CN109825532B - CRISPR/Cas12a基因编辑系统在小立碗藓基因编辑中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了CRISPR/Cas12a基因编辑系统在小立碗藓基因编辑中的应用，属于基因工程技术领域，所述应用包括以下步骤：1)构建Cas12a蛋白酶表达载体；2)构建gRNA表达载体；3)采用Cas12a蛋白酶表达载体、gRNA表达载体和表达抗性的质粒对小立碗藓进行转化，经过抗性筛选得到突变体植株。本发明应用于小立碗藓基因编辑的CRISPR/Cas12a基因编辑系统具有基因编辑效率高、脱靶概率小、尤其能够高效编辑多靶标的优点。

Description

CRISPR/Cas12a基因编辑系统在小立碗藓基因编辑中的应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及CRISPR/Cas12a基因编辑系统在小立碗藓基因编辑中的应用。
背景技术
小立碗藓(学名：Physcomitrella patens)在分类上属于葫芦藓科，小立碗藓属，分布于欧洲、亚洲、非洲及大洋洲，中国湖南省张家界地区有分布。
小立碗藓生长所需营养简单，容易培养；其配子体在生活史中占优势，对其突变体的表型可以进行直接研究；其核基因组易于与有同源片段的外源DNA发生高频率的同源重组，从而使得精确的基因破坏和基因敲除成为可能，为基因功能的研究提供了良好的材料。小立碗藓与高等陆生植物有很多相似特点，而小立碗藓的一些特性使得它比其他植物更易于进行分子生物学的研究。小立碗藓在国外已经成为植物分子生物学研究的模式生物。
基因敲除(knockout)是用含有一定已知序列的DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得到表达的一种外源DNA导入技术。它是针对某个序列已知但功能未知的序列，改变生物的遗传基因，令特定的基因功能丧失作用，从而使部分功能被屏蔽，并可进一步对生物体造成影响，进而推测出该基因的生物学功能。
目前，对小立碗藓进行基因敲除的方法主要是利用同源重组，但是该方法获得基因敲除突变体的效率只有不到20％。而多基因敲除需要不同的抗性组合，从而限制了多基因敲除突变体的获得。
发明内容
本发明的目的在于提供CRISPR/Cas12a基因编辑系统在小立碗藓基因编辑中的应用，该应用基因编辑效率高、脱靶概率小。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了CRISPR/Cas12a基因编辑系统在小立碗藓基因编辑中的应用，包括以下步骤：
1)将两端带有核定位信号的编码Cas12a蛋白酶的核苷酸序列连接到质粒pAct-Cas9上，用pActin promoter启动表达，得到Cas12a蛋白酶表达载体；
2)将gRNA连接到质粒pU6-sgRNA上，用PpU6 promoter启动表达，得到gRNA表达载体；
3)采用步骤1)所述Cas12a蛋白酶表达载体、步骤2)所述gRNA表达载体和表达抗性的质粒对小立碗藓进行转化，经过抗性筛选得到突变体植株；
所述步骤1)和步骤2)没有时间顺序限制；
所述两端带有核定位信号编码Cas12a蛋白酶的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述gRNA包括至少一个gRNA单元和一个7个胸腺嘧啶碱基的终止序列；所述gRNA单元和7个胸腺嘧啶碱基的终止序列顺次连接；
当gRNA单元的数量≥2时，所述gRNA单元串联连接；
所述gRNA单元包括顺次连接的成熟的crRNA和设计的靶基因序列。
优选的，步骤3)中所述小立碗藓为原丝体阶段的小立碗藓。
优选的，步骤1)中所述编码Cas12a蛋白酶的核苷酸序列连接到质粒pAct-Cas9上的NcoI和XbaI酶切位点之间。
优选的，步骤1)中所述连接的体系为：以10μL计，包括pAct-Cas9质粒4.5μL、编码Cas12a蛋白酶的核苷酸序列3.5μL、T4 DNA连接酶1μL和T4 DNA连接Buffer 1μL；所述连接的程序为：4℃，连接9～12h。
优选的，步骤2)中所述gRNA连接到质粒pU6-sgRNA上的NcoI和XbaI酶切位点之间。
优选的，步骤2)中所述连接的体系为：以10μL计，包括pU6-sgRNA质粒3μL、gRNA 5μL、T4 DNA连接酶1μL和T4 DNA连接Buffer 1μL；所述连接的程序为：4℃，连接9～12h。
优选的，步骤3)中所述Cas12a蛋白酶表达载体、gRNA表达载体和表达抗性筛选的质粒的体积比为0.5～1.5:0.5～1.5:0.5～1.5；所述Cas12a蛋白酶表达载体的浓度为0.5～1.5μg/μL；所述gRNA表达载体的浓度为0.5～1.5μg/μL；所述表达抗性筛选的质粒的浓度为0.5～1.5μg/μL。
优选的，步骤3)中所述表达抗性的质粒为表达潮霉素抗性筛选的质粒。
优选的，所述成熟的crRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明的有益效果：本发明提供了CRISPR/Cas12a基因编辑系统在小立碗藓基因编辑中的应用，本发明中通过构建Cas12a蛋白酶表达载体和gRNA表达载体，使gRNA和Cas12a蛋白酶形成复合物，gRNA引导Cas12a蛋白酶到达含有5’-TTTN-3’PAM序列的靶序列处，gRNA与一条DNA靶序列进行碱基互补配对，Cas12a蛋白酶在PAM序列下游进行切割使双链断裂，产生粘性末端，通过以同源重组或者非同源性末端接合的方式进行修复，修复过程中发生碱基增添缺失或者替换等编辑情况，达到基因敲除目的。经过验证，本发明应用于小立碗藓基因编辑的CRISPR/Cas12a基因编辑系统具有较高的多基因编辑效率，利用的CRISPR/Cas12a基因编辑系统对小立碗藓的3个转录因子进行编辑，其对应的三基因突变体，二基因突变体和单基因突变体的编辑效率，分别为38.7％，45.2％和16.1％。并且CRISPR/Cas12a进行多基因编辑时发生脱靶的概率很小。
附图说明：
图1表示Cas12a蛋白酶表达载体和gRNA表达载体的结构示意图，其中a表示Cas12a蛋白酶表达载体；b表示gRNA表达载体；
图2表示实施例1中Cas12a蛋白酶表达载体的骨架图；
图3表示实施例1中gRNA表达载体的骨架图；
图4为利用CRISPR/Cas12a基因编辑系统对小立碗藓中转录因子9250进行基因编辑的情况；
图5为利用CRISPR/Cas12a基因编辑系统对小立碗藓中转录因子32480进行基因编辑的情况；
图6为利用CRISPR/Cas12a基因编辑系统对小立碗藓中转录因子9580进行基因编辑的情况；
图7为利用CRISPR/Cas12a基因编辑系统设计的gRNA对小立碗藓中9250转录因子进行基因编辑，可能出现的脱靶位点；
图8为利用CRISPR/Cas12a基因编辑系统设计的gRNA对小立碗藓中32480转录因子进行基因编辑，可能出现的脱靶位点；
图9为利用CRISPR/Cas12a基因编辑系统设计的gRNA对小立碗藓中9580转录因子进行基因编辑，可能出现的脱靶位点。
具体实施方式
本发明提供了CRISPR/Cas12a基因编辑系统在小立碗藓基因编辑中的应用，包括以下步骤：
1)将两端带有核定位信号的编码Cas12a蛋白酶的核苷酸序列连接到质粒pAct-Cas9上，用pActin promoter启动表达，得到Cas12a蛋白酶表达载体；
2)将gRNA连接到质粒pU6-sgRNA上，用PpU6 promoter启动表达，得到gRNA表达载体；
3)采用步骤1)所述Cas12a蛋白酶表达载体、步骤2)所述gRNA表达载体和表达抗性筛选的质粒对小立碗藓进行转化，经过抗性筛选得到突变体植株；
所述步骤1)和步骤2)没有时间顺序限制。
本发明中，所述Cas12a蛋白酶表达载体和gRNA表达载体的结构示意图如图1所示，其中a表示Cas12a蛋白酶表达载体；b表示gRNA表达载体。
本发明的原理是gRNA和Cas12a蛋白酶形成复合物，gRNA引导Cas12a蛋白酶到达含有5’-TTTN-3’PAM序列的靶序列处，gRNA与一条DNA靶序列进行碱基互补配对，Cas12a蛋白酶在PAM序列下游进行切割使双链断裂，产生粘性末端，通过同源重组或者非同源性末端接合的方式进行修复，修复过程中发生碱基增添缺失或者替换等编辑情况，达到基因敲除目的。
本发明首先将两端带有核定位信号的编码Cas12a蛋白酶的核苷酸序列连接到质粒pAct-Cas9上，用pActin promoter启动表达，得到Cas12a蛋白酶表达载体；所述pActinpromoter是原始载体pActCas9上留下来的启动子，在编码Cas12a蛋白酶的核苷酸序列的5'端；所述两端带有核定位信号编码Cas12a蛋白酶的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明的具体实施过程中，所述两端带有核定位信号编码Cas12a蛋白酶的核苷酸序列由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
本发明中，所述编码Cas12a蛋白酶的核苷酸序列优选的连接到质粒pAct-Cas9上的NcoI和XbaI酶切位点之间。
本发明具体实施过程中，将两端带有核定位信号的编码Cas12a蛋白酶的核苷酸序列和质粒pAct-Cas9分别双酶切，回收后进行连接。
本发明具体实施过程中，所述两端带有核定位信号的编码Cas12a蛋白酶的核苷酸序列的双酶切体系以20μL计，包括带有核定位信号的Cas12a片段10μL(约3μg)、NcoI 2μL、XbaI 2μL、10×CutSmart Buffer 2μL和dd H2O 4μL；所述双酶切程序为37℃，4h。
本发明的具体实施过程中，所述质粒pAct-Cas9双酶切体系以30μL计，包括质粒pAct-Cas9 20μL(约3μg)、NcoI 2μL、XbaI 2μL、10×CutSmart Buffer 3μL和dd H2O 3μL；所述双酶切程序为37℃，4h。
本发明对所述回收的方法没有特殊限制，采用本领域常规DNA回收方法即可，本发明的具体实施过程中，优选的采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收；所述琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒优选为SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒，购自于生工生物工程(上海)股份有限公司，产品货号为B518131-0100。
本发明的具体实施过程中，所述两端带有核定位信号的编码Cas12a蛋白酶的核苷酸序列连接到质粒pAct-Cas9上的连接的体系为：以10μL计，包括pAct-Cas9质粒4.5μL、编码Cas12a蛋白酶的核苷酸序列3.5μL、T4 DNA连接酶1μL和T4 DNA连接Buffer 1μL；所述连接的程序为：4℃，连接9～12h。
本发明将gRNA连接到质粒pU6-sgRNA上，用PpU6 promoter启动表达，得到gRNA表达载体；所述PpU6 promoter是原始载体pU6-sgRNA上留下来的启动子，在编码gRNA表达盒的核苷酸序列的5'端；所述gRNA包括至少一个gRNA单元和一个7个胸腺嘧啶碱基的终止序列；所述gRNA单元和7个胸腺嘧啶碱基的终止序列顺次连接；当gRNA单元的数量≥2时，所述gRNA单元串联连接，再加上7个胸腺嘧啶碱基的终止序列；所述gRNA单元包括顺次连接的成熟的crRNA和设计的靶基因序列；所述成熟的crRNA(DR)的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明的具体实施过程中，所述设计的靶基因序列优选为靶基因9250，32480和9580；所述靶基因9250，32480和9580是通过CRISPOR在线软件(http://crispor.tefor.net/)(Haeussler et al.,2016)和CRISPR-P 2.0(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)(Liu et al.,2017)设计得到；所述9250的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述32480的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述9580的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；所述串联后的gRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；所述串联后的gRNA由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
本发明中，所述gRNA优选的连接到质粒pU6-sgRNA上的NcoI和XbaI酶切位点之间。
本发明具体实施过程中，将gRNA和质粒pU6-sgRNA分别双酶切，回收后进行连接。
本发明的具体实施过程中，所述gRNA的双酶切体系以20μL计，包括gRNA片段13μL(约3μg)、NcoI 2μL、XbaI 2μL、10×CutSmart Buffer 2μL和dd H2O 1μL；所述双酶切程序为37℃，2h。
本发明的具体实施过程中，所述质粒pU6-sgRNA的双酶切体系以30μL计，包括质粒pU6-sgRNA 18μL(约3μg)、NcoI 2μL、XbaI 2μL、10×CutSmart Buffer 3μL和dd H2O 5μL；所述双酶切程序为37℃，4h。
本发明对所述回收的方法没有特殊限制，采用本领域常规DNA回收方法即可，本发明的具体实施过程中，优选的采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收；所述琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒优选为SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒，购自于生工生物工程(上海)股份有限公司，产品货号为B518131-0100。
本发明的具体实施过程中，所述gRNA连接到质粒pU6-sgRNA上的连接的体系为：以10μL计，包括pU6-sgRNA质粒3μL、gRNA 5μL、T4 DNA连接酶1μL和T4 DNA连接Buffer 1μL；所述连接的程序为：4℃，连接9～12h。
本发明在得到Cas12a蛋白酶表达载体和gRNA表达载体后，采用Cas12a蛋白酶表达载体、gRNA表达载体和表达抗性的质粒对小立碗藓进行转化，经过抗性筛选得到突变体植株。
本发明对所述转化的方法没有特殊限制，采用本领域常规质粒转化的方法即可，本发明的具体实施过程中，所述转化的方法优选为PEG介导的原生质体的方法。本发明对所述抗性筛选的方法没有特殊限制，采用本领域常规抗性筛选的方法即可。
本发明中，所述小立碗藓优选为原丝体世代的小立碗藓；所述原丝体世代的小立碗藓优选的采用以下方法制备获得：
A)采用BCDAT培养基对小立碗藓进行培养5d，即可得到用于转化的原丝体阶段材料；
B)对步骤A)原丝体打磨继代后进行培养，得到配子体世代的小立碗藓。
本发明首先采用BCDAT培养基对小立碗藓进行培养，得到原丝体；所述培养的光周期优选为16h光照/8h黑暗；所述培养的温度优选为25℃；所述培养的光照强度优选为80μmol photons m-2s-1；所述培养的时间为一周。
本发明中，所述BCDAT培养基的配方为：MgSO4.7H2O 1μM，KH2PO4 18.4μM，KNO3 10μM，FeSO4.7H2O 45μM；CuSO4.5H2O 0.22μM，H3BO3 10μM，CoCl2.6H2O 0.23μM，Na2MoO4.2H2O 0.1μM，ZnSO4.7H2O 0.19μM，MnCl2.4H2O 2μM，KI 0.17μM，酒石酸铵5mM和琼脂0.8％。121℃，20min灭菌。
本发明在得到原丝体后，对培养一周的原丝体转移到BCD培养基上培养，得到配子体世代的小立碗藓；所述培养的光周期优选为16h光照/8h黑暗；所述培养的温度为25℃；所述培养的时间优选为20～30d，更优选为20d；所述培养的光照强度优选为80μmol photonsm-2s-1。
本发明中，所述表达抗性筛选的质粒优选为表达潮霉素抗性筛选的质粒，更优选为表达潮霉素抗性筛选的质粒BHRF；所述质粒BHRF由法国国家农业科学研究院(INRA)凡尔赛中心(INRA Centre de Versailles-Grignon)的Fabien Nogue教授实验室惠赠(参见[Collonnier C,EpertA,Mara K,Maclot F,Guyon-Debast A,Charlot F,White C,Schaefer DG,Nogué F.2016.CRISPR-Cas9-mediated efficient directed mutagenesisand RAD51-dependent and RAD51-independent gene targeting in the mossPhyscomitrella patens.Plant Biotechnology Journal])；所述Cas12a蛋白酶表达载体、gRNA表达载体和表达抗性筛选的质粒的体积比优选为0.5～1.5:0.5～1.5:0.5～1.5，更优选为1:1:1；所述Cas12a蛋白酶表达载体的浓度为0.5～1.5μg/μL；所述gRNA表达载体的浓度为0.5～1.5μg/μL；所述表达抗性筛选的质粒的浓度为0.5～1.5μg/μL。
本发明在得到突变体植株后，提取突变体植株全基因组DNA，扩增靶DNA的序列，进行测序，得到序列信息。
本发明对所述提取突变体植株全基因组DNA没有特殊限定，采用本领域常规植物基因组DNA提取方法即可，本发明的具体实施过程中，采用CTAB法提取突变体植株全基因组DNA。
本发明对所述扩增的方法没有特殊限定，采用本领域常规DNA扩增的方法即可，本发明的具体实施过程中，采用PCR扩增对靶DNA序列进行扩增。
下面结合实施例对本发明提供的CRISPR/Cas12a基因编辑系统在小立碗藓基因编辑中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1 CRISPR/Cas12a基因编辑系统在小立碗藓基因编辑中的应用
1.小立碗藓的培养方法
使用BCDAT培养基培养苔藓，将小立碗藓材料打磨继代后于16h光照/8h黑暗的光周期，80μmol photons m-2s-1的光照强度，25℃条件下培养5d，形成均一化的幼嫩原丝体。
2.构建Cas12a蛋白酶表达载体
在编码Cas12a的核酸序列的两端都加上核定位信号(Nucleus Location Signal，NLS)，两端带有核定位信号的Cas12a核苷酸序列是通过上海捷瑞生物工程有限公司合成，把带有核定位信号的Cas12a片段通过酶切连接的方法连接到质粒pAct-Cas9上，酶切位点是NcoI和XbaI，用pActin promoter启动表达。两端带有核定位信号的编码Cas12a蛋白酶的核苷酸序列的双酶切体系参见表1；质粒pAct-Cas9双酶切体系参见表2；所述Cas12a蛋白酶表达载体的骨架图参见图2。
表1两端带有核定位信号的编码Cas12a蛋白酶的核苷酸序列的双酶切体系
酶切条件和时间：37℃，4h。
表2质粒pAct-Cas9双酶切体系
酶切条件和时间：37℃，4h。
对上面两个酶切体系进行电泳鉴定，对目的条带进行胶回收(琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购于生工生物工程(上海)股份有限公司，产品名称为SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒，用于PCR产物回收，产品货号为B518131-0100)。
用T4 DNA连接酶(购于Thermo Fisher Scientific公司，产品名称为ThermoScientific T4 DNA Ligase，产品货号为00532665)连接pAct-Cas9载体片段和Cas12a目的片段，两端带有核定位信号的编码Cas12a蛋白酶的核苷酸序列连接到质粒pAct-Cas9上的连接的体系参见表3。
表3两端带有核定位信号的编码Cas12a蛋白酶的核苷酸序列连接到质粒pAct-Cas9上的连接的体系
连接条件和时间：4℃，12h。
3.构建gRNA表达载体
设计同时敲除3个靶基因(9250，32480，9580)的gRNA序列，每个gRNA由两部分构成：DR(direct repeat，也就是成熟的crRNA)和设计的靶基因序列，将3个gRNA序列串联在一起，通过上海捷瑞生物工程有限公司合成，把敲除3个靶序列的gRNA片段通过酶切连接的方法连接到质粒pU6-sgRNA上，酶切位点是NcoI和Xba I，用PpU6 promoter启动表达。gRNA的双酶切体系参见表4；质粒pU6-sgRNA的双酶切体系参见表5。
表4 gRNA的双酶切体系
酶切条件和时间：37℃，2h。
表5质粒pU6-sgRNA的双酶切体系
酶切条件和时间：37℃，4h。
对上面两个酶切体系进行电泳鉴定，对目的条带进行胶回收(琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购于生工生物工程(上海)股份有限公司，产品名称为SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒，用于PCR产物回收，产品货号为B518131-0100)。
用T4 DNA连接酶(购于Thermo Fisher Scientific公司，产品名称为ThermoScientific T4 DNA Ligase，产品货号为00532665)连接pU6-sgRNA质粒片段和3个gRNA目的片段，gRNA连接到质粒pU6-sgRNA上的连接的体系参见表6；所述gRNA表达载体的骨架图参见图3。
表6 gRNA连接到质粒pU6-sgRNA上的连接的体系
连接条件和时间：4℃，12h。
4.小立碗藓的转化
用步骤1的生长了5d的幼嫩原丝体的小立碗藓进行转化。选用聚乙二醇(PEG)介导的外源质粒DNA引入原生质体的方法。这里将表达抗性筛选的质粒BHRF(潮霉素抗性)，浓度为1μg/μL，10μL)，Cas12a表达载体(浓度为1μg/μL，10μL)，gRNA表达载体(浓度为1μg/μL，10μL)混合在一起。然后同时用PEG介导的转化原生质体的方法转化小立碗藓。具体步骤为：
1)制崩溃酶(用于裂解小立碗藓原丝体，破碎细胞壁，使原生质体释放出来。崩溃酶由日本Hasabe实验室提供)：称取0.5g崩溃裂解酶+25mL8％mannitol于50mL的离心管中，避光，28℃，摇床摇30min，然后5000rpm离心10min，用0.45μm过滤滤头进行过滤灭菌；
2)将原丝体材料加入到过滤好的崩溃裂解酶中进行裂解，然后避光放在光照培养箱中，30min，每10min轻轻地摇晃一下，然后在显微镜下观察原生质体裂解情况，如果原生质体绝大部分被裂解出来则可进行下一步；
3)配溶解PEG的溶液：1mL 1M Ca(NO3)2+100μL 1M Tris-HCl(pH8.0)+9mL 8％mannitol，用0.22μm过滤滤头进行过滤灭菌，然后取5mL加入2g PEG4000，加热溶解；
4)配制3M溶液：0.91g mannitol固体+0.15mL MgCl2(1M)+1mL1％MES(pH5.6)+8.85mL H2O，用0.22μm过滤滤头进行过滤灭菌；
5)用8％mannitol洗涤漏斗滤纸，然后将裂解的原生质体用50μm的尼龙膜过滤到50mL的离心管中，加8％mannitol洗涤定容至30mL；
6)离心，1200rpm，8min；
7)用移液枪吸走上清(注意不要全部吸完，留一些液体，然后在掌心轻轻混匀)；
8)接着用30mL 8％mannitol洗涤(洗第一遍)；
9)离心，1200rpm，8min；
10)用移液枪吸走上清(注意不要全部吸完，留一些液体，然后在掌心轻轻混匀)；
11)接着用30mL 8％mannitol洗涤(洗第二遍)；
12)离心，1200rpm，8min；
13)用移液枪吸走上清(注意不要全部吸完，留一些液体，然后在掌心轻轻混匀)；
14)再加入40mL 8％mannitol，然后吸取100μL液体，用血球计数板在显微镜下进行原生质体计数；
15)离心，1200rpm，8min，用移液枪吸走上清，加(原生质体个数*1000)/4μL的3M溶液重悬原生质体；
16)将30μg(约30μL)质粒加到15mL热激管中，然后再加入300μL原生质体溶液，最后加入300μLPEG溶液，立即摇匀；
17)45℃热激5min，放冷水中10min；
18)依次加入300μL，600μL，1mL，3mL的8％mannitol，每次加完都要立马摇匀；
19)离心1200rpm，8min，去上清液；
20)配置好的40mL Top argar里面加入的1mL CaCl2，取10mL倒入到热激管中，迅速摇匀，倒在培养基上并放入光照培养箱中进行培养。
5.基因编辑突变体DNA水平鉴定及测序
利用PEG介导的方法转化小立碗藓原生质体结束后，经过如下抗性筛选获得突变体植株31株。抗性筛选的具体过程为：转过过程结束后的3～5d进行显微镜观察，看是否出芽，如果大部分原生质体出芽了，则将其转移到含潮霉素抗性培养基上进行抗性筛选，在抗性培养基上培养一周左右(若没有抗性质粒转入进去的植株会被筛死)，然后转移到普通的培养基上恢复生长，然后再其转移到含潮霉素抗性培养基上进行第2次抗性筛选(潮霉素筛选：第一次筛选浓度为20μg/mL，第二次的筛选浓度为40μg/mL)，约一周左右，再把原生质体从抗性培养基转移到普通的培养基上恢复生长，长成单株以后进行分苗培养，待植株长大提取DNA，对可能发生编辑的位点进行PCR扩增，然后再测序，鉴定植株是否发生编辑。
本实验中苔藓总DNA的提取采用CTAB法,并使用nonoprotein公司的2*TaqMasterMix进行对9250，32480，9580这三个基因的基因编辑位点分别进行PCR扩增，扩增片段大小约为500bp。
体系(50μL)：F(10μM)1μL，R(10μM)1μL，2*Taq MasterMix 25μL，H2O 22μL，基因组DNA 1μL。
使用eppendorf PCR仪，程序：95℃预变性5min，95℃变性30s，53℃退火15s，72℃延伸30s(扩增效率1kb/min)，34个循环，循环后72℃延伸10min，4℃保温。将有目的片段大小条带的PCR原液送测序，看9250，32480，9580这三个基因的基因编辑情况。其中PCR扩增9580的上游引物如SEQ ID No.7所示；PCR扩增9580的下游引物如SEQ ID No.8所示；PCR扩增32480的上游引物如SEQ ID No.9所示；PCR扩增32480的下游引物如SEQ ID No.10所示；PCR扩增9250的上游引物如SEQ ID No.11所示；PCR扩增9250的下游引物如SEQ ID No.12所示的核苷酸序列。具体内容参见表7。
表7 DNA扩增靶序列所用到的引物
鉴定结果：小立碗藓基因编辑情况参见图4～6和表8，其中图4为利用CRISPR/Cas12a基因编辑系统对小立碗藓中转录因子9250进行基因编辑的情况；图5为利用CRISPR/Cas12a基因编辑系统对小立碗藓中转录因子32480进行基因编辑的情况；图6为利用CRISPR/Cas12a基因编辑系统对小立碗藓中转录因子9580进行基因编辑的情况。
图4表示这31个植株中有27个植株的9250发生编辑，9250的编辑效率是87.1％；图5表示31个植株中有27个植株的32480发生编辑，32480的编辑效率是87.1％；图6表示31个植株中有16个植株的9580发生了编辑，9580的编辑效率是51.6％；表8表示的是统计的三基因突变体，二基因突变体和单基因突变体的的编辑效率，分别为38.7％，45.2％，16.1％。由此可见CRISPR/Cas12a基因编辑系统在小立碗藓中进行多基因编辑的效率非常高。
表8三基因突变体，二基因突变体和单基因突变体的的编辑效率
6.脱靶位点检测
为了检测CRISPR/Cas12a基因编辑体系是否存在脱靶效应，我们根据网站(http://crispor.tefor.net)预测的可能脱靶位点进行检测。对脱靶位点片段进行PCR扩增，扩增片段大小约为500bp。
体系(50μL)：F(10μM)1μL，R(10μM)1μL，2*Taq Master Mix 25μL，H2O 22μL，基因组DNA 1μL。
使用eppendorf PCR仪，程序：95℃预变性5min，95℃变性30s，53℃退火15s，72℃延伸30s(扩增效率1kb/min)，34个循环，循环后72℃延伸10min，4℃保温。
将有目的片段大小条带的PCR原液送测序，看9250，32480，9580这三个基因编辑设计的gRNA可能引起的脱靶位点的DNA序列是否发生编辑。如果发生了编辑，说明存在脱靶问题，如果没有，说明不存在脱靶问题。其中PCR扩增9580的上游引物如SEQ ID No.13所示；PCR扩增9580的下游引物如SEQ ID No.14所示；PCR扩增32480的上游引物如SEQ ID No.15所示；PCR扩增32480的下游引物如SEQ ID No.16所示；PCR扩增9250的上游引物如SEQ IDNo.17所示；PCR扩增9250的下游引物如SEQ ID No.18所示的核苷酸序列。具体内容参见表9。
表9 DNA扩增脱靶位点所用到的引物
检测结果：预测的可能脱靶位点的检测结果示意图参见图7～9，其中图7为利用CRISPR/Cas12a基因编辑系统设计的gRNA对小立碗藓中9250转录因子进行基因编辑，可能出现的脱靶位点；图8为利用CRISPR/Cas12a基因编辑系统设计的gRNA对小立碗藓中32480转录因子进行基因编辑，可能出现的脱靶位点；图9为利用CRISPR/Cas12a基因编辑系统设计的gRNA对小立碗藓中9580转录因子进行基因编辑，可能出现的脱靶位点。可以发现，设计的gRNA编辑9250和32480时出现非常少的脱靶，随机挑选12株9250发生编辑的植株中仅有2个植株发生脱靶，脱靶率为16.6％；随机挑选了13株32480发生编辑的植株中只有1个植株发生脱靶，脱靶率为0.07％；而随机挑选了20株9580发生编辑的植株中没有植株发生脱靶，脱靶率为0。因此CRISPR/Cas12a进行多基因编辑时发生脱靶的概率很小。
由以上实施例可知，本发明提供了CRISPR/Cas12a基因编辑系统在小立碗藓基因编辑中的应用，该该应用基因编辑效率高、脱靶概率小。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国科学院昆明植物研究所
<120> CRISPR/Cas12a基因编辑系统在小立碗藓基因编辑中的应用
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3788
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
catggcccca aagaagaagc ggaaggtcgg gatccacgga gtcccagcag ccatgagtaa 60
gctggagaaa tttacgaatt gttatagcct gtccaagaca ctgaggttca aggctatccc 120
cgttggaaaa actcaagaga atatcgataa caagcgtctg ctggttgagg atgagaagag 180
agcggaagac tataagggag tcaaaaaact tctggataga tactatctgt cttttataaa 240
cgacgtgctg cattccatta aattgaagaa tctgaacaac tatatttccc tgttccgaaa 300
gaagacgaga acagagaaag aaaataagga gctggaaaac ctggagatca acctgaggaa 360
ggagattgca aaggctttca agggaaatga aggttataag agcctgttca aaaaagatat 420
tattgaaact atactgcctg aatttctcga tgataaggat gagatcgcgc tcgtgaacag 480
ctttaacgga ttcacgactg cctttactgg atttttcgat aatagggaga acatgttctc 540
agaggaagcc aagagcacct cgatcgcttt tcgttgcata aatgagaatt tgacaagata 600
catcagcaac atggacattt tcgagaaggt tgatgcgatc tttgataagc atgaggttca 660
ggagattaag gagaagattc tgaactctga ttatgatgtt gaggatttct tcgaaggaga 720
attttttaat ttcgttttga cacaggaagg tatagatgtg tataacgcta ttatcggtgg 780
gttcgttacc gaatcagggg agaagataaa gggtctgaat gagtacatca atctgtataa 840
ccagaagaca aagcagaaac tgccaaaatt caagcctctc tataagcaag tcctgagcga 900
tcgggagtcg ctttcgttct acggtgaagg ttataccagc gatgaggagg tactggaggt 960
ctttagaaac actctgaaca agaatagcga aattttctct tccattaaga agctggagaa 1020
gctgttcaag aattttgatg agtactcgag cgcaggtatt ttcgtgaaga acggacctgc 1080
tataagcact attagcaagg atatttttgg agagtggaat gttattcggg ataagtggaa 1140
tgcagagtac gacgatatac acctgaagaa gaaggctgtg gtaactgaga agtatgagga 1200
cgatagacgc aaaagcttca agaagatcgg ttcctttagc ctggagcaac tgcaggagta 1260
tgcggacgca gatctgagcg tggtcgagaa actgaaggag atcattatcc aaaaggtgga 1320
tgagatttac aaggtatacg gtagctcaga aaagctcttt gatgcagatt tcgttctcga 1380
aaagagcctg aagaagaatg atgctgttgt tgctataatg aaggacctgc tcgatagcgt 1440
taagagcttt gagaattaca tcaaggcatt ctttggcgag ggaaaggaaa caaacagaga 1500
cgaaagcttc tatggcgact ttgtgctagc ttatgacatc ctgctgaagg tagaccatat 1560
atatgatgca attcgtaatt acgttaccca aaagccgtac agcaaggata agttcaaact 1620
ctattttcaa aacccgcaat ttatgggtgg ctgggataag gacaaggaaa cagattatag 1680
ggccactatc ctgcgatatg gcagcaagta ctacctcgct atcatggata agaagtatgc 1740
taagtgtctc cagaagatag ataaggacga cgtgaacgga aattacgaga agattaatta 1800
caagctactg cctgggccta acaagatgct gccaaaagtc ttcttttcaa agaaatggat 1860
ggcttactac aacccatcag aggatatcca aaagatatac aaaaatggga cctttaaaaa 1920
gggagacatg tttaacctga atgactgcca taagctgatc gattttttta aggatagcat 1980
cagcagatat cctaagtggt caaacgctta tgattttaat ttctccgaaa cagagaagta 2040
taaggacatt gctggtttct atagggaagt cgaagaacaa ggttataagg ttagctttga 2100
atcggcttca aagaaggaag ttgataaact agtggaagaa ggtaagctct atatgttcca 2160
aatttacaac aaggattttt ccgacaagtc tcacggaact cctaaccttc atacgatgta 2220
ttttaagctg ctgtttgatg agaacaatca cggccaaata cgactctccg gtggagcaga 2280
actttttatg cggagagcga gcctcaagaa agaagaactt gtggttcatc ccgccaacag 2340
cccgattgct aacaagaatc cagataaccc taagaagact acaacactgt cgtacgatgt 2400
ttataaggat aagcgtttct cggaagacca gtatgagttg cacataccaa tagcaatcaa 2460
taagtgccca aagaacattt tcaaaatcaa caccgaggtt cgtgttctgc tgaagcatga 2520
cgataacccg tacgtgatag gaattgacag gggggagaga aacctgctgt atatcgtagt 2580
cgttgatgga aagggcaaca tcgttgagca gtacagcttg aatgaaatca ttaacaactt 2640
taacggtata cgtatcaaga ctgactacca tagcctgctg gataagaagg agaaggagag 2700
attcgaggca aggcaaaact ggacgagcat cgaaaacatc aaggaactaa aggccggtta 2760
tatcagccaa gtagtccata agatttgtga gctggtggag aagtatgacg ctgtcatcgc 2820
cttggaggat ctgaattctg gcttcaaaaa tagccgggtg aaagtggaga agcaggtata 2880
ccaaaagttt gagaagatgc tcatcgataa gctaaactac atggttgata aaaagagcaa 2940
tccgtgcgcc acaggaggag ctctcaaagg gtaccaaata accaacaagt tcgaaagctt 3000
caagtcaatg agcacacaaa acgggtttat tttttatata ccagcatggc tgacgagcaa 3060
gattgatccc agcactggtt ttgtcaacct gctgaagacc aagtatacta gcattgctga 3120
ttctaaaaag tttatttcga gcttcgaccg tattatgtac gttccagagg aggatctgtt 3180
cgaattcgcg ctggattaca agaacttcag cagaaccgat gctgattata ttaagaagtg 3240
gaagctgtac tcttacggta atagaataag gatcttcaga aaccctaaga aaaacaacgt 3300
gttcgattgg gaagaggtct gtctcactag cgcgtataag gagctgttca ataagtacgg 3360
aataaattac cagcaagggg acatccgcgc tctgctgtgt gaacagagtg acaaagcatt 3420
ttatagcagt ttcatggcgc tgatgagcct gatgctgcag atgcgaaaca gcattactgg 3480
tagaacagac gttgactttc tcatcagccc tgtgaagaac agcgacggaa tcttttacga 3540
ttccaggaac tacgaggcac aggaaaacgc tattctgcct aaaaacgctg atgcaaacgg 3600
agcctataac attgcacgaa aagttctgtg ggctattgga cagttcaaga aggctgaaga 3660
tgagaagcta gataaggtaa agatagctat tagcaataag gaatggctgg agtacgcaca 3720
aacatccgtt aagcacaaaa ggccggcggc cacgaaaaag gccggccagg caaaaaagaa 3780
aaagtaat 3788
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
taatttctac taagtgtaga t 21
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttgaaggatc gttcaccaga tggt 24
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaagaaagta tgggacagga acgg 24
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttgccaaagc tatgcagaat ccaa 24
<210> 6
<211> 142
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
taatttctac taagtgtaga tgaagaaagt atgggacagg aacggtaatt tctactaagt 60
gtagatttgc caaagctatg cagaatccaa taatttctac taagtgtaga tttgaaggat 120
cgttcaccag atggtttttt tt 142
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctgtatatgt gttaacgaaa cg 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gacgccagat tgtcgattca gt 22
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gagttcttag tcgtgcttcg cg 22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gctggaaaag ttgttgtgct ta 22
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cggacctgta agctagtcct t 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgtattactc atttggacgg c 21
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gaccatatgg cttttgatga a 21
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tcgcgagtgt acctacgtct 20
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tcgcaggtgg tgaagacgga t 21
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ttcagccgcg tcaagattga a 21
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tttggctctg tacgtagatt g 21
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cacttctcac tgaaacgcta c 21

Claims (8)

1.CRISPR/Cas12a基因编辑系统在小立碗藓基因编辑中的应用，包括以下步骤：
1)将两端带有核定位信号的编码Cas12a蛋白酶的核苷酸序列连接到质粒pAct-Cas9上，用pActinpromoter启动表达，得到Cas12a蛋白酶表达载体；
2)将gRNA连接到质粒pU6-sgRNA上，用PpU6 promoter启动表达，得到gRNA表达载体；
3)采用步骤1)所述Cas12a蛋白酶表达载体、步骤2)所述gRNA表达载体和表达抗性的质粒对小立碗藓进行转化，经过抗性筛选得到突变体植株；
所述步骤1)和步骤2)没有时间顺序限制；
所述两端带有核定位信号编码Cas12a蛋白酶的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述gRNA包括至少一个gRNA单元和一个7个胸腺嘧啶碱基的终止序列；所述gRNA单元和7个胸腺嘧啶碱基的终止序列顺次连接；
当gRNA单元的数量≥2时，所述gRNA单元串联连接；
所述gRNA单元包括顺次连接的成熟的crRNA和设计的靶基因序列；
所述成熟的crRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤3)中所述小立碗藓为原丝体阶段的小立碗藓。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，步骤1)中所述编码Cas12a蛋白酶的核苷酸序列连接到质粒pAct-Cas9上的NcoI和XbaI酶切位点之间。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤1)中所述连接的体系为：以10μL计，包括pAct-Cas9质粒4.5μL、编码Cas12a蛋白酶的核苷酸序列3.5μL、T4 DNA连接酶1μL和T4DNA连接Buffer 1μL；所述连接的程序为：4℃，连接9～12h。
5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，步骤2)中所述gRNA连接到质粒pU6-sgRNA上的NcoI和XbaI酶切位点之间。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤2)中所述连接的体系为：以10μL计，包括pU6-sgRNA质粒3μL、gRNA 5μL、T4 DNA连接酶1μL和T4DNA连接Buffer 1μL；所述连接的程序为：4℃，连接9～12h。
7.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，步骤3)中所述Cas12a蛋白酶表达载体、gRNA表达载体和表达抗性筛选的质粒的体积比为0.5～1.5:0.5～1.5:0.5～1.5；所述Cas12a蛋白酶表达载体的浓度为0.5～1.5μg/μL；所述gRNA表达载体的浓度为0.5～1.5μg/μL；所述表达抗性筛选的质粒的浓度为0.5～1.5μg/μL。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤3)中所述表达抗性的质粒为表达潮霉素抗性的质粒。
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