CN105566465A - 一种玉米开花调控蛋白、编码基因及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种玉米开花调控蛋白、编码基因及应用，该调控蛋白是如下a)或b)的蛋白：a)由序列表中序列9所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)在序列表中序列9的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与开花相关的由a)衍生的蛋白质。本发明还公开了所述调控蛋白的编码基因。该调控蛋白、编码基因是可以显著促进植物的开花，在调控植物开花方面具有重要的应用前景。

Description

一种玉米开花调控蛋白、编码基因及应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，更具体的说，涉及一种与玉米开花性相关的调控蛋白、编码基因及应用。

背景技术

植物开花不仅影响着植物能否正常的繁衍后代，而且直接关系到农作物的产量。已有研究表明，开花素通过运输系统到达顶端分生组织，激活其他基因的表达，最终促使植物开花。作物开花转换时间决定了不同品种的作物在不同区域的适应能力和产量。因此，对作物开花调控基因的克隆和鉴定对农业生产具有重要的理论意义和应用前景。

各种植物在经过足够的营养生长后就会在合适的环境下从营养生长转变到生殖生长。种子植物复杂而精确的调控网络确保植株在最适条件下开花，完成后代的繁殖。开花时间是由多种基因被外界特定的时空环境诱导表达并相互作用所后决定：首先，植物生长到一定阶段，通过叶片等部位可以感受到外界开花诱导因子，诱导因子激活整合因子，整合因子进一步促进花分生组织特定基因和花器官分生组织基因的表达，最后通过激活多个花器官决定基因形成花。研究发现植物具有环境温度(ambienttemperature)、光周期途径(photoperiod)、自主途径(autonomous)、春化途径(vernalization)、年龄(age)和赤霉素(gibberellin)等六条开花调控途径。

在模式植物拟南芥中，开花调控途径研究的最为清楚。光周期响应因子是CO基因，春化途径和自主途径有共同的响应因子FLC基因，年龄发育响应因子为SPL基因，而赤霉素途径响应因子则是SOC1基因，SVP基因同时可以响应赤霉素，自主和春化等途径。这些响应因子并不能直接与花器官决定因子产生作用，需要一些能够传递到开花控制相关的核心因子，即开花信号整合因子，如拟南芥中的FT基因和SOC基因。这些整合因子接受开花促进信号或者开花抑制信号后，单独或与其他蛋白相互作用后形成多聚体，作用于花分生组织决定基因LFY和AP1，促使这些基因的表达量上升或者下调，这些基因也组成二聚体或者多聚体调节使花器官建成因子表达，花器官形成。

SOC1(SUPPRESSOROFOVEREXPRESSIONOFCONSTANS1)基因广泛存在于种子(单子叶和双子叶)植物中，它属于MIKC转录因子家族。SOC1在拟南芥的各种开花调控途径中具有重要作用，它不仅是信号通路中的响应因子，同时还是整合这些调控路径中的信号整合因子，能够调节开花时间。

另一个转录因子AGL24是MADS转录因子家族一员，光周期途径、GA途径、春化途径和自主途径都会影响AGL24表达，AGL24在叶片、根、茎和花序组织中均广泛地表达，并且在这些组织中的时空表达模式与SOC1相同。微阵列(Mircoarray)分析表明：AGL24和SOC1能够通过结合到对方的启动子上相互提高对方的表达水平，在赤霉素开花途径中，AGL24与SOC1通过蛋白互作方式来调控LFY的表达，表明了开花整合信号AGL24和SOC1能互相形成正反馈回路。FT-FD蛋白与SOC1蛋白形成复合体后，在顶端分生组织中激活了花分生组织特性基因AP1、FΜL和LFY的表达，进而在顶芽中启动花器官的形成。在植物中，并非所有的SOC1同源基因均具有促进开花的功能，如矮牵牛UNS(UNSHAVEN)基因与拟南芥SOC1是同源基因，但是UNS的作用却与SOC1相反，它对花分生组织基因的表达和花器官的建成具有负调控作用。

在花芽形成的过程中，LFY主要受SOC1调节，AP1主要受FT调控。当花分生组织特异性基因发生突变时，植物会产生茎芽而不是花芽。SOC1可以诱导LFY茎尖表达形成分生组织，过量表达SOC1的植株会促使LFY表达量升高，而SOC1功能缺失性突变体则降低了LFY的表达。拟南芥染色质免疫沉淀实验表明，SOC1蛋白是通过与AGL24结合形成聚合体后再进入细胞核，然后直接与LFY启动子中的CArG域结合，激活LFY基因的转录来调控相应蛋白的含量，从而促进开花。

发明内容

本发明的主要目的在于：提供一种玉米开花调控蛋白、编码基因及应用，该调控蛋白、编码基因来源于玉米B73。

在本发明的第一方面，提供玉米开花调控蛋白，名称为ZmSOC1蛋白，来源于玉米B73，属MADS类转录因子，是如下a)或b)的蛋白：

a)由序列表中序列9所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)在序列表中序列9的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与开花相关的由a)衍生的蛋白质。

其中，序列表中序列9包括232个氨基酸。本发明的ZmSOC1蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

在本发明的第二方面，提供玉米开花调控编码基因，名称为ZmSOC1基因，所述玉米开花调控编码基因是如下1)或2)或3)的基因：

1)其核苷酸序列是序列表中序列8；

2)在严格条件下与序列8限定的DNA片段杂交且与植物开花相关蛋白的DNA分子；

3)与1)或2)的基因具有90％以上的同源性，且编码与植物开花相关的蛋白的DNA分子。

其中，序列表中序列8由696个核苷酸组成，编码序列表中序列9所示的蛋白。

扩增ZmSOC1基因全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

含有上述ZmSOC1基因的重组载体也属于本发明的保护范围。

在本发明的第三方面，本发明对ZmSOC1蛋白、ZmSOC1基因的功能进行了研究，表明该基因和其编码的蛋白是可以显著促进植物的开花，在调控植物开花方面具有重要的应用前景，可以作为转基因植物的目的基因，ZmSOC1蛋白、ZmSOC1基因、包含ZmSOC1基因的重组表达载体在转基因植物中的应用属于本发明的保护范围。

本发明把ZmSOC1基因构建到植物表达载体上，启动子为Ubiqutin，得到过表达质粒，将其转化到农杆菌EHA105中，用农杆菌转化拟南芥并获得了转基因植株。把转基因植株与未转基因的野生型植株在正常生长条件下进行比较，结果表明，ZmSOC1基因的过表达导致植物开花提前，说明ZmSOC1基因参与了植物的开花调控。

附图说明

以下将结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明。附图中：

图1为ZmSOC1蛋白的亚细胞定位图；

图2为ZmSOC1蛋白在逆境条件下的表达；

图3为ZmSOC1过表达载体图谱；

图4为ZmSOC1转基因拟南芥开花时莲座叶统计。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1ZmSOC1基因的克隆

以玉米B73的总RNA为模板进行RT-PCR扩增，PCR引物如下：

上游引物，即引物序列1：

5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGTGCGGGGCAAGACGCAGAT-3’；

下游引物，即引物序列2：

5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGCCTGACCTGACCGCCACTG-3’。

扩增条件：

扩增出DNA片段从琼脂糖胶中回收，利用GATEWAY重组系统的BP反应将PCR产物重组到pDONR221载体，转化E.coli，酶切鉴定后测序。测序结果表明：成功获得了玉米ZmSOC1基因的CDS序列，其序列如序列8所示，大小为696bp。将该基因命名为ZmSOC1基因，其编码蛋白的氨基酸序列如序列9所示。

实施例2拟南芥ZmSOC1亚细胞定位分析

转录因子的特征之一是定位于细胞核中，并在细胞核中执行其转录调控功能。为此，利用原生质体转化的方法在原生质体中对玉米ZmSOC1蛋白的亚细胞定位进行了研究。

载体构建：利用GATEWAY的LR反应将pDONR221载体上的ZmSOC1基因重组到pK7WFG2载体上，与GFP(绿色荧光蛋白)形成融合基因表达载体，由35S启动子驱动表达。

拟南芥叶片原生质体的制备：选取长势良好的拟南芥叶子，用刀片切成0.5mm宽的叶条。将切好的叶条放入预先配置好的酶解液(1.5％CellμLaseR10,0.4％macerozymeR10,0.4Mmannitol,20mMKCl,20mMMES,pH5.7,10mMCaCl2,and0.1％BSA)中(每5-10ml酶解液大约需10-20片叶子)。并用镊子帮助使叶子完全浸入酶解液，50转/分钟条件下酶解5～6h。

原生质体的转化：

1)100g离心10分钟使原生质体沉淀在管底，然后用适量MMG溶液(0.4Mmannitol,15mMMgCl₂,and4mMMES,pH5.7)重悬原生质体，使之最终浓度在2×10⁵个/ml。

2)每100μL原生质体加入10μLDNA(10μLDNA约5-10kb的质粒DNA)至2ml离心管中，轻柔混合。

3)加入等体积110μlPEG溶液(40％PEG[v/v],0.2Mmannitol,and0.1MCaCl₂)，轻柔拍打离心管完全混合。诱导转化混合物10分钟。

4)100g离心2分钟去上清后，用1mLWI溶液(0.5Mmannitol,20mMKCl，4mMMES,pH5.7)轻柔重悬原生质体。

5)室温下(20-25℃)诱导原生质体14小时以上。以上所有操作在室温下进行。

GFP表达情况观察：在激光共聚焦显微镜下观察GFP表达，图1示出了ZmSOC1蛋白的亚细胞定位图，如图1所示，ZmSOC1蛋白定位于细胞核中。

实施例3ZmSOC1基因在非生物逆境条件下的表达分析

玉米材料的处理：选取健康饱满的玉米自交系“齐319”种子用0.5％的H₂O₂浸泡约24小时，自来水冲洗后转移至铺有一层湿润滤纸的培养皿中，置于28℃培养箱中培养。待玉米种子胚根伸出约5mm，将其播种在湿润的蛭石中，生长约20天后，玉米幼苗长至三叶一芯时，将其从蛭石中小心取出，尽量避免伤及根部，用清水将根部附着的蛭石冲洗干净，水中静置2小时以消除创伤刺激。

胁迫诱导：幼苗根部分别进行如下处理：干燥处理，NaCl溶液浸泡(250mM)，PEG6000溶液浸泡(20％)，ABA溶液浸泡(100μM)，SA溶液浸泡(100μM)和4度冷处理。然后分别在0h，0.5h，1h，3h，6h，12h，24h以每组3棵为单位分地上地下部取材，水处理同样取材，作为对照CK。

RNA的提取及DNA的去除：

1)取约200mg处理的玉米材料，液氮研磨，用Trizol试剂(Invitrogen)提取RNA。

2)将RNA溶于85μL水中，加入10倍buffer10μL和5μLRQ1RNAFreeDNase(1U/μL)，37℃，15min，以去除DNA的污染。

3)加入100μL的酚氯仿抽提一次，取上清，用等体积的异丙醇沉淀RNA，70％的乙醇洗一次，溶于50μL的水中。

4)定量RNA的浓度为1μg/μL。

RT-qPCR：按照Promega公司的GoScript^TMReverseTranscriptionSystem(PromegaA5000)，取OligodT₁₈1μL(0.5μg/μL)，RNA5μL(1μg/μL)，dNTP1μL(10mM)，水27μL；65℃处理5min；0℃处理2min；加入5倍buffer10μL，DTT(100mM)5μL，RNaseInhibitor10U(40U/μL)；42℃处理2～5min；加入M-MLV1μL(200u/μL)；42℃处理50min；70℃处理15min灭活，备用。

将CDS稀释3倍作为荧光定量PCR的模板，玉米Actin1基因作为内参。引物设计如下：

上游引物，即引物序列3：5’-ACCTCACCGACCACCTAATG-3’；

下游引物，即引物序列4：5’-CTGAACCTTTCTGACCCAAT-3’；

上游引物，即引物序列5：5’-TCGAGTCAGCACCAAACCG-3’

下游引物，即引物序列6：5’-TTGAGCATGTTCCTATGCCTTC-3’

荧光定量用promega公司的qPCRMasterMix在ABI7500上采用两步法进行。

qPCR反应体系：模板1μL，2倍PCRbuffer10μL，0.5μL10mMprimerFW，0.5μL10mMprimerRV，8μLH₂O。

PCR条件：

采用2^-ΔΔCt法计算不同处理条件下ZmSOC1基因的表达量。图2示出了ZmSOC1基因在逆境条件下的表达，图2(A)为ZmSOC1基因在干燥条件下的表达量；图2(B)为ZmSOC1基因在低温条件下的表达量；图2(C)为ZmSOC1基因在PEG6000处理下的表达量；图2(D)为ZmSOC1基因在ABA处理下的表达量；图2(E)为ZmSOC1基因在高盐下的表达量；图2(F)为ZmSOC1基因在SA处理下的表达量。结果表明，在干旱、高盐等逆境条件下ZmSOC1基因的表达受到抑制。

实施例4转基因拟南芥的获得

载体构建：利用GATEWAY的LR反应直接将pDONR221载体上的ZmSOC1基因重组到植物表达载体pGWCVP64，获得过表达载体，图3示出了过表达载体图谱，将其命名为pGWCVP64-ZmSOC1质粒，简称pGWZmSOC1。转化E.coli，酶切鉴定后测序，确定目的基因已经重组于载体上。将该质粒转化到农杆菌EHA105中。

拟南芥转化：挑取阳性的农杆菌单菌落，接种于5mL的LB液体培养基(Kan50mg/L，Rif50mg/L)中，28℃，250rpm培养约20h。将活化的菌液1：500转接入含200mL的YEP培养基(Kan50mg/L，Rif50mg/L)的500ml锥形瓶中，28℃，200rpm继续培养约14h；至OD₆₀₀＝1.5～3.0时即可。4℃，5000rpm离心10min，收集菌体，弃上清；加入2倍体积10％蔗糖(含0.02％SilwetL-77)，将菌体充分悬浮。转化前剪去拟南芥中已经长出的小果荚，将菌液置于于大培养皿中，将拟南芥花浸泡在菌液中约40s后取出，用吸水纸将残余菌液吸去，将浸染后的拟南芥倒置避光培养24h后正常培养，收集种子。

实施例5转基因植株的抗性筛选和PCR检测

转基因植株的抗性筛选和PCR检测：将收集到的T0代转基因拟南芥种子消毒后，播种在1/2MS培养基上(含Bar20mg/L)，春化3天,放置于培养箱(22℃，光照16小时；18℃，暗8小时)中培养。约7天后在Bar抗性培养板上出现黄化苗和绿苗，转基因植株表现为Bar抗性，呈正常绿色，非转基因植株呈黄色。将绿苗移至1/2MS培养板上5天恢复生长后，转移至土中。当转移至土中的苗长至10-12片叶子时，提取基因组DNA，进行PCR鉴定。

拟南芥基因组的DNA提取：拟南芥苗子生长到10-12片叶子时可剪取叶片，置于1.5mL离心管中，加入适量液氮，用预冷的玻璃研磨棒将其研磨成粉末，加入700μL的DNA提取液(100mMNaCl；100mMTris-HCl，pH8.5；50mMEDTA；1％SDS)，60℃水浴30min。加入200μL酚：氯仿(1：1)混匀后，4℃，12000rpm离心10min。转移上清600μl，加入600μL异丙醇后混匀充分，-20℃放置15-20min。

4℃，12000rpm，15min离心后弃上清，75％乙醇洗涤DNA。

加入30μL超纯水(内含无DNA酶的20μg/mL胰RNA酶)，37℃放置30min去除RNA后，-20℃保存备用。

PCR鉴定：基因组DNA1μL；Taq酶1U；10倍buffer2μL；10mMdNTP0.5μL；

引物：

上游引物，即引物序列5：5’-TCGAGTCAGCACCAAACCG-3'；

下游引物，即引物序列7：5'-TCGCTACCGAGCATTCCAG-3'

各1μL，加水到20μL。

PCR扩增条件：

实施例6过表达ZmSOC1基因的拟南芥花期分析

将野生型及过表达ZmSOC1基因的转基因拟南芥各选取三个纯系(line1、line2、line3)在22度条件下，经过14小时光照和10小时黑暗处理下培养4周，统计开花时间，发现转基因拟南芥与野生型拟南芥(WT)相比：过表达ZmSOC1的植株在很少莲座叶(7.2-9.3片)的情况下就会抽苔和开花；野生型拟南芥抽苔开花不仅推迟了7天至10天。图4示出了ZmSOC1转基因拟南芥开花时莲座叶统计，如图4所示，抽苔时的莲座叶平均有14.5片，充分表明了过表达ZmSOC1能够促进拟南芥提早开花。

Claims (5)

1.一种玉米开花调控蛋白，是如下a)或b)的蛋白：

a)由序列表中序列9所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)在序列表中序列9的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与开花相关的由a)衍生的蛋白质。

2.权利要求1所述调控蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因是如下1)或2)或3)的基因：

1)其核苷酸序列是序列表中序列8；

2)在严格条件下与序列8限定的DNA片段杂交且与植物开花相关蛋白的DNA分子；

3)与1)或2)的基因具有90％以上的同源性，且编码与植物开花相关的蛋白的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述编码基因的重组表达载体。

5.权利要求1所述调控蛋白、权利要求2或3所述编码基因、权利要求4所述重组表达载体在转基因植物中的应用。