CN103820451B - 大豆逆境诱导基因启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一个大豆逆境诱导启动子GmNCED1，它涉及到以大豆（吉育72）基因组DNA为模板，利用染色体步移技术克隆GmNCED1基因启动子。GmNCED1基因启动子可以受盐碱、干旱、植物激素ABA以及低温胁迫所诱导，对盐胁迫极为敏感，基因主要在植物的根部表达；更适合利用植物基因工程手段培育抗逆作物新品种；为基因工程育种提供了优质的启动元件。

Description

大豆逆境诱导基因启动子及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一个大豆逆境诱导基因启动子及其在转基因植物中的应用。

背景技术

启动子是基因的一个组成部分，控制基因表达的起始时间和表达程度。启动子本身并不控制基因的功能，转录因子可以与基因的启动子结合而调控基因的表达。高等植物基因启动子主要可以分为三种类型：组成型启动子、组织特异性启动子与诱导型启动子。组成型启动子是应用最早、最广泛的一类启动子。其中应用最广泛的CaMV35S启动子为广大植物学工作者所认可。该启动子从花椰菜花叶病毒中克隆得到的，在植物的大部分组织中都具有高效的表达，CaMV35S启动子是基因功能鉴定的首选启动子。组织特异性启动子是一种只在特定组织中表达的启动子，如：根特异性表达启动子，种子特异性启动子等。而诱导型启动子在正常生长条件下几乎不表达，在特定诱导条件下才可以驱动目的基因的表达。

随着组成型启动子（如CaMV35S启动子）的广泛应用，人们发现组成型启动子并不适合通过基因工程手段改良作物性状。因为组成型启动子不仅可以驱动目的基因的超表达，而且这种超表达没有时间与空间的限制，即：在任何时间、任何地点目的基因的表达量均很高。这将造成植物自身能量消耗变大，所以组成型超表达的转基因植株多表现出植株矮小等形状。为了避免这个问题，组织特异性启动子与诱导型启动子的开发利用成为基因工程研究的一个热点。

植物诱导型启动子是指在某些特定的物理或化学信号的刺激下，该种类型的启动子可以大幅度地提高基因的转录水平。在没有信号刺激时，该启动子驱动的基因不表达或表达量很低。而在需要基因表达（具有相应信号刺激）时该基因大量表达，从而合理利用植物自身能量，达到调节植物信号并使植物适应刺激因素所带来的影响。植物逆境诱导启动子为在逆境条件下诱导表达的一类启动子，主要逆境胁迫为盐、盐碱、干旱及低温等。近年来随着气候变化等因素，低温、干旱与盐等环境因素对农作物的产量造成很大影响。为了提高作物的抗逆性以应对不良环境对农作物的影响，人们分离并鉴定了大量逆境诱导启动子。

发明内容

本发明的目的是提供大豆逆境诱导基因启动子。

大豆逆境诱导启动子GmNCED1基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；

所述的逆境诱导，是受盐碱、干旱、低温或植物激素ABA胁迫诱导。

大豆逆境诱导启动子GmNCED1基因的制备方法，它是以“吉育72”基因组DNA为模板，用引物：

NCED-F：gttatacacgtagatgcatgc

NCED-R：catgtgatggtgttggaattg

PCR扩增。

大豆逆境诱导启动子GmNCED1基因在培育转基因植物中的应用。

本发明提供了一个大豆逆境诱导启动子GmNCED1，它涉及到以大豆（吉育72）基因组DNA为模板，利用染色体步移技术克隆GmNCED1基因启动子。GmNCED1基因启动子可以受盐碱、干旱、植物激素ABA以及低温胁迫所诱导，对盐胁迫极为敏感，基因主要在植物的根部表达；更适合利用植物基因工程手段培育抗逆作物新品种；为基因工程育种提供了优质的启动元件。

附图说明

图1为大豆逆境诱导启动子GmNCED1的PCR检测，其中，M：DNA Marker DL2000；1：阴性对照；2：启动子PCR产物。

图2为GmNCED1基因启动子与GUS融合表达载体图。

图3为GUS组织化学染色结果。

具体实施方式

实施例1 提取大豆基因组DNA

将大豆“吉育72”（购买于种子公司）种子播在液体营养钵中，放在培养室中进行培养。取生长大豆幼苗嫩叶，按照植物基因组DNA小量提取试剂盒进行提取大豆基因组DNA。提取步骤如下：

（1）在 65℃水浴中预热buffer S1，同时预热洗脱缓冲液（EB）；

（2）取适量鲜嫩的大豆叶片，在液氮中充分碾磨；

（3） 转移研磨成功的细粉（约100mg）到一个新的的1.5ml EP管中，加入550μL 65℃预热buffer S1和7μL RNA酶，涡旋震荡至完全混合，室温条件下静止放置10分钟；

（4）在离心管中加入130 μL的buffer S2，需要涡旋震荡至完全混合，放入离心机内12000 rpm离心5 分钟；

（5）吸取上清置于蓝色分离柱A中，12000 rpm 离心1分钟，收集下液；

（6）加入1.5倍体积buffer S3后立即缓慢的上下颠倒数次至充分混合；

（7）将已得混合物（包括可能出现的白色絮状沉淀）加入至白色吸附柱AC中，12000 rpm离心1分钟，弃废液；

（8）加入700 μL 漂洗液WB，12000 rpm 离心1分钟，弃废液；

（9）重复步骤（8）一次；

（10）将吸附柱AC放回收集管中，12000 rpm 离心30秒；

（11）将吸附柱AC置于无核酸酶的EP管中，用事先预热的洗脱缓冲液EB洗脱，室温放置1-2分钟，12000 rpm 离心30秒，收集大豆基因组DNA。

实施例2 大豆GmNCED1基因启动子的克隆

以大豆基因组DNA为模板，利用引物NCED-F（gTTATACACgTAgATgCATgC）与NCED-R（CATgTgATggTgTTggAATTg）对GmNCED1基因启动子进行克隆，PCR体系见表1，PCR程序为94℃预变性10分钟，94℃变性1分钟，60℃退火1分钟，延伸2分钟，共进行35个循环。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，连接克隆载体pEASY-T1（购自全式金生物技术有限公司）生成pEASY-GmNCED1后进行测序，测序结果见SEQ ID No.1。

实施例3 大豆GmNCED1基因启动子表达载体的构建及转化烟草

1. 表达载体的构建

将pEASY-GmNCED1质粒与pBI121质粒分别用BamHI与Sph I进行双酶切，分别回收目的基因与载体大片段，在DNA连接酶的作用下进行连接，得到表达载体pBI121-GmNCED1。将空载体即pBI121-CaMV 35S与pBI121-GmNCED1分别转化至农杆菌EHA105中，用于浸染烟草。

2. 农杆菌介导的烟草转化

按照叶盘转化法（Horsch et al.1988）进行。农杆菌菌液用灭菌水稀释至106-107cells/mL（一般稀释30倍左右）。取无菌烟草叶片，去掉主脉将叶片切成四方形状，然后将其浸入到稀释后的菌液中，侵染8-10分钟。

(1) 共培养

取出叶片外植体后在灭菌滤纸上吸干菌液，将其叶表面向下倒置于MS培养基的表面，24°C-25°C暗培养2天；

(2) 选择培养

将共培养叶片转移到选择分化培养基（含250 mg/L头孢；100 mg/L卡那霉素）上，28°C，每日光照16小时，15-20天换一次培养基；

(3) 生根培养

当分化的抗性芽长到1 cm左右，切下（最好不带任何愈伤组织）转移到生根培养基上，28°C，每日光照16小时；

(4) 土壤培养

当根长出约1-3 cm长，且密度较大时，去除封口膜，室温环境中进行炼苗2-3天，取出植株彻底洗净培养基，同时注意尽量减少根的损伤，移入温室土壤中培养。前2-3天需要遮阴培养；

(5) 烟草的繁种

将转基因烟草播种与人工气候室中，繁种至T2代后，收取种子用于GUS染色分析。

实施例4 GUS组织化学染色

分别将两种转基因烟草种植于MS固体培养基中，待长至4片叶时将小苗移至液体培养基中，生长2天后进行盐、干旱、低温及ABA处理，干旱处理1天，其他处理均处理6小时。将处理好的烟草幼苗放入培养皿中，加入染色液（X-Gluc）浸没植物材料，盖上平皿盖。37℃培养箱中温育过夜；将浸染过得烟草幼苗转入70%乙醇溶液中进行脱色2-3次，直至将叶绿素完全去除为止。

结果显示CaMV35S启动子驱动的GUS基因在未处理、盐、干旱以及低温等处理下均有较高表达，GUS染色较深。而大豆逆境诱导启动子GmNCED1驱动的GUS基因在未处理下并无表达，幼苗无染色。在盐、干旱、低温以及ABA处理下GUS基因均有表达，幼苗均有染色效果。并且在盐诱导下GUS染色很深，尤其是在根部。这些结果说明GmNCED1基因启动子为诱导型启动子，可以受盐、干旱、低温以及ABA处理所诱导，并且受盐胁迫诱导显著，基因主要在植物的根部表达。该基因启动子较CaMV35S启动子在逆境胁迫，尤其是在盐胁迫下有更好的表达特性，更适合利用植物基因工程手段培育抗逆作物新品种。

<110> 吉林农业大学

 

<120>大豆逆境诱导基因启动子及其应用

 

<160>  1

 

<210>  1

<211>  1252

<212>  DNA

<213>  大豆品种“吉育72”

 

<400>  1

 

gttatacacg tagatgcatg cataattcga gagggagcat ataaacaata tttaaaatat   60

tttaatttta ttagaaaaga acaacgaata attagctgat taaaattcaa gataagttta   120

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cgctccctta cacacctcca ccacctctct taccattttc aaaattcgat acacacgcct    1020

ccatacaaac cattttctac tacttacttc cttttaccac aacaaaatac cttccaattt    1080

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caaacacttg gattaaaacc acactccctt ctcttccgac atcttctccg acaaccttaa    1200

ataaaaggtt tccttcctat cctaattcca attccaattc caacaccatc ac      1252

Claims (3)

1.大豆逆境诱导启动子基因GmNCED1，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。

2.大豆逆境诱导启动子基因GmNCED1的制备方法，以“吉育72”基因组DNA为模板，用引物：

NCED-F：gttatacacgtagatgcatgc

NCED-R：catgtgatggtgttggaattg

PCR扩增。

3.权利要求1所述的大豆逆境诱导启动子基因GmNCED1在培育转基因大豆或烟草中的应用。