CN106244591A - 修饰crRNA在CRISPR/Cpf1基因编辑系统中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了CRISPR/Cpf1系统在基因编辑中的应用。所述CRISPR/Cpf1系统中的crRNA为修饰crRNA；所述修饰的方式为脱氧核糖核酸修饰；所述脱氧核糖核酸修饰的方法为：在所述crRNA的5’末端增加1～3个脱氧核糖核酸和/或3’末端增加1～3个脱氧核糖核酸；所述脱氧核糖核酸为胸腺嘧啶脱氧核苷酸。实验证明，化学合成且具有修饰的crRNA用于AsCRISPR/Cpf1系统或FnCRISPR/Cpf1系统均造成hAAVS1基因和THUMPD3‑AS1基因的突变，即均有一定的基因编辑能力。因此，修饰crRNA在利用CRISPR/Cpf1系统进行基因编辑中具有重要的应用价值。

Description

修饰crRNA在CRISPR/Cpf1基因编辑系统中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及修饰crRNA在CRISPR/Cpf1基因编辑系统中的应用。
背景技术
基因编辑是在基因组水平上进行精确修饰的一种技术，可完成基因定点删除(InDel)突变、基因定点插入突变、多位点同时突变和小片段的删失等。基因编辑技术可用于基因功能及疾病发病机理研究、构建疾病动物模型、生物治疗、遗传和肿瘤相关疾病研究、整合病毒疾病研究和改良农畜牧物种。基因编辑技术是从根本上改变物种遗传物质DNA的工具，具有极其广泛的应用价值和发展前景。
锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)和CRISPR/Cas9系统是三大基因编辑技术，本质上均是利用非同源末端链接途径(NHEJ)修复和同源重组(HR)修复，联合特异性DNA的靶向识别及核酸内切酶完成的DNA序列改变。NHEJ修复使基因产生插入或删除突变，从而造成基因移码突变，以实现编码蛋白基因敲除，如果是基因组邻近位置两处双链断裂，NHEJ修复后则可造成基因组片段缺失。锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)和CRISPR/Cas9系统三种编辑技术的共同点是含有靶点DNA序列的识别区域及DNA剪切功能区域。其中ZFN通过锌指结构域识别靶点DNA序列，TALEN识别靶点DNA序列的区域是重复可变双残基的重复，ZFN和TALEN的DNA剪切功能区域均为一种名为Fokl的核酸内切酶结构域，FokI结构需要形成二聚体才能发挥DSB剪切功能，所以ZFNs和TALEN均需要表达两个DNA靶向-FokI核酸内切酶结构融合蛋白。而CRISPR/Cas9系统是存在于大多数细菌(约40％)和古细菌(约90％)中的一种后天免疫系统，可用来消灭或对抗外来的质体或者噬菌体，并在自身基因组中留下外来基因片段作为“记忆”，在下一次外源DNA入侵时，表达的Cas9核酸酶在含有记忆片段的crRNA及tracrRNA的指导下切割与记忆片段一样且含有PAM的外源基因，发挥抵抗外源DNA片段入侵的免疫作用。利用CRISPR/Cas9系统编辑生物基因组，可在靶标片段处造成不同形式的缺失或插入，现已成功应用于人类细胞系、斑马鱼、大鼠、小鼠、果蝇等生物中。与ZFN和TALEN相比，CRISPR/Cas9系统中蛋白质对DNA序列的识别要更加精确得多，降低了脱靶切割的几率，减低了细胞毒性，而且CRISPR/Cas9系统的构建仅仅需要设计与靶序列互补的gRNA即可，更为简单和廉价，大大提高了基因操作的效率及简便性。但是，CRISPR/Cas9系统也存在着一些不足，如Cas9蛋白不能对任意序列进行切割，其靶点3’端要求必须含有PAM序列(如SpCas9蛋白要求PAM序列为NGG)。
最新发现的CRISPR/Cpf1系统(Zetsche B,Gootenberg JS et al.Cpf1is asingle RNA-guided endonuclease of a class 2CRISPR-Cas system.Cell.2015Oct22；163(3):759-71.)和CRISPR/Cas9系统同属CRISPR-Cas Class2系统，但前者仅需要一条更短的crRNA即可实现基因编辑，更有潜力实现更简单、更精确的基因组工程操作。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何进行基因编辑。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了CRISPR/Cpf1系统在基因编辑中的应用；所述CRISPR/Cpf1系统中的crRNA为修饰crRNA。
上述应用中，所述修饰的方式可为脱氧核糖核酸修饰。
上述应用中，所述脱氧核糖核酸修饰的方法可为：在所述crRNA的5’末端增加1～3个脱氧核糖核酸和/或3’末端增加1～3个脱氧核糖核酸。
上述应用中，所述脱氧核糖核酸修饰的方法具体可为a1)-a6)中的任一种：
a1)在所述crRNA的5’末端增加1个脱氧核糖核酸；
a2)在所述crRNA的5’末端增加2个脱氧核糖核酸；
a3)在所述crRNA的3’末端增加1个脱氧核糖核酸；
a4)在所述crRNA的3’末端增加2个脱氧核糖核酸；
a5)在所述crRNA的5’末端和3’末端各增加1个脱氧核糖核酸；
a6)在所述rRNA的5’末端和3’末端各增加2个脱氧核糖核酸。
上述应用中，所述脱氧核糖核酸具体可为胸腺嘧啶脱氧核苷酸。
上述应用中，所述CRISPR/Cpf1系统可为AsCRISPR/Cpf1系统或FnCRISPR/Cpf1系统。
上述应用中，“所述CRISPR/Cpf1系统中的crRNA为修饰crRNA”具体可为所述CRISPR/Cpf1系统中的crRNA为化学合成且具有修饰的crRNA。
所述AsCRISPR/Cpf1系统来自Acidaminococcus_sp.BV3L6，其表达AsCpf1蛋白。所述FnCRISPR/Cpf1系统来自Francisella_novicida，其表达FnCpf1蛋白。
所述AsCpf1蛋白可为h1)或h2)或h3)：
h1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；
h2)在h1)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
h3)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
所述FnCpf1蛋白可为i1)或i2)或i3)：
i1)氨基酸序列是序列表中序列3所示的蛋白质；
i2)在i1)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
i3)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
为解决上述技术问题，本发明还提供了定向编辑基因组的方法。
本发明所提供的定向编辑基因组的方法，可包括如下步骤：
(1)根据受体基因组中预期进行定向编辑的靶基因设计crRNA；
(2)将所述crRNA进行修饰，得到修饰的crRNA；
(3)利用所述修饰的crRNA和编码Cpf1蛋白的基因对受体进行定向编辑。
所述(1)中，所述靶基因具体可为hAAVS1基因(Gene ID：54776)或THUMPD3-AS1基因(Gene ID：440944)。根据所述hAAVS1基因的核苷酸序列选择靶序列Ⅰ，所述靶序列Ⅰ的核苷酸序列具体可为：5’-TCTGTCCCCTCCACCCCACAGTGG-3’。根据所述THUMPD3-AS1基因的核苷酸序列选择靶序列Ⅱ，所述靶序列Ⅱ的核苷酸序列具体可为：5’-GAGAACAAGCGCCTCCCACCCACA-3’。
所述(3)中，所述Cpf1蛋白可为所述AsCpf1蛋白或所述FnCpf1蛋白。
所述(2)中，所述修饰的方式可为脱氧核糖核酸修饰。
所述(2)中，所述脱氧核糖核酸修饰的方法可为：在所述crRNA的5’末端增加1～3个脱氧核糖核酸和/或3’末端增加1～3个脱氧核糖核酸。
所述(2)中，所述脱氧核糖核酸修饰的方法具体可为a1)-a6)中的任一种：
a1)在所述crRNA的5’末端增加1个脱氧核糖核酸；
a2)在所述crRNA的5’末端增加2个脱氧核糖核酸；
a3)在所述crRNA的3’末端增加1个脱氧核糖核酸；
a4)在所述crRNA的3’末端增加2个脱氧核糖核酸；
a5)在所述crRNA的5’末端和3’末端各增加1个脱氧核糖核酸；
a6)在所述crRNA的5’末端和3’末端各增加2个脱氧核糖核酸。
所述(2)中，所述脱氧核糖核酸具体可为胸腺嘧啶脱氧核苷酸。
所述(2)具体可为完成步骤(1)后，化学合成所述crRNA并进行修饰，得到修饰的crRNA。
所述(2)和(3)中，所述修饰的crRNA具体可为e1)-e16)中的任一种：
e1)5’-AAUUUCUACUCUUGUAGAUUCUGUCCCCUCCACCCCACAGdT-3’；
e2)5’-AAUUUCUACUGUUGUAGAUUCUGUCCCCUCCACCCCACAGdT-3’；
e3)5’-AAUUUCUACUCUUGUAGAUUCUGUCCCCUCCACCCCACAGdTdT-3’；
e4)5’-AAUUUCUACUGUUGUAGAUUCUGUCCCCUCCACCCCACAGdTdT-3’；
e5)5’-dTAAUUUCUACUCUUGUAGAUUCUGUCCCCUCCACCCCACAGdT-3’；
e6)5’-dTAAUUUCUACUGUUGUAGAUUCUGUCCCCUCCACCCCACAGdT-3’；
e7)5’-dTdTAAUUUCUACUCUUGUAGAUUCUGUCCCCUCCACCCCACAGdTdT-3’；
e8)5’-dTdTAAUUUCUACUGUUGUAGAUUCUGUCCCCUCCACCCCACAGdTdT-3’；
e9)5’-AAUUUCUACUCUUGUAGAUGAGAACAAGCGCCUCCCACCCdT-3’；
e10)5’-AAUUUCUACUGUUGUAGAUGAGAACAAGCGCCUCCCACCCdT-3’；
e11)5’-AAUUUCUACUCUUGUAGAUGAGAACAAGCGCCUCCCACCCdTdT-3’；
e12)5’-AAUUUCUACUGUUGUAGAUGAGAACAAGCGCCUCCCACCCdTdT-3’；
e13)5’-dTAAUUUCUACUCUUGUAGAUGAGAACAAGCGCCUCCCACCCdT；
e14)5’-dTAAUUUCUACUGUUGUAGAUGAGAACAAGCGCCUCCCACCCdT-3’；
e15)5’-dTdTAAUUUCUACUCUUGUAGAUGAGAACAAGCGCCUCCCACCCdTdT；
e16)5’-dTdTAAUUUCUACUGUUGUAGAUGAGAACAAGCGCCUCCCACCCdTdT-3’。
所述e1)、所述e3)、所述e5)、所述e7)、所述e9)、所述e11)、所述e13)或所述e15)，具体可与编码所述AsCpf1蛋白的基因导入所述受体。所述编码所述AsCpf1蛋白的基因可通过质粒的形式导入所述受体。所述质粒具体可为Addgene公司的质粒pcDNA3.1-hAsCpf1。所述受体可为293T细胞。
所述e2)、所述e4)、所述e6)、所述e8)、所述e10)、所述e12)、所述e14)或所述e16)，具体可与编码所述FnCpf1蛋白的基因导入所述受体。所述编码所述FnCpf1蛋白的基因可通过质粒的形式导入所述受体。所述质粒具体可为Addgene公司的质粒pcDNA3.1-hFnCpf1。所述受体可为293T细胞。
为解决上述技术问题，本发明还提供了定向编辑基因组的CRISPR/Cpf1系统。
本发明所提供的定向编辑基因组的CRISPR/Cpf1系统，该系统中的crRNA为修饰crRNA。
上述系统中，所述CRISPR/Cpf1系统为AsCRISPR/Cpf1系统或FnCRISPR/Cpf1系统。所述AsCRISPR/Cpf1系统来自Acidaminococcus_sp.BV3L6，其表达上述任一所述AsCpf1蛋白。所述FnCRISPR/Cpf1系统来自Francisella_novicida，其表达上述任一所述FnCpf1蛋白。
上述系统中，所述修饰的方式可为脱氧核糖核酸修饰。
上述系统中，所述脱氧核糖核酸修饰的方法可为：在所述crRNA的5’末端增加1～3个脱氧核糖核酸和/或3’末端增加1～3个脱氧核糖核酸。
上述系统中，所述脱氧核糖核酸修饰的方法具体可为a1)-a6)中的任一种：
a1)在所述crRNA的5’末端增加1个脱氧核糖核酸；
a2)在所述crRNA的5’末端增加2个脱氧核糖核酸；
a3)在所述crRNA的3’末端增加1个脱氧核糖核酸；
a4)在所述crRNA的3’末端增加2个脱氧核糖核酸；
a5)在所述crRNA的5’末端和3’末端各增加1个脱氧核糖核酸；
a6)在所述crRNA的5’末端和3’末端各增加2个脱氧核糖核酸。
上述系统中，所述脱氧核糖核酸具体可为胸腺嘧啶脱氧核苷酸。
上述系统中，所述“修饰crRNA”具体可为化学合成且具有修饰的crRNA。
实验证明，化学合成的crRNA和化学合成且具有修饰的crRNA用于AsCRISPR/Cpf1系统或FnCRISPR/Cpf1系统均造成hAAVS1基因和THUMPD3-AS1基因的突变，即均有一定的基因编辑能力。与仅化学合成的crRNA相比，化学合成且具有修饰的crRNA的基因编辑能力更强。因此，修饰crRNA在利用CRISPR/Cpf1系统进行基因编辑中具有重要的应用价值。
附图说明
图1为T7E1突变检测结果。
图2为测序结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
质粒pcDNA3.1-hAsCpf1和质粒pcDNA3.1-hFnCpf1均为Addgene公司的产品，在下文中，质粒pcDNA3.1-hAsCpf1简称为Y1681，质粒pcDNA3.1-hFnCpf1简称为Y1682。
质粒pU6gRNA为苏州吉玛基因股份有限公司的产品，质粒pU6gRNA(环形)的核苷酸序列如序列表序列1所示。在下文中，质粒pU6gRNA简称为Y523。
293T细胞为中国科学院细胞库产品，目录号为GNHu17。DMEM培养基和FBS均为Gibco公司的产品。细胞孔板为Corning公司的产品。Max酶为Vazyme公司产品，货号为P505。Genomic DNA Extraction kit为Takara公司产品，产品目录号为#9765。Trypsin-EDTASolution为Hyclone公司，货号为SH30042.02。PBS缓冲液是用超纯水稀释PBS(10×)至10倍体积得到的；PBS(10×)为生工生物工程(上海)股份有限公司产品，货号为E607016。OPTI-MEM培养基为Gibco公司产品，产品目录号为#31985-070。lipofectamine 2000为thermofisher-invitrogen公司产品，货号为11668-027。T7E1为T7E1突变检测试剂盒中的组件；T7E1突变检测试剂盒为苏州吉玛基因股份有限公司的产品。DNA Marker为Thermo Fisher公司产品，产品名称为GeneRuler DNA Ladder Mix，货号为SM0331。10×退火buffer：含10mM EDTA·2Na、1000mM NaCl的pH 8.0、100mM Tris-HCl缓冲液。
实施例1、化学合成且具有修饰的crRNA用于CRISPR/Cpf1系统在基因编辑中的应用
选择hAAVS1基因(Gene ID：54776)和THUMPD3-AS1基因(Gene ID：440944)作为检测CRISPR/Cpf1系统的基因编辑能力的靶基因。CRISPR/Cpf1系统具体为AsCRISPR/Cpf1系统或FnCRISPR/Cpf1系统。AsCRISPR/Cpf1系统来自Acidaminococcus_sp.BV3L6，其表达序列表中序列2所示的AsCpf1蛋白。FnCRISPR/Cpf1系统来自Francisella_novicida，其表达序列表中序列3所示的FnCpf1蛋白。
根据hAAVS1基因的核苷酸序列选择靶序列Ⅰ，根据THUMPD3-AS1基因的核苷酸序列选择靶序列Ⅱ。靶序列Ⅰ和靶序列Ⅱ的序列如下：
靶序列Ⅰ：5’-TCTGTCCCCTCCACCCCACAGTGG-3’；
靶序列Ⅱ：5’-GAGAACAAGCGCCTCCCACCCACA-3’。
一、质粒的构建
1、质粒Y1640的构建
(1)用限制性内切酶BbsⅠ和EcoRⅠ双酶切质粒pU6gRNA，回收约2955bp的载体骨架。
(2)由苏州吉玛基因股份有限公司合成引物Y1640-S：
5’-CACCgTAATTTCTACTCTTGTAGAT g-3’(单下划线为As crRNA骨架序列，双下划线为靶序列Ⅰ，波浪线为终止序列)和引物Y1640-A：
5’-aattc ATCTACAAGAGTAGAAATTAc-3’(单下划线为As crRNA骨架序列，双下划线为靶序列Ⅰ，波浪线为终止序列)，用去离子水分别将引物Y1640-S和引物Y1640-A稀释至100μM，得到引物Y1640-S稀释液和引物Y1640-A稀释液；然后进行退火反应，形成DNA分子Ⅰ。
退火体系：引物Y1640-S稀释液5μL、引物Y1640-S稀释液5μL、去离子水35μL、10×退火buffer 5μL。
退火程序：99℃10min，85℃5min，80℃5min，75℃5min，70℃5min，16℃保存。
(3)将载体骨架和DNA分子Ⅰ连接，得到质粒Y1640。
根据测序结果，对质粒Y1640进行结构描述如下：将质粒pU6gRNA的限制性内切酶BbsⅠ和EcoRⅠ识别序列间的片段(质粒pU6gRNA被限制性内切酶BbsⅠ和EcoRⅠ切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)替换为DNA分子Ⅰ。质粒Y1640的核苷酸序列如序列表序列4所示。
2、质粒Y1641的构建
按照步骤1的方法，仅将DNA分子Ⅰ替换为DNA分子Ⅱ，其它步骤均不变，得到质粒Y1641。
DNA分子Ⅱ的制备方法如下：由苏州吉玛基因股份有限公司合成引物Y1641-S：
5’-CACCgTAATTTCTACTCTTGTAGAT g-3’(单下划线为As crRNA骨架序列，双下划线为靶序列Ⅱ，波浪线为终止序列)和引物Y1641-A：
5’-aattc ATCTACAAGAGTAGAAATTAc-3’(单下划线为As crRNA骨架序列，双下划线为靶序列Ⅱ，波浪线为终止序列)，用去离子水分别将引物Y1641-S和引物Y1641-A稀释至100μM，得到引物Y1641-S稀释液和引物Y1641-A稀释液；然后进行退火反应，形成DNA分子Ⅱ。
退火体系：引物Y1641-S稀释液5μL、引物Y1641-S稀释液5μL、去离子水35μL、10×退火buffer 5μL。
退火程序：99℃10min，85℃5min，80℃5min，75℃5min，70℃5min，16℃保存。
根据测序结果，对质粒Y1641进行结构描述如下：将质粒pU6gRNA的限制性内切酶BbsⅠ和EcoRⅠ识别序列间的片段(质粒pU6gRNA被限制性内切酶BbsⅠ和EcoRⅠ切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)替换为DNA分子Ⅱ。
3、质粒Y1642的构建
按照步骤1的方法，仅将DNA分子Ⅰ替换为DNA分子Ⅲ，其它步骤均不变，得到质粒Y1642。
DNA分子Ⅲ的制备方法如下：由苏州吉玛基因股份有限公司合成引物Y1642-S：
5’-CACCgTAATTTCTACTGTTGTAGAT g-3’(单下划线为Fn crRNA骨架序列，双下划线为靶序列Ⅰ，波浪线为终止序列)和引物Y1642-A：
5’-aattc ATCTACAAGAGTAGAAATTAc-3’(单下划线为Fn crRNA骨架序列，双下划线为靶序列Ⅰ，波浪线为终止序列)，用去离子水分别将引物Y1642-S和引物Y1642-A稀释至100μM，得到引物Y1642-S稀释液和引物Y1642-A稀释液；然后进行退火反应，形成DNA分子Ⅲ。
退火体系：引物Y1642-S稀释液5μL、引物Y1642-S稀释液5μL、去离子水35μL、10×退火buffer 5μL。
退火程序：99℃10min，85℃5min，80℃5min，75℃5min，70℃5min，16℃保存。
根据测序结果，对质粒Y1642进行结构描述如下：将质粒pU6gRNA的限制性内切酶BbsⅠ和EcoRⅠ识别序列间的片段(质粒pU6gRNA被限制性内切酶BbsⅠ和EcoRⅠ切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)替换为DNA分子Ⅲ。
4、质粒Y1643的构建
按照步骤1的方法，仅将DNA分子Ⅰ替换为DNA分子Ⅳ，其它步骤均不变，得到质粒Y1643。
DNA分子Ⅳ的制备方法如下：由苏州吉玛基因股份有限公司合成引物Y1643-S：
5’-CACCgTAATTTCTACTGTTGTAGAT g-3’(单下划线为Fn crRNA骨架序列，双下划线为靶序列Ⅱ，波浪线为终止序列)和引物Y1643-A：
5’-aattc ATCTACAAGAGTAGAAATTAc-3’(单下划线为Fn crRNA骨架序列，双下划线为靶序列Ⅱ，波浪线为终止序列)，用去离子水分别将引物Y1643-S和引物Y1643-A稀释至100μM，得到引物Y1643-S稀释液和引物Y1643-A稀释液；然后进行退火反应，形成DNA分子Ⅲ。
退火体系：引物Y1643-S稀释液5μL、引物Y1643-S稀释液5μL、去离子水35μL、10×退火buffer 5μL。
退火程序：99℃10min，85℃5min，80℃5min，75℃5min，70℃5min，16℃保存。
根据测序结果，对质粒Y1643进行结构描述如下：将质粒pU6gRNA的限制性内切酶BbsⅠ和EcoRⅠ识别序列间的片段(质粒pU6gRNA被限制性内切酶BbsⅠ和EcoRⅠ切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)替换为DNA分子Ⅳ。
二、化学合成且具有修饰的crRNA的制备
合成表1中所示的crRNA，其中胸腺嘧啶脱氧核苷酸修饰指的是在crRNA的5’端和/或3’端增加1－2个胸腺嘧啶脱氧核苷酸，在表中用dT表示。表1中，单下划线为As crRNA骨架序列自5’末端起第2至20位，虚线为Fn crRNA骨架序列自5’末端起第2至20位，双下划线为靶序列Ⅰ自5’末端起第1至21位，方框为靶序列Ⅱ自5’末端起第1至21位。
表1中所示的所有crRNA为均1OD(33μg)一管，每管中加入66μL DEPC水，得到浓度均为0.5μg/μL的RNA溶液。
表1.化学合成的crRNA或化学合成且具有修饰的crRNA的基本信息
三、检测化学合成且具有修饰的crRNA用于AsCRISPR/Cpf1系统中的基因编辑能力
1、共转染
(1)Y1681-Y1640-293T细胞组的获得
质粒Y1681和质粒Y1640共转染293T细胞的步骤如下：
①将293T细胞置于装有10％(体积比)FBS的DMEM培养基的培养皿(直径为10cm)，37℃、5％CO2培养箱中培养，待293T细胞培养至80～90％融合时，弃培养基，用3mL PBS缓冲液洗涤两次。
②完成步骤①后，向所述培养皿中加入1mL Trypsin-EDTA Solution，混匀，然后吸出液相，37℃静置1～2min。
③完成步骤②后，向所述培养皿中加入2mL含10％(体积比)FBS的DMEM培养基，吹打形成单细胞悬液。
④完成步骤③后，将所述单细胞悬液接种于6孔板，每孔约接种2×105个293T细胞，37℃、5％CO2培养箱中培养24h。
⑤完成步骤④后，将所述6孔板中的培养基更换为OPTI-MEM培养基，然后加入4μg质粒Y1681和4μg质粒Y1640，进行共转染(共转染过程中，转染试剂为lipofectamine2000，培养基为OPTI-MEM培养基，共转染的步骤参考Lipofectamin2000说明书)，然后37℃、5％CO2培养箱中孵育6h，然后更换为新的OPTI-MEM培养基，37℃、5％CO2培养箱中继续培养18h。
⑥重复步骤⑤一次。
⑦完成步骤⑥后48h，收集细胞，然后用1mL PBS缓冲液洗涤一次。
⑧完成步骤⑦后，向所述培养皿中加入0.5mL Trypsin-EDTA Solution，混匀，然后吸出液相，37℃静置1～2min。
⑨完成步骤⑧后，向所述培养皿中加入1mL含10％(体积比)FBS的DMEM培养基，吹打形成单细胞悬液；将该单细胞悬液1000rpm离心3min，得到沉淀1。
⑩完成步骤⑨后，向所述沉淀中加入1mL PBS缓冲液，1000rpm离心3min，得到沉淀2。
沉淀2即为质粒Y1681和质粒Y1640共转染后的293T细胞组，简称Y1681-Y1640-293T细胞组。
(2)Y1681-Y1641-293T细胞组的获得
按照上述步骤(1)的方法，将质粒Y1640替换为质粒Y1641，其它步骤均不变，得到Y1681-Y1641-293T细胞组。
(3)Y1682-Y1642-293T细胞组的获得
按照上述步骤(1)的方法，将质粒Y1681替换为质粒Y1682，质粒Y1640替换为质粒Y1642，其它步骤均不变，得到Y1682-Y1642-293T细胞组。
(4)Y1682-Y1643-293T细胞组的获得
按照上述步骤(1)的方法，将质粒Y1681替换为质粒Y1682，质粒Y1640替换为质粒Y1643，其它步骤均不变，得到Y1682-Y1643-293T细胞组。
(5)Y1681-293T细胞组的获得
质粒Y1681转染293T细胞的步骤如下：
①同步骤(1)中①。
②同步骤(1)中②。
③同步骤(1)中③。
④同步骤(1)中④。
⑤完成步骤④后，将所述6孔板中的培养基更换为OPTI-MEM培养基，然后加入4μg质粒Y1681，进行转染(共转染过程中，转染试剂为lipofectamine 2000，培养基为OPTI-MEM培养基，共转染的步骤参考Lipofectamin2000说明书)，然后37℃、5％CO2培养箱中孵育6h，然后更换为新的OPTI-MEM培养基，37℃、5％CO2培养箱中继续培养18h。
⑥重复步骤⑤一次。
⑦同步骤(1)中⑦。
⑧同步骤(1)中⑧。
⑨同步骤(1)中⑨。
⑩同步骤(1)中⑩。
步骤⑩获得的沉淀即为质粒Y1681转染后的293T细胞组，简称Y1681-293T细胞组。
(6)Y1682-293T细胞组的获得
按照上述步骤(1)的方法，将质粒Y1681替换为质粒Y1682，其它步骤均不变，得到Y1682-293T细胞组。
(7)Y1681-A1-293T细胞组的获得
质粒Y1683和A1共转染293T细胞的步骤如下：
①同步骤(1)中①。
②同步骤(1)中②。
③同步骤(1)中③。
④同步骤(1)中④。
⑤完成步骤④后，将所述6孔板中的培养基更换为OPTI-MEM培养基，然后加入4μg质粒Y1681和2μg A1(即4μL)，进行共转染(共转染过程中，转染试剂为lipofectamine2000，培养基为OPTI-MEM培养基，共转染的步骤参考Lipofectamin2000说明书)，然后37℃、5％CO2培养箱中孵育6h，然后更换为新的OPTI-MEM培养基，37℃、5％CO2培养箱中继续培养18h。
⑥重复步骤⑤一次。
⑦同步骤(1)中⑦。
⑧同步骤(1)中⑧。
⑨同步骤(1)中⑨。
⑩同步骤(1)中⑩。
步骤⑩获得的沉淀即为质粒Y1683和A1共转染后的293T细胞，简称Y1683-A1-293T细胞组。
(8)Y1681-A3-293T细胞的获得
按照上述步骤(7)的方法，将A1替换为A3，其它步骤均不变，得到Y1681-A3-293T细胞组。
(9)Y1681-A5-293T细胞的获得
按照上述步骤(7)的方法，将A1替换为A5，其它步骤均不变，得到Y1681-A5-293T细胞组。
(10)Y1681-A7-293T细胞的获得
按照上述步骤(7)的方法，将A1替换为A7，其它步骤均不变，得到Y1681-A7-293T细胞组。
(11)Y1681-A9-293T细胞的获得
按照上述步骤(7)的方法，将A1替换为A9，其它步骤均不变，得到Y1681-A9-293T细胞组。
(12)Y1681-R1-293T细胞的获得
按照上述步骤(7)的方法，将A1替换为R1，其它步骤均不变，得到Y1681-R1-293T细胞组。
(13)Y1681-R3-293T细胞的获得
按照上述步骤(7)的方法，将A1替换为R3，其它步骤均不变，得到Y1681-R3-293T细胞组。
(14)Y1681-R5-293T细胞的获得
按照上述步骤(7)的方法，将A1替换为R5，其它步骤均不变，得到Y1681-R5-293T细胞组。
(15)Y1681-R7-293T细胞的获得
按照上述步骤(7)的方法，将A1替换为R7，其它步骤均不变，得到Y1681-R7-293T细胞组。
(16)Y1681-R9-293T细胞的获得
按照上述步骤(7)的方法，将A1替换为R9，其它步骤均不变，得到Y1681-R9-293T细胞组。
(17)Y1682-A2-293T细胞的获得
按照上述步骤(7)的方法，将质粒Y1681替换为质粒Y1682，将A1替换为A2，其它步骤均不变，得到Y1682-A2-293T细胞组。
(18)Y1682-A4-293T细胞的获得
按照上述步骤(7)的方法，将质粒Y1681替换为质粒Y1682，将A1替换为A4，其它步骤均不变，得到Y1682-A4-293T细胞组。
(19)Y1682-A6-293T细胞的获得
按照上述步骤(7)的方法，将质粒Y1681替换为质粒Y1682，将A1替换为A6，其它步骤均不变，得到Y1682-A6-293T细胞组。
(20)Y1682-A8-293T细胞的获得
按照上述步骤(7)的方法，将质粒Y1681替换为质粒Y1682，将A1替换为A8，其它步骤均不变，得到Y1682-A8-293T细胞组。
(21)Y1682-A10-293T细胞的获得
按照上述步骤(7)的方法，将质粒Y1681替换为质粒Y1682，将A1替换为A10，其它步骤均不变，得到Y1682-A10-293T细胞组。
(22)Y1682-R2-293T细胞的获得
按照上述步骤(7)的方法，将质粒Y1681替换为质粒Y1682，将A1替换为R2，其它步骤均不变，得到Y1682-R2-293T细胞组。
(23)Y1682-R4-293T细胞的获得
按照上述步骤(7)的方法，将质粒Y1681替换为质粒Y1682，将A1替换为R4，其它步骤均不变，得到Y1682-R4-293T细胞组。
(24)Y1682-R6-293T细胞的获得
按照上述步骤(7)的方法，将质粒Y1681替换为质粒Y1682，将A1替换为R6，其它步骤均不变，得到Y1682-R6-293T细胞组。
(25)Y1682-R8-293T细胞的获得
按照上述步骤(7)的方法，将质粒Y1681替换为质粒Y1682，将A1替换为R8，其它步骤均不变，得到Y1682-R8-293T细胞组。
(26)Y1682-R10-293T细胞的获得
按照上述步骤(7)的方法，将质粒Y1681替换为质粒Y1682，将A1替换为R10，其它步骤均不变，得到Y1682-R10-293T细胞组。
2、各细胞的基因组DNA的提取和PCR扩增产物的回收
(1)用Genomic DNA Extraction kit分别提取步骤1获得的各细胞组的基因组DNA。
(2)完成步骤(1)后，以步骤(1)提取的Y1681-Y1640-293T细胞组、Y1681-293T细胞组、Y1681-Y1641-293T细胞组、Y1681-A1-293T细胞组、Y1681-A3-293T细胞组、Y1681-A5-293T细胞组、Y1681-A7-293T细胞组、Y1681-A9-293T细胞组、Y1681-R1-293T细胞组、Y1681-R3-293T细胞组、Y1681-R5-293T细胞组、Y1681-R7-293T细胞组或Y1681-R9-293T细胞组的基因组DNA为模板，以hAAV-F：
5’-GGGTCACCTCTCACTCCTTTCAT-3’和hAAV-R：5’-ATCCTCTCTGGCTCCATCGTAAG-3’组成的引物，用Max酶进行PCR扩增，得到475bp的PCR扩增产物甲。
(3)完成步骤(1)后，以步骤(1)提取的Y1682-Y1642-293T细胞组、Y1682-293T细胞组、Y1682-Y1643-293T细胞组、Y1682-A2-293T细胞组、Y1682-A4-293T细胞组、Y1682-A6-293T细胞组、Y1682-A8-293T细胞组、Y1682-A10-293T细胞组、Y1682-R2-293T细胞组、Y1682-R4-293T细胞组、Y1682-R6-293T细胞组、Y1682-R8-293T细胞组或Y1682-R10-293T细胞组的基因组DNA为模板，以hRosa26-F：
5’-AACCTCGACACCAACTCTAGTCC-3’和hRosa26-R：5’-TCTCACATGAGCGAAACCACTGC-3’组成的引物，用Max酶进行PCR扩增，得到670bp的PCR扩增产物乙。
3、T7E1突变检测
(1)样品的制备
①将PCR扩增产物甲进行胶回收，得到回收产物甲；将PCR扩增产物乙进行胶回收，得到回收产物乙。
②完成步骤①后，配制退火反应体系：退火反应体系包括回收产物甲或回收产物乙500ng、突变检测buffer 2μL，用ddH2O补至20μL。
③完成步骤②后，进行退火反应。反应条件为：首先98℃10min，然后缓慢降温(降温速度<1℃/10s)至25℃，最后25℃5min。
完成步骤③后的退火反应体系即为制备的样品。
(2)T7E1处理
取步骤(1)制备的样品20μL，加入0.5μL T7E1，得到处理体系；然后37℃条件下反应30min。
(3)电泳分析和结果判断
将完成步骤(2)的处理体系用浓度为2％的琼脂糖凝胶电泳分析，然后进行如下结果判断：
如果PCR扩增产物甲可被T7EⅠ酶切为两段且大小分别约为198bp和277bp、说明相应的CRISPR/Cpf1系统造成hAAVS1基因的突变；如果PCR扩增产物甲被T7EⅠ酶切后的大小无明显变化，则相应的CRISPR/Cpf1系统不造成hAAVS1基因的突变；
如果PCR扩增产物乙可被T7EⅠ酶切为两段且大小分别约为286bp和384bp、说明相应的CRISPR/Cpf1系统造成THUMPD3-AS1基因的突变；如果PCR扩增产物乙被T7EⅠ酶切后的大小无明显变化，则相应的CRISPR/Cpf1系统不造成THUMPD3-AS1基因的突变。
T7E1突变检测实验结果见图1(左上图为AsCRISPR/Cpf1系统中的hAAVS1基因的突变检测结果，其中M为DNA Marker，“－”为Y1681-293T细胞组，“+”为Y1681-Y1640-293T细胞组，A1为Y1681-A1-293T细胞组，A3为Y1681-A3-293T细胞组，A5为Y1681-A5-293T细胞组，A7为Y1681-A7-293T细胞组，A9为Y1681-A9-293T细胞组；左下图为AsCRISPR/Cpf1系统中的THUMPD3-AS1基因的突变检测结果，其中M为DNA Marker，“－”为Y1681-293T细胞组，“+”为Y1681-Y1641-293T细胞组，R1为Y1681-R1-293T细胞组，R3为Y1681-R3-293T细胞组，R5为Y1681-R5-293T细胞组，R7为Y1681-R7-293T细胞组，R9为Y1681-R9-293T细胞组；右上图为FnCRISPR/Cpf1系统中的hAAVS1基因的突变检测结果，其中M为DNA Marker，“－”为Y1682-293T细胞组，“+”为Y1682-Y1642-293T细胞组，A2为Y1682-A2-293T细胞组，A4为Y1682-A4-293T细胞组，A6为Y1682-A6-293T细胞组，A8为Y1682-A8-293T细胞组，A10为Y1682-A10-293T细胞组；右下图为FnCRISPR/Cpf1系统中的THUMPD3-AS1基因的突变检测结果，其中M为DNA Marker，“－”为Y1682-293T细胞组，“+”为Y1682-Y1643-293T细胞组，R2为Y1682-R2-293T细胞组，R4为Y1682-R4-293T细胞组，R6为Y1682-R6-293T细胞组，R8为Y1682-R8-293T细胞组，R10为Y1682-R10-293T细胞组)。
结果表明，化学合成的crRNA和化学合成且具有修饰的crRNA用于AsCRISPR/Cpf1系统或FnCRISPR/Cpf1系统均造成hAAVS1基因和THUMPD3-AS1基因的突变，但与仅化学合成的crRNA相比，化学合成且具有修饰的crRNA的基因编辑能力更强。
4、PCR扩增产物甲和PCR扩增产物乙的测序
将步骤2中(2)得到的PCR扩增产物甲进行测序，引物为hAAV-ce：
5’-cagctcccctaccccccttac-3’。将步骤2中(3)得到的PCR扩增产物乙进行测序，引物为hRosa26-ce：5’-cgcccagggaccaagttagc-3’。测序由苏州金唯智生物科技有限公司完成。
测序结果见图2(A为AsCRISPR/Cpf1系统中hAAVS1基因的测序结果，其中AsCpf1为Y1681-293T细胞组，AsCpf1+Plasmid AAVS1crRNA为Y1681-Y1640-293T细胞组，AsCpf1+A1为Y1681-A1-293T细胞组，AsCpf1+A3为Y1681-A3-293T细胞组，AsCpf1+A5为Y1681-A5-293T细胞组，AsCpf1+A7为Y1681-A7-293T细胞组，AsCpf1+A9为Y1681-A9-293T细胞组；B为FnCRISPR/Cpf1系统的hAAVS1基因的测序结果，其中AsCpf1为Y1682-293T细胞组，FnCpf1+Plasmid AAVS1crRNA为Y1682-Y1642-293T细胞组，FnCpf1+A2为Y1682-A2-293T细胞组，FnCpf1+A4为Y1682-A4-293T细胞组，FnCpf1+A6为Y1682-A6-293T细胞组，FnCpf1+A8为Y1682-A8-293T细胞组，FnCpf1+A10为Y1682-A10-293T细胞组；C为AsCRISPR/Cpf1系统中THUMPD3-AS1基因的测序结果，其中AsCpf1为Y1681-293T细胞组，AsCpf1+PlasmidTHUMPD3AS1crRNA为Y1681-Y1641-293T细胞组，AsCpf1+R1为Y1681-R1-293T细胞组，AsCpf1+R3为
Y1681-R3-293T细胞组，AsCpf1+R5为Y1681-R5-293T细胞组，AsCpf1+R7为
Y1681-R7-293T细胞组，AsCpf1+R9为Y1681-R9-293T细胞组；D为FnCRISPR/Cpf1系统中THUMPD3-AS1基因的测序结果，其中FnCpf1为Y1682-293T细胞组，FnCpf1+PlasmidTHUMPD3Fn1crRNA为Y1682-Y1643-293T细胞组，FnCpf1+R2为Y1682-R2-293T细胞组，FnCpf1+R4为Y1682-R4-293T细胞组，FnCpf1+R6为Y1682-R6-293T细胞组，FnCpf1+R8为Y1682-R8-293T细胞组，FnCpf1+R10为Y1682-R10-293T细胞组)。
结果表明，化学合成的crRNA和化学合成且具有修饰的crRNA用于AsCRISPR/Cpf1系统或FnCRISPR/Cpf1系统均造成hAAVS1基因和THUMPD3-AS1基因的突变，但与仅化学合成的crRNA相比，化学合成且具有修饰的crRNA的基因编辑能力更强。

Claims (10)

1.CRISPR/Cpf1系统在基因编辑中的应用；所述CRISPR/Cpf1系统中的crRNA为修饰crRNA。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述修饰的方式为脱氧核糖核酸修饰。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述脱氧核糖核酸修饰的方法为：在所述crRNA的5’末端增加1～3个脱氧核糖核酸和/或3’末端增加1～3个脱氧核糖核酸。
4.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于：所述脱氧核糖核酸为胸腺嘧啶脱氧核苷酸。
5.如权利要求1至4任一所述的应用，其特征在于：所述CRISPR/Cpf1系统为AsCRISPR/Cpf1系统或FnCRISPR/Cpf1系统。
6.一种定向编辑基因组的方法，包括如下步骤：
(1)根据受体基因组中预期进行定向编辑的靶基因设计crRNA；
(2)将所述crRNA进行修饰，得到修饰的crRNA；
(3)利用所述修饰的crRNA和编码Cpf1蛋白的基因对受体进行定向编辑。
7.一种定向编辑基因组的CRISPR/Cpf1系统，其特征在于：所述CRISPR/Cpf1系统中的crRNA为修饰crRNA。
8.如权利要求6所述的方法或权利要求7所述的系统，其特征在于：所述修饰的方式为脱氧核糖核酸修饰。
9.如权利要求6或8所述的方法，或，权利要求7或8所述的系统，其特征在于：所述脱氧核糖核酸修饰的方法为：在所述crRNA的5’末端增加1～3个脱氧核糖核酸和/或3’末端增加1～3个脱氧核糖核酸。
10.如权利要求6或8或9任一所述的方法，或，权利要求7或8或9任一所述的系统，其特征在于：所述脱氧核糖核酸为胸腺嘧啶脱氧核苷酸。
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