CN105002215A - 一种含有可调控表达的cre重组酶基因和报告基因LacZ的表达载体及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种含有可调控表达的cre重组酶基因和报告基因LacZ的表达载体及其构建方法和应用，属于生物技术领域。本发明的表达载体为pBI-3-LacZ-cre，且该表达载体中含有LacZ报告基因、Cre重组酶基因及双向启动子tetO元件。本发明将表达载体pBI-3-LacZ-cre导入小鼠输卵管内进行妊娠，获得转基因小鼠。将该转基因小鼠与正在应用的两种模型动物可诱导肝脏特异性表达rtTA分子的rTA^LAP-1小鼠和可调控表达HBV基因组的HBV？Tg(Transgenic)小鼠进行杂交后，经反复交配最终得到肝脏可诱导表达的Tet-on联合Cre/loxP的双调控策略的三转基因小鼠新模型。本发明能够有效应用于HBV抑制剂或药物的筛选和评价、HBV的致病机制以及HBV感染后宿主免疫反应等关键问题的研究。

Description

一种含有可调控表达的cre重组酶基因和报告基因LacZ的表达载体及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种真核表达载体及其构建方法，具体涉及一种含有可调控表达的cre重组酶基因和报告基因LacZ的表达载体及其构建方法和应用。

背景技术

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染仍然是全球性的公共卫生问题，估计全世界HBV携带者高达3.5亿。我国是乙型肝炎高流行区，人群HBV携带率约为10％，其中部分慢性肝炎患者可演变成肝硬化或肝癌。

HBV的致病机制尚未完全清楚。HBV侵入机体后，主要在肝细胞内复制产生完整的病毒颗粒并分泌或表达表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg)以及核心抗原(HBcAg)等病毒抗原成分。在血液或肝细胞膜上的病毒抗原可诱导机体产生特异性的细胞免疫和体液免疫应答。大量的研究结果表明，机体对HBV的免疫效应具有双重性：既可清除病毒，也可造成肝细胞的损伤。

HBV的体外实验模型目前采用的是病毒DNA转染的细胞培养系统，可用于筛选抗HBV药物。由于HBV具有较高的宿主特异性，只能自然感染人和黑猩猩等灵长类动物。黑猩猩感染HBV后可出现类似人急性肝炎的免疫病理变化，是乙型肝炎比较理想的动物模型，但其来源困难且价格昂贵，无法推广使用。近年来有学者发现与黑猩猩种系发生关系较为接近的树鼩也可以感染HBV，但目前研究显示树鼩的实验室HBV感染率偏低，而且通常只表现为轻度的暂时性HBV感染，体内病毒滴度不高。此外，鸭乙型肝炎病毒(DHBV)与土拨鼠肝炎病毒(WHV)等可在其相应的天然宿主中形成类似人乙型肝炎的感染，特别是DHBV因其动物宿主来源方便，在国内、外被广泛采用。但上述动物模型在实际应用中也存在明显的缺点：①体型均较大，实验室饲养和操作不便，而且通常不易获得；②均为远交系动物，遗传和免疫学背景不清；③不同种动物肝炎病毒在基因组结构等多个方面与人HBV存在较大差异，特别是鸭乙型肝炎病毒。因此长期以来由于缺乏理想的小动物模型，有关HBV致病机制等关键问题的研究受到很大影响。

小鼠具备遗传和免疫学背景清楚等多方面的优点，因此HBV小鼠模型的建立一直是HBV研究的热点和难点之一，特别是HBV转基因小鼠模型的研究被认为是解决HBV宿主特异性这一难题非常有前途的方法之一。但目前的HBV转基因小鼠模型存在的最大缺点是：小鼠从胚胎发育阶段就开始持续性地表达病毒抗原，导致小鼠出生后对病毒抗原无法产生免疫应答，即小鼠对HBV处于完全免疫耐受状态，小鼠的肝脏也不能产生类似人乙型肝炎的免疫病理变化，这就大大削弱了转基因小鼠模型在HBV的致病机制，以及HBV感染后宿主免疫反应等关键问题研究方面的应用价值。因此，转基因小鼠模型对HBV的免疫耐受难题不解决，必将大大削弱转基因小鼠在HBV感染的致病机理以及HBV感染后宿主免疫反应等关键问题研究方面的应用价值。

为了克服上述缺点科研人员开发出了多种可调控型的转基因技术。其中Bujard等建立的四环素调控系统是目前最具代表性的条件性基因表达调控系统之一，这个系统包括早期开发的Tet-off系统和经过改进的Tet-on系统两种类型。虽然Tet-on系统在降低rtTA毒性以及提高反应速度等方面较Tet-off系统均有了很大提高，但该系统的漏过性表达(即未诱导时的背景表达)问题只是较Tet-off系统有所改善而已，单纯应用Tet-on系统仍然难以克服胚胎期免疫耐受难题。

综上所述，建立一种既可以突破胚胎期免疫耐受，又可以使HBV在体内长期、稳定复制的HBV转基因小鼠模型，用于对HBV致病机制、抗病毒药物和疫苗的筛选，对早日解决HBV对人类健康的危害都非常重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种含有可调控表达的cre重组酶基因和报告基因LacZ的表达载体及其构建方法和应用。

本发明是通过以下技术方案来实现：

本发明公开了一种含有可调控表达的cre重组酶基因和报告基因LacZ的表达载体，该表达载体为pBI-3-LacZ-cre，且该表达载体中含有LacZ报告基因、cre重组酶基因及双向启动子tetO元件。

所述cre重组酶基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

本发明还公开了一种含有可调控表达的cre重组酶基因和报告基因LacZ的表达载体的构建方法，该真核表达载体pBI-3的双向启动子tetO的一侧为LacZ报告基因，在另一侧插入cre重组酶基因，构建得到真核表达载体pBI-3-LacZ-cre。

优选地，该含有可调控表达的cre重组酶基因和报告基因LacZ的表达载体的构建方法，包括以下步骤：

1)以引物对P1为引物，以包含cre重组酶基因的pET32a-cre载体为模板，PCR扩增基因，得到cre重组酶基因扩增片段；

2)用限制性内切酶PstⅠ和SalⅠ双酶切表达载体pBI-3-LacZ并回收大片段产物，将cre重组酶基因扩增片段用限制性内切酶PstⅠ和SalⅠ进行双酶切，并回收产物；

3)将步骤2)酶切回收的两个产物用T₄DNA连接酶连接，得到含有可调控表达的cre重组酶基因和报告基因LacZ的表达载体pBI-3-LacZ-cre。

步骤1)所述的引物对P1为：

上游引物：AACTGCAGGCCACCATGGCCAATTTACTG；

下游引物：ACGCGTCGACCTAATCGCCATCTTCCAGCAG；

步骤2)所述的大片段产物包含插入的cre重组酶基因和调控元件，大小为7521bp。

所述cre重组酶基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

本发明还公开了含有可调控表达的cre重组酶基因和报告基因LacZ的表达载体在抗HBV抑制剂筛选中的应用。

本发明还公开了一种构建肝脏可诱导表达的Tet-on联合Cre/loxP的双调控策略的三转基因小鼠的方法，首先，将权利要求1所述的表达载体导入小鼠输卵管内进行妊娠，获得转基因小鼠；然后，将可诱导肝脏特异性表达rtTA分子的rTA^LAP-1转基因小鼠、可调控表达HBV基因组的HBV Tg小鼠和转基因小鼠进行杂交，经反复交配，得到肝脏可诱导表达的Tet-on联合Cre/loxP的双调控策略的三转基因小鼠。

在可诱导肝脏特异性表达rtTA分子的rTA^LAP-1转基因小鼠的表达载体中含有肝脏特异性启动子和rtTA元件。

可调控表达HBV基因组的HBV Tg小鼠的表达载体为pBI-3-Luc-pA-HBVTg-EGFP，含有LacZ报告基因-双向启动子tetO-loxP-Luciferase-polyA-loxP-HBVTg-IRES-EGFP报告基因的元件。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明公开了一种含有可调控表达的cre重组酶基因和报告基因LacZ的表达载体及其构建方法，该表达载体中含有LacZ报告基因、cre重组酶基因及双向启动子tetO元件。该表达载体的cre重组酶基因的表达需要在盐酸强力霉素(Dox)诱导其他载体表达的rtTA分子与tetO双向启动子特异性结合后启动，tetO双向启动子一端可启动cre重组酶基因表达，另一端可启动报告基因LacZ的表达。该表达载体可应用于由rtTA分子启动的cre重组酶基因表达的所有基于Cre/loxP重组酶条件性敲除的系统，并且该cre重组酶基因的表达可由LacZ报告基因的表达进行观察。

本发明还公开了基于表达载体pBI-3-LacZ-cre构建肝脏可诱导表达的Tet-on联合Cre/loxP的双调控策略的三转基因小鼠的方法，是将表达载体pBI-3-LacZ-cre导入小鼠输卵管内进行妊娠，获得转基因小鼠。将该转基因小鼠与正在应用的两种模型动物可诱导肝脏特异性表达rtTA分子的rTALAP-1小鼠和可调控表达HBV基因组的HBV Tg(Transgenic)小鼠进行杂交后，经反复交配最终得到肝脏可诱导表达的Tet-on联合Cre/loxP的双调控策略的三转基因小鼠新模型。该三转基因小鼠模型在受到Dox调控诱导后Cre重组酶被启动表达，并特异性切除两个loxP位点间的polyA终止序列，同时rtTALAP-1中的rtTA分子与tetO双向启动子特异性结合，HBV基因以及其后的内部核糖体进入位点序列IRES和荧光蛋白EGFP报告基因同时开始表达。由此，HBV基因组得以在肝脏靶向性表达，此时表达的病毒抗原是后天人工诱导产生的，机体可以产生针对病毒不同抗原的细胞和体液免疫应答以及相应的免疫病理变化，其诱导的生理病理变化更接近HBV自然感染动物，突破现有HBV转基因小鼠胚胎期免疫耐受难题，实现对HBV体内复制的调控，可应用于HBV抑制剂或药物的筛选和评价、HBV的致病机制以及HBV感染后宿主免疫反应等关键问题的研究。

附图说明

图1为pBI-3-cre-LacZ表达载体主要元件顺序图；

图2为pBI-3表达载体质粒图谱；

图3为表达载体pBI-3-Luc-pA-HBVTg-EGFP元件顺序图；

图4为PCR扩增的cre基因的凝胶电泳结果图；

图5为pBI-3空载体和PCR扩增后的cre基因分别被PstⅠ和SalⅠ双酶切的电泳结果图；

图6为pBI-3-LacZ-cre表达载体的PstⅠ和SalⅠ双酶切鉴定结果图；

图7为Western检测pBI-3-LacZ-cre表达载体在真核细胞HepG2内被诱导表达结果图；

图8为pBI-3-LacZ-cre(PBI3C)表达载体的Ase I酶切鉴定结果图；

图9为PCR鉴定Cre单转基因小鼠的阳性结果。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

针对现有技术中的不足，发明人致力于研究可突破HBV转基因小鼠胚胎期免疫耐受，并且能够利用活体成像技术直观观测目标基因表达效果的新型HBV感染动物模型。本发明把正在应用的两种模型动物可诱导肝脏特异性表达rtTA分子的rTALAP-1小鼠和可调控表达HBV基因组的HBV Tg(Transgenic)小鼠与本发明的小鼠模型进行杂交，经反复交配最终得到肝脏可诱导表达的Tet-on联合Cre/loxP的双调控策略的三转基因小鼠新模型，可以阻止HBV基因组在未诱导时的漏过性表达。由于rTALAP-1小鼠已经带有Luc报告基因，为与之区别本发明将PBI-3-cre质粒载体的报告基因改为LacZ报告基因。

本发明是通过以下技术方案来实现：

依据本发明提供的一种含有可调控表达的cre重组酶基因和报告基因LacZ的表达载体，该表达载体为pBI-3-LacZ-cre表达载体，且载体中含有LacZ报告基因、Cre重组酶基因及双向启动子tetO元件。

所述的表达载体pBI-3-LacZ-cre的构建为：

1)在真核表达载体pBI-3的双向启动子tetO的一侧为LacZ报告基因，另一侧插入cre重组酶基因，构建真核表达载体pBI-3-LacZ-cre(如图1所示)。

Cre重组酶基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；

2)以引物对P1为引物，以包含cre基因的pET32a-cre载体为模板，PCR扩增基因；所述的引物对P1为：

上游引物：AACTGCAGGCCACCATGGCCAATTTACTG 29bp

下游引物：ACGCGTCGACCTAATCGCCATCTTCCAGCAG 31bp

3)用PstⅠ和SalⅠ双酶切表达载体pBI-3-LacZ并胶回收大片段，同样用PstⅠ和SalⅠ双酶切cre重组酶基因扩增片段并胶回收产物，将两者产物用T₄DNA连接酶连接，得到表达载体pBI-3-LacZ-cre。

本发明提供一种可诱导的Tet-on调控cre表达转基因小鼠模型的构建方法，将前述的表达载体导入小鼠受精卵中，然后将获得的受精卵移入小鼠输卵管内进行妊娠，获得转基因小鼠。

本发明的可诱导的Tet-on调控Cre表达转基因小鼠模型，进一步的筛选、纯化与建系：

DNA雄原核显微注射方法制作转基因小鼠时，转入的目的基因仅仅只是整合在二倍体动物的其中一条染色体上，所以是杂合子，它的后代只有一部分个体带有整合的基因，有的没有目的基因。所以，转基因小鼠需要一个相当长的筛选和纯化过程，以期获得纯合子的转基因小鼠。由于目的基因随机整合到基因组，因此首代转基因小鼠将会有不同的整合位点。整合基因的拷贝数可能在不同的首代转基因小鼠中也不同。因此，每一个首代转基因小鼠需要作为一个独立的谱系对待并且与其它首代转基因小鼠分开来进行繁殖。

本发明进一步提供由前述方法构建得到的转基因小鼠在HBV致病机制和抗HBV抑制剂的筛选相关研究中的应用。

本发明还公开了构建肝脏可诱导表达的Tet-on联合Cre/loxP的双调控策略的三转基因小鼠的方法，首先，将权利要求1所述的表达载体导入小鼠输卵管内进行妊娠，获得转基因小鼠；然后，将可诱导肝脏特异性表达rtTA分子的rTA^LAP-1转基因小鼠、可调控表达HBV基因组的HBV Tg小鼠和转基因小鼠进行杂交，经反复交配，得到肝脏可诱导表达的Tet-on联合Cre/loxP的双调控策略的三转基因小鼠。

所述的可特异性表达rtTA分子的rTALAP-1转基因小鼠的表达载体含有肝脏特异性启动子和rtTA元件。

所述的可调控表达HBV基因组的HBV Tg小鼠的表达载体为pBI-3-Luc-pA-HBVTg-EGFP，含有LacZ报告基因-双向启动子tetO-loxP-Luciferase-polyA-loxP-HBVTg-IRES-EGFP报告基因的元件排列。

本发明得到的三转基因小鼠在受到盐酸强力霉素调控诱导后Cre重组酶被启动表达，并特异性切除两个loxP位点间的polyA终止序列，同时rtTALAP-1中的rtTA分子与tetO双向启动子特异性结合，HBV基因以及其后的内部核糖体进入位点序列IRES和荧光蛋白EGFP报告基因同时开始表达。由此，HBV基因组得以在肝脏靶向性表达，此时表达的病毒抗原是后天人工诱导产生的，小鼠可以产生针对病毒不同抗原的细胞和体液免疫应答以及相应的免疫病理变化，其诱导的生理病理变化更接近HBV自然感染动物，突破现有HBV转基因小鼠胚胎期免疫耐受难题，实现对HBV体内复制的调控，可应用于HBV抑制剂或药物的筛选和评价、HBV的致病机制以及HBV感染后宿主免疫反应等关键问题的研究。

本发明提供肝脏可诱导表达的Tet-on联合Cre/loxP的双调控策略的三转基因小鼠模型。可与正在应用的两种模型动物可诱导肝脏特异性表达rtTA分子的rTALAP-1小鼠和可调控表达HBV基因组的HBV Tg小鼠进行杂交后得到肝脏可诱导表达的Tet-on联合Cre/loxP的双调控策略的rTALAP-1/Cre/HBVTg三重转基因小鼠，多筛选的小鼠能够通过Dox诱导严格调控HBVTg的表达，通过转基因技术制备的HBVTg严格调控表达的三转基因小鼠，该小鼠在正常饲喂时HBVTg不被表达，经过Dox饲喂诱导后，HBVTg在肝脏开始表达，同时还可利用小鼠活体成像技术直观观察HBVTg抑制剂效果。

可调控表达Cre重组酶的LC-1单转基因小鼠的构建：

1、构建表达Cre重组酶的转基因载体及体外检测效果

1.1将含有双启动子Ptetbi-1(CMV1/2)和LacZ报告基因的真核表达载体pBI-3(由德国海德堡大学惠赠，其图谱如图2所示)，用限制性内切酶PstⅠ和SalⅠ双酶切，经琼脂糖凝胶电泳后回收大片段，用试剂盒纯化后-20℃储存备用。其中LacZ是β-半乳糖苷酶报告基因。

1.2PCR扩增cre重组酶编码基因

cre重组酶基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；

以引物对P1为引物，pET32a-cre质粒DNA为模板，用高保真DNA聚合酶PCR扩增cre基因，95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸2分钟，共进行35个循环。

所述的引物对P1为：

上游引物：AACTGCAGGCCACCATGGCCAATTTACTG 29bp

下游引物：ACGCGTCGACCTAATCGCCATCTTCCAGCAG 31bp

该引物对能够扩增大小为1737bp的Cre重组酶基因，其中，上游引物含有PstⅠ酶切位点，下游引物含有SalⅠ酶切位点；将PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图4所示，其中，泳道1为Marker，泳道2为扩增的片段；

将扩增的cre基因片段用限制性内切酶PstⅠ和SalⅠ双酶切，经琼脂糖凝胶电泳后回收片段并纯化后-20℃储存备用。

1.3将同样用PstⅠ和SalⅠ双酶切的cre基因扩增片段和表达载体pBI-3-LacZ回收的片段(如图5所示，泳道1为Marker)，用T₄DNA连接酶连接构建得到表达载体pBI-3-LacZ-cre，并转化感受态大肠杆菌DH5α，扩增后提取质粒，用PstⅠ和SalⅠ双酶切筛选阳性克隆，酶切鉴定结果如图6所示，其中，泳道1为双酶切后的载体，泳道2为Marker，阳性克隆可被切为大小两个片段，其中小片段为插入的cre重组酶基因片段；将酶切鉴定正确的载体进行测序鉴定，cre基因的测序结果如SEQ.ID.NO.2所示。

1.4将真核表达载体pBI-3-LacZ-cre与rtTALAP-1表达载体共转染真核HepG2细胞，经Dox诱导24小时后检测HepG2细胞，收集细胞，并提取细胞总蛋白，经Western检测HepG2细胞表达cre重组酶的水平，如图7所示，与未诱导相比，Dox诱导后有明显的cre重组酶的表达。

1.5用AseⅠ单酶切pBI-3-LacZ-cre表达载体，由于该表达载体有两处可被AseⅠ识别的位点(如图2所示)，经其酶切后可得到两个片段(如图所示8)，小片段大小为1235bp，大片段包含插入的Cre重组酶基因和调控元件，大小为7521bp，经胶回收大片段后-20℃储存备用。

2、将AseⅠ单酶切pBI-3-LacZ-cre表达载体，经纯化后回收的大片段线性化的目的片段显微注射入C57BL/6J小鼠来源的受精卵雄原核，然后将这些注射卵分别移植到假孕母鼠的输卵管中。

2.1选取7-8周龄雌性小鼠，作为提供受精卵的供体，下午3:00左右，每只小鼠腹腔注射10IU孕马血清促性腺激素(Pregnant Mare SerumGonadotropin，PMSG)。47-48小时后，每只小鼠腹腔注射0.8IU人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin,HCG)，并与正常公鼠合笼；另取数只2月龄以上雌鼠作为受精卵胚胎发育的母体，阴道口潮红，与结扎公鼠合笼。

2.2第二天上午9:00前观察供体、受体，有精栓者拿出备用。

10:30左右，断颈处死供体，手术取出整个输卵管，放入含有300ug/ml透明质酸酶的M2培养液(Sigma公司)中。显微镜下，用镊子撕开输卵管壶腹部，受精卵随同颗粒细胞即一同流出。

2.3仔细观察放在含透明质酸酶M2培养液中的受精卵，当受精卵周围的颗粒细胞脱离时，将受精卵吸出，放入M2培养液中洗涤，最后放在M16培养液(Sigma公司)中，放入5％CO₂，37℃培养箱培养。

2.4在显微镜下观察，挑选细胞饱满，透明带清晰，雄原核清晰可见的受精卵待用。

2.5安装持卵针和注射针，使其末端平行于载物台，在凹玻片的中央滴入一滴M2培养液，覆盖石蜡油，移入待注射的受精卵。DNA在注射针中的气泡应在先前全部弹走。

2.6在高倍镜下，将注射针轻触持卵管，使DNA缓慢流出并控制其流量；反复吹吸受精卵，使其处于最佳位置，将注射针刺入受精卵的雄原核，直至看到原核膨大即退出。将注射过的和未注射过的受精卵上下分开放置，不致于混搅，注射完毕后，放入5％CO₂，37℃培养箱培养。

2.7将受体雌性小鼠麻醉，腹腔注射1％戊巴比妥钠0.01ml/g。手术取出卵巢连接输卵管，用脂肪镊固定，在显微镜下找到输卵管开口。吸取注射后经培养成活的受精卵插入输卵管口，轻轻将移植管内的液体吹入，看到输卵管壶腹部膨大并清晰地看到三个气泡，即重组受精卵移植成功。将卵巢连同输卵管放回腹腔，缝合肌肉和皮肤。

2.8将植入重组受精卵的受体小鼠放入转基因动物培养室正常饲喂。每隔一个星期称体重一次，当第二次比第一次称重增加时，即可初步判断怀孕。

3、筛选阳性的cre重组酶单转基因小鼠

3.1手术后19-21天仔鼠分娩，待新生转基因小鼠3周后，用无菌剪刀剪取1-2mm鼠尾放入Eppendorf管中，加入200ul消化液(含20mg/ml蛋白酶K，25mMEDTA，1％SDS的Tris-HCl)，55℃温水浴8小时，100℃金属浴10分钟灭活蛋白酶K，8000rpm离心10分钟，-20℃保存备用。

3.2新生转基因小鼠的PCR检测

cre重组酶的单转基因小鼠的检测：以提取的基因组DNA作为模板，引物对P3为引物，PCR扩增检测cre基因，PCR扩增产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图9所示，泳道1为Marker，其他显示出885bp条带的泳道为cre阳性的小鼠。所述的引物对P3为：

上游引物：TGCAACGAGTGATGAGGTTC 20bp

下游引物：GCTTGCATGATCTCCGGTAT 20bp

3.3转基因小鼠的繁殖保种

将上述得到的可诱导表达cre重组酶的转基因小鼠分别与C57Bl6野生型小鼠交配，得到F1代小鼠，以PCR法检测筛选同样阳性小鼠，然后继续与C57Bl6野生型小鼠交配，繁殖扩群，同样方法筛选阳性小鼠，直至外源基因可稳定遗传至子代。

DNA原核显微注射方法制作转基因小鼠时，转入的目的基因仅仅只是整合在二倍体动物的其中一条染色体上，所以是半合子，它的后代只有一部分个体带有整合的基因，有的没有目的基因。所以，转基因小鼠需要一个相当长的筛选和纯化过程，以期获得纯合子的转基因小鼠。通常的方法是，制作同一批转基因小鼠后，将其中的一部分与正常的野生型小鼠杂交，检测后代的整合几率，再通过同一窝的阳性雌雄小鼠交配，在基因的同源重组作用下，最终得到纯合子小鼠。由于目的基因随机整合到基因组，因此首代转基因小鼠将会有不同的整合位点。整合基因的拷贝数可能在不同的首代转基因小鼠中也不同。由于这些原因，每一个首代转基因小鼠需要作为一个独立的谱系对待并且与其它首代转基因小鼠分开来进行繁殖。每个首代转基因小鼠的子代都需要进行转基因遗传和表达的检测。由于不同的整合位点和拷贝数，每一个首代转基因小鼠可以有不同的表达水平。可采用经典育种与PCR相结合的方法对转基因小鼠纯合子进行筛选。将用于建系的原代(F0)转基因小鼠与野生型小鼠配种繁殖产生的后代(不同窝的仔鼠分别统计)为F1。F1中阳性转基因小鼠同胞交配产生的后代为F2。在F2中选择数对阳性鼠同胞交配产生的后代为F3。根据各窝鼠的整合率及PCR的信号，选出假定纯合小鼠。将假定的纯合子小鼠与野生型小鼠配种产生F4，根据后代整合率，对假定的纯合子转基因小鼠做出验证。可继续传代以求建立稳定的转基因小鼠品系。通常情况下，制作转基因小鼠，并经过筛选鉴定之后，得到纯合子的转基因小鼠，并用纯合子来保存育种。

本发明公开的一种构建肝脏可诱导表达的Tet-on联合Cre/loxP的双调控策略的三转基因小鼠的方法，包括以下步骤：

1)将上述实验获得的表达载体导入小鼠输卵管内进行妊娠，获得转基因小鼠；

2)将可诱导肝脏特异性表达rtTA分子的rTA^LAP-1转基因小鼠、可调控表达HBV基因组的HBV Tg小鼠和转基因小鼠进行杂交，经反复交配，得到肝脏可诱导表达的Tet-on联合Cre/loxP的双调控策略的三转基因小鼠。

其中，可诱导肝脏特异性表达rtTA分子的rTALAP-1小鼠(德国海德堡大学惠赠)由第四军医大学基础医学部病原生物学教研室保种。

可调控表达HBV基因组的HBV Tg小鼠由第四军医大学基础医学部病原生物学教研室构建并保种。其构建方法简述如下：

构建可受调控表达HBV Tg的转基因载体：

1)在含有双启动子Ptetbi-1(CMV1/2)和LacZ报告基因的真核表达载体pBI-3(其质粒图谱如图2所示)的LacZ报告基因的另一侧顺序插入loxP、Luciferase、polyA、loxP调控元件，构建真核表达载体pBI-3-Luc-pA-HBVTg-EGFP，其元件组成顺序如图3所示。其中，LacZ是β-半乳糖苷酶报告基因；前后两个loxP序列的排列顺序相同，以利于Cre重组酶特异性的识别并切除两个loxP位点之间的目的基因，从而达到条件下敲除目的基因的目的；Luciferase为荧光素酶报告基因；polyA多聚腺苷酸为终止序列，以达到严格避免HBVTg基因的漏过性表达。表达载体pBI-3-Luc-pA-HBVTg-EGFP元件顺序参见图3，其中，IRES：内部核糖体进入位点；EGFP：增强型绿色荧光蛋白报告基因；Luc：萤光素酶报告基因；lacZ：β-半乳糖苷酶报告基因；Pbi-1：双向启动子TetO元件。

2)将AseⅠ单酶切pBI-3-Luc-pA-HBVTg-EGFP表达载体，经纯化后回收的大片段线性化的目的片段显微注射入C57BL/6J小鼠来源的受精卵雄原核，然后将这些注射卵分别移植到假孕母鼠的输卵管中，筛选阳性的HBVTg转基因小鼠，繁育保种。此过程技术方法与上述cre重组酶单转基因小鼠繁育保种方法相同。

Claims (10)

1.一种含有可调控表达的cre重组酶基因和报告基因LacZ的表达载体，其特征在于，该表达载体为pBI-3-LacZ-cre，且该表达载体中含有LacZ报告基因、Cre重组酶基因及双向启动子tetO元件。

2.根据权利要求1所述的一种含有可调控表达的cre重组酶基因和报告基因LacZ的表达载体，其特征在于，所述cre重组酶基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

3.一种含有可调控表达的cre重组酶基因和报告基因LacZ的表达载体的构建方法，其特征在于，该真核表达载体pBI-3的双向启动子tetO的一侧为LacZ报告基因，在另一侧插入cre重组酶基因，构建得到真核表达载体pBI-3-LacZ-cre。

4.根据权利要求3所述的含有可调控表达的cre重组酶基因和报告基因LacZ的表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)以引物对P1为引物，以包含cre重组酶基因的pET32a-cre载体为模板，PCR扩增基因，得到cre重组酶基因扩增片段；

2)用限制性内切酶PstⅠ和SalⅠ双酶切表达载体pBI-3-LacZ并回收大片段产物，将cre重组酶基因扩增片段用限制性内切酶PstⅠ和SalⅠ进行双酶切，并回收产物；

3)将步骤2)酶切回收的两个产物用T₄DNA连接酶连接，得到含有可调控表达的cre重组酶基因和报告基因LacZ的表达载体pBI-3-LacZ-cre。

5.根据权利要求4所述的含有可调控表达的cre重组酶基因和报告基因LacZ的表达载体的构建方法，其特征在于，步骤1)所述的引物对P1为：

上游引物：AACTGCAGGCCACCATGGCCAATTTACTG；

下游引物：ACGCGTCGACCTAATCGCCATCTTCCAGCAG；

步骤2)所述的大片段产物包含插入的cre重组酶基因和调控元件，大小为7521bp。

6.根据权利要求3或4所述的含有可调控表达的cre重组酶基因和报告基因LacZ的表达载体的构建方法，其特征在于，所述cre重组酶基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

7.权利要求1所述的含有可调控表达的cre重组酶基因和报告基因LacZ的表达载体在抗HBV抑制剂筛选中的应用。

8.一种构建肝脏可诱导表达的Tet-on联合Cre/loxP的双调控策略的三转基因小鼠的方法，其特征在于：首先，将权利要求1所述的表达载体导入小鼠输卵管内进行妊娠，获得转基因小鼠；然后，将可诱导肝脏特异性表达rtTA分子的rTA^LAP-1转基因小鼠、可调控表达HBV基因组的HBV Tg小鼠和转基因小鼠进行杂交，经反复交配，得到肝脏可诱导表达的Tet-on联合Cre/loxP的双调控策略的三转基因小鼠。

9.如权利要求8所述的构建肝脏可诱导表达的Tet-on联合Cre/loxP的双调控策略的三转基因小鼠的方法，其特征在于：在可诱导肝脏特异性表达rtTA分子的rTA^LAP-1转基因小鼠的表达载体中含有肝脏特异性启动子和rtTA元件。

10.如权利要求8所述的构建肝脏可诱导表达的Tet-on联合Cre/loxP的双调控策略的三转基因小鼠的方法，其特征在于：可调控表达HBV基因组的HBVTg小鼠的表达载体为pBI-3-Luc-pA-HBVTg-EGFP，含有LacZ报告基因-双向启动子tetO-loxP-Luciferase-polyA-loxP-HBVTg-IRES-EGFP报告基因的元件。