CN102676530B - 一种柑橘的绿色组织特异启动子 - Google Patents
一种柑橘的绿色组织特异启动子 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102676530B CN102676530B CN 201210202831 CN201210202831A CN102676530B CN 102676530 B CN102676530 B CN 102676530B CN 201210202831 CN201210202831 CN 201210202831 CN 201210202831 A CN201210202831 A CN 201210202831A CN 102676530 B CN102676530 B CN 102676530B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- chlorenchyma
- specific promoter
- tangerine
- chlorenchyma specific
- fruits
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
一种柑橘的绿色组织特异启动子，其具有SEQIDNO.1所示的序列。使用本发明之柑橘绿色组织特异启动子驱动外源基因只在绿色组织表达，而不是在全株表达，能避免过度消耗养分和能量，将其运用于以种子、果实为主要收获产物的作物中，让抗除草剂、抗虫等外源基因只在茎叶等绿色部分表达而不在成熟的种子、果实等器官中表达，以提高转基因作物的生物安全性。
Description
技术领域
本发明涉及一种柑橘绿色组织特异启动子，尤其涉及绿色组织特异表达。
背景技术
在转基因研究中，启动子是决定外源基因在转基因植株表达的关键性元件。目前，转基因研究中主要使用组成型启动子。组成型启动子驱动外源基因持续恒定在各个组织表达，造成植株物质和能量的浪费，产生了大量的异源蛋白质或代谢产物并在植株体内积累，打破了植株原有的代谢平衡；在可食用部分表达外源基因，还会带来转基因食品安全问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一种柑橘的绿色组织特异启动子，使用该柑橘绿色组织特异启动子驱动外源基因只在绿色组织表达，而不是在全株表达，能避免过度消耗养分和能量，将其运用于以种子、果实为主要收获产物的作物中，让抗除草剂、抗虫等外源基因只在茎、叶等绿色部分表达而不在成熟的种子、果实等器官中表达，以提高转基因作物的生物安全性。
本发明之柑橘的绿色组织特异启动子的序列为SEQ ID NO.1：
所述启动子序列包含5个与组织特异表达相关的顺势作用元件GATA-box；GATA-box使用方框标注，TATA-box使用下划线标注，CAAT-box使用波浪线标注。序列全长708bp。该启动子在控制组织特异性表达的元件GATA-box以及其他顺势作用元件的调控下驱动外源基因在绿色组织特异表达，在其他组织不表达。
使用本发明之柑橘绿色组织特异启动子驱动外源基因只在绿色组织表达，而不是在全株表达，能避免过度消耗养分和能量，将其运用于以种子、果实为主要收获产物的作物中，让抗除草剂、抗虫等外源基因只在茎叶等绿色部分表达而不在成熟的种子、果实等器官中表达，以提高转基因作物的生物安全性。
附图说明
图1为本发明带有柑橘绿色组织特异启动子序列表达载体的构建示意图；
图2为本发明实施例PBI121表达载体示意图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
本实施例利用SEQ ID NO.1所示的绿色组织特异启动子构建表达载体，以PBI121质粒（带有组成型启动子35S）为对照，农杆菌介导法分别转化番茄。
本实施例具体包括以下步骤：
（1）表达载体的构建：根据SEQ ID NO.1和PBI 121载体序列设计带有酶切位点和保护性碱基的特异引物F：5′- TAAAGCTTTCATGACGACG -3′和R：5′- CGTCTAGATTTACAATGATCAGAG -3′，酶切位点分别为Hind III 和Xba I；以糖橙基因组ＤＮＡ为模板，ＰＣＲ扩增得到SEQ ID NO.1，将ＰＣＲ产物通过琼脂糖凝胶电泳纯化回收，将回收产物连接到PGM-T easy载体，热击转化大肠杆菌DH5a并检测，经鉴定呈阳性的克隆测序验证；分别将获得的正确阳性克隆菌和含PBI121质粒的大肠杆菌接种到含有50mg/l Amp和50mg/lkan的LB液体培养基，37℃，180r/min，培养12h，分别提取质粒；将获得的两种质粒分别利用Hind III 和Xba I双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳检测，含有绿色组织启动子序列的质粒回收小片段，PBI121质粒回收大片段。利用ＤＮＡ连接酶将上述两个片段连接，热击转化大肠杆菌DH5a并检测，经鉴定呈阳性的克隆测序验证；
（2）农杆菌介导法转化番茄：制备农杆菌EHA105感受态，从YEB平板上挑取农杆菌EHA105单菌落，接种于含利福平25 mg/l的YEB液体培养基中，28 ℃，220 rpm摇菌12h；取上述培养物0.5 ml加入到50 ml含利福平25 mg/l的YEB液体培养基中，28 ℃，280 rpm摇4 h，使其OD600达到0.5。将菌液冰浴30 min，然后在4 ℃、6 000 rpm离心10 min，收集菌体，加入10 ml预冷的0.15 mol/l NaCl悬浮细胞。4 ℃，6 000 rpm离心10 min；弃上清，加1 ml预冷的20 mmol/l CaCl2重悬细胞，分装于离心管中，－70 ℃保存备用；取构建的表达载体质粒和PBI 121质粒各1 μl（0.5～1 μg）分别加入到100 μl的EHA105感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30 min；液氮中速冻1 min，37 ℃温育3～5 min，融化细胞，加入1ml含50 mg/l Kan的YEB液体培养基，28 ℃，125 rpm摇2～3 h；收集菌体涂布于含50 mg/l Kan的YEB平板28 ℃培养2天；挑取单菌落，PCR鉴定，将阳性克隆保存于-70℃备用；无菌苗的培养，番茄种子用75%酒精消毒30sec，接着在10％ 的次氯酸钠溶液消毒30min，期间每隔5min摇动一下，灭菌蒸馏水冲洗5次，接种于1/2 MS培养基；25℃黑暗条件下培养至发芽，转入光照培养室，幼苗生长条件为25℃、16h光照/8h黑暗，光照强度1800 lx；外植体准备和农杆菌培养，种子发芽后7d，将无菌苗的子叶和下胚轴用刀切下（叶带有一小段叶柄，下胚轴约2cm），置入预培养基中培养ld；取转入表达载体的农杆菌，活化，挑单菌落，于液体培养基（YEB培养基 + 100 mg/l Kan）中，28 ℃振荡20～25 h，待菌液达到菌对数生长期（OD600≈0.6）时，5 000 rpm离心10 min，除去上清液，再用重悬培养基悬浮OD600≈1.0即可用于侵染；转化再生，将所述在预培养基中培养1d的材料浸入到准备好的农杆菌重悬液中浸泡30min，用无菌滤纸吸掉茎段上多余的菌液，转入一选培养基培养，转移到一选培养基上进行筛选培养，26℃，光／暗周期16 h／8h条件下，约14d，转移到二选培养基，每2周继代一次。再生芽生根、移栽，待再生芽长至1cm左右时，将芽切下，放入生根培养基中生根。2周后对生根良好、长至5cm左右的转化苗进行炼苗，移栽至一次性塑料杯中，成活后移栽至花盆中。
通过化学组织染色分析发现，转入带有绿色组织特异启动子表达载体番茄的叶和未成熟呈绿色的果实中能检测到GUS基因，在花和成熟呈红色的果实中则检测不到。转入PBI121表达载体的番茄在叶、花、未成熟呈绿色的果实和成熟呈红色的果实中均能检测到GUS基因。以上说明该启动子为绿色组织特异启动子。
<110>湖南农业大学
<120>一种柑橘的绿色组织特异启动子
<160> 1
<210> 1
<211>708
<212> DNA
<213> 埃及糖橙（Citrus sinensisL. Osbeck）
<400> 1
AAAGCTTTCA TGACGACGTA TAATTGTTTC ATTAATCTTC CGGCCCAACG TCCGCATCGT 60
CATGGGTTCA TTTTCTTTTC ATTTTGTCTA TCAAGTCAGA CTAACATCAC GTCTTTTAAT 120
TCAAACAAAG AAAACATCAC GTCTTTAAAT ATCTATAAAT GCAAATCACT GCAGAATTTT 180
CTTCTCTTGT TTGTTGTTTA TCTGCCGACG ACGATAACTG ATAACAAACA AGTGTGGAAA 240
ATTCAGTTTA AAAACTTTCA ATTAATCCAT CAATATTTCG TGGCGCAATT TTAAGTCGTT 300
GAAAACTATT TTTCACCAGA GGAAAAACAA AAGAAAAAAG AGTCGTTAAA AATATCGGAC 360
CATGCAAACG TGGGTGTTTT TAATTCAAGA TAATCAATCT AGGAAGCATT ATCTCTTACA 420
AGATTTTCAA TGAGTCTGAA TGCAATCCAT TATACATACG TGGAACACCC ACACTGGTTC 480
CATGTCAATA AAAGAATCTG AAGAGCCTGG TGGACTAGAG ACTGCCACCT CACATGAAAA 540
ATCAAACCCA AAATCTTCAG CTTCCAATGA AATTAGAGAA TTAGATACCA CAAAGATAAG 600
AAACCTGACT CAAAAAACAT TATATAATAA ACCCACCAAT GTACAAGTTC CAATTCACCT 660
CTCAACACTC GAACACTAGA GCTCACCAAC AACTCTGATC ATTGTAAA 708
Claims (1)
1. 一种柑橘的绿色组织特异启动子，其特征在于，所述启动子的序列如SEQ ID NO.1所示。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201210202831 CN102676530B (zh) | 2012-06-19 | 2012-06-19 | 一种柑橘的绿色组织特异启动子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201210202831 CN102676530B (zh) | 2012-06-19 | 2012-06-19 | 一种柑橘的绿色组织特异启动子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102676530A CN102676530A (zh) | 2012-09-19 |
| CN102676530B true CN102676530B (zh) | 2013-07-10 |
Family
ID=46809082
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 201210202831 Expired - Fee Related CN102676530B (zh) | 2012-06-19 | 2012-06-19 | 一种柑橘的绿色组织特异启动子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102676530B (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106636099B (zh) * | 2017-02-08 | 2019-07-19 | 华中农业大学 | 一种柑橘果实特异性启动子及应用 |
| CN110117594B (zh) * | 2019-04-03 | 2020-01-24 | 湖北省农业科学院果树茶叶研究所 | 一种柑橘果实表皮高效表达启动子及其应用 |
| CN113201556B (zh) * | 2021-05-14 | 2022-11-22 | 浙江大学 | pSOY19-ZM2载体、其制备方法及应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102002498B (zh) * | 2010-03-12 | 2013-02-13 | 华南师范大学 | 一种韧皮部特异性启动子及其应用 |
| CN101818151B (zh) * | 2010-03-26 | 2012-02-08 | 吉林大学 | 一种大豆种子特异性启动子及其应用 |
-
2012
- 2012-06-19 CN CN 201210202831 patent/CN102676530B/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102676530A (zh) | 2012-09-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105420248A (zh) | 花青苷调控基因PyMYB10.2及其应用 | |
| CN103710382B (zh) | 一种改变植物花型的双35s过表达载体及其应用 | |
| CN102791729A (zh) | 用于作物改良的成花诱导剂的分子工程 | |
| CN104004781A (zh) | 一种抗草甘膦转基因水稻的制备方法 | |
| CN106480163B (zh) | 一种联合苹果愈伤组织细胞培养和遗传转化鉴定苹果抗病基因的方法 | |
| CN103060369B (zh) | 杂交作物转基因安全控制的方法和实现该方法的基因删除系统 | |
| CN102676530B (zh) | 一种柑橘的绿色组织特异启动子 | |
| CN101845445B (zh) | Cre重组酶重组基因及Cre/loxP介导的转基因安全性植物表达载体 | |
| CN106636099B (zh) | 一种柑橘果实特异性启动子及应用 | |
| CN103243096B (zh) | 一种植物组织特异表达启动子及其应用 | |
| CN100491535C (zh) | 川草二号老芒麦转抗虫基因技术 | |
| CN102499075A (zh) | 一种制备大豆复合型外植体的方法及用该外植体制备快速转基因大豆植株的方法 | |
| CN107630022B (zh) | 番茄SlMYB75基因在增强番茄果实抗腐烂、延长货架期中的应用 | |
| CN110204600A (zh) | BnSPL14基因、蛋白及其在控制甘蓝型油菜株型中的应用 | |
| CN108486112A (zh) | 一种具有花药组织特异性的启动子 | |
| CN111454966B (zh) | 一种春兰CgWRKY4基因及其应用 | |
| CN104988175B (zh) | 番茄HsfA1a基因在提高植物自噬体活性及抗旱性中的应用 | |
| CN103589750A (zh) | 一种在植株水平上删除转基因水稻标记基因的方法 | |
| CN107641155A (zh) | 一种在植物中表达重组人血清白蛋白的方法 | |
| CN105505988A (zh) | 可实现农杆菌共转化的双t-dna载体及其构建方法和应用 | |
| CN106947770B (zh) | 苤蓝基因及其在培育紫色微型番茄中的应用 | |
| CN101463393A (zh) | 一种用安全标记基因筛选转基因植物的方法 | |
| CN110951771A (zh) | 春兰miR390a在控制植物根系发育中的应用 | |
| CN117187294B (zh) | BnaC5.ACBP4基因在提高植物耐水淹性中的应用 | |
| CN111424040B (zh) | 一种春兰CgWRKY21基因及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20130710 Termination date: 20140619 |
|
| EXPY | Termination of patent right or utility model |