KR102393114B1 - 산소 내성 및 효소 활성이 우수한 일산화탄소 탈수소효소 및 그의 용도 - Google Patents
산소 내성 및 효소 활성이 우수한 일산화탄소 탈수소효소 및 그의 용도 Download PDFInfo
- Publication number
- KR102393114B1 KR102393114B1 KR1020200092551A KR20200092551A KR102393114B1 KR 102393114 B1 KR102393114 B1 KR 102393114B1 KR 1020200092551 A KR1020200092551 A KR 1020200092551A KR 20200092551 A KR20200092551 A KR 20200092551A KR 102393114 B1 KR102393114 B1 KR 102393114B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- carbon monoxide
- dehydrogenase
- monoxide dehydrogenase
- chcodh
- seq
- Prior art date
Links
- 108010031234 carbon monoxide dehydrogenase Proteins 0.000 title claims abstract description 180
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 93
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 title claims abstract description 93
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 title claims abstract description 93
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 54
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 52
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 52
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 title claims abstract description 39
- UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N Carbon monoxide Chemical compound [O+]#[C-] UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 49
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 claims abstract description 49
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 34
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims abstract description 18
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 claims abstract description 17
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 claims abstract description 17
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 36
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 34
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 34
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 34
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 30
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 23
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 23
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 20
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 20
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 5
- 235000019504 cigarettes Nutrition 0.000 abstract description 9
- 239000007789 gas Substances 0.000 abstract description 8
- 238000010411 cooking Methods 0.000 abstract description 4
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 abstract description 4
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 abstract description 4
- 238000002485 combustion reaction Methods 0.000 abstract description 3
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 abstract description 2
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000010959 steel Substances 0.000 abstract description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 41
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 41
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 38
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 37
- 241000620137 Carboxydothermus hydrogenoformans Species 0.000 description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 16
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 13
- 101710160473 Carbon monoxide dehydrogenase 2 Proteins 0.000 description 11
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 9
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 9
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 7
- -1 hydrogen ions Chemical class 0.000 description 7
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- QTQLUUDYDWDXNA-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-4-(1-ethylpyridin-1-ium-4-yl)pyridin-1-ium Chemical compound C1=C[N+](CC)=CC=C1C1=CC=[N+](CC)C=C1 QTQLUUDYDWDXNA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 6
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 5
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 5
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 5
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 4
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 4
- 241000023308 Acca Species 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 239000002912 waste gas Substances 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710160472 Carbon monoxide dehydrogenase 1 Proteins 0.000 description 2
- 241000193401 Clostridium acetobutylicum Species 0.000 description 2
- 241001656809 Clostridium autoethanogenum Species 0.000 description 2
- 241000193155 Clostridium botulinum Species 0.000 description 2
- 241000186570 Clostridium kluyveri Species 0.000 description 2
- 241000193469 Clostridium pasteurianum Species 0.000 description 2
- 241000193468 Clostridium perfringens Species 0.000 description 2
- 241000531185 Ferroglobus placidus Species 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical group CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 241000203378 Methanococcus vannielii Species 0.000 description 2
- 241000205275 Methanosarcina barkeri Species 0.000 description 2
- 241001302042 Methanothermobacter thermautotrophicus Species 0.000 description 2
- 241000121202 Oligotropha carboxidovorans Species 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 238000004887 air purification Methods 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011790 ferrous sulphate Substances 0.000 description 2
- 235000003891 ferrous sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100001261 hazardous Toxicity 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 description 2
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- QMMRZOWCJAIUJA-UHFFFAOYSA-L nickel dichloride Chemical compound Cl[Ni]Cl QMMRZOWCJAIUJA-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 2
- 238000006479 redox reaction Methods 0.000 description 2
- 102200068592 rs281865530 Human genes 0.000 description 2
- 102220339811 rs386833559 Human genes 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- ZFRKQXVRDFCRJG-UHFFFAOYSA-N skatole Chemical compound C1=CC=C2C(C)=CNC2=C1 ZFRKQXVRDFCRJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000567139 Aeropyrum pernix Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 1
- 241000193454 Clostridium beijerinckii Species 0.000 description 1
- 241000186566 Clostridium ljungdahlii Species 0.000 description 1
- 241001611023 Clostridium ragsdalei Species 0.000 description 1
- 241000186587 Clostridium scatologenes Species 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 1
- 241001522878 Escherichia coli B Species 0.000 description 1
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000600434 Homo sapiens Putative uncharacterized protein encoded by MIR7-3HG Proteins 0.000 description 1
- 101100321817 Human parvovirus B19 (strain HV) 7.5K gene Proteins 0.000 description 1
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 1
- 239000004201 L-cysteine Substances 0.000 description 1
- 235000013878 L-cysteine Nutrition 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- 101710192606 Latent membrane protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000193459 Moorella thermoacetica Species 0.000 description 1
- 241000460112 Murella Species 0.000 description 1
- 101100476480 Mus musculus S100a8 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000010718 Oxidation Activity Effects 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 102100037401 Putative uncharacterized protein encoded by MIR7-3HG Human genes 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 241000190984 Rhodospirillum rubrum Species 0.000 description 1
- 241000193448 Ruminiclostridium thermocellum Species 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 101710109576 Terminal protein Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 208000003443 Unconsciousness Diseases 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 229940097012 bacillus thuringiensis Drugs 0.000 description 1
- 239000013602 bacteriophage vector Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 101150110946 gatC gene Proteins 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000013383 initial experiment Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- VUZPPFZMUPKLLV-UHFFFAOYSA-N methane;hydrate Chemical compound C.O VUZPPFZMUPKLLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 125000001421 myristyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000001312 palmitoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- FGIUAXJPYTZDNR-UHFFFAOYSA-N potassium nitrate Chemical compound [K+].[O-][N+]([O-])=O FGIUAXJPYTZDNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 229940074386 skatole Drugs 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 125000004079 stearyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A62—LIFE-SAVING; FIRE-FIGHTING
- A62D—CHEMICAL MEANS FOR EXTINGUISHING FIRES OR FOR COMBATING OR PROTECTING AGAINST HARMFUL CHEMICAL AGENTS; CHEMICAL MATERIALS FOR USE IN BREATHING APPARATUS
- A62D3/00—Processes for making harmful chemical substances harmless or less harmful, by effecting a chemical change in the substances
- A62D3/02—Processes for making harmful chemical substances harmless or less harmful, by effecting a chemical change in the substances by biological methods, i.e. processes using enzymes or microorganisms
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D53/00—Separation of gases or vapours; Recovering vapours of volatile solvents from gases; Chemical or biological purification of waste gases, e.g. engine exhaust gases, smoke, fumes, flue gases, aerosols
- B01D53/34—Chemical or biological purification of waste gases
- B01D53/74—General processes for purification of waste gases; Apparatus or devices specially adapted therefor
- B01D53/84—Biological processes
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D53/00—Separation of gases or vapours; Recovering vapours of volatile solvents from gases; Chemical or biological purification of waste gases, e.g. engine exhaust gases, smoke, fumes, flue gases, aerosols
- B01D53/34—Chemical or biological purification of waste gases
- B01D53/74—General processes for purification of waste gases; Apparatus or devices specially adapted therefor
- B01D53/86—Catalytic processes
- B01D53/864—Removing carbon monoxide or hydrocarbons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
- C12Y102/02—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with a cytochrome as acceptor (1.2.2)
- C12Y102/02004—Carbon-monoxide dehydrogenase (cytochrome b-561)(1.2.2.4)
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D2255/00—Catalysts
- B01D2255/80—Type of catalytic reaction
- B01D2255/804—Enzymatic
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D2257/00—Components to be removed
- B01D2257/50—Carbon oxides
- B01D2257/502—Carbon monoxide
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D2258/00—Sources of waste gases
- B01D2258/06—Polluted air
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D2259/00—Type of treatment
- B01D2259/45—Gas separation or purification devices adapted for specific applications
- B01D2259/4508—Gas separation or purification devices adapted for specific applications for cleaning air in buildings
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D2259/00—Type of treatment
- B01D2259/45—Gas separation or purification devices adapted for specific applications
- B01D2259/4566—Gas separation or purification devices adapted for specific applications for use in transportation means
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/20—Air quality improvement or preservation, e.g. vehicle emission control or emission reduction by using catalytic converters
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/59—Biological synthesis; Biological purification
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Environmental & Geological Engineering (AREA)
- Business, Economics & Management (AREA)
- Emergency Management (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
일 양상은 산소 내성 및/또는 효소 활성이 증가된 일산화탄소 탈수소효소(CO dehydrogenase)에 관한 것으로, 구체적으로, 아미노산 잔기를 돌연변이시켜 산소 내성 및/또는 효소 활성이 증가된 돌연변이 일산화탄소 탈수소효소를 제공한다. 상기 일산화탄소 탈수소효소는 상온, 상압에서 독성이 있는 일산화탄소를 쉽게 산화시켜 이산화탄소로 전환시킴으로써 무독화할 수 있으며, 산소 등이 포함된 가스 중에도 일산화탄소를 효과적으로 산화시킬 수 있다. 나아가, 석유화학, 철강산업 등의 산업체, 담배 연소, 가정용 취사기구, 각종 보일러 연소 시 다량 배출되는 일산화탄소를 담배필터, 공기정화기, 가정용 취사기구 흡입필터, 가스보일러 등을 통해 제거가 가능한 바, 다양한 활용이 가능하다.
Description
산소 내성 및/또는 효소 활성이 우수한 일산화탄소 탈수소효소 및 그의 용도에 관한 것이다.
가정이나 산업현장에서 탄소의 불완전한 연소에 의하여 상당히 많은 양의 일산화탄소가 발생하고 있다. 일산화탄소는 산소에 비하여 매우 높은 친화력을 가지고 혈중 적혈구 세포의 헤모글로빈 단백질에 결합하는 특성을 보인다. 이로 인하여 일산화탄소가 일정 농도 이상이 포함된 공기를 흡입할 경우 산소 부족현상으로 인하여 심장 박동수 증가로 인한 혈압 증가로 인한 혈관 손상 및 최악의 경우 의식불명, 사망에까지 이를 수 있다. 따라서 공기 중에 포함된 독성의 일산화탄소를 상온상압하에서 간단히 산화하여 무해한 이산화탄소로 전환할 필요가 있다.
특히 담배의 경우 흡연자가 흡입하는 기체 중에 이산화탄소가 9 ~ 14% (45 ~ 65 mg / 담배 1개비)를 차지한다면 일산화탄소는 2.8 ~ 4.6% (14 ~ 23 mg / 담배 1개비)를 차지할 정도로 매우 높은 비율로 일산화탄소가 발생하고 흡입되어 흡연자 및 간접흡연자들의 건강을 치명적으로 위협하는 요인이 되고 있다. 담배필터에는 활성탄 등의 흡착제가 있으나 일산화탄소를 흡착할 정도의 특이성과 성능을 가지지 못하는 단점이 있어 일산화탄소를 효과적으로 제거하지 못하는 형편이다.
한편, 일산화탄소 탈수소효소(Carbon monoxide dehydrogenase, CO dehydrogenase: CODH)는 미생물 내에서 대사 효소 중 하나로서, 독성이 높은 일산화탄소 가스를 상온 및 상압에서 산화시켜 이산화탄소로 전환시킬 수 있는 효소이다(하기 반응식 1 참조). 이 때, 산소를 전자수용체로 사용하는 것이 아니고 물 분자를 전자수용체로 사용하는 것이 독특한 특성이며, 일산화탄소 산화에 있어서 산소 분자가 필요한 것이 아니고 물 분자가 필요하다.
[반응식 1]
CO + H2O ↔ CO2 + 2H+ + 2e-
현재까지 알려진 CO dehydrogenase는 상당히 효소의 단위 활성이 높은 장점이 있는 반면, 공기 중의 산소 분자에 극히 취약하여 효소의 활성이 급격히 감소하는 문제가 있었다. 일산화탄소가 포함된 폐가스 등에는 적은 농도라 할지라도 산소가 포함된 경우가 대부분이었고, CO dehydrogenase를 이용하여 폐가스 중에 포함된 CO를 산화 전환하려는 시도는 폐가스 중에 포함된 산소 분자에 의하여 CO dehydrogenase의 활성이 급격하게 감소하여 성공적으로 원하는 목적을 달성하지 못 하였었다.
이에 본 발명자들은 산소 내성이 우수할 뿐만 아니라 효소 활성도 우수한 CO dehydrgenase를 개발하기에 이르렀다.
Bond, S.R., Naus, C.C. 2012. RF-Cloning.org: an online tool for the design of restriction-free cloning projects. Nucleic Acids Res. 40(W1), W209-W213.
일 양상은 산소 내성 및/또는 효소 활성이 증가된 일산화탄소 탈수소효소(CO dehydrogenase)를 제공하는 것이다.
다른 양상은 산소 내성 및/또는 효소 활성이 증가된 일산화탄소 탈수소효소(CO dehydrogenase)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 산소 내성 및/또는 효소 활성이 증가된 일산화탄소 탈수소효소(CO dehydrogenase)를 발현하는 벡터를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 산소 내성 및/또는 효소 활성이 증가된 일산화탄소 탈수소효소(CO dehydrogenase)를 발현하는 미생물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 산소 내성 및/또는 효소 활성이 증가된 일산화탄소 탈수소효소(CO dehydrogenase)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 일산화탄소 탈수소효소의 제조 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 일산화탄소에 산소 내성 및/또는 효소 활성이 증가된 일산화탄소 탈수소효소(CO dehydrogenase)를 접촉시키는 단계를 포함하는 일산화탄소의 제거 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 일산화탄소에 산소 내성 및/또는 효소 활성이 증가된 일산화탄소 탈수소효소(CO dehydrogenase)를 접촉시키는 단계를 포함하는 이산화탄소의 제조 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 산소 내성 및/또는 효소 활성이 증가된 일산화탄소 탈수소효소(CO dehydrogenase)를 포함하는 일산화탄소 제거 장치를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 산소 내성 및/또는 효소 활성이 증가된 일산화탄소 탈수소효소(CO dehydrogenase)를 포함하는 필터를 제공하는 것이다.
일 양상은 산소 내성 및/또는 효소 활성이 증가된 일산화탄소 탈수소효소(CO dehydrogenase)를 제공한다.
상기 산소 내성은 산소 존재 하에서도 상기 일산화탄소 탈수소효소가 활성을 유지할 수 있는 능력을 의미하며, 구체적으로는 특정 농도의 산소와 효소를 먼저 접촉시킨 후 상기 일산화탄소 탈수소효소의 활성을 측정함으로써 확인할 수 있다.
또한 상기 산소 내성은 효소의 활성이 초기 활성 대비 20 내지 80%, 20 내지 70%, 20 내지 60%, 30 내지 80%, 30 내지 70%, 30 내지 60%, 40 내지 80%, 40 내지 70% 또는 40 내지 60%를 유지하는 최대 산소 농도를 측정함으로써 확인할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 일산화탄소 탈수소효소는 야생형(Wild type)에 비해 산소 내성이 1 내지 200배, 1 내지 150배, 1 내지 125배, 50 내지 200배, 50 내지 150배, 50 내지 125배, 75 내지 200배, 75 내지 150배 또는 75 내지 125배 증가된 것일 수 있다.
상기 효소 활성은 상기 일산화탄소 탈수소효소가 하기 반응식 1의 반응을 촉매하는 활성을 의미하는 것이다:
[반응식 1]
CO + H2O ↔ CO2 + 2H+ + 2e-.
상기 일산화탄소 탈수소효소의 활성은 일산화탄소 및 물을 상기 일산화탄소 탈수소효소에 접촉시켜 발생되는 이산화탄소, 수소이온 또는 전자를 측정함으로써 확인할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 일산화탄소 탈수소효소는 야생형(Wild type)에 비해 그 활성이 1 내지 200배, 1 내지 150배, 1 내지 125배, 50 내지 200배, 50 내지 150배, 50 내지 125배, 75 내지 200배, 75 내지 150배 또는 75 내지 125배 증가된 것일 수 있다.
상기 일산화탄소 탈수소효소는 천연으로부터 유래될 수도 있고, 당해 분야에서 널리 공지된 다양한 단백질 합성 방법으로 획득할 수 있다. 일례로서, 폴리뉴클레오티드 재조합과 단백질 발현 시스템을 이용하여 제조하거나 단백질 합성과 같은 화학적 합성을 통하여 시험관 내에서 합성하는 방법 및 무세포 단백질 합성법 등으로 제조될 수 있다. 또한, 일례로서, 상기 일산화탄소 탈수소효소는 펩티드, 식물 유래 조직이나 세포의 추출물, 미생물(예를 들어 세균류 또는 진균류, 그리고 특히 효모)의 배양으로 얻어진 생산물일 수 있다.
용어 "단백질(Protein)”는 아마이드 결합 (또는 펩티드 결합)으로 연결된 2개 이상의 아미노산으로 이루어진 폴리머를 의미한다.
상기 일산화탄소 탈수소효소는 일산화탄소 탈수소효소의 아미노산 서열과 각각 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85%이상, 약 90% 이상, 약 92% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 일산화탄소 탈수소효소는 일산화탄소 탈수소효소의 동질효소일 수 있다. 구체적으로 상기 일산화탄소 탈수소효소는 무렐라 써모아세티카(Moorella thermoacetica), 로도스피릴룸 루브룸(Rhodospirillum rubrum), 카르복시도써머스 하이드로게노포르만스(Carboxydothermus hydrogenoformans), 메타노코쿠스 바니엘리(Methanococcus vannielii), 메타노사르시나 바커리(Methanosarcina barkeri), 메타노써모박터 써마우토트로피커스(Methanothermobacter thermautotrophicus), 클로스티리듐 파스튜리아늄(Clostridium pasteurianum), 올리고트로파 카르복시도보란스(Oligotropha carboxidovorans), 에르피룸 페르닉스(Aeropyrum pernix), 페로글로버스 플라씨더스(Ferroglobus placidus), 클로스티리듐 아우토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum), 클로스트리듐 라그스달레이(Clostridium ragsdalei), 클로스티리듐 리융달리(Clostridium ljungdahlii), 클로스티리듐 스카톨로게네스(Clostridium scatologenes), 클로스티리듐 아세토뷰틸리쿰(Clostridium acetobutylicum), 클로스티리듐 베이예린키(Clostridium beijerinckii), 클로스티리듐 페르프린겐스(C. perfringens), 클로스티리듐 써모셀룸(C. thermocellum), 클로스티리듐 클루이베리(C. kluyveri), 클로스티리듐 보툴리늄(C. botulinum) 유래 일산화탄소 탈수소효소일 수 있고, 구체적으로 카르복시도써머스 하이드로게노포르만스(Carboxydothermus hydrogenoformans) 유래 일산화탄소 탈수소효소일 수 있고, 보다 구체적으로, 야생형의 카르복시도써머스 하이드로게노포르만스(Carboxydothermus hydrogenoformans) 유래 일산화탄소 탈수소효소-2(CODH-2)인 경우 서열번호 1의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질일 수 있고, 야생형의 카르복시도써머스 하이드로게노포르만스(Carboxydothermus hydrogenoformans) 유래 일산화탄소 탈수소효소-4(CODH-4)인 경우, 서열번호 2의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질일 수 있다.
또한, 상기 일산화탄소 탈수소효소는 일산화탄소 탈수소효소-1(CODH-1), 일산화탄소 탈수소효소-2(CODH-2), 일산화탄소 탈수소효소-3(CODH-3) 및 일산화탄소 탈수소효소-4(CODH-4)로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 일산화탄소 탈수소효소일 수 있으며, 구체적으로 일산화탄소 탈수소효소-2(CODH-2) 또는 일산화탄소 탈수소효소-4(CODH-4)일 수 있으며, 보다 구체적으로는 서열번호 1 또는 2의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질일 수 있다.
용어 "상동성(Homology)"은 야생형 아미노산 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 이러한 상동성의 비교는 당업계에서 널리 알려진 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있으며, 2개 이상의 서열간 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있다.
또한, 보다 나은 화학적 안정성, 강화된 약리 특성(반감기, 흡수성, 역가, 효능 등), 변경된 특이성(예를 들어, 광범위한 생물학적 활성 스펙트럼), 감소된 항원성을 획득하기 위하여, 상기 일산화탄소 탈수소효소의 N- 또는 C-말단에 보호기가 결합되어 있을 수 있다. 상기 보호기는 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG)일 수 있으나, 상기 일산화탄소 탈수소효소의 개질, 특히 일산화탄소 탈수소효소의 안정성을 증진시킬 수 있는 성분이라면, 제한없이 포함할 수 있다.
상기 용어 "안정성"은 생체 내 단백질 절단 효소의 공격으로부터 상기 일산화탄소 탈수소효소를 보호하는 인 비보(in vivo) 안정성뿐만 아니라, 저장 안정성(예컨대, 상온 저장 안정성)도 의미하는 것일 수 있다.
아울러, 상기 일산화탄소 탈수소효소는 표적화 서열, 태그 (tag), 표지된 잔기를 위한 특정 목적으로 제조된 아미노산 서열도 추가적으로 포함할 수 있고, 구체적으로 pET-28(서열번호 3) 플라스미드에서 발현되는 His-tag 말단의 단백질과 결합된 형태일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 일산화탄소 탈수소효소는 상기 일산화탄소 탈수소효소의 82번째 아미노산, 559번째 아미노산, 565번째 아미노산, 578번째 아미노산, 580번째 아미노산, 586번째 아미노산, 593번째 아미노산, 597번째 아미노산 및 610번째 아미노산으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산이 변형된 것일 수 있다.
또한, 일 실시예에 있어서, 상기 변형은 결실, 추가 및 치환으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나일 수 있고, 하나의 아미노산이 변형된 것일 수 있고, 두 개 이상의 아미노산이 변형된 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 일산화탄소 탈수소효소의 82번째 아미노산은 류신(Leucine)이고, 상기 일산화탄소 탈수소효소의 559번째 아미노산은 알라닌(Alanine)이고, 상기 일산화탄소 탈수소효소의 565번째 아미노산은 발린(Valine)이고, 상기 일산화탄소 탈수소효소의 578번째 아미노산은 트레오닌(Threonine)이고, 상기 일산화탄소 탈수소효소의 580번째 아미노산은 이소류신(Isoleucine)이고, 상기 일산화탄소 탈수소효소의 586번째 아미노산은 이소류신(Isoleucine)이고, 상기 일산화탄소 탈수소효소의 593번째 아미노산은 트레오닌(Threonine)이고, 상기 일산화탄소 탈수소효소의 597번째 아미노산은 트레오닌(Threonine)이고, 상기 일산화탄소 탈수소효소의 610번째 아미노산은 발린(Valine)일 수 있다.
또한, 일 실시예에 있어서, 상기 변형이 치환인 경우, 치환된 아미노산은 트립토판(Tryptophan), 티로신(Tyrosine), 세린(Serine), 히스티딘(Histidine), 아스파르트산(Aspartic acid), 글루탐산(Glutamic acid), 아스파라긴(Asparagine), 알라닌(Alanine), 트레오닌(Threonine), 글루타민(Glutamine), 류신(Leucine) 및 발린(Valine)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산일 수 있다.
구체적으로, 상기 일산화탄소 탈수소효소의 82번째 아미노산인 류신(Leucine)은 세린(Serine) 또는 발린(Valine)으로 치환될 수 있고; 상기 일산화탄소 탈수소효소의 559번째 아미노산인 알라닌(Alanine)은 트립토판(Tryptophan), 티로신(Tyrosine), 세린(Serine), 히스티딘(Histidine), 아스파르트산(Aspartic acid), 글루탐산(Glutamic acid), 아스파라긴(Asparagine), 트레오닌(Threonine) 또는 글루타민(Glutamine)으로 치환될 수 있고; 상기 일산화탄소 탈수소효소의 565번째 아미노산인 발린(Valine)은 알라닌(Alanine), 세린(Serine) 또는 류신(Leucine)으로 치환될 수 있고; 상기 일산화탄소 탈수소효소의 578번째 아미노산인 트레오닌(Threonine)은 세린(Serine)으로 치환될 수 있고; 상기 일산화탄소 탈수소효소의 580번째 아미노산인 이소류신(Isoleucine)은 류신(Leucine)으로 치환될 수 있고; 상기 일산화탄소 탈수소효소의 586번째 아미노산인 이소류신(Isoleucine)은 세린(Serine)으로 치환될 수 있고; 상기 일산화탄소 탈수소효소의 593번째 아미노산인 트레오닌(Threonine)은 세린(Serine)으로 치환될 수 있고; 상기 일산화탄소 탈수소효소의 597번째 아미노산인 트레오닌(Threonine)은 세린(Serine)으로 치환될 수 있고; 상기 일산화탄소 탈수소효소의 610번째 아미노산인 발린(Valine)은 알라닌(Alanine) 또는 세린(Serine)으로 치환될 수 있으며, 상기 치환은 하나의 아미노산이 치환된 것일 수 있고, 두 개 이상의 아미노산이 치환된 것일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 일산화탄소 탈수소효소는 서열번호 24 내지 43의 염기 서열로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질일 수 있다.
다른 양상은 산소 내성 및/또는 효소 활성이 증가된 일산화탄소 탈수소효소(CO dehydrogenase)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기 "산소 내성", "효소 활성" 또는 "일산화탄소 탈수소효소" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 복수의 뉴클레오티드가 연속적으로 연결된 것을 의미하며, 상기 폴리뉴클레오티드는 일산화탄소 탈수소효소를 발현할 수 있다.
용어 '발현(expression)'은 폴리펩티드(polypeptide)이 구조 유전자로부터 생산되는 과정을 지칭한다. 상기 과정은 유전자(폴리뉴클레오티드)의 mRNA로의 전사, 및 이러한 mRNA의 폴리펩티드(단백질)(들)로의 해독을 포함한다.
용어 '효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드'는 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(polynucleotide), 또는 부가적인 코딩 및/또는 넌-코딩(non-coding) 서열을 더 포함하는 폴리뉴클레오티드를 말한다.
상기 일산화탄소 탈수소효소가 야생형의 카르복시도써머스 하이드로게노포르만스(Carboxydothermus hydrogenoformans) 유래 일산화탄소 탈수소효소-2(CODH-2)인 경우 서열번호 1의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드일 수 있고, 야생형의 카르복시도써머스 하이드로게노포르만스(Carboxydothermus hydrogenoformans) 유래 일산화탄소 탈수소효소-4(CODH-4)인 경우, 서열번호 2의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
또한, 구체적으로 상기 산소 내성 및/또는 효소 활성이 증가된 일산화탄소 탈수소효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 24 내지 43의 염기 서열로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
또 다른 양상은 산소 내성 및/또는 효소 활성이 증가된 일산화탄소 탈수소효소(CO dehydrogenase)를 발현하는 벡터를 제공한다.
상기 "산소 내성", "효소 활성", "일산화탄소 탈수소효소" 또는 "발현" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
용어 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다.
상기 일산화탄소 탈수소효소를 발현하는 벡터는 재조합 벡터일 수 있고, 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예를 들면, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈(pET-28 포함) 및 pUC19 등), 파지 또는 바이러스 (예를 들면, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있고, 구체적으로, pET-28(서열번호 3)일 수 있다.
용어 '재조합 벡터'는 목적하는 클로닝된 유전자(들)를 함유하는 임의의 클로닝 또는 발현 벡터를 포함한다.
용어 '재조합'은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
상기 재조합 벡터에서 상기 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다.
용어 "작동 가능하게 연결된(operatively linked)"은 뉴클레오티드 발현 조절 서열(예를 들어, 프로모터 서열)과 다른 뉴클레오티드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미한다. 상기 조절 서열은 "작동 가능하게 연결(operatively linked)"됨으로써 다른 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절할 수 있다.
상기 재조합 벡터는, 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.
상기 재조합 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예를 들어, CMV 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
일 실시예에 있어서, 상기 재조합 벡터에 도입된 일산화탄소 탈수소효소를 코딩하는 유전자가 야생형의 카르복시도써머스 하이드로게노포르만스(Carboxydothermus hydrogenoformans) 유래 일산화탄소 탈수소효소-2(CODH-2)인 경우, 상기 재조합 벡터는 서열번호 4의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드일 수 있고, 야생형의 카르복시도써머스 하이드로게노포르만스(Carboxydothermus hydrogenoformans) 유래 일산화탄소 탈수소효소-4(CODH-4)인 경우, 상기 재조합 벡터는 서열번호 5의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
또 다른 양상은 산소 내성 또는 효소 활성이 증가된 일산화탄소 탈수소효소(CO dehydrogenase)를 발현하는 미생물을 제공한다.
상기 "산소 내성", "효소 활성", "일산화탄소 탈수소효소" 또는 "발현" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
상기 미생물은 재조합 미생물일 수 있고, 상기 미생물은 상기 재조합 벡터를 적절한 숙주 미생물에 도입시킴으로써 얻어진 것일 수 있다. 상기 미생물은 상기 재조합 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 또는 발현시킬 수 있는 세포로서 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 원핵 세포로는, 예를 들어, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며, 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어, Sp2/0, CHO(Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, PER.C6, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN, MDCK 세포주 등이 이용될 수 있고, 구체적으로, E. coli BL21일 수 있다.
또 다른 양상은 산소 내성 및/또는 효소 활성이 증가된 일산화탄소 탈수소효소(CO dehydrogenase)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 일산화탄소 탈수소효소의 제조 방법을 제공한다.
상기 "산소 내성", "효소 활성", "일산화탄소 탈수소효소", "발현" 또는 "미생물" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
상기 배양은 공지된 통상의 배양 방법일 수 있고, 구체적으로 상기 미생물에 일산화탄소 탈수소효소를 표지하는 단백질을 발현하는 플라스미드를 상기 미생물에 도입하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 제조 방법은 일산화탄소 탈수소효소의 발현을 촉진할 수 있는 물질을 처리하는 단계 및 단백질을 분리 및 정제하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 제조 방법에 의해 제조된 일산화탄소 탈수소효소는 산소 존재 하에서도 우수한 효소 활성을 나타낼 수 있다.
또 다른 양상은 일산화탄소에 산소 내성 및/또는 효소 활성이 증가된 일산화탄소 탈수소효소(CO dehydrogenase)를 접촉시키는 단계를 포함하는 일산화탄소의 제거 방법을 제공한다.
상기 "산소 내성", "효소 활성", "일산화탄소 탈수소효소" 또는 "발현" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
상기 접촉을 통해 일산화탄소는 물과 반응하여 이산화탄소, 수소이온, 전자로 변형되는 바, 일산화탄소가 제거될 수 있으며, 산소 존재 하에서도 우수한 효율로 이산화탄소가 제거될 수 있다.
또 다른 양상은 일산화탄소에 산소 내성 및/또는 효소 활성이 증가된 일산화탄소 탈수소효소(CO dehydrogenase)를 접촉시키는 단계를 포함하는 이산화탄소의 제조 방법을 제공한다.
상기 "산소 내성", "효소 활성", "일산화탄소 탈수소효소" 또는 "발현" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
상기 접촉을 통해 일산화탄소는 물과 반응하여 이산화탄소, 수소이온, 전자로 변형되는 바, 이산화탄소가 제조될 수 있으며, 산소 존재 하에서도 우수한 효율로 이산화탄소가 제조될 수 있다.
또 다른 양상은 산소 내성 및/또는 효소 활성이 증가된 일산화탄소 탈수소효소(CO dehydrogenase)를 포함하는 일산화탄소 제거 장치를 제공한다.
상기 "산소 내성", "효소 활성", "일산화탄소 탈수소효소" 또는 "발현" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
상기 장치에 포함된 일산화탄소 탈수소효소는 일산화탄소를 물과 반응시켜 이산화탄소, 수소이온, 전자로 변형시키는 바, 일산화탄소가 제거될 수 있으며, 산소 존재 하에서도 우수한 효율로 이산화탄소를 제거시킬 수 있다.
상기 장치는 유해 가스 처리 기술이 필요한 산업 현장, 공기 내 유해 물질 살균/제거 정화기술 및 시스템, 차량, 열차 등 이동수단 내 실내 공기질 관리를 위한 처리시설 및 관련기술, 환기효율 및 경제적 환기를 위한 기술 및 장치, 공기청정기, 에어컨, 환풍기 등과 같은 실내공기 정화장치 등에 포함될 수 있다.
또 다른 양상은 산소 내성 및/또는 효소 활성이 증가된 일산화탄소 탈수소효소(CO dehydrogenase)를 포함하는 필터를 제공한다.
상기 "산소 내성", "효소 활성", "일산화탄소 탈수소효소" 또는 "발현" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
상기 필터에 포함된 일산화탄소 탈수소효소는 일산화탄소를 물과 반응시켜 이산화탄소, 수소이온, 전자로 변형시키는 바, 일산화탄소가 제거될 수 있으며, 산소 존재 하에서도 우수한 효율로 일산화탄소를 제거시킬 수 있다.
상기 필터는 담배 필터, 공기청정기 필터 등 일산화탄소가 발생되는 장소에서 다양한 필터에 적용될 수 있으며, 나아가 유해 가스 처리 기술이 필요한 산업 현장, 공기 내 유해 물질 살균/제거 정화기술 및 시스템, 차량, 열차 등 이동수단 내 실내 공기질 관리를 위한 처리시설 및 관련기술, 환기효율 및 경제적 환기를 위한 기술 및 장치, 공기청정기, 에어컨, 환풍기 등과 같은 실내공기 정화장치 등에 포함될 수 있다.
일 양상에 따른 일산화탄소 탈수소효소는 산소 내성 및/또는 효소 활성이 증가된 것으로서, 상기 일산화탄소 탈수소효소는 상온, 상압에서 독성이 있는 일산화탄소를 쉽게 산화시켜 이산화탄소로 전환시킴으로써 무독화할 수 있으며, 산소 등이 포함된 가스 중에도 일산화탄소를 효과적으로 산화시킬 수 있다. 나아가, 석유화학, 철강산업 등의 산업체, 담배 연소, 가정용 취사기구, 각종 보일러 연소 시 다량 배출되는 일산화탄소를 담배필터, 공기정화기, 가정용 취사기구 흡입필터, 가스보일러 등을 통해 제거가 가능한 바, 다양한 활용이 가능하다.
도 1은 CO dehydrogenase 효소 단백질 서열에 의한 계통도이다.
도 2는 CO dehydrogenase 효소 단백질 서열 상호 비교를 나타낸 도이다.
도 2는 CO dehydrogenase 효소 단백질 서열 상호 비교를 나타낸 도이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 일산화탄소 탈수소효소(CODH)의 계통도 작성
현재까지 알려진 CO dehydrogenase의 서열 정보를 바탕으로 하기 도 1과 같은 계통도를 작성하였다.
이 중에서 가장 활성이 높은 CO dehydrogenase는 Carboxydothermus hydrogenoformans 유래 ChCODH-II로서 산소 내성이 있는 것으로 알려진 ChCODH-IV에 비하여 활성이 100 배 이상 높으나 산소에 대한 내성이 없어 산소 존재 하에서는 활성을 매우 빠르게 잃는 것으로 알려져 있다.
2. 다양한 일산화탄소 탈수소효소(CODH)들의 서열 비교
ChCODH-II와 ChCODH-IV를 포함하여 다양한 CO dehydrogenase 효소들의 서열을 상호 비교하여 산소 내성에 주로 관계가 있을 것으로 예상된 핵심 잔기를 결정하였다(도 2).
도 2와 같이 CODH들의 서열 비교를 통하여 ChCODH-II에서 산소 안정성에 관계가 있을 것으로 예상되는 잔기로서 L82(Leucine82), A559(Alanine559), V565(Valine565), T578(Threonine578), I580(Isoleucine580)를 결정하였다. 이 중에서 효소 활성이 측정이 되는 A559가 초기 실험결과 상당히 높은 활성을 보여 우선적으로 돌연변이체를 만들었으며, 이에 더하여 다른 부위를 더하여 추가적인 돌연변이체를 제작하여 실험을 진행하였다.
3. 일산화탄소 탈수소효소(CODH)의 돌연변이체 제작
산소 내성 CO 탈수소효소(CO dehydrogenase, CODH) 및 이를 함유하는 재조합 미생물을 제조하고자 하였다.
(1) 야생형 일산화탄소 탈수소효소
산소 내성 CO 탈수소효소의 유전자 변이 주형(template)으로 이용하기 위해 C. hydrogenoforman (GenBank no. NC_007503) 유래 ChCODH-2 및 ChCODH-4 단백질을 코딩하는 유전자(서열번호 1 및 2)는 GenScript사(Piscataway, NJ, USA)를 통해 인위적으로 합성하였다.
상기 합성된 C. hydrogenoforman 유래 ChCODH-2 혹은 ChCODH-4 유전자는 NdeI/BamHI 혹은 NdeI/XhoI의 제한효소들 (New England BioLabs Inc., US)로 37℃, 20분간 절단한 후, SolGent™ T4 DNA Ligase를 이용하여 발현용 벡터 pET-28(Novagen, USA, 서열번호 3)에 클로닝하였다. 상기 CO 탈수소효소 유전자를 함유하는 벡터(서열번호 4 및 5)를 대장균(Escherichia coli) BL21에 열충격 (heat chock, 42℃, 1분)도입하여 야생형 CO 탈수소효소를 함유하는 재조합 미생물을 제조하였다.
(2) 산소 내성 일산화탄소 탈수소효소
상기 합성된 야생형 ChCODH-2를 주형으로, 단일 혹은 복수의 아미노산 치환(single amino acid substitution)을 위해 부위-지정 돌연변이 유발(site-directed mutagenesis)을 진행하여 다양한 산소 내성 후보 CO 탈수소효소의 변이형들을 합성하였고, 이의 변이형 CO 탈수소효소를 함유하는 벡터는 상기 실시예 3.-(1)에서와 마찬가지로 대장균 BL21에 도입하여 변이형 CO 탈수소효소를 함유하는 재조합 미생물을 제조하였다.
상기 변이형 CO 탈수소효소 합성에서 사용된 프라이머의 정보는 하기 표 1과 같았다.
치환 아미노산 | 프라이머 | 삽입벡터 | 서열번호 |
A559W | F-5'gcgcggcggaatggatgcatgagaaggcggtgg | pET28a | 6 |
R-5'tctcatgcatccattccgccgcgctcgcaacc | 7 | ||
A559Y | F-5'gcgcggcggaatacatgcatgagaaggcggtgg | 8 | |
R-5'tctcatgcatgtattccgccgcgctcgcaacc | 9 | ||
A559S | F-5'cgcggcggaaagcatgcatgagaaggcggtgg | 10 | |
R-5'tctcatgcatgctttccgccgcgctcgcaacc | 11 | ||
A559H | F-5'cgcggcggaacacatgcatgagaaggcggtgg | 12 | |
R-5'tctcatgcatgtgttccgccgcgctcgcaacc | 13 | ||
A559D | F-5'cgcggcggaagatatgcatgagaaggcggtgg | 14 | |
R-5'tctcatgcatatcttccgccgcgctcgcaacc | 15 | ||
A559E | F-5'cgcggcggaagagatgcatgagaaggcgg | 16 | |
R-5'tctcatgcatctcttccgccgcgctcgcaa | 17 | ||
A559N | F-5'gcgcggcggaaaacatgcatgagaaggcggtgg | 18 | |
R-5'tctcatgcatgttttccgccgcgctcgcaacc | 19 | ||
V610A | F-5'gctacttcatcgcggaactggacccggagacc | 20 | |
R-5'ggtccagttccgcgatgaagtagccaccgg | 21 | ||
V610S | F-5'gctacttcatcagcgaactggacccggagacc | 22 | |
R-5'ggtccagttcgctgatgaagtagccaccgg | 23 | ||
A559W/V610A | A559W F&R; V610A F&R | - | |
A559W/V610S | A559W F&R; V610S F&R | - | |
A559S/V610A | A559S F&R; V610A F&R | - | |
A559S/V610S | A559S F&R; V610S F&R | - | |
A559H/V610A | A559H F&R; V610A F&R | - | |
A559H/V610S | A559H F&R; V610S F&R | - |
4. 산소 내성 일산화탄소 탈수소효소의 발현과 정제
상기 재조합 미생물 유래 산소 내성 일산화탄소 탈수소효소를 얻기 위해서 pET-28(서열번호 3) 발현벡터를 이용하여 His-tag말단의 변이형 CO 탈수소효소를 함유하는 발현벡터로 합성하였다. 합성된 변이형 CO 탈수소효소 발현벡터는 pRKISC(J. Biochem. 126:917, 1999) 플라스미드가 포함된 대장균 BL21으로 도입하여 최종 재조합 미생물을 완성하였고, 이를 각각 배양하여 His-tag말단의 단백질 형태로 발현을 유도하여 CO 탈수소효소를 정제하였다.
상기 배양은 50 μg/mL 카나마이신, 10 μg/mL 테트라사이클린, 0.02 mM 염화니켈 (NiCl2), 0.1 mM 황산제일철 (FeSO4), 2 mM 엘-시스테인(l-cysteine)이 포함되어 있는 TB medium (400 mL, 2 L 플라스크)에서, 37℃, 225 rpm의 조건으로 재조합 대장균을 호기적으로 배양하였다.
이 후, 효소의 발현 유도(induction)를 위해서 OD(optical density) 600값이 약 0.4 ~ 0.6이 된 후에 질소 치환(N2-fluxing)된 세럼병(serum bottle)에서 0.2 mM 농도의 isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside(IPTG)와 0.5 mM 염화니켈(NiCl2), 1 mM 황산제일철(FeSO4), 50 mM 질산칼륨(KNO3)를 각각 추가하였다. 이 때, 온도를 30℃로 낮추었다.
24시간 배양 후, 12,000 rpm에서 30분 간 4℃ 환경에서 원심 분리를 시켜 재조합 대장균을 수득하였으며, 혐기 챔버(anaerobic chamber)내에서 Ni-NTA 레진을 이용하여 효소를 정제하였다.
5. 일산화탄소 탈수소효소의 활성 측정
CO 탈수소효소의 CO 산화 반응 활성은 일산화탄소가 포화된 30℃ 반응 완충액 내에서 분광광도법(spectrophotometer, 578 nm)으로 효소에 의한 에틸바이올로젠(ethyl viologen, EV)의 산화-환원반응으로 측정되었다.
상기 반응은 일산화탄소 헤드스페이스를 가진 스크류캡 큐벳을 이용하였고 이때 반응액(2 mL)은 20 mM 산화 에틸바이올로젠 및 일산화탄소 포화된 50 mM HEPES/NaOH 버퍼(pH 8)를 포함하며 반응은 효소 주입으로 시작되어 2분 간 측정되었다. 여기서 CO 탈수소효소 활성의 1 단위(unit)는 온도 30℃, pH 8에서 1 mmol 산화된 에틸바이올로젠의 환원반응에 필요한 효소의 양으로 정의한다.
6. 일산화탄소 탈수소효소의 산소안정성 측정
CO 탈수소효소의 산소 안정성 측정은 0 - 250 mM 농도의 산소와 효소를 1분 간 먼저 반응시킨 후 효소의 잔류 활성을 실시예 5에서와 같이 분광광도법(578 nm)으로 산소 노출된 효소에 의한 에틸바이올로젠(ethyl viologen, EV)의 산화-환원반응을 측정하였다.
7. 일산화탄소 탈수소효소의 한 부위 돌연변이체 (single mutant)의 활성 및 산소 내성 측정
Carboxydothermus hydrogenoformans 유래 ChCODH-II의 야생종과 돌연변이체의 활성 및 산소 내성을 측정한 결과는 하기 표 2와 같았다. 산소 내성은 효소의 활성이 초기 활성 대비 50%를 유지하는 최대 산소 농도로 표시하였다.
CODH 종류 | 서열번호 | 활성 (U/mg) | 효소 활성을 유지하는 산소 농도 (mM) |
야생종 ChCODH-II | 1 | 1,000 | 1 |
야생종 ChCODH-IV | 2 | 100 | 25 |
ChCODH-II A559W | 24 | 3,000 | 25 |
ChCODH-II A559Y | 25 | 800 | 20 |
ChCODH-II A559S | 26 | 1,000 | 50 |
ChCODH-II A559T | 27 | 0 | 0 |
ChCODH-II A559N | 28 | 200 | <5 |
ChCODH-II A559Q | 29 | 400 | <1 |
ChCODH-II A559H | 30 | 10,000 | 50 |
ChCODH-II A559D | 31 | 400 | <5 |
ChCODH-II A559E | 32 | 300 | <5 |
실험 결과, 상기 표 2에서 볼 수 있듯이, ChCODH-II A559W와 A559H가 활성 및 산소 내성 측면에서 상당히 우수한 증가 특성을 나타내었다. 따라서 이 후 연구에서는 이들에 대하여 추가적인 돌연변이 잔기를 도입함으로써 산소 내성을 증가시기키는 연구를 진행하였다.
8. 일산화탄소 탈수소효소의 두 부위 돌연변이체(double mutant)의 활성 및 산소 내성 측정
Carboxydothermus hydrogenoformans 유래 ChCODH-II의 야생종과 돌연변이체의 활성 및 산소 내성을 측정한 결과는 하기 표 3과 같았다. 산소 내성은 효소의 활성이 초기 활성 대비 50%를 유지하는 최대 산소 농도를 표시하였다.
CODH 종류 | 서열번호 | 활성 (U/mg) | 효소 활성을 유지하는 산소 농도 (mM) |
야생종 ChCODH-II | 1 | 1,000 | 1 |
야생종 ChCODH-IV | 2 | 100 | 25 |
ChCODH-II A559W | 24 | 3,000 | 25 |
ChCODH-II A559W:V565A | 33 | 100 | 0 |
ChCODH-II A559W:V565S | 34 | 500 | <10 |
ChCODH-II A559Y:V565L | 35 | 1,500 | <10 |
ChCODH-II A559W:T578S | 36 | 1,500 | <10 |
ChCODH-II A559W:L82S | 37 | 2,000 | <50 |
ChCODH-II A559W:L82V | 38 | 1,000 | <50 |
ChCODH-II A559Y:I580L | 39 | 500 | 1 |
ChCODH-II A559H | 30 | 10,000 | 50 |
ChCODH-II A559H:I586S | 40 | 2,000 | <25 |
ChCODH-II A559H:T593S | 41 | 3,000 | <25 |
ChCODH-II A559H:T597S | 42 | 3,000 | <50 |
ChCODH-II A559H:V610S | 43 | 1,000 | 100 |
실험 결과, 표 3에서 볼 수 있듯이, A559H:V610S double mutant의 경우 효소의 활성이 50%를 유지하는 산소 농도가 100 mM에 달하여 야생종 ChCODH-II에 비해서 약 100배 정도 증가하였고, 여태까지 알려진 가장 산소 내성이 높은 야생종인 야생종 ChCODH-IV에 비해서도 4배 정도 높은 산소 내성을 보여주고 있으며, 야생종 ChCODH-IV에 비해서는 효소 활성이 약 10배 정도 증가한 특성을 보여주고 있다.
또한, 한 부위 돌연변이체 중 가장 산소 내성이 우수하였던 ChCODH-II A559H에 비해서도 2배 높은 산소 내성을 보였다.
<110> UNIST(ULSAN NATIONAL INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY)
<120> CARBON MONOXIDE DEHYDROGENASE HAVING OXYGEN RESISTANCE AND
INCREASED ENZYME ACTIVITY AND USES THEREOF
<130> PN134591KR
<160> 43
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1911
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Carboxydothermus hydrogenoformans
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1911)
<223> CARBON MONOXIDE DEHYDROGENASE-2
<400> 1
atggcgaaac aaaatctgaa gagcaccgac cgtgcggttc aacaaatgct ggataaagcg 60
aagcgtgagg gtattcaaac cgtgtgggat cgttacgagg cgatgaagcc gcagtgcggt 120
ttcggcgaaa ccggtctgtg ctgccgtcac tgcctgcaag gtccgtgccg tattaacccg 180
tttggcgatg agccgaaagt gggcatttgc ggtgcgaccg cggaagtgat cgttgcgcgt 240
ggtctggacc gtagcattgc ggcgggtgcg gcgggtcata gcggtcatgc gaagcacctg 300
gcgcacaccc tgaagaaagc ggtgcagggc aaagcggcga gctatatgat taaggaccgt 360
accaaactgc acagcatcgc gaagcgtctg ggtattccga ccgaaggcca aaaagacgag 420
gatattgcgc tggaagttgc gaaagcggcg ctggcggact tccatgagaa agataccccg 480
gttctgtggg tgaccaccgt tctgccgccg agccgtgtga aggttctgag cgcgcatggt 540
ctgatcccgg cgggtattga tcacgaaatc gcggagatta tgcaccgtac cagcatgggt 600
tgcgacgcgg atgcgcagaa cctgctgctg ggtggcctgc gttgcagcct ggcggacctg 660
gcgggttgct acatgggcac cgacctggcg gatatcctgt ttggtacccc ggcgccggtg 720
gttaccgaaa gcaacctggg cgtgctgaag gcggatgcgg tgaacgttgc ggtgcacggt 780
cacaacccgg ttctgagcga catcattgtt agcgtgagca aagagatgga aaacgaggcg 840
cgtgcggcgg gtgcgaccgg tatcaacgtg gttggtattt gctgcaccgg caacgaggtg 900
ctgatgcgtc acggtattcc ggcgtgcacc cacagcgtta gccaggaaat ggcgatgatc 960
accggcgcgc tggacgcgat gatcctggat tatcagtgca ttcaaccgag cgtggcgacc 1020
attgcggagt gcaccggtac caccgttatt accaccatgg aaatgagcaa aatcaccggt 1080
gcgacccatg tgaactttgc ggaggaagcg gcggttgaga acgcgaagca aatcctgcgt 1140
ctggcgattg atacctttaa acgtcgtaag ggtaaaccgg tggagatccc gaacattaag 1200
accaaagtgg ttgcgggctt cagcaccgaa gcgatcatta acgcgctgag caagctgaac 1260
gcgaacgatc cgctgaaacc gctgattgac aacgtggtta acggtaacat ccgtggcgtg 1320
tgcctgttcg cgggttgcaa caacgttaag gtgccgcagg accaaaactt taccaccatt 1380
gcgcgtaagc tgctgaaaca gaacgttctg gtggttgcga ccggttgcgg tgcgggtgcg 1440
ctgatgcgtc acggttttat ggacccggcg aacgtggatg agctgtgcgg cgacggtctg 1500
aaagcggttc tgaccgcgat cggtgaagcg aacggtctgg gtggcccgct gccgccggtg 1560
ctgcacatgg gtagctgcgt tgacaacagc cgtgcggtgg cgctggttgc ggcgctggcg 1620
aaccgtctgg gcgttgacct ggatcgtctg ccggtggttg cgagcgcggc ggaagcgatg 1680
catgagaagg cggtggcgat tggtacctgg gcggttacca tcggtctgcc gacccacatt 1740
ggtgtgctgc cgccgatcac cggcagcctg ccggtgaccc aaatcctgac cagcagcgtt 1800
aaagatatta ccggtggcta cttcatcgtt gaactggacc cggagaccgc ggcggacaaa 1860
ctgctggcgg cgatcaatga gcgtcgtgcg ggtctgggtc tgccgtggtg a 1911
<210> 2
<211> 1902
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Carboxydothermus hydrogenoformans
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1902)
<223> CARBON MONOXIDE DEHYDROGENASE-4
<400> 2
atggataaaa gcaagttatc agtagatcct gtgatcccga atttatatcg taaagccaga 60
gaggaaggga tttccactgt ttttgatcgt tatgaagcac agcagcctca gtgcggattt 120
gggcttacag gcctttgctg tcgtcattgc gtgcagggac cgtgccgcat agatccgttt 180
ggggaaggac cgcaagcggg catttgcggt gctaccgccg aggtaataac ggctcgcaat 240
ctgctgcgtc aagtcacggc gggtgctgcc gcccatgtag accatgcgta tgatgtgctg 300
gaagttttgg aacaaatcgc ccaaggtacg gaatcataca gtatcaaaga tcaagaaaag 360
ttaaagcagg tcgcttttac cttaggtata gataccgcta acaaaacaga gcaggagatt 420
gttgaagaga tgtgccaaat tatctatcgg gattttgcca attctggtgc aacaccgatg 480
acctatctga aagccaactc tcctcgggaa cgccttgaga catgggaaaa attaggggtt 540
ctgcctcgta acccagaccg tgaaatcaga gaagccttac accagactac aatggggatg 600
gatgcggacc cagtaaattt aatcttaaaa actattcgcc ttggtctggt tgatggtttt 660
gcgggtctca agttagcgac ggatttacag gacatcattt ttggcactcc ccagccagtt 720
gtcacagaag caaatctggg tgtactcaaa gaagattatg tgaatatcat agtccacggc 780
catgttccgt tacttagcga aaaaattgtt gaatggagca gaaagttgga agatgaggcg 840
aaaaaagcag gggcaaaagg aatcaatctt gcaggtatat gttgtactgg taacgaggtg 900
ttaatgcgtc agggtgtacc gttagcaaca aacttcctgg cccaggagtt ggcgattatt 960
acgggggcag ttgacttaat ggtagtggat gttcagtgta ttatgccctc attagcagaa 1020
attgctgctt gctatcatac ccgcttagtc actaccatgc cgattgtgaa aattccaggt 1080
gcggagcatg ttccgttcac cacagaaact gccgatgagg cctcgcagca gattgtgcgt 1140
atggctatag agagttacca aaaacgcaat ccagccaagg tctacatccc cagggaaaaa 1200
gccaaagttg tagcaggatt cagcgttgag gcaatagtaa aagcgttagc gaaactaaat 1260
cctgacgatc cgttaaagcc cttaattgat aatattgtgt ctggcaacat tctgggtgtg 1320
gtcgccaccg ttggttgtaa caatgtgaag gtcaagcatg attggttcca catagaatta 1380
gtaaaagaac taattaaaaa caatgtgtta gtggtgacta caggctgttc cgctcatgcg 1440
ttagcgaaag caggcttgat ggaccccgca gcagccgaat gggctggcga gggtttacga 1500
gccgtcttaa cggcaatagg cacggctaat gatttgggcg gcccgctgcc gcctgttttg 1560
cacatgggat cgtgtgttga taactcccga atcggggact tagtgatcgc cgtcgcaaac 1620
taccttaaag taagtccaaa agaccttccg attgcggctt ctgcacctga ataccagcat 1680
gaaaaggctt tgagcatcgg aacctgggcg gtagcgatgg gtattatgac ccacttggga 1740
gttgttccac ctgtggtcgg aagttcaaaa gttacccgta ttcttaccca agatgccgag 1800
gctttaatag gcggcaaatt ttatgtggaa acggacccat ataaagcagc agcgggcatc 1860
attgaacata ttaaggctaa acgggctcta ctgaatttat aa 1902
<210> 3
<211> 5369
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pET-28
<400> 3
atccggatat agttcctcct ttcagcaaaa aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa 60
ggggttatgc tagttattgc tcagcggtgg cagcagccaa ctcagcttcc tttcgggctt 120
tgttagcagc cggatctcag tggtggtggt ggtggtgctc gagtgcggcc gcaagcttgt 180
cgacggagct cgaattcgga tccgcgaccc atttgctgtc caccagtcat gctagccata 240
tggctgccgc gcggcaccag gccgctgctg tgatgatgat gatgatggct gctgcccatg 300
gtatatctcc ttcttaaagt taaacaaaat tatttctaga ggggaattgt tatccgctca 360
caattcccct atagtgagtc gtattaattt cgcgggatcg agatctcgat cctctacgcc 420
ggacgcatcg tggccggcat caccggcgcc acaggtgcgg ttgctggcgc ctatatcgcc 480
gacatcaccg atggggaaga tcgggctcgc cacttcgggc tcatgagcgc ttgtttcggc 540
gtgggtatgg tggcaggccc cgtggccggg ggactgttgg gcgccatctc cttgcatgca 600
ccattccttg cggcggcggt gctcaacggc ctcaacctac tactgggctg cttcctaatg 660
caggagtcgc ataagggaga gcgtcgagat cccggacacc atcgaatggc gcaaaacctt 720
tcgcggtatg gcatgatagc gcccggaaga gagtcaattc agggtggtga atgtgaaacc 780
agtaacgtta tacgatgtcg cagagtatgc cggtgtctct tatcagaccg tttcccgcgt 840
ggtgaaccag gccagccacg tttctgcgaa aacgcgggaa aaagtggaag cggcgatggc 900
ggagctgaat tacattccca accgcgtggc acaacaactg gcgggcaaac agtcgttgct 960
gattggcgtt gccacctcca gtctggccct gcacgcgccg tcgcaaattg tcgcggcgat 1020
taaatctcgc gccgatcaac tgggtgccag cgtggtggtg tcgatggtag aacgaagcgg 1080
cgtcgaagcc tgtaaagcgg cggtgcacaa tcttctcgcg caacgcgtca gtgggctgat 1140
cattaactat ccgctggatg accaggatgc cattgctgtg gaagctgcct gcactaatgt 1200
tccggcgtta tttcttgatg tctctgacca gacacccatc aacagtatta ttttctccca 1260
tgaagacggt acgcgactgg gcgtggagca tctggtcgca ttgggtcacc agcaaatcgc 1320
gctgttagcg ggcccattaa gttctgtctc ggcgcgtctg cgtctggctg gctggcataa 1380
atatctcact cgcaatcaaa ttcagccgat agcggaacgg gaaggcgact ggagtgccat 1440
gtccggtttt caacaaacca tgcaaatgct gaatgagggc atcgttccca ctgcgatgct 1500
ggttgccaac gatcagatgg cgctgggcgc aatgcgcgcc attaccgagt ccgggctgcg 1560
cgttggtgcg gatatctcgg tagtgggata cgacgatacc gaagacagct catgttatat 1620
cccgccgtta accaccatca aacaggattt tcgcctgctg gggcaaacca gcgtggaccg 1680
cttgctgcaa ctctctcagg gccaggcggt gaagggcaat cagctgttgc ccgtctcact 1740
ggtgaaaaga aaaaccaccc tggcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 1800
cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca 1860
acgcaattaa tgtaagttag ctcactcatt aggcaccggg atctcgaccg atgcccttga 1920
gagccttcaa cccagtcagc tccttccggt gggcgcgggg catgactatc gtcgccgcac 1980
ttatgactgt cttctttatc atgcaactcg taggacaggt gccggcagcg ctctgggtca 2040
ttttcggcga ggaccgcttt cgctggagcg cgacgatgat cggcctgtcg cttgcggtat 2100
tcggaatctt gcacgccctc gctcaagcct tcgtcactgg tcccgccacc aaacgtttcg 2160
gcgagaagca ggccattatc gccggcatgg cggccccacg ggtgcgcatg atcgtgctcc 2220
tgtcgttgag gacccggcta ggctggcggg gttgccttac tggttagcag aatgaatcac 2280
cgatacgcga gcgaacgtga agcgactgct gctgcaaaac gtctgcgacc tgagcaacaa 2340
catgaatggt cttcggtttc cgtgtttcgt aaagtctgga aacgcggaag tcagcgccct 2400
gcaccattat gttccggatc tgcatcgcag gatgctgctg gctaccctgt ggaacaccta 2460
catctgtatt aacgaagcgc tggcattgac cctgagtgat ttttctctgg tcccgccgca 2520
tccataccgc cagttgttta ccctcacaac gttccagtaa ccgggcatgt tcatcatcag 2580
taacccgtat cgtgagcatc ctctctcgtt tcatcggtat cattaccccc atgaacagaa 2640
atccccctta cacggaggca tcagtgacca aacaggaaaa aaccgccctt aacatggccc 2700
gctttatcag aagccagaca ttaacgcttc tggagaaact caacgagctg gacgcggatg 2760
aacaggcaga catctgtgaa tcgcttcacg accacgctga tgagctttac cgcagctgcc 2820
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 2880
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 2940
ttggcgggtg tcggggcgca gccatgaccc agtcacgtag cgatagcgga gtgtatactg 3000
gcttaactat gcggcatcag agcagattgt actgagagtg caccatatat gcggtgtgaa 3060
ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc gctcttccgc ttcctcgctc 3120
actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg 3180
gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc 3240
cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc 3300
ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga 3360
ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc 3420
ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat 3480
agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg 3540
cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc 3600
aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga 3660
gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact 3720
agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt 3780
ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag 3840
cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg 3900
tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgaa caataaaact 3960
gtctgcttac ataaacagta atacaagggg tgttatgagc catattcaac gggaaacgtc 4020
ttgctctagg ccgcgattaa attccaacat ggatgctgat ttatatgggt ataaatgggc 4080
tcgcgataat gtcgggcaat caggtgcgac aatctatcga ttgtatggga agcccgatgc 4140
gccagagttg tttctgaaac atggcaaagg tagcgttgcc aatgatgtta cagatgagat 4200
ggtcagacta aactggctga cggaatttat gcctcttccg accatcaagc attttatccg 4260
tactcctgat gatgcatggt tactcaccac tgcgatcccc gggaaaacag cattccaggt 4320
attagaagaa tatcctgatt caggtgaaaa tattgttgat gcgctggcag tgttcctgcg 4380
ccggttgcat tcgattcctg tttgtaattg tccttttaac agcgatcgcg tatttcgtct 4440
cgctcaggcg caatcacgaa tgaataacgg tttggttgat gcgagtgatt ttgatgacga 4500
gcgtaatggc tggcctgttg aacaagtctg gaaagaaatg cataaacttt tgccattctc 4560
accggattca gtcgtcactc atggtgattt ctcacttgat aaccttattt ttgacgaggg 4620
gaaattaata ggttgtattg atgttggacg agtcggaatc gcagaccgat accaggatct 4680
tgccatccta tggaactgcc tcggtgagtt ttctccttca ttacagaaac ggctttttca 4740
aaaatatggt attgataatc ctgatatgaa taaattgcag tttcatttga tgctcgatga 4800
gtttttctaa gaattaattc atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac 4860
aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgaaattgta aacgttaata 4920
ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc attttttaac caataggccg 4980
aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga gatagggttg agtgttgttc 5040
cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc caacgtcaaa gggcgaaaaa 5100
ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc ctaatcaagt tttttggggt 5160
cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag cccccgattt agagcttgac 5220
ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa agcgaaagga gcgggcgcta 5280
gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac cacacccgcc gcgcttaatg 5340
cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgcca 5369
<210> 4
<211> 7244
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pET-28-ChCODH-2
<400> 4
atccggatat agttcctcct ttcagcaaaa aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa 60
ggggttatgc tagttattgc tcagcggtgg cagcagccaa ctcagcttcc tttcgggctt 120
tgttagcagc cggatctcag tggtggtggt ggtggtgctc gagtgcggcc gcaagcttgt 180
cgacggagct cgaattcgga tcctcaccac ggcagaccca gacccgcacg acgctcattg 240
atcgccgcca gcagtttgtc cgccgcggtc tccgggtcca gttcaacgat gaagtagcca 300
ccggtaatat ctttaacgct gctggtcagg atttgggtca ccggcaggct gccggtgatc 360
ggcggcagca caccaatgtg ggtcggcaga ccgatggtaa ccgcccaggt accaatcgcc 420
accgccttct catgcatcgc ttccgccgcg ctcgcaacca ccggcagacg atccaggtca 480
acgcccagac ggttcgccag cgccgcaacc agcgccaccg cacggctgtt gtcaacgcag 540
ctacccatgt gcagcaccgg cggcagcggg ccacccagac cgttcgcttc accgatcgcg 600
gtcagaaccg ctttcagacc gtcgccgcac agctcatcca cgttcgccgg gtccataaaa 660
ccgtgacgca tcagcgcacc cgcaccgcaa ccggtcgcaa ccaccagaac gttctgtttc 720
agcagcttac gcgcaatggt ggtaaagttt tggtcctgcg gcaccttaac gttgttgcaa 780
cccgcgaaca ggcacacgcc acggatgtta ccgttaacca cgttgtcaat cagcggtttc 840
agcggatcgt tcgcgttcag cttgctcagc gcgttaatga tcgcttcggt gctgaagccc 900
gcaaccactt tggtcttaat gttcgggatc tccaccggtt tacccttacg acgtttaaag 960
gtatcaatcg ccagacgcag gatttgcttc gcgttctcaa ccgccgcttc ctccgcaaag 1020
ttcacatggg tcgcaccggt gattttgctc atttccatgg tggtaataac ggtggtaccg 1080
gtgcactccg caatggtcgc cacgctcggt tgaatgcact gataatccag gatcatcgcg 1140
tccagcgcgc cggtgatcat cgccatttcc tggctaacgc tgtgggtgca cgccggaata 1200
ccgtgacgca tcagcacctc gttgccggtg cagcaaatac caaccacgtt gataccggtc 1260
gcacccgccg cacgcgcctc gttttccatc tctttgctca cgctaacaat gatgtcgctc 1320
agaaccgggt tgtgaccgtg caccgcaacg ttcaccgcat ccgccttcag cacgcccagg 1380
ttgctttcgg taaccaccgg cgccggggta ccaaacagga tatccgccag gtcggtgccc 1440
atgtagcaac ccgccaggtc cgccaggctg caacgcaggc cacccagcag caggttctgc 1500
gcatccgcgt cgcaacccat gctggtacgg tgcataatct ccgcgatttc gtgatcaata 1560
cccgccggga tcagaccatg cgcgctcaga accttcacac ggctcggcgg cagaacggtg 1620
gtcacccaca gaaccggggt atctttctca tggaagtccg ccagcgccgc tttcgcaact 1680
tccagcgcaa tatcctcgtc tttttggcct tcggtcggaa tacccagacg cttcgcgatg 1740
ctgtgcagtt tggtacggtc cttaatcata tagctcgccg ctttgccctg caccgctttc 1800
ttcagggtgt gcgccaggtg cttcgcatga ccgctatgac ccgccgcacc cgccgcaatg 1860
ctacggtcca gaccacgcgc aacgatcact tccgcggtcg caccgcaaat gcccactttc 1920
ggctcatcgc caaacgggtt aatacggcac ggaccttgca ggcagtgacg gcagcacaga 1980
ccggtttcgc cgaaaccgca ctgcggcttc atcgcctcgt aacgatccca cacggtttga 2040
ataccctcac gcttcgcttt atccagcatt tgttgaaccg cacggtcggt gctcttcaga 2100
ttttgtttcg ccatatggct gccgcgcggc accaggccgc tgctgtgatg atgatgatga 2160
tggctgctgc ccatggtata tctccttctt aaagttaaac aaaattattt ctagagggga 2220
attgttatcc gctcacaatt cccctatagt gagtcgtatt aatttcgcgg gatcgagatc 2280
tcgatcctct acgccggacg catcgtggcc ggcatcaccg gcgccacagg tgcggttgct 2340
ggcgcctata tcgccgacat caccgatggg gaagatcggg ctcgccactt cgggctcatg 2400
agcgcttgtt tcggcgtggg tatggtggca ggccccgtgg ccgggggact gttgggcgcc 2460
atctccttgc atgcaccatt ccttgcggcg gcggtgctca acggcctcaa cctactactg 2520
ggctgcttcc taatgcagga gtcgcataag ggagagcgtc gagatcccgg acaccatcga 2580
atggcgcaaa acctttcgcg gtatggcatg atagcgcccg gaagagagtc aattcagggt 2640
ggtgaatgtg aaaccagtaa cgttatacga tgtcgcagag tatgccggtg tctcttatca 2700
gaccgtttcc cgcgtggtga accaggccag ccacgtttct gcgaaaacgc gggaaaaagt 2760
ggaagcggcg atggcggagc tgaattacat tcccaaccgc gtggcacaac aactggcggg 2820
caaacagtcg ttgctgattg gcgttgccac ctccagtctg gccctgcacg cgccgtcgca 2880
aattgtcgcg gcgattaaat ctcgcgccga tcaactgggt gccagcgtgg tggtgtcgat 2940
ggtagaacga agcggcgtcg aagcctgtaa agcggcggtg cacaatcttc tcgcgcaacg 3000
cgtcagtggg ctgatcatta actatccgct ggatgaccag gatgccattg ctgtggaagc 3060
tgcctgcact aatgttccgg cgttatttct tgatgtctct gaccagacac ccatcaacag 3120
tattattttc tcccatgaag acggtacgcg actgggcgtg gagcatctgg tcgcattggg 3180
tcaccagcaa atcgcgctgt tagcgggccc attaagttct gtctcggcgc gtctgcgtct 3240
ggctggctgg cataaatatc tcactcgcaa tcaaattcag ccgatagcgg aacgggaagg 3300
cgactggagt gccatgtccg gttttcaaca aaccatgcaa atgctgaatg agggcatcgt 3360
tcccactgcg atgctggttg ccaacgatca gatggcgctg ggcgcaatgc gcgccattac 3420
cgagtccggg ctgcgcgttg gtgcggatat ctcggtagtg ggatacgacg ataccgaaga 3480
cagctcatgt tatatcccgc cgttaaccac catcaaacag gattttcgcc tgctggggca 3540
aaccagcgtg gaccgcttgc tgcaactctc tcagggccag gcggtgaagg gcaatcagct 3600
gttgcccgtc tcactggtga aaagaaaaac caccctggcg cccaatacgc aaaccgcctc 3660
tccccgcgcg ttggccgatt cattaatgca gctggcacga caggtttccc gactggaaag 3720
cgggcagtga gcgcaacgca attaatgtaa gttagctcac tcattaggca ccgggatctc 3780
gaccgatgcc cttgagagcc ttcaacccag tcagctcctt ccggtgggcg cggggcatga 3840
ctatcgtcgc cgcacttatg actgtcttct ttatcatgca actcgtagga caggtgccgg 3900
cagcgctctg ggtcattttc ggcgaggacc gctttcgctg gagcgcgacg atgatcggcc 3960
tgtcgcttgc ggtattcgga atcttgcacg ccctcgctca agccttcgtc actggtcccg 4020
ccaccaaacg tttcggcgag aagcaggcca ttatcgccgg catggcggcc ccacgggtgc 4080
gcatgatcgt gctcctgtcg ttgaggaccc ggctaggctg gcggggttgc cttactggtt 4140
agcagaatga atcaccgata cgcgagcgaa cgtgaagcga ctgctgctgc aaaacgtctg 4200
cgacctgagc aacaacatga atggtcttcg gtttccgtgt ttcgtaaagt ctggaaacgc 4260
ggaagtcagc gccctgcacc attatgttcc ggatctgcat cgcaggatgc tgctggctac 4320
cctgtggaac acctacatct gtattaacga agcgctggca ttgaccctga gtgatttttc 4380
tctggtcccg ccgcatccat accgccagtt gtttaccctc acaacgttcc agtaaccggg 4440
catgttcatc atcagtaacc cgtatcgtga gcatcctctc tcgtttcatc ggtatcatta 4500
cccccatgaa cagaaatccc ccttacacgg aggcatcagt gaccaaacag gaaaaaaccg 4560
cccttaacat ggcccgcttt atcagaagcc agacattaac gcttctggag aaactcaacg 4620
agctggacgc ggatgaacag gcagacatct gtgaatcgct tcacgaccac gctgatgagc 4680
tttaccgcag ctgcctcgcg cgtttcggtg atgacggtga aaacctctga cacatgcagc 4740
tcccggagac ggtcacagct tgtctgtaag cggatgccgg gagcagacaa gcccgtcagg 4800
gcgcgtcagc gggtgttggc gggtgtcggg gcgcagccat gacccagtca cgtagcgata 4860
gcggagtgta tactggctta actatgcggc atcagagcag attgtactga gagtgcacca 4920
tatatgcggt gtgaaatacc gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat caggcgctct 4980
tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca 5040
gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac 5100
atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt 5160
ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg 5220
cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc 5280
tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc 5340
gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc 5400
aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac 5460
tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt 5520
aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct 5580
aactacggct acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc 5640
ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt 5700
ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg 5760
atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc 5820
atgaacaata aaactgtctg cttacataaa cagtaataca aggggtgtta tgagccatat 5880
tcaacgggaa acgtcttgct ctaggccgcg attaaattcc aacatggatg ctgatttata 5940
tgggtataaa tgggctcgcg ataatgtcgg gcaatcaggt gcgacaatct atcgattgta 6000
tgggaagccc gatgcgccag agttgtttct gaaacatggc aaaggtagcg ttgccaatga 6060
tgttacagat gagatggtca gactaaactg gctgacggaa tttatgcctc ttccgaccat 6120
caagcatttt atccgtactc ctgatgatgc atggttactc accactgcga tccccgggaa 6180
aacagcattc caggtattag aagaatatcc tgattcaggt gaaaatattg ttgatgcgct 6240
ggcagtgttc ctgcgccggt tgcattcgat tcctgtttgt aattgtcctt ttaacagcga 6300
tcgcgtattt cgtctcgctc aggcgcaatc acgaatgaat aacggtttgg ttgatgcgag 6360
tgattttgat gacgagcgta atggctggcc tgttgaacaa gtctggaaag aaatgcataa 6420
acttttgcca ttctcaccgg attcagtcgt cactcatggt gatttctcac ttgataacct 6480
tatttttgac gaggggaaat taataggttg tattgatgtt ggacgagtcg gaatcgcaga 6540
ccgataccag gatcttgcca tcctatggaa ctgcctcggt gagttttctc cttcattaca 6600
gaaacggctt tttcaaaaat atggtattga taatcctgat atgaataaat tgcagtttca 6660
tttgatgctc gatgagtttt tctaagaatt aattcatgag cggatacata tttgaatgta 6720
tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgaaa 6780
ttgtaaacgt taatattttg ttaaaattcg cgttaaattt ttgttaaatc agctcatttt 6840
ttaaccaata ggccgaaatc ggcaaaatcc cttataaatc aaaagaatag accgagatag 6900
ggttgagtgt tgttccagtt tggaacaaga gtccactatt aaagaacgtg gactccaacg 6960
tcaaagggcg aaaaaccgtc tatcagggcg atggcccact acgtgaacca tcaccctaat 7020
caagtttttt ggggtcgagg tgccgtaaag cactaaatcg gaaccctaaa gggagccccc 7080
gatttagagc ttgacgggga aagccggcga acgtggcgag aaaggaaggg aagaaagcga 7140
aaggagcggg cgctagggcg ctggcaagtg tagcggtcac gctgcgcgta accaccacac 7200
ccgccgcgct taatgcgccg ctacagggcg cgtcccattc gcca 7244
<210> 5
<211> 7195
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pET-28-ChCODH-4
<400> 5
atccggatat agttcctcct ttcagcaaaa aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa 60
ggggttatgc tagttattgc tcagcggtgg cagcagccaa ctcagcttcc tttcgggctt 120
tgttagcagc cggatctcag tggtggtggt ggtggtgctc gagttataaa ttcagtagag 180
cccgtttagc cttaatatgt tcaatgatgc ccgctgctgc tttatatggg tccgtttcca 240
cataaaattt gccgcctatt aaagcctcgg catcttgggt aagaatacgg gtaacttttg 300
aacttccgac cacaggtgga acaactccca agtgggtcat aatacccatc gctaccgccc 360
aggttccgat gctcaaagcc ttttcatgct ggtattcagg tgcagaagcc gcaatcggaa 420
ggtcttttgg acttacttta aggtagtttg cgacggcgat cactaagtcc ccgattcggg 480
agttatcaac acacgatccc atgtgcaaaa caggcggcag cgggccgccc aaatcattag 540
ccgtgcctat tgccgttaag acggctcgta aaccctcgcc agcccattcg gctgctgcgg 600
ggtccatcaa gcctgctttc gctaacgcat gagcggaaca gcctgtagtc accactaaca 660
cattgttttt aattagttct tttactaatt ctatgtggaa ccaatcatgc ttgaccttca 720
cattgttaca accaacggtg gcgaccacac ccagaatgtt gccagacaca atattatcaa 780
ttaagggctt taacggatcg tcaggattta gtttcgctaa cgcttttact attgcctcaa 840
cgctgaatcc tgctacaact ttggcttttt ccctggggat gtagaccttg gctggattgc 900
gtttttggta actctctata gccatacgca caatctgctg cgaggcctca tcggcagttt 960
ctgtggtgaa cggaacatgc tccgcacctg gaattttcac aatcggcatg gtagtgacta 1020
agcgggtatg atagcaagca gcaatttctg ctaatgaggg cataatacac tgaacatcca 1080
ctaccattaa gtcaactgcc cccgtaataa tcgccaactc ctgggccagg aagtttgttg 1140
ctaacggtac accctgacgc attaacacct cgttaccagt acaacatata cctgcaagat 1200
tgattccttt tgcccctgct tttttcgcct catcttccaa ctttctgctc cattcaacaa 1260
ttttttcgct aagtaacgga acatggccgt ggactatgat attcacataa tcttctttga 1320
gtacacccag atttgcttct gtgacaactg gctggggagt gccaaaaatg atgtcctgta 1380
aatccgtcgc taacttgaga cccgcaaaac catcaaccag accaaggcga atagttttta 1440
agattaaatt tactgggtcc gcatccatcc ccattgtagt ctggtgtaag gcttctctga 1500
tttcacggtc tgggttacga ggcagaaccc ctaatttttc ccatgtctca aggcgttccc 1560
gaggagagtt ggctttcaga taggtcatcg gtgttgcacc agaattggca aaatcccgat 1620
agataatttg gcacatctct tcaacaatct cctgctctgt tttgttagcg gtatctatac 1680
ctaaggtaaa agcgacctgc tttaactttt cttgatcttt gatactgtat gattccgtac 1740
cttgggcgat ttgttccaaa acttccagca catcatacgc atggtctaca tgggcggcag 1800
cacccgccgt gacttgacgc agcagattgc gagccgttat tacctcggcg gtagcaccgc 1860
aaatgcccgc ttgcggtcct tccccaaacg gatctatgcg gcacggtccc tgcacgcaat 1920
gacgacagca aaggcctgta agcccaaatc cgcactgagg ctgctgtgct tcataacgat 1980
caaaaacagt ggaaatccct tcctctctgg ctttacgata taaattcggg atcacaggat 2040
ctactgataa cttgctttta tccatatggc tgccgcgcgg caccaggccg ctgctgtgat 2100
gatgatgatg atggctgctg cccatggtat atctccttct taaagttaaa caaaattatt 2160
tctagagggg aattgttatc cgctcacaat tcccctatag tgagtcgtat taatttcgcg 2220
ggatcgagat ctcgatcctc tacgccggac gcatcgtggc cggcatcacc ggcgccacag 2280
gtgcggttgc tggcgcctat atcgccgaca tcaccgatgg ggaagatcgg gctcgccact 2340
tcgggctcat gagcgcttgt ttcggcgtgg gtatggtggc aggccccgtg gccgggggac 2400
tgttgggcgc catctccttg catgcaccat tccttgcggc ggcggtgctc aacggcctca 2460
acctactact gggctgcttc ctaatgcagg agtcgcataa gggagagcgt cgagatcccg 2520
gacaccatcg aatggcgcaa aacctttcgc ggtatggcat gatagcgccc ggaagagagt 2580
caattcaggg tggtgaatgt gaaaccagta acgttatacg atgtcgcaga gtatgccggt 2640
gtctcttatc agaccgtttc ccgcgtggtg aaccaggcca gccacgtttc tgcgaaaacg 2700
cgggaaaaag tggaagcggc gatggcggag ctgaattaca ttcccaaccg cgtggcacaa 2760
caactggcgg gcaaacagtc gttgctgatt ggcgttgcca cctccagtct ggccctgcac 2820
gcgccgtcgc aaattgtcgc ggcgattaaa tctcgcgccg atcaactggg tgccagcgtg 2880
gtggtgtcga tggtagaacg aagcggcgtc gaagcctgta aagcggcggt gcacaatctt 2940
ctcgcgcaac gcgtcagtgg gctgatcatt aactatccgc tggatgacca ggatgccatt 3000
gctgtggaag ctgcctgcac taatgttccg gcgttatttc ttgatgtctc tgaccagaca 3060
cccatcaaca gtattatttt ctcccatgaa gacggtacgc gactgggcgt ggagcatctg 3120
gtcgcattgg gtcaccagca aatcgcgctg ttagcgggcc cattaagttc tgtctcggcg 3180
cgtctgcgtc tggctggctg gcataaatat ctcactcgca atcaaattca gccgatagcg 3240
gaacgggaag gcgactggag tgccatgtcc ggttttcaac aaaccatgca aatgctgaat 3300
gagggcatcg ttcccactgc gatgctggtt gccaacgatc agatggcgct gggcgcaatg 3360
cgcgccatta ccgagtccgg gctgcgcgtt ggtgcggata tctcggtagt gggatacgac 3420
gataccgaag acagctcatg ttatatcccg ccgttaacca ccatcaaaca ggattttcgc 3480
ctgctggggc aaaccagcgt ggaccgcttg ctgcaactct ctcagggcca ggcggtgaag 3540
ggcaatcagc tgttgcccgt ctcactggtg aaaagaaaaa ccaccctggc gcccaatacg 3600
caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctggcacg acaggtttcc 3660
cgactggaaa gcgggcagtg agcgcaacgc aattaatgta agttagctca ctcattaggc 3720
accgggatct cgaccgatgc ccttgagagc cttcaaccca gtcagctcct tccggtgggc 3780
gcggggcatg actatcgtcg ccgcacttat gactgtcttc tttatcatgc aactcgtagg 3840
acaggtgccg gcagcgctct gggtcatttt cggcgaggac cgctttcgct ggagcgcgac 3900
gatgatcggc ctgtcgcttg cggtattcgg aatcttgcac gccctcgctc aagccttcgt 3960
cactggtccc gccaccaaac gtttcggcga gaagcaggcc attatcgccg gcatggcggc 4020
cccacgggtg cgcatgatcg tgctcctgtc gttgaggacc cggctaggct ggcggggttg 4080
ccttactggt tagcagaatg aatcaccgat acgcgagcga acgtgaagcg actgctgctg 4140
caaaacgtct gcgacctgag caacaacatg aatggtcttc ggtttccgtg tttcgtaaag 4200
tctggaaacg cggaagtcag cgccctgcac cattatgttc cggatctgca tcgcaggatg 4260
ctgctggcta ccctgtggaa cacctacatc tgtattaacg aagcgctggc attgaccctg 4320
agtgattttt ctctggtccc gccgcatcca taccgccagt tgtttaccct cacaacgttc 4380
cagtaaccgg gcatgttcat catcagtaac ccgtatcgtg agcatcctct ctcgtttcat 4440
cggtatcatt acccccatga acagaaatcc cccttacacg gaggcatcag tgaccaaaca 4500
ggaaaaaacc gcccttaaca tggcccgctt tatcagaagc cagacattaa cgcttctgga 4560
gaaactcaac gagctggacg cggatgaaca ggcagacatc tgtgaatcgc ttcacgacca 4620
cgctgatgag ctttaccgca gctgcctcgc gcgtttcggt gatgacggtg aaaacctctg 4680
acacatgcag ctcccggaga cggtcacagc ttgtctgtaa gcggatgccg ggagcagaca 4740
agcccgtcag ggcgcgtcag cgggtgttgg cgggtgtcgg ggcgcagcca tgacccagtc 4800
acgtagcgat agcggagtgt atactggctt aactatgcgg catcagagca gattgtactg 4860
agagtgcacc atatatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca 4920
tcaggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc 4980
gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg 5040
caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt 5100
tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa 5160
gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct 5220
ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc 5280
cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg 5340
tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct 5400
tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag 5460
cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga 5520
agtggtggcc taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga 5580
agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg 5640
gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag 5700
aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag 5760
ggattttggt catgaacaat aaaactgtct gcttacataa acagtaatac aaggggtgtt 5820
atgagccata ttcaacggga aacgtcttgc tctaggccgc gattaaattc caacatggat 5880
gctgatttat atgggtataa atgggctcgc gataatgtcg ggcaatcagg tgcgacaatc 5940
tatcgattgt atgggaagcc cgatgcgcca gagttgtttc tgaaacatgg caaaggtagc 6000
gttgccaatg atgttacaga tgagatggtc agactaaact ggctgacgga atttatgcct 6060
cttccgacca tcaagcattt tatccgtact cctgatgatg catggttact caccactgcg 6120
atccccggga aaacagcatt ccaggtatta gaagaatatc ctgattcagg tgaaaatatt 6180
gttgatgcgc tggcagtgtt cctgcgccgg ttgcattcga ttcctgtttg taattgtcct 6240
tttaacagcg atcgcgtatt tcgtctcgct caggcgcaat cacgaatgaa taacggtttg 6300
gttgatgcga gtgattttga tgacgagcgt aatggctggc ctgttgaaca agtctggaaa 6360
gaaatgcata aacttttgcc attctcaccg gattcagtcg tcactcatgg tgatttctca 6420
cttgataacc ttatttttga cgaggggaaa ttaataggtt gtattgatgt tggacgagtc 6480
ggaatcgcag accgatacca ggatcttgcc atcctatgga actgcctcgg tgagttttct 6540
ccttcattac agaaacggct ttttcaaaaa tatggtattg ataatcctga tatgaataaa 6600
ttgcagtttc atttgatgct cgatgagttt ttctaagaat taattcatga gcggatacat 6660
atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt 6720
gccacctgaa attgtaaacg ttaatatttt gttaaaattc gcgttaaatt tttgttaaat 6780
cagctcattt tttaaccaat aggccgaaat cggcaaaatc ccttataaat caaaagaata 6840
gaccgagata gggttgagtg ttgttccagt ttggaacaag agtccactat taaagaacgt 6900
ggactccaac gtcaaagggc gaaaaaccgt ctatcagggc gatggcccac tacgtgaacc 6960
atcaccctaa tcaagttttt tggggtcgag gtgccgtaaa gcactaaatc ggaaccctaa 7020
agggagcccc cgatttagag cttgacgggg aaagccggcg aacgtggcga gaaaggaagg 7080
gaagaaagcg aaaggagcgg gcgctagggc gctggcaagt gtagcggtca cgctgcgcgt 7140
aaccaccaca cccgccgcgc ttaatgcgcc gctacagggc gcgtcccatt cgcca 7195
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A559W-F
<400> 6
gcgcggcgga atggatgcat gagaaggcgg tgg 33
<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A559W-R
<400> 7
tctcatgcat ccattccgcc gcgctcgcaa cc 32
<210> 8
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A559Y-F
<400> 8
gcgcggcgga atacatgcat gagaaggcgg tgg 33
<210> 9
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A559Y-R
<400> 9
tctcatgcat gtattccgcc gcgctcgcaa cc 32
<210> 10
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A559S-F
<400> 10
cgcggcggaa agcatgcatg agaaggcggt gg 32
<210> 11
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A559S-R
<400> 11
tctcatgcat gctttccgcc gcgctcgcaa cc 32
<210> 12
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A559H-F
<400> 12
cgcggcggaa cacatgcatg agaaggcggt gg 32
<210> 13
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A559H-R
<400> 13
tctcatgcat gtgttccgcc gcgctcgcaa cc 32
<210> 14
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A559D-F
<400> 14
cgcggcggaa gatatgcatg agaaggcggt gg 32
<210> 15
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A559D-R
<400> 15
tctcatgcat atcttccgcc gcgctcgcaa cc 32
<210> 16
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A559E-F
<400> 16
cgcggcggaa gagatgcatg agaaggcgg 29
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A559E-R
<400> 17
tctcatgcat ctcttccgcc gcgctcgcaa 30
<210> 18
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A559N-F
<400> 18
gcgcggcgga aaacatgcat gagaaggcgg tgg 33
<210> 19
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A559N-R
<400> 19
tctcatgcat gttttccgcc gcgctcgcaa cc 32
<210> 20
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> V610A-F
<400> 20
gctacttcat cgcggaactg gacccggaga cc 32
<210> 21
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> V610A-R
<400> 21
ggtccagttc cgcgatgaag tagccaccgg 30
<210> 22
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> V610S-F
<400> 22
gctacttcat cagcgaactg gacccggaga cc 32
<210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> V610S-R
<400> 23
ggtccagttc gctgatgaag tagccaccgg 30
<210> 24
<211> 1911
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ChCODH-2 A559W
<400> 24
atggcgaaac aaaatctgaa gagcaccgac cgtgcggttc aacaaatgct ggataaagcg 60
aagcgtgagg gtattcaaac cgtgtgggat cgttacgagg cgatgaagcc gcagtgcggt 120
ttcggcgaaa ccggtctgtg ctgccgtcac tgcctgcaag gtccgtgccg tattaacccg 180
tttggcgatg agccgaaagt gggcatttgc ggtgcgaccg cggaagtgat cgttgcgcgt 240
ggtctggacc gtagcattgc ggcgggtgcg gcgggtcata gcggtcatgc gaagcacctg 300
gcgcacaccc tgaagaaagc ggtgcagggc aaagcggcga gctatatgat taaggaccgt 360
accaaactgc acagcatcgc gaagcgtctg ggtattccga ccgaaggcca aaaagacgag 420
gatattgcgc tggaagttgc gaaagcggcg ctggcggact tccatgagaa agataccccg 480
gttctgtggg tgaccaccgt tctgccgccg agccgtgtga aggttctgag cgcgcatggt 540
ctgatcccgg cgggtattga tcacgaaatc gcggagatta tgcaccgtac cagcatgggt 600
tgcgacgcgg atgcgcagaa cctgctgctg ggtggcctgc gttgcagcct ggcggacctg 660
gcgggttgct acatgggcac cgacctggcg gatatcctgt ttggtacccc ggcgccggtg 720
gttaccgaaa gcaacctggg cgtgctgaag gcggatgcgg tgaacgttgc ggtgcacggt 780
cacaacccgg ttctgagcga catcattgtt agcgtgagca aagagatgga aaacgaggcg 840
cgtgcggcgg gtgcgaccgg tatcaacgtg gttggtattt gctgcaccgg caacgaggtg 900
ctgatgcgtc acggtattcc ggcgtgcacc cacagcgtta gccaggaaat ggcgatgatc 960
accggcgcgc tggacgcgat gatcctggat tatcagtgca ttcaaccgag cgtggcgacc 1020
attgcggagt gcaccggtac caccgttatt accaccatgg aaatgagcaa aatcaccggt 1080
gcgacccatg tgaactttgc ggaggaagcg gcggttgaga acgcgaagca aatcctgcgt 1140
ctggcgattg atacctttaa acgtcgtaag ggtaaaccgg tggagatccc gaacattaag 1200
accaaagtgg ttgcgggctt cagcaccgaa gcgatcatta acgcgctgag caagctgaac 1260
gcgaacgatc cgctgaaacc gctgattgac aacgtggtta acggtaacat ccgtggcgtg 1320
tgcctgttcg cgggttgcaa caacgttaag gtgccgcagg accaaaactt taccaccatt 1380
gcgcgtaagc tgctgaaaca gaacgttctg gtggttgcga ccggttgcgg tgcgggtgcg 1440
ctgatgcgtc acggttttat ggacccggcg aacgtggatg agctgtgcgg cgacggtctg 1500
aaagcggttc tgaccgcgat cggtgaagcg aacggtctgg gtggcccgct gccgccggtg 1560
ctgcacatgg gtagctgcgt tgacaacagc cgtgcggtgg cgctggttgc ggcgctggcg 1620
aaccgtctgg gcgttgacct ggatcgtctg ccggtggttg cgagcgcggc ggaatggatg 1680
catgagaagg cggtggcgat tggtacctgg gcggttacca tcggtctgcc gacccacatt 1740
ggtgtgctgc cgccgatcac cggcagcctg ccggtgaccc aaatcctgac cagcagcgtt 1800
aaagatatta ccggtggcta cttcatcgtt gaactggacc cggagaccgc ggcggacaaa 1860
ctgctggcgg cgatcaatga gcgtcgtgcg ggtctgggtc tgccgtggtg a 1911
<210> 25
<211> 1911
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ChCODH-2 A559Y
<400> 25
atggcgaaac aaaatctgaa gagcaccgac cgtgcggttc aacaaatgct ggataaagcg 60
aagcgtgagg gtattcaaac cgtgtgggat cgttacgagg cgatgaagcc gcagtgcggt 120
ttcggcgaaa ccggtctgtg ctgccgtcac tgcctgcaag gtccgtgccg tattaacccg 180
tttggcgatg agccgaaagt gggcatttgc ggtgcgaccg cggaagtgat cgttgcgcgt 240
ggtctggacc gtagcattgc ggcgggtgcg gcgggtcata gcggtcatgc gaagcacctg 300
gcgcacaccc tgaagaaagc ggtgcagggc aaagcggcga gctatatgat taaggaccgt 360
accaaactgc acagcatcgc gaagcgtctg ggtattccga ccgaaggcca aaaagacgag 420
gatattgcgc tggaagttgc gaaagcggcg ctggcggact tccatgagaa agataccccg 480
gttctgtggg tgaccaccgt tctgccgccg agccgtgtga aggttctgag cgcgcatggt 540
ctgatcccgg cgggtattga tcacgaaatc gcggagatta tgcaccgtac cagcatgggt 600
tgcgacgcgg atgcgcagaa cctgctgctg ggtggcctgc gttgcagcct ggcggacctg 660
gcgggttgct acatgggcac cgacctggcg gatatcctgt ttggtacccc ggcgccggtg 720
gttaccgaaa gcaacctggg cgtgctgaag gcggatgcgg tgaacgttgc ggtgcacggt 780
cacaacccgg ttctgagcga catcattgtt agcgtgagca aagagatgga aaacgaggcg 840
cgtgcggcgg gtgcgaccgg tatcaacgtg gttggtattt gctgcaccgg caacgaggtg 900
ctgatgcgtc acggtattcc ggcgtgcacc cacagcgtta gccaggaaat ggcgatgatc 960
accggcgcgc tggacgcgat gatcctggat tatcagtgca ttcaaccgag cgtggcgacc 1020
attgcggagt gcaccggtac caccgttatt accaccatgg aaatgagcaa aatcaccggt 1080
gcgacccatg tgaactttgc ggaggaagcg gcggttgaga acgcgaagca aatcctgcgt 1140
ctggcgattg atacctttaa acgtcgtaag ggtaaaccgg tggagatccc gaacattaag 1200
accaaagtgg ttgcgggctt cagcaccgaa gcgatcatta acgcgctgag caagctgaac 1260
gcgaacgatc cgctgaaacc gctgattgac aacgtggtta acggtaacat ccgtggcgtg 1320
tgcctgttcg cgggttgcaa caacgttaag gtgccgcagg accaaaactt taccaccatt 1380
gcgcgtaagc tgctgaaaca gaacgttctg gtggttgcga ccggttgcgg tgcgggtgcg 1440
ctgatgcgtc acggttttat ggacccggcg aacgtggatg agctgtgcgg cgacggtctg 1500
aaagcggttc tgaccgcgat cggtgaagcg aacggtctgg gtggcccgct gccgccggtg 1560
ctgcacatgg gtagctgcgt tgacaacagc cgtgcggtgg cgctggttgc ggcgctggcg 1620
aaccgtctgg gcgttgacct ggatcgtctg ccggtggttg cgagcgcggc ggaatacatg 1680
catgagaagg cggtggcgat tggtacctgg gcggttacca tcggtctgcc gacccacatt 1740
ggtgtgctgc cgccgatcac cggcagcctg ccggtgaccc aaatcctgac cagcagcgtt 1800
aaagatatta ccggtggcta cttcatcgtt gaactggacc cggagaccgc ggcggacaaa 1860
ctgctggcgg cgatcaatga gcgtcgtgcg ggtctgggtc tgccgtggtg a 1911
<210> 26
<211> 1911
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ChCODH-2 A559S
<400> 26
atggcgaaac aaaatctgaa gagcaccgac cgtgcggttc aacaaatgct ggataaagcg 60
aagcgtgagg gtattcaaac cgtgtgggat cgttacgagg cgatgaagcc gcagtgcggt 120
ttcggcgaaa ccggtctgtg ctgccgtcac tgcctgcaag gtccgtgccg tattaacccg 180
tttggcgatg agccgaaagt gggcatttgc ggtgcgaccg cggaagtgat cgttgcgcgt 240
ggtctggacc gtagcattgc ggcgggtgcg gcgggtcata gcggtcatgc gaagcacctg 300
gcgcacaccc tgaagaaagc ggtgcagggc aaagcggcga gctatatgat taaggaccgt 360
accaaactgc acagcatcgc gaagcgtctg ggtattccga ccgaaggcca aaaagacgag 420
gatattgcgc tggaagttgc gaaagcggcg ctggcggact tccatgagaa agataccccg 480
gttctgtggg tgaccaccgt tctgccgccg agccgtgtga aggttctgag cgcgcatggt 540
ctgatcccgg cgggtattga tcacgaaatc gcggagatta tgcaccgtac cagcatgggt 600
tgcgacgcgg atgcgcagaa cctgctgctg ggtggcctgc gttgcagcct ggcggacctg 660
gcgggttgct acatgggcac cgacctggcg gatatcctgt ttggtacccc ggcgccggtg 720
gttaccgaaa gcaacctggg cgtgctgaag gcggatgcgg tgaacgttgc ggtgcacggt 780
cacaacccgg ttctgagcga catcattgtt agcgtgagca aagagatgga aaacgaggcg 840
cgtgcggcgg gtgcgaccgg tatcaacgtg gttggtattt gctgcaccgg caacgaggtg 900
ctgatgcgtc acggtattcc ggcgtgcacc cacagcgtta gccaggaaat ggcgatgatc 960
accggcgcgc tggacgcgat gatcctggat tatcagtgca ttcaaccgag cgtggcgacc 1020
attgcggagt gcaccggtac caccgttatt accaccatgg aaatgagcaa aatcaccggt 1080
gcgacccatg tgaactttgc ggaggaagcg gcggttgaga acgcgaagca aatcctgcgt 1140
ctggcgattg atacctttaa acgtcgtaag ggtaaaccgg tggagatccc gaacattaag 1200
accaaagtgg ttgcgggctt cagcaccgaa gcgatcatta acgcgctgag caagctgaac 1260
gcgaacgatc cgctgaaacc gctgattgac aacgtggtta acggtaacat ccgtggcgtg 1320
tgcctgttcg cgggttgcaa caacgttaag gtgccgcagg accaaaactt taccaccatt 1380
gcgcgtaagc tgctgaaaca gaacgttctg gtggttgcga ccggttgcgg tgcgggtgcg 1440
ctgatgcgtc acggttttat ggacccggcg aacgtggatg agctgtgcgg cgacggtctg 1500
aaagcggttc tgaccgcgat cggtgaagcg aacggtctgg gtggcccgct gccgccggtg 1560
ctgcacatgg gtagctgcgt tgacaacagc cgtgcggtgg cgctggttgc ggcgctggcg 1620
aaccgtctgg gcgttgacct ggatcgtctg ccggtggttg cgagcgcggc ggaaagcatg 1680
catgagaagg cggtggcgat tggtacctgg gcggttacca tcggtctgcc gacccacatt 1740
ggtgtgctgc cgccgatcac cggcagcctg ccggtgaccc aaatcctgac cagcagcgtt 1800
aaagatatta ccggtggcta cttcatcgtt gaactggacc cggagaccgc ggcggacaaa 1860
ctgctggcgg cgatcaatga gcgtcgtgcg ggtctgggtc tgccgtggtg a 1911
<210> 27
<211> 1911
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ChCODH-2 A559T
<400> 27
atggcgaaac aaaatctgaa gagcaccgac cgtgcggttc aacaaatgct ggataaagcg 60
aagcgtgagg gtattcaaac cgtgtgggat cgttacgagg cgatgaagcc gcagtgcggt 120
ttcggcgaaa ccggtctgtg ctgccgtcac tgcctgcaag gtccgtgccg tattaacccg 180
tttggcgatg agccgaaagt gggcatttgc ggtgcgaccg cggaagtgat cgttgcgcgt 240
ggtctggacc gtagcattgc ggcgggtgcg gcgggtcata gcggtcatgc gaagcacctg 300
gcgcacaccc tgaagaaagc ggtgcagggc aaagcggcga gctatatgat taaggaccgt 360
accaaactgc acagcatcgc gaagcgtctg ggtattccga ccgaaggcca aaaagacgag 420
gatattgcgc tggaagttgc gaaagcggcg ctggcggact tccatgagaa agataccccg 480
gttctgtggg tgaccaccgt tctgccgccg agccgtgtga aggttctgag cgcgcatggt 540
ctgatcccgg cgggtattga tcacgaaatc gcggagatta tgcaccgtac cagcatgggt 600
tgcgacgcgg atgcgcagaa cctgctgctg ggtggcctgc gttgcagcct ggcggacctg 660
gcgggttgct acatgggcac cgacctggcg gatatcctgt ttggtacccc ggcgccggtg 720
gttaccgaaa gcaacctggg cgtgctgaag gcggatgcgg tgaacgttgc ggtgcacggt 780
cacaacccgg ttctgagcga catcattgtt agcgtgagca aagagatgga aaacgaggcg 840
cgtgcggcgg gtgcgaccgg tatcaacgtg gttggtattt gctgcaccgg caacgaggtg 900
ctgatgcgtc acggtattcc ggcgtgcacc cacagcgtta gccaggaaat ggcgatgatc 960
accggcgcgc tggacgcgat gatcctggat tatcagtgca ttcaaccgag cgtggcgacc 1020
attgcggagt gcaccggtac caccgttatt accaccatgg aaatgagcaa aatcaccggt 1080
gcgacccatg tgaactttgc ggaggaagcg gcggttgaga acgcgaagca aatcctgcgt 1140
ctggcgattg atacctttaa acgtcgtaag ggtaaaccgg tggagatccc gaacattaag 1200
accaaagtgg ttgcgggctt cagcaccgaa gcgatcatta acgcgctgag caagctgaac 1260
gcgaacgatc cgctgaaacc gctgattgac aacgtggtta acggtaacat ccgtggcgtg 1320
tgcctgttcg cgggttgcaa caacgttaag gtgccgcagg accaaaactt taccaccatt 1380
gcgcgtaagc tgctgaaaca gaacgttctg gtggttgcga ccggttgcgg tgcgggtgcg 1440
ctgatgcgtc acggttttat ggacccggcg aacgtggatg agctgtgcgg cgacggtctg 1500
aaagcggttc tgaccgcgat cggtgaagcg aacggtctgg gtggcccgct gccgccggtg 1560
ctgcacatgg gtagctgcgt tgacaacagc cgtgcggtgg cgctggttgc ggcgctggcg 1620
aaccgtctgg gcgttgacct ggatcgtctg ccggtggttg cgagcgcggc ggaaaccatg 1680
catgagaagg cggtggcgat tggtacctgg gcggttacca tcggtctgcc gacccacatt 1740
ggtgtgctgc cgccgatcac cggcagcctg ccggtgaccc aaatcctgac cagcagcgtt 1800
aaagatatta ccggtggcta cttcatcgtt gaactggacc cggagaccgc ggcggacaaa 1860
ctgctggcgg cgatcaatga gcgtcgtgcg ggtctgggtc tgccgtggtg a 1911
<210> 28
<211> 1911
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ChCODH-2 A559N
<400> 28
atggcgaaac aaaatctgaa gagcaccgac cgtgcggttc aacaaatgct ggataaagcg 60
aagcgtgagg gtattcaaac cgtgtgggat cgttacgagg cgatgaagcc gcagtgcggt 120
ttcggcgaaa ccggtctgtg ctgccgtcac tgcctgcaag gtccgtgccg tattaacccg 180
tttggcgatg agccgaaagt gggcatttgc ggtgcgaccg cggaagtgat cgttgcgcgt 240
ggtctggacc gtagcattgc ggcgggtgcg gcgggtcata gcggtcatgc gaagcacctg 300
gcgcacaccc tgaagaaagc ggtgcagggc aaagcggcga gctatatgat taaggaccgt 360
accaaactgc acagcatcgc gaagcgtctg ggtattccga ccgaaggcca aaaagacgag 420
gatattgcgc tggaagttgc gaaagcggcg ctggcggact tccatgagaa agataccccg 480
gttctgtggg tgaccaccgt tctgccgccg agccgtgtga aggttctgag cgcgcatggt 540
ctgatcccgg cgggtattga tcacgaaatc gcggagatta tgcaccgtac cagcatgggt 600
tgcgacgcgg atgcgcagaa cctgctgctg ggtggcctgc gttgcagcct ggcggacctg 660
gcgggttgct acatgggcac cgacctggcg gatatcctgt ttggtacccc ggcgccggtg 720
gttaccgaaa gcaacctggg cgtgctgaag gcggatgcgg tgaacgttgc ggtgcacggt 780
cacaacccgg ttctgagcga catcattgtt agcgtgagca aagagatgga aaacgaggcg 840
cgtgcggcgg gtgcgaccgg tatcaacgtg gttggtattt gctgcaccgg caacgaggtg 900
ctgatgcgtc acggtattcc ggcgtgcacc cacagcgtta gccaggaaat ggcgatgatc 960
accggcgcgc tggacgcgat gatcctggat tatcagtgca ttcaaccgag cgtggcgacc 1020
attgcggagt gcaccggtac caccgttatt accaccatgg aaatgagcaa aatcaccggt 1080
gcgacccatg tgaactttgc ggaggaagcg gcggttgaga acgcgaagca aatcctgcgt 1140
ctggcgattg atacctttaa acgtcgtaag ggtaaaccgg tggagatccc gaacattaag 1200
accaaagtgg ttgcgggctt cagcaccgaa gcgatcatta acgcgctgag caagctgaac 1260
gcgaacgatc cgctgaaacc gctgattgac aacgtggtta acggtaacat ccgtggcgtg 1320
tgcctgttcg cgggttgcaa caacgttaag gtgccgcagg accaaaactt taccaccatt 1380
gcgcgtaagc tgctgaaaca gaacgttctg gtggttgcga ccggttgcgg tgcgggtgcg 1440
ctgatgcgtc acggttttat ggacccggcg aacgtggatg agctgtgcgg cgacggtctg 1500
aaagcggttc tgaccgcgat cggtgaagcg aacggtctgg gtggcccgct gccgccggtg 1560
ctgcacatgg gtagctgcgt tgacaacagc cgtgcggtgg cgctggttgc ggcgctggcg 1620
aaccgtctgg gcgttgacct ggatcgtctg ccggtggttg cgagcgcggc ggaaaacatg 1680
catgagaagg cggtggcgat tggtacctgg gcggttacca tcggtctgcc gacccacatt 1740
ggtgtgctgc cgccgatcac cggcagcctg ccggtgaccc aaatcctgac cagcagcgtt 1800
aaagatatta ccggtggcta cttcatcgtt gaactggacc cggagaccgc ggcggacaaa 1860
ctgctggcgg cgatcaatga gcgtcgtgcg ggtctgggtc tgccgtggtg a 1911
<210> 29
<211> 1911
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ChCODH-2 A559Q
<400> 29
atggcgaaac aaaatctgaa gagcaccgac cgtgcggttc aacaaatgct ggataaagcg 60
aagcgtgagg gtattcaaac cgtgtgggat cgttacgagg cgatgaagcc gcagtgcggt 120
ttcggcgaaa ccggtctgtg ctgccgtcac tgcctgcaag gtccgtgccg tattaacccg 180
tttggcgatg agccgaaagt gggcatttgc ggtgcgaccg cggaagtgat cgttgcgcgt 240
ggtctggacc gtagcattgc ggcgggtgcg gcgggtcata gcggtcatgc gaagcacctg 300
gcgcacaccc tgaagaaagc ggtgcagggc aaagcggcga gctatatgat taaggaccgt 360
accaaactgc acagcatcgc gaagcgtctg ggtattccga ccgaaggcca aaaagacgag 420
gatattgcgc tggaagttgc gaaagcggcg ctggcggact tccatgagaa agataccccg 480
gttctgtggg tgaccaccgt tctgccgccg agccgtgtga aggttctgag cgcgcatggt 540
ctgatcccgg cgggtattga tcacgaaatc gcggagatta tgcaccgtac cagcatgggt 600
tgcgacgcgg atgcgcagaa cctgctgctg ggtggcctgc gttgcagcct ggcggacctg 660
gcgggttgct acatgggcac cgacctggcg gatatcctgt ttggtacccc ggcgccggtg 720
gttaccgaaa gcaacctggg cgtgctgaag gcggatgcgg tgaacgttgc ggtgcacggt 780
cacaacccgg ttctgagcga catcattgtt agcgtgagca aagagatgga aaacgaggcg 840
cgtgcggcgg gtgcgaccgg tatcaacgtg gttggtattt gctgcaccgg caacgaggtg 900
ctgatgcgtc acggtattcc ggcgtgcacc cacagcgtta gccaggaaat ggcgatgatc 960
accggcgcgc tggacgcgat gatcctggat tatcagtgca ttcaaccgag cgtggcgacc 1020
attgcggagt gcaccggtac caccgttatt accaccatgg aaatgagcaa aatcaccggt 1080
gcgacccatg tgaactttgc ggaggaagcg gcggttgaga acgcgaagca aatcctgcgt 1140
ctggcgattg atacctttaa acgtcgtaag ggtaaaccgg tggagatccc gaacattaag 1200
accaaagtgg ttgcgggctt cagcaccgaa gcgatcatta acgcgctgag caagctgaac 1260
gcgaacgatc cgctgaaacc gctgattgac aacgtggtta acggtaacat ccgtggcgtg 1320
tgcctgttcg cgggttgcaa caacgttaag gtgccgcagg accaaaactt taccaccatt 1380
gcgcgtaagc tgctgaaaca gaacgttctg gtggttgcga ccggttgcgg tgcgggtgcg 1440
ctgatgcgtc acggttttat ggacccggcg aacgtggatg agctgtgcgg cgacggtctg 1500
aaagcggttc tgaccgcgat cggtgaagcg aacggtctgg gtggcccgct gccgccggtg 1560
ctgcacatgg gtagctgcgt tgacaacagc cgtgcggtgg cgctggttgc ggcgctggcg 1620
aaccgtctgg gcgttgacct ggatcgtctg ccggtggttg cgagcgcggc ggaacaaatg 1680
catgagaagg cggtggcgat tggtacctgg gcggttacca tcggtctgcc gacccacatt 1740
ggtgtgctgc cgccgatcac cggcagcctg ccggtgaccc aaatcctgac cagcagcgtt 1800
aaagatatta ccggtggcta cttcatcgtt gaactggacc cggagaccgc ggcggacaaa 1860
ctgctggcgg cgatcaatga gcgtcgtgcg ggtctgggtc tgccgtggtg a 1911
<210> 30
<211> 1911
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ChCODH-2 A559H
<400> 30
atggcgaaac aaaatctgaa gagcaccgac cgtgcggttc aacaaatgct ggataaagcg 60
aagcgtgagg gtattcaaac cgtgtgggat cgttacgagg cgatgaagcc gcagtgcggt 120
ttcggcgaaa ccggtctgtg ctgccgtcac tgcctgcaag gtccgtgccg tattaacccg 180
tttggcgatg agccgaaagt gggcatttgc ggtgcgaccg cggaagtgat cgttgcgcgt 240
ggtctggacc gtagcattgc ggcgggtgcg gcgggtcata gcggtcatgc gaagcacctg 300
gcgcacaccc tgaagaaagc ggtgcagggc aaagcggcga gctatatgat taaggaccgt 360
accaaactgc acagcatcgc gaagcgtctg ggtattccga ccgaaggcca aaaagacgag 420
gatattgcgc tggaagttgc gaaagcggcg ctggcggact tccatgagaa agataccccg 480
gttctgtggg tgaccaccgt tctgccgccg agccgtgtga aggttctgag cgcgcatggt 540
ctgatcccgg cgggtattga tcacgaaatc gcggagatta tgcaccgtac cagcatgggt 600
tgcgacgcgg atgcgcagaa cctgctgctg ggtggcctgc gttgcagcct ggcggacctg 660
gcgggttgct acatgggcac cgacctggcg gatatcctgt ttggtacccc ggcgccggtg 720
gttaccgaaa gcaacctggg cgtgctgaag gcggatgcgg tgaacgttgc ggtgcacggt 780
cacaacccgg ttctgagcga catcattgtt agcgtgagca aagagatgga aaacgaggcg 840
cgtgcggcgg gtgcgaccgg tatcaacgtg gttggtattt gctgcaccgg caacgaggtg 900
ctgatgcgtc acggtattcc ggcgtgcacc cacagcgtta gccaggaaat ggcgatgatc 960
accggcgcgc tggacgcgat gatcctggat tatcagtgca ttcaaccgag cgtggcgacc 1020
attgcggagt gcaccggtac caccgttatt accaccatgg aaatgagcaa aatcaccggt 1080
gcgacccatg tgaactttgc ggaggaagcg gcggttgaga acgcgaagca aatcctgcgt 1140
ctggcgattg atacctttaa acgtcgtaag ggtaaaccgg tggagatccc gaacattaag 1200
accaaagtgg ttgcgggctt cagcaccgaa gcgatcatta acgcgctgag caagctgaac 1260
gcgaacgatc cgctgaaacc gctgattgac aacgtggtta acggtaacat ccgtggcgtg 1320
tgcctgttcg cgggttgcaa caacgttaag gtgccgcagg accaaaactt taccaccatt 1380
gcgcgtaagc tgctgaaaca gaacgttctg gtggttgcga ccggttgcgg tgcgggtgcg 1440
ctgatgcgtc acggttttat ggacccggcg aacgtggatg agctgtgcgg cgacggtctg 1500
aaagcggttc tgaccgcgat cggtgaagcg aacggtctgg gtggcccgct gccgccggtg 1560
ctgcacatgg gtagctgcgt tgacaacagc cgtgcggtgg cgctggttgc ggcgctggcg 1620
aaccgtctgg gcgttgacct ggatcgtctg ccggtggttg cgagcgcggc ggaacacatg 1680
catgagaagg cggtggcgat tggtacctgg gcggttacca tcggtctgcc gacccacatt 1740
ggtgtgctgc cgccgatcac cggcagcctg ccggtgaccc aaatcctgac cagcagcgtt 1800
aaagatatta ccggtggcta cttcatcgtt gaactggacc cggagaccgc ggcggacaaa 1860
ctgctggcgg cgatcaatga gcgtcgtgcg ggtctgggtc tgccgtggtg a 1911
<210> 31
<211> 1911
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ChCODH-2 A559D
<400> 31
atggcgaaac aaaatctgaa gagcaccgac cgtgcggttc aacaaatgct ggataaagcg 60
aagcgtgagg gtattcaaac cgtgtgggat cgttacgagg cgatgaagcc gcagtgcggt 120
ttcggcgaaa ccggtctgtg ctgccgtcac tgcctgcaag gtccgtgccg tattaacccg 180
tttggcgatg agccgaaagt gggcatttgc ggtgcgaccg cggaagtgat cgttgcgcgt 240
ggtctggacc gtagcattgc ggcgggtgcg gcgggtcata gcggtcatgc gaagcacctg 300
gcgcacaccc tgaagaaagc ggtgcagggc aaagcggcga gctatatgat taaggaccgt 360
accaaactgc acagcatcgc gaagcgtctg ggtattccga ccgaaggcca aaaagacgag 420
gatattgcgc tggaagttgc gaaagcggcg ctggcggact tccatgagaa agataccccg 480
gttctgtggg tgaccaccgt tctgccgccg agccgtgtga aggttctgag cgcgcatggt 540
ctgatcccgg cgggtattga tcacgaaatc gcggagatta tgcaccgtac cagcatgggt 600
tgcgacgcgg atgcgcagaa cctgctgctg ggtggcctgc gttgcagcct ggcggacctg 660
gcgggttgct acatgggcac cgacctggcg gatatcctgt ttggtacccc ggcgccggtg 720
gttaccgaaa gcaacctggg cgtgctgaag gcggatgcgg tgaacgttgc ggtgcacggt 780
cacaacccgg ttctgagcga catcattgtt agcgtgagca aagagatgga aaacgaggcg 840
cgtgcggcgg gtgcgaccgg tatcaacgtg gttggtattt gctgcaccgg caacgaggtg 900
ctgatgcgtc acggtattcc ggcgtgcacc cacagcgtta gccaggaaat ggcgatgatc 960
accggcgcgc tggacgcgat gatcctggat tatcagtgca ttcaaccgag cgtggcgacc 1020
attgcggagt gcaccggtac caccgttatt accaccatgg aaatgagcaa aatcaccggt 1080
gcgacccatg tgaactttgc ggaggaagcg gcggttgaga acgcgaagca aatcctgcgt 1140
ctggcgattg atacctttaa acgtcgtaag ggtaaaccgg tggagatccc gaacattaag 1200
accaaagtgg ttgcgggctt cagcaccgaa gcgatcatta acgcgctgag caagctgaac 1260
gcgaacgatc cgctgaaacc gctgattgac aacgtggtta acggtaacat ccgtggcgtg 1320
tgcctgttcg cgggttgcaa caacgttaag gtgccgcagg accaaaactt taccaccatt 1380
gcgcgtaagc tgctgaaaca gaacgttctg gtggttgcga ccggttgcgg tgcgggtgcg 1440
ctgatgcgtc acggttttat ggacccggcg aacgtggatg agctgtgcgg cgacggtctg 1500
aaagcggttc tgaccgcgat cggtgaagcg aacggtctgg gtggcccgct gccgccggtg 1560
ctgcacatgg gtagctgcgt tgacaacagc cgtgcggtgg cgctggttgc ggcgctggcg 1620
aaccgtctgg gcgttgacct ggatcgtctg ccggtggttg cgagcgcggc ggaagatatg 1680
catgagaagg cggtggcgat tggtacctgg gcggttacca tcggtctgcc gacccacatt 1740
ggtgtgctgc cgccgatcac cggcagcctg ccggtgaccc aaatcctgac cagcagcgtt 1800
aaagatatta ccggtggcta cttcatcgtt gaactggacc cggagaccgc ggcggacaaa 1860
ctgctggcgg cgatcaatga gcgtcgtgcg ggtctgggtc tgccgtggtg a 1911
<210> 32
<211> 1911
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ChCODH-2 A559E
<400> 32
atggcgaaac aaaatctgaa gagcaccgac cgtgcggttc aacaaatgct ggataaagcg 60
aagcgtgagg gtattcaaac cgtgtgggat cgttacgagg cgatgaagcc gcagtgcggt 120
ttcggcgaaa ccggtctgtg ctgccgtcac tgcctgcaag gtccgtgccg tattaacccg 180
tttggcgatg agccgaaagt gggcatttgc ggtgcgaccg cggaagtgat cgttgcgcgt 240
ggtctggacc gtagcattgc ggcgggtgcg gcgggtcata gcggtcatgc gaagcacctg 300
gcgcacaccc tgaagaaagc ggtgcagggc aaagcggcga gctatatgat taaggaccgt 360
accaaactgc acagcatcgc gaagcgtctg ggtattccga ccgaaggcca aaaagacgag 420
gatattgcgc tggaagttgc gaaagcggcg ctggcggact tccatgagaa agataccccg 480
gttctgtggg tgaccaccgt tctgccgccg agccgtgtga aggttctgag cgcgcatggt 540
ctgatcccgg cgggtattga tcacgaaatc gcggagatta tgcaccgtac cagcatgggt 600
tgcgacgcgg atgcgcagaa cctgctgctg ggtggcctgc gttgcagcct ggcggacctg 660
gcgggttgct acatgggcac cgacctggcg gatatcctgt ttggtacccc ggcgccggtg 720
gttaccgaaa gcaacctggg cgtgctgaag gcggatgcgg tgaacgttgc ggtgcacggt 780
cacaacccgg ttctgagcga catcattgtt agcgtgagca aagagatgga aaacgaggcg 840
cgtgcggcgg gtgcgaccgg tatcaacgtg gttggtattt gctgcaccgg caacgaggtg 900
ctgatgcgtc acggtattcc ggcgtgcacc cacagcgtta gccaggaaat ggcgatgatc 960
accggcgcgc tggacgcgat gatcctggat tatcagtgca ttcaaccgag cgtggcgacc 1020
attgcggagt gcaccggtac caccgttatt accaccatgg aaatgagcaa aatcaccggt 1080
gcgacccatg tgaactttgc ggaggaagcg gcggttgaga acgcgaagca aatcctgcgt 1140
ctggcgattg atacctttaa acgtcgtaag ggtaaaccgg tggagatccc gaacattaag 1200
accaaagtgg ttgcgggctt cagcaccgaa gcgatcatta acgcgctgag caagctgaac 1260
gcgaacgatc cgctgaaacc gctgattgac aacgtggtta acggtaacat ccgtggcgtg 1320
tgcctgttcg cgggttgcaa caacgttaag gtgccgcagg accaaaactt taccaccatt 1380
gcgcgtaagc tgctgaaaca gaacgttctg gtggttgcga ccggttgcgg tgcgggtgcg 1440
ctgatgcgtc acggttttat ggacccggcg aacgtggatg agctgtgcgg cgacggtctg 1500
aaagcggttc tgaccgcgat cggtgaagcg aacggtctgg gtggcccgct gccgccggtg 1560
ctgcacatgg gtagctgcgt tgacaacagc cgtgcggtgg cgctggttgc ggcgctggcg 1620
aaccgtctgg gcgttgacct ggatcgtctg ccggtggttg cgagcgcggc ggaagagatg 1680
catgagaagg cggtggcgat tggtacctgg gcggttacca tcggtctgcc gacccacatt 1740
ggtgtgctgc cgccgatcac cggcagcctg ccggtgaccc aaatcctgac cagcagcgtt 1800
aaagatatta ccggtggcta cttcatcgtt gaactggacc cggagaccgc ggcggacaaa 1860
ctgctggcgg cgatcaatga gcgtcgtgcg ggtctgggtc tgccgtggtg a 1911
<210> 33
<211> 1911
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ChCODH-2 A559W:V565A
<400> 33
atggcgaaac aaaatctgaa gagcaccgac cgtgcggttc aacaaatgct ggataaagcg 60
aagcgtgagg gtattcaaac cgtgtgggat cgttacgagg cgatgaagcc gcagtgcggt 120
ttcggcgaaa ccggtctgtg ctgccgtcac tgcctgcaag gtccgtgccg tattaacccg 180
tttggcgatg agccgaaagt gggcatttgc ggtgcgaccg cggaagtgat cgttgcgcgt 240
ggtctggacc gtagcattgc ggcgggtgcg gcgggtcata gcggtcatgc gaagcacctg 300
gcgcacaccc tgaagaaagc ggtgcagggc aaagcggcga gctatatgat taaggaccgt 360
accaaactgc acagcatcgc gaagcgtctg ggtattccga ccgaaggcca aaaagacgag 420
gatattgcgc tggaagttgc gaaagcggcg ctggcggact tccatgagaa agataccccg 480
gttctgtggg tgaccaccgt tctgccgccg agccgtgtga aggttctgag cgcgcatggt 540
ctgatcccgg cgggtattga tcacgaaatc gcggagatta tgcaccgtac cagcatgggt 600
tgcgacgcgg atgcgcagaa cctgctgctg ggtggcctgc gttgcagcct ggcggacctg 660
gcgggttgct acatgggcac cgacctggcg gatatcctgt ttggtacccc ggcgccggtg 720
gttaccgaaa gcaacctggg cgtgctgaag gcggatgcgg tgaacgttgc ggtgcacggt 780
cacaacccgg ttctgagcga catcattgtt agcgtgagca aagagatgga aaacgaggcg 840
cgtgcggcgg gtgcgaccgg tatcaacgtg gttggtattt gctgcaccgg caacgaggtg 900
ctgatgcgtc acggtattcc ggcgtgcacc cacagcgtta gccaggaaat ggcgatgatc 960
accggcgcgc tggacgcgat gatcctggat tatcagtgca ttcaaccgag cgtggcgacc 1020
attgcggagt gcaccggtac caccgttatt accaccatgg aaatgagcaa aatcaccggt 1080
gcgacccatg tgaactttgc ggaggaagcg gcggttgaga acgcgaagca aatcctgcgt 1140
ctggcgattg atacctttaa acgtcgtaag ggtaaaccgg tggagatccc gaacattaag 1200
accaaagtgg ttgcgggctt cagcaccgaa gcgatcatta acgcgctgag caagctgaac 1260
gcgaacgatc cgctgaaacc gctgattgac aacgtggtta acggtaacat ccgtggcgtg 1320
tgcctgttcg cgggttgcaa caacgttaag gtgccgcagg accaaaactt taccaccatt 1380
gcgcgtaagc tgctgaaaca gaacgttctg gtggttgcga ccggttgcgg tgcgggtgcg 1440
ctgatgcgtc acggttttat ggacccggcg aacgtggatg agctgtgcgg cgacggtctg 1500
aaagcggttc tgaccgcgat cggtgaagcg aacggtctgg gtggcccgct gccgccggtg 1560
ctgcacatgg gtagctgcgt tgacaacagc cgtgcggtgg cgctggttgc ggcgctggcg 1620
aaccgtctgg gcgttgacct ggatcgtctg ccggtggttg cgagcgcggc ggaatggatg 1680
catgagaagg cggcggcgat tggtacctgg gcggttacca tcggtctgcc gacccacatt 1740
ggtgtgctgc cgccgatcac cggcagcctg ccggtgaccc aaatcctgac cagcagcgtt 1800
aaagatatta ccggtggcta cttcatcgtt gaactggacc cggagaccgc ggcggacaaa 1860
ctgctggcgg cgatcaatga gcgtcgtgcg ggtctgggtc tgccgtggtg a 1911
<210> 34
<211> 1911
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ChCODH-2 A559W:V565S
<400> 34
atggcgaaac aaaatctgaa gagcaccgac cgtgcggttc aacaaatgct ggataaagcg 60
aagcgtgagg gtattcaaac cgtgtgggat cgttacgagg cgatgaagcc gcagtgcggt 120
ttcggcgaaa ccggtctgtg ctgccgtcac tgcctgcaag gtccgtgccg tattaacccg 180
tttggcgatg agccgaaagt gggcatttgc ggtgcgaccg cggaagtgat cgttgcgcgt 240
ggtctggacc gtagcattgc ggcgggtgcg gcgggtcata gcggtcatgc gaagcacctg 300
gcgcacaccc tgaagaaagc ggtgcagggc aaagcggcga gctatatgat taaggaccgt 360
accaaactgc acagcatcgc gaagcgtctg ggtattccga ccgaaggcca aaaagacgag 420
gatattgcgc tggaagttgc gaaagcggcg ctggcggact tccatgagaa agataccccg 480
gttctgtggg tgaccaccgt tctgccgccg agccgtgtga aggttctgag cgcgcatggt 540
ctgatcccgg cgggtattga tcacgaaatc gcggagatta tgcaccgtac cagcatgggt 600
tgcgacgcgg atgcgcagaa cctgctgctg ggtggcctgc gttgcagcct ggcggacctg 660
gcgggttgct acatgggcac cgacctggcg gatatcctgt ttggtacccc ggcgccggtg 720
gttaccgaaa gcaacctggg cgtgctgaag gcggatgcgg tgaacgttgc ggtgcacggt 780
cacaacccgg ttctgagcga catcattgtt agcgtgagca aagagatgga aaacgaggcg 840
cgtgcggcgg gtgcgaccgg tatcaacgtg gttggtattt gctgcaccgg caacgaggtg 900
ctgatgcgtc acggtattcc ggcgtgcacc cacagcgtta gccaggaaat ggcgatgatc 960
accggcgcgc tggacgcgat gatcctggat tatcagtgca ttcaaccgag cgtggcgacc 1020
attgcggagt gcaccggtac caccgttatt accaccatgg aaatgagcaa aatcaccggt 1080
gcgacccatg tgaactttgc ggaggaagcg gcggttgaga acgcgaagca aatcctgcgt 1140
ctggcgattg atacctttaa acgtcgtaag ggtaaaccgg tggagatccc gaacattaag 1200
accaaagtgg ttgcgggctt cagcaccgaa gcgatcatta acgcgctgag caagctgaac 1260
gcgaacgatc cgctgaaacc gctgattgac aacgtggtta acggtaacat ccgtggcgtg 1320
tgcctgttcg cgggttgcaa caacgttaag gtgccgcagg accaaaactt taccaccatt 1380
gcgcgtaagc tgctgaaaca gaacgttctg gtggttgcga ccggttgcgg tgcgggtgcg 1440
ctgatgcgtc acggttttat ggacccggcg aacgtggatg agctgtgcgg cgacggtctg 1500
aaagcggttc tgaccgcgat cggtgaagcg aacggtctgg gtggcccgct gccgccggtg 1560
ctgcacatgg gtagctgcgt tgacaacagc cgtgcggtgg cgctggttgc ggcgctggcg 1620
aaccgtctgg gcgttgacct ggatcgtctg ccggtggttg cgagcgcggc ggaatggatg 1680
catgagaagg cgagcgcgat tggtacctgg gcggttacca tcggtctgcc gacccacatt 1740
ggtgtgctgc cgccgatcac cggcagcctg ccggtgaccc aaatcctgac cagcagcgtt 1800
aaagatatta ccggtggcta cttcatcgtt gaactggacc cggagaccgc ggcggacaaa 1860
ctgctggcgg cgatcaatga gcgtcgtgcg ggtctgggtc tgccgtggtg a 1911
<210> 35
<211> 1911
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ChCODH-2 A559Y:V565L
<400> 35
atggcgaaac aaaatctgaa gagcaccgac cgtgcggttc aacaaatgct ggataaagcg 60
aagcgtgagg gtattcaaac cgtgtgggat cgttacgagg cgatgaagcc gcagtgcggt 120
ttcggcgaaa ccggtctgtg ctgccgtcac tgcctgcaag gtccgtgccg tattaacccg 180
tttggcgatg agccgaaagt gggcatttgc ggtgcgaccg cggaagtgat cgttgcgcgt 240
ggtctggacc gtagcattgc ggcgggtgcg gcgggtcata gcggtcatgc gaagcacctg 300
gcgcacaccc tgaagaaagc ggtgcagggc aaagcggcga gctatatgat taaggaccgt 360
accaaactgc acagcatcgc gaagcgtctg ggtattccga ccgaaggcca aaaagacgag 420
gatattgcgc tggaagttgc gaaagcggcg ctggcggact tccatgagaa agataccccg 480
gttctgtggg tgaccaccgt tctgccgccg agccgtgtga aggttctgag cgcgcatggt 540
ctgatcccgg cgggtattga tcacgaaatc gcggagatta tgcaccgtac cagcatgggt 600
tgcgacgcgg atgcgcagaa cctgctgctg ggtggcctgc gttgcagcct ggcggacctg 660
gcgggttgct acatgggcac cgacctggcg gatatcctgt ttggtacccc ggcgccggtg 720
gttaccgaaa gcaacctggg cgtgctgaag gcggatgcgg tgaacgttgc ggtgcacggt 780
cacaacccgg ttctgagcga catcattgtt agcgtgagca aagagatgga aaacgaggcg 840
cgtgcggcgg gtgcgaccgg tatcaacgtg gttggtattt gctgcaccgg caacgaggtg 900
ctgatgcgtc acggtattcc ggcgtgcacc cacagcgtta gccaggaaat ggcgatgatc 960
accggcgcgc tggacgcgat gatcctggat tatcagtgca ttcaaccgag cgtggcgacc 1020
attgcggagt gcaccggtac caccgttatt accaccatgg aaatgagcaa aatcaccggt 1080
gcgacccatg tgaactttgc ggaggaagcg gcggttgaga acgcgaagca aatcctgcgt 1140
ctggcgattg atacctttaa acgtcgtaag ggtaaaccgg tggagatccc gaacattaag 1200
accaaagtgg ttgcgggctt cagcaccgaa gcgatcatta acgcgctgag caagctgaac 1260
gcgaacgatc cgctgaaacc gctgattgac aacgtggtta acggtaacat ccgtggcgtg 1320
tgcctgttcg cgggttgcaa caacgttaag gtgccgcagg accaaaactt taccaccatt 1380
gcgcgtaagc tgctgaaaca gaacgttctg gtggttgcga ccggttgcgg tgcgggtgcg 1440
ctgatgcgtc acggttttat ggacccggcg aacgtggatg agctgtgcgg cgacggtctg 1500
aaagcggttc tgaccgcgat cggtgaagcg aacggtctgg gtggcccgct gccgccggtg 1560
ctgcacatgg gtagctgcgt tgacaacagc cgtgcggtgg cgctggttgc ggcgctggcg 1620
aaccgtctgg gcgttgacct ggatcgtctg ccggtggttg cgagcgcggc ggaatacatg 1680
catgagaagg cgctggcgat tggtacctgg gcggttacca tcggtctgcc gacccacatt 1740
ggtgtgctgc cgccgatcac cggcagcctg ccggtgaccc aaatcctgac cagcagcgtt 1800
aaagatatta ccggtggcta cttcatcgtt gaactggacc cggagaccgc ggcggacaaa 1860
ctgctggcgg cgatcaatga gcgtcgtgcg ggtctgggtc tgccgtggtg a 1911
<210> 36
<211> 1911
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ChCODH-2 A559W:T578S
<400> 36
atggcgaaac aaaatctgaa gagcaccgac cgtgcggttc aacaaatgct ggataaagcg 60
aagcgtgagg gtattcaaac cgtgtgggat cgttacgagg cgatgaagcc gcagtgcggt 120
ttcggcgaaa ccggtctgtg ctgccgtcac tgcctgcaag gtccgtgccg tattaacccg 180
tttggcgatg agccgaaagt gggcatttgc ggtgcgaccg cggaagtgat cgttgcgcgt 240
ggtctggacc gtagcattgc ggcgggtgcg gcgggtcata gcggtcatgc gaagcacctg 300
gcgcacaccc tgaagaaagc ggtgcagggc aaagcggcga gctatatgat taaggaccgt 360
accaaactgc acagcatcgc gaagcgtctg ggtattccga ccgaaggcca aaaagacgag 420
gatattgcgc tggaagttgc gaaagcggcg ctggcggact tccatgagaa agataccccg 480
gttctgtggg tgaccaccgt tctgccgccg agccgtgtga aggttctgag cgcgcatggt 540
ctgatcccgg cgggtattga tcacgaaatc gcggagatta tgcaccgtac cagcatgggt 600
tgcgacgcgg atgcgcagaa cctgctgctg ggtggcctgc gttgcagcct ggcggacctg 660
gcgggttgct acatgggcac cgacctggcg gatatcctgt ttggtacccc ggcgccggtg 720
gttaccgaaa gcaacctggg cgtgctgaag gcggatgcgg tgaacgttgc ggtgcacggt 780
cacaacccgg ttctgagcga catcattgtt agcgtgagca aagagatgga aaacgaggcg 840
cgtgcggcgg gtgcgaccgg tatcaacgtg gttggtattt gctgcaccgg caacgaggtg 900
ctgatgcgtc acggtattcc ggcgtgcacc cacagcgtta gccaggaaat ggcgatgatc 960
accggcgcgc tggacgcgat gatcctggat tatcagtgca ttcaaccgag cgtggcgacc 1020
attgcggagt gcaccggtac caccgttatt accaccatgg aaatgagcaa aatcaccggt 1080
gcgacccatg tgaactttgc ggaggaagcg gcggttgaga acgcgaagca aatcctgcgt 1140
ctggcgattg atacctttaa acgtcgtaag ggtaaaccgg tggagatccc gaacattaag 1200
accaaagtgg ttgcgggctt cagcaccgaa gcgatcatta acgcgctgag caagctgaac 1260
gcgaacgatc cgctgaaacc gctgattgac aacgtggtta acggtaacat ccgtggcgtg 1320
tgcctgttcg cgggttgcaa caacgttaag gtgccgcagg accaaaactt taccaccatt 1380
gcgcgtaagc tgctgaaaca gaacgttctg gtggttgcga ccggttgcgg tgcgggtgcg 1440
ctgatgcgtc acggttttat ggacccggcg aacgtggatg agctgtgcgg cgacggtctg 1500
aaagcggttc tgaccgcgat cggtgaagcg aacggtctgg gtggcccgct gccgccggtg 1560
ctgcacatgg gtagctgcgt tgacaacagc cgtgcggtgg cgctggttgc ggcgctggcg 1620
aaccgtctgg gcgttgacct ggatcgtctg ccggtggttg cgagcgcggc ggaatggatg 1680
catgagaagg cggtggcgat tggtacctgg gcggttacca tcggtctgcc gagccacatt 1740
ggtgtgctgc cgccgatcac cggcagcctg ccggtgaccc aaatcctgac cagcagcgtt 1800
aaagatatta ccggtggcta cttcatcgtt gaactggacc cggagaccgc ggcggacaaa 1860
ctgctggcgg cgatcaatga gcgtcgtgcg ggtctgggtc tgccgtggtg a 1911
<210> 37
<211> 1911
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ChCODH-2 A559W:L82S
<400> 37
atggcgaaac aaaatctgaa gagcaccgac cgtgcggttc aacaaatgct ggataaagcg 60
aagcgtgagg gtattcaaac cgtgtgggat cgttacgagg cgatgaagcc gcagtgcggt 120
ttcggcgaaa ccggtctgtg ctgccgtcac tgcctgcaag gtccgtgccg tattaacccg 180
tttggcgatg agccgaaagt gggcatttgc ggtgcgaccg cggaagtgat cgttgcgcgt 240
ggtagcgacc gtagcattgc ggcgggtgcg gcgggtcata gcggtcatgc gaagcacctg 300
gcgcacaccc tgaagaaagc ggtgcagggc aaagcggcga gctatatgat taaggaccgt 360
accaaactgc acagcatcgc gaagcgtctg ggtattccga ccgaaggcca aaaagacgag 420
gatattgcgc tggaagttgc gaaagcggcg ctggcggact tccatgagaa agataccccg 480
gttctgtggg tgaccaccgt tctgccgccg agccgtgtga aggttctgag cgcgcatggt 540
ctgatcccgg cgggtattga tcacgaaatc gcggagatta tgcaccgtac cagcatgggt 600
tgcgacgcgg atgcgcagaa cctgctgctg ggtggcctgc gttgcagcct ggcggacctg 660
gcgggttgct acatgggcac cgacctggcg gatatcctgt ttggtacccc ggcgccggtg 720
gttaccgaaa gcaacctggg cgtgctgaag gcggatgcgg tgaacgttgc ggtgcacggt 780
cacaacccgg ttctgagcga catcattgtt agcgtgagca aagagatgga aaacgaggcg 840
cgtgcggcgg gtgcgaccgg tatcaacgtg gttggtattt gctgcaccgg caacgaggtg 900
ctgatgcgtc acggtattcc ggcgtgcacc cacagcgtta gccaggaaat ggcgatgatc 960
accggcgcgc tggacgcgat gatcctggat tatcagtgca ttcaaccgag cgtggcgacc 1020
attgcggagt gcaccggtac caccgttatt accaccatgg aaatgagcaa aatcaccggt 1080
gcgacccatg tgaactttgc ggaggaagcg gcggttgaga acgcgaagca aatcctgcgt 1140
ctggcgattg atacctttaa acgtcgtaag ggtaaaccgg tggagatccc gaacattaag 1200
accaaagtgg ttgcgggctt cagcaccgaa gcgatcatta acgcgctgag caagctgaac 1260
gcgaacgatc cgctgaaacc gctgattgac aacgtggtta acggtaacat ccgtggcgtg 1320
tgcctgttcg cgggttgcaa caacgttaag gtgccgcagg accaaaactt taccaccatt 1380
gcgcgtaagc tgctgaaaca gaacgttctg gtggttgcga ccggttgcgg tgcgggtgcg 1440
ctgatgcgtc acggttttat ggacccggcg aacgtggatg agctgtgcgg cgacggtctg 1500
aaagcggttc tgaccgcgat cggtgaagcg aacggtctgg gtggcccgct gccgccggtg 1560
ctgcacatgg gtagctgcgt tgacaacagc cgtgcggtgg cgctggttgc ggcgctggcg 1620
aaccgtctgg gcgttgacct ggatcgtctg ccggtggttg cgagcgcggc ggaatggatg 1680
catgagaagg cggtggcgat tggtacctgg gcggttacca tcggtctgcc gacccacatt 1740
ggtgtgctgc cgccgatcac cggcagcctg ccggtgaccc aaatcctgac cagcagcgtt 1800
aaagatatta ccggtggcta cttcatcgtt gaactggacc cggagaccgc ggcggacaaa 1860
ctgctggcgg cgatcaatga gcgtcgtgcg ggtctgggtc tgccgtggtg a 1911
<210> 38
<211> 1911
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ChCODH-2 A559W:L82V
<400> 38
atggcgaaac aaaatctgaa gagcaccgac cgtgcggttc aacaaatgct ggataaagcg 60
aagcgtgagg gtattcaaac cgtgtgggat cgttacgagg cgatgaagcc gcagtgcggt 120
ttcggcgaaa ccggtctgtg ctgccgtcac tgcctgcaag gtccgtgccg tattaacccg 180
tttggcgatg agccgaaagt gggcatttgc ggtgcgaccg cggaagtgat cgttgcgcgt 240
ggtgtggacc gtagcattgc ggcgggtgcg gcgggtcata gcggtcatgc gaagcacctg 300
gcgcacaccc tgaagaaagc ggtgcagggc aaagcggcga gctatatgat taaggaccgt 360
accaaactgc acagcatcgc gaagcgtctg ggtattccga ccgaaggcca aaaagacgag 420
gatattgcgc tggaagttgc gaaagcggcg ctggcggact tccatgagaa agataccccg 480
gttctgtggg tgaccaccgt tctgccgccg agccgtgtga aggttctgag cgcgcatggt 540
ctgatcccgg cgggtattga tcacgaaatc gcggagatta tgcaccgtac cagcatgggt 600
tgcgacgcgg atgcgcagaa cctgctgctg ggtggcctgc gttgcagcct ggcggacctg 660
gcgggttgct acatgggcac cgacctggcg gatatcctgt ttggtacccc ggcgccggtg 720
gttaccgaaa gcaacctggg cgtgctgaag gcggatgcgg tgaacgttgc ggtgcacggt 780
cacaacccgg ttctgagcga catcattgtt agcgtgagca aagagatgga aaacgaggcg 840
cgtgcggcgg gtgcgaccgg tatcaacgtg gttggtattt gctgcaccgg caacgaggtg 900
ctgatgcgtc acggtattcc ggcgtgcacc cacagcgtta gccaggaaat ggcgatgatc 960
accggcgcgc tggacgcgat gatcctggat tatcagtgca ttcaaccgag cgtggcgacc 1020
attgcggagt gcaccggtac caccgttatt accaccatgg aaatgagcaa aatcaccggt 1080
gcgacccatg tgaactttgc ggaggaagcg gcggttgaga acgcgaagca aatcctgcgt 1140
ctggcgattg atacctttaa acgtcgtaag ggtaaaccgg tggagatccc gaacattaag 1200
accaaagtgg ttgcgggctt cagcaccgaa gcgatcatta acgcgctgag caagctgaac 1260
gcgaacgatc cgctgaaacc gctgattgac aacgtggtta acggtaacat ccgtggcgtg 1320
tgcctgttcg cgggttgcaa caacgttaag gtgccgcagg accaaaactt taccaccatt 1380
gcgcgtaagc tgctgaaaca gaacgttctg gtggttgcga ccggttgcgg tgcgggtgcg 1440
ctgatgcgtc acggttttat ggacccggcg aacgtggatg agctgtgcgg cgacggtctg 1500
aaagcggttc tgaccgcgat cggtgaagcg aacggtctgg gtggcccgct gccgccggtg 1560
ctgcacatgg gtagctgcgt tgacaacagc cgtgcggtgg cgctggttgc ggcgctggcg 1620
aaccgtctgg gcgttgacct ggatcgtctg ccggtggttg cgagcgcggc ggaatggatg 1680
catgagaagg cggtggcgat tggtacctgg gcggttacca tcggtctgcc gacccacatt 1740
ggtgtgctgc cgccgatcac cggcagcctg ccggtgaccc aaatcctgac cagcagcgtt 1800
aaagatatta ccggtggcta cttcatcgtt gaactggacc cggagaccgc ggcggacaaa 1860
ctgctggcgg cgatcaatga gcgtcgtgcg ggtctgggtc tgccgtggtg a 1911
<210> 39
<211> 1911
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ChCODH-2 A559Y:I580L
<400> 39
atggcgaaac aaaatctgaa gagcaccgac cgtgcggttc aacaaatgct ggataaagcg 60
aagcgtgagg gtattcaaac cgtgtgggat cgttacgagg cgatgaagcc gcagtgcggt 120
ttcggcgaaa ccggtctgtg ctgccgtcac tgcctgcaag gtccgtgccg tattaacccg 180
tttggcgatg agccgaaagt gggcatttgc ggtgcgaccg cggaagtgat cgttgcgcgt 240
ggtctggacc gtagcattgc ggcgggtgcg gcgggtcata gcggtcatgc gaagcacctg 300
gcgcacaccc tgaagaaagc ggtgcagggc aaagcggcga gctatatgat taaggaccgt 360
accaaactgc acagcatcgc gaagcgtctg ggtattccga ccgaaggcca aaaagacgag 420
gatattgcgc tggaagttgc gaaagcggcg ctggcggact tccatgagaa agataccccg 480
gttctgtggg tgaccaccgt tctgccgccg agccgtgtga aggttctgag cgcgcatggt 540
ctgatcccgg cgggtattga tcacgaaatc gcggagatta tgcaccgtac cagcatgggt 600
tgcgacgcgg atgcgcagaa cctgctgctg ggtggcctgc gttgcagcct ggcggacctg 660
gcgggttgct acatgggcac cgacctggcg gatatcctgt ttggtacccc ggcgccggtg 720
gttaccgaaa gcaacctggg cgtgctgaag gcggatgcgg tgaacgttgc ggtgcacggt 780
cacaacccgg ttctgagcga catcattgtt agcgtgagca aagagatgga aaacgaggcg 840
cgtgcggcgg gtgcgaccgg tatcaacgtg gttggtattt gctgcaccgg caacgaggtg 900
ctgatgcgtc acggtattcc ggcgtgcacc cacagcgtta gccaggaaat ggcgatgatc 960
accggcgcgc tggacgcgat gatcctggat tatcagtgca ttcaaccgag cgtggcgacc 1020
attgcggagt gcaccggtac caccgttatt accaccatgg aaatgagcaa aatcaccggt 1080
gcgacccatg tgaactttgc ggaggaagcg gcggttgaga acgcgaagca aatcctgcgt 1140
ctggcgattg atacctttaa acgtcgtaag ggtaaaccgg tggagatccc gaacattaag 1200
accaaagtgg ttgcgggctt cagcaccgaa gcgatcatta acgcgctgag caagctgaac 1260
gcgaacgatc cgctgaaacc gctgattgac aacgtggtta acggtaacat ccgtggcgtg 1320
tgcctgttcg cgggttgcaa caacgttaag gtgccgcagg accaaaactt taccaccatt 1380
gcgcgtaagc tgctgaaaca gaacgttctg gtggttgcga ccggttgcgg tgcgggtgcg 1440
ctgatgcgtc acggttttat ggacccggcg aacgtggatg agctgtgcgg cgacggtctg 1500
aaagcggttc tgaccgcgat cggtgaagcg aacggtctgg gtggcccgct gccgccggtg 1560
ctgcacatgg gtagctgcgt tgacaacagc cgtgcggtgg cgctggttgc ggcgctggcg 1620
aaccgtctgg gcgttgacct ggatcgtctg ccggtggttg cgagcgcggc ggaatacatg 1680
catgagaagg cggtggcgat tggtacctgg gcggttacca tcggtctgcc gacccacctg 1740
ggtgtgctgc cgccgatcac cggcagcctg ccggtgaccc aaatcctgac cagcagcgtt 1800
aaagatatta ccggtggcta cttcatcgtt gaactggacc cggagaccgc ggcggacaaa 1860
ctgctggcgg cgatcaatga gcgtcgtgcg ggtctgggtc tgccgtggtg a 1911
<210> 40
<211> 1911
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ChCODH-2 A559H:I586S
<400> 40
atggcgaaac aaaatctgaa gagcaccgac cgtgcggttc aacaaatgct ggataaagcg 60
aagcgtgagg gtattcaaac cgtgtgggat cgttacgagg cgatgaagcc gcagtgcggt 120
ttcggcgaaa ccggtctgtg ctgccgtcac tgcctgcaag gtccgtgccg tattaacccg 180
tttggcgatg agccgaaagt gggcatttgc ggtgcgaccg cggaagtgat cgttgcgcgt 240
ggtctggacc gtagcattgc ggcgggtgcg gcgggtcata gcggtcatgc gaagcacctg 300
gcgcacaccc tgaagaaagc ggtgcagggc aaagcggcga gctatatgat taaggaccgt 360
accaaactgc acagcatcgc gaagcgtctg ggtattccga ccgaaggcca aaaagacgag 420
gatattgcgc tggaagttgc gaaagcggcg ctggcggact tccatgagaa agataccccg 480
gttctgtggg tgaccaccgt tctgccgccg agccgtgtga aggttctgag cgcgcatggt 540
ctgatcccgg cgggtattga tcacgaaatc gcggagatta tgcaccgtac cagcatgggt 600
tgcgacgcgg atgcgcagaa cctgctgctg ggtggcctgc gttgcagcct ggcggacctg 660
gcgggttgct acatgggcac cgacctggcg gatatcctgt ttggtacccc ggcgccggtg 720
gttaccgaaa gcaacctggg cgtgctgaag gcggatgcgg tgaacgttgc ggtgcacggt 780
cacaacccgg ttctgagcga catcattgtt agcgtgagca aagagatgga aaacgaggcg 840
cgtgcggcgg gtgcgaccgg tatcaacgtg gttggtattt gctgcaccgg caacgaggtg 900
ctgatgcgtc acggtattcc ggcgtgcacc cacagcgtta gccaggaaat ggcgatgatc 960
accggcgcgc tggacgcgat gatcctggat tatcagtgca ttcaaccgag cgtggcgacc 1020
attgcggagt gcaccggtac caccgttatt accaccatgg aaatgagcaa aatcaccggt 1080
gcgacccatg tgaactttgc ggaggaagcg gcggttgaga acgcgaagca aatcctgcgt 1140
ctggcgattg atacctttaa acgtcgtaag ggtaaaccgg tggagatccc gaacattaag 1200
accaaagtgg ttgcgggctt cagcaccgaa gcgatcatta acgcgctgag caagctgaac 1260
gcgaacgatc cgctgaaacc gctgattgac aacgtggtta acggtaacat ccgtggcgtg 1320
tgcctgttcg cgggttgcaa caacgttaag gtgccgcagg accaaaactt taccaccatt 1380
gcgcgtaagc tgctgaaaca gaacgttctg gtggttgcga ccggttgcgg tgcgggtgcg 1440
ctgatgcgtc acggttttat ggacccggcg aacgtggatg agctgtgcgg cgacggtctg 1500
aaagcggttc tgaccgcgat cggtgaagcg aacggtctgg gtggcccgct gccgccggtg 1560
ctgcacatgg gtagctgcgt tgacaacagc cgtgcggtgg cgctggttgc ggcgctggcg 1620
aaccgtctgg gcgttgacct ggatcgtctg ccggtggttg cgagcgcggc ggaacacatg 1680
catgagaagg cggtggcgat tggtacctgg gcggttacca tcggtctgcc gacccacatt 1740
ggtgtgctgc cgccgagcac cggcagcctg ccggtgaccc aaatcctgac cagcagcgtt 1800
aaagatatta ccggtggcta cttcatcgtt gaactggacc cggagaccgc ggcggacaaa 1860
ctgctggcgg cgatcaatga gcgtcgtgcg ggtctgggtc tgccgtggtg a 1911
<210> 41
<211> 1911
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ChCODH-2 A559H:T593S
<400> 41
atggcgaaac aaaatctgaa gagcaccgac cgtgcggttc aacaaatgct ggataaagcg 60
aagcgtgagg gtattcaaac cgtgtgggat cgttacgagg cgatgaagcc gcagtgcggt 120
ttcggcgaaa ccggtctgtg ctgccgtcac tgcctgcaag gtccgtgccg tattaacccg 180
tttggcgatg agccgaaagt gggcatttgc ggtgcgaccg cggaagtgat cgttgcgcgt 240
ggtctggacc gtagcattgc ggcgggtgcg gcgggtcata gcggtcatgc gaagcacctg 300
gcgcacaccc tgaagaaagc ggtgcagggc aaagcggcga gctatatgat taaggaccgt 360
accaaactgc acagcatcgc gaagcgtctg ggtattccga ccgaaggcca aaaagacgag 420
gatattgcgc tggaagttgc gaaagcggcg ctggcggact tccatgagaa agataccccg 480
gttctgtggg tgaccaccgt tctgccgccg agccgtgtga aggttctgag cgcgcatggt 540
ctgatcccgg cgggtattga tcacgaaatc gcggagatta tgcaccgtac cagcatgggt 600
tgcgacgcgg atgcgcagaa cctgctgctg ggtggcctgc gttgcagcct ggcggacctg 660
gcgggttgct acatgggcac cgacctggcg gatatcctgt ttggtacccc ggcgccggtg 720
gttaccgaaa gcaacctggg cgtgctgaag gcggatgcgg tgaacgttgc ggtgcacggt 780
cacaacccgg ttctgagcga catcattgtt agcgtgagca aagagatgga aaacgaggcg 840
cgtgcggcgg gtgcgaccgg tatcaacgtg gttggtattt gctgcaccgg caacgaggtg 900
ctgatgcgtc acggtattcc ggcgtgcacc cacagcgtta gccaggaaat ggcgatgatc 960
accggcgcgc tggacgcgat gatcctggat tatcagtgca ttcaaccgag cgtggcgacc 1020
attgcggagt gcaccggtac caccgttatt accaccatgg aaatgagcaa aatcaccggt 1080
gcgacccatg tgaactttgc ggaggaagcg gcggttgaga acgcgaagca aatcctgcgt 1140
ctggcgattg atacctttaa acgtcgtaag ggtaaaccgg tggagatccc gaacattaag 1200
accaaagtgg ttgcgggctt cagcaccgaa gcgatcatta acgcgctgag caagctgaac 1260
gcgaacgatc cgctgaaacc gctgattgac aacgtggtta acggtaacat ccgtggcgtg 1320
tgcctgttcg cgggttgcaa caacgttaag gtgccgcagg accaaaactt taccaccatt 1380
gcgcgtaagc tgctgaaaca gaacgttctg gtggttgcga ccggttgcgg tgcgggtgcg 1440
ctgatgcgtc acggttttat ggacccggcg aacgtggatg agctgtgcgg cgacggtctg 1500
aaagcggttc tgaccgcgat cggtgaagcg aacggtctgg gtggcccgct gccgccggtg 1560
ctgcacatgg gtagctgcgt tgacaacagc cgtgcggtgg cgctggttgc ggcgctggcg 1620
aaccgtctgg gcgttgacct ggatcgtctg ccggtggttg cgagcgcggc ggaacacatg 1680
catgagaagg cggtggcgat tggtacctgg gcggttacca tcggtctgcc gacccacatt 1740
ggtgtgctgc cgccgatcac cggcagcctg ccggtgagcc aaatcctgac cagcagcgtt 1800
aaagatatta ccggtggcta cttcatcgtt gaactggacc cggagaccgc ggcggacaaa 1860
ctgctggcgg cgatcaatga gcgtcgtgcg ggtctgggtc tgccgtggtg a 1911
<210> 42
<211> 1911
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ChCODH-2 A559H:T597S
<400> 42
atggcgaaac aaaatctgaa gagcaccgac cgtgcggttc aacaaatgct ggataaagcg 60
aagcgtgagg gtattcaaac cgtgtgggat cgttacgagg cgatgaagcc gcagtgcggt 120
ttcggcgaaa ccggtctgtg ctgccgtcac tgcctgcaag gtccgtgccg tattaacccg 180
tttggcgatg agccgaaagt gggcatttgc ggtgcgaccg cggaagtgat cgttgcgcgt 240
ggtctggacc gtagcattgc ggcgggtgcg gcgggtcata gcggtcatgc gaagcacctg 300
gcgcacaccc tgaagaaagc ggtgcagggc aaagcggcga gctatatgat taaggaccgt 360
accaaactgc acagcatcgc gaagcgtctg ggtattccga ccgaaggcca aaaagacgag 420
gatattgcgc tggaagttgc gaaagcggcg ctggcggact tccatgagaa agataccccg 480
gttctgtggg tgaccaccgt tctgccgccg agccgtgtga aggttctgag cgcgcatggt 540
ctgatcccgg cgggtattga tcacgaaatc gcggagatta tgcaccgtac cagcatgggt 600
tgcgacgcgg atgcgcagaa cctgctgctg ggtggcctgc gttgcagcct ggcggacctg 660
gcgggttgct acatgggcac cgacctggcg gatatcctgt ttggtacccc ggcgccggtg 720
gttaccgaaa gcaacctggg cgtgctgaag gcggatgcgg tgaacgttgc ggtgcacggt 780
cacaacccgg ttctgagcga catcattgtt agcgtgagca aagagatgga aaacgaggcg 840
cgtgcggcgg gtgcgaccgg tatcaacgtg gttggtattt gctgcaccgg caacgaggtg 900
ctgatgcgtc acggtattcc ggcgtgcacc cacagcgtta gccaggaaat ggcgatgatc 960
accggcgcgc tggacgcgat gatcctggat tatcagtgca ttcaaccgag cgtggcgacc 1020
attgcggagt gcaccggtac caccgttatt accaccatgg aaatgagcaa aatcaccggt 1080
gcgacccatg tgaactttgc ggaggaagcg gcggttgaga acgcgaagca aatcctgcgt 1140
ctggcgattg atacctttaa acgtcgtaag ggtaaaccgg tggagatccc gaacattaag 1200
accaaagtgg ttgcgggctt cagcaccgaa gcgatcatta acgcgctgag caagctgaac 1260
gcgaacgatc cgctgaaacc gctgattgac aacgtggtta acggtaacat ccgtggcgtg 1320
tgcctgttcg cgggttgcaa caacgttaag gtgccgcagg accaaaactt taccaccatt 1380
gcgcgtaagc tgctgaaaca gaacgttctg gtggttgcga ccggttgcgg tgcgggtgcg 1440
ctgatgcgtc acggttttat ggacccggcg aacgtggatg agctgtgcgg cgacggtctg 1500
aaagcggttc tgaccgcgat cggtgaagcg aacggtctgg gtggcccgct gccgccggtg 1560
ctgcacatgg gtagctgcgt tgacaacagc cgtgcggtgg cgctggttgc ggcgctggcg 1620
aaccgtctgg gcgttgacct ggatcgtctg ccggtggttg cgagcgcggc ggaacacatg 1680
catgagaagg cggtggcgat tggtacctgg gcggttacca tcggtctgcc gacccacatt 1740
ggtgtgctgc cgccgatcac cggcagcctg ccggtgaccc aaatcctgag cagcagcgtt 1800
aaagatatta ccggtggcta cttcatcgtt gaactggacc cggagaccgc ggcggacaaa 1860
ctgctggcgg cgatcaatga gcgtcgtgcg ggtctgggtc tgccgtggtg a 1911
<210> 43
<211> 1911
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ChCODH-2 A559H:V610S
<400> 43
atggcgaaac aaaatctgaa gagcaccgac cgtgcggttc aacaaatgct ggataaagcg 60
aagcgtgagg gtattcaaac cgtgtgggat cgttacgagg cgatgaagcc gcagtgcggt 120
ttcggcgaaa ccggtctgtg ctgccgtcac tgcctgcaag gtccgtgccg tattaacccg 180
tttggcgatg agccgaaagt gggcatttgc ggtgcgaccg cggaagtgat cgttgcgcgt 240
ggtctggacc gtagcattgc ggcgggtgcg gcgggtcata gcggtcatgc gaagcacctg 300
gcgcacaccc tgaagaaagc ggtgcagggc aaagcggcga gctatatgat taaggaccgt 360
accaaactgc acagcatcgc gaagcgtctg ggtattccga ccgaaggcca aaaagacgag 420
gatattgcgc tggaagttgc gaaagcggcg ctggcggact tccatgagaa agataccccg 480
gttctgtggg tgaccaccgt tctgccgccg agccgtgtga aggttctgag cgcgcatggt 540
ctgatcccgg cgggtattga tcacgaaatc gcggagatta tgcaccgtac cagcatgggt 600
tgcgacgcgg atgcgcagaa cctgctgctg ggtggcctgc gttgcagcct ggcggacctg 660
gcgggttgct acatgggcac cgacctggcg gatatcctgt ttggtacccc ggcgccggtg 720
gttaccgaaa gcaacctggg cgtgctgaag gcggatgcgg tgaacgttgc ggtgcacggt 780
cacaacccgg ttctgagcga catcattgtt agcgtgagca aagagatgga aaacgaggcg 840
cgtgcggcgg gtgcgaccgg tatcaacgtg gttggtattt gctgcaccgg caacgaggtg 900
ctgatgcgtc acggtattcc ggcgtgcacc cacagcgtta gccaggaaat ggcgatgatc 960
accggcgcgc tggacgcgat gatcctggat tatcagtgca ttcaaccgag cgtggcgacc 1020
attgcggagt gcaccggtac caccgttatt accaccatgg aaatgagcaa aatcaccggt 1080
gcgacccatg tgaactttgc ggaggaagcg gcggttgaga acgcgaagca aatcctgcgt 1140
ctggcgattg atacctttaa acgtcgtaag ggtaaaccgg tggagatccc gaacattaag 1200
accaaagtgg ttgcgggctt cagcaccgaa gcgatcatta acgcgctgag caagctgaac 1260
gcgaacgatc cgctgaaacc gctgattgac aacgtggtta acggtaacat ccgtggcgtg 1320
tgcctgttcg cgggttgcaa caacgttaag gtgccgcagg accaaaactt taccaccatt 1380
gcgcgtaagc tgctgaaaca gaacgttctg gtggttgcga ccggttgcgg tgcgggtgcg 1440
ctgatgcgtc acggttttat ggacccggcg aacgtggatg agctgtgcgg cgacggtctg 1500
aaagcggttc tgaccgcgat cggtgaagcg aacggtctgg gtggcccgct gccgccggtg 1560
ctgcacatgg gtagctgcgt tgacaacagc cgtgcggtgg cgctggttgc ggcgctggcg 1620
aaccgtctgg gcgttgacct ggatcgtctg ccggtggttg cgagcgcggc ggaacacatg 1680
catgagaagg cggtggcgat tggtacctgg gcggttacca tcggtctgcc gacccacatt 1740
ggtgtgctgc cgccgatcac cggcagcctg ccggtgaccc aaatcctgac cagcagcgtt 1800
aaagatatta ccggtggcta cttcatcagc gaactggacc cggagaccgc ggcggacaaa 1860
ctgctggcgg cgatcaatga gcgtcgtgcg ggtctgggtc tgccgtggtg a 1911
Claims (16)
- 산소 내성 또는 효소 활성이 증가된 일산화탄소 탈수소효소(CO dehydrogenase)로서,
상기 일산화탄소 탈수소효소는 서열번호 24, 26, 30, 35 내지 38 및 40 내지 43의 염기 서열로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질인, 일산화탄소 탈수소효소.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 청구항 1에 있어서, 상기 산소 내성은 야생형(Wild type)에 비해 1 내지 200배 증가된 것인, 일산화탄소 탈수소효소.
- 청구항 1에 있어서, 상기 효소 활성은 야생형(Wild type)에 비해 1 내지 200배 증가된 것인, 일산화탄소 탈수소효소.
- 산소 내성 또는 효소 활성이 증가된 일산화탄소 탈수소효소(CO dehydrogenase)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서,
상기 일산화탄소 탈수소효소는 서열번호 24, 26, 30, 35 내지 38 및 40 내지 43의 염기 서열로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질인, 폴리뉴클레오티드.
- 산소 내성 또는 효소 활성이 증가된 일산화탄소 탈수소효소(CO dehydrogenase)를 발현하는 벡터로서,
상기 일산화탄소 탈수소효소는 서열번호 24, 26, 30, 35 내지 38 및 40 내지 43의 염기 서열로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질인, 벡터.
- 산소 내성 또는 효소 활성이 증가된 일산화탄소 탈수소효소(CO dehydrogenase)를 발현하는 미생물로서,
상기 일산화탄소 탈수소효소는 서열번호 24, 26, 30, 35 내지 38 및 40 내지 43의 염기 서열로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질인, 미생물.
- 산소 내성 또는 효소 활성이 증가된 일산화탄소 탈수소효소(CO dehydrogenase)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 일산화탄소 탈수소효소의 제조 방법으로서,
상기 일산화탄소 탈수소효소는 서열번호 24, 26, 30, 35 내지 38 및 40 내지 43의 염기 서열로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질인, 방법.
- 일산화탄소에 산소 내성 또는 효소 활성이 증가된 일산화탄소 탈수소효소(CO dehydrogenase)를 접촉시키는 단계를 포함하는 일산화탄소의 제거 방법으로서,
상기 일산화탄소 탈수소효소는 서열번호 24, 26, 30, 35 내지 38 및 40 내지 43의 염기 서열로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질인, 방법.
- 일산화탄소에 산소 내성 또는 효소 활성이 증가된 일산화탄소 탈수소효소(CO dehydrogenase)를 접촉시키는 단계를 포함하는 이산화탄소의 제조 방법으로서,
상기 일산화탄소 탈수소효소는 서열번호 24, 26, 30, 35 내지 38 및 40 내지 43의 염기 서열로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질인, 방법.
- 산소 내성 또는 효소 활성이 증가된 일산화탄소 탈수소효소(CO dehydrogenase)를 포함하는 일산화탄소 제거 장치로서,
상기 일산화탄소 탈수소효소는 서열번호 24, 26, 30, 35 내지 38 및 40 내지 43의 염기 서열로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질인, 장치.
- 산소 내성 또는 효소 활성이 증가된 일산화탄소 탈수소효소(CO dehydrogenase)를 포함하는 필터로서,
상기 일산화탄소 탈수소효소는 서열번호 24, 26, 30, 35 내지 38 및 40 내지 43의 염기 서열로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질인, 필터.
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020200092551A KR102393114B1 (ko) | 2020-07-24 | 2020-07-24 | 산소 내성 및 효소 활성이 우수한 일산화탄소 탈수소효소 및 그의 용도 |
US18/006,563 US20230323313A1 (en) | 2020-07-24 | 2020-08-27 | Carbon monoxide dehydrogenase having excellent oxygen resistance and enzyme activity, and use thereof |
PCT/KR2020/011468 WO2022019372A1 (ko) | 2020-07-24 | 2020-08-27 | 산소 내성 및 효소 활성이 우수한 일산화탄소 탈수소효소 및 그의 용도 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020200092551A KR102393114B1 (ko) | 2020-07-24 | 2020-07-24 | 산소 내성 및 효소 활성이 우수한 일산화탄소 탈수소효소 및 그의 용도 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20220013234A KR20220013234A (ko) | 2022-02-04 |
KR102393114B1 true KR102393114B1 (ko) | 2022-05-02 |
Family
ID=79728771
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020200092551A KR102393114B1 (ko) | 2020-07-24 | 2020-07-24 | 산소 내성 및 효소 활성이 우수한 일산화탄소 탈수소효소 및 그의 용도 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20230323313A1 (ko) |
KR (1) | KR102393114B1 (ko) |
WO (1) | WO2022019372A1 (ko) |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101826207B1 (ko) * | 2016-11-09 | 2018-02-06 | 주식회사 씨원켐 | 대장균 내 과발현 가능한 Pantoea species YR343 유래 호기성 일산화탄소-탈수소효소(carbon monoxide dehydrogenase, PsCODH)를 코딩하는 재조합 벡터, 재조합 PsCODH의 과발현 방법 및 PsCODH를 이용하여 철강 제조 공정에서 발생한 CO(carbon monoxide) 포함 폐가스를 전환하는 방법 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101865779B1 (ko) * | 2011-11-16 | 2018-06-12 | 한국과학기술원 | 이산화탄소 고정능을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용한 유용물질의 제조 방법 |
PT3180421T (pt) * | 2014-08-11 | 2019-06-07 | Lanzatech New Zealand Ltd | Bactéria geneticamente manipulada com atividade de monóxido de carbono desidrogenase (codh) diminuída |
KR102089516B1 (ko) * | 2016-01-06 | 2020-03-16 | 주식회사 씨원켐 | Co 수화효소 및 이를 이용한 개미산의 제조방법 |
-
2020
- 2020-07-24 KR KR1020200092551A patent/KR102393114B1/ko active IP Right Grant
- 2020-08-27 US US18/006,563 patent/US20230323313A1/en active Pending
- 2020-08-27 WO PCT/KR2020/011468 patent/WO2022019372A1/ko active Application Filing
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101826207B1 (ko) * | 2016-11-09 | 2018-02-06 | 주식회사 씨원켐 | 대장균 내 과발현 가능한 Pantoea species YR343 유래 호기성 일산화탄소-탈수소효소(carbon monoxide dehydrogenase, PsCODH)를 코딩하는 재조합 벡터, 재조합 PsCODH의 과발현 방법 및 PsCODH를 이용하여 철강 제조 공정에서 발생한 CO(carbon monoxide) 포함 폐가스를 전환하는 방법 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2022019372A1 (ko) | 2022-01-27 |
KR20220013234A (ko) | 2022-02-04 |
US20230323313A1 (en) | 2023-10-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU2016203445B2 (en) | Integration of a polynucleotide encoding a polypeptide that catalyzes pyruvate to acetolactate conversion | |
AU2013326968B2 (en) | Multiprotein expression cassettes | |
KR20210023830A (ko) | 프로그래밍가능한 염기 편집기 시스템을 이용하여 병원성 돌연변이를 억제하는 방법 | |
Byrd et al. | Nicking by transesterification: the reaction catalysed by a relaxase | |
CN106279380B (zh) | 使用alkL基因产物的生物催化的氧化方法 | |
US6090393A (en) | Recombinant canine adenoviruses, method for making and uses thereof | |
DK2855662T3 (en) | RECOMBINANT MICROORGANISMS AND APPLICATIONS THEREOF | |
Llosa et al. | Functional domains in protein TrwC of plasmid R388: dissected DNA strand transferase and DNA helicase activities reconstitute protein function | |
KR20140015136A (ko) | 3-히드록시프로피온산 및 다른 생성물의 제조 방법 | |
JPH08168376A (ja) | 古細菌由来の組換え熱安定dnaポリメラーゼ | |
KR20140099251A (ko) | 아세트산 및 글리세롤로부터 에탄올을 생성하도록 합성된 이스트 스트레인 | |
KR20140146616A (ko) | 부타놀로겐용 배지의 아세테이트 보충물 | |
KR20120099043A (ko) | 변이 효소 및 그 용도 | |
KR102397454B1 (ko) | 전자전달체에 대한 친화도 및 반응 속도가 우수한 일산화탄소 탈수소효소 및 그의 용도 | |
CN111465689B (zh) | Cas9变体和使用方法 | |
CN106661573B (zh) | 多核苷酸文库的重组酶介导的整合 | |
CN110951770B (zh) | 一种简单快速高效的CRISPR/Cas9载体构建方法及应用 | |
CN101849017A (zh) | 具有下调的维生素b12系统的微生物 | |
KR102393114B1 (ko) | 산소 내성 및 효소 활성이 우수한 일산화탄소 탈수소효소 및 그의 용도 | |
EP1189921A2 (en) | Synthetic genes for enhanced expression | |
Salas | Mechanisms of initiation of linear DNA replication in prokaryotes | |
JP3453397B2 (ja) | Pyrococcus種から得られる精製耐熱性DNAポリメラーゼ | |
CN108026538B (zh) | 猪圆环病毒2型的外鞘蛋白质的制备方法及含该外鞘蛋白质的医药组合物 | |
KR20240001708A (ko) | 유전적 장애의 치료를 위해 생체내 뉴클레아제-매개의 유전자 표적화를 위한 조성물 및 방법 | |
Gong et al. | Aminolevulinate synthase: functionally important residues at a glycine loop, a putative pyridoxal phosphate cofactor-binding site |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
GRNT | Written decision to grant |