CN101845445A

CN101845445A - Cre重组酶重组基因及Cre/loxP介导的转基因安全性植物表达载体

Info

Publication number: CN101845445A
Application number: CN201010105772A
Authority: CN
Inventors: 王勇; 徐亚英; 陈典
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2010-02-04
Filing date: 2010-02-04
Publication date: 2010-09-29
Anticipated expiration: 2030-02-04
Also published as: CN101845445B

Abstract

Cre重组酶重组基因及Cre/loxP介导的转基因安全性植物表达载体，它涉及一种Cre重组酶重组基因及植物表达载体。它解决了现有Cre/loxP位点特异性重组系统去除转基因植物中标记基因的方法中因Cre/loxP位点特异性重组系统具有可逆性，导致其删除效率降低的问题。crein基因序列如SEQ ID NO：1所示。本发明载体包含标记基因bar、crein基因、热激启动子hsp和组成型启动子CaMV35S。本发明可提高转基因植物的安全性。

Description

Cre重组酶重组基因及Cre/loxP介导的转基因安全性植物表达载体

技术领域

本发明涉及一种Cre重组酶重组基因及植物表达载体。

背景技术

转基因植物(transgenic plants)是指利用生物转基因技术，将从动物、微生物、人类、远缘植物中提取的或人工合成的目的基因导入植物细胞或组织，并使其表达而产生理想性状的植物。随着转基因技术的发展，转基因植物无论是在品种数量上还是在种植面积上都发展得非常迅猛，其遍布范围几乎波及了整个地球。随着转基因植物进入人们生活的方方面面，随之而来的是人们对转基因植物的安全性的质疑，其主要原因是由于转基因植物中标记基因的存在。标记基因是一种用来筛选和鉴定转化的细胞、组织和转基因植株的DNA片段。它们主要来源于动植物，有些甚至来自细菌、病毒和其他生物体。

标记基因用于帮助在植物遗传转化中筛选和鉴定转化的细胞、组织和再生植株。在选择压力下不含标记基因及其产物的非转化细胞和组织死亡，转化细胞由于有抗性，可继续成活、分裂并分化成植株。因此，标记基因的存在方便了植物的遗传转化；但获得转化植株后，特别是在转基因产品的产业化过程中，标记基因的存在是多余的，甚至是有害的，并具有一定的潜在危险，例如：①转基因植物本身可能变为杂草或通过杂交等方式使野生近缘种变为杂草；②标记基因传播到其他生物体中会引发生态失衡，如产生超级害虫等；③转基因植物的标记基因及其产物可能对人或动物的健康有害；④筛选剂影响转化细胞的增殖及分化；⑤相同的标记基因向植物叠加外源标记基因可能被转移到人或动物肠道寄生菌中而产生耐药性，降低或丧失某种抗生素的治疗作用。所以，目前本领域技术人员采用共转化法、位点特异性重组系统、转座子法、同源重组作用等手段去除转基因植物中的标记基因。现有去除转基因植物中标记基因的方法中应用最早、最广泛、也最深入的是位点特异性重组系统中的Cre/loxP位点特异性重组系统，由于目前尚未在真核生物中发现类似的DNA重组酶，所以将原核生物的重组酶及其相应的识别位点导入到真核生物中可实现真核生物基因组中相应的DNA片段的定位、删除和倒位等，但由于Cre/loxP位点特异性重组系统具有可逆性，导致其删除效率降低。Wierz诱变分析研究发现，对酶分子活性区域的氨基酸进行突变，结果Cre酶活性丧失或降低。Schaikh等研究得到3个Cre重组酶的突变体，将Ala36突变为Val、Thr41突变为Phe、Gly314突变为Arg，结果发现这3个突变体均不能进行DNA链的切割。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有Cre/loxP位点特异性重组系统去除转基因植物中标记基因的方法中因Cre/loxP位点特异性重组系统具有可逆性，导致其删除效率降低的问题，而提供的一种Cre重组酶重组基因及Cre/loxP介导的转基因安全性植物表达载体

本发明Cre重组酶重组基因命名为crein基因，crein基因的DNA序列如SEQ ID NO：1所示。本发明Cre重组酶重组基因crein基因的长度为1222bp，本发明crein基因将内含子intron(AF354045.1)引入cre基因内部，基因的头部位置为cre基因的前3个碱基、之后为TC+内含子intron(AF354045.1)序列、再后为cre基因的后1027个碱基。

本发明Cre/loxP介导的转基因安全性植物表达载体包含标记基因bar、crein基因、热激启动子hsp和组成型启动子CaMV35S，标记基因bar和crein基因共同位于2个同向的loxP位点内，其中crein基因由热激启动子hsp驱动，标记基因bar由组成型启动子CaMV35S驱动。

本发明crein基因可用于Cre/loxP位点特异性重组系统，本发明应用crein基因进行植物的遗传转化，通过半定量RT-PCR方法检测，Cre的表达效率提高了10％～20％，此外，由于crein基因在cre内部引入了190bp的内含子序列，因此避免了其在原核生物(如大肠杆菌和农杆菌)中的渗漏表达，从而为其与loxP位点共同存在于一个系统中的操作提供了便利。

本发明Cre/loxP介导的转基因安全性植物表达载体的特点是在正常的生长发育温度下热激启动子hsp不具启动子活性，表现为对除草剂的抗性；而多克隆位点的存在允许了外源目的基因的组装，允许选择抗性基因和目的基因协同进入到宿主细胞当中。因此，当本发明Cre/loxP介导的转基因安全性植物表达载体转化完成以后，可以用热激处理(42℃)的方法，去除选择标记基因。Cre作为一种重组酶，为了防止其在植物当中再次发生整合反应，在去除标记基因的同时，它也一并从植物基因组中自身删除。

利用本发明构建的Cre/loxP介导的转基因安全性植物表达载体可以在转基因当代利用除草剂进行转基因植株的筛选，而且当转化完成后即可通过1～3h的42℃热处理去除标记基因，而不必通过杂交、共转化等方式，从而达到获得转基因安全性植株的目的。

利用本发明构建的Cre/loxP介导的转基因安全性植物表达载体获得的转基因植物在保证了转基因82.6％以上成功表达的同时，通过热激处理可将70％以上的标记基因删除，没有可逆性，避免了安全隐患。

附图说明

图1是具体实施方式三步骤c中将crein基因连接到pGEM-T Easy载体上的载体构建示意图。图2是具体实施方式三步骤c中重组质粒pT-Crein与载体phsp-Cre构建载体phsp-Crein的示意图。图3是具体实施方式三步骤c中启动子-除草剂抗性基因-终止序列连接到pGEM-T Easy载体上的载体构建示意图。图4是具体实施方式三步骤c中构建质粒pGl-GUS’的示意图。图5是具体实施方式三步骤c中用质粒pGl-GUS’与重组质粒pT-35Sbar构建载体pGl-bar的示意图。图6是具体实施方式三步骤c中构建载体pGl-bar-Crein的示意图。图7是具体实施方式三步骤c中用载体pGl-bar-Crein构建载体pGl-bar-Crein’的示意图。图8是具体实施方式三步骤c中构建载体p3300-gl-bar-Crein’的示意图。图9是具体实施方式三拟南芥的遗传转化及再生实验中转基因拟南芥在含有除草剂的MS培养基上的筛选情况图。图10是具体实施方式三拟南芥的遗传转化及再生试验中转基因拟南芥植株PCR检测结果图，图10中“M”泳道标样为Marker，“1”至“11”泳道标样为转基因拟南芥植株，“12”泳道标样为阳性对照，“13”泳道标样为负对照，“14”泳道标样为阴性对照。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式Cre重组酶重组基因命名为crein基因，crein基因的DNA序列如SEQ ID NO：1所示。本发明Cre重组酶重组基因crein基因的长度为1222bp，基因的头部位置为cre基因的前3个碱基、之后为TC(将原第4和第5位碱基替换为TC)+内含子intron(AF354045.1)序列、再后为cre基因的后1027个碱基。

为克隆本实施方式Cre重组酶重组基因——crein基因，本实施方式设计引物08crein1：5’-GCTCTAGAATGAGGTAAATTTCTAGTTTTTCTCCTTC-3’；引物crein2：5’-TTGGTGTACGGTCAGTAAATTGCTGTAACTATCATCATCATCAT-3’；和引物cre3：5’-GAGCATGCCTAATCGCCATCTTCCAGCA-3’。

引物08crein1中下划线部分为XbaI识别位点，引物cre3中下划线部分为SphI识别位点。

步骤a：扩增内含子intron序列

以植物表达载体pCAMBIA1305.1(含intron，AF354045.1)为模板、引物08crein1和引物crein2为引物进行PCR扩增反应，PCR扩增体系为20μL：由2.0μL 10×PCR buffer、2.0μL浓度为25mmol/L的MgCl₂、0.2μL浓度为10mmol/L的dNTPs、1μL浓度为10mmol/L的引物08crein1、1μL浓度为10mmol/L的引物crein2、0.2μL浓度为100ng/μL的植物表达载体pCAMBIA1305.1、0.2μL浓度为2.5U/μL的Pfu酶和余量的ddH₂O组成；PCR扩增条件为94℃预变性7min；(94℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸30s)30个循环；72℃延伸7min；所得PCR产物命名为pfu1305.1。

步骤b、以质粒pMM23为模板、pfu1305.1为引物对cre基因进行单引物扩增，PCR扩增体系为20μL：由2.0μL 10×PCR buffer、2.0μL浓度为25mmol/L的MgCl₂、0.2μL浓度为10mmol/L的dNTPs、0.5μL浓度为20ng/μL的pfu1305.1、0.2μL浓度为20ng/μL的质粒pMM23、0.2μL浓度为2.5U/μL的Pfu酶和余量的ddH₂O组成；PCR扩增条件为94℃预变性7min；(94℃变性30s、52℃退火40s、72℃延伸2.5min)5个循环；即获得了crein基因。

步骤a、b扩增产物用质量浓度为1％的琼脂糖凝胶进行凝胶电泳检测，电泳缓冲液为1×TAE，保持100V恒压(4～5V/cm)，电泳时间为30min。

步骤c、取1μL步骤b扩增产物(crein基因)为模板、引物08crein1和引物cre3为引物进行全长crein基因的双引物扩增

PCR扩增体系为20μL：由2.0μL 10×PCR buffer、2.0μL浓度为25mmol/L的MgCl₂、0.2μL浓度为10mmol/L的dNTPs、1μL浓度为10mmol/L的引物08crein1、1μL浓度为10mmol/L的引物cre3、0.2μL crein基因(浓度约为20ng/μL)、0.2μL浓度为2.5U/μL的pfu酶和余量的ddH₂O组成；PCR扩增条件为94℃变性7min，94℃变性20s、56℃退火30s、72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸7min；即得到Cre重组酶重组基因——crein基因。

步骤c扩增产物用质量浓度为1％的琼脂糖凝胶进行凝胶电泳检测，电泳缓冲液为1×TAE，保持100V恒压(4～5V/cm)，电泳时间为30min。

本实施方式中使用的药品、试剂、酶、感受态细胞和质粒等均容易购得，若无特殊要求则浓度为产品标注浓度。本实施方式中的操作步骤参见试剂盒使用操作手册。

本实施方式步骤a所得产物pfu1305.1是具有cre5’的内含子序列，步骤b以步骤a PCR反应产物为引物进行全长crein基因的扩增，此步骤以含有cre基因的质粒pMM23为模板，以pfu1305.1为引物，但由于是单引物扩增，PCR产物量少，加之对此步骤进行优化非常困难，所以本实施方式少数几个循环获得一定的模板即crein基因后终止反应，进入到步骤c，进行crein基因的双引物即指数扩增。基因制备过程很完整，没有问题。

具体实施方式二：本实施方式Cre/loxP介导的转基因安全性植物表达载体包含标记基因bar、crein基因、热激启动子hsp和组成型启动子CaMV35S，标记基因bar和crein基因共同位于2个同向的loxP位点内，其中crein基因由热激启动子hsp驱动，标记基因bar由组成型启动子CaMV35S驱动。

本实施方式crein基因可用于Cre/loxP位点特异性重组系统，本实施方式应用crein基因进行植物的遗传转化，通过半定量RT-PCR方法检测，cre的表达效率提高了10％～20％。此外，由于crein基因在cre内部引入了190bp的内含子序列，因此避免了其在原核生物(如大肠杆菌和农杆菌)中的渗漏表达，从而为其与loxP位点共同存在于一个系统中的操作提供了便利。

本实施方式Cre/loxP介导的转基因安全性植物表达载体的特点是在正常的生长发育温度下热激启动子hsp不具启动子活性，表现为对除草剂的抗性；而多克隆位点的存在允许了外源目的基因的组装，允许选择抗性基因和目的基因协同进入到宿主细胞当中。因此，当本实施方式Cre/loxP介导的转基因安全性植物表达载体转化完成以后，可以用热激处理(42℃)的方法，去除选择标记基因。Cre作为一种重组酶，为了防止其在植物当中再次发生整合反应，在去除标记基因的同时，它也一并从植物基因组中自身删除。

利用本实施方式构建的Cre/loxP介导的转基因安全性植物表达载体可以在转基因当代利用除草剂进行转基因植株的筛选，而且当转化完成后即可通过1～3h的42℃热处理去除标记基因，而不必通过杂交、共转化等方式，从而达到获得转基因安全性植株的目的。

具体实施方式三：本实施方式Cre/loxP介导的转基因安全性植物表达载体的按以下步骤构建：

步骤a、热激启动子Gmhsp 17.5(hsp)的获得：

①设计PCR反应引物

引物hsp1：5’-CATAAGCTTTTTCCACTTCAATTCCTCCTCT-3’；

引物hsp2：5’-GTTCTAGATGAGATCGCAAACAGGTAACTT-3’；

引物hsp1中下划线部分为HindIII识别位点，引物hsp2中下划线部分为XbaI识别位点。

②PCR扩增反应

PCR扩增体系为20μL：由2.0μL 10×PCR buffer、2.0μL浓度为25mmol/L的MgCl₂、0.2μL浓度为10mmol/L的dNTPs、1μL浓度为10mmol/L的引物hsp1、1μL浓度为10mmol/L的引物hsp2、0.2μL大豆基因组DNA(浓度约为100ng/μL)、0.2μL浓度为2.5U/μL的Pfu酶和余量的ddH₂O组成；PCR扩增条件为94℃变性10min，94℃变性1min、46℃退火1min、72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸10min。

步骤b、获得启动子-除草剂抗性基因-终止序列(CaMV35s-bar-Tnos)

①设计PCR反应引物

引物SMbar3：5’-CGAAGCTTTATTGGCTAGAGCAGCTT-3’；

引物SMbar4：5’GACCCGGGGTACTGAATTAACGCCGA-3’；

引物SMbar3中下划线部分为EcoR I识别位点，引物SMbar4中下划线部分为Sma I识别位点。

②PCR扩增反应

PCR扩增体系为20μL：由2.0μL 10×PCR buffer、2.0μL浓度为25mmol/L的MgCl₂、0.2μL浓度为10mmol/L的dNTPs、1μL浓度为10mmol/L的引物SMbar3、1μL浓度为10mmol/L的引物SMbar4、0.2μL质粒pCAMBIA3301(含CaMV35s-bar-Tnos，AF354045.1)(浓度约为20ng/μL)、0.2μL浓度为2.5U/μL的tag酶和余量的ddH₂O组成；PCR扩增条件为94℃变性7min，94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸3min，30个循环，72℃延伸7min。

步骤c、构建转基因安全性植物表达载体

①构建载体pGl-bar

采用Pst I酶对质粒pGl-GUS(质粒pGl-GUS由北京大学生命科学学院林忠平教授馈赠)进行酶切，回收酶切片段Gl-GUS后用T4-DNA聚合酶补平，再利用T4-DNA连接酶进行自连(如图4所示)，转化大肠杆菌DH5α，挑取转化克隆培养并提取质粒，经酶切鉴定后得到所需的重组质粒，该质粒中PstI酶切位点消失，被命名为质粒pGl-GUS’；(质粒pGl-GUS有一个Pst I酶切位点，该Pst I酶切位点不是多功能酶切位点)；

将步骤b获得的启动子-除草剂抗性基因-终止序列(CaMV35s-bar-Tnos)连接到pGEM-T Easy载体上(如图3所示)，然后转化到大肠杆菌DH5α中，挑取转化克隆培养并提取质粒，经酶切、PCR鉴定后得到所需的重组质粒，被命名为pT-35Sbar；

用Sma I酶与EcoR I酶分别对质粒pGl-GUS’与重组质粒pT-35Sbar进行双酶切(在质粒pGl-GUS’的GUS基因片段两端与重组质粒pT-35Sbar的CaMV35s-bar-Tnos基因片段两端均有一个Sma I酶切位点和一个EcoR I酶切位点)，酶切后回收质粒pGl-GUS’中较大的片段(作为此步构建的连接载体)和CaMV35s-bar-Tnos片段(作为此步构建的目的片段)，然后利用T4-DNA连接酶进行连接(如图5所示)，转化大肠杆菌DH5α，挑取转化克隆培养并提取质粒，经酶切鉴定和PCR鉴定后得到所需的重组质粒，即得到载体pGl-bar。

②构建载体phsp-cre

本实施方式步骤a中所得的PCR产物热激启动子hsp与质粒pMM23用酶Xba I与酶HindIII分别进行双酶切(质粒pMM23的CaMV35S启动子和hsp片段两端分别具有一个Xba I酶切位点和HindIII酶切位点)，然后回收质粒pMM23酶切大片段(作为此步构建的载体)，与酶切后的hsp(作为此步构建的目的片段)用T4-DNA连接酶进行连接，转化大肠杆菌DH5α，挑取转化克隆培养并提取质粒，经酶切鉴定后得到所需的重组质粒，即为载体phsp-Cre。

③构建载体phsp-Crein

将crein基因连接到pGEM-T Easy载体上(如图1所示)并转化到大肠杆菌DH5a中，挑取转化克隆培养并提取质粒，经酶切鉴定后得到所需的重组质粒，被命名为pT-Crein.；

用Xba I和Sph I分别对重组质粒pT-Crein与载体phsp-Cre进行双酶切(重组质粒pT-Crein的crein基因片段的两端与载体phsp-Cre的cre基因片段的两端均具有Xba I和SphI酶切位点)，然后回收重组质粒pT-Crein酶切的crein基因片段(作为此步构建的目的片段)和酶切载体phsp-Cre中较长片段(作为此步构建的连接载体)，再用T4-DNA连接酶进行连接(如图2所示)，转化大肠杆菌DH5a，挑取转化克隆培养并提取质粒，经酶切、PCR鉴定后得到所需的重组质粒，即为载体phsp-Crein。

④构建载体pGl-bar-Crein(如图6所示)

用EcoR I酶对步骤c①中构建的载体pGl-bar(载体PGI-bar中具有一个EcoR I酶切位点和一个HindIII酶切位点)进行单酶切，回收酶切产物纯化后用Klenow Fragement进行补平，再用HindIII进行酶切，回收EcoR I酶切位点消失的大片段(作为此步构建的连接载体)；

用Sac I酶对质粒phsp-Crein(载体phsp-Crein中hsp-Crein-Tnos片段两端具有Sac I与HindIII酶切位点)进行单酶切并回收酶切产物，经纯化后用T4-DNA聚合酶补平，再用HindIII进行酶切，回收Sac I酶切位点消失的hsp-Crein-Tnos片段(作为此步构建的目的片段)；

将本步骤回收的连接载体和目的片段用T4-DNA连接酶进行连接，转化大肠杆菌DH5α，挑取转化克隆培养并提取质粒，经酶切、PCR鉴定后得到所需的重组质粒，即为载体pGl-bar-Crein。

⑤构建载体p3300-gl-bar-Crein’(如图8所示)

用HindIII酶对载体pGl-bar-Crein进行酶切，纯化后用Klenow Fragement进行补平(因此HindIII酶切位点在该载体中消失)，再用T4-DNA连接酶进行连接(如图7所示)，转化大肠杆菌DH5α，挑取转化克隆培养并提取质粒，经酶切、PCR鉴定后得到所需的重组质粒，即得到载体pGl-bar-Crein’；

本实施方式中以pCAMBIA3300为转基因安全性植物表达载体的基本骨架，用Xho I酶对pCAMBIA3300进行酶切，纯化后用Klenow Fragement补平，再利用Sac I酶进行酶切，回收酶切大片段作为构建安全性植物表达载体的连接载体；

对含有目片段的载体pGl-bar-Crein’用Spe I酶切、纯化后用KlenowFragement补平再利用Sac I酶进行酶切，得到连接目的片段；

将本步骤回收的连接载体和连接目的片段用T4-DNA连接酶进行连接，转化大肠杆菌DH5α，挑取转化克隆培养并提取质粒，经酶切、PCR鉴定后得到所需的重组质粒，即为Cre/loxP介导的转基因安全性植物表达载体p3300-gl-bar-Crein’。

本实施方式步骤a中以大豆基因组DNA为模板、引物hsp1和引物hsp2为引物扩增大豆Gmhsp 17.5热激启动子，得到长度为520bp的热激启动子片段，被命名为hsp。

本实施方式步骤b中以质粒pCAMBIA3301(含CaMV35s-bar-Tnos，AF354045.1)为模板，PCR扩增得到CaMV35s-bar-Tnos。

用本实施方式获得的Cre/loxP介导的转基因安全性植物表达载体p3300-gl-bar-Crein’转化根癌农杆菌，步骤如下所示：

一、氯化钙法制备根癌农杆菌感受态细胞

a.从LB平板(含50μg/mL利福平)上挑取新鲜的根癌农杆菌EHA105的单菌落，接种于10mL利福平浓度为50μg/mL的LB液体培养基中，在200r/min、28℃条件下振荡培养48h；

b.取根癌农杆菌对数生长期菌液，按1∶20的体积比接种于50mL利福平浓度为50μg/mL的LB液体培养基中，在200r/min、28℃条件下振荡培养至OD₆₀₀＝0.5(约培养4h)；

c.菌液冰浴30min，分装至离心管(容积为1.5mL)中以4000r/min离心6分钟，弃去离心上清液，用600μL灭菌的浓度为0.1mol/L的CaCl₂溶液重悬细胞沉淀，冰浴30min；

d.在4000r/min条件下离心10分钟，弃去离心上清液，用100μL灭菌的浓度为0.1mol/L的CaCl₂(加入体积占15％的灭菌甘油)溶液重悬菌体；即得到根癌农杆菌感受态细胞。

二、根癌农杆菌转化

a.将1μL本实施方式构建的Cre/loxP介导的转基因安全性植物表达载体p3300-gl-bar-Crein’加入到100μL的根癌农杆菌感受态细胞中，轻轻混匀，冰上放置30min，再置于液氮速冻6分钟，然后37℃温浴30min；

b.加入体积为800μL的无抗生素的LB液体培养基中，在200r/min、28℃条件下轻摇4h，消除感受态；

c.取100μL步骤b制备的菌液，均匀的涂布在利福平浓度为50μg/mL和卡那霉素浓度为50μg/mL的固体LB培养基的平板上，封口膜后于28℃的恒温箱中倒置培养36～48h，经PCR鉴定及酶切鉴定，得到pGl-bar-Crein’-gus转化的根癌农杆菌。

转基因试验：

拟南芥的遗传转化及再生

(1)拟南芥的种植

a.将种子置于冰箱4℃的环境内放置2～3天进行春化处理；

b.在温度24～28℃，空气湿度为70％～90％的温室中光照16h/天，光照强度为4000Lux；将草炭和硅石按1∶1的体积比装入营养钵中并浇透水，将拟南芥的种子与细沙混匀后均匀的播种于浇透水的营养钵中，不覆土；用无纺布覆盖营养钵约一周左右，即可出苗，揭去无纺布，每隔2～3天浇一次透水即可；

c.当植株长至茎高约3cm，去除其顶生花序，以刺激腋生花序的生长，从而增加花的数量，注意避免伤及腋生花序；待腋生花序长出，其下部的花已有授粉现象出现时进行转化，转化前，将已授粉的花以及果荚除掉。

(2)制备转化用的农杆菌菌液

挑取p3300-gl-bar-Crein’转化的根癌农杆菌的单菌落接种于10mL利福平浓度为50μg/mL和卡那霉素浓度为50μg/mL的LB液体培养基中，在200r/min、28℃条件下振荡培养48h，使菌体生长至对数生长后期(OD₆₀₀＝1.5～2.0)；培养液按1∶100稀释，再接种到50mL利福平浓度为50μg/mL和卡那霉素浓度为50μg/mL的LB液体培养基中，于200r/min、28℃条件下振荡培养至菌体生长至对数后期(OD₆₀₀＝1.5～2.0，时间约为24h)；终止培养后以4000r/min离心10min收集菌体，用MS液体培养基悬浮菌体(OD₆₀₀＝0.7左右)；即得到农杆菌花序浸染液(应立即进行花序浸泡转基因实验)。

(3)农杆菌花序侵染法转化

在上午10点到下午1点开花盛期，除去花序上未开放的花蕾和以前已开放的花朵，留下正在开放的花朵和即将开花的拟南芥植株倒置，使花蕾朝下并浸入农杆菌花序浸染液中，浸泡约15min；转化后将植株平放，并覆上保鲜膜，在黑暗条件下放置24小时，然后置于正常光照条件下生长，一周后选植株开花旺盛的时候可再转化一次(方法同上)，以提高转化效率，直至收获种子。

(4)转基因植株的分析

a.收获经农杆菌转化的拟南芥种子，干燥后于4℃的冰箱内放置2～4天，进行春化作用；

b.种子处理：

种子用体积浓度为70％酒精消毒30s，再用质量浓度为10％的NaClO消毒15min，期间不断摇晃，然后用灭菌水冲洗3～4遍；再将种子均匀播种到1/2MS培养基上(筛选培养基的ppt浓度为3.0mg/L)，放到培养室培养(光照16h/天，温度为25℃、湿度50％～70％)；7天后可用于检测判断转基因植株。

本实施方式拟南芥的遗传转化及再生获得的转基因拟南芥在含有除草剂的MS培养基上的筛选情况(如图9所示，黄色枯萎的为未转化植株，绿色生根的为转基因植株，箭头标出了转基因植株)。

对本实施方式转基因拟南芥植株进行PCR检测，检测结果如图10所示。转化Cre/loxP介导的转基因安全性植物表达载体p3300-gl-bar-Crein’的拟南芥转基因植株中90.9％扩增出大小为1032bp(去除内含子)的条带，说明90.9％转基因成功。

将转基因成功的转基因拟南芥进行选择标记基因去除试验

转基因当代拟南芥植株热激处理：选择6个单拷贝转基因植株系于42℃热激处理2h，共处理三次，每次处理间隙在25℃条件下恢复培养12h。热激处理后在25℃、光照16h/天的条件下任其生长开花结实。取其种子在含有除草剂的MS培养基上进行生根试验，观察标记基因的删除情况(并以该6个转基因植株系未热激处理作为对照)如表1所示。

表1

注：HS为热激诱导，NHS为未诱导。

转基因子代拟南芥植株热激处理：选择3个单拷贝转基因植株系25℃、光照16h/天的条件下任其生长开花结实。分别取各株系的种子在28℃萌动24h，然后在42℃热激处理2h，再在28℃条件下恢复培养24h，如此热激处理和恢复培养循环往复至萌发。然后在含有除草剂的MS培养基上进行生根试验，观察标记基因的删除情况(并以该3个转基因植株系未热激处理作为对照)如表2所示。

表2

注：HS为热激诱导，NHS为未诱导。

表1和表2的试验数据说明对转基因当代以及转基因后代(子代)拟南芥植株进行热激处理，标记基因即发生了自删除，如此转基因后代只含有目的基因而不含有标记性状，可认为利用本实施方式Cre/loxP介导的转基因安全性植物表达载体进行转基因是安全的。

序列表

<110>东北农业大学

<120>Cre重组酶重组基因及Cre/loxP介导的转基因安全性植物表达载体

<160>8

<210>1

<211>1222

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<222>Cre重组酶重组基因序列

<400>1

atgtcgtaaa tttctagttt ttctccttca ttttcttggt taggaccctt ttctcttttt 60

atttttttga gctttgatct ttctttaaac tgatctattt tttaattgat tggttatggt 120

gtaaatatta catagcttta actgataatc tgattacttt atttcgtgtg tctatgatga 180

tgatgatagt tacagcaatt tactgaccgt acaccaaaat ttgcctgcat taccggtcga 240

tgcaacgagt gatgaggttc gcaagaacct gatggacatg ttcagggatc gccaggcgtt 300

ttctgagcat acctggaaaa tgcttctgtc cgtttgccgg tcgtgggcgg catggtgcaa 360

gttgaataac cggaaatggt ttcccgcaga acctgaagat gttcgcgatt atcttctata 420

tcttcaggcg cgcggtctgg cagtaaaaac tatccagcaa catttgggcc agctaaacat 480

gcttcatcgt cggtccgggc tgccacgacc aagtgacagc aatgctgttt cactggttat 540

gcggcggatc cgaaaagaaa acgttgatgc cggtgaacgt gcaaaacagg ctctagcgtt 600

cgaacgcact gatttcgacc aggttcgttc actcatggaa aatagcgatc gctgccagga 660

tatacgtaat ctggcatttc tggggatggc ttataacacc ctgttacgta tagccgaagt 720

tgccaggatc agggttaaag atatctcacg tactgacggt gggagaatgt taatccatat 780

tggcagaacg aaaacgctgg ttagcaccgc aggtgtagag aaggcactta gcctgggggt 840

aactaaactg gtcgagcgat ggatttccgt ctctggtgta gctgatgatc cgaataacta 900

cctgttttgc cgggtcagaa aaaatggtgt tgccgcgcca tctgccacca gccagctatc 960

aactcgcgcc ctggaaggga tttttgaagc aactcatcga ttgatttacg gcgctaagga 1020

tgactctggt cagagatacc tggcctggtc tggacacagt gcccgtgtcg gagccgcgcg 1080

agatatggcc cgcgctggag tttcaatacc ggagatcatg caagctggtg gctggaccaa 1140

tgtaaatatt gtcatgaact atatccgtaa cctggatagt gaaacagggg caatggtgcg 1200

cctgctggaa gatggcgatt ag 1222

<210>2

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<222>Cre重组酶重组基因PCR扩增用引物08crein1。

<400>2

gctctagaat gaggtaaatt tctagttttt ctccttc 37

<210>3

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<222>Cre重组酶重组基因PCR扩增用引物crein2。

<400>3

ttggtgtacg gtcagtaaat tgctgtaact atcatcatca tcat 44

<210>4

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<222>Cre重组酶重组基因PCR扩增用引物ere3。

<400>4

gagcatgcct aatcgccatc ttccagca 28

<210>5

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<222>PCR扩增热激启动子Gmhsp 17.5设计的引物hsp1。

<400>5

cataagcttt ttccacttca attcctcctc t 31

<210>6

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<222>PCR扩增热激启动子Gmhsp 17.5设计的引物hsp2。

<400>6

gttctagatg agatcgcaaa caggtaactt 30

<210>7

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<222>PCR扩增启动子-除草剂抗性基因-终止序列设计的引物SMbar3。

<400>7

cgaagcttta ttggctagag cagctt 26

<210>8

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<222>PCR扩增启动子-除草剂抗性基因-终止序列设计的引物SMbar4。

<400>8

gacccggggt actgaattaa cgccga 26

Claims

1.Cre重组酶重组基因，其特征在于Cre重组酶重组基因命名为crein基因，crein基因的DNA序列如下所示：

ATGTCGTAAATTTCTAGTTTTTCTCCTTCATTTTCTTGGTTAGGACCCTTTTCTCTTTTTATTTTTTTGAGCTTTGATCTTTCTTTAAACTGATCTATTTTTTAATTGATTGGTTATGGTGTAAATATTACATAGCTTTAACTGATAATCTGATTACTTTATTTCGTGTGTCTATGATGATGATGATAGTTACAGCAATTTACTGACCGTACACCAAAATTTGCCTGCATTACCGGTCGATGCAACGAGTGATGAGGTTCGCAAGAACCTGATGGACATGTTCAGGGATCGCCAGGCGTTTTCTGAGCATACCTGGAAAATGCTTCTGTCCGTTTGCCGGTCGTGGGCGGCATGGTGCAAGTTGAATAACCGGAAATGGTTTCCCGCAGAACCTGAAGATGTTCGCGATTATCTTCTATATCTTCAGGCGCGCGGTCTGGCAGTAAAAACTATCCAGCAACATTTGGGCCAGCTAAACATGCTTCATCGTCGGTCCGGGCTGCCACGACCAAGTGACAGCAATGCTGTTTCACTGGTTATGCGGCGGATCCGAAAAGAAAACGTTGATGCCGGTGAACGTGCAAAACAGGCTCTAGCGTTCGAACGCACTGATTTCGACCAGGTTCGTTCACTCATGGAAAATAGCGATCGCTGCCAGGATATACGTAATCTGGCATTTCTGGGGATGGCTTATAACACCCTGTTACGTATAGCCGAAGTTGCCAGGATCAGGGTTAAAGATATCTCACGTACTGACGGTGGGAGAATGTTAATCCATATTGGCAGAACGAAAACGCTGGTTAGCACCGCAGGTGTAGAGAAGGCACTTAGCCTGGGGGTAACTAAACTGGTCGAGCGATGGATTTCCGTCTCTGGTGTAGCTGATGATCCGAATAACTACCTGTTTTGCCGGGTCAGAAAAAATGGTGTTGCCGCGCCATCTGCCACCAGCCAGCTATCAACTCGCGCCCTGGAAGGGATTTTTGAAGCAACTCATCGATTGATTTACGGCGCTAAGGATGACTCTGGTCAGAGATACCTGGCCTGGTCTGGACACAGTGCCCGTGTCGGAGCCGCGCGAGATATGGCCCGCGCTGGAGTTTCAATACCGGAGATCATGCAAGCTGGTGGCTGGACCAATGTAAATATTGTCATGAACTATATCCGTAACCTGGATAGTGAAACAGGGGCAATGGTGCGCCTGCTGGAAGATGGCGATTAG。

2.Cre/loxP介导的转基因安全性植物表达载体，其特征在于Cre/loxP介导的转基因安全性植物表达载体包含标记基因bar、crein基因、热激启动子hsp和组成型启动子CaMV35S，标记基因bar和crein基因共同位于2个同向的loxP位点内，其中crein基因由热激启动子hsp驱动，标记基因bar由组成型启动子CaMV35S驱动。