase) 및 그 용도에 관한 것이다.

일산화탄소는 제철소 등 산업현장에서 대량으로 발생하고 있으며 이는 지구 온난화를 유발하는 기체이자 두통, 의식불명을 일으키는 등 인체에 유해한 기체로서 그 농도가 해마다 증가하고 있으며 특히 중국 일대에서 많은 양이 배출되고 있어 일산화탄소의 전환이 환경적인 관점에서 많은 관심을 모으고 있다.

또한, 선진국들이 이산화탄소 배출량에 대해 탄소세를 부과하려는 움직임을 보이고 있는 실정에서 에너지를 많이 사용하는 산업기반을 가진 우리나라는 큰 부담일 수 밖에 없으며, 이를 해결할 이산화탄소 저감 기술의 개발이 절실한 상황이다.

미생물 배양기술과 유전공학적 기술의 획기적인 발달에 힘입어 생물공정에 의한 생물학적 물질(biochemical)의 생산이 점차 석유화학공정에 대하여 경쟁력을 갖게 되었다. 생물학적인 방법은 값싼 재생자원(renewable resource)을 원료로서 이용하고, 이산화탄소 등 지구온난화가스의 발생을 공정상에서 억제할 수 있기 때문에 환경문제를 근본적으로 해결할 수 있는 환경친화적 공정으로 알려져 있으므로, 균주개발 및 공정개선 등 원가절감을 위한 연구가 확대되고 있는 추세이다. 아울러, 생물학적 물질의 시장성이 매우 높아지고 있어, 미생물을 이용하여 생물자원(biomass)으로부터 생물학적 물질의 생산에 대한 연구가 전세계적으로 활발히 진행되고 있다.

유용 효소 복합체 연구 분야에서 기체를 기질로 하는 효소에 관한 연구가 많이 진행되어 오고 있다. 대한민국 등록특허 10-0315563의 경우 높은 성장 속도 및 수소전환속도를 가지는 시이트로박터 속 Y19를 이용한 일산화탄소를 수소로 전환시키는 방법을 제시하고 있으나, 혐기성 미생물 조건에서 일산화탄소를 전환시키고 있어 실용적인 접근에 어려움이 있으며, 기체를 기질로 하는 효소의 경우 대부분 이산화탄소 전환에 집중되어 있어 일산화탄소의 전환에 대한 연구는 부족한 부분이 있다.

이산화탄소로부터 직접 개미산(포름산, 포르메이트, formate, formic acid)을 제조하는 기술은 이산화탄소의 유용한 저감 방법이며, C1 계열의 석유화학 기초 물질인 개미산은 다른 석유화학제품의 원료로서 비교적 고부가화물질로 C1 화학의 중요한 중간체로 이용 가치가 크다.

일산화탄소로부터 개미산을 생성하기 위해서는, 먼저 일산화탄소 전환효소를 통해 CO로부터 CO₂를 생성한 다음, 이산화탄소 환원효소를 통해 상기 CO₂로부터 개미산을 생성하는 2단계의 생성과정을 거친다.

일산화탄소로부터 개미산을 생성하는 균주인 Methanosarcina barkeri는 보고된 바 있으나(Mazumder et al., Biotechnology Letters, 7(6):377-382, 1985), in vitro 상에서 개미산 생성에 관여하는 CO 탈수소효소와 CO₂ 환원효소를 결합시킨 효소복합체, 및 이를 이용한 개미산의 제조방법은 보고된 바 없다.

이산화탄소 환원효소인 개미산 탈수소효소(Formate dehydrogenase, FDH)를 활용하여 개미산을 합성하는 방법(US 20070042479)에서는 NAD+를 생물학적인 방법으로 재생하여 FDH를 촉매로 개미산 및 메탄올을 합성하는 방법에 개발하였고, FDH로부터 이산화탄소를 개미산이나 메탄올로 전환하기 위한 생물학적 NADH 재생방법(JP 2002233395, US 7087418) 및 전기화학적 NADH 재생방법(JP 06153904)이 발표되었다. 이러한 FDH를 촉매로 NADH를 매개체로 사용하여 이산화탄소를 개미산으로 제조하는 기술은 FDH가 개미산으로부터 이산화탄소로 전환하는 반응이 정반응인 효소촉매시스템에서 NADH의 농도 및 pH의 조절에 의해 역반응으로 수행해야하는 매우 어려운 반응일 뿐 아니라, NADH 및 FDH의 가격이 매우 높아 현실적으로 상용화단계까지 가기 어려운 반응시스템이 된다.

이러한 기술적 배경하에서, 본 발명자들은 CO를 개미산으로 직접 전환할 수 있는 CO 수화효소(CO hydratase)를 개발하고자 예의 노력한 결과, CO 탈수소효소(CO dehydrogenase, CODH)와 CO₂ 환원효소(CO₂ reductase)를 결합시킨 새로운 효소복합체인 CO 수화효소를 개발하고, 이를 이용할 경우 높은 효율로 CO로부터 개미산을 생성할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

발명의 요약

본 발명의 목적은 CO(일산화탄소)를 개미산으로 직접 전환시킬 수 있는 CO 수화효소를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 CO 수화효소를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터 및 재조합 미생물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 미생물을 배양하여 CO 수화효소를 생성한 다음, 이를 회수하는 단계를 포함하는 재조합 CO 수화효소의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 CO 수화효소를 이용하여 CO로부터 개미산의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 CO 수화효소 발현 미생물을 이용하여 CO로부터 개미산의 제조방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 CO 탈수소효소(CO dehydrogenase, CODH)와 CO₂ 환원효소(CO₂ reductase)가 결합되어 있고, CO(일산화탄소)를 개미산으로 직접 전환할 수 있는 CO 수화효소(Carbon Monoxide hydratase, CO hydratase)를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 CO 수화효소를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터 및 재조합 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 미생물을 배양하여 CO 수화효소를 발현시키는 단계를 포함하는 상기 CO 수화효소의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 상기 CO 수화효소 또는 상기 재조합 미생물 존재하에 CO를 공급하여, CO로부터 개미산을 합성하는 단계; 및 (b) 상기 합성된 개미산을 회수하는 단계를 포함하는 개미산의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 탄소원으로 CO 존재하에 상기 재조합 미생물을 배양하여 개미산을 생성하는 단계; 및 (b) 상기 생성된 개미산을 회수하는 단계를 포함하는 개미산의 제조방법을 제공한다.

도 1은 CO 탈수소효소(CO dehydrogenase, CODH)와 CO₂ 환원효소(CO₂ reductase)가 결합되어 있고, CO(일산화탄소)를 개미산으로 직접 전환할 수 있는 CO 수화효소(Carbon Monoxide hydratase, CO hydratase)를 나타낸 것이다.

발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

일산화탄소 전환효소를 이용하여 CO를 CO₂로 전환시킨 다음, 이산화탄소 전환효소를 이용하여 상기 CO₂를 개미산으로 전환시키는 종래 2단계 개미산 제조방법은 전환효율이 낮다는 것을 인지하고, 본 발명에서는 높은 효율로 CO를 개미산으로 전환시키기 위한 효소군을 함유하는 CO 수화효소를 제조하였다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, CO 탈수소효소(CO dehydrogenase, CODH)와 CO₂ 환원효소(CO₂ reductase)가 결합되어 있고, CO(일산화탄소)를 개미산으로 직접 전환할 수 있는 CO 수화효소(Carbon Monoxide hydratase, CO hydratase)에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 CO 탈수소효소를 코딩하는 유전자는 Pantoea sp.YR343, Moorella thermoacetica, Rhodospirillum rubrum, Carboxydothermus hydrogenoformans, Methanococcus vannielii, Methanosarcina barkeri, Methanothermobacter thermautotrophicus, Clostridium pasteurianum, Oligotropha carboxidovorans, Aeropyrum pernix, Ferroglobus placidus, 또는 Bacillus schlegelii 유래인 것을 이용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 CO 탈수소효소를 코딩하는 유전자는 바람직하게는 Pantoea sp.YR343에서 유래한 일산화탄소 탈수소효소(carbon monoxide dehydrogenase; CODH) 유전자(PsCODH)인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 일 양태에서는 Pantoea sp. YR343에서 유래한 CODH (PsCODH)를 발견, 선택하였다. 그 이유는 i) Pantoea species YR343이 E.coli와 계통학적으로 가깝고, ii) E.coli와 비슷하게 엔테로박테리아과(enterobacteriaae)에 속하며, iii)호기성/혐기성 CODH의 계통학적 경계에 위치하여, E.coli에 이종 발현 (heterologously expressed)된 혐기성 CODH의 특징을 부분적으로 가질 수 있기 때문이다. (Fesseler et al., 2015; Jeoung & Dobbek, 2007).

본 발명의 일 양태에서, PsCODH를 구성하는 각 coxL (GenBank accession: EJM96788), coxM(GenBank accession: EJM96789), coxS (GenBank accession: EJM96790) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 GenScript사(Piscataway, NJ, USA)에 의해 인위적으로 합성되었다. 이하 coxL 폴리펩티드는 L 체인(chain)으로, coxM 폴리펩디드는 M 체인으로, coxS 폴리펩티드는 S 체인으로 각각 칭하기로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 CO₂ 환원효소는 포름산 탈수소효소(formate dehydrogenase, FDH)인 것을 특징으로 할 수 있다. 여기서, 상기 FDH를 코딩하는 유전자는 Acetobacterium woodii, 티오바실러스 에스피(Thiobacillus sp), 메틸로박테리움 엑스토퀴엔스(Methylobacterium extorquens), 미코박테리움 바카이(Mycobacterium vaccae), 칸디다 보이디나디(Candida boidinii) 또는 하이호마이크로비움 에스피(Hyphomicrobium sp.) 유래인 것을 이용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

Acetobacterium woodii는 혐기성(anaerobic) 미생물로써, 도 1의 우드-융달 경로를 통해 이산화탄소를 아세테이트 혹은 CO로 전환한 뒤 일산화탄소 탈수소효소/아세틸-CoA 합성효소(CO dehydrogenase/Acetyl-CoA synthase, CODH/ACS)를 통해 최종적으로 아세테이트를 생성한다. 따라서, 상기 FDH를 코딩하는 유전자는 Acetobacterium woodii 유래인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 CO 수화효소는 융합단백질 또는 가교결합단백질인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 여기서, 상기 융합단백질은 링커 펩티드를 통해 inframe으로 CO 탈수소효소와 CO₂ 환원효소가 결합될 수 있고, 상기 가교결합단백질은 촉매활성부위가 유지되도록 CO 탈수소효소와 CO₂ 환원효소가 가교결합제의 처리를 통해 결합되어 있는 형태를 가질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 가교결합제는 디이소시아네이트, 디안히드라이드, 디에폭사이드, 디알데하이드,디이미드, 1-에틸-3-디메틸 아미노프로필카보디이미드, 글루타르알데하이드, 비스(이미도 에스테르), 비스(석신이미딜 에스테르) 및 디애시드 클로라이드로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 화합물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 다른 관점에서, 상기 CO 수화효소를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터 및 재조합 미생물에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "재조합 벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.

본 발명에서 "작동가능하게 연결된(operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용하여 용이하게 할 수 있다.

본 발명의 적합한 발현 벡터는 프로모터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열을 포함할 수 있다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 면역원성 표적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 일반 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 원핵 세포에는 lac, tac, T3 및 T7 프로모터가 있으나 이로 제한되지는 않는다. 진핵세포에는 원숭이 바이러스 40(SV40), 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, 사람 면역 결핍 바이러스(HIV), 예를 들면 HIV의 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터, 몰로니 바이러스, 시토메갈로바이러스(CMV), 엡스타인 바 바이러스(EBV), 로우스 사코마 바이러스(RSV) 프로모터 뿐만 아니라, β-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈, 사람 근육 크레아틴, 사람 메탈로티오네인 유래의 프로모터가 있으나 이것으로 제한되지는 않는다.

상기 발현 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함할 수 있다. 선택마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하므로 형질전환된 세포가 선별 가능하다. 또한, 벡터는 복제가능한 발현벡터인 경우, 복제가 개시되는 특정 핵산 서열인 복제원점(replication origin)을 포함할 수 있다.

외래 유전자를 삽입하기 위한 재조합 발현 벡터로는 플라스미드, 바이러스, 코즈미드 등 다양한 형태의 벡터를 사용할 수 있다. 재조합 벡터의 종류는 원핵세포 및 진핵세포의 각종 숙주세포에서 원하는 유전자를 발현하고 원하는 단백질을 생산하는 기능을 하는 한 특별히 한정되지 않지만, 강력한 활성을 나타내는 프로모터와 강한 발현력을 보유하면서 자연 상태와 유사한 형태의 외래 단백질을 대량으로 생산할 수 있는 벡터가 바람직하다.

세균 숙주에 사용할 수 있는 발현 벡터에는 pET, pRSET, pBluescript, pGEX2T, pUC 벡터, col E1, pCR1, pBR322, pMB9 및 이들의 유도체와 같이 대장균(Escherichia coli)에서 얻어지는 세균성 플라스미드, RP4와 같이 보다 넓은 숙주 범위를 갖는 플라스미드, λgt10과 λgt11, NM989와 같은 매우 다양한 파지 람다(phage lambda) 유도체로 예시될 수 있는 파지 DNA, 및 M13과 필라멘트성 단일가닥의 DNA 파지와 같은 기타 다른 DNA 파지가 포함된다. 특히, 대장균에서의 발현을 위해서는 안트라닐레이트 합성효소(TrpE) 및 카르복시 말단의 폴리링커를 코딩하는 DNA 서열을 포함할 수 있으며, 다른 발현 벡터 시스템은 베타-갈락토시다제(pEX); 람다 PL 말토스 결합 단백질(pMAL); 및 글루타치온 S-트랜스퍼레이즈(pGST)에 기초한다(Gene 67:31, 1988; Peptide Research 3:167, 1990).

효모에서 발현시키는 것이 요망되는 경우에, 효모에서 사용하기에 적합한 선택 유전자는 효모 플라스미드 Yrp7에 존재하는 trpl 유전자이다(Stinchcomb et al., Nature, 282:39, 1979; Kingsman et al, Gene, 7:141, 1979). Trpl 유전자는 트립토판 내에서 성장하는 능력이 결핍된 효모의 뮤턴트 균주, 예를 들어 ATCC No. 44076 또는 PEP4-1에 대한 선택 마커를 제공한다(Jones, Genetics, 85:12, 1977). 따라서 효모 숙주 세포 게놈 내에 trpl 유전자의 손상은 트립토판 부재 하에 성장에 의한 형질전환을 검출하기 위한 효과적인 환경을 제공한다. 유사하게 leu2-결함 효모 균주(ATCC 20,622 또는 38,626)는 Leu2 유전자를 함유하는 공지의 플라스미드에 의해 보완된다.

본 발명에서의 발현벡터에는 발현되는 DNA 서열 또는 단편에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 발현 조절 서열을 포함할 수 있다. 발현 조절 서열은 클로닝되는 DNA 서열의 발현을 제어 또는 조절하기 위해 벡터에 삽입된다. 유용한 발현조절 서열의 예는 lac 시스템, trp 시스템, tac 시스템, trc-시스템, 파아지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 부위, fd 코트 단백질의 조절부위, 효모의 당분해(glycolytic) 프로모터, 예를 들어 3-포스포글리세레이트 키나제의 프로모터, 효모 산 포스파타제의 프로모터, 예를 들어 Pho5, 효모알파 교배 인자의 프로모터 및 폴리오마, 아데노바이러스, 레트로바이러스 및 시미안 바이러스에서 유래한 프로모터, 예를 들어 SV40의 초기 및 후기의 프로모터, 및 원핵 또는 진핵세포 및 이들의 바이러스의 유전자 발현을 조절하는 것으로 알려진 다른 서열 및 이들의 조합물이 포함될 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다. 상기 재조합 벡터는 숙주세포에 삽입되어 형질전환체 또는 재조합 미생물을 형성한다. 상기 벡터의 적합한 숙주세포는 대장균, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스 속(Staphylococcus sp.)과 같은 원핵 세포일 수 있다. 또한, 아스페르길러스 속(Aspergillus sp.)과 같은 진균, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스 속(Schizosaccharomyces sp.) 및 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)와 같은 효모, 그 밖의 하등 진핵세포, 및 곤충으로부터의 세포와 같은 고등 진핵생물의 세포와 같은 진핵 세포일 수 있다.

본 발명에서 숙주세포로의 "형질 전환" 또는 "재조합"은 외래 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산칼슘(CaPO₄) 침전, 염화칼슘(CaCl₂) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로 박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 재조합 미생물을 배양하여 CO 수화효소를 발현시키는 단계를 포함하는 CO 수화효소의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 상기 CO 수화효소 또는 상기 재조합 미생물 존재하에 CO를 공급하여, CO로부터 개미산을 합성하는 단계; 및 (b) 상기 합성된 개미산을 회수하는 단계를 포함하는 개미산의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 탄소원으로 CO 존재하에 상기 재조합 미생물을 배양하여 개미산을 생성하는 단계; 및 (b) 상기 생성된 개미산을 회수하는 단계를 포함하는 개미산의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 CO는 혼합가스(syngas) 유래인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

이하 실시예에서는 CO 탈수소효소(CO dehydrogenase, CODH)로 Pantoea sp.YR343 유래 PsCODH를 사용하였고, CO₂ 환원효소로는 Acetobacterium woodii 유래의 포름산 탈수소효소(formate dehydrogenase, FDH)를 사용하였으나, CO 탈수소효소 활성을 가지는 효소나 CO 탈수소효소 활성을 가지는 효소라면 제한없이 사용할 수 있으며, CO₂ 환원효소로는 호기성 미생물인 Methylobacterium extorquens 유래 tungsten 함유 formate dehydrogenase, Rhodobacter capsulatus 유래 몰리브뎀 함유 formate dehydrogenase를 이용할 수 있으며, 관련 효소도 제한없이 사용할 수 있다.

실시예 1: CO 수화효소의 제조

CO 탈수소효소(CO dehydrogenase, CODH)와 CO₂ 환원효소(CO₂ reductase)가 결합되어 있고, CO(일산화탄소)를 개미산으로 직접 전환할 수 있는 CO 수화효소(Carbon Monoxide hydratase, CO hydratase), 및 이를 함유하는 재조합 미생물을 제조하고자 하였다.

1-1: CO 수화효소(융합단백질)

CO 수화효소가 하나의 융합단백질(fusion protein)로 발현되도록 제조하였다.

먼저, Pantoea sp.YR343 유래 PsCODH 유전자(서열번호 1) 및 Acetobacterium woodii 유래의 포름산 탈수소효소를 코딩하는 FDH 유전자(서열번호 2)는 GenScript사(Piscataway, NJ, USA)에 의해 인위적으로 합성하였다

상기 합성된 Pantoea sp.YR343 유래 PsCODH 유전자 및 Acetobacterium woodii 유래 FDH 유전자를 발현용 벡터 pQE-80(Quiagen, USA)에 클로닝한 다음, 상기 CODH 및 CO₂ reductase 유전자를 함유하는 벡터를 E.coli Top10 (DE3) 에 도입하여 CO 수화효소를 발현하는 재조합 미생물을 제조하였다.

그 다음, 상기 재조합 미생물을 배양하여 융합단백질의 형태로 CO 수화효소의 발현을 유도한 다음, CO 수화효소를 정제하였다.

상기 배양은 50 μg/mL 앰피실린과 1mM 농도의 몰리브렌산나트륨(sodium molybdate)이 포함되어 있는 LB medium (300mL, 1L 플라스크)에서, 37℃, 200 rpm의 조건으로 재조합 대장균을 배양하였다. 이후, 인덕션(induction) 및 in vivo 재분화(reconstitution)을 위해서 OD(optical density) 600값이 약 1.0이 된 후에 1.0mM 농도의 isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside(IPTG)와 100 μM 농도의 FAD를 각각 추가하였다. 이후, 온도를 25℃로 낮추었다. 24시간 배양 후, 12,000rpm에서 30분간 4℃ 환경에서 원심분리를 시켜 재조합 대장균을 수득하였으며, Ni-NTA 레진을 이용하여 융합단백질을 정제하였다.

1-2: CO 수화효소(가교결합단백질)

실시예 1-1에서 합성된 CODH 및 포름산 탈수소효소(formate dehydrogenase, FDH) 각각의 단백질을 코딩하는 유전자를 각각 발현용 벡터 pQE-80(Quiagen, USA)에 클로닝한 다음, 상기 CODH 또는 FDH를 함유하는 벡터를 각각의 E.coli Top10 (DE3) 에 도입하여 재조합 대장균을 제조하였다.

그 다음, 상기 재조합 미생물로부터 CODH 및 FDH 단백질들을 각각 실시예 1-1과 동일한 방법으로 배양 및 정제한 다음, 디이소시아네이트, 디안히드라이드, 디에폭사이드, 디알데하이드, 디이미드, 1-에틸-3-디메틸 아미노프로필카보디이미드, 글루타르알데하이드, 비스(이미도 에스테르), 비스(석신이미딜 에스테르) 및 디애시드 클로라이드로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 가교결합제의 처리를 통해 CODH 및 FDH가 가교결합(cross-link)된 가교결합단백질의 형태로 CO 수화효소를 제조하였다.

1-3: CO 수화효소의 금속 또는 도전성 담체에 고정화

그 다음, 상기 재조합 미생물로부터 CODH 및 FDH 단백질들을 각각 실시예 1-1과 동일한 방법으로 배양 및 정제한 다음, 이를 금속 또는 도전성 담체에 고정화하였다. 고정화방법은 금속 또는 도전성 담체(다공성 탄소파우더, 탄소나노튜브, 탄소그래핀, 백금착체 탄소파우더 등)의 다공성 특성을 이용하여 기공에 흡착시키는 방식을 이용하거나, 발현된 CODH 및 FDH에 포함된 histidine tag과 금속간의 친화적 상호작용을 이용하여 고정화하는 방법을 이용하였다.

실시예 2: CO 수화효소를 이용한 개미산의 제조방법

실시예 1에서 제조된 CO 수화효소(CO hydratase)(또는 상기 CO 수화효소가 발현된 재조합 미생물)에 적절한 조건하에서 CO를 공급하고 개미산을 제조하였다.

철강 제조 시 배출되는, 산소를 다량으로 포함하는 폐가스를 모사한 가스(질소 55 %, 산소 5%, 이산화탄소 20%, 일산화탄소 20%)를 1 mg/ml 농도의 실시예 1-1, 1-2, 1-3의 CO 수화효소가 포함된 수용액에 투입한 후, 일정 시간 후의 일산화탄소를 측정하여 효소에 의한 소모율 및 포름산 생성율을 확인하였다. 대조군으로는 1 mg/ml의 PsCODH와 FDH를 각각 함유하는 수용액을 사용하였다.

CO를 CO₂로 변환시키는 PsCODH의 기능을 확인하기 위해, CO 및 DT에 의한 PsCODH 환원(reduction) 결과를 비교하였다(Zhang et al., J. Biol. Chem. 285(17), 12571-12578, 2010). 포름산 생성량은 HPLC 분석을 통해 측정하였다.

그 결과, 각각의 CODH 및 CO₂ reductase를 이용하여 제조된 개미산의 생성효율에 비해 CO 수화효소인 융합단백질(실시예 1-1), 가교결합단백질(실시예 1-2) 또는 고정화된 효소(실시예 1-3)를 이용하여 제조된 개미산의 생성효율이 높게 나타나는 것을 확인하였다(표 1: CO 수화효소를 이용한 개미산의 생산).

실시예	CO 소모율(%)	개미산 생산 농도 (mM)
대조군(PaCODH 및 FDH 각각 처리)	21.3	13.4
실시예 1-1	50.5	50.4
실시예 1-2	42.2	34.1
실시예 1-3	32.0	27.2

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

본 발명에 따른 CO 수화효소는 특히 철강 제조 공정 등에서 발생한 CO를 포함하는 폐가스로부터 산업적으로 높은 가치를 지니는 유기 물질인 개미산으로 생산하는데 유용하다.

전자파일 첨부하였음.

<110> KWANGWOON UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COLLABORATION FOUNDATION <120> CO Hydratase and Method of Producint Formic Acid Using the Same <130> PP-B1833 <150> KR 10-2016-0001717 <151> 2016-01-06 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 3720 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PsCODH <400> 1 atgagcagcc aacatctgac caccccggcg ccggcgatga tgccgatcag cttcaaggtg 60 aacggtattc agcaacagct ggacgttgat acccgtacca ccctgctgga tgcgctgcgt 120 gagcacctgc acctgaccgg taccaagaaa ggctgcgatc atggccagtg cggtgcgtgc 180 accgtgatgg ttaacggccg tcgtatcaac agctgcctga ccctggcggt gatgcaacag 240 gacgcggata tcaccaccat tgaaggtctg ggcaacccgg accaactgca cccgctgcag 300 gcggcgttta tcaagcacga tggttaccaa tgcggctatt gcaccccggg tcagatttgc 360 agcagcatgg cggttctgga ggaaatcaaa gcgggcattc cgagccacgt gacccacgac 420 ctggttagcg cgccgcaact gaccgcggat gagatccgtg aacgtatgag cggtaacatt 480 tgccgttgcg gtgcgtatgc gaacatcctg gcggcgattg aggaatatgc ggagggtctg 540 gaatcatgaa tgaagagctt cacctaccaa cgtgttaaaa ccccggcgga 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Claims

CO 탈수소효소(CO dehydrogenase, CODH)와 포름산 탈수소효소(formate dehydrogenase, FDH)가 결합되어 있는 구조를 가지고, CO(일산화탄소)를 개미산으로 직접 전환하는 효소 활성을 가지는 CO 수화효소(Carbon Monoxide hydratase, CO hydratase).
삭제
제1항에 있어서, 상기 CO 탈수소효소는 판토에아 sp. YR343(Pantoea sp.YR343), 무렐라 써모아세티카(Moorella thermoacetica), 로도스피릴럼 루브럼(Rhodospirillum rubrum), 카복시오써머스 히드로게노포르만스( Carboxydothermus hydrogenoformans), 메타노코코스 반니엘리(Methanococcus vannielii), 메타노사르시나 바르커리(Methanosarcina barkeri), 메타노써모박터 썸모토트로피쿠스(Methanothermobacter thermautotrophicus), 클로스트리듐 파스퇴리아늠(Clostridium pasteurianum), 올리고트로파 카르복시도보란스(Oligotropha carboxidovorans), 아에로피룸 페르닉스(Aeropyrum pernix), 페로글로버스 플라시더스(Ferroglobus placidus) 및 바실러스 스클레겔리(Bacillus schlegelii)으로 구성된 군에서 선택되는 균주 유래인 것을 특징으로 하는 CO 수화효소.
제1항에 있어서, 상기 포름산 탈수소효소는 아세토박테리움 우디(Acetobacterium woodii), 티오바실러스 에스피(Thiobacillus sp), 메틸로박테리움 엑스토퀴엔스(Methylobacterium extorquens), 미코박테리움 바카이(Mycobacterium vaccae), 칸디다 보이디나디(Candida boidinii) 및 하이호마이크로비움 에스피(Hyphomicrobium sp.)으로 구성된 군에서 선택되는 균주 유래인 것을 특징으로 하는 CO 수화효소.
제1항의 CO 수화효소를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터.
제1항의 CO 수화효소를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 미생물.
제6항의 재조합 미생물을 배양하여 CO 수화효소를 발현시키는 단계를 포함하는 CO 수화효소의 제조방법.
다음 단계를 포함하는 개미산의 제조방법:
(a) 제1항의 CO 수화효소 또는 제6항의 재조합 미생물 존재하에 CO를 공급하여, CO로부터 개미산을 합성하는 단계; 및
(b) 상기 합성된 개미산을 회수하는 단계.
제8항에 있어서, 상기 CO는 혼합가스(syngas) 유래인 것을 특징으로 하는 제조방법.
다음 단계를 포함하는 개미산의 제조방법:
(a) 탄소원으로 CO 존재하에 제6항의 재조합 미생물을 배양하여 개미산을 생성하는 단계; 및
(b) 상기 생성된 개미산을 회수하는 단계.
제10항에 있어서, 상기 CO는 혼합가스(syngas) 유래인 것을 특징으로 하는 제조방법.