CN105018523A - 一种zb转座子系统及其介导的基因转移方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于动物基因工程领域；涉及一种斑马鱼ZB转座子系统及其介导的转基因方法，所述ZB转座子系统，来源于斑马鱼，包含可插入目的基因盒的两个末端重复序列的转基因供体质粒和提供转座活性的转座酶辅助质粒；所述的转基因供体质粒包括斑马鱼ZB转座子两侧末端重复序列和Msc1插入克隆位点。还公开了基于ZB转座子系统的基因转移方法，是通过ZB转座子系统将目的基因导入受体基因组。本发明可应用于多个生物技术领域：1)使用本发明中给出的方法可有效地将目的基因盒插入到宿主基因组中，提高基因转移效率；2)与基因捕获技术结合可以有效开展动物基因功能研究；3)可以介导进行人类基因治疗等。
Description
技术领域
本发明涉及建立一种基于斑马鱼ZB转座子系统介导的转基因方法，同时还公开了该方法涉及的转基因供体质粒和转座酶真核表达及体外转录辅助质粒的构建方法，及其在制备转基因动物、研究基因功能和人类基因治疗中的应用。本发明属于动物基因工程领域。
背景技术
基因转移是当前一项重要的生物技术手段，在研究基因功能、制备转基因生物和基因治疗等领域中具有重要的应用价值。
转座子是一类在基因组上可以自由跳跃(复制或移位)的移动DNA序列，首先由Mc.Clintock于20世纪40年代在玉米染色体中发现，以后又陆续在细菌、真菌及昆虫等各种生物中发现。科学家们利用转座子能够介导基因转移的特点发展完善了转座子介导细胞质显微注射方法，DNA转座系统中的转座酶含有核定位信号序列，可以介导目标基因顺利进入细胞核，注射可以不入核，直接进行细胞质注射。转座子介导细胞质显微注射技术正受到重视，并取得了一些令人鼓舞的进展，这可能是突破大型哺乳动物转基因技术瓶颈的新方法。
转座子除了可以有效提高以显微注射技术为基础的转基因动物的制备效率外，还可以用于人类基因治疗。基因治疗的主要步骤包括目的基因的克隆、基因转移、靶细胞的选择和临床试验观察等，其中基因转移是基因治疗的关键步骤。在基因治疗中转座子介导基因转移的优点是高效、安全。在过去十年中，转座子已发展为基因治疗中最常用的非病毒载体。除此之外，转座子还可以制备突变体，开展基因捕获，应用于功能基因组学研究。该技术近年来在人类基因治疗、鼠和斑马鱼等模式动物的转基因制备和功能基因组学研究上的已经取得重要进展。
DNA转座子介导的基因转移系统是新一代转基因技术，但具有自主转座活性的DNA转座子在脊椎动物中很少见。1996年，首次在白化青鏘(Oryziaslatipes)中发现具有天然活性的脊椎动物转座子，即Tol2转座子，该转座子已在模式生物斑马鱼转基因、基因和启动子捕获方面进行了较为广泛的应用。2008年，在金鱼中发现了第二例具有自主转座活性的Tgf2转座子，并且该转座子与青鏘Tol2转座子元件十分相似。
发明内容
本发明的目的在于提供一种斑马鱼ZB转座子以及基于该转座子系统介导的高效基因转移方法，提高鼠、斑马鱼等动物的转基因制备效率，并可以有效应用于细胞基因转染整合、人类基因治疗和基因捕获等研究领域。
本发明的ZB转座子，源自于斑马鱼(zebrafish)基因组，因此命名为“ZB”转座子。是一个具有转座活性的DNA转座子，隶属于Tc1/mariner家族。原始的ZB元件约1.4kb，两端各有一个对称的203bp的末端反向重复序列，中间为启动子和1026bp的编码转座酶序列。这种排列方式允许在TTAA核苷酸序列处以“剪切粘贴”机制介导转座进基因组。本发明所涉及的高效转基因方法就是建立在斑马鱼ZB转座子系统基础上。
本发明所述的ZB转座子系统来源于斑马鱼，主要由ZB转座子供体质粒和ZB转座酶辅助质粒构成。
本发明所述的转基因供体质粒(pZB-Msc)包括斑马鱼ZB转座子两侧末端重复序列和Msc1插入克隆位点，插入克隆位点可以插入需要转移的目的基因盒，该供体质粒的序列如SEQ ID No.1所示。序列中IR/DR(L)133-350，IR/DR(R)363-572，ColE Origin 912-1792，Amp CDS 1856-2513，F1Origin 2844-3300。
本发明所述的斑马鱼ZB转座子两侧末端重复序列来源于斑马鱼基因组活性转座子TC1/Mariner家族，侧冀末端重复序列长为203个核苷酸序列，序列如SEQ ID No.2所示。
本发明所述的目的基因盒可以是报告基因表达盒，或者其它外源基因表达盒，或者基因捕获元件。
本发明所述的ZB转座酶辅助质粒包括两种形式，一种是可以在细胞和体内直接表达转座酶的pCMV-ZB真核表达质粒，另一种是pTNT-ZB体外转录辅助质粒，可以进行体外转录形成5’加帽ZB转座酶的mRNA。
本发明所述的pCMV-ZB真核表达质粒包括病毒启动子序列(CMV)和ZB转座酶cDNA序列和SV40多聚腺苷酸(PolyA)组成；载体构架来自pCMV-SB100X载体，所述病毒启动子序列(CMV)长度为523个核苷酸序列，能够指导下游基因的表达；所述ZB转座酶cDNA序列克隆自斑马鱼，长度为1026个核苷酸序列；所述SV40多聚腺苷酸(PolyA)长度为120个核苷酸序列，该载体能够自主表达转座酶，该载体的序列如SEQ ID No.3所示。
本发明所述的pTNT-ZB体外转录辅助质粒包括Sp6、T7启动子、ZB转座酶cDNA序列和T7转录终止序列(terminator)组成；载体构架来自pTNT载体，所述Sp6启动子长度为18个核苷酸序列，T7启动子长度为19个核苷酸序列；所述ZB转座酶cDNA序列克隆自斑马鱼，长度为1026个核苷酸序列；所述T7转录终止序列长度为36个核苷酸序列，载体能够利用mMessagemMachine kit(购自Ambion公司)试剂盒进行ZB转座酶5’加帽mRNA的体外转录，该载体的序列如SEQ ID No.4所示。
本发明提供的基于斑马鱼ZB转座子系统的基因转移方法，经过细胞和胚胎水平验证能够高效介导基因转移，可应用于多个生物技术领域：1)使用本发明中给出的方法可有效地将目的基因盒插入到宿主基因组中，提高基因转移效率；2)与基因捕获技术结合可以有效开展动物基因功能研究；3)可以介导进行人类基因治疗等。
附图说明
图1：pCMV-ZB质粒图谱；
图2：PCR扩增ZB-ORF产物电泳图；
图3：pCMV-ZB质粒酶切产物电泳图；
图4：pTNT-ZB质粒图谱；
图5：pTNT-ZB质粒酶切产物电泳图；
图6：pZB-Msc质粒图谱；
图7：PCR扩增ZB 3’产物电泳图；
图8：PCR扩增ZB 5’产物电泳图；
图9：pT3-ZB-5质粒酶切产物电泳图；
图10：pZB-Msc质粒酶切产物电泳图；
图11：pZB-CAG-GFP质粒酶切产物电泳图；
图12：PCR扩增PGK-NEO-bGHpA产物电泳图；
图13：pZB-PGK-NEO质粒酶切产物电泳图；
图14：MEF细胞G418抗性筛选阳性克隆图；
图15：ZB转座子系统介导转基因小鼠胚胎荧光图；
图16：不同转座酶浓度显微注射斑马鱼胚胎24h后荧光图；
图17：不同转座酶浓度显微注射斑马鱼胚胎5d后荧光图；
图18：不同转座酶浓度斑马鱼阳性率结果图。
具体实施方式
下述实施例中提到的实验方法，如无特别说明均为常规方法。
实施例I、转座酶表达载体pCMV-ZB和转座酶体外转录载体pTNT-ZB的构建
1、ZB转座酶编码区(ORF)的克隆
以斑马鱼基因组DNA为模板，按表1中列举的扩增ZB-ORF的引物扩增转座酶基因片段。反应体系为50μl，10μL 5×SF Buffer、1μl dNTP、2μL 10μM引物ZB-ORF F、2μl 10μM引物ZB-ORF R(引物序列：ZB-ORF-F：ttCTCGAGACTAGTgccaccatgatgggtaaaaacaaagaactc(SEQ ID NO.5)；ZB-ORF-R：atGGTACCGGGCCCttaatactttgtagaaaagcctt(SEQ ID NO.6))、1μl PhantaTM Super-Fidelity，1μl斑马鱼基因组DNA模板，加超纯水至50μl(高保真酶购自诺唯赞公司)。PCR扩增程序：94℃40s，55℃40s，72℃1m30s，循环30次。PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测(如图2)。将PCR产物琼脂糖凝胶回收，与T载体连接，进行TA克隆，筛选出阳性克隆测序，测序比对正确后保存供下一步连接用。
2、转座酶真核表达质粒pCMV-ZB的构建
用限制性内切酶Spe1和Apa1将ORF从T载体中切出，琼脂糖凝胶回收。同时用Spe1和Apa1双酶切pCMV-SB100X(pCMV-SB100X[1]由Max Delbrück Center for Molecular Medicine,Berlin,Germany.Zsuzsanna Izsva′k教授赠送)，切胶回收3700bp片段作为载体框架。将ORF和载体框架连接后，转化感受态细胞Top10，挑单菌落至液体培养基LB培养，提质粒进行电泳及酶切鉴定(如图3)，阳性克隆者命名为pCMV-ZB，pCMV-ZB质粒图谱如图1所示。
3、转座酶体外转录辅助质粒pTNT-ZB的构建
用限制性内切酶Xho1和Kpn1将ORF从T载体上切出，琼脂糖凝胶回收。同时用Xho1和Kpn1双酶切pTNT载体(pTNT载体为商品化质粒，购自Promega公司)，切胶回收2850bp片段。将上述1026bp和2850bp片段连接后，转化感受态细胞Top10，挑单菌落至液体培养基LB培养，提质粒进行电泳及酶切鉴定(如图5)，阳性克隆者命名为pTNT-ZB，pTNT-ZB质粒图谱如4所示。
实施例II、转座子表达载体的构建
1、转基因供体质粒pZB-Msc载体构建
1.1pT3-PST载体的构建
首先采用高保真PCR法以PB[2]、SB[1]及Tol2[3]质粒载体为模板，克隆5’和3’转座元件，引物序列：
SBF：ATGgatccatttaaatggcgcgccgtttaaaccagttgaagtcggaagttta(SEQ ID NO.7)；
SBR：GAGgatccatttaaatggccggccttaattaacagttgaagtcggaagttta(SEQ ID NO.8)；
5’PBF：atggcgcgccttaaccctagaaagatagtctg(SEQ ID NO.9)；
5’PBR：acgtttaaac tgatatctataacaagaaaatata(SEQ ID NO.10)；
3’PBF：gcttaattaagtttaaactaaaagttttgttactttatagaag(SEQ ID NO.11)；
3’PBR：atggccggccttaaccctagaaagataatcatattg(SEQ ID NO.12)；
5’Tol2F：CGAAGCTTAGGCCTCAGAGGTGTAAAGTACTTGAGTA(SEQ ID NO.13)；
5’Tol2R：GCTTGAATTCCCCGGGGCTAGCAAGTGATCTCCAAAAAATAAGTAC(SEQ ID NO.14)；
3’Tol2：GATGGCCATCGCGAGCTAGCAATACTCAAGTACAATTTTAATGGAG(SEQ ID NO.15)；
3’Tol2R：GCTGAGATCTAGGCCTCAGAGGTGTAAAAAGTACTCAA(SEQ ID NO.16)；
PT3-SB-F：gttttcccagtcacgacgtt(SEQ ID NO.17)；
PT3-SB-R：accatgattacgccaagctc(SEQ ID NO.18)
测序正确后，将各元件通过限制性内切酶位点按顺序先后克隆至质粒载体pT2-HB(pT2-HB为商品化质粒，购自Addgene公司)，获得含三种转座元件的重组载体，经电泳和酶切鉴定正确后，将此多转座子载体命名为pT3-PST。
1.2ZB两个末端反向重复元件(ZB 3’和5’)的克隆
TA克隆方法同上，用高保真PCR法从斑马鱼基因组中扩增ZB 3’和5’转座元件；(引物序列：
ZB-3F：atTCGCGAgtaaagtgtgttcaatacttatt；(SEQ ID NO.19)
ZB-3R：atGGCCGGCCatacagcggggaaaataagtat；(SEQ ID NO.20)
ZB-5F：atGGCGCGCCtacagcggggaaaataagta；(SEQ ID NO.21)
ZB-5R：at TGGCCAGCTAGCTCGCGA tcaTGTGTTCAATACTTATTC，(SEQ ID NO.22)
扩增结果如图7、8，进行TA克隆，筛选出阳性克隆测序，序列比对正确后保存供下一步连接用。
1.3pT3-ZB-5载体构建
用限制性内切酶Asc 1和Msc1将ZB 5’端转座元件(236bp)从T载体上切出，琼脂糖凝胶回收。同时用Asc 1和Msc1酶切pT3-PST，切胶回收3688bp DNA片段作为载体框架。上述回收的ZB 5’端转座元件和载体框架连接，连接产物转化感受态细胞Top10，挑单菌落至液体培养基LB培养，提质粒进行电泳及酶切鉴定(如图9)，阳性克隆者命名为pT3-ZB-5。
1.4pZB-Msc载体构建
用限制性内切酶Nru1和Fse1将ZB 3’端转座元件(210bp)从T载体上切出，琼脂糖凝胶回收。同时用Nru1和Fse1酶切pT3-ZB-5，切胶回收3180bp DNA片段作为框架。将上述3180bp和210bp片段连接后转化感受态细胞Top10，挑单菌落至液体培养基LB培养，提质粒进行电泳及酶切鉴定(如图10)，阳性克隆者命名为pZB-Msc，pZB-Msc质粒图谱如图6所示。
2、转座子载体pZB-CAG-GFP的构建
2.1pT3-PST-CAG-GFP的构建
用平端限制性内切酶ScaI和PsiI酶切绿色荧光蛋白载体pCAG-GFP(pCAG-GFP为商品化质粒，购自Addgene公司)，琼脂糖凝胶回收。同时用平端限制性内切酶MscI酶切pT3-PST载体，回收约4.6kb的DNA片段作为载体框架。将上述回收的pCAG-GFP绿色荧光蛋白载体和pT3-PST框架16℃过夜连接后，转化感受态细胞Top10，提质粒进行电泳及酶切鉴定，阳性克隆者命名为pT3-PST-CAG-GFP。
2.2pZB-CAG-GFP的构建
用限制性内切酶Swa1和Nhe1将CAG-GFP表达框从pT3-PST-CAG-GFP上切出，琼脂糖凝胶回收。用补平酶将目的片段两端补平。用限制性内切酶Msc1切pZB-Msc，回收约3.4kb框架，将目的片段表达框和载体框架连接，转化感受态细胞Top10，挑单菌落至液体培养基LB培养，提质粒进行电泳及酶切鉴定(如图11)，阳性克隆者命名为pZB-CAG-GFP。
3、转座子载体pZB-FAG-GFP的构建
3.1RP2-GFP-polyA的构建
TA克隆方法同上，用高保真PCR法从pCAG-GFP质粒中扩增polyA元件(引物序列：PolyA-F：ATCGATCGGCCGCACTCCTCAGGTGC(SEQ ID NO.23)；PolyA-R：ATCGATGCTAGC AGCTTGGGCTGCAGGTCGAG(SEQID NO.24))，测序正确后，用限制性内切酶Cla I将Poly A(568bp)从TA克隆载体中切出，琼脂糖凝胶回收。用限制性内切酶Cla I酶切pGBT-RP2-1载体(商品化质粒，购自Addgene公司)，回收约9.1kb的DNA片段作为载体框架，将目的片段表达框和载体框架连接，转化感受态细胞Top10，挑单菌落至液体培养基LB培养，提质粒进行电泳及酶切鉴定，阳性克隆者命名为RP2-GFP-polyA。
3.2pZB-FAG-GFP的构建
用限制性内切酶Nhe1将β-actin-GFP-polyA表达框从RP2-GFP-polyA切出，琼脂糖凝胶回收。用补平酶将目的片段两端补平。用限制性内切酶Msc1酶切pZB-Msc，回收约3.4kb框架，将目的片段表达框和载体框架连接，转化感受态细胞Top10，挑单菌落至液体培养基LB培养，筛选到阳性克隆后测序鉴定，克隆序列与原基因同源性100％，阳性克隆者命名为pZB-FAG-GFP。
4、转座子载体pZB-PGK-NEO的构建
4.1pT3-PGK-NEO的构建
用高保真PCR法从PB-SB-PGK-NEO-bpA[4]转座子载体扩增NEO基因(引物序列：NEO-B-F：AACCCGGGGCTTGGCTGCAGGTCGTCG(SEQ ID NO.25)；NEO-A-R：CTGAATTCTCCCCAGCATGCCTGCTATT(SEQ IDNO.26))，进行TA克隆，筛选出阳性克隆测序正确后保存。用XmaI和EcoRI同时酶切的NEO TA克隆载体及pT3-PST多转座子载体，16℃过夜连接后，转化感受态细胞Top10，经电泳及酶切鉴定后，阳性克隆者命名为pT3-PGK-NEO。
4.2PGK-NEO-bGHpA的克隆与鉴定
TA克隆方法同上(引物序列：NEO-F：AATCgCgAgCTTggCTgCAggTCgTCg(SEQ ID NO.27)；NEO-R：CTTCgCgATCCCCAgCATgCCTgCTATT(SEQ ID NO.28))，从pT3-PGK-NEO载体中克隆获得PGK-NEO-bGHpA(如图12)，利用引物两端的Spe1和Apa1酶切位点进行酶切鉴定，可切出预期大小的片段。测序结果表明克隆序列与原基因同源性100％，说明已获得PGK-NEO-bGHpA元件。
4.3pZB-PGK-NEO的构建
用Nru1酶切PGK-NEO-bGHpA TA克隆载体，回收1659bp的PGK-NEO-bGHpA表达框。用Msc1酶切pZB-Msc载体，回收3.4kb的载体框架，连接后经PCR扩增目的片段及酶切鉴定(如图13)，结果表明克隆序列与原基因同源性100％，阳性克隆者命名为pZB-PGK-NEO。
实施例III、ZB转座子介导目的基因在小鼠细胞水平表达检验
1、冻存细胞的复苏与培养
pZB-PGK-NEO和pCMV-ZB质粒用OMEGA无内毒素质粒提取试剂盒(购自OMEGA公司)提取，产物终浓度调整为500ng/μL用于细胞转染。
从液氮中取出装有小鼠胚胎成纤维细胞MEF(购自中国科学院细胞库)、小鼠C2C12细胞和猪PK15细胞的冻存小管，立即投入37-40℃的温水中快速晃动，直至冻存液完全融解；在1-2min内完成复温；将细胞悬液移入无菌的离心管，加入5mL培养液，轻轻吹匀；将细胞悬液800-1000rpm离心5min，弃上清；向含有细胞沉淀的离心管加入1mL完全培养基，轻轻吹匀，将细胞悬液转入细胞培养瓶，加入适量的完全培养基进行培养。
2、细胞转染与筛选
将小鼠胚胎成纤维细胞MEF分成2组，各组分别转染转染pZB-PGK-NEO：pCMV-ZB/pcDNA3(pcDNA3质粒为商品化质粒，购自life公司)，每组3个重复。
转染前24h，向每孔含10％胎牛血清(购自GIBCO公司)的2000μLDMEM高糖培养基(购自GIBCO公司)的6孔板中按5×105个细胞/孔接种MEF细胞，使细胞在转染前达到约90％的汇合；将2种质粒按照1：1质量比混和稀释于用50μL的无血清、无抗生素的培养基中，并温和地混匀；使用前将多聚阳离子PEI温和摇匀，将2μL PEI加入50μL的无血清、无抗生素的DMEM培养基并轻轻混匀，于室温孵育5min；5min后，分别将50μL的PEI稀释液加入50μL的各组DNA稀释液中，轻轻混匀并于室温放置20min；将100μL混合物加入到准备好的孔内，轻轻来回晃动培养板，将其置于37℃、饱和湿度、5％CO2的培养箱中培养，于4h后用完全培养基代替转染培养基，完全培养24-48h后，将10％的细胞接种于10cm培养皿中培养，当细胞达50-60％汇合时，加入浓度为500μg/mL的G418筛选培养液，筛选10-12天。用Gimsa染液(购自GIBCO公司)染色，统计阳性克隆数。
3、转染细胞阳性克隆鉴定
以pZB-PGK-NEO和pcDNA3共转染为对照组，pZB-PGK-NEO和pCMV-ZB共转染为实验组，含G418抗性培养液筛选10-12天后，Gimsa染色计数。结果发现：实验组阳性克隆数为27，实验组阳性克隆数为0，实验组的细胞表达新霉素抗性基因的细胞数量显著高于对照组(如图14)。结果表明斑马鱼ZB转座子系统能在小鼠成纤维细胞中高效的介导新霉素抗性基因转染整合，即用抗性基因证实了ZB转座子系统有介导基因转移的功能。
实施例IV、ZB转座子介导目的基因在小鼠胚胎中的基因转移
1、小鼠受精卵的准备
成熟雌小鼠腹腔内注射5国际单位(IU)的孕马血清促性腺激素(PMSG)之后，约在48—54h后再注射2.5-5.0IU的人绒毛膜促性腺激素(hCG)，约12h后即可诱发排卵。雌小鼠给予hCG后立刻与雄性小鼠合笼。交配后雌鼠的阴道栓易见，可用交配指示剂指示。受精卵于合笼后次晨显微注射前几小时收集。将输卵管仔细切开，采用输卵管冲洗术或输卵管壶部切开术收集受精卵。
2、细胞质显微注射小鼠受精卵
pZB-CAG-GFP和pCMV-ZB质粒用OMEGA无内毒素质粒提取试剂盒提取，以线性pTNT-ZB为模板，用mMessagemMachine kit试剂盒制备ZB-mRNA，产物终浓度调整为20ng/μL，pZB-CAG-GFP和pCMV-ZB/ZB-mRNA以1:1摩尔比混合备用。
注射分3组，pZB-CAG-GFP和pCMV-ZB/ZB-mRNA混合注射为实验组，pZB-CAG-GFP质粒单注射为对照组，每组3个重复，其中转座子质粒为环状。
细胞质显微注射小鼠受精卵，注射后约4d待胚胎发育至囊胚期后，用倒置荧光显微镜检测胚胎绿色荧光表达情况。
3、小鼠囊胚绿色荧光表达情况鉴定
荧光显微镜观察结果显示3组胚胎均有荧光，同等培养条件下，加转座酶质粒组、转座酶mRNA组和未加转座酶组的阳性胚胎率分别为41.07％、50％和1.7％，加转座酶组的荧光胚胎数均多于未加转座酶组，且前者荧光强度大于后者(如图15)。结果表明斑马鱼ZB转座子系统能在小鼠胚胎高效的介导绿色荧光蛋白基因转移，即在小鼠胚胎上证实了ZB转座子系统有介导基因转移的功能。
实施例V、ZB转座子介导目的基因在斑马鱼胚胎中的基因转移
1、斑马鱼受精卵的准备
公母鱼各饲养若干，于注射前一天晚上，移取2尾母鱼，1尾公鱼于繁殖盒中，隔板隔开培养，光刺激1h后避光过夜培养，第二天将隔板拿开，公母鱼追逐即开始产卵，自产卵开始计时，约10min后收卵，将收集的受精卵置于体视显微镜下进行斑马鱼胚胎注射实验。
2、显微注射斑马鱼胚胎
pZB-FAG-GFP质粒用无内毒素质粒提取试剂盒提取，产物终浓度调整为20ng/μL用于显微注射。
将pZB-FAG-GFP质粒和ZB转座酶mRNA以不同浓度混合注射斑马鱼一细胞期胚胎。固定转座子质粒终浓度为20ng/μL，ZB-mRNA的终浓度设5个梯度：0/10/30/50/100ng/μL，同时以未处理(即未注射组)为空白对照组。每组3个重复，每个重复注射胚胎数均在100枚以上。将注射后的胚胎于1×E3培养液中培养，12-24h换液一次，换液的同时去除死亡胚胎，空白对照组按照同样的方法培养。分别在培养24h和5d后于荧光显微镜下观察绿色荧光表达情况，同时统计成活胚胎数和阳性胚胎数，计算阳性率。
3、不同浓度转座酶介导目的基因表达检测
在荧光显微镜下检测荧光表达情况，结果显示实验组的各组胚胎在显微注射后24h和5d时两个时间段都有荧光表达，空白对照组没有荧光(如图16、17)。注射不同转座酶浓度，斑马鱼表达绿色荧光蛋白的阳性率不同；当转座酶浓度为0ng/μL时，其阳性率显著低于添加转座酶各组的阳性率；当转座酶浓度为50ng/μL时，注射后24h和5d的阳性率最高(如图18)。结果表明斑马鱼ZB转座子系统同样能在斑马鱼胚胎高效的介导绿色荧光蛋白基因转移，即在斑马鱼胚胎上证实了ZB转座子系统有介导基因转移的功能，并且转座酶浓度不同，基因转移效率不同。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是为了说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
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Claims (8)
1.一种ZB转座子系统，其特征在于，来源于斑马鱼，包含可插入目的基因盒的两个末端重复序列的转基因供体质粒和提供转座活性的转座酶辅助质粒；所述的转基因供体质粒包括斑马鱼ZB转座子两侧末端重复序列和Msc1插入克隆位点。
2.根据权利要求1所述的基于ZB转座子系统，其特征在于，所述供体质粒的序列如SEQID No.1所示。
3.根据权利要求1所述的基于ZB转座子系统，其特征在于，所述的转座酶辅助质粒包括两种形式，一种是可以在细胞和体内直接表达转座酶的pCMV-ZB真核表达质粒，另一种是pTNT-ZB体外转录辅助质粒，可以进行体外转录形成5’加帽ZB转座酶的mRNA。
4.根据权利要求1所述的ZB转座子系统，其特征在于，所述的目的基因盒，是报告基因表达盒，或者其它外源基因表达盒，或者基因捕获元件。
5.根据权利要求3所述的ZB转座子系统，其特征在于，所述的真核表达质粒pCMV-ZB的构建是将ZB转座酶ORF阅读框DNA序列与CMV启动子连接，构建表达转座酶的辅助质粒。
6.根据权利要求3所述的ZB转座子系统，其特征在于，所述的体外转录辅助质粒pTNT-ZB的构建是将ZB转座酶ORF阅读框DNA序列与Sp6启动子、T7启动子、T7转录终止序列连接，构建可以体外转录转座酶的辅助质粒。
7.根据权利要求6所述的ZB转座子系统，其特征在于，所述的转座酶体外转录辅助质粒(pTNT-ZB)载体能够利用mMessagemMachine kit试剂盒进行ZB转座酶5’加帽mRNA的体外转录。
8.一种基于权利要求1所述ZB转座子系统的基因转移方法，其特征在于，是通过ZB转座子系统将目的基因导入受体基因组。
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