CN110117594B - 一种柑橘果实表皮高效表达启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种柑橘果实表皮高效表达启动子及其应用。所述的柑橘果实表皮高效表达启动子命名为：P1080，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过柑橘不同组织定量PCR分析，发现P1080启动子调控下游Cs2g31080基因在柑橘果实表皮有很强的表达活性，而在叶、根及果肉中低表达；将上述的P1080启动子与标记基因GUS融合，通过农杆菌EHA105介导瞬时转化本生烟草叶片和Micro Tom番茄果实，证实P1080启动子与阳性对照(强启动子CaMV35s)具有相近的表达活性。本发明的P1080启动子可用于构建果实表皮特异表达的转基因植物。

Description

一种柑橘果实表皮高效表达启动子及其应用

技术领域

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种柑橘果实表皮高效表达启动子及其应用。

背景技术

柑橘(Citrus)是世界第一大水果。我国是柑橘原产地之一，产量和面积占世界的1/4左右。柑橘果实表皮也称黄皮层，是果实外观色泽主要载体，还可作为某些柑橘品种(如金柑)的主要食用部位。同时黄皮层富含类黄酮、酚类物质和其他化学活性成分如柑橘精油，可用来防控害虫和病菌侵染。

植物基因的表达调控包括转录前调控(如DNA修饰)、转录调控、转录后调控、翻译及翻译后调控。而启动子和转录因子协调作用，在RNA聚合酶等一系列因素参与下启动基因的转录是转录水平调控基因表达的关键。

目前，在基因工程及遗传改良研究中主要采用组成型强启动子。但组成型启动子驱动目标基因在整个植株中持续超量表达，不仅浪费植株体内物质和能量，而且破环植株代谢平衡，影响植株的正常生长发育。而在植物花粉和可食用部分表达外源基因，还带来转基因生物安全问题争议。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种柑橘果实表皮高效表达启动子，所述的柑橘果实表皮高效表达启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的柑橘果实表皮高效表达启动子序列长度为1467bp，命名为P1080。

本发明的第二个目的是提供一种表达载体，该表达载体含有上述的柑橘果实表皮高效表达启动子。

本发明的第三个目的是提供一种宿主菌，该宿主菌含有上述的表达载体。

优选，所述的宿主菌为大肠杆菌DH5α或根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciensEHA105单克隆细胞系。

本发明的第四个目的是提供上述的柑橘果实表皮高效表达启动子在构建果实表皮特异表达的转基因植物中的应用。

本发明通过柑橘不同组织定量PCR分析，发现P1080启动子调控下游Cs2g31080基因在柑橘果实表皮有很强的表达活性，而在叶、根部及果肉中低表达；同时将上述的P1080启动子与标记基因GUS融合，通过根癌农杆菌EHA105介导瞬时转化本生烟草和Micro Tom番茄果实，证实P1080启动子与阳性对照(强启动子CaMV35s)具有相近的表达活性。以上结果表明，本发明的柑橘果实表皮高效表达启动子P1080可用于构建果实表皮特异表达的转基因植物，通过改良果实表皮在提高果实观赏性、抗逆性等品质方面具有重要作用。

附图说明

图1是P1080启动子调控下游Cs2g31080基因在柑橘不同组织中的相对表达量。

图2是本发明构建的pCAMBIA2300-P1080-GUS质粒和pCAMBIA2300-CaMV35s-GUS质粒(对照)经Pst I和Bam HI双酶切后进行琼脂糖胶电泳的结果。其中，P1080表示pCAMBIA2300-P1080-GUS质粒，CaMV35s表示pCAMBIA2300-CaMV35s-GUS质粒。

图3是采用注射法将含有本发明构建的pCAMBIA2300-P1080-GUS质粒和pCAMBIA2300-CaMV35s-GUS质粒(对照)的农杆菌EHA105瞬时转化本生烟草叶片的GUS染色结果。其中，左边表示pCAMBIA2300-CaMV35s-GUS质粒转化本生烟草叶片的GUS染色结果，右边表示pCAMBIA2300-P1080-GUS质粒转化本生烟草叶片的GUS染色结果。

图4是采用注射法将含有本发明构建的pCAMBIA2300-P1080-GUS质粒和pCAMBIA2300-CaMV35s-GUS质粒(对照)的农杆菌EHA105瞬时转化Micro Tom番茄绿熟期果实的GUS染色结果。其中，A表示pCAMBIA2300-P1080-GUS质粒转化Micro Tom番茄绿熟期果实的GUS染色结果，B表示pCAMBIA 2300-CaMV35s-GUS质粒转化Micro Tom番茄绿熟期果实的GUS染色结果。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1pCAMBIA2300-P1080-GUS构建

申请人利用四种柑橘果实外表皮转录组数据库，从中筛选到一个超高表达的基因，在甜橙基因组数据库(http://citrus.hzau.edu.cn/orange/)中基因号为Cs2g31080。进一步通过不同组织定量PCR分析，分别以柑橘根部、叶片、果实外表皮和果肉cDNA为模板，采用引物qF：5'-GCAAGGAGGTGAAAGGAGTT-3'和qR：5'-TTTGAAGGCTGATCCGACTAAG-3'进行定量PCR扩增。以柑橘看家基因β-actin为内参，引物为：aF 5'-GCTGCCTGATGGTCAAGTC-3'和aR：5'-AGTTGTAGGTGGTCTCGTGAA -3'。反应在ABI 7500实时定量PCR仪上进行(AppliedBiosystems，USA)，10μL反应体系，其中SYBER Green PCR Mix 5μL，引物各0.5μL(10μmol·L-1)，cDNA模板约200ng，每个反应3次重复。反应程序为50℃2min，95℃10min；95℃15s，60℃1min，40个循环。基因的相对表达量通过2^-ΔΔC(t)公式计算，即经内参β-actin校正后，以叶片中的表达水平为1计算相对表达量。PCR反应体系结果证实P1080启动子调控下游Cs2g31080基因主要在柑橘果实外表皮表达，在柑橘根部、叶片和果肉中的表达量相对较低(图1)。

以Cs2g31080及其5'上游序列为参考序列设计引物，以Marisol克里曼丁橘(Citrus clementina hort.ex Tanaka)基因组DNA为模板，利用带有酶切位点的特异引物F：5'-CTGCAG CTGTGCGGCAATAATTTCTTT-3'和R：5'-GGATCCTCGGACGTCCATTATATACAGA-3'(下划线表示酶切位点，酶切位点分别为Pst I和Bam HI)进行PCR扩增。PCR采用Phusion high-fidelity PCR master mix with HF buffer(NEB，US)试剂盒进行，反应体系如下：25μL 2×Phusion Master Mix，1.5μL DMSO(终浓度3％)，正、反向引物各25μM，200ng模板DNA，ddH₂O加至终体积50μL。PCR反应程序为：98℃(预变性)30sec，1个循环；98℃(变性)10sec，70℃(退火)30sec，72℃(延伸)90sec，34个循环；72℃(终延伸)8min,1个循环；4℃保存。PCR产物用1.0％琼脂糖胶电泳，切取1.5kb左右大小的目的条带，使用QiAGelExtraction kit(QIAGEN,Hilden,Germany)回收目的条带DNA。利用pMini T2.0vectorwithPCR Cloning Kit(NEB)将回收DNA与pMini T2.0载体进行连接，热激转化至大肠杆菌DH5α。

挑单克隆细菌扩繁，提取质粒用Pst I和Bam HI进行双酶切验证阳性。阳性质粒送武汉擎科创新生物科技有限公司测序。测序序列与甜橙基因组参考序列比对，选择测序正确质粒，置于-20℃保存备用。

将测序正确的质粒和pCAMBIA2300-CaMV35s-GUS目标载体(本实验室保存)分别用Pst I和Bam HI进行双酶切，产物经过1.0％琼脂糖胶电泳，分别取1.5kb、10kb左右大小的目的条带，用QiAGel Extraction kit(QIAGEN,Hilden,Germany)回收目的条带DNA。使用T4DNA ligase(NEB,US)将插入片段(1.5kb)和载体(10kb)按说明书进行连接。反应体系如下：1μL T4DNA ligase,2μL T4DNA Ligase Buffer(10X)，载体DNA约100ng，插入片段DNA约45ng，ddH₂O加至终体积20μL；16℃反应12-16h(过夜)后，65℃处理10min终止反应，得到连接反应产物。

取5μL连接反应产物，热激转化至大肠杆菌DH5α。挑取单克隆细菌扩繁，利用特异引物F：5'-CTGCAG CTGTGCGGCAATAATTTCTTT-3'和R：5'-GGATCCTCGGACGTCCATTATATACAGA-3'进行PCR阳性验证。阳性菌液提取质粒后经Pst I和Bam HI双酶切进一步确认质粒是否构建成功，产物经过1.0％琼脂糖胶电泳结果见图2所示。由图2可知，pCAMBIA2300-P1080-GUS质粒载体构建成功，其电泳泳道含有出现目标条带1.5kb片段。最后将阳性克隆菌液添加30％甘油后置于-80℃保存，将pCAMBIA2300-P1080-GUS质粒置于-20℃保存。

实施例2农杆菌介导的本生烟草叶片和Micro Tom番茄绿熟期果实转化

取1μg左右的pCAMBIA2300-P1080-GUS载体质粒，加入到200μL农杆菌EHA105感受态细胞中，冰上静置30min后液氮处理5min，37℃热激5min后冰上静置2min，加入500μL LB液体培养基，28℃，180rpm摇床培养4-5h。4℃，3000rpm离心5min收集菌液，用200μL LB液体培养基重悬，取100μL涂布在LB固体培养基(含100mg/L卡那霉素和25mg/L利福平)上。培养皿用Parafilim封口膜封好后在28℃培养2-3d，挑取单克隆细菌扩繁，利用特异引物F：5'-CTGCAG CTGTGCGGCAATAATTTCTTT-3'和R：5'-GGATCCTCGGACGTCCATTATATACAGA-3'进行PCR筛选阳性克隆。验证后的农杆菌EHA105加30％甘油保存于-80℃备用。

应用pCAMBIA2300-P1080-GUS表达载体，以pCAMBIA2300-CaMV35s-GUS为对照，采用注射法瞬时转化本生烟草(Nicotiana benthamiana)叶片和Micro Tom番茄(Lycopersicon esculentum Mill.cv.Micro-Tom)绿熟期果实。具体步骤如下：

(1)农杆菌侵染液制备：上述阳性农杆菌EHA105在LB培养基(含100mg/L卡那霉素和25mg/L利福平)上划线，挑取单克隆在5mL YEB液体培养基(含100mg/L卡那霉素和25mg/L利福平)上180rpm，28℃振荡培养1-2d，然后取1mL菌液到50mL YEB液体培养基(含100mg/L卡那霉素和25mg/L利福平)中过夜扩大培养至OD₆₀₀值1.0左右。6000rpm离心8min收集菌体，用25mL诱导缓冲液(10mM MgCl₂,10mM MES,pH 5.8)重悬，再次离心收集菌体，用侵染缓冲液(10mM MgCl₂,10mM MES,200μM乙酰丁香酮，pH 5.8)重悬菌体至OD₆₀₀值1.0左右。室温静置3-5h后可用于瞬时转化。

(2)本生烟草瞬时转化：使用播种后45天左右的烟草植株，渗透法转化叶片，实验前1d控水，摘心，去掉下层坏死老叶。用1mL去掉针头的注射器吸取侵染液，在叶背面将菌液渗透注射进叶片内。室温光照培养2-3d后，取转化叶片备用。

(3)Micro Tom番茄果实瞬时转化：使用绿熟期(花后22-25d)番茄果实(离体或非离体均可)，用1mL带针头的注射器沿果实中心柱插入约1cm深，缓慢推动注射器，将菌液(约600μL)注射进果实，作好标记，室温放置约2-3d，将果实切片备用。

(4)将上述转化后的本生烟草叶片和Micro Tom番茄果实切片通过GUS组织化学染色。GSU染色液(配方：100mM Tis盐酸缓冲液pH7.0，50mM氯化钠，0.5mM铁化钾，0.5mM铁氰化钾，0.01％Triton-X，2mM X-gluc)现配现用。将材料浸没在染色液中，抽中空5min左右，置于37℃温箱1h以上。染色后取出材料，用75％乙醇漂洗3-5次，每次30min左右至材料完全脱色。脱色后的材料可浸泡在70％乙醇中长期保存。在显微镜下观察转化材料的染色结果并拍照，结果见图3和图4所示。由图3和图4可知，无论是在本生烟草叶片，还是Micro Tom番茄果实，P1080启动子具有与强启动子CaMV35s相近的表达活性。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 湖北省农业科学院果树茶叶研究所

<120> 一种柑橘果实表皮高效表达启动子及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1467

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctgtgcggca ataatttctt gttttttttt tgttttgttt gagtccatgt gttttcatat 60

cctatatttt tctcttcatt gtaatggtaa aatatctatg aaatatgcaa atgatcatag 120

tcgttgaagt gagtggaaat aatggcagtt gcttttttta aaaaactagg gctgccacct 180

ttattatata tactcaagaa ttttttatca actttgctca aacgatgttg ttaactgaac 240

aaccaaggat aaaatttcaa tgggatacgc ttaattcggg tctgatgcgt ggagatggga 300

tttatgttta taaaagtaac aaagacaaac tcattgtatt gcttcatata tgaacacaaa 360

tacattctta ataaagtcca tcctttcata cacacacaca catttctatt gcttaagtcc 420

catttcaacg gatttttttt aactagaaac aatagcaaac accgtcttag gatttcaata 480

agttttctct gaattctttg attgctgtag cttataatgg attagttttg gtcttatttt 540

tttaataatc ttaacttagg ttttaaaaaa gaaaaggggg cttatgataa ttgggggtca 600

aaatttttca aacaaaggaa aaaattgtgg gtgtaaagat ttttttttaa ttgtttgttt 660

ctaggatata ggtttattta gaagttgcat gtagttttaa tgaagattaa aattataaaa 720

tacttaaaaa gggttttaag atgttttatt aggagtgaca agagtcgagc tctatcaatt 780

acgtacaaaa gtgtgattgc tgattgggct ctgctgctcg gaccaagcac caaaagttcg 840

ggctcttttt cattttttgt gctgtatttg tgtgaggttc aatttatgaa aattttgcac 900

agcacaatcc attaaagggg aaaaataata ataataacga taatagtaat atctgtcaca 960

ttttctaaat gatttttttt ttttagtgtt atcattcatt atttaccagg tgtatgcttc 1020

tccttggaga gtggttattt tattggatat acgctaagta ttttcgatct cttgtttgcc 1080

ttcatgattt ttagactgaa tcagtagtga actagttaac ttcaatggaa aggggattaa 1140

taattaatcg aatcatttat agttccgaga gataaagttc cgatacagtt atctagatcg 1200

cgtgagaaag gtaactcaac taacaaatga ttcacatgtc tacagcataa atattttgat 1260

tttgtaacga taattttaat aatgtattta taaccatatg aacattaagg ttcatgcctc 1320

tctctagaac aataaaattt ctttaaagat ttaaaatact ttgaagcaac aaaaacgccg 1380

gcctgaaggt aatgtcacgc gattatgact tatttgaaaa ttttggcttc ccatatcccc 1440

ccccatctgt atataatgga cgtccga 1467

Claims (5)

1.一种柑橘果实外表皮高效表达启动子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种表达载体，其特征在于，含有权利要求1所述的柑橘果实外表皮高效表达启动子。

3.一种宿主菌，其特征在于，含有权利要求2所述的表达载体。

4.根据权利要求3所述的宿主菌，其特征在于，所述的宿主菌为大肠杆菌DH5α或根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens EHA105单克隆细胞系。

5.权利要求1所述的柑橘果实外表皮高效表达启动子在构建果实外表皮特异表达的转基因植物中的应用。

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