CN110951770B - 一种简单快速高效的CRISPR/Cas9载体构建方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种简单快速高效的CRISPR/Cas9载体构建方法及应用，包括：构建骨架载体并对骨架载体进行线性化处理得到线性化的骨架载体，制备靶点引物后将所述靶点引物接入所述线性化的骨架载体中得到连接产物，将所述连接产物转接至大肠杆菌后得到阳性CRISPR/Cas9载体；其中，所述骨架载体连接有OsU3启动子或OsU6b启动子、gRNA1及Bsa I酶切位点，所述gRNA1上5’端的碱基5’‑gtttt‑3’被删除；所述靶点引物可包含一个或多个靶点引物片段，并通过粘性末端设计与骨架载体连接。本发明的有益效果是该方法适用于单双靶点CRISPR/Cas9载体的构建；利用Bsa I线性化的载体和酶切回收的外源片段可以长期存放于，用于大量CRISPR/Cas9载体构建。本载体系统构建CRISPR/Cas9降低了外源片段突变概率，可以确保重组质粒测序正确率为100％。

Description

一种简单快速高效的CRISPR/Cas9载体构建方法及应用

技术领域

本发明属于分子生物学，具体涉及一种简单快速高效的CRISPR/Cas9载体构建方法及应用。

背景技术

CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas(CRISPR-associated gene)系统最早是在Streptococcus pyogenes细菌中发现的，它是一种原核免疫系统，通过选择性的靶向和破坏外源DNA如病毒来保护细胞。CRISPR/Cas9是一种基于II型CRISPR的高效基因编辑系统，主要有3个组分：Cas9蛋白、tracrRNA和pre-crRNA。CRISPR/Cas9系统在植物基因编辑中应用广泛。自从2013年成功用于拟南芥、烟草和水稻的基因编辑以来，CRISPR/Cas9在水稻、小麦、烟草、拟南芥、高粱、番茄、玉米、马铃薯、杨树、大豆、大麦、苔藓、甘蓝、甜橙、苹果、苔藓、葡萄、莴苣、棉花、莲藕、蒲公英、亚麻、矮牵牛、柑橘、西瓜、蘑菇、油菜和梨树中实现编辑功能(Zhang et al 2017)。CRISPR/Cas9被认为是第三代基因编辑工具，Cas9在sgRNA的引导下，可以对靶标序列的双链进行切割，使DNA双链断裂，从而激活细胞的DNA双链断裂修复功能。在修复过程中，会发生少量碱基的替换、缺失或插入，从而导致基因的编辑。基因被编辑以后，可以采用PCR产物测序法鉴定基因型。由于测序之前并不知道基因型，所以对多个家系测序，以获得理想的编辑材料；同时测序质量的好坏也会影响对基因型的判断，所以需要重复测序最终才能确定基因型；此外由于DNA序列存在复杂结构，可能导致测序失败。因此，PCR产物测序法是一种费时费力的基因型鉴定方法。

为了简单快速鉴定CRISPR/Cas9编辑体的基因型，很多学者用两个靶点去编辑一个基因，当一个DNA序列上有两个位置发生双链断裂后，中间的片段可能发生丢失，从而只需要在靶点上下游设计引物，进行PCR扩增后，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳即可鉴定编辑体的基因型。Enciso-Rodriguez等利用CRISPR/Cas9双靶点敲除马铃薯S-RNase，在T0代成功获得了10株中间片段丢失的突变体，缺失片段达到580bp。在拟南芥中，利用这种双靶点CRISPR/Cas9敲除策略，成功删除了1.7～13kbDNA片段。在水稻中可以删除0.2～245kb的DNA片段，而删除430bp的DNA片段的概率高达22.2％。所以说双靶点敲除单个基因是一种易于检测且高效的基因编辑方法。

目前在植物中，主要采用以下4种方法来构建双靶点CRISPR/Cas9载体，第1种，Golden Gate组装。刘耀光课题组通过边切边连(Bsa I酶切，T4连接酶连接)、重叠延伸PCR制备两个两端带有Bsa I酶切位点的sgRNA表达盒，然后利用“边切边连”法组装sgRNA表达盒到pYLCRISPR/Cas9载体上。朱健康课题组的方法是先将多个设计好的靶点DNA小片段用T4 DNA连接酶构建到BbsI线性化的sgRNA入门载体上，然后用不同的限制性内切酶将相应的sgRNA表达盒切下来，最后用Golden Gate的方法将多个sgRNA表达盒连接到CRISPR/Cas9载体上。第2种，Gibson组装。研究者们首先通过PCR制备sgRNA表达盒，然后将纯化好的PCR产物与线性化的载体混合，加入混合酶反应。第3种，Golden Gate和Gateway联用法。该方法分为3步，第1步将设计好的靶点用T4 DNA连接酶构建到含有不同启动子的Golden Gate入门载体中；第2步利用Golden Gate方法将多个sgRNA表达盒构建到具有Gateway重组位点的中间载体上；第3步用Gateway重组法将Cas9蛋白、上一步中的多个sgRNA表达盒以及驱动Cas9表达的启动子构建到最终的表达载体上。第4种，同源重组法。首先通过两轮PCR将同源臂、tRNAGly、sgRNA1和靶点扩增到一起，然后将最终的PCR片段利用一步法克隆到Bsa I线性化的表达载体上。以上的方法用于CRISPR/Cas9载体构建时，操作复杂，耗时长，需要经验丰富的科研人员才能顺利完成。

发明内容

解决现有技术中CRISPR/Cas9载体构建时，操作复杂，耗时长的技术问题，本发明提供一种简单快速高效的CRISPR/Cas9载体构建方法及应用。

具体技术方案如下：

一种简单快速高效的CRISPR/Cas9载体构建方法，其不同之处在于，所述CRISPR/Cas9载体构建方法包括：

构建骨架载体并对骨架载体进行线性化处理得到线性化的骨架载体，制备靶点引物后将所述靶点引物接入所述线性化的骨架载体中得到连接产物，将所述连接产物转接至大肠杆菌后依次进行培养、抽提质粒，得到阳性CRISPR/Cas9载体；其中，所述骨架载体连接有OsU3启动子或OsU6b启动子、gRNA1及Bsa I酶切位点，所述gRNA1上5’端的碱基5’-gtttt-3’被删除；

所述靶点引物包含一个或多个靶点引物片段：

当所述靶点引物包含一个靶点引物片段时，所述靶点引物片段的正向靶点引物的5’端序列为ggca或gttg，所述靶点引物片段序列的正向引物3’端序列为gtttt，所述靶点引物片段序列的反向靶点引物的5’端序列为ctctaaaac；

当所述靶点引物包含多个引物片段时，第一个靶点引物片段序列的正向靶点引物的5’端序列为ggca或gttg，最后一个靶点引物片段序列的正向引物3’端序列为gtttt，最后一个靶点引物片段序列的反向靶点引物的5’端序列为ctctaaaac，各个所述靶点引物片段之间通过制备的外源片段进行连接。

进一步，所述gRNA1从pYLgRNA-OsU3上扩增出来得到5’端碱基5’-gtttt-3被删除的gRNA1,扩增gRNA1的正向引物序列如SEQ ID NO.10所示，所述反向引物序列如SEQ IDNO.11。

进一步，所述骨架载体上连接有ccdB表达盒，所述Bsa I酶切位点在ccdB的两端。

进一步，所述骨架载体连接有OsU3启动子时、gRNA1、ccdB表达盒及Bsa I酶切位点时，得到的骨架载体为pRC3骨架载体；

所述骨架载体连接有OsU6b启动子、gRNA1、ccdB表达盒及Bsa I酶切位点时，得到的骨架载体为pRC6b骨架载体；

所述pRC3骨架载体序列如SEQ ID NO.1所示；

所述pRC6b骨架载体序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步，当所述靶点引物包含一个靶点引物片段时，所述靶点引物片段的正向靶点引物的5’端序列为ggca时，所述靶点引物构建至所述pRC3骨架载体上，所述靶点引物片段的正向靶点引物的5’端序列为gttg时,所述靶点引物构建至所述pRC6b骨架载体上；

当所述靶点引物包含多个靶点引物片段时，第一个靶点引物片段序列的正向靶点引物的5’端序列为ggca时，所述靶点引物构建至所述pRC3骨架载体上；第一个靶点引物片段序列的正向靶点引物的5’端序列为gttg时，所述靶点引物构建至所述pRC6b骨架载体上。

进一步，所述线性化的骨架载体包括Pu粘性末端及gRNA1粘性末端，所述Pu粘性末端的序列为ccgt或caac，所述gRNA1粘性末端序列为agag。

上述简单快速高效的CRISPR/Cas9载体构建方法在构建单靶点CRISPR/Cas9载体中的应用，其特征在于，包括以下步骤:

步骤A1:构建骨架载体；

步骤A2:制备靶点引物；

步骤A3:对所述骨架载体进行线性化处理，得到线性化的骨架载体；

步骤A4:将所述步骤A2靶点引物变性退火，形成带粘性末端的靶点接头，再与所述线性化的骨架载体进行连接，得到连接产物；

步骤A5：将所述连接产物转接至大肠杆菌后依次进行培养、抽提质粒，酶切验证得到阳性CRISPR/Cas9载体。

上述简单快速高效的CRISPR/Cas9载体构建方法在构建多靶点CRISPR/Cas9载体中的应用，其特征在于，包括以下步骤:

步骤B1:构建骨架载体；

步骤B2:制备靶点引物；

步骤B3:制备外源片段；

步骤B4:对所述骨架载体进行线性化处理，得到线性化的骨架载体；

步骤B5:将所述步骤A2靶点引物变性退火，形成带粘性末端的靶点接头，再与所述线性化的骨架载体及所述外源片段进行连接，得到连接产物；

步骤B6：将所述连接产物转接至大肠杆菌后依次进行培养、抽提质粒，酶切验证得到阳性CRISPR/Cas9载体；

其中，所述步骤B3包括如下步骤：

步骤B3-1:包含所述外源片段的载体制备：将和启动子P_U6a以及LacZ表达盒构建到克隆载体pEASY-Blunt3上得到外源片段载体pGLU6a，所述pGLU6a的序列如SEQ ID NO.3所示；

步骤B3-2:外源片段提取，将所述外源片段载体采用Bsa I酶进行酶切，凝胶电泳后回收得到外源片段。

进一步，所述靶点引物包含两个靶点引物片段；

其中，所述第一靶点引物片段正向引物的5’端序列为ggca或gttg，所述第一靶点引物片段反向引物的5’端序列为aaac；所述第二靶点引物片段正向引物的5’端序列为gccg，所述第二靶点引物片段正向引物的3’端序列为gtttt，所述第二靶点引物片段反向引物的5’端序列为ctctaaaac。

上述CRISPR/Cas9载体构建方法在水稻基因的CRISPR/Cas9载体构建中的应用。

与现技术相比，本发明的有益效果是：(1)为基因编辑建立了一种简单快速高效的CRISPR/Cas9载体构建的方法，且该方法不仅适用于单靶点，而且适用于双靶点甚至多靶点的CRISPR/Cas9载体的构建，在双靶点及多靶点的CRISPR/Cas9载体的构建中其高效简便性相较于传统方法更为显著；(2)利用Bsa I线性化的载体和酶切回收的外源片段gRNA2-LacZ-P_U6a可以长期存放于-20℃，不用每次制备，非常方便用于大量CRISPR/Cas9载体构建。同时在外源片段上引入LacZ报告基因，阳性克隆可以在含有卡那霉素、IPTG和X-gal的LB培养皿上显蓝色，进一步提高了阳性克隆率。(3)本载体系统构建CRISPR/Cas9载体不需要经过PCR过程，大大降低了外源片段的突变概率，可以确保重组质粒测序正确率为100％。

附图说明

图1是骨架载体pRC3的载体图；

图2是骨架载体pRC6b的载体图；

图3是pGLU6a的载体图；

图4是双靶点CRISPR/Cas9载体构建流程图；

图5是10个水稻基因的双靶点CRISPR/Cas9载体酶切胶图与单靶点CRISPR/Cas9载体酶切胶图；

其中，A-双靶点构建到pRC3，B-双靶点构建到pRC6b，M-表示DNA分子标记，C-OsCYO1单靶点CRISPR/Cas9载体酶切胶图,D-OsSKIPa的单靶点CRISPR/Cas9载体酶切胶图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

CRISPR/Cas9载体构建方法应用于单靶点CRISPR/Cas9载体的构建，步骤如下：

步骤A1:构建骨架载体；

骨架载体pRC3由以下步骤制得：

将OsU3启动子(P_U3)和gRNA1从pYLgRNA-OsU3上扩增出来,所述gRNA1从pYLgRNA-OsU3上扩增出来,扩增gRNA1的正向引物序列如SEQ ID NO.10所示，所述反向引物序列如SEQ ID NO.11。

SEQ ID NO.10：tacacagccagtctgcaggtggtctcgagagctagaaatagcaa

SEQ ID NO.11：gagaggcgcgccaatgataccgacgcgtccatccactccaagctcttg

将ccdB表达盒从DS355上扩增出来(两端带有Bsa I酶切位点)；

将P_U3、ccdB表达盒和gRNA1克隆到载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H上，形成骨架载体pRC3；所述pRC3骨架载体序列如SEQ ID NO.1所示；

骨架载体由RC6b以下步骤制得：

将OsU6b启动子(P_U6b)从pYLgRNA-OsU6b上扩增出来；

所述gRNA1从pYLgRNA-OsU3上扩增出来,将ccdB表达盒从DS355上扩增出来(两端带有Bsa I酶切位点)；

将P_U6b、ccdB表达盒和gRNA1克隆到载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H上，形成骨架载体pRC6b。所述pRC6b骨架载体序列如SEQ ID NO.2所示。

扩增gRNA1的正向引物序列如SEQ ID NO.10所示，所述反向引物序列如SEQ IDNO.11。

SEQ ID NO.10：tacacagccagtctgcaggtggtctcgagagctagaaatagcaa

SEQ ID NO.11：gagaggcgcgccaatgataccgacgcgtccatccactccaagctcttg步骤A2:制备靶点引物

设计靶点。

用软件CRISPR-P 2.0(Liu et al 2017)选择第一个碱基是g的靶点。在正向靶点引物的5’端加gtt，得到5’端为gttg的序列，3’端加gtttt，反向靶点引物的5’端加ctctaaaac,然后构建到pRC6b上。

用软件CRISPR-P 2.0(Liu et al 2017)选择第一个碱基是G的靶点。在正向靶点引物的5’端加ggc，得到5’端为ggca的序列，3’端加gtttt，反向靶点引物的5’端加ctctaaaac，然后构建到pRC3上。

步骤A3：线性化载体。

Bsa I线性化pRC6b，灭活备用。酶切体系为：载体3μg，10×Cutsmart Buffer 5μl，30U Bsa I，ddH2O补至50μl，37℃酶切1h。所述线性化骨架载体包括Pu粘性末端及gRNA1粘性末端，Pu粘性末端的序列为caac或ccgt，所述gRNA1粘性末端序列为agag；

步骤A4：

所述步骤A2靶点引物变性退火，形成带粘性末端的双链靶点接头，再与所述线性化骨架载体进行连接，得到连接产物；

将两条靶点引物混合在一起，变性退火后，将0.2μL靶点引物(浓度为1μmol/L)和80ng Bsa I线性化载体pRC6b混合在一起，总共20μL反应体系(2μL 10 x NEB T4 DNAligase buffer,80U T4 DNA ligase)，利用PCR仪10℃5min，20℃5min，反应10-15个循环。连接产物转化大肠杆菌Trans1-T1。

步骤A5

连接产物转化大肠杆菌Trans1-T1。

CRISPR/Cas9载体构建方法应用于双靶点CRISPR/Cas9载体的构建，步骤如下：

步骤B1:构建骨架载体；

骨架载体pRC3由以下步骤制得：

将OsU3启动子(P_U3)和gRNA1从pYLgRNA-OsU3上扩增出来,所述gRNA1从pYLgRNA-OsU3上扩增出来,扩增gRNA1的正向引物序列如SEQ ID NO.10所示，所述反向引物序列如SEQ ID NO.11。

SEQ ID NO.10：tacacagccagtctgcaggtggtctcgagagctagaaatagcaa

SEQ ID NO.11：gagaggcgcgccaatgataccgacgcgtccatccactccaagctcttg

将ccdB表达盒从DS355上扩增出来(两端带有Bsa I酶切位点)；

将P_U3、ccdB表达盒和gRNA1克隆到载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H上，形成骨架载体pRC3；所述pRC3骨架载体序列如SEQ ID NO.1所示；

架载体由RC6b以下步骤制得：

将OsU6b启动子(P_U6b)从pYLgRNA-OsU6b上扩增出来；

所述gRNA1从pYLgRNA-OsU3上扩增出来,将ccdB表达盒从DS355上扩增出来(两端带有Bsa I酶切位点)；

将P_U6b、ccdB表达盒和gRNA1克隆到载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H上，形成骨架载体pRC6b。所述pRC6b骨架载体序列如SEQ ID NO.2所示。

扩增gRNA1的正向引物序列如SEQ ID NO.10所示，所述反向引物序列如SEQ IDNO.11。

SEQ ID NO.10：tacacagccagtctgcaggtggtctcgagagctagaaatagcaa

SEQ ID NO.11：gagaggcgcgccaatgataccgacgcgtccatccactccaagctcttg

步骤B2:制备靶点引物

设计靶点。

用软件CRISPR-P 2.0(Liu et al 2017)来选择两个靶点引物片段，第一靶点引物片段的第一个碱基必须是a或g，第二靶点引物片段的第一个碱基必须是g。靶点第一个碱基是a，则在5’端加上序列为ggc，得到5’端为ggca的序列，然后构建到pRC3上，第一靶点引物片段的第一个碱基是g，则在5’端加上序列为gtt，得到5’端为gttg的序列,然后构建到pRC6b上。选择好20-nt的靶点后，给两个靶点加好相应的碱基接头。

得到如下序列的引物片段：

如果靶点1的第一个碱基是a，则第一靶点引物片段正向引物序列如SEQ ID NO.4所示、第一靶点引物片段反向引物如SEQ ID NO.5所示、如果靶点1的第一个碱基是G，则第一靶点引物片段正向引物序列如SEQ ID NO.8所示、第一靶点引物片段反向引物如SEQ IDNO.9所示

第二靶点引物片段正向引物序列如SEQ ID NO.6所示、第二靶点引物片段正向引物序列如SEQ ID NO.7所示。

SEQ ID NO.4:ggcannnnnnnnnnnnnnnnnnn

SEQ ID NO.5:aaacnnnnnnnnnnnnnnnnnnn

SEQ ID NO.6:gccgnnnnnnnnnnnnnnnnnnngtttt

SEQ ID NO.7:ctctaaaacnnnnnnnnnnnnnnnnnnn

SEQ ID NO.8:gttgnnnnnnnnnnnnnnnnnnn

SEQ ID NO.9:aaacnnnnnnnnnnnnnnnnnnn

步骤B3：

步骤B3-1:包含所述外源片段的载体制备：

制备提供外源片段gRNA2-LacZ-P_U6a的载体pGLU6a由以下步骤制得：

以引物gRNA-F和gRNA-R进行PCR，将gRNA2从pYLgRNA-OsU6a扩增出来；

以引物LacZ-F和LacZ-R进行PCR，将LacZ表达盒从pYL322d2(Zhu et al 2017)扩增出来；

以引物U6a-F和U6a-R进行PCR，将启动子P_U6a从pYLgRNA-OsU6a扩增出来；

通过重叠延伸PCR将gRNA2、LacZ表达盒和P_U6a连接成为一个DNA片段，最后克隆到pEASY-Blunt3载体上，构建为提供外源片段gRNA2-LacZ-P_U6a的载体pGLU6a。

步骤B3-2:外源片段提取，

在靶点引物合成之前，用限制性内切酶Bsa I酶切pGLU6a，跑1％-1.5％琼脂糖凝胶，利用DNA纯化回收试剂盒回收外源片段gRNA2-LacZ-P_U6a。NanoDrop2000测好浓度后，-20℃保存备用。

步骤B4:

线性化载体。Bsa I线性化pRC3或pRC6b，灭活备用。酶切体系为：载体3μg，10×Cutsmart Buffer 5μl，30U Bsa I，ddH2O补至50μl，37℃酶切1h。所述线性化骨架载体包括Pu粘性末端及gRNA1粘性末端，pRC3的Pu粘性末端的序列为ccgt，pRC6b的Pu粘性末端的序列为caac，所述gRNA1粘性末端序列为agag；

步骤B5：

连接产物的制备

制备靶点接头。靶点引物合成后，将靶点引物用ddH2O溶解成100μmol/L母液，各取1μl加入到98μl ddH2O混合稀释到1μmol/L。90℃，变性30sec，移至室温冷却完成退火。

连接反应。将0.2或0.5μl靶点引物(浓度为1μmol/L)，15或30ng外源片段gRNA2-LacZ-P_U6a和80或160ng Bsa I线性化载体pRC3或pRC6b，利用NEB T4 DNA ligase连接，20μl反应体系(2μl 10×NEB T4 DNA ligase buffer,80U T4 DNA ligase)，利用PCR仪10℃5min，20℃5min，反应10～15个循环。

步骤B6

连接产物转化大肠杆菌Trans1-T1。

基于粘性末端互补配对，使用T4 DNA连接酶将多个外源片段一次性构建到线性化的载体上时，要求外源片段5’端的粘性末端与载体或者相邻的上游外源片段的3’端的粘性末端是互补配对的，并且多个外源片段和载体上的粘性末端不能重复，否则，具有重复粘性末端的外源片段就会相互竞争，导致外源片段的连接不按设计的方式进行，从而使得载体构建失败。构建双靶点CRISPR/Cas9载体，就需要将两个靶点和两个gRNA(其中gRNA1已经构建到载体骨架上)连接在一起，但gRNA是保守序列，按照传统方法设计粘性末端时，gRNA1和gRNA2的5’粘性末端就会重复，导致一次性连接多个外源片段不能进行。

本方法用正向引物和反向引物扩增gRNA1时，会删除gRNA1上5’端的5个碱基5’-GTTTT-3’，因此在合成第二个靶点序列时，需要将5’-GTTTT-3’添加到添加到第二个靶点的3’末端，这样既保证了多个粘性末端的差异性，又使得载体在构建完成后，gRNA1恢复成完整的序列。

本载体系统非常高效。载体上的克隆位点携带有ccdB致死基因，ccdB编码一个毒素蛋白，可以使Trans-T1大肠杆菌致死，克隆失败的菌株在LB平板上长不出来，从而大幅度提高重组质粒的阳性率。同时在外源片段上引入LacZ报告基因，阳性克隆可以在含有卡那霉素，IPTG和X-gal的LB培养皿上显蓝色，进一步提高了阳性克隆率。

实施例一

CRISPR/Cas9载体构建方法应用于单靶点CRISPR/Cas9载体的构建，步骤如下：

步骤A1

骨架载体由RC6b以下步骤制得：

将OsU6b启动子(P_U6b)从pYLgRNA-OsU6b上扩增出来；

所述gRNA1从pYLgRNA-OsU3上扩增出来,将ccdB表达盒从DS355上扩增出来(两端带有Bsa I酶切位点)；

将P_U6b、ccdB表达盒和gRNA1克隆到载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H上，形成骨架载体pRC6b。所述pRC6b骨架载体序列如SEQ ID NO.2所示。

扩增gRNA1的正向引物序列如SEQ ID NO.10所示，所述反向引物序列如SEQ IDNO.11。

SEQ ID NO.10：tacacagccagtctgcaggtggtctcgagagctagaaatagcaa

SEQ ID NO.11：gagaggcgcgccaatgataccgacgcgtccatccactccaagctcttg

步骤A2

设计靶点。

对OsCYO1和OsSKIPa用软件CRISPR-P 2.0(Liu et al 2017)选择第一个碱基是g的靶点。在正向靶点引物的5’端加gtt，3’端加gtttt，反向靶点引物的5’端加ctctaaaac，得到引物序列如表1所示

表1 OsCYO1和OsSKIPa单靶点CRISPR/Cas9载体构建引物

步骤A3：线性化骨架载体。

Bsa I线性化pRC6b，灭活备用。酶切体系为：载体3μg，10×Cutsmart Buffer 5μl，30U Bsa I，ddH2O补至50μl，37℃酶切1h。所述线性化骨架载体包括Pu粘性末端及gRNA1粘性末端，pRC6b的Pu粘性末端的序列为caac，所述gRNA1粘性末端序列为agag；

步骤A4：将所述步骤A2靶点引物变性退火，形成带粘性末端的双链靶点接头，再与所述线性化骨架载体进行连接，得到连接产物；

将两条靶点引物混合在一起，变性退火后，将0.2μL靶点引物(浓度为1μmol/L)和80ng Bsa I线性化载体pRC6b混合在一起，总共20μL反应体系(2μL 10 x NEB T4 DNAligase buffer,80U T4 DNA ligase)，利用PCR仪10℃5min，20℃5min，反应10-15个循环。连接产物转化大肠杆菌Trans1-T1。

步骤A5：连接产物转化大肠杆菌Trans1-T1。

随机挑取8个单菌落，经碱裂解法抽提质粒，用Mlu I和BamH I酶切验证，结果显示阳性率为100％(图5)，阳性质粒送测序，结果显示序列无突变。这些结果说明本载体系统也可以高效的构建单靶点CRISPR/Cas9载体。

实施例二

水稻基因的双靶点CRISPR/Cas9载体构建

步骤B1:构建骨架载体；

骨架载体pRC3由以下步骤制得：

将OsU3启动子(P_U3)和gRNA1从pYLgRNA-OsU3上扩增出来,所述gRNA1从pYLgRNA-OsU3上扩增出来,扩增gRNA1的正向引物序列如SEQ ID NO.10所示，所述反向引物序列如SEQ ID NO.11。

SEQ ID NO.10：tacacagccagtctgcaggtggtctcgagagctagaaatagcaa

SEQ ID NO.11：gagaggcgcgccaatgataccgacgcgtccatccactccaagctcttg将ccdB表达盒从DS355上扩增出来(两端带有Bsa I酶切位点)；

将P_U3、ccdB表达盒和gRNA1克隆到载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H上，形成骨架载体pRC3；所述pRC3骨架载体序列如SEQ ID NO.1所示；

架载体由RC6b以下步骤制得：

将OsU6b启动子(P_U6b)从pYLgRNA-OsU6b上扩增出来；

所述gRNA1从pYLgRNA-OsU3上扩增出来,将ccdB表达盒从DS355上扩增出来(两端带有Bsa I酶切位点)；

将P_U6b、ccdB表达盒和gRNA1克隆到载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H上，形成骨架载体pRC6b。所述pRC6b骨架载体序列如SEQ ID NO.2所示。

扩增gRNA1的正向引物序列如SEQ ID NO.10所示，所述反向引物序列如SEQ IDNO.11。

SEQ ID NO.10：tacacagccagtctgcaggtggtctcgagagctagaaatagcaa

SEQ ID NO.11：gagaggcgcgccaatgataccgacgcgtccatccactccaagctcttg

步骤B2:制备靶点引物

设计靶点。

用软件CRISPR-P 2.0(Liu et al 2017)来选择两个靶点引物片段，第一靶点引物片段的第一个碱基必须是a或g，第二靶点引物片段的第一个碱基必须是g。靶点第一个碱基是a，则在5’端加上序列为ggc，得到5’端为ggca的序列，然后构建到pRC3上，第一靶点引物片段的第一个碱基是g，则在5’端加上序列为gtt，得到5’端为gttg的序列,然后构建到pRC6b上。选择好20-nt的靶点后，给两个靶点加好相应的碱基接头。

本研究针对10个已报道的水稻基因YS83、YGL2、TCD5、OsFLN1、YSA、OsCYO1、NTRC、OsClpP5、OsTLP27和OsSKIPa，每个基因分别设计3对靶点引物(表2)，构建到pRC3和pRC6b上，共计20个载体。

表2 10个水稻基因双靶点CRISPR/Cas9载体构建引物

上表中，所述第一靶点引物片段正向引物的5’端序列为ggca或gttg，所述第一靶点引物片段反向引物的5’端序列为aaac；

所述第二靶点引物片段正向引物的5’端序列为gccg，所述第二靶点引物片段正向引物的3’端序列为gtttt，所述第二靶点引物片段反向引物的5’端序列为ctctaaaac。

步骤B3：外源片段的制备

步骤B3-1:包含所述外源片段的载体制备：

制备提供外源片段gRNA2-LacZ-P_U6a的载体pGLU6a由以下步骤制得：

以引物gRNA-F和gRNA-R进行PCR，将gRNA2从pYLgRNA-OsU6a扩增出来；

以引物LacZ-F和LacZ-R进行PCR，将LacZ表达盒从pYL322d2(Zhu et al 2017)扩增出来；

以引物U6a-F和U6a-R进行PCR，将启动子P_U6a从pYLgRNA-OsU6a扩增出来；

通过重叠延伸PCR将gRNA2、LacZ表达盒和P_U6a连接成为一个DNA片段，最后克隆到pEASY-Blunt3载体上，构建为提供外源片段gRNA2-LacZ-P_U6a的载体pGLU6a。

步骤B3-2

提取外源片段gRNA2-LacZ-P_U6a。

利用限制性内切酶Bsa I酶切pGLU6a，酶切体系如下：

按如上体系配好反应后，37℃酶切1h，跑1％-1.5％琼脂糖凝胶，利用DNA纯化回收试剂盒回收外源片段。NanoDrop2000测好浓度后，-20℃保存备用。

步骤B4：线性化载体

利用限制性内切酶Bsa I酶切pRC3/pRC6b，酶切体系如下：

按如上体系配好反应后，37℃酶切1h，65℃(Bsa I)/80℃(Bsa

v2)灭活20min，-20℃保存备用。

步骤B5:将所述步骤B2靶点引物变性退火，形成带粘性末端的双链靶点接头，再与所述线性化骨架载体及步骤B3外源片段进行连接，得到连接产物；

制备靶点接头。

靶点引物合成后，将靶点引物用ddH2O溶解成100μmol/L母液，各取1μl加入到98μlddH2O混合稀释到1μmol/L。90℃，变性30sec，移至室温冷却完成退火。

连接反应。

将0.2或0.5μl靶点引物(浓度为1μmol/L)，15或30ng外源片段gRNA2-LacZ-P_U6a和80或160ng Bsa I线性化载体pRC3或pRC6b，利用NEB T4 DNA ligase连接，20μl反应体系(2μl 10×NEB T4 DNA ligase buffer,80U T4 DNA ligase)，利用PCR仪10℃5min，20℃5min，反应10～15个循环。

所述第一靶点引物片段正向引物的5’端序列为ggca时靶点引物与pRC3骨架载体构成连接反应的体系，构建至所述pRC3骨架载体上；所述第一靶点引物片段正向引物的5’端序列为gttg与pRC6b骨架载体构成连接反应的体系，构建至所述pRC6b骨架载体上。

步骤B6

连接产物转化大肠杆菌Trans1-T1。

取30μL冰浴上融化的大肠杆菌感受态细胞(Trans1-T1 Phage ResistantChemically Competent Cell)加到1.5mL无菌离心管中，然后加入5μL连接产物，轻轻混匀，在冰浴中放置30min。

42℃水浴热激30sec，然后快速转移到冰上放置2min，该过程不要摇动离心管。

向每个离心管中加入600μL LB液体培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃，180r/min培养1h，使大肠杆菌复苏。

6000r/min离心30sec，弃去400μL上清，用剩余的200μL培养基悬浮菌体，将菌液全部转移到含有卡那霉素，IPTG和X-gal的LB培养皿上，涂开并晾干，做好标记，倒置于37℃恒温培养箱，过夜培养。

摇菌培养。

在灭菌过的10mL离心管中加入2mL卡那霉素抗性的LB液体培养基，每个皿上挑取3个蓝色单菌落至培养基中，置于摇床中，37℃，180r/min培养12-16h。

质粒酶切检测。

用碱裂解法抽提质粒，然后以空载体pRC3/pRC6b为对照，限制性内切酶Mlu I和BamH I酶切质粒检测，酶切体系如下：

37℃酶切30min，跑1％-1.5％琼脂糖凝胶检测。

在构建双靶点双靶点CRISPR/Cas9载体时，根据靶点引物序列构建对应的骨架载体即可，同理，实施例二根据表2中第一靶点引物片段序列分开设计的骨架载体。

酶切结果如图5，均切出正确大小的外源片段，阳性率为100％，测序显示无突变。这说明该方法适用于水稻基因的双靶点CRISPR/Cas9载体构建。

与传统方法相比，采用本方法构建单/双靶点CRISPR/Cas9载体非常简单、快速和高效。

本方法非常简单，首先，利用软件CRISPR-P2.0(Liu et al 2017)来选择合适的靶点，加好接头之后合成引物，然后将合成的靶点引物90℃变性30sec，移至室温冷却完成退火，完成靶点的制备，再与外源片段gRNA2-LacZ-P_U6a在T4 DNA连接酶作用下，构建到线性化的载体pRC3或pRC6b上完成连接。最后转化大肠杆菌，涂布含有IPTG和X-gal的筛选培养基，挑选蓝色单菌落送测序验证，即完成双靶点CRISPR/Cas9载体构建。其中利用BsaⅠ线性化的载体和酶切回收的外源片段gRNA2-LacZ-P_U6a可以长期存放于-20℃，不用每次制备，非常方便用于大量CRISPR/Cas9载体构建。

本载体系统非常快速。从获得靶点引物开始，只需要1h至2h即可获得连接产物。连接产物转化感受态细胞后，第2天即可获得阳性的CRISPR/Cas9载体。而用传统方法构建CRISPR/Cas9时，需要复杂且漫长的人工操作，需要约8h才能获得连接产物。或者需要经过2次转化感受态细胞约4d至7d才能获得阳性克隆。

此外，本载体系统构建CRISPR/Cas9载体不需要经过PCR过程，大大降低了外源片段的突变概率。选取了10个已报道的水稻基因，利用本载体系统构建了20个双靶点CRISPR/Cas9载体，挑取蓝色克隆酶切验证并测序发现，阳性克隆概率为100％

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种简单快速高效的CRISPR/Cas9载体构建方法

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 16668

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tggcaggata tattgtggtg taaacaaatt gacgcttaga caacttaata acacattgcg 60

gacgttttta atgtactgaa ttaacgccga attaattcgg gggatctgga ttttagtact 120

ggattttggt tttaggaatt agaaatttta ttgatagaag tattttacaa atacaaatac 180

atactaaggg tttcttatat gctcaacaca tgagcgaaac cctataggaa ccctaattcc 240

cttatctggg aactactcac acattattat ggagaaactc gagcttgtcg atcgacagat 300

ccggtcggca tctactctat ttctttgccc tcggacgagt gctggggcgt cggtttccac 360

tatcggcgag tacttctaca cagccatcgg tccagacggc cgcgcttctg cgggcgattt 420

gtgtacgccc gacagtcccg gctccggatc ggacgattgc gtcgcatcga ccctgcgccc 480

aagctgcatc atcgaaattg ccgtcaacca agctctgata gagttggtca agaccaatgc 540

ggagcatata cgcccggagt cgtggcgatc ctgcaagctc cggatgcctc cgctcgaagt 600

agcgcgtctg ctgctccata caagccaacc acggcctcca gaagaagatg ttggcgacct 660

cgtattggga atccccgaac atcgcctcgc tccagtcaat gaccgctgtt atgcggccat 720

tgtccgtcag gacattgttg gagccgaaat ccgcgtgcac gaggtgccgg acttcggggc 780

agtcctcggc ccaaagcatc agctcatcga gagcctgcgc gacggacgca ctgacggtgt 840

cgtccatcac agtttgccag tgatacacat ggggatcagc aatcgcgcat atgaaatcac 900

gccatgtagt gtattgaccg attccttgcg gtccgaatgg gccgaacccg ctcgtctggc 960

taagatcggc cgcagcgatc gcatccatag cctccgcgac cggttgtaga acagcgggca 1020

gttcggtttc aggcaggtct tgcaacgtga caccctgtgc acggcgggag atgcaatagg 1080

tcaggctctc gctaaactcc ccaatgtcaa gcacttccgg aatcgggagc gcggccgatg 1140

caaagtgccg ataaacataa cgatctttgt agaaaccatc ggcgcagcta tttacccgca 1200

ggacatatcc acgccctcct acatcgaagc tgaaagcacg agattcttcg ccctccgaga 1260

gctgcatcag gtcggagacg ctgtcgaact tttcgatcag aaacttctcg acagacgtcg 1320

cggtgagttc aggctttttc atatctcatt gccccccggg atctgcgaaa gctcgagaga 1380

gatagatttg tagagagaga ctggtgattt cagcgtgtcc tctccaaatg aaatgaactt 1440

ccttatatag aggaaggtct tgcgaaggat agtgggattg tgcgtcatcc cttacgtcag 1500

tggagatatc acatcaatcc acttgctttg aagacgtggt tggaacgtct tctttttcca 1560

cgatgctcct cgtgggtggg ggtccatctt tgggaccact gtcggcagag gcatcttgaa 1620

cgatagcctt tcctttatcg caatgatggc atttgtaggt gccaccttcc ttttctactg 1680

tccttttgat gaagtgacag atagctgggc aatggaatcc gaggaggttt cccgatatta 1740

ccctttgttg aaaagtctca atagcccttt ggtcttctga gactgtatct ttgatattct 1800

tggagtagac gagagtgtcg tgctccacca tgttatcaca tcaatccact tgctttgaag 1860

acgtggttgg aacgtcttct ttttccacga tgctcctcgt gggtgggggt ccatctttgg 1920

gaccactgtc ggcagaggca tcttgaacga tagcctttcc tttatcgcaa tgatggcatt 1980

tgtaggtgcc accttccttt tctactgtcc ttttgatgaa gtgacagata gctgggcaat 2040

ggaatccgag gaggtttccc gatattaccc tttgttgaaa agtctcaata gccctttggt 2100

cttctgagac tgtatctttg atattcttgg agtagacgag agtgtcgtgc tccaccatgt 2160

tggcaagctg ctctagccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta 2220

atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca acgcaattaa 2280

tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc cggctcgtat 2340

gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg accatgatta 2400

cgaattcgag ctcggtacca actataacgg tcctaaggta gcgaaggatc cgctcgctac 2460

cttaagagag gatatccctc catcctataa tgtaggctat aggaactagg gcaaggccgg 2520

ccatgcggcc gcaagctggg tgcagcgtga cccggtcgtg cccctctcta gagataatga 2580

gcattgcatg tctaagttat aaaaaattac cacatatttt ttttgtcaca cttgtttgaa 2640

gtgcagttta tctatcttta tacatatatt taaactttac tctacgaata atataatcta 2700

tagtactaca ataatatcag tgttttagag aatcatataa atgaacagtt agacatggtc 2760

taaaggacaa ttgagtattt tgacaacagg actctacagt tttatctttt tagtgtgcat 2820

gtgttctcct ttttttttgc aaatagcttc acctatataa tacttcatcc attttattag 2880

tacatccatt tagggtttag ggttaatggt ttttatagac taattttttt agtacatcta 2940

ttttattcta ttttagcctc taaattaaga aaactaaaac tctattttag tttttttatt 3000

taataattta gatataaaat agaataaaat aaagtgacta aaaattaaac aaataccctt 3060

taagaaatta aaaaaactaa ggaaacattt ttcttgtttc gagtagataa tgccagcctg 3120

ttaaacgccg tcgacgagtc taacggacac caaccagcga accagcagcg tcgcgtcggg 3180

ccaagcgaag cagacggcac ggcatctctg tcgctgcctc tggacccctc tcgagagttc 3240

cgctccaccg ttggacttgc tccgctgtcg gcatccagaa attgcgtggc ggagcggcag 3300

acgtgagccg gcacggcagg cggcctcctc ctcctctcac ggcacggcag ctacggggga 3360

ttcctttccc accgctcctt cgctttccct tcctcgcccg ccgtaataaa tagacacccc 3420

ctccacaccc tctttcccca acctcgtgtt gttcggagcg cacacacaca caaccagatc 3480

tcccccaaat ccacccgtcg gcacctccgc ttcaaggtac gccgctcgtc ctcccccccc 3540

ccccctctct accttctcta gatcggcgtt ccggtccatg gttagggccc ggtagttcta 3600

cttctgttca tgtttgtgtt agatccgtgt ttgtgttaga tccgtgctgc tagcgttcgt 3660

acacggatgc gacctgtacg tcagacacgt tctgattgct aacttgccag tgtttctctt 3720

tggggaatcc tgggatggct ctagccgttc cgcagacggg atcgatttca tgattttttt 3780

tgtttcgttg catagggttt ggtttgccct tttcctttat ttcaatatat gccgtgcact 3840

tgtttgtcgg gtcatctttt catgcttttt tttgtcttgg ttgtgatgat gtggtctggt 3900

tgggcggtcg ttctagatcg gagtagaatt ctgtttcaaa ctacctggtg gatttattaa 3960

ttttggatct gtatgtgtgt gccatacata ttcatagtta cgaattgaag atgatggatg 4020

gaaatatcga tctaggatag gtatacatgt tgatgcgggt tttactgatg catatacaga 4080

gatgcttttt gttcgcttgg ttgtgatgat gtggtgtggt tgggcggtcg ttcattcgtt 4140

ctagatcgga gtagaatact gtttcaaact acctggtgta tttattaatt ttggaactgt 4200

atgtgtgtgt catacatctt catagttacg agtttaagat ggatggaaat atcgatctag 4260

gataggtata catgttgatg tgggttttac tgatgcatat acatgatggc atatgcagca 4320

tctattcata tgctctaacc ttgagtacct atctattata ataaacaagt atgttttata 4380

attattttga tcttgatata cttggatgat ggcatatgca gcagctatat gtggattttt 4440

ttagccctgc cttcatacgc tatttatttg cttggtactg tttcttttgt cgatgctcac 4500

cctgttgttt ggtgttactt ctgcagatgg ctcctaagaa gaagcggaag gttggtattc 4560

acggggtgcc tgcggctgac aagaagtact ccatcggcct cgacatcggc accaacagcg 4620

tcggctgggc ggtgatcacc gacgagtaca aggtcccgtc caagaagttc aaggtcctgg 4680

gcaacaccga ccgccactcc atcaagaaga acctcatcgg cgccctcctc ttcgactccg 4740

gcgagacggc ggaggcgacc cgcctcaagc gcaccgcccg ccgccgctac acccgccgca 4800

agaaccgcat ctgctacctc caggagatct tctccaacga gatggcgaag gtcgacgact 4860

ccttcttcca ccgcctcgag gagtccttcc tcgtggagga ggacaagaag cacgagcgcc 4920

accccatctt cggcaacatc gtcgacgagg tcgcctacca cgagaagtac cccactatct 4980

accaccttcg taagaagctt gttgactcta ctgataaggc tgatcttcgt ctcatctacc 5040

ttgctctcgc tcacatgatc aagttccgtg gtcacttcct tatcgagggt gaccttaacc 5100

ctgataactc cgacgtggac aagctcttca tccagctcgt ccagacctac aaccagctct 5160

tcgaggagaa ccctatcaac gcttccggtg tcgacgctaa ggcgatcctt tccgctaggc 5220

tctccaagtc caggcgtctc gagaacctca tcgcccagct ccctggtgag aagaagaacg 5280

gtcttttcgg taacctcatc gctctctccc tcggtctgac ccctaacttc aagtccaact 5340

tcgacctcgc tgaggacgct aagcttcagc tctccaagga tacctacgac gatgatctcg 5400

acaacctcct cgctcagatt ggagatcagt acgctgatct cttccttgct gctaagaacc 5460

tctccgatgc tatcctcctt tcggatatcc ttagggttaa cactgagatc actaaggctc 5520

ctctttctgc ttccatgatc aagcgctacg acgagcacca ccaggacctc accctcctca 5580

aggctcttgt tcgtcagcag ctccccgaga agtacaagga gatcttcttc gaccagtcca 5640

agaacggcta cgccggttac attgacggtg gagctagcca ggaggagttc tacaagttca 5700

tcaagccaat ccttgagaag atggatggta ctgaggagct tctcgttaag cttaaccgtg 5760

aggacctcct taggaagcag aggactttcg ataacggctc tatccctcac cagatccacc 5820

ttggtgagct tcacgccatc cttcgtaggc aggaggactt ctaccctttc ctcaaggaca 5880

accgtgagaa gatcgagaag atccttactt tccgtattcc ttactacgtt ggtcctcttg 5940

ctcgtggtaa ctcccgtttc gcttggatga ctaggaagtc cgaggagact atcacccctt 6000

ggaacttcga ggaggttgtt gacaagggtg cttccgccca gtccttcatc gagcgcatga 6060

ccaacttcga caagaacctc cccaacgaga aggtcctccc caagcactcc ctcctctacg 6120

agtacttcac ggtctacaac gagctcacca aggtcaagta cgtcaccgag ggtatgcgca 6180

agcctgcctt cctctccggc gagcagaaga aggctatcgt tgacctcctc ttcaagacca 6240

accgcaaggt caccgtcaag cagctcaagg aggactactt caagaagatc gagtgcttcg 6300

actccgtcga gatcagcggc gttgaggacc gtttcaacgc ttctctcggt acctaccacg 6360

atctcctcaa gatcatcaag gacaaggact tcctcgacaa cgaggagaac gaggacatcc 6420

tcgaggacat cgtcctcact cttactctct tcgaggatag ggagatgatc gaggagaggc 6480

tcaagactta cgctcatctc ttcgatgaca aggttatgaa gcagctcaag cgtcgccgtt 6540

acaccggttg gggtaggctc tcccgcaagc tcatcaacgg tatcagggat aagcagagcg 6600

gcaagactat cctcgacttc ctcaagtctg atggtttcgc taacaggaac ttcatgcagc 6660

tcatccacga tgactctctt accttcaagg aggatattca gaaggctcag gtgtccggtc 6720

agggcgactc tctccacgag cacattgcta accttgctgg ttcccctgct atcaagaagg 6780

gcatccttca gactgttaag gttgtcgatg agcttgtcaa ggttatgggt cgtcacaagc 6840

ctgagaacat cgtcatcgag atggctcgtg agaaccagac tacccagaag ggtcagaaga 6900

actcgaggga gcgcatgaag aggattgagg agggtatcaa ggagcttggt tctcagatcc 6960

ttaaggagca ccctgtcgag aacacccagc tccagaacga gaagctctac ctctactacc 7020

tccagaacgg tagggatatg tacgttgacc aggagctcga catcaacagg ctttctgact 7080

acgacgtcga ccacattgtt cctcagtctt tccttaagga tgactccatc gacaacaagg 7140

tcctcacgag gtccgacaag aacaggggta agtcggacaa cgtcccttcc gaggaggttg 7200

tcaagaagat gaagaactac tggaggcagc ttctcaacgc taagctcatt acccagagga 7260

agttcgacaa cctcacgaag gctgagaggg gtggcctttc cgagcttgac aaggctggtt 7320

tcatcaagag gcagcttgtt gagacgaggc agattaccaa gcacgttgct cagatcctcg 7380

attctaggat gaacaccaag tacgacgaga acgacaagct catccgcgag gtcaaggtga 7440

tcaccctcaa gtccaagctc gtctccgact tccgcaagga cttccagttc tacaaggtcc 7500

gcgagatcaa caactaccac cacgctcacg atgcttacct taacgctgtc gttggtaccg 7560

ctcttatcaa gaagtaccct aagcttgagt ccgagttcgt ctacggtgac tacaaggtct 7620

acgacgttcg taagatgatc gccaagtccg agcaggagat cggcaaggcc accgccaagt 7680

acttcttcta ctccaacatc atgaacttct tcaagaccga gatcaccctc gccaacggcg 7740

agatccgcaa gcgccctctt atcgagacga acggtgagac tggtgagatc gtttgggaca 7800

agggtcgcga cttcgctact gttcgcaagg tcctttctat gcctcaggtt aacatcgtca 7860

agaagaccga ggtccagacc ggtggcttct ccaaggagtc tatccttcca aagagaaact 7920

cggacaagct catcgctagg aagaaggatt gggaccctaa gaagtacggt ggtttcgact 7980

cccctactgt cgcctactcc gtcctcgtgg tcgccaaggt ggagaagggt aagtcgaaga 8040

agctcaagtc cgtcaaggag ctcctcggca tcaccatcat ggagcgctcc tccttcgaga 8100

agaacccgat cgacttcctc gaggccaagg gctacaagga ggtcaagaag gacctcatca 8160

tcaagctccc caagtactct cttttcgagc tcgagaacgg tcgtaagagg atgctggctt 8220

ccgctggtga gctccagaag ggtaacgagc ttgctcttcc ttccaagtac gtgaacttcc 8280

tctacctcgc ctcccactac gagaagctca agggttcccc tgaggataac gagcagaagc 8340

agctcttcgt ggagcagcac aagcactacc tcgacgagat catcgagcag atctccgagt 8400

tctccaagcg cgtcatcctc gctgacgcta acctcgacaa ggtcctctcc gcctacaaca 8460

agcaccgcga caagcccatc cgcgagcagg ccgagaacat catccacctc ttcacgctca 8520

cgaacctcgg cgcccctgct gctttcaagt acttcgacac caccatcgac aggaagcgtt 8580

acacgtccac caaggaggtt ctcgacgcta ctctcatcca ccagtccatc accggtcttt 8640

acgagactcg tatcgacctt tcccagcttg gtggtgataa gcgtcctgct gccaccaaaa 8700

aggccggaca ggctaagaaa aagaagtagg atcctcccga tcgttcaaac atttggcaat 8760

aaagtttctt aagattgaat cctgttgccg gtcttgcgat gattatcata taatttctgt 8820

tgaattacgt taagcatgta ataattaaca tgtaatgcat gacgttattt atgaggtggg 8880

tttttatgat tagagtcccg caattataca tttaatacgc gatagaaaac aaaatatagc 8940

gcgcaaacta ggataaatta tcgcgcgcgg tgtcatctat gttactagat cgggagcacc 9000

ggtaaggcgc gccgtagtgc tcgactagta ggaatcttta aacatacgaa cagatcactt 9060

aaagttcttc tgaagcaact taaagttatc aggcatgcat ggatcttgga ggaatcagat 9120

gtgcagtcag ggaccatagc acaagacagg cgtcttctac tggtgctacc agcaaatgct 9180

ggaagccggg aacactgggt acgttggaaa ccacgtgtga tgtgaaggag taagataaac 9240

tgtaggagaa aagcatttcg tagtgggcca tgaagccttt caggacatgt attgcagtat 9300

gggccggccc attacgcaat tggacgacaa caaagactag tattagtacc acctcggcta 9360

tccacataga tcaaagctgg tttaaaagag ttgtgcagat gatccgtggc aagagaccgc 9420

tttacacttt atgcttccgg ctcgtataat gtgtggattt tgagttagga tccgtcgaga 9480

ttttcaggag ctaaggaagc taaaatgcag tttaaggttt acacctataa aagagagagc 9540

cgttatcgtc tgtttgtgga tgtacagagt gatattattg acacgcccgg gcgacggatg 9600

gtgatccccc tggccagtgc acgtctgctg tcagataaag tctcccgtga actttacccg 9660

gtggtgcata tcggggatga aagctggcgc atgatgacca ccgatatggc cagtgtgcct 9720

gtctccgtta tcggggaaga agtggctgat ctcagccacc gcgaaaatga catcaaaaac 9780

gccattaacc tgatgttctg gggaatataa atgtcaggct cccttataca cagccagtct 9840

gcaggtggtc tcgagagcta gaaatagcaa gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt 9900

gaaaaagtgg caccgagtcg gtgctttttt tcaagagctt ggagtggatg gacgcgtcgg 9960

tatcattggc gcgcctctcg agctagcggc cgcatgcatc gatctcctac atcgtataaa 10020

ttagcctata cgaagttatt gcatctatgt cgggtgcgga gaaagaggta atgaaatggc 10080

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cacccataat agctgtttgc caagcttggc actggccgtc gtttttacaa cgtcgtgact 10200

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cagcaacgct ctgtcatcgt tacaatcaac atgctaccct ccgcgagatc atccgtgttt 16500

caaacccggc agcttagttg ccgttcttcc gaatagcatc ggtaacatga gcaaagtctg 16560

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<210> 2

<211> 16637

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctctaaaacn nnnnnnnnnn nnnnnnnn 28

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gttgnnnnnn nnnnnnnnnn nnn 23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aaacnnnnnn nnnnnnnnnn nnn 23

<210> 10

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tacacagcca gtctgcaggt ggtctcgaga gctagaaata gcaa 44

<210> 11

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gagaggcgcg ccaatgatac cgacgcgtcc atccactcca agctcttg 48

Claims (8)

1.一种CRISPR/Cas9载体构建方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9载体构建方法包括：

构建骨架载体并对骨架载体进行线性化处理得到线性化的骨架载体，制备靶点引物后将所述靶点引物接入所述线性化的骨架载体中得到连接产物，将所述连接产物转接至大肠杆菌后依次进行培养、抽提质粒，得到阳性CRISPR/Cas9载体；

其中，所述骨架载体连接有OsU3启动子或OsU6b启动子、gRNA1及Bsa I酶切位点，所述gRNA1从pYLgRNA－OsU3上扩增后得到5’端碱基5’－gtttt－3被删除的gRNA1；

所述靶点引物包含多个引物片段，第一个靶点引物片段序列的正向靶点引物的5’端序列为ggca或gttg，最后一个靶点引物片段序列的正向引物3’端序列为gtttt，最后一个靶点引物片段序列的反向靶点引物的5’端序列为ctctaaaac，各个所述靶点引物片段之间通过制备的外源片段进行连接；所述外源片段包括gRNA2粘性末端及PU6a粘性末端，所述gRNA2粘性末端位于所述外源片段5’端，所述gRNA2粘性末端的序列为GTTT，所述PU6a粘性末端位于所述外源片段的3’端，所述PU6a粘性末端序列为CGGC；

所述骨架载体采用Bsa I酶进行酶切得到所述线性化的骨架载体，所述线性化的骨架载体包括Pu粘性末端及gRNA1粘性末端，所述Pu粘性末端位于所述线性化骨架载体的3’端，其序列为ccgt或caac，所述gRNA1粘性末端位于所述线性化骨架载体的5’端，其序列为agag；第一个靶点引物片段与所述Pu粘性末端连接，最后一个靶点引物片段序列与所述gRNA1粘性末端连接；所述外源片段的制备包括：将gRNA2、LacZ表达盒以及启动子PU6a构建到克隆载体pEASY－Blunt3 上得到外源片段载体pGLU6a，其中，gRNA2、LacZ表达盒以及启动子PU6a依次连接；外源片段提取，将所述外源片段载体采用Bsa I酶进行酶切，凝胶电泳后回收得到外源片段。

2.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas9载体构建方法，其特征在于，扩增gRNA1的正向引物序列如SEQ ID NO.10所示，所述反向引物序列如SEQ ID NO.11。

3.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas9载体构建方法，其特征在于，所述骨架载体上连接有ccdB表达盒，所述Bsa I酶切位点在ccdB的两端。

4.根据权利要求3所述的CRISPR/Cas9载体构建方法，其特征在于，所述骨架载体连接有OsU3启动子、gRNA1、ccdB表达盒及Bsa I酶切位点时，得到的骨架载体为pRC3骨架载体；

所述骨架载体连接有OsU6b启动子、gRNA1、ccdB表达盒及Bsa I酶切位点时，得到的骨架载体为pRC6b骨架载体；

所述pRC3骨架载体序列如SEQ ID NO.1所示；

所述pRC6b骨架载体序列如SEQ ID NO.2所示。

5.根据权利要求4所述的CRISPR/Cas9载体构建方法，其特征在于，第一个靶点引物片段序列的正向靶点引物的5’端序列为ggca时，所述靶点引物构建至所述pRC3骨架载体上；第一个靶点引物片段序列的正向靶点引物的5’端序列为gttg时，所述靶点引物构建至所述pRC6b骨架载体上。

6.权利要求1～5任一项所述的CRISPR/Cas9载体构建方法在构建多靶点CRISPR/Cas9载体中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

步骤B1：构建骨架载体；

步骤B2：制备靶点引物；

步骤B3：制备外源片段；

步骤B4：对所述骨架载体进行线性化处理，得到线性化的骨架载体；

步骤B5：将所述步骤B2靶点引物变性退火，形成带粘性末端的靶点接头，再与所述线性化的骨架载体及所述外源片段进行连接，得到连接产物；

步骤B6：将所述连接产物转接至大肠杆菌后依次进行培养、抽提质粒，酶切验证得到阳性CRISPR/Cas9载体；

其中，所述步骤B3包括如下步骤：

步骤B3－1：包含所述外源片段的载体制备：将和启动子P_U6a以及LacZ表达盒构建到克隆载体pEASY－Blunt3上得到外源片段载体pGLU6a，所述pGLU6a的序列如SEQ ID NO.3所示；

步骤B3－2：外源片段提取，将所述外源片段载体采用Bsa I酶进行酶切，凝胶电泳后回收得到外源片段。

7.根据权利要求6所述的CRISPR/Cas9载体构建方法在构建多靶点CRISPR/Cas9载体中的应用，其特征在于，所述靶点引物包含两个靶点引物片段；

其中，所述第一靶点引物片段正向引物的5’端序列为ggca或gttg，所述第一靶点引物片段反向引物的5’端序列为aaac；所述第二靶点引物片段正向引物的5’端序列为gccg，所述第二靶点引物片段正向引物的3’端序列为gtttt，所述第二靶点引物片段反向引物的5’端序列为ctctaaaac。

8.权利要求1～5任一项所述一种CRISPR/Cas9载体构建方法在水稻基因的CRISPR/Cas9载体构建中的应用。

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