CN107022570A - 一种条件性基因表达调控系统 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种条件性基因表达调控系统，该系统由目标基因的表达载体和位点特异性重组酶的表达载体两部分组成，目标基因的读码框中插入了内含子序列，在内含子序列中插入一个位点特异性重组酶的识别序列，在目标基因的5＇或者3＇端也插入一个位点特异性重组酶的识别序列，两个识别序列的方向相反且两者之间的DNA片段反向放置。本发明使得正常情况下目标基因不能表达，在位点特异性重组酶的作用下，两个识别序列发生重组使得两者之间的DNA片段方向发生颠倒，从而使目标基因恢复正常表达。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种条件性基因表达调控系统。
背景技术
基因的条件性表达是指在药物或者其它基因的诱导下，实现目标基因在特定的时间或特定的空间表达，该技术在基因的功能研究以及基因治疗中具有重要的意义。
目前常用的条件性基因表达调控系统有Tet on、Tet off、Cre-loxp、Flp-FRT等，然而，由于不同因素的影响，这些调控系统本底表达仍然较高。Tet on、Tet off系统依赖于药物Dox与Tet结构域结合后使得相应的转录因子与启动子结合或者脱离，从而实现诱导性表达，但由于药物Dox不与Tet结合的情况下转录因子仍然与启动子有一定程度的结合力，使得该系统本底较高。Cre-loxp和Flp-FRT原理相似，在启动子和目标基因之间插入转录终止信号，转录终止信号两端加入loxp序列，在CRE酶的作用下可以使启动子和基因之间的转录终止信号去除，从而使目标基因启动表达。该系统严谨性与Tet on、Tet off系统相比较好，但是由于转录终止信号并不能完全终止启动子的启动活性，因此该系统也存在一定的本底表达。
综上，目前仍没有一种足够严谨的条件性基因表达调控系统。
发明内容
针对上述基因表达调控严谨性不足存在的技术难题，本发明的目的在于，提供一种严谨性较高的条件性基因表达调控系统。本发明将目标基因分为两个段，将其中一段的方向跌倒，这样破坏了目标基因的正常编码顺序，使得正常情况下目标基因完全不能表达，而在位点特异性重组酶的作用下跌倒的片段恢复为正常方向后，目标基因的读码框恢复正常，基因才能正常表达。
为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：
一种条件性基因表达调控系统，其特征在于，该系统由目标基因的表达载体和位点特异性重组酶的表达载体两部分组成，目标基因的读码框中插入了内含子序列，在内含子序列中插入一个位点特异性重组酶的识别序列，在目标基因的5＇或者3＇端也插入一个位点特异性重组酶的识别序列，两个识别序列的方向相反且两者之间的DNA片段反向放置。
所述目标基因的读码框中插入了内含子序列是指目标基因起始密码子和终止密码子之间的任意两个相邻碱基之间插入了内含子序列；所述在内含子序列中是指在内含子的剪切供体序列和剪切受体序列之间。
所述表达载体是真核表达载体。
所述位点特异性重组酶是CRE、FLP、ΦC31中的任意一种；所述位点特异性重组酶的识别序列是CRE酶识别的loxp序列、FLP酶识别的FRT序列、ΦC31酶识别的attB/attP中的任意一种。
所述内含子序列为SEQ ID No.1的内含子序列1，如下：
SEQ ID No.1：内含子序列1
GTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTCGAGTACAGAATTCATGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAG。
所述内含子序列为SEQ ID No.11的内含子序列2，如下：
SEQ ID No.11：内含子序列2
GTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGGACCAATAGGTGCCTATCAGAAACGCAAGAGTCTTCTCTGTCTCGACAAGCCCAGTTTCTATTGGTCTCCTTAAATTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAG。
本发明的有益效果：本发明将目标基因分为两个片段，将其中一个片段方向跌倒，破坏该基因的正常编码顺序，使得正常情况下该基因完全不能表达；在方向跌倒的片段两端加入位点特异性重组酶的识别序列，两个识别序列方向相反，这样在位点特异性重组酶的作用下能够使方向跌倒的片段反转过来恢复正常的方向；为了去除两个片段之间的位点特异性重组酶的识别序列，在两个片段之间加入了内含子序列，使特异性重组酶的识别序列位于内含子序列的剪切供体和剪切受体之间，这样目标基因在表达成mRNA后，通过内含子的自剪切将内含子以及位于内含子中的特异性重组酶的识别序列去除，获得能够正常编码目标基因的mRNA。通过该方案，可以最大限度的降低目标基因在非诱导的条件下的本底表达，而在诱导条件下能够大量的表达，而且还可以通过与组织特异性启动子、Tet on、Tetoff等启动子的组合使用，获得组织特异的条件性基因表达或者药物诱导的条件性基因表达。为基因的功能研究以及基因治疗提供更好的技术手段。
附图说明
图1是位点特异性重组酶表达载体结构示意图；
图2是目标基因表达载体结构及作用原理示意图；
图3是本发明条件性基因表达调控系统严谨性检测结果；
图4是本发明条件性基因表达调控系统与传统调控系统本底表达的比较结果。
以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明，这些实施例是较优的例子，本发明不限于这些实施例。
具体实施方式
为了解决目前条件性基因表达调控系统本底较高的问题，本发明提供了一种条件性基因表达调控系统，该系统由目标基因的表达载体和位点特异性重组酶的表达载体两部分组成，目标基因的读码框中插入了内含子序列，在内含子序列中插入一个位点特异性重组酶的识别序列，在目标基因的5＇或者3＇端也插入一个位点特异性重组酶的识别序列，两个识别序列的方向相反且两者之间的DNA片段反向放置。在该条件性基因表达调控系统中，由于目标基因被分为两段，且其中一个片段方向发生了跌倒，使得正常情况下目标基因完全不能表达，在位点特异性重组酶的作用下，两个位点特异性重组酶的识别序列发生重组使得两者之间的DNA片段方向发生颠倒，从而使目标基因的两个片段方向一致，而目标基因的两个片段之间的内含子序列和位于内含子序列之间的位点特异性重组酶的识别序列在目标基因转录为mRNA后，通过mRNA内含子的自剪切被去除，因此目标基因恢复正常表达。
实施例1
一种条件性基因表达调控系统，该系统由目标基因的表达载体和位点特异性重组酶的表达载体两部分组成，目标基因的读码框中插入了内含子序列，在内含子序列中插入一个位点特异性重组酶的识别序列，在目标基因的5＇或者3＇端也插入一个位点特异性重组酶的识别序列，两个识别序列的方向相反且两者之间的DNA片段反向放置。
所述目标基因的读码框中插入了内含子序列是指目标基因起始密码子和终止密码子之间的任意两个相邻碱基之间插入了内含子序列；所述在内含子序列中是指在内含子的剪切供体序列和剪切受体序列之间。
所述表达载体是真核表达载体。所述位点特异性重组酶是CRE、FLP、ΦC31中的任意一种；所述位点特异性重组酶的识别序列是CRE酶识别的loxp序列、FLP酶识别的FRT序列、ΦC31酶识别的attB/attP中的任意一种。
所述内含子序列为SEQ ID No.1的内含子序列1，如下：
SEQ ID No.1：内含子序列1
GTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTCGAGTACAGAATTCATGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAG。
实施例2
以下是以荧光素酶报告基因luciferase的条件性基因表达调控系统为例的具体实例。
1、荧光素酶报告基因luciferase的条件性基因表达调控系统的结构
该系统由位点特异性重组酶CRE的表达载体和目标基因luciferase的表达载体两部分组成，位点特异性重组酶CRE的表达载体结构为在pcDNA3.1(+)载体中插入了Cre基因，其结构见附图1。目标基因luciferase的表达载体结构为在pcDNA3.1(+)载体中插入了luciferase基因，但是luciferase基因读码框的第970个碱基和第971个碱基之间插入内含子序列，将目标基因luciferase分为luciN和luciC两个片段，内含子序列为SEQ ID No.1的内含子序列1。
SEQ ID No.1：内含子序列1
GTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTCGAGTACAGAATTCATGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAG。
在该SEQ ID No.1的内含子序列1的第85个碱基和第86个碱基之间插入一个特异性重组酶CRE的识别序列loxp，将内含子分为int和ron两个片段，在luciferase基因的5＇端插入一个loxp序列，两个loxp序列方向相反，将两个loxp序列之间的luciN-int片段反向放置，目标基因luciferase的完整序列为SEQ ID No.2。
SEQ ID No.2：目标基因luciferase的完整序列
ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATTCGAGAAACGCAAGAGTCTTCTCTGTCTCGACAAGCCCAGTTTCTATTGGTCTCCTTAAACCTGTCTTGTAACCTTGATACTTACCTACCTCCTTGCTGAGCGGCGCCCCGCCGCTGGCGATCTCGTGCAAGTTGCTTAGGTCGTACTTGTCGATGAGAGTGCTCTTAGCGAAGAAGCTAAATAGTGTGGGCACCAGCAGGGCAGATTGAATCTTATAGTCTTGCAAGCTGCGCAAGAATAGCTCCTCCTCGAAGCGGTACATGAGCACGACCCGAAAGCCGCAGATCAAGTAGCCCAGCGTGGTGAACATGCCGAAGCCGTGGTGAAATGGCACCACGCTGAGGATAGCGGTGTCGGGGATGATCTGGTTGCCGAAGATGGGGTCGCGGGCATGACTGAATCGGACACAAGCGGTGCGGTGCGGTAGGGCTACGCCCTTGGGCAATCCGGTACTGCCACTACTGTTCATGATCAGGGCGATGGTTTTGTCCCGGTCGAAGCTCTCGGGCACGAAGTCGTACTCGTTGAAGCCGGGTGGCAAATGGGAAGTCACGAAGGTGTACATGCTTTGGAAGCCCTGGTAGTCGGTCTTGCTATCCATGATGATGATCTTTTGTATGATCGGTAGCTTCTTTTGCACGTTGAGGATCTTTTGCAGCCCTTTCTTGCTCACGAATACGACGGTGGGCTGGCTGATGCCCATGCTGTTCAGCAGCTCGCGCTCGTTGTAGATGTCGTTAGCTGGGGCCACAGCCACACCGATGAACAGGGCACCCAACACGGGCATGAAGAACTGCAAGCTATTCTCGCTGCACACCACGATCCGATGGTTTGTATTCAGCCCATAGCGCTTCATAGCTTCTGCCAGCCGAACGCTCATCTCGAAGTACTCGGCGTAGGTAATGTCCACCTCGATATGTGCGTCGGTAAAGGCGATGGTGCCGGGCACCAGGGCGTAGCGCTTCATGGCTTTGTGCAGCTGCTCGCCGGCGGTCCCGTCTTCGAGTGGGTAGAATGGCGCTGGGCCCTTCTTAATGTTTTTGGCATCTTCCATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCTCGAGGTACAGAATTCATGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGAGGCCGTGGCCAAACGCTTCCACCTACCAGGCATCCGCCAGGGCTACGGCCTGACAGAAACAACCAGCGCCATTCTGATCACCCCCGAAGGGGACGACAAGCCTGGCGCAGTAGGCAAGGTGGTGCCCTTCTTCGAGGCTAAGGTGGTGGACTTGGACACCGGTAAGACACTGGGTGTGAACCAGCGCGGCGAGCTGTGCGTCCGTGGCCCCATGATCATGAGCGGCTACGTTAACAACCCCGAGGCTACAAACGCTCTCATCGACAAGGACGGCTGGCTGCACAGCGGCGACATCGCCTACTGGGACGAGGACGAGCACTTCTTCATCGTGGACCGGCTGAAGAGCCTGATCAAATACAAGGGCTACCAGGTAGCCCCAGCCGAACTGGAGAGCATCCTGCTGCAACACCCCAACATCTTCGACGCCGGGGTCGCCGGCCTGCCCGACGACGATGCCGGCGAGCTGCCCGCCGCAGTCGTCGTGCTGGAACACGGTAAAACCATGACCGAGAAGGAGATCGTGGACTATGTGGCCAGCCAGGTTACAACCGCCAAGAAGCTGCGCGGTGGTGTTGTGTTCGTGGACGAGGTGCCTAAAGGACTGACCGGCAAGTTGGACGCCCGCAAGATCCGCGAGATTCTCATTAAGGCCAAGAAGGGCGGCAAGATCGCCGTGTAA。
目标基因Luciferase的表达载体结构及作用原理见附图2。图中可见，目标基因luciferase由luciN-int和ron-luciC两个片段组成，luciferase由luciN-int的两端分别有一个loxp序列，两个loxp序列的方向相反，且两个loxp序列之间的luciN-int片段反向放置，正常情况下目标基因luciferase是不能表达的，在位点特异性重组酶CRE的作用下，两个loxp序列发生重组，两个loxp序列之间反向放置的luciN-int片段方向发生颠倒，使得luciN-int和ron-luciC方向一致，而位于luciN和luciC之间序列int-loxp-ron在luciferase基因被转录为mRNA后通过内含子的自剪切被去除，目标基因luciferase得以正常表达。
在该系统中所用的位点特异性重组酶也可以是FLP、ΦC31中的任意一种，而位点特异性重组酶的识别序列也可以是FRT(FLP的识别序列)、attB/attP(ΦC31的识别序列)中的任意一种。
2、荧光素酶报告基因luciferase的条件性基因表达调控系统构建过程
(1)位点特异性重组酶CRE的表达载体构建
PCR扩增获得Cre基因，将Cre基因通过KpnI和NotI位点克隆到pcDNA3.1(+)载体中，获得位点特异性重组酶CRE的表达载体pcDNA3.1/Cre。
(2)目标基因luciferase的表达载体构建
在华大基因公司合成内含子全长片段，序列见SEQ ID No.1的内含子序列1，同时合成以下引物：
SEQ ID No.3：loxp-luciNXhoI for
ACTCGAGATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATATGGAAGATGCCAAAAACATTAAGA
SEQ ID No.4：luciN-int for
GCCGCTCAGCAAGGAGGTAGGTAAGTATCAAGGTTACAA
SEQ ID No.5：luciN-int reverse
TTGTAACCTTGATACTTACCTACCTCCTTGCTGAGCGGC
SEQ ID No.6：loxp-intKpnI reverse
AGGTACCATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATTCGAGAAACGCAAGAGTCTT
SEQ ID No.7：ronXhoI for
ACTCGAGGTACAGAATTCATGATAGGCAC
SEQ ID No.8：ron-luciC for
ACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGAGGCCGTGGCCAAACG
SEQ ID No.9：ron-luciC reverse
CGTTTGGCCACGGCCTCACCTGTGGAGAGAAAGGCAAAGT
SEQ ID No.10：luciCNotI reverse
AGCGGCCGCTTACACGGCGATCTTGCCGCCCTT
以SEQ IDNo.3/SEQ IDNo.4/SEQ IDNo.5/SEQ ID No.6为引物，luciferase基因和内含子片段为模板进行重叠PCR，获得loxp-luciN-int-loxp片段，以SEQ ID No.7/SEQ IDNo.8/SEQ ID No.9/SEQ ID No.10为引物，luciferase基因和内含子片段为模板进行重叠PCR获得ron-luciC片段。用KpnI和XhoI酶切并回收loxp-luciN-int-loxp片段，用XhoI和NotI酶切并回收ron-luciC片段，将loxp-luciN-int-loxp片段和ron-luciC片段同时连接到KpnI和NotI酶切处理的pcDNA3.1(+)载体，获得目标基因luciferase的表达载体pcDNA3.1/loxp-luciN-int-loxp-ron-luciC。
3、荧光素酶报告基因luciferase的条件性基因表达调控系统的使用方法
将8μg目标基因luciferase的表达载体pcDNA3.1/loxp-luciN-int-loxp-ron-luciC转染到60mm培养皿中的HEK293，加G418筛选10-20天，待细胞不再死亡获得稳定细胞系loxp-luci-HEK293。
将6μg位点特异性重组酶CRE的表达载体pcDNA3.1/Cre转染loxp-luci-HEK293，转染72小时后收集细胞，提取蛋白通过荧光素酶活性检测试剂盒检测荧光素酶活力。同时收集未转染pcDNA3.1/Cre的loxp-luci-HEK293细胞，提取蛋白测荧光素酶活力作为对照。附图3显示了荧光素酶活力检测结果。图中可见细胞转入CRE表达载体后，目标基因luciferase得到大量表达，而在未转染CRE时，目标基因几乎不表达。同时还将这种条件性基因表达调控系统与目前常用的基因表达调控系统目标基因的本底表达水平做了对照，结果见附图4，图中可见，本发明的条件性基因表达调控系统luciferase基因的本底表达更低。
实施例3
以下是以荧光素酶报告基因luciferase的Dox诱导性基因表达调控系统为例的具体实例。
将位点特异性重组酶CRE的表达载体中Cre基因的启动子替换为Tet on启动子，将该载体中的筛选基因替换为puromycin基因，获得的载体命名为pcDNA3.1/Tet on-cre。其它结构与实施例2相同。
该系统使用方法如下：
将8μg位点特异性重组酶CRE的表达载体pcDNA3.1/Tet on-cre转染loxp-luci-HEK293，用puromycin筛选8-10天，待细胞不再死亡获得稳定细胞系Tet on-cre-loxp-luci-HEK293。
将Tet on-cre-loxp-luci-HEK293传至两个60mm细胞培养皿，一个平皿加入强力霉素诱导，另一个平皿不做处理，72小时后收集细胞提取蛋白检测荧光素酶活力。其它步骤与实施例2相同。
实施例4
以下是以绿色荧光蛋白报告基因eGFP的条件性基因表达调控系统为例的具体实例。
绿色荧光蛋白报告基因eGFP的条件性基因表达调控系统组成如下：
该系统由位点特异性重组酶FLP的表达载体和目标基因eGFP的表达载体两部分组成，位点特异性重组酶FLP的表达载体结构为在pcDNA3.1(+)载体中插入了Flp基因。目标基因eGFP的表达载体结构为在pcDNA3.1(+)载体中插入了eGFP基因，但是eGFP基因编码区的第4个碱基和第5个碱基之间插入内含子序列，内含子序列与实施例1相同，在该内含子序列的第66个碱基和第67个碱基之间插入位点特异性重组酶FLP的识别序列FRT，在eGFP基因的3＇端插入FRT序列，两个FRT序列方向相反，将两个FRT序列之间的DNA片段反向放置。
在该系统中所用的位点特异性重组酶也可以是CRE、ΦC31中的任意一种，而位点特异性重组酶的识别序列也可以是loxp(CRE的识别序列)、attB/attP(ΦC31的识别序列)中的任意一种。
实施例5
以下是以干细胞相关因子Oct4的条件性基因表达调控系统为例的具体实例。
干细胞相关因子Oct4的条件性基因表达调控系统组成如下：
该系统由位点特异性重组酶ΦC31的表达载体和目标基因Oct4的表达载体两部分组成，位点特异性重组酶ΦC31的表达载体结构为在pcDNA3.1(+)载体中插入了ΦC31基因。目标基因Oct4的表达载体结构为在pcDNA3.1(+)载体中插入了Oct4基因，但是Oct4基因编码区的第1079个碱基和第1080个碱基之间插入内含子序列，内含子序列为SEQ ID No.11的内含子序列2。
SEQ ID No.11：内含子序列2
GTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGGACCAATAGGTGCCTATCAGAAACGCAAGAGTCTTCTCTGTCTCGACAAGCCCAGTTTCTATTGGTCTCCTTAAATTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAG。
在该内含子序列的第45个碱基和第46个碱基之间插入attB序列，在Oct4基因的3＇端插入attP序列，attB与attP序列方向相反，将attB和attP序列之间的DNA片段反向放置。
在该系统中所用的位点特异性重组酶也可以是CRE、FLP中的任意一种，而位点特异性重组酶的识别序列也可以是loxp(CRE)、FRT(FLP识别序列)中的任意一种。
本实施例没有详细叙述的部分和英文缩写属本行业的公知常识，在网上可以搜索到，这里不一一叙述。
核苷酸或氨基酸序列表
SEQUENCE LISTING
<110>中国人民解放军第四军医大学
<120> 一种条件性基因表达调控系统
<160> 11
<210> 1
<211> 149
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>misc_feature
<400> 1
gtaagtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcttgtcgaga 60
cagagaagactcttgcgtttctcgagtacagaattcatgataggcacctattggtcttac 120
tgacatccactttgcctttctctccacag 149
<210> 2
<211> 1876
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>misc_feature
<400> 2
ataacttcgtatagcatacattatacgaagttattcgagaaacgcaagagtcttctctgt 60
ctcgacaagcccagtttctattggtctccttaaacctgtcttgtaaccttgatacttacc 120
tacctccttgctgagcggcgccccgccgctggcgatctcgtgcaagttgcttaggtcgta 180
cttgtcgatgagagtgctcttagcgaagaagctaaatagtgtgggcaccagcagggcaga 240
ttgaatcttatagtcttgcaagctgcgcaagaatagctcctcctcgaagcggtacatgag 300
cacgacccgaaagccgcagatcaagtagcccagcgtggtgaacatgccgaagccgtggtg 360
aaatggcaccacgctgaggatagcggtgtcggggatgatctggttgccgaagatggggtc 420
gcgggcatgactgaatcggacacaagcggtgcggtgcggtagggctacgcccttgggcaa 480
tccggtactgccactactgttcatgatcagggcgatggttttgtcccggtcgaagctctc 540
gggcacgaagtcgtactcgttgaagccgggtggcaaatgggaagtcacgaaggtgtacat 600
gctttggaagccctggtagtcggtcttgctatccatgatgatgatcttttgtatgatcgg 660
tagcttcttttgcacgttgaggatcttttgcagccctttcttgctcacgaatacgacggt 720
gggctggctgatgcccatgctgttcagcagctcgcgctcgttgtagatgtcgttagctgg 780
ggccacagccacaccgatgaacagggcacccaacacgggcatgaagaactgcaagctatt 840
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gccggcggtcccgtcttcgagtgggtagaatggcgctgggcccttcttaatgtttttggc 1080
15
atcttccatataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatctcgaggtacagaattc 1140
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gcccttcttcgaggctaaggtggtggacttggacaccggtaagacactgggtgtgaacca 1380
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ggctacaaacgctctcatcgacaaggacggctggctgcacagcggcgacatcgcctactg 1500
ggacgaggacgagcacttcttcatcgtggaccggctgaagagcctgatcaaatacaaggg 1560
ctaccaggtagccccagccgaactggagagcatcctgctgcaacaccccaacatcttcga 1620
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单链DNA 寡聚核苷酸
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16
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<220>
<223> 单链DNA 寡聚核苷酸
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t 61
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<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单链DNA 寡聚核苷酸
<400> 7
actcgaggtacagaattcatgataggcac 29
<210> 8
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单链DNA 寡聚核苷酸
<400> 8
actttgcctttctctccacaggtgaggccgtggccaaacg 40
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单链DNA 寡聚核苷酸
<400> 9
cgtttggccacggcctcacctgtggagagaaaggcaaagt 40
<210> 10
<211> 33
<212> DNA
17
<213> 人工序列
<220>
<223> 单链DNA 寡聚核苷酸
<400> 10
agcggccgcttacacggcgatcttgccgccctt 33
<210> 11
<211> 133
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>misc_feature
<400> 11
gtaagtatcaaggttacaagacagggaccaataggtgcctatcagaaacgcaagagtctt 60
ctctgtctcgacaagcccagtttctattggtctccttaaattactgacatccactttgcc 120
tttctctcca cag 133
Claims (6)
1.一种条件性基因表达调控系统，其特征在于，该系统由目标基因的表达载体和位点特异性重组酶的表达载体两部分组成，目标基因的读码框中插入了内含子序列，在内含子序列中插入一个位点特异性重组酶的识别序列，在目标基因的5＇或者3＇端也插入一个位点特异性重组酶的识别序列，两个识别序列的方向相反且两者之间的DNA片段反向放置。
2.如权利要求1所述的条件性基因表达调控系统，其特征在于，所述目标基因的读码框中插入了内含子序列是指目标基因起始密码子和终止密码子之间的任意两个相邻碱基之间插入了内含子序列；所述在内含子序列中是指在内含子的剪切供体序列和剪切受体序列之间。
3.如权利要求1所述的条件性基因表达调控系统，其特征在于，所述表达载体是真核表达载体。
4.如权利要求1所述的条件性基因表达调控系统，其特征在于，所述位点特异性重组酶是CRE、FLP、ΦC31中的任意一种；所述位点特异性重组酶的识别序列是CRE酶识别的loxp序列、FLP酶识别的FRT序列、ΦC31酶识别的attB/attP中的任意一种。
5.如权利要求1所述的条件性基因表达调控系统，其特征在于，所述内含子序列为SEQID No.1的内含子序列1，如下：
SEQ ID No.1：内含子序列1
GTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTCGAGTACAGAATTCATGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAG。
6.如权利要求1所述的条件性基因表达调控系统，其特征在于，所述内含子序列为SEQID No.11的内含子序列2，如下：
SEQ ID No.11：内含子序列2
GTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGGACCAATAGGTGCCTATCAGAAACGCAAGAGTCTTCTCTGTCTCGACAAGCCCAGTTTCTATTGGTCTCCTTAAATTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAG。
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