CN102676530A

CN102676530A - 一种柑橘的绿色组织特异启动子

Info

Publication number: CN102676530A
Application number: CN2012102028318A
Authority: CN
Inventors: 邓子牛; 陶坚; 龙桂友; 李荣华; 戴素明
Original assignee: Hunan Agricultural University
Current assignee: Hunan Agricultural University
Priority date: 2012-06-19
Filing date: 2012-06-19
Publication date: 2012-09-19
Anticipated expiration: 2032-06-19
Also published as: CN102676530B

Abstract

一种柑橘的绿色组织特异启动子，其具有SEQIDNO.1所示的序列。使用本发明之柑橘绿色组织特异启动子驱动外源基因只在绿色组织表达，而不是在全株表达，能避免过度消耗养分和能量，将其运用于以种子、果实为主要收获产物的作物中，让抗除草剂、抗虫等外源基因只在茎叶等绿色部分表达而不在成熟的种子、果实等器官中表达，以提高转基因作物的生物安全性。

Description

一种柑橘的绿色组织特异启动子

技术领域

本发明涉及一种柑橘绿色组织特异启动子，尤其涉及绿色组织特异表达。

背景技术

在转基因研究中，启动子是决定外源基因在转基因植株表达的关键性元件。目前，转基因研究中主要使用组成型启动子。组成型启动子驱动外源基因持续恒定在各个组织表达，造成植株物质和能量的浪费，产生了大量的异源蛋白质或代谢产物并在植株体内积累，打破了植株原有的代谢平衡；在可食用部分表达外源基因，还会带来转基因食品安全问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一种柑橘的绿色组织特异启动子，使用该柑橘绿色组织特异启动子驱动外源基因只在绿色组织表达，而不是在全株表达，能避免过度消耗养分和能量，将其运用于以种子、果实为主要收获产物的作物中，让抗除草剂、抗虫等外源基因只在茎、叶等绿色部分表达而不在成熟的种子、果实等器官中表达，以提高转基因作物的生物安全性。

本发明之柑橘的绿色组织特异启动子的序列为SEQ ID NO.1：

Figure 2012102028318100002DEST_PATH_IMAGE002

所述启动子序列包含5个与组织特异表达相关的顺势作用元件GATA-box；GATA-box使用方框标注，TATA-box使用下划线标注，CAAT-box使用波浪线标注。序列全长708bp。该启动子在控制组织特异性表达的元件GATA-box以及其他顺势作用元件的调控下驱动外源基因在绿色组织特异表达，在其他组织不表达。

使用本发明之柑橘绿色组织特异启动子驱动外源基因只在绿色组织表达，而不是在全株表达，能避免过度消耗养分和能量，将其运用于以种子、果实为主要收获产物的作物中，让抗除草剂、抗虫等外源基因只在茎叶等绿色部分表达而不在成熟的种子、果实等器官中表达，以提高转基因作物的生物安全性。

附图说明

图1为本发明带有柑橘绿色组织特异启动子序列表达载体的构建示意图；

图2为本发明实施例PBI121表达载体示意图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。

本实施例利用SEQ ID NO.1所示的绿色组织特异启动子构建表达载体，以PBI121质粒（带有组成型启动子35S）为对照，农杆菌介导法分别转化番茄。

本实施例具体包括以下步骤：

（1）表达载体的构建：根据SEQ ID NO.1和PBI 121载体序列设计带有酶切位点和保护性碱基的特异引物F：5′- TAAAGCTTTCATGACGACG -3′和R：5′- CGTCTAGATTTACAATGATCAGAG -3′，酶切位点分别为Hind III 和Xba I；以糖橙基因组ＤＮＡ为模板，ＰＣＲ扩增得到SEQ ID NO.1，将ＰＣＲ产物通过琼脂糖凝胶电泳纯化回收，将回收产物连接到PGM-T easy载体，热击转化大肠杆菌DH5a并检测，经鉴定呈阳性的克隆测序验证；分别将获得的正确阳性克隆菌和含PBI121质粒的大肠杆菌接种到含有50mg/l Amp和50mg/lkan的LB液体培养基，37℃，180r/min，培养12h，分别提取质粒；将获得的两种质粒分别利用Hind III 和Xba I双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳检测，含有绿色组织启动子序列的质粒回收小片段，PBI121质粒回收大片段。利用ＤＮＡ连接酶将上述两个片段连接，热击转化大肠杆菌DH5a并检测，经鉴定呈阳性的克隆测序验证；

（2）农杆菌介导法转化番茄：制备农杆菌EHA105感受态，从YEB平板上挑取农杆菌EHA105单菌落，接种于含利福平25 mg/l的YEB液体培养基中，28 ℃，220 rpm摇菌12h；取上述培养物0.5 ml加入到50 ml含利福平25 mg/l的YEB液体培养基中，28 ℃，280 rpm摇4 h，使其OD₆₀₀达到0.5。将菌液冰浴30 min，然后在4 ℃、6 000 rpm离心10 min，收集菌体，加入10 ml预冷的0.15 mol/l NaCl悬浮细胞。4 ℃，6 000 rpm离心10 min；弃上清，加1 ml预冷的20 mmol/l CaCl₂重悬细胞，分装于离心管中，－70 ℃保存备用；取构建的表达载体质粒和PBI 121质粒各1 μl（0.5～1 μg）分别加入到100 μl的EHA105感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30 min；液氮中速冻1 min，37 ℃温育3～5 min，融化细胞，加入1ml含50 mg/l Kan的YEB液体培养基，28 ℃，125 rpm摇2～3 h；收集菌体涂布于含50 mg/l Kan的YEB平板28 ℃培养2天；挑取单菌落，PCR鉴定，将阳性克隆保存于-70℃备用；无菌苗的培养，番茄种子用75%酒精消毒30sec，接着在10％的次氯酸钠溶液消毒30min，期间每隔5min摇动一下，灭菌蒸馏水冲洗5次，接种于1/2 MS培养基；25℃黑暗条件下培养至发芽，转入光照培养室，幼苗生长条件为25℃、16h光照/8h黑暗，光照强度1800 lx；外植体准备和农杆菌培养，种子发芽后7d，将无菌苗的子叶和下胚轴用刀切下（叶带有一小段叶柄，下胚轴约2cm），置入预培养基中培养ld；取转入表达载体的农杆菌，活化，挑单菌落，于液体培养基（YEB培养基 + 100 mg/l Kan）中，28 ℃振荡20～25 h，待菌液达到菌对数生长期（OD₆₀₀≈0.6）时，5 000 rpm离心10 min，除去上清液，再用重悬培养基悬浮OD₆₀₀≈1.0即可用于侵染；转化再生，将所述在预培养基中培养1d的材料浸入到准备好的农杆菌重悬液中浸泡30min，用无菌滤纸吸掉茎段上多余的菌液，转入一选培养基培养，转移到一选培养基上进行筛选培养，26℃，光／暗周期16 h／8h条件下，约14d，转移到二选培养基，每2周继代一次。再生芽生根、移栽，待再生芽长至1cm左右时，将芽切下，放入生根培养基中生根。2周后对生根良好、长至5cm左右的转化苗进行炼苗，移栽至一次性塑料杯中，成活后移栽至花盆中。

通过化学组织染色分析发现，转入带有绿色组织特异启动子表达载体番茄的叶和未成熟呈绿色的果实中能检测到GUS基因，在花和成熟呈红色的果实中则检测不到。转入PBI121表达载体的番茄在叶、花、未成熟呈绿色的果实和成熟呈红色的果实中均能检测到GUS基因。以上说明该启动子为绿色组织特异启动子。

<110>湖南农业大学

<120>一种柑橘的绿色组织特异启动子

<160> 1

<210> 1

<211>708

<212> DNA

<213>　埃及糖橙（Citrus sinensisL. Osbeck）

<400> 1

AAAGCTTTCA TGACGACGTA TAATTGTTTC ATTAATCTTC CGGCCCAACG TCCGCATCGT 60

CATGGGTTCA TTTTCTTTTC ATTTTGTCTA TCAAGTCAGA CTAACATCAC GTCTTTTAAT 120

TCAAACAAAG AAAACATCAC GTCTTTAAAT ATCTATAAAT GCAAATCACT GCAGAATTTT 180

CTTCTCTTGT TTGTTGTTTA TCTGCCGACG ACGATAACTG ATAACAAACA AGTGTGGAAA 240

ATTCAGTTTA AAAACTTTCA ATTAATCCAT CAATATTTCG TGGCGCAATT TTAAGTCGTT 300

GAAAACTATT TTTCACCAGA GGAAAAACAA AAGAAAAAAG AGTCGTTAAA AATATCGGAC 360

CATGCAAACG TGGGTGTTTT TAATTCAAGA TAATCAATCT AGGAAGCATT ATCTCTTACA 420

AGATTTTCAA TGAGTCTGAA TGCAATCCAT TATACATACG TGGAACACCC ACACTGGTTC 480

CATGTCAATA AAAGAATCTG AAGAGCCTGG TGGACTAGAG ACTGCCACCT CACATGAAAA 540

ATCAAACCCA AAATCTTCAG CTTCCAATGA AATTAGAGAA TTAGATACCA CAAAGATAAG 600

AAACCTGACT CAAAAAACAT TATATAATAA ACCCACCAAT GTACAAGTTC CAATTCACCT 660

CTCAACACTC GAACACTAGA GCTCACCAAC AACTCTGATC ATTGTAAA 708

Claims

1. 一种柑橘的绿色组织特异启动子，其特征在于，所述启动子具有SEQ ID NO.1所示的序列。